JP7317255B1 - Ｐｈａ生産量の高い遺伝子組換え細菌及びその構築方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）生産量の高い遺伝子組換え細菌及びその構築方法を提供する。【解決手段】ＰＨＡ生産量の高い組換えラルストニア・ユートロファを提供する。前記組換えラルストニア・ユートロファは、ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターを含み、更に変異型ｐｈａＣ遺伝子を含む。本発明が提供する組換えラルストニア・ユートロファは、ＰＨＡにおけるポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）（ＰＨＢＨＨｘ）を生産するのに用いられる。【選択図】図１

Description

GDMCC GDMCC 62177 CGMCC CGMCC 23600
本発明は、遺伝子工学と発酵工学の分野に属し、より具体的には、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ、ＰＨＡ）生産量の高い遺伝子組換え細菌、及びその製造方法と使用に関するものである。
ポリヒドロキシアルカノエート（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ、ＰＨＡ）は、微生物から合成される再生・分解可能な複数の材料特性を有する高分子ポリマーであり、医療、材料、及び環境保護の分野で広く応用される見込みがある。ポリヒドロキシアルカノエートは、主に炭素源およびエネルギーの貯蔵担体として微生物の細胞に広く存在する。ＰＨＡは、モノマーの種類や重合方法に応じて、硬くて脆い硬質プラスチックないし柔軟なエラストマー等、一連の多様な材料特性を有する。
ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）は、商業的に有用な複合バイオポリマーであって、大量の細菌から生産される細胞内材料である。ポリヒドロキシ酪酸は、ポリマーの化学的および物理的性質による有用な生物学的材料であり、生分解性／熱可塑性材料、ある抗生物質の有機合成用のキラル中心の供給源、及び薬物送達および骨置換用の基質としての使用を含む、多種の潜在的な使用がある。ポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）（ＰＨＢＨＨｘ）は、ＰＨＡの１種であり、不溶性微小球状粒子状として細胞質に存在する。
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ；カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）とも言う）は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成を研究するための重要なモデル細菌であり、現在多く研究されているＰＨＢ株の生成に用いられる菌株である。炭素が過剰で窒素が不足すると、菌株はＰＨＢを大量に蓄積することができる。一方、細胞内の他の炭素源の代謝が活発になる場合、ＰＨＢの合成は影響されてしまう。
ラルストニア・ユートロファ体内のＰＨＢ合成経路はすでに明らかにされている。アシルコエンザイムＡ（Ａｃｙｌ－ＣｏＡ）は、ｐｈａＡ（β－ケトチオラーゼ）の作用下でアセトアセチルコエンザイムＡ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）を合成し、さらにｐｈａＢ（アセトアセチルコエンザイムＡ還元酵素）により３－ヒドロキシ酪酸を合成する。同時に、ｐｈａＪ（（Ｒ）－エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ）は、脱水素して３－ヒドロキシヘキサン酸を生成し、ｐｈａＣ（ＰＨＡポリメラーゼ）の作用下で２種の化合物を重合してＰＨＢＨＨｘを形成する。
ＰＨＢＨＨｘをより効率的に生産し、それにおける３－ヒドロキシヘキサン酸モノマーのモル比を特定の割合に制御するためには、ＰＨＡ合成用の新規の微生物の開発が急務である。
当分野の上記の需要を満すために、本発明は、ＰＨＡ生産量の高い組換えラルストニア・ユートロファを提供する。本発明は、出発菌株としてラルストニア・ユートロファＨ１６（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６，Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒに受託され、受託番号ＣＧＭＣＣ １．７０９２）を使用し、菌株を更に改造して、その発酵性能を更に向上させる。
一つの態様では、本発明は、組換えラルストニア・ユートロファのゲノムにｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターが導入され、かつ導入されたｐｈａＣ変異遺伝子を含む、組換えラルストニア・ユートロファを提供する。本発明で提供される組換えラルストニア・ユートロファにおいて、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の発現により、前記組換えラルストニア・ユートロファがポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）を合成する。本発明の１つの実施形態では、前記組換えラルストニア・ユートロファが生産したポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）における３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が増加する。
本発明の上記態様のいくつかの実施形態では、相同組換えによって、前記組換えラルストニア・ユートロファのゲノムにｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターを導入する。本発明の好ましい実施形態では、相同組換えによって、プロモーター配列を有するプラスミドを用いて、ｐｈａＪ遺伝子の上流にｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーター配列を挿入する。本発明で提供される組換えラルストニア・ユートロファにおいて、好ましくは、前記ｐｈａＪ遺伝子がｐｈａＪ４ｂ遺伝子である。また、好ましくは、前記プロモーター配列は、ｐｈａＪ４３プロモーター配列である配列番号３、ｐｈａＪ２１０プロモーター配列である配列番号８、ｐｈａＪ１８３プロモーター配列である配列番号９、及びｐｈａＪ２２５プロモーター配列である配列番号１０から選ばれるものであり、より好ましくは、前記プロモーター配列は、ｐｈａＪ４３プロモーター配列である配列番号３である。
本発明の上記態様のいくつかの実施形態では、前記組換えラルストニア・ユートロファには、導入されたｐｈａＣ変異遺伝子が含まれる。好ましい実施形態では、以下の方法によりｐｈａＣ変異遺伝子を導入する：（１）前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子は、前記組換えラルストニア・ユートロファのゲノムに組み込まれ、元のゲノムｐｈａＣ遺伝子は不活化され、その不活化方法は、変異、置換、置き換え又はノックアウトを含んでもよく、好ましくは、ｐｈａＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドを構築することで不活化を行い、具体的な元のゲノムｐｈａＣ遺伝子の配列は、配列番号１が示すとおりである；又は、（２）前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子は、前記組換えラルストニア・ユートロファに導入された安定なプラスミドに存在しており、好ましくは、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の配列は、配列番号５が示すとおりである。
本発明の上記態様の好ましい実施形態では、前記組換えラルストニア・ユートロファは、さらに、導入されたｐｒｏＣ遺伝子を含んでもよい。特に、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子が、前記組換えラルストニア・ユートロファに導入された安定なプラスミドに存在する場合、元のゲノムｐｈａＣ遺伝子は不活化され、かつ元のゲノムｐｒｏＣ遺伝子は不活化されるとともに、前記組換えラルストニア・ユートロファ内の安定なプラスミドにｐｒｏＣ遺伝子が導入され、不活化方法は、変異、置換、置き換え又はノックアウトを含んでもよく、好ましくは、ｐｒｏＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドを構築することで不活化を行い、具体的な元のゲノムｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号２が示すとおりであり、好ましくは、前記導入されたｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号４が示すとおりである。
本発明の上記態様の好ましい実施形態では、前記組換えラルストニア・ユートロファは、ラルストニア・ユートロファを出発菌株とする。好ましくは、前記出発菌株は、ラルストニア・ユートロファＨ１６であり、より好ましくは、前記出発菌株は、ラルストニア・ユートロファＲｅ０９８０である。
本発明の上記態様の好ましい実施形態では、前記組換えラルストニア・ユートロファのゲノムにｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターが導入されており、好ましくは、前記プロモーター配列は、ｐｈａＪ４３プロモーター配列である配列番号３である。また、元のゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子とｐｒｏＣ遺伝子がノックアウトされている。具体的には、前記元のゲノムｐｈａＣ遺伝子の配列は、配列番号１が示すとおりであり、具体的には、前記元のゲノムｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号２が示すとおりである。前記組換えラルストニア・ユートロファには、ラルストニア・ユートロファ内に安定に存在するプラスミドも導入されており、前記プラスミドに、導入されたｐｈａＣ変異遺伝子と導入されたｐｒｏＣ遺伝子が載せられており、好ましくは、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の配列は、配列番号５が示すとおりであり、また、好ましくは、前記導入されたｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号４が示すとおりである。
本発明の上記態様の好ましい実施形態では、前記組換えラルストニア・ユートロファであるラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）菌株ＢＰＳ－０５０は、受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３６００として、２０２１年１０月１３日にＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所、郵便番号：１００１０１）に受託された。
本発明の他の態様は、ラルストニア・ユートロファを出発菌株として、前記ラルストニア・ユートロファのゲノムに、ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターを導入し、前記ラルストニア・ユートロファにｐｈａＣ変異遺伝子を導入し、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の発現により、前記組換えラルストニア・ユートロファがポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）を合成し、生産されたポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）における３－ヒドロキシヘキサン酸の割合が増加した組換えラルストニア・ユートロファを得るステップを含む、組換えラルストニア・ユートロファの製造方法を提供する。
本発明の上記態様のいくつかの実施形態では、相同組換えによって、前記組換えラルストニア・ユートロファのゲノムにｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターを導入する。本発明の好ましい実施形態では、相同組換えによって、プロモーター配列を有するプラスミドを用いて、ｐｈａＪ遺伝子の上流にプロモーター配列を挿入してｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションする。好ましくは、前記ｐｈａＪ遺伝子はｐｈａＪ４ｂ遺伝子である。また、好ましくは、前記プロモーター配列は、ｐｈａＪ４３プロモーター配列である配列番号３、ｐｈａＪ２１０プロモーター配列である配列番号８、ｐｈａＪ１８３プロモーター配列である配列番号９、及びｐｈａＪ２２５プロモーター配列である配列番号１０から選ばれるものであり、より好ましくは、前記プロモーター配列は、ｐｈａＪ４３プロモーター配列である。
本発明の上記態様のいくつかの実施形態では、前記組換えラルストニア・ユートロファにｐｈａＣ変異遺伝子を導入する。好ましい実施形態では、以下の方法によりｐｈａＣ変異遺伝子を導入する：（１）ｐｈａＣ変異遺伝子の導入は、前記ｐｈａＣ変異遺伝子を前記組換えラルストニア・ユートロファのゲノムに組み込み、元のゲノムｐｈａＣ遺伝子を不活化させることで行われ、その不活化方法は、変異、置換、置き換え又はノックアウトを含んでもよく、好ましくは、ｐｈａＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドを構築することで不活化を行い、具体的な元のゲノムｐｈａＣ遺伝子の配列は、配列番号１が示すとおりである；又は（２）ｐｈａＣ変異遺伝子の導入は、前記ｐｈａＣ変異遺伝子を安定なプラスミドに載せて、前記組換えラルストニア・ユートロファに導入することで行われ、好ましくは、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の配列は、配列番号５が示すとおりである。
本発明の上記態様の好ましい実施形態は、前記組換えラルストニア・ユートロファにｐｒｏＣ遺伝子を導入することも含む。特に、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子が前記組換えラルストニア・ユートロファに導入された安定なプラスミドに存在する場合、元のゲノムｐｈａＣ遺伝子を不活化させ、そして、元のゲノムｐｒｏＣ遺伝子を不活化させながら、前記組換えラルストニア・ユートロファ内の安定なプラスミドにｐｒｏＣ遺伝子を導入し、その不活化方法は、変異、置換、置き換え又はノックアウトを含んでもよく、好ましくは、ｐｒｏＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドを構築することで不活化を行い、具体的な元のゲノムｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号２が示すとおりであり、好ましくは、前記導入されたｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号４が示すとおりである。また、更に好ましくは、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子と導入されたｐｒｏＣ遺伝子は、同一のプラスミドに載せられる。
本発明の上記態様の好ましい実施形態では、前記出発菌株は、ラルストニア・ユートロファＨ１６であり、好ましくは、前記出発菌株は、ラルストニア・ユートロファＲｅ０９８０である。
本発明の上記態様の好ましい実施形態では、前記方法は、以下のステップを含む。
（１）ラルストニア・ユートロファを出発菌株として、元のゲノムｐｈａＣ遺伝子とｐｒｏＣ遺伝子をノックアウトするステップ、
（２）前記ラルストニア・ユートロファのゲノムに、ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターを導入するステップ、及び
（３）ラルストニア・ユートロファ内に安定に存在するプラスミドを導入するステップ。
好ましくは、前記ノックアウトは、それぞれ、ｐｈａＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドとｐｒｏＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドを構築することで行われ、具体的には、前記元のゲノムｐｈａＣ遺伝子の配列は、配列番号１が示すとおりであり、かつ具体的には、前記元のゲノムｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号２が示すとおりである。
好ましくは、前記ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターの配列は、ｐｈａＪ４３プロモーター配列である配列番号３である。
前記プラスミドに、導入されたｐｈａＣ変異遺伝子及び／又は導入されたｐｒｏＣ遺伝子が載せられており、好ましくは、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の配列は、配列番号５が示すとおりであり、好ましくは、前記導入されたｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号４が示すとおりである。
より好ましくは、前記出発菌株は、ラルストニア・ユートロファＲｅ０９８０である。
本発明は、さらに、ＰＨＡ及び／又はＰＨＢを製造するための組換えラルストニア・ユートロファの使用を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、ＰＨＡ及び／又はＰＨＢを製造するための、本明細書に記載の組換えラルストニア・ユートロファ又は本明細書に記載の方法により製造された組換えラルストニア・ユートロファの使用を提供する。
本発明は、さらに、本明細書に記載の組換えラルストニア・ユートロファ又は本明細書に記載の方法により製造された組換えラルストニア・ユートロファを用いて、発酵によりＰＨＡ又はＰＨＢを得るステップを含む、ＰＨＡ及び／又はＰＨＢの製造方法を提供する。
各菌株の培養結果を示す図である。
特に断りがない限り、本発明の実践では、本技術分野の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び合成生物学などの通常の技術を採用する。このような技術は、下記の文献において十分に説明されている：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９８７、定期的に更新）；「ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編集、１９９４）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ第２版、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９４）、及びＭａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、 Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９２）。これらは、当業者に、本願で使用される多くの用語の一般的なガイドラインを提供する。
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的・科学的用語は、本発明が属する分野の一般的な技術者の通常の理解と同じ意味を持つ。本発明の目的のために、以下の用語を下記のように定義する。
本明細書において、「１つ／１種（ａ／ａｎ）」および「当該／前記（ｔｈｅ）」といった冠詞は、前記冠詞の文法目的語が１つ／１種以上（すなわち、少なくとも１つ／１種）であることを指すために使用されるものである。例えば、「要素」とは、１つ／１種以上の要素を意味する。
代替（例えば：「または」）の使用は、代案のいずれか１つ、２つ、またはその任意の組み合わせを意味するものと理解されるべきである。
「及び／又は」という用語は、代案のいずれかまたは両方を意味するものと理解されるべきである。
本明細書で使用されるように、「約」または「ほぼ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数量、頻度、百分率、スケール、サイズ、量、重量または長さに対して、最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％変更した数量、レベル、値、数量、頻度、百分率、スケール、サイズ、量、重量または長さを意味する。１つの実施形態において、「約」または「ほぼ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数量、頻度、百分率、スケール、サイズ、量、重量または長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の数量、レベル、値、数量、頻度、百分率、スケール、サイズ、量、重量または長さを意味する。
本明細書で使用されるように、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ／ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、基準の数量、レベル、値、数量、頻度、百分率、スケール、サイズ、量、重量または長さに対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％或いはより高い数量、レベル、値、数量、頻度、百分率、スケール、サイズ、量、重量または長さを意味する。１つの実施形態において、「実質的に同じ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数量、頻度、百分率、スケール、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じ数量、レベル、値、数量、頻度、百分率、スケール、サイズ、量、重量または長さを意味する。
本明細書で使用されるように、「実質的に含まない」という用語は、細胞集団または培地のような組成物の記述に使用される場合、特定の物質を含まないことを意味する。例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％で特定の物質を含まず、或いは常法で測定できないことを意味する。「存在しない」という用語も同義であり、組成物の特定の物質または成分が存在しないことを意味する。
本明細書の全文において、特に要求がない限り、「包含する」、「含む」、「含有する」、および「有する」という用語は、前記ステップや要素、又はステップ群や要素群を含むことを示唆するものと理解されるべきであるが、他のステップや要素、又はステップ群や要素群を除外するものではない。特定の実施形態では、「包含する」、「含む」、「含有する」、および「有する」という用語は、同義で使用される。
「からなる」とは、「からなる」という記述の前のすべてのものを含み、かつそれらに限られることを意味する。よって、「からなる」という記述は、挙げられた要素が必須または強制的であり、かつ他の要素が存在してはいけないことを意味する。
「実質的に…からなる」とは、「実質的に…からなる」という記述において挙げられた要素をいずれも含み、かつ他の要素が、挙げられた要素に係る開示内容で規定されたアクティビティや動作を干渉しないまたはそれに寄与するものに限られることを意味する。よって、「実質的に…からなる」という記述とは、挙げられた要素が必須または強制的であって、他の要素が任意ではなく、それらの有無が挙げられた要素のアクティビティまたは動作に影響を与えるかによることを意味する。
本明細書の全文において、「１つの実施形態」、「いくつかの実施形態」、「１つの具体的な実施形態」などの類似表現は、前記実施形態と組み合わせて説明される特定の特徴、構造や特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、これらの用語は、本明細書の全文の各箇所におけるこれらの用語が必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。また、特定の特徴、構造や特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方式で組み合わせることができる。
本発明の特定の態様（例えば、本発明の製品）に係る特徴が開示された場合、このような開示は、本発明の他の如何なる態様（例えば、本発明の方法および使用）にも適用可能であり、そして、必要な修正がなされる。
本発明の目的を達成するための、本発明が提供する解決案のポイントは、以下の通りである。
ラルストニア・ユートロファの元のｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流にはプロモーターが無いが、本発明者は、外来プロモーターを挿入することでｐｈａＪ４ｂ遺伝子の過剰発現が可能となり、ＰＨＢＨＨｘにおけるＨＨｘの割合を高めることができることを見出した。例えば、ラルストニア・ユートロファのゲノムには、相同組換えによって、特定のプロモーターを有するプラスミドを用いて、ｐｈａＪ遺伝子の上流に特定のプロモーター配列を挿入してｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションする。
一方、ラルストニア・ユートロファの元のｐｈａＣ遺伝子はＰＨＢＨＨｘを合成できない。ＰＨＢＨＨｘの合成、特に、油脂を炭素源とするＰＨＢＨＨｘの合成との目的を達成するためには、ｐｈａＣ変異遺伝子を導入する必要がある。
前記ｐｈａＣ変異遺伝子について、２つの方式でラルストニア・ユートロファに導入して安定に発現させることができる。
（１）元のゲノムｐｈａＣ遺伝子を不活化させ、ｐｈａＣ変異遺伝子を相同組換えによってゲノムに組み込む；又は
（２）元のゲノムｐｈａＣ遺伝子を不活化させ、ｐｈａＣ変異遺伝子を持つプラスミドを構築して組換え細菌の形質転換を行う。
プラスミドの安定な発現は、プラスミドに菌株の成長に必要な遺伝子を持たせるとともに、ゲノムにおける当該合成遺伝子を不活化させることによって達成することができる。前記必要な遺伝子は、例えばｐｒｏＣ遺伝子であっても良い。
より具体的には、本発明は、ゲノムにおける元のゲノムｐｈａＣ遺伝子とｐｒｏＣ遺伝子がノックアウトされ、ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターが導入されるとともに、ラルストニア・ユートロファ内に安定に存在する、ｐｈａＣ変異遺伝子及びｐｒｏＣ遺伝子が載せられたプラスミドが導入されたラルストニア・ユートロファ変異菌株を提供する。
本発明の他の目的は、ＰＨＢＨＨｘ生産量の高い菌株の構築方法を提供することであり、そのステップは、以下の通りである。
１、ｐｈａＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドを構築し、ラルストニア・ユートロファ内のｐｈａＣ遺伝子をノックアウトする。ノックアウトされる遺伝子の配列は、具体的に配列番号１が示すとおりである。
２、ｐｒｏＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドを構築し、更にステップ１におけるラルストニア・ユートロファ内のゲノムｐｒｏＣ遺伝子をノックアウトする。ノックアウトされる遺伝子の配列は、具体的に配列番号２が示すとおりである。
３、ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーター配列を設計し、ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターを挿入するためのプラスミドを構築し、更にステップ２で得られるラルストニア・ユートロファを改造し、設計したｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターを挿入する。挿入される遺伝子の配列は、具体的に配列番号３が示すとおりである。
４、外来ｐｈａＣ変異遺伝子とｐｒｏＣ遺伝子を持つ安定なプラスミドを構築し、ステップ３にけるラルストニア・ユートロファに取り込み、完全なＰＨＢ経路を補完して構築する。
また、本発明は上記のように生産されたＰＨＢＨＨｘ菌株を用いて製造されたポリマーを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明のＰＨＡ生産に用いられる微生物は、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）又はその近縁菌である。１つの具体的な実施形態では、本発明のＰＨＡ生産に用いられる微生物は、ラルストニア・ユートロファＨ１６又はラルストニア・ユートロファＨ１６から誘導されたものである。
更に、本発明は、上記のような遺伝子組み換え手段により得られた新規な菌株ＢＰＳ－０５０を提供する。当該菌株ＢＰＳ－０５０は、受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３６００として、２０２１年１０月１３日にＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒに受託された。
菌株ＢＰＳ－０５０の形態学的特徴について、ＬＢ固体培地上で観察する場合、コロニーは薄い黄色で、辺縁が整っており、滑らかで湿っていて、強い臭いがある。顕微鏡検査で観察した結果、当該菌株は、グラム陰性で、短棒状かつ無胞子性のものであった。
菌株ＢＰＳ－０５０の１６ｓ ＲＮＡ配列は：ＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＡＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＣＣＣＴＧＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＣＴＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＴＴＡＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＡＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＴＣＴＧＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＡＡＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＡＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＧＣＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＡＡＴＡＣＣＣＧＧＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＴＧＣＧＡＧＣＧＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＧＴＡＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＣＧＣＴＴＧＴＧＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＡＧＴＡＴＧＴＣＡＧＡＧＧＧＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＡＡＡＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＴＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＧＴＡＡＣＧＴＡＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＡＡＣＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＴＡＧＧＴＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣＴＣＴＡＧＴＴＧＣＴＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＴＡＴＧＧＧＴＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴＡＣＡＡＴＧＧＴＧＣＧＴＡＣＡＧＡＧＧＧＴＴＧＣＣＡＡＣＣＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＡＧＣＴＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＴＣＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＴＡＧＣＣＴＡＡＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＡＣＣＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＣＴＡＴＣＣである。
いくつかの実施形態では、ラルストニア・ユートロファにおける元のゲノムｐｈａＣ遺伝子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％或いは前述数値のいずれか２つで構成される範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、実質的にこれらのヌクレオチド配列からなるか、或いはこれらのヌクレオチド配列からなってもよい。
いくつかの実施形態では、ラルストニア・ユートロファに導入されるｐｈａＣ変異遺伝子は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号５と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％或いは前述数値のいずれか２つで構成される範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、実質的にこれらのヌクレオチド配列からなるか、或いはこれらのヌクレオチド配列からなってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｐｒｏＣは、ラルストニア・ユートロファのゲノムにおけるｐｈａＣである。いくつかの実施形態では、ラルストニア・ユートロファにおけるｐｒｏＣ遺伝子は、配列番号２で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号２と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％或いは前述数値のいずれか２つで構成される範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、実質的にこれらのヌクレオチド配列からなるか、或いはこれらのヌクレオチド配列からなってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書においてラルストニア・ユートロファに導入されるｐｒｏＣ遺伝子は、配列番号４で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号４と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％或いは前述数値のいずれか２つで構成される範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、実質的にこれらのヌクレオチド配列からなるか、或いはこれらのヌクレオチド配列からなってもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で用いられるプロモーターｐｈａＪ４３配列は、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、又は配列番号３と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％或いは前述数値のいずれか２つで構成される範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、実質的にこれらのヌクレオチド配列からなるか、或いはこれらのヌクレオチド配列からなってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明で用いられる１種以上の酵素は、本明細書に記載される酵素の変異体（ｍｕｔａｎｔ）または変種（ｖａｒｉａｎｔ）であってもよい。本明細書で用いられる「変異体」や「変種」とは、元の配列の生物学的活性と同一または実質的に同一の生物学的活性を保持している分子を意味する。当該変異体又は変種は、同じまたは異なるものに由来するものであってもよく、または天然分子または既存の分子に基づく合成配列であってもよい。いくつかの実施形態では、「変異体」と「変種」という用語は、ポリペプチドが有するアミノ酸配列が、対応する野生型ポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸において異なることを意味する。例えば、変異体や変種は、保存的置換を含んでもよく、すなわち、対応する元のアミノ酸を相似性質のアミノ酸に置き換えてもよい。保存的置換は、極性アミノ酸に対する極性アミノ酸の置換（グリシン（Ｇ，Ｇｌｙ）、セリン（Ｓ，Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔ，Ｔｈｒ）、チロシン（Ｙ，Ｔｙｒ）、システイン（Ｃ，Ｃｙｓ）、アスパラギン（Ｎ，Ａｓｎ）、およびグルタミン（Ｑ，Ｇｌｎ））；非極性アミノ酸に対する非極性アミノ酸の置換（アラニン（Ａ，Ａｌａ）、バリン（Ｖ，Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｗ，Ｔｒｐ）、ロイシン（Ｌ，Ｌｅｕ）、プロリン（Ｐ，Ｐｒｏ）、メチオニン（Μ，Ｍｅｔ）、およびフェニルアラニン（Ｆ，Ｐｈｅ））；酸性アミノ酸に対する酸性アミノ酸の置換 （アスパラギン酸 （Ｄ，Ａｓｐ）、グルタミン酸 （Ｅ， Ｇｌｕ）；塩基性アミノ酸に対する塩基性アミノ酸の置換（アルギニン（Ｒ，Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈ，Ｈｉｓ）、リジン（Ｋ，Ｌｙｓ））；電荷性アミノ酸に対する電荷性アミノ酸の置換（アスパラギン酸（Ｄ，Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ，Ｇｌｕ）、ヒスチジン（Ｈ，Ｈｉｓ）、リジン（Ｋ，Ｌｙｓ）、およびアルギニン（Ｒ，Ａｒｇ））；及び、疎水性アミノ酸に対する疎水性アミノ酸の置換（アラニン（Ａ，Ａｌａ）、ロイシン（ＵＬｅｕ）、イソロイシン（Ｉ，Ｉｌｅ）、バリン（Ｖ，Ｖａｌ）、プロリン（Ｐ，Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｆ，Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｗ，Ｔｒｐ）、およびメチオニン（Ｍ，Ｍｅｔ））であってもよい。いくつかの他の実施形態では、変異体又は変種は、非保存的置換を含んでも良い。
いくつかの実施形態では、変異体又は変種ポリペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個以上又は前述数値のいずれか２つで構成される範囲のアミノ酸の置換、付加、挿入又は欠失を有しても良い。変化されていない酵素に対して、変異体又は変種は、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％或いは前述数値のいずれか２つで構成される範囲の活性を有しても良い。酵素活性は、当該技術分野における公知の通常技術、例えば酵素比色法によって測定することができる。
当業者に周知されているように、ポリペプチド（例えば、酵素）をコードするヌクレオチド配列における１つ以上のコード用ヌクレオチド（すなわちコドン）を、宿主においてより良好に発現されるもう一つのコドンに置換することで、宿主における異種核酸の発現を改善できる（すなわちコドンの最適化）。このような効果が生じる理由の一つとして、異なる生物が異なるコドンに対して好みを示すためである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチド（例えば、酵素）をコードするヌクレオチド配列は、得られるヌクレオチド配列が特定の宿主に対するコドンの好みを反映するように修飾または最適化される。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、もう一つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドとが規定の百分率で「配列同一性」または「同一性」を有することは、２つの配列を対比すると、当該百分率の塩基またはアミノ酸が同一で、且つ同じ相対位置にあることを意味する。２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の同一性の百分率の同定には、２つの配列の相応位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを対比・比較することが含まれても良い。２つの配列の全ての位置が同じアミノ酸残基またはヌクレオチドに占有される場合、当該２つの配列は１００％同一であると見なされる。配列の同一性は、様々な方式で確定することができる。例えば、様々な方法およびコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ－ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴなど）を用いて配列を対比することができる。
本発明のいくつかの実施形態は、ｐｈａＪ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を含む発現構築物、例えば、プラスミドのようなベクターに関する。好ましくはｐｈａＪ遺伝子プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物である。前記ｐｈａＪ遺伝子プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、前記の通りである。好ましくは、前記発現構築物は、プラスミドである。好ましくは、前記発現構築物はラルストニア・ユートロファにおけるｐｈａＪ遺伝子プロモーターの発現に用いることができる。好ましくは、前記発現構築物はラルストニア・ユートロファＨ１６におけるｐｈａＪ遺伝子プロモーターの発現に用いられる。
本発明のいくつかの実施形態は、１個以上のｐｈａＣ及び／又はｐｒｏＣをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物、例えば、プラスミドのようなベクターに関する。好ましくは１個以上のｐｈａＣ及び／又はｐｒｏＣをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物である。前記ｐｈａＣ及び／又はｐｒｏＣをコードするヌクレオチド配列は、前記の通りである。好ましくは、前記発現構築物は、プラスミドである。好ましくは、前記発現構築物はラルストニア・ユートロファにおけるｐｈａＣ及び／又はｐｒｏＣの発現に用いることができる。好ましくは、前記発現構築物はラルストニア・ユートロファＨ１６におけるｐｈａＣ及び／又はｐｒｏＣの発現に用いられる。より好ましくは、ｐｈａＣ及びｐｒｏＣの発現に用いられる。
微生物に対する遺伝子操作は、前記微生物において所望の酵素を発現させることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現構築物は、所望の酵素を発現させるために、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により宿主微生物に導入される。前記形質転換は、当分野での公知の方法で行うことができる。例えば、本明細書に記載のｐｈａＪ遺伝子プロモーター、ｐｈａＣ及び／又はｐｒｏＣをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドは、ｐｈａＪ遺伝子プロモーター、ｐｈａＣ及び／又はｐｒｏＣを発現させるために、形質転換によりラルストニア・ユートロファに導入される。形質転換は、アグロバクテリウム媒介形質転換、プラスミドＤＮＡによるエレクトロポレーション、ＤＮＡ取り込み、遺伝子銃による形質転換、ウイルス媒介形質転換、またはプロトプラスト形質転換であってもよいが、これらに限定されない。形質転換は、特定の宿主に適用される他の任意の形質転換方法であってもよい。
所望の目的を達成するために宿主微生物において所望の酵素を発現させることは、上記のように、宿主微生物において前記酵素をコードする発現構築物の形質転換を行うことで達成させることができるが、前記酵素をコードする発現構築物を種々な方式で前記宿主微生物のゲノム配列に組み込むことで、又は前記宿主微生物における元の酵素をコードする遺伝子の転写および／または発現を種々な方式で増大させることで達成させることもできる。例えば、プロモーターのようなより強力な調節因子を用いることで達成させることができる。このような方式は、大体、当業者に熟知されているものである。
微生物に対する遺伝子操作は、前記微生物における所望のタンパク質の機能を干渉すること、例えば、前記タンパク質の発現を減少または排除することを含んでもよい。これは、例えば、前記微生物において所望のゲノム配列の欠失、置換またはノックアウトによって達成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の微生物におけるゲノムｐｈａＣ及び／又はｐｒｏＣ遺伝子は、欠失、置換又はノックアウトされる。いくつかの実施形態では、欠失、置換又はノックアウトされたｐｈａＣ遺伝子の配列は、配列番号１が示すとおりである。いくつかの実施形態では、欠失したｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号２が示すとおりである。好ましくは、前記ゲノムｐｈａＣ及び／又はｐｒｏＣ遺伝子の不活化はノックアウトによって実現される。
微生物における所望のゲノム配列の欠失以外、当該技術分野で公知の他の方法で所望のタンパク質の機能を干渉することができる。所望のタンパク質をコードするゲノム配列の転写への干渉、所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現への干渉、所望のタンパク質の送達への干渉、例えば細胞外への送達への干渉が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、所望のタンパク質をコードするゲノム配列またはその調節因子（例えばプロモーター）の全部または一部を欠失させ、所望のタンパク質をコードするゲノム配列またはその調節因子（例えばプロモーター）の途中に、その転写に影響を与える１つ以上のヌクレオチド（例えば、終止コドン）を挿入し、またはその１つ以上のヌクレオチドをゲノム配列が正常に転写できない程度に変異させる方法；ｓｉＲＮＡやｄｓＲＮＡｉ試薬のような、所望のタンパク質をコードするｍＲＮＡを干渉またはサイレンスする試薬を導入したり、所望のタンパク質の、例えば細胞外の系（例えば、シャペロンタンパク質、シグナル配列、トランスポータータンパク質）への送達を抑制または停止させる方法が含まれるが、これらに限定されない。
宿主培養用の適宜な培地は、標準培地（例えば、１種以上の他の試薬（例えば、誘導剤）が補充されてもよいＬＢ培地、標準酵母培地など）を含んでも良い。いくつかの実施形態では、培地には、発酵性糖（例えば、ヘキソース、例えばグルコース、キシロース等）が補充されていてもよい。いくつかの実施形態では、適宜な培地には、誘導剤が含まれている。このようなある実施形態では、誘導剤には、ラムノースが含まれている。
宿主培養用の適宜な培地における炭素源は、グルコースのような単純な糖ないし酵母エキスのような他のバイオマスであるより複雑な加水分解物などの、異なるものであってもよい。塩の添加は、通常、細胞がポリペプチドおよび核酸を合成するための、マグネシウム、窒素、リンおよび硫黄のような必須元素を提供する。適宜な培地には、特定のプラスミドを選択的に維持するために、抗生物質のような選択的試薬がさらに補充されていてもよい。例えば、微生物がアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンのような特定の抗生物質に耐性を有する場合、これらの抗生物質を培地に添加して、耐性に乏しい細胞の増殖を防ぐことができる。適宜な培地には、所望の生理的または生化学的特性を選択するために、必要に応じて他の化合物、例えば、特定のアミノ酸が補充されていてもよい。
本明細書では、例えば、本発明の微生物の維持及び増殖に適用される材料及び方法を実施例で説明する。
小規模生産の場合、遺伝子操作された微生物を、例えば、約１００ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、５Ｌまたは１０Ｌのスケールでバッチで成長、発酵させ、ｐｈａＣおよび／またはｐｒｏＣをコードするヌクレオチド配列のような所望のヌクレオチド配列の発現を誘導し、および／またはＰＨＡおよび／またはＰＨＢのような所望の発酵産物を合成することができる。大量生産の場合、遺伝子操作された微生物を、約１０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ以上のスケールでバッチで成長、発酵させ、ｐｈａＣおよび／またはｐｒｏＣをコードするヌクレオチド配列のような所望のヌクレオチド配列の発現を誘導し、および／またはオリベトールおよび／またはオリベトリン酸のような所望の発酵産物を合成することができる。
培養過程中の１つ以上の時刻における濃度は、所望の発酵物をクロマトグラフィ、好ましくは、ＨＰＬＣにより分離し、発酵物の分析を行うことで同定できる。微生物培養物および発酵物は、光度測定方法（吸収、蛍光）によって検出することができる。
本明細書に記載の遺伝子操作された微生物は、ＰＨＡの生産量の増加を達成した。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された微生物は、適宜な遺伝子操作されなかった、または部分的に遺伝子操作された微生物対照に比べ、ＰＨＡ生産において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００倍以上、或いは前述数値のいずれか２つで構成される範囲のより高い生産量を達成した。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された微生物は、オリベトールおよび／またはオリベトリン酸の生産において、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００ ｍｇ／Ｌ以上、或いは前述数値のいずれか２つで構成される範囲の生産量を達成した。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、ここで提供される実施例は、説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。
特に説明がない限り、以下の実施例で使用される実験方法は、いずれも通常の方法である。
特に説明がない限り、以下の実施例で使用される材料、試薬などは、いずれも商業ルートから入手可能である。
酵素試薬は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社から購入されたものであり、プラスミドを抽出するためのキットは、ＴＩＡＮＧＥＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入されたものであり、ＤＮＡ断片を回収するためのキットは、米国ｏｍｅｇａ社から購入されたものであり、相応の操作手順は、製品の取り扱い説明書に準じて厳密に行った。特に説明がない限り、培地はいずれも脱イオン水で製造したものである。
培地の処方：
ＬＢ培地：酵母エキス（英国ＯＸＩＤ社から購入、カタログ番号ＬＰ００２１）５ｇ／Ｌ、ペプトン（英国ＯＸＩＤ社から購入、カタログ番号ＬＰ００４２）１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、残りが水である。ｐＨは、７．０～７．２までに調整され、高圧蒸気滅菌も行われた。
シェイクフラスコ発酵培地：パーム油１％、ＮＨ４Ｃｌ １ｇ／Ｌ、微量元素溶液Ｉ １０ｍＬ／Ｌ、及び微量元素溶液ＩＩ １ｍＬ／Ｌ。そのうち、微量元素溶液Ｉの組成は、ＭｇＳＯ４ ２０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ２ｇ／Ｌである。微量元素溶液ＩＩの組成は、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １００ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ３００ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌである。上記試薬は、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入されたものである。
種子培地Ｉ：ペプトン １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、グルコース ３ｇ／Ｌ。
種子培地ＩＩ：パーム油 ０．１５％、ペプトン １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ。
生産培地：パーム油 １．０％、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ９．８５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １．５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ ３．０ｇ／Ｌ、微量元素溶液Ｉ １０ｍＬ／Ｌ、及び微量元素溶液ＩＩ １ｍＬ／Ｌ。そのうち、微量元素溶液Ｉの組成は、ＭｇＳＯ４ ２０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ２ｇ／Ｌである。微量元素溶液ＩＩの組成は、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １００ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ３００ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌである。そのうち、上記試薬は、いずれもＳｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入されたものである。
実施例１：ＢＰＳ－０５０の構築
Ｓ１、ラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣの構築
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｒｅ０９８０を出発菌株として、ラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣを構築した。
前記Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｒｅ０９８０（以下、Ｒｅ０９８０と略す）は、ゲノムｐｈａＣ遺伝子がノックアウトされたラルストニア・ユートロファであり、即ちラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣであり、当該組換えラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）菌株Ｒｅ０９８０は、２０２１年１２月３１日にＧｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ （ＧＤＭＣＣ）（住所：広州市先烈中路１００号院５９号ビル５階、広東省科学院微生物研究所、郵便番号：５１００７０）に受託され、受託番号がＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６２１７７である。
Ｒｅ０９８０ゲノムをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行うことで、ｐｒｏＣ遺伝子の上流及び下流と相同な断片ｐｒｏＣ－Ｈ１及びｐｒｏＣ－Ｈ２を得、ｐｒｏＣ ＦｐおよびｐｒｏＣ ＲｐをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によりベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｐｒｏＣを得た。使用したプライマーは、以下の通りである。
組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ΔｐｒｏＣを大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに接合形質転換法によりラルストニア・ユートロファに導入し、自殺プラスミドが宿主菌内で複製できない特性を利用して、カナマイシン２００μｇ／ｍＬ、アプラマイシン１００μｇ／ｍＬ、０．２％プロリンを同時に含むＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングした。相同な断片を有する組換えプラスミドがゲノム上のＨ１およびＨ２が存在する特定の位置に組み込まれた当該陽性クローンを、第一の相同組換え菌とした。
第一の相同組換え菌をスクロース１００ｍｇ／ｍＬを含む０．２％プロリン含有ＬＢプレート上に画線状に塗布して、単一のクローンを培養し、これらの単一のクローンからカナマイシン耐性のないクローンをスクリーニングし、プライマーｐｒｏＣ ＦｐとｐｒｏＣ ＲｐによるＰＣＲによりｐｒｏＣ遺伝子がノックアウトされた組換え菌を同定し、得られた組換え菌はラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣである。
Ｓ２、ｐｈａＣ変異遺伝子及びｐｒｏＣ遺伝子を含む安定なプラスミドの構築
ラルストニア・ユートロファで安定に遺伝できるプラスミドを構築し、その上にｐｒｏＣ遺伝子とｐｈａＣ変異遺伝子を載せた。具体的な操作は下記の通りである。
ＢｓａＩリンカー配列を持つｐｒｏＣ遺伝子を遺伝子合成し、具体的に合成された配列は配列番号４が示すとおりである。
ＢｓａＩリンカー配列を持つｐｈａＣ変異遺伝子を遺伝子合成し、具体的に合成された配列は配列番号５が示すとおりである。
ＢｓａＩリンカー配列を持つｐＳＰプラスミドを遺伝子合成し、具体的に合成された配列は配列番号６が示すとおりである。
上記３つのプラスミドについて、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ組み立てを行い、ｐｈａＣ変異遺伝子およびｐｒｏＣ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＳＰ－Ｂ－ｐｈａＣ－ｐｒｏＣを得た。
Ｓ３、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流に特定のプロモーターが挿入された組換え菌の構築
ステップ１：Ｓ１で得られたラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、ｐｈａＪ－Ｈ１ Ｆｐ、ｐｈａＪ－Ｈ１ Ｒｐを用いてｐｈａＪ遺伝子プロモーターの上流と相同な断片Ｈ１を得た。また、ｐｈａＪ－Ｈ２ Ｆｐ、ｐｈａＪ－Ｈ２ Ｒｐを用いて、ｐａＪ遺伝子プロモーターの上流と相同な断片Ｈ２を得た。
ステップ２：ｐｈａＪ遺伝子のプロモーターｐｈａＪ４３を遺伝子合成した。
ｐｈａＪ４３：
ＡＴＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＧＴＣＡＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＣＧＴＴＣＡＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＣＧＡＴＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡ。
ステップ３：ＰＣＲにより得られたＨ１、Ｈ２、およびｐｈａＪ４３プロモーターをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によりベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＪ４３を得た。使用したプライマーは、以下の通りである。
ステップ４：組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＪ４３を大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに接合形質転換法によりラルストニア・ユートロファに導入し、自殺プラスミドが宿主菌内で複製できない特性を利用して、カナマイシン２００μｇ／ｍＬとアプラマイシン１００μｇ／ｍＬを同時に含む０．２％プロリン含有ＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングした。相同な断片を有する組換えプラスミドがゲノム上のＨ１およびＨ２が存在する特定の位置に組み込まれた当該陽性クローンを、第一の相同組換え菌とした。
第一の相同組換え菌をスクロース１００ｍｇ／ｍＬを含む０．２％プロリン含有ＬＢプレート上に画線状に塗布して、単一のクローンを培養し、これらの単一のクローンからカナマイシン耐性のないクローンをスクリーニングし、プライマーｐｈａＪ ＦｐとｐｈａＪ ＲｐによるＰＣＲにより相応のサイズの組換え菌を同定し、得られた組換え菌は、ラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣ ｐｈａＪ４３である。
Ｓ４、ｐｈａＪプロモーターが挿入された変異株への安定なプラスミドｐＳＰ－Ｂ－ｐｈａＣ－ｐｒｏＣの導入
Ｓ２で構築された組換えプラスミドｐＳＰ－Ｂ－ｐｈａＣ－ｐｒｏＣを、大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに接合形質転換法によりＳ３で構築されたラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣ ｐｈａＪ４３に導入し、カナマイシン２５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングして、組換えラルストニア・ユートロファを得た。この菌株をＢＰＳ－０５０とし、Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒに受託され、受託番号がＣＧＭＣＣ ２３６００である。当該クローンは、設計された安定なプラスミドを含むものとなり、また、培地にプロリンをさらに補充する必要がない。
ＬＢ固体培地上で観察したところ、コロニーは、薄い黄色で、辺縁が整っており、滑らかで湿っていて、強い臭いがある。顕微鏡検査で観察した結果、当該菌株は、グラム陰性で、短棒状かつ無胞子性のものである。
さらに、当該菌株の１６ｓ ＲＮＡをシークエンシングしたところ、１６ｓ ＲＮＡの配列は、前記の通りである。
実施例２：ゲノムにおけるｐｈａＣ変異遺伝子を発現する菌株の構築
２０ｂｐのホモロジーアーム配列を持つｐｈａＣ変異遺伝子を遺伝子合成し、具体的に合成された配列は配列番号７が示すとおりである。Ｇｉｂｓｏｎ連結により、ｐｈａＣ－Ｈ１、ｐｈａＣ変異遺伝子、ｐｈａＣ－Ｈ２をｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドに連結させて、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＣを得た。
構築された組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＣを大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに接合形質転換法によりｐｈａＣ遺伝子がノックアウトされたＨ１６菌株に導入し、カナマイシン２５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングし、組換えラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃを得た。それをＧ－０とした。
実施例３：組換えラルストニア・ユートロファの構築
本実施例は、実施例２をもとに、実施例１のＳ３と同様な導入方法により、ｐｈａＪ４３プロモーターを導入し、組換えラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ ｐｈａＪ４３を得た。それをＧ－４３とした。
比較例１～３：
比較例１～３と実施例１の差異は、下記の通りである。
（１）Ｓ３のステップ２において、それぞれ、ｐｈａＪ遺伝子のプロモーターｐｈａＪ２１０、ｐｈａＪ１８３、及びｐｈａＪ２２５を合成した。
ｐｈａＪ２１０（配列番号８）：
ＡＴＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＧＴＣＡＣＡｔｃｃｔｇｔｔｇｃｇｔＴＣＡＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡｇｔａｔＡＣＡＧｔＴＴＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＡａＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡ
ｐｈａＪ１８３（配列番号９）：
ＡＴＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＧＴＣＡＣＡｔｃｃｔｇｔｔｇｃｇｔＴＣＡＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡｇｔａｔａｇｃａｔＴＴＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＡａＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡ
ｐｈａＪ２２５（配列番号１０）：
ＡＴＧＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＧＴＣＡＣＡｔｃｃｔｇｔｔｇｃｇｔＴＣＡＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡｇｔａｔａｃｃｃｔＴＴＧＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣＡａＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡ。
（２）Ｓ３のステップ３において、ＰＣＲにより得られたＨ１及びＨ２を、それぞれ、ｐｈａＪ２１０、ｐｈａＪ１８３、及びｐｈａＪ２２５プロモーターと、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によりベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＪ２１０、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＪ１８３、及びｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＪ２２５を得た。
（３）Ｓ３のステップ４において、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＪ２１０、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＪ１８３、及びｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｐｈａＪ２２５を、それぞれ、大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに接合形質転換法によりラルストニア・ユートロファに導入し、自殺プラスミドが宿主菌内で複製できない特性を利用して、カナマイシン２００μｇ／ｍＬとアプラマイシン１００μｇ／ｍＬを同時に含む０．２％プロリン含有ＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングした。相同な断片を有する組換えプラスミドがゲノム上のＨ１およびＨ２が存在する特定の位置に組み込まれた当該陽性クローンを、第一の相同組換え菌とした。
第一の相同組換え菌をスクロース１００ｍｇ／ｍＬを含む０．２％プロリン含有ＬＢプレート上に画線状に塗布して、単一のクローンを培養し、これらの単一のクローンからカナマイシン耐性のないクローンをスクリーニングし、プライマーｐｈａＪ ＦｐとｐｈａＪ ＲｐによるＰＣＲにより相応のサイズの組換え菌を同定し、得られた組換え菌は、ラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣ ｐｈａＪ２１０、ＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣ ｐｈａＪ１８３、ＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣ ｐｈａＪ２２５である。
（４）Ｓ４において、Ｓ２で構築された組換えプラスミドｐＳＰ－Ｂ－ｐｈａＣ－ｐｒｏＣを、大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに接合形質転換法により、それぞれ、Ｓ３で構築されたラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣ ｐｈａＪ２１０、ＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣ ｐｈａＪ１８３、ＲｅΔｐｈａＣΔｐｒｏＣ ｐｈａＪ２２５に導入し、カナマイシン２５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングし、組換えラルストニア・ユートロファを得た。これらの菌株をＰ－２１０、Ｐ－１８３、Ｐ－２２５とした。
実験例１：シェイクフラスコによる変異株の発酵能力の測定
実施例１～３、比較例１～３で得られた形質転換体について、平板画線を行い、変異株の単一のクローンを得、単一のクローンを種子培地（４ｍｌ）に接種し、１２時間培養した。一晩培養した菌液をＬＢ活性化培地１０ｍＬが充填された１００ｍＬガラス製三角フラスコに移植し、接種終了時のＯＤ量が約０．１となるように、３０℃、２００ｒｐｍで、８時間培養することで、移植・培養を行った。ポリエステル生産培養では、ＯＤ値が６～７の前培養種子を、発酵培地３０ｍｌが充填された２５０ｍｌシェイクフラスコに０．１ＯＤで接種した後、３００μｌのパーム油と規定の量の乳化剤を添加した。４８時間後に発酵を停止し、発酵液を採取して遠心分離して菌体を得た。菌体を一定の重量となるように乾燥させた。
乾燥菌体の重量を測定して、乾燥重量とした。得られた乾燥菌体にクロロホルム１００ｍｌを加え、室温で１昼夜攪拌し、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣を濾別した後、全容積が約３０ｍｌとなるようにエバポレーターで濃縮させ、その後、約９０ｍｌのヘキサンをゆっくり添加し、ゆっくり攪拌しながら１時間放置した。析出したポリエステルを濾別した後、５ＣＴＣで３時間真空乾燥した。乾燥ポリエステルの質量を測定し、菌体内のポリエステル含有量を算出した。
各菌株の測定結果を下記表１に示す。
シェイクフラスコによる測定結果によれば、Ｐ４３プロモーターを用いた後、Ｇ－４３およびＢＰＳ－０５０の代謝産物における３ＨＨｘの割合が顕著に増加するとともに、菌株の発酵能力が対照菌株Ｇ－０より高く、プラスミドバージョンを用いてｐｈａＣ変異遺伝子およびｐｒｏＣ遺伝子を発現させた後、その発酵性能がさらに向上する余地があることが明らかとなった。他の理論上発現強度がより高いプロモーター配列を使用しても、それに応じて収量が高くなることはなく、細胞の乾燥重量は逆に低くなった。
実験例２：発酵タンクの試験
まず、グリセロールチューブに保存された実施例１及び実施例３の菌株（１０００μＬ）を種子培地Ｉ（２０ｍｌ）に接種し、種子の一次培養を１２時間行った。次に、１％の種子培養液Ｉを種子培地ＩＩに接種し、種子の二次培養を行った。その後、１０ｖ／ｖ％の種子培養液ＩＩを、１．１Ｌの生産培養基を含む２Ｌの小型発酵タンク（Ｔ＆Ｊ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）に接種した。操作条件は、培養温度３０℃、攪拌速度８００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／ｍｉｎであり、ｐＨを６．７～６．８とした。ｐＨ制御には２８％のアンモニア水溶液が用いられた。培養中、炭素源としてパーム油を継続的に使用し、培養時間は５４時間であった。
測定方式は実験例１と同様である。
各菌株の培養結果を図１及び表２に示す。
対照菌株Ｇ－０に比べ、遺伝子編集された組換え菌ＢＰＳ－０５０は、ある程度の３－ヒドロキシヘキサン酸の割合に達した上、細胞の乾燥重量が５．４９％[（２１２．７２－２０１．６４）／２０１．６４]向上し、ＰＨＡの割合が３．４１％[（８３．４８％－８０．７３％）／８０．７３％]向上した。対照菌株に比べ、顕著な向上が確認された。
ここで、本発明の好ましい実施形態を示して説明したが、このような実施形態が例示であることは、当業者にとって自明である。本発明の趣旨から逸脱しない範囲で行われた多様な変形、変更および置換は、現在当業者が想到し得るものである。本発明の実践において、ここに記載される本発明の実施形態の異なる代案を採用することができると理解されるべきである。

Claims (5)

  1. 組換えラルストニア・ユートロファであって、
    前記組換えラルストニア・ユートロファのゲノムに、ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターが導入されており、
    前記ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターの配列は、ｐｈａＪ４３プロモーター配列である配列番号３であり、
    前記組換えラルストニア・ユートロファのゲノムにおける元のｐｈａＣ遺伝子とｐｒｏＣ遺伝子は、不活化され、
    前記元のｐｈａＣ遺伝子の配列は、配列番号１が示すとおりであり、前記元のｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号２が示すとおりであり、
    前記組換えラルストニア・ユートロファには、更に、ラルストニア・ユートロファ内に安定に存在するプラスミドが導入されており、
    前記プラスミドに、導入されたｐｈａＣ変異遺伝子と導入されたｐｒｏＣ遺伝子が載せられており、
    前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の配列は、配列番号５が示すとおりであり、前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の発現によって、前記組換えラルストニア・ユートロファがポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）を合成し、前記導入されたｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号４が示すとおりであり、
    前記組換えラルストニア・ユートロファの出発菌株は、ラルストニア・ユートロファＲｅ０９８０であり、前記ラルストニア・ユートロファＲｅ０９８０の受託番号は、ＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６２１７７である、
    ことを特徴とする組換えラルストニア・ユートロファ。
  2. 前記元のｐｈａＣ遺伝子とｐｒｏＣ遺伝子の不活化は、元のゲノムｐｈａＣ遺伝子と元のゲノムｐｒｏＣ遺伝子をノックアウトすることで実現される、ことを特徴とする請求項１に記載の組換えラルストニア・ユートロファ。
  3. 前記組換えラルストニア・ユートロファは、菌株ＢＰＳ－０５０であり、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３６００である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の組換えラルストニア・ユートロファ。
  4. ラルストニア・ユートロファを出発菌株として、前記ラルストニア・ユートロファのゲノムに、ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターを導入するステップを含み、
    前記ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターの配列は、ｐｈａＪ４３プロモーター配列である配列番号３であり、
    前記組換えラルストニア・ユートロファのゲノムにおける元のｐｈａＣ遺伝子とｐｒｏＣ遺伝子は、不活化され、
    前記元のｐｈａＣ遺伝子の配列は、配列番号１が示すとおりであり、前記元のｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号２が示すとおりであり、
    前記組換えラルストニア・ユートロファには、更にラルストニア・ユートロファ内に安定に存在するプラスミドが導入されており、
    前記プラスミドに、導入されたｐｈａＣ変異遺伝子と導入されたｐｒｏＣ遺伝子が載せられており、
    前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の配列は、配列番号５が示すとおりであり、
    前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の発現によって、前記組換えラルストニア・ユートロファがポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）を合成し、前記導入されたｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号４が示すとおりであり、
    前記出発菌株は、ラルストニア・ユートロファＲｅ０９８０であり、前記ラルストニア・ユートロファＲｅ０９８０の受託番号がＧＤＭＣＣ Ｎｏ：６２１７７である、
    ことを特徴とする組換えラルストニア・ユートロファの製造方法。
  5. （１）ラルストニア・ユートロファＲｅ０９８０を出発菌株として、ゲノムにおける元のｐｈａＣ遺伝子とｐｒｏＣ遺伝子をノックアウトするステップ、
    （２）前記ラルストニア・ユートロファのゲノムに、ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターを導入するステップ、及び
    （３）ラルストニア・ユートロファ内に安定に存在するプラスミドを導入するステップ、
    を含み、
    前記ノックアウトは、それぞれ、ｐｈａＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドとｐｒｏＣ遺伝子ノックアウト用プラスミドを構築することで行われ、前記元のｐｈａＣ遺伝子の配列は、配列番号１が示すとおりであり、前記元のｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号２が示すとおりであり、
    前記ｐｈａＪ遺伝子をアップレギュレーションするプロモーターの配列は、ｐｈａＪ４３プロモーター配列である配列番号３であり、
    前記プラスミドには、導入されたｐｈａＣ変異遺伝子と導入されたｐｒｏＣ遺伝子が載せられており、
    前記導入されたｐｈａＣ変異遺伝子の配列は、配列番号５が示すとおりであり、前記導入されたｐｒｏＣ遺伝子の配列は、配列番号４が示すとおりである、ことを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
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