CN114381415A

CN114381415A - 高产pha的基因重组菌及其构建方法

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Publication number: CN114381415A
Application number: CN202210280731.0A
Authority: CN
Inventors: 尹进; 王禺; 张桦宇; 李英滋
Original assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-22
Filing date: 2022-03-22
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2042-03-22
Also published as: JP2023140293A; JP7317255B1; US20230303966A1; EP4257681A1; CN114381415B

Abstract

本发明涉及高产PHA的基因重组菌及其构建方法，提供了可用于生产聚羟基脂肪酸酯（PHA）的工程化微生物，更具体地是高产PHA的重组富养罗尔斯通氏菌，其中所述重组富养罗尔斯通氏菌包含上调phaJ基因的启动子，并进一步包括突变的phaC基因。本发明提供的重组富养罗尔斯通氏菌可用于生产PHA中的3‑羟基丁酸与3‑羟基己酸共聚酯(PHBHHx)。

Description

高产PHA的基因重组菌及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程和发酵工程领域，更具体地，本发明涉及一种高产聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）的基因重组菌及其制备方法和用途。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一类由微生物合成的可再生可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。PHA根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。

聚羟基丁酸酯（PHB）是一种商业上有用的复合生物聚合物，是由大量细菌产生的细胞内材料。聚羟基丁酸酯是基于聚合物的化学和物理性质的有用的生物材料，具有多种潜在应用，包括用作可生物降解/热塑性材料，某些抗生素有机合成的手性中心来源以及用作药物递送和骨替代的基质。3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx）是PHA中的一种，以不溶性微球状颗粒状形式存在于细胞质中。

富养罗尔斯通氏菌（Ralstonia eutropha，也称为Cupriavidus necator）是研究聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成的重要模式细菌，是目前研究较多的用于PHB菌株生成的菌株。当碳过剩、氮缺乏时，菌株可以大量积累PHB；而当胞内其他碳源代谢旺盛时，PHB的合成会受到影响。

PHB在富养罗尔斯通氏菌体内的合成途径已被阐述清楚。酯酰辅酶A（Acyl-CoA）在phaA（β-酮基硫解酶）的作用下合成乙酰乙酰辅酶A（acetoacetyl CoA），再通过phaB（乙酰乙酰辅酶A还原酶）合成3-羟基丁酸。同时phaJ（(R)-烯酰辅酶A水合酶）脱氢产生3-羟基己酸，在phaC（PHA聚合酶）的作用下聚合两种化合物形成PHBHHx。

为了更高效的生产PHBHHx，并使其中的3-羟基己酸单体的摩尔比控制在特定比例，亟需开发一种用于合成PHA的新型微生物。

发明内容

本发明通过提供一种高产PHA的重组富养罗尔斯通氏菌而满足了本领域的上述需要。本发明使用富养罗尔斯通氏菌H16（Ralstonia eutropha H16，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 1.7092）作为出发菌株，对菌株进一步改造，使其发酵性能进一步提高。

在一个方面，本发明提供了一种重组富养罗尔斯通氏菌，其中所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中引入了上调phaJ基因的启动子，并且所述重组富养罗尔斯通氏菌中包括引入的phaC突变基因。在本发明所提供的重组富养罗尔斯通氏菌中，所述引入的phaC突变基因的表达使得所述重组富养罗尔斯通氏菌合成3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯。在本发明的一个实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌生产3-羟基己酸在3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯中的比例增加。

在本发明该方面的一些实施方案中，通过同源重组的方式，在所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中引入了上调phaJ基因的启动子。在本发明的优选实施方案中，通过同源重组的方式，利用带有启动子序列的质粒，在phaJ基因上游插入上调phaJ基因的启动子序列。在本发明所提供的重组富养罗尔斯通氏菌中，优选地所述phaJ基因是phaJ4b基因。还优选地，所述启动子序列选自phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3、phaJ210启动子序列SEQ IDNO.8、phaJ183启动子序列SEQ ID NO.9和phaJ225启动子序列SEQ ID NO.10；更优选地，所述启动子序列是phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3。

在本发明该方面的一些实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌中包括引入的phaC突变基因。在优选的实施方案中，通过以下方法引入phaC突变基因：（1）所述引入的phaC突变基因整合在所述重组富养罗尔斯通氏菌的基因组上，而原基因组phaC基因失活，其中失活的方法可以包括突变、取代、替换或敲除，优选地通过构建phaC基因敲除质粒进行失活，具体的原基因组phaC基因序列如SEQ ID NO.1所示；或者（2）所述引入的phaC突变基因存在于引入所述重组富养罗尔斯通氏菌内的稳定质粒上；其中优选地所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明该方面的优选实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌中还可以包括引入其中的proC基因。特别是，当所述引入的phaC突变基因存在于引入所述重组富养罗尔斯通氏菌内的稳定质粒上时，原基因组phaC基因失活，并且原基因组proC基因失活，同时引入在所述重组富养罗尔斯通氏菌内的稳定质粒上的proC基因，其中失活的方法可以包括突变、取代、替换或敲除，优选地通过构建proC基因敲除质粒进行失活，具体地原基因组proC基因序列如SEQ ID NO.2所示；其中优选地，所述引入的proC基因序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明该方面的优选实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌是以富养罗尔斯通氏菌为出发菌。优选地，所述出发菌为富养罗尔斯通氏菌H16；更优选地，所述出发菌为富养罗尔斯通氏菌Re0980。

在本发明该方面的优选实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌的基因组中引入了上调phaJ基因的启动子，优选地所述启动子序列是phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3；并且敲除了原基因组上的phaC和proC基因，具体地所述原基因组phaC基因序列如SEQ ID NO.1所示，且具体地所述原基因组proC基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述重组富养罗尔斯通氏菌中还引入了在富养罗尔斯通氏菌中稳定存在的质粒，所述质粒上装载有引入的phaC突变基因和引入的proC基因，其中优选地所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示，并且优选地所述引入的proC基因序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明该方面的优选实施方案中，所述重组富养罗尔斯通氏菌富养罗尔斯通氏菌（Ralstonia eutropha）菌株BPS-050，以保藏编号CGMCC No. 23600于2021年10月13日保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）。

本发明另一方面还提供了一种制备重组富养罗尔斯通氏菌的方法，包括以下步骤：以富养罗尔斯通氏菌为出发菌，在所述富养罗尔斯通氏菌基因组中引入上调phaJ基因的启动子，并且在所述富养罗尔斯通氏菌中引入phaC突变基因，其中所述引入的phaC突变基因的表达使得所述重组富养罗尔斯通氏菌合成3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯，从而得到生产3-羟基己酸在3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯中的比例增加的重组富养罗尔斯通氏菌。

在本发明该方面的一些实施方案中，通过同源重组的方式，在所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中引入上调phaJ基因的启动子。在本发明的优选实施方案中，通过同源重组的方式，利用带有启动子序列的质粒，在phaJ基因上游插入启动子序列来上调phaJ基因。优选地，所述phaJ基因是phaJ4b基因。还优选地，所述启动子序列选自phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3、phaJ210启动子序列SEQ ID NO.8、phaJ183启动子序列SEQ ID NO.9和phaJ225启动子序列SEQ ID NO.10；更优选地，所述启动子序列是phaJ43启动子序列。

在本发明该方面的一些实施方案中，在所述重组富养罗尔斯通氏菌引入phaC突变基因。在优选的实施方案中，通过以下方法引入phaC突变基因：（1）引入phaC突变基因是通过将所述phaC突变基因整合在所述重组富养罗尔斯通氏菌的基因组上，并且对原基因组phaC基因进行失活，其中失活的方法可以包括突变、取代、替换或敲除，优选地通过构建phaC基因敲除质粒，具体地原基因组phaC基因序列如SEQ ID NO.1所示；或者（2）引入phaC突变基因是通过将所述phaC突变基因装载于稳定质粒上并引入所述重组富养罗尔斯通氏菌内；其中优选地，所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明该方面的优选实施方案中，还包括在所述重组富养罗尔斯通氏菌中引入proC基因。特别是，当所述引入的phaC突变基因存在于引入所述重组富养罗尔斯通氏菌内的稳定质粒上时，对原基因组phaC基因进行失活，并且对原基因组proC基因进行失活，同时引入在所述重组富养罗尔斯通氏菌内的稳定质粒上的proC基因，其中失活的方法可以包括突变、取代、替换或敲除，优选地通过构建proC基因敲除质粒进行失活，具体地原基因组proC基因序列如SEQ ID NO.2所示；其中优选地，所述引入的proC基因序列如SEQ ID NO.4所示；还进一步优选地，所述引入的phaC突变基因和引入的proC基因装载于同一质粒上。

在本发明该方面的优选实施方案中，所述出发菌为富养罗尔斯通氏菌H16，优选地所述出发菌为富养罗尔斯通氏菌Re0980。

在本发明该方面的优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：

（1）以富养罗尔斯通氏菌为出发菌，敲除原基因组phaC和proC基因，优选地所述敲除通过分别构建phaC基因敲除质粒和proC基因敲除质粒进行，具体地所述原基因组phaC基因序列如SEQ ID NO.1所示且具体地所述原基因组proC基因序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）在所述富养罗尔斯通氏菌基因组中引入上调phaJ基因的启动子，优选地所述启动子序列是phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3；

（3）引入在富养罗尔斯通氏菌中稳定存在的质粒，所述质粒上装载有引入的phaC突变基因和/或引入的proC基因，其中优选地所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示，并且优选地所述引入的proC基因序列如SEQ ID NO.4所示；

更优选地所述出发菌为富养罗尔斯通氏菌Re0980。

本发明还提供了使用重组富养罗尔斯通氏菌用于制备PHA和/或PHB的用途。在优选的实施方案中，本发明提供了本文所述的重组富养罗尔斯通氏菌或通过本文所述的方法制备的重组富养罗尔斯通氏菌用于制备PHA和/或PHB的用途。

本发明还提供了一种制备PHA和/或PHB的方法，该方法包括利用本文所述的的重组富养罗尔斯通氏菌或通过本文所述的方法制备的重组富养罗尔斯通氏菌，通过发酵得到PHA或PHB的步骤。

附图说明

图1显示了各菌株培养结果。

具体实施方式

除非另外指出，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和合成生物学等等的常规技术，其在本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的解释：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,”第二版（Sambrook等人，1989）；“Oligonucleotide Synthesis”（M.J. Gait编,1984）；“Animal CellCulture”（R.I. Freshney编,1987）；“Methods in Enzymology”（Academic Press, Inc.）；“Current Protocols in Molecular Biology”（F.M. Ausubel等人编，1987，以及定期更新）；“PCR: The Polymerase Chain Reaction,”（Mullis等人编,1994）；Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第二版，J. Wiley & Sons（NewYork，N.Y.1994）和March’s Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms andStructure第四版，John Wiley & Sons（New York，N.Y.1992），为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了下述术语。

冠词"一个/一种（a/an）"和"该/所述（the）"在本文中用于指一个/一种或超过一个/一种（即至少一个/一种）所述冠词的语法对象。例如，"要素"意指一个/一种要素或超过一个/一种要素。

替代（例如"或"）的使用应理解为意指替代方案中任一、两者或其任何组合。

术语"和/或"应理解为意指替代方案中任一或两者。

如本文使用的，术语"约"或"大约”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度相比较，改变多达15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度。在一个实施方式中，术语"约"或"大约”是指围绕参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%或±1%的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。

如本文使用的，术语"基本上（substantially/essentially）”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度相比较，是约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度。在一个实施方式中，术语"基本上相同”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺度、大小、量、重量或长度范围。

如本文使用的，术语"基本上不含"当用于描述组合物例如细胞群或培养基时，指不含指定物质，例如95%不含、96%不含、97%不含、98%不含、99%不含指定物质的组合物，或如通过常规手段测量是无法检测的。类似含义可应用于术语"不存在"，当指不存在组合物的特定物质或组分时。

在本说明书全文，除非上下文另有要求，否则术语"包含"，“包括”、“含有”和“具有”应理解为暗示包括所述步骤或要素或者步骤组或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤组或要素组。在特定实施方式中，术语"术语"包含"，“包括”、“含有”和“具有”同义使用。

"由……组成"意指包括但限于在短语"由……组成"后的任何。因此，短语"由……组成”是指示所列出的要素是需要的或强制性的，并且没有其他要素是可以存在的。

"基本上由……组成"意指包括在短语"基本上由……组成"后列出的任何要素，并且限于不干扰或贡献于所列出的要素的公开内容中指定的活动或动作的其他要素。因此，短语"基本上由……组成”是指示所列出的要素是需要的或强制性的，但没有其他要素是任选的，并且取决于它们是否影响所列出的要素的活动或动作而可以存在或不存在。

在本说明书全文，提到"一个实施方式"、"一些实施方式"、"一个具体的实施方式"等类似表述意指与所述实施方式结合描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，前述短语在本说明书全文的各个地方的出现不一定全部指相同实施方式。此外，特定特征、结构或特性可以以任何合适方式在一个或多个实施方式中组合。

在公开关于本发明的特定方面（例如本发明的产品）的特征时，这样的公开也被认为适用于本发明的任何其他方面（例如本发明的方法和用途），并作出必要的修正。

为了实现本发明目的，本发明提供的解决方案的关键点在于：

富养罗尔斯通氏菌的原始phaJ4b基因上游无启动子，本发明人发现通过插入外源启动子可实现phaJ4b基因过表达，可以提高PHBHHx中HHx的比例。例如，在富养罗尔斯通氏菌的基因组上，通过同源重组的方式，利用带有特定启动子的质粒，在phaJ基因上游插入特定启动子序列来上调phaJ基因。

另一方面，富养罗尔斯通氏菌的原始phaC基因不能合成PHBHHx，需向其中引入phaC突变基因，才能实现合成PHBHHx，尤其是以油脂为碳源时合成PHBHHx的目的。

对于所述phaC突变基因，可采用两种方式将其引入富养罗尔斯通氏菌中并使其稳定表达：

（1）将原基因组phaC基因失活，并将phaC突变基因通过同源重组的方式整合到基因组上；或

（2）将原基因组phaC基因失活，通过构建带有phaC突变基因的质粒，并转化到重组菌中。

质粒的稳定表达可通过在质粒中携带菌株生长的必需基因，同时将基因组中的该合成基因失活来实现。所述必须基因例如可以是proC基因。

更为具体地，本发明提供了一株富养罗尔斯通氏菌突变菌株，所述突变菌株在基因组上对原基因组phaC和proC基因进行了敲除，引入了上调phaJ基因的启动子，同时引入了能够在富养罗尔斯通氏菌中可稳定存在的质粒，该质粒上装载了phaC突变基因及proC基因。

本发明的另一个目的是提供一种高产PHBHHx菌株的构建方法，其步骤如下：

1、构建phaC基因敲除质粒，将富养罗尔斯通氏菌中phaC基因进行敲除，具体被敲除基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2、构建proC基因敲除质粒，进一步将步骤1中的富养罗尔斯通氏菌中的基因组proC基因进行敲除，具体被敲除基因序列如SEQ ID NO.2所示。

3、设计上调phaJ基因的启动子序列，构建上调phaJ基因的启动子的插入质粒，进一步将步骤2中得到的富养罗尔斯通氏菌进行改造，插入设计的上调phaJ基因的启动子，具体插入的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

4、构建带有外源phaC突变基因和proC基因的稳定质粒，并将其转入步骤3中的富养罗尔斯通氏菌中，补充构建完整PHB通路。

本发明还提供了利用上述生产PHBHHx的菌株生产的聚合物。

在一些实施方式中，本发明用于产生PHA的微生物是富养罗尔斯通氏菌（Ralstonia eutropha）或其亲缘菌。在一个具体实施方式中，本发明用于产生PHA的微生物是富养罗尔斯通氏菌H16或衍生自富养罗尔斯通氏菌H16。

进一步地，本发明提供了一株按照上述基因工程改造手段获得的新菌株BPS-050，其以保藏编号CGMCC No. 23600于2021年10月13日保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心。

菌株BPS-050的形态学特征为：在LB固体培养基上观察菌落呈淡黄色色，边缘整齐，光滑湿润；有浓烈臭味。镜检观察菌株为革兰氏染色阴性，短杆状，无芽孢。

菌株BPS-050的16s RNA序列为：AGGGCTTTGGCGGCTGCCTTAACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGCTTCGGCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCTGTAGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGCAAGGCCTCGCGCTACAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAAGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATGGCTCTGGTTAATACCCGGGGTCGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACAGGCGTGAAATCCCCGAGCTCAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTCACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGCATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATACCACGGCAGGTCATACTATCC。

在一些实施方式中，富养罗尔斯通氏菌中的原基因组phaC基因可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或由与SEQ ID NO: 1具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的核苷酸序列。

在一些实施方式中，用于引入富养罗尔斯通氏菌中的phaC突变基因可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO: 5具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的核苷酸序列。

在一些实施方式中，本文所述的proC是富养罗尔斯通氏菌基因组中的phaC。在一些实施方式中，富养罗尔斯通氏菌中的proC基因可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列或由与SEQ ID NO: 2具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的核苷酸序列。

在一些实施方式中，本文中用于引入富养罗尔斯通氏菌中的proC基因可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO: 4具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的核苷酸序列。

在一些实施方式中，本文所用的启动子phaJ43序列可以包含，基本上由以下组成，或者由以下组成：由SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列或由与SEQ ID NO: 3具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的同一性的核苷酸序列。

在一些实施方式中，本发明所用的一种或多种酶可以是本文描述的酶的突变体（mutant）或变体（variant）。如本文所用的，“突变体”和“变体”是指保留与原始序列的生物学活性相同或基本上相同的生物学活性的分子。该突变体或变体可以来自相同或不同的物种，或者可以是基于天然的分子或现有的分子的合成序列。在一些实施方式中，术语“突变体”和“变体”是指多肽具有的氨基酸序列与对应的野生型多肽至少相差一个氨基酸。例如，突变体和变体可以包含保守氨基酸取代：即用具有相似性质的氨基酸取代原有的对应氨基酸。保守取代可以是极性对极性氨基酸（甘氨酸（G，Gly）、丝氨酸（S，Ser）、苏氨酸（T，Thr）、酪氨酸（Y，Tyr）、半胱氨酸（C，Cys）、天冬酰胺（N，Asn）和谷氨酰胺（Q，Gln））；非极性对非极性氨基酸（丙氨酸（A，Ala）、缬氨酸（V，Val）、色氨酸（W，Trp）、亮氨酸（L，Leu）、脯氨酸（P，Pro）、甲硫氨酸（Μ，Met）、苯丙氨酸（F，Phe））；酸性对酸性氨基酸（天冬氨酸（D，Asp）、谷氨酸（E，Glu））；碱性对碱性氨基酸（精氨酸（R，Arg）、组氨酸（H，His）、赖氨酸（K，Lys））；带电荷氨基酸对带电荷氨基酸（天冬氨酸（D，Asp）、谷氨酸（E，Glu）、组氨酸（H，His）、赖氨酸（K，Lys）和精氨酸（R，Arg））；和疏水对疏水性氨基酸（丙氨酸（A，Ala）、亮氨酸（ULeu）、异亮氨酸（I，Ile）、缬氨酸（V，Val）、脯氨酸（P，Pro）、苯丙氨酸（F，Phe）、色氨酸（W，Trp）和甲硫氨酸（M，Met））。在一些其他实施方式中，突变体或变体也可以包含非保守性取代。

在一些实施方式中，突变体或变体多肽可以具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个或前述数值中的任意两者构成的范围的氨基酸的置换、添加、插入或缺失。与未改变的酶相比，突变体或变体可以具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的活性。酶活性可以通过本领域已知的常规技术，例如比色酶学测定来测定。

如本领域技术人员众所周知的，可以通过使编码多肽如酶的核苷酸序列中的一个或多个编码核苷酸（即密码子）被在宿主中更好表达的另一种密码子替代来改善在宿主中异源核酸的表达（即密码子优化）。产生这种效应的一种原因是由于不同的生物体显示出对不同密码子的偏好。在一些实施方式中，本文公开的编码多肽如酶的核苷酸序列被修饰或优化，使得所得核苷酸序列反映针对特定宿主的密码子偏好。

多核苷酸或多肽与另一个多核苷酸或多肽具有一定的“序列同一性”或“同一性”百分比，意味着当比对两条序列时，该百分比的碱基或氨基酸相同并且在相同的相对位置。确定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的百分比同一性可以包括比对和比较两个序列中相应位置处的氨基酸残基或核苷酸。如果两个序列中的所有位置被相同的氨基酸残基或核苷酸占据，那么所述序列被认为是100%相同的。序列同一性可以以多种不同方式确定，例如，可以使用各种方法和计算机程序（例如，BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等）对序列进行比对。

本发明的一些实施方式涉及包含phaJ基因启动子的核苷酸序列的表达构建体，例如载体，如质粒，优选地是包含编码phaJ基因启动子的核苷酸序列的表达构建体。所述编码phaJ基因启动子的核苷酸序列如上所述。优选地，所述表达构建体是质粒。优选地，所述表达构建体可以用于在富养罗尔斯通氏菌，优选地在富养罗尔斯通氏菌H16中表达phaJ基因启动子。

本发明的一些实施方式涉及包含一个或多个编码phaC和/或proC的核苷酸序列的表达构建体，例如载体，如质粒，优选地是包含一个或多个编码phaC和/或proC的核苷酸序列的表达构建体。所述编码phaC和/或proC的核苷酸序列如上所述。优选地，所述表达构建体是质粒。优选地，所述表达构建体可以用于在富养罗尔斯通氏菌，优选地在富养罗尔斯通氏菌H16中表达phaC和/或proC，更优选共表达phaC和proC。

对微生物进行工程化可以包括在所述微生物中表达感兴趣的酶。在一些实施方式中，本文所述的表达构建体通过转化（transformation）而引入到宿主微生物中以表达感兴趣的酶。所述转化可以通过本领域公知的方法进行。例如，本文所述的包含编码phaJ基因启动子、phaC和/或proC的核苷酸序列的质粒可以通过转化而引入到富养罗尔斯通氏菌中以表达phaJ基因启动子、phaC和/或proC。转化可以是，但不限于，农杆菌介导的转化、用质粒DNA的电穿孔、DNA摄取、基因枪转化、病毒介导的转化或原生质体转化。转化可以是适用于特定宿主的任意其他转化方法。

在宿主微生物中表达感兴趣的酶以实现预期目的可以如上所述通过向所述宿主微生物中转化编码所述酶的表达构建体来实现，也可以通过采用各种各样的方式将编码所述酶的表达构建体整合到所述宿主微生物的基因组序列中来实现，也可以通过采用各种各样的方式增强所述宿主微生物中原有的酶编码基因的转录和/或表达来实现，例如通过使用更强的调节元件如启动子。这样的方式大体上都是本领域技术人员熟知的。

对微生物进行工程化可以包括干预所述微生物中的感兴趣的蛋白的功能，例如，减少或消除所述蛋白的表达，这可以例如通过在所述微生物中使感兴趣的基因组序列缺失、替换或敲除来实现。在一些实施方式中，本文所述的微生物中的基因组phaC和/或proC基因被缺失、替换或敲除。在一些实施方式中，被缺失、替换或敲除的phaC基因序列如SEQID NO: 1所示。在一些实施方式中，被缺失的proC基因序列如SEQ ID NO: 2所示。优选地，通过敲除实现所述基因组phaC和/或proC基因的失活。

除了使微生物中的感兴趣的基因组序列缺失以外，还可以通过本领域已知的其他方法来干预感兴趣的蛋白的功能，包括，但不限于，干预编码感兴趣的蛋白的基因组序列的转录、干预编码感兴趣的蛋白的mRNA的表达、干预感兴趣的蛋白的递送，例如向细胞外递送；更具体地，包括，但不限于，使编码感兴趣的蛋白的基因组序列或其调控元件如启动子的全部或部分缺失、在编码感兴趣的蛋白的基因组序列或其调控元件如启动子的中间插入影响其转录的一个或多个核苷酸例如终止密码子或使其一个或多个核苷酸突变至所述基因组序列无法正常转录的程度的方法、引入干预或沉默编码感兴趣的蛋白的mRNA的试剂如siRNA或dsRNAi试剂、或者抑制或停止递送感兴趣的蛋白例如至细胞外的系统（例如伴侣蛋白、信号序列、转运蛋白）的功能的方法。

用于宿主培养的合适的培养基可以包括标准培养基（例如Luria-Bertani肉汤，任选地补充一种或多种其他试剂，例如诱导剂；标准酵母培养基；等等）。在一些实施方式中，培养基可以补充有可发酵糖（例如己糖，例如葡萄糖、木糖等）。在一些实施方式中，合适的培养基包含诱导剂。在某些这样的实施方式中，诱导剂包括鼠李糖。

用于宿主培养的合适的培养基中的碳源可以不同，从简单的糖如葡萄糖到其他生物质的更复杂的水解产物，如酵母提取物。盐的添加通常提供必需的元素，例如镁、氮、磷和硫，以允许细胞合成多肽和核酸。合适的培养基还可以补充有选择性试剂，例如抗生素，以选择维持某些质粒等。例如，如果微生物对某种抗生素具有抗性，如氨苄青霉素、四环素或卡那霉素，则可以将该抗生素添加到培养基中，以阻止缺乏抗性的细胞生长。合适的培养基可以根据需要补充其他化合物以选择期望的生理或生化特性，如特定的氨基酸等。

本文例如在实施例部分中描述了适用于本发明的微生物的维持和生长的材料和方法。

对于小规模生产，可以使工程化微生物以例如约100mL、500mL、1L、5L或10L的规模进行批量生长，发酵，并诱导其表达期望的核苷酸序列，如编码phaC和/或proC的核苷酸序列，和/或合成期望的发酵产物，如PHA和/或PHB。对于大规模生产，可以使工程化微生物以约10L、100L、1000L、10,000L、100,000L或更大的规模进行批量生长，发酵，并诱导其表达期望的核苷酸序列，如编码phaC和/或proC的核苷酸序列，和/或合成期望的发酵产物，如橄榄醇和/或橄榄醇酸。

可以通过色谱法优选HPLC分离感兴趣的发酵产物来进行发酵产物的分析，以确定培养过程中的一个或多个时间处的浓度。也可以通过光度测定方式（吸收、荧光）检测微生物培养物和发酵产物。

本文所述的工程化微生物实现了提高的PHA的产量。在一些实施方式中，本文所述的工程化微生物与适当的未工程化或部分工程化的微生物对照相比，在PHA生产方面实现了至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000倍或更高或前述数值中的任意两者构成的范围的更高产量。在一些实施方式中，本文所述的工程化微生物在橄榄醇和/或橄榄醇酸生产方面实现了至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000 mg/L或更高或前述数值中的任意两者构成的范围的产量。

实施例

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所用酶试剂采购自New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。

培养基配方：

LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

摇瓶发酵培养基：1% 棕榈油，1g/L NH₄Cl，10mL/L微量元素溶液I和1mL/L微量元素溶液II。其中微量元素溶液I的组成为：20g/L MgSO₄，2g/L CaCl₂。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO₄·7H₂O，30mg/L MnCl₂·4H₂O，300mg/L H₃BO₃，200mg/L CoCl₂·6H₂O，10mg/L CuSO₄·5H₂O，20mg/L NiCl₂·6H₂O，30mg/L NaMoO₄·2H₂O。上述试剂购自国药集团化学试剂公司。

种子培养基Ⅰ：10g/L peptone，5g/L Yeast Extract，3g/L glucose。

种子培养基Ⅱ：0.15% 棕榈油,10g/L peptone，5g/L Yeast Extract。

生产培养基：1.0% 棕榈油，9.85g/L Na₂HPO₄·12H₂O,1.5g/L KH₂PO₄，3.0g/LNH₄Cl，10mL/L微量元素溶液I和1mL/L微量元素溶液II。其中微量元素溶液I的组成为：20g/L MgSO₄，2g/L CaCl₂。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO₄·7H₂O，30mg/L MnCl₂·4H2O，300mg/L H₃BO₃，200mg/L CoCl₂·6H₂O，10mg/L CuSO4·5H₂O，20mg/L NiCl₂·6H₂O，30mg/L NaMoO₄·2H₂O。其中。上述试剂均购自国药集团化学试剂公司。

实施例1：BPS-050的构建

S1、构建富养罗尔斯通氏菌ReΔphaCΔproC

以Ralstonia eutropha Re0980作为出发菌，构建富养罗尔斯通氏菌ReΔphaCΔ proC。

所述Ralstonia eutropha Re0980（下文简称Re0980）为一株基因组phaC基因被敲除的富养罗尔斯通氏菌，即富养罗尔斯通氏菌ReΔphaC，该重组富养罗尔斯通式菌（Ralstonia eutropha）菌株Re0980于2021年12月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮政编码：510070），保藏编号为GDMCC No：62177。

以Re0980基因组为模板进行PCR扩增得到proC基因的上下游同源片段proC-H1和proC-H2，将proC Fp和proC Rp通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB-ΔproC。使用的引物如下：

将重组质粒pK18mobsacB-ΔproC转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入富养罗尔斯通氏菌中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/mL卡那霉素、100μg/mL安普霉素、0.2%脯氨酸的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。

将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的0.2%脯氨酸LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物proC Fp和proC Rp进行PCR鉴别出proC基因敲除的重组菌，得到的重组菌为富养罗尔斯通氏菌ReΔphaCΔproC。

S2、构建含有phaC突变基因及proC基因的稳定质粒

构建可以在富养罗尔斯通氏菌中稳定遗传的质粒，并在其上装载proC基因和phaC突变基因，具体操作如下：

基因合成带有BsaI接头序列的proC基因，具体合成序列如SEQ ID NO.4；

基因合成带有BsaI接头序列的phaC突变基因，具体合成序列如SEQ ID NO.5；

基因合成带有BsaI接口序列的pSP质粒，具体合成序列如SEQ ID NO.6；

将上述三个质粒进行Goldengate组装，得到含有phaC突变及proC基因的重组质粒pSP-B-phaC-proC。

S3、构建phaJ4b基因上游插入有特定启动子的重组菌

步骤1：以S1中得到的富养罗尔斯通氏菌ReΔphaCΔproC基因组为模板进行PCR扩增，使用phaJ-H1 Fp、phaJ-H1 Rp得到phaJ基因启动子的上游同源片段H1；使用phaJ-H2Fp、phaJ-H2 Rp得到phaJ基因启动子的上游同源片段H2。

步骤2：基因合成phaJ基因的启动子phaJ43：

phaJ43：

ATGCCTCCACACCGCTCGTCACATCCTGTTGCGTTCACTGGAATCCCACGATAGAGTTTGACCTGCGAGCAAGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAA。

步骤3：将PCR得到的H1和H2，及phaJ43启动子通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB-phaJ43。使用的引物如下：

步骤4：将重组质粒pK18mobsacB-phaJ43转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入富养罗尔斯通氏菌中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/mL卡那霉素与100μg/mL安普霉素的0.2%脯氨酸LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。

将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的0.2%脯氨酸LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物phaJ Fp和phaJ Rp进行PCR鉴别出相应大小的重组菌，得到的重组菌为富养罗尔斯通氏菌ReΔphaCΔproC_phaJ43。

S4、将稳定质粒pSP-B-phaC-proC转入已插入phaJ启动子的突变株

将S2构建的重组质粒pSP-B-phaC-proC转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入S3构建的富养罗尔斯通氏菌ReΔphaCΔproC_phaJ43中，用含有250 ug/mL的卡那霉素LB平板筛选出阳性克隆，即得到重组富养罗尔斯通氏菌，菌株命名为BPS-050，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC 23600。该克隆中将带有设计好的稳定质粒，并且培养基中不再需要补充脯氨酸。

在LB固体培养基上观察菌落：菌落呈淡黄色色，边缘整齐，光滑湿润；有浓烈臭味。镜检观察菌株为革兰氏染色阴性，短杆状，无芽孢。

进一步对该菌株的16s RNA进行测序，16s RNA序列如前文所述。

实施例2：构建基因组表达phaC突变基因的菌株

基因合成带有20bp同源臂序列的phaC突变基因，具体合成序列如SEQ ID NO.7。使用Gibson连接的方式，将phaC-H1、phaC突变基因、phaC-H2连接到pK18mobsacB质粒上，得到重组质粒pK18mobsacB-phaC。

将构建的重组质粒pK18mobsacB-phaC转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入已敲除phaC基因的H16菌株中，用含有250 ug/mL的卡那霉素LB平板筛选出阳性克隆，即得到重组富养罗尔斯通氏菌ReΔphaC::phaCac，命名为G-0。

实施例3：构建重组富养罗尔斯通氏菌

本实施例在实施例2的基础上引入phaJ43启动子，引入方法同实施例1的S3，获得重组富养罗尔斯通氏菌ReΔphaC_phaJ43，命名为G-43。

对比例1-3：

对比例1-3与实施例1的区别在于：

（1）S3的步骤2中，分别合成phaJ基因的启动子phaJ210、phaJ183和phaJ225：

phaJ210（SEQ ID NO.8）：

ATGCCTCCACACCGCTCGTCACAtcctgttgcgtTCACTGGAATCCCAgtatACAGtTTGACCTGCGAGCAaGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAA

phaJ183（SEQ ID NO.9）：

ATGCCTCCACACCGCTCGTCACAtcctgttgcgtTCACTGGAATCCCAgtatagcatTTGACCTGCGAGCAaGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAA

phaJ225（SEQ ID NO.10）：

ATGCCTCCACACCGCTCGTCACAtcctgttgcgtTCACTGGAATCCCAgtataccctTTGACCTGCGAGCAaGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAA。

（2）S3的步骤3中，将PCR得到的H1和H2，分别与phaJ210、phaJ183和phaJ225启动子通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB-phaJ210、pK18mobsacB-phaJ183和pK18mobsacB-phaJ225。

（3）S3的步骤4中，分别将重组质粒pK18mobsacB-phaJ210、pK18mobsacB-phaJ183和pK18mobsacB-phaJ225转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入富养罗尔斯通氏菌中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/mL卡那霉素与100μg/mL安普霉素的0.2%脯氨酸LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。

将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的0.2%脯氨酸LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物phaJ Fp和phaJ Rp进行PCR鉴别出相应大小的重组菌，得到的重组菌为富养罗尔斯通氏菌ReΔphaCΔproC_phaJ210，Re ΔphaCΔproC_phaJ183，ReΔphaCΔproC_phaJ225。

（4）S4中，将S2构建的重组质粒pSP-B-phaC-proC转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法分别转入S3构建的富养罗尔斯通氏菌ReΔphaCΔproC_phaJ210，ReΔphaCΔ proC_phaJ183，ReΔphaCΔproC_phaJ225中，用含有250 ug/mL的卡那霉素LB平板筛选出阳性克隆，即得到重组富养罗尔斯通氏菌，菌株命名为P-210，P-183，P-225。

实验例1：摇瓶测试突变株的发酵能力

将实施例1-3，对比例1-3获得的转化体进行平板划线，得到突变株的单克隆，将单克隆接在种子培养基(4ml)中，培养12小时。将过夜培养的菌液转接到装有10 mL LB活化培养基的100 mL玻璃锥形瓶，接种终OD量约0.1，30℃，200 rpm，培养8 h，即可进行转接培养。聚脂生产培养是将OD值在6-7之间的前培养种子，按0.1OD接种于装有30ml发酵培养基的250ml摇瓶里，之后再加入300ul的棕榈油及一定量的乳化剂。48 h后停止发酵，取发酵液进行离心得到菌体。将菌体烘干至恒重。

测定干燥菌体的重量记为干重。向约所得的干燥菌体中加入100ml氯仿，于室温搅拌一昼夜，抽提菌体内的聚酯。滤去菌体残渣后，用蒸发器浓缩至总容积为约30ml，然后缓慢加入约90 ml的己烷，在缓慢搅拌下放置1小时。将析出的聚酯滤出后，于5CTC真空干燥3小时。测定干燥聚酯的质量，计算菌体内的聚酯含量。

各菌株测试效果如下表1所示：

	干重 (g/L)	PHA比例	3HHx比例
				G-0	10.72	80.85%	2.56%
G-43	10.15	81.59%	11.21%
				P-210	3.73	56.73%	8.71%
P-183	3.83	48.71%	10.94%
				P-225	6.08	67.88%	9.23%
BPS-050	10.34	82.21%	8.15%

摇瓶结果发现，使用P43启动子后G-43和BPS-050的代谢产物中3HHx的比例显著提升，同时菌株的发酵能力要高于对照菌株G-0，使用质粒版本表达phaC突变基因及proC基因后，其发酵性能有进一步的提升空间。而使用其他理论上表达强度更高的启动子序列，却并不能相应的提高产量，反而降低了细胞干重。

实验例2：发酵罐测试

首先，将甘油管保存的实施例1和实施例3菌株（1000uL）接种于种子培养基Ⅰ中(20ml)，进行12小时的种子一级培养。接着，将1％的种子培养液Ⅰ接种于种子培养基Ⅱ中，进行二级种子培养。然后将10 v/v%的种子培养液Ⅱ接种于装有1.1生产培养的2L小型发酵罐（迪必尔公司）中。运行条件为培养温度30℃、搅拌速度800rpm、通气量1L/min，将pH控制为6.7～6.8之间。pH控制中使用了28％的氨水溶液。在培养过程中，持续的使用棕榈油作为碳源，培养时间为54小时。

检测方式同实验例1。

各菌株培养结果如图1和表2所示：

菌株编号	干重（g/L）	PHA比例
			G-0	201.64	80.73%
G-43	207.12	81.59%
			P-210	120.47	53.77%
P-183	108.88	47.51%
			P-225	170.77	67.09%
BPS-50	212.72	83.48%

相比于对照菌株G-0，经过基因编辑得到的重组菌BPS-050在达到一定比例3-羟基己酸的基础上，细胞干重提升了5.49%【(212.72-201.64)/201.64】，PHA比例提升了3.41%【(83.48%-80.73%)/80.73%】。相较对照菌株有明显提升。

虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施方式，但是对本领域技术人员而言应该显而易见是这样的实施方式仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下众多变化、改变和取代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，在实践本发明中可以采用在此描述的本发明的实施方式的不同替代方案。

序列表

<110> 深圳蓝晶生物科技有限公司

<120> 高产PHA的基因重组菌及其构建方法

<130> CID210093

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1770

<212> DNA

<213> 富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)

<400> 1

atggcgaccg gcaaaggcgc ggcagcttcc acgcaggaag gcaagtccca accattcaag 60

gtcacgccgg ggccattcga tccagccaca tggctggaat ggtcccgcca gtggcagggc 120

actgaaggca acggccacgc ggccgcgtcc ggcattccgg gcctggatgc gctggcaggc 180

gtcaagatcg cgccggcgca gctgggtgat atccagcagc gctacatgaa ggacttctca 240

gcgctgtggc aggccatggc cgagggcaag gccgaggcca ccggtccgct gcacgaccgg 300

cgcttcgccg gcgacgcatg gcgcaccaac ctcccatatc gcttcgctgc cgcgttctac 360

ctgctcaatg cgcgcgcctt gaccgagctg gccgatgccg tcgaggccga tgccaagacc 420

cgccagcgca tccgcttcgc gatctcgcaa tgggtcgatg cgatgtcgcc cgccaacttc 480

cttgccacca atcccgaggc gcagcgcctg ctgatcgagt cgggcggcga atcgctgcgt 540

gccggcgtgc gcaacatgat ggaagacctg acacgcggca agatctcgca gaccgacgag 600

agcgcgtttg aggtcggccg caatgtcgcg gtgaccgaag gcgccgtggt cttcgagaac 660

gagtacttcc agctgttgca gtacaagccg ctgaccgaca aggtgcacgc gcgcccgctg 720

ctgatggtgc cgccgtgcat caacaagtac tacatcctgg acctgcagcc ggagagctcg 780

ctggtgcgcc atgtggtgga gcagggacat acggtgtttc tggtgtcgtg gcgcaatccg 840

gacgccagca tggccggcag cacctgggac gactacatcg agcacgcggc catccgcgcc 900

atcgaagtcg cgcgcgacat cagcggccag gacaagatca acgtgctcgg cttctgcgtg 960

ggcggcacca ttgtctcgac cgcgctggcg gtgctggccg cgcgcggcga gcacccggcc 1020

gccagcgtca cgctgctgac cacgctgctg gactttgccg acacgggcat cctcgacgtc 1080

tttgtcgacg agggccatgt gcagttgcgc gaggccacgc tgggcggcgg cgccggcgcg 1140

ccgtgcgcgc tgctgcgcgg ccttgagctg gccaatacct tctcgttctt gcgcccgaac 1200

gacctggtgt ggaactacgt ggtcgacaac tacctgaagg gcaacacgcc ggtgccgttc 1260

gacctgctgt tctggaacgg cgacgccacc aacctgccgg ggccgtggta ctgctggtac 1320

ctgcgccaca cctacctgca gaacgagctc aaggtaccgg gcaagctgac cgtgtgcggc 1380

gtgccggtgg acctggccag catcgacgtg ccgacctata tctacggctc gcgcgaagac 1440

catatcgtgc cgtggaccgc ggcctatgcc tcgaccgcgc tgctggcgaa caagctgcgc 1500

ttcgtgctgg gtgcgtcggg ccatatcgcc ggtgtgatca acccgccggc caagaacaag 1560

cgcagccact ggactaacga tgcgctgccg gagtcgccgc agcaatggct ggccggcgcc 1620

atcgagcatc acggcagctg gtggccggac tggaccgcat ggctggccgg gcaggccggc 1680

gcgaaacgcg ccgcgcccgc caactatggc aatgcgcgct atcgcgcaat cgaacccgcg 1740

cctgggcgat acgtcaaagc caaggcatga 1770

<210> 2

<211> 837

<212> DNA

<213> 富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)

<400> 2

atgctcgata cccttacctt tggctttctc ggcggcggca acatggccac cgcactgatc 60

ggcggcctga tcgcccgcgg cgtgccggcc ggctcgatcc gcgtggtcga ccccttcccc 120

gaggcccagc aacgcctggc gcgcgacctc ggcgtgcatg ccgccggcgc gccggatgcc 180

gccttcggcg cctgcgacgt gctggtgctg gcggtcaagc cgcagcagtt ccgcgacgcc 240

gcggcgcagc tgctgccgat cctgccggcc agcggcaagg gcaacctggt gatcagcgtg 300

gccgccggca tccggctgca ggacatggag cgctggctgg acgggcgcgc ccggctggtg 360

cgggcgatgc cgaacacgcc ggcgctggcc ggcatgggca tgaccgggct ggccgcgccg 420

gccgggctgt cggccgaaga ccgcgcgatc gccagcgcgg tggccgaggc cgtcggcaag 480

tgcgtatggg tggatgggga tgaccagatc gatgcggtca ccgccatttc cggcagtggg 540

ccggcctatg tcttctactt tatcgaagcg atggaacgcg ccgccaccga gctgggcctg 600

acggcggagc aaggccgcga actggcggta gaaaccttcc gtggcgctgc taccctggcc 660

gggcagtctt ccgagccggt gtcgacgctg cgtgagcgcg tgacgtccaa gggcggcacg 720

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atgcatgctg ccgcggcgcg gggcaaggag atgggggcgg agttcgggaa ggattga 837

<210> 3

<211> 146

<212> DNA

<213> 富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)

<400> 3

atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccacg atagagtttg 60

acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120

cagcctctac aaataatttt gtttaa 146

<210> 4

<211> 2025

<212> DNA

<213> 富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)

<400> 4

ggtctcacaa ggtggacatc cttgtgcgtc atcgaggcga tgttgatccg gcgcatgtcg 60

ccgtggatcc gcaccatcgg cggcatgtcc gcggagagat gaagatcaga cgccttgttc 120

ttgacagcga aagccaatag ctgcgcgatg tccatctata atgaccccac cctagttatc 180

agtactttgc gtactttctt ttgtatgttc gccggattat gtctgtaatt gccgccaact 240

tgcaagccgt tcaccagcgc atcgcggcgg ccgcacaaca agccggcaga cagcccgcgg 300

acatcgccct gctggcggtt tccaagaccg ttccccccga ccgcataagg gccgcatacg 360

ccgccggaca ggtcgctttc ggcgaaaact acgtccagga aggcgtcgac aagatcgccg 420

cgctggccga cctgcgccac cgcctgcaat ggcatttcat cggcccgctg cagagcaaca 480

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ccgagcggct gtcggcccag cgcccggccg gcatggccgc gctgcaggtc tgcatccagg 600

tcaatatcag cggcgaagcc agcaagagcg gcgtcgcccc ggcagaggtg cccggcctgg 660

cacatgccgt cgccgcgctg ccaggcctgc gcctgcgcgg gctgatggcc atccccgagc 720

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cgctgcgcac cgacggcctg gacctcgaca cgctgtcgat gggcatgtcg ggcgacatgg 840

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gccaataccc gtagtccggc gcgcccagtc cattcccttc aagcccccca acggatctcc 960

atgctcgata cccttacctt tggctttctc ggcggcggca acatggccac cgcactgatc 1020

ggcggcctga tcgcccgcgg cgtgccggcc ggctcgatcc gcgtggtcga ccccttcccc 1080

gaggcccagc aacgcctggc gcgcgacctc ggcgtgcatg ccgccggcgc gccggatgcc 1140

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cgggcgatgc cgaacacgcc ggcgctggcc ggcatgggca tgaccgggct ggccgcgccg 1380

gccgggctgt cggccgaaga ccgcgcgatc gccagcgcgg tggccgaggc cgtcggcaag 1440

tgcgtatggg tggatgggga tgaccagatc gatgcggtca ccgccatttc cggcagtggg 1500

ccggcctatg tcttctactt tatcgaagcg atggaacgcg ccgccaccga gctgggcctg 1560

acggcggagc aaggccgcga actggcggta gaaaccttcc gtggcgctgc taccctggcc 1620

gggcagtctt ccgagccggt gtcgacgctg cgtgagcgcg tgacgtccaa gggcggcacg 1680

acgtatgcgg cgctgacggc gatggaggct tcgggcattg gtgatgcctt cgtgcgcgcg 1740

atgcatgctg ccgcggcgcg gggcaaggag atgggggcgg agttcgggaa ggattgaggc 1800

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catccggtcg cggtcacgaa tcagcgtgta atgatacctg agacc 2025

<210> 5

<211> 2256

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtctcatac ccaaaaattc atccttctcg cctatgctct ggggcctcgg cagatgcgag 60

cgctgcatac cgtccggtag gtcgggaagc gtgcagtgcc gaggcggatt cccgcattga 120

cagcgcgtgc gttgcaaggc aacaatggac tcaaatgtct cggaatcgct gacgattccc 180

aggtttctcc ggcaagcata gcgcatggcg tctccatgcg agaatgtcgc gcttgccgga 240

taaaagggga gccgctatcg gaatggacgc aagccacggc cgcagcaggt gcggtcgagg 300

gcttccagcc agttccaggg cagatgtgcc ggcagaccct cccgctttgg gggaggcgca 360

agccgggtcc attcggatag catctcccca tgcaaagtgc cggccagggc aatgcccgga 420

gccggttcga atagtgacgg cagagagaga caatcaaatc atgagccaac catcttatgg 480

cccgctgttc gaggccctgg cccactacaa tgacaagctg ctggccatgg ccaaggccca 540

gacagagcgc accgcccagg cgctgctgca gaccaatctg gacgatctgg gccaggtgct 600

ggagcagggc agccagcaac cctggcagct gatccaggcc cagatgaact ggtggcagga 660

tcagctcaag ctgatgcagc acaccctgct caaaagcgca ggccagccga gcgagccggt 720

gatcaccccg gagcgcagcg atcgccgctt caaggccgag gcctggagcg aacaacccat 780

ctatgactac ctcaagcagt cctacctgct caccgccagg cacctgctgg cctcggtgga 840

tgccctggag ggcgtccccc agaagagccg ggagcggctg cgtttcttca cccgccagta 900

cgtctctgcc atggccccca gcaacttcct ggccaccaac cccgagctgc tcaagctgac 960

cctggagtcc ggcggccaga acctggtgcg cggactggcc ctcttggccg aggatctgga 1020

gcgcagcgcc gatcagctca acatccgcct gaccgacgaa tccgccttcg agctcgggcg 1080

ggatctggcc ctgaccccgg gccgggtggt gcagcgcacc gagctctatg agctcattca 1140

gtacagcccg actaccgaga cggtgggcaa gacacctgtg ctgatagtgc cgcccttcat 1200

caacaagtac tacatcatgg acatgcggcc ccagaactcc ctggtcgcct ggctggtcgc 1260

ccagggccag acggtattca tgatctcctg gcgcaacccg ggcgtggccc aggcccaaat 1320

cgatctcgac gactacgtgg tggatggcgt catcgccgcc ctggacggcg tggaggcggc 1380

caccggcgag cgggaggtgc acggcatcgg ctactgcatc ggcggcaccg ccctgtcgct 1440

cgccatgggc tggctggcgg cgcggcgcca gaagcagcgg gtgcgcaccg ccaccctgtt 1500

cactaccctg ctggacttct cccagcccgg ggagcttggc atcttcatcc acgagcccat 1560

catagcggcg ctcgaggcgc aaaatgaggc caagggcatc atggacgggc gccagctggc 1620

ggtcagcttc agcctgctgc gggagaacag cctctactgg aactactaca tcgacagcta 1680

cctcaagggt cagagcccgg tggccttcga tctgctgcac tggaacagcg acagcaccaa 1740

tgtggcgggc aagacccaca acagcctgct gcgccgtctc tacctggaga accagctggt 1800

gaagggggag ctcaagatcc gcaacacccg catcgatctc ggcaaggtga agacccctgt 1860

gctgctggtg tcggcggtgg acgatcacat cgccctctgg cagggcacct ggcagggcat 1920

gaagctgttt ggcggggagc agcgcttcct cctggcggag tccggccaca tcgccggcat 1980

catcaacccg ccggccgcca acaagtacgg cttctggcac aacggggccg aggccgagag 2040

cccggagagc tggctggcag gggcgacgca ccagggcggc tcctggtggc ccgagatgat 2100

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cccaacagag gaggacgccg catgaccgct gagacc 2256

<210> 6

<211> 6752

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtctcattt tcgccagata tcggtagcgg agtgtatact ggcttactat gttggcactg 60

atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa aaggctgcac cggtgcgtca 120

gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc actgactcgc tacgctcggt 180

cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc ggagatttcc tggaagatgc 240

caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa agccgttttt ccataggctc 300

cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc agtggtggcg aaacccgaca 360

ggactataaa gataccaggc gtttcccctg gcggctccct cgtgcgctct cctgttcctg 420

cctttcggtt taccggtgtc attccgctgt tatggccgcg tttgtctcat tccacgcctg 480

acactcagtt ccgggtaggc agttcgctcc aagctggact gtatgcacga accccccgtt 540

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gcaaaagcac cactggcagc agccactggt aattgattta gaggagttag tcttgaagtc 660

atgcgccggt taaggctaaa ctgaaaggac aagttttggt gactgcgctc ctccaagcca 720

gttacctcgg ttcaaagagt tggtagctca gagaaccttc gaaaaaccgc cctgcaaggc 780

ggttttttcg ttttcagagc aagagattac gcgcagacca aaacgatctc aagaagatca 840

tcttattaaa gggtccccaa taattacgat ttaaattgga tgaatgtcag ctactgggct 900

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ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 1260

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ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 1440

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 1500

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ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 1740

ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 1800

atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 1860

ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 1920

gacgagttct tctgatcaat ttccgagaat gacagttctc agaaattgat ttgacttttg 1980

tccttttccg ctgcataacc ctgcttcggg gtcattatag cgattttttc ggtatatcca 2040

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gcgctgaaag tctagggcgg cggatttgtc ctactcagga gagcgttcac cgacaaacaa 6420

cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc gttttatttg atgcctttaa 6480

ttaaagcgga taacaatttc acacaggaga gtgaagagct tttgctcttc atccaagcga 6540

gaccaaaagg tctcgccgcg acccattacc gcctttgagt gagcgtcgtg actgggaaaa 6600

ccctggcgac tagtcttgga ctcctgttga tagatccagt aatgacctca gaactccatc 6660

tggatttgtt cagaacgctc ggttgccgcc gggcgttttt tattggtgag aatccagtca 6720

atttccgaga atgacagttc tcagaaattg aa 6752

<210> 7

<211> 1825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcagagaga caatcaaatc atgagccaac catcttatgg cccgctgttc gaggccctgg 60

cccactacaa tgacaagctg ctggccatgg ccaaggccca gacagagcgc accgcccagg 120

cgctgctgca gaccaatctg gacgatctgg gccaggtgct ggagcagggc agccagcaac 180

cctggcagct gatccaggcc cagatgaact ggtggcagga tcagctcaag ctgatgcagc 240

acaccctgct caaaagcgca ggccagccga gcgagccggt gatcaccccg gagcgcagcg 300

atcgccgctt caaggccgag gcctggagcg aacaacccat ctatgactac ctcaagcagt 360

cctacctgct caccgccagg cacctgctgg cctcggtgga tgccctggag ggcgtccccc 420

agaagagccg ggagcggctg cgtttcttca cccgccagta cgtctctgcc atggccccca 480

gcaacttcct ggccaccaac cccgagctgc tcaagctgac cctggagtcc ggcggccaga 540

acctggtgcg cggactggcc ctcttggccg aggatctgga gcgcagcgcc gatcagctca 600

acatccgcct gaccgacgaa tccgccttcg agctcgggcg ggatctggcc ctgaccccgg 660

gccgggtggt gcagcgcacc gagctctatg agctcattca gtacagcccg actaccgaga 720

cggtgggcaa gacacctgtg ctgatagtgc cgcccttcat caacaagtac tacatcatgg 780

acatgcggcc ccagaactcc ctggtcgcct ggctggtcgc ccagggccag acggtattca 840

tgatctcctg gcgcaacccg ggcgtggccc aggcccaaat cgatctcgac gactacgtgg 900

tggatggcgt catcgccgcc ctggacggcg tggaggcggc caccggcgag cgggaggtgc 960

acggcatcgg ctactgcatc ggcggcaccg ccctgtcgct cgccatgggc tggctggcgg 1020

cgcggcgcca gaagcagcgg gtgcgcaccg ccaccctgtt cactaccctg ctggacttct 1080

cccagcccgg ggagcttggc atcttcatcc acgagcccat catagcggcg ctcgaggcgc 1140

aaaatgaggc caagggcatc atggacgggc gccagctggc ggtcagcttc agcctgctgc 1200

gggagaacag cctctactgg aactactaca tcgacagcta cctcaagggt cagagcccgg 1260

tggccttcga tctgctgcac tggaacagcg acagcaccaa tgtggcgggc aagacccaca 1320

acagcctgct gcgccgtctc tacctggaga accagctggt gaagggggag ctcaagatcc 1380

gcaacacccg catcgatctc ggcaaggtga agacccctgt gctgctggtg tcggcggtgg 1440

acgatcacat cgccctctgg cagggcacct ggcagggcat gaagctgttt ggcggggagc 1500

agcgcttcct cctggcggag tccggccaca tcgccggcat catcaacccg ccggccgcca 1560

acaagtacgg cttctggcac aacggggccg aggccgagag cccggagagc tggctggcag 1620

gggcgacgca ccagggcggc tcctggtggc ccgagatgat gggctttatc cagaaccgtg 1680

acgaagggtc agagcccgtc cccgcgcggg tcccggagga agggctggcc cccgcccccg 1740

gccactatgt caaggtgcgg ctcaaccccg tgtttgcctg cccaacagag gaggacgccg 1800

catgacgctt gcatgagtgc cggcg 1825

<210> 8

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atacagtttg 60

acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120

cagcctctac aaataatttt gtttaa 146

<210> 9

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atagcatttg 60

acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120

cagcctctac aaataatttt gtttaa 146

<210> 10

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt ataccctttg 60

acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120

cagcctctac aaataatttt gtttaa 146

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggtacccgg ccaagtctgc ctacgtccag gaaggcgtcg 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggtttggcc gcgcctcaat atcgagcatg gagatccgtt 40

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacggatctc catgctcgat attgaggcgc ggccaaac 38

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caggatgtga cgagcggtgc ccgttcttca agcgcttc 38

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctggcggttt ccaagaccg 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtgttgccgc tcaatgcgc 19

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctgggccgc cgaagtgagc ttcgacggcg tcttcgttcc 40

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgagcggtgt ggaggcatct attcagtcag ggatgcct 38

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctacaaataa ttttgtttaa ctgactgaat aggaagagca agc 43

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccctgatttc cataaggcgc cgcacgccgc gcggtgacga c 41

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttcgtggtct cggccgat 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caaagtcact gggttcccg 19

Claims

1.一种重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中引入了上调phaJ基因的启动子；所述重组富养罗尔斯通氏菌中包括引入的phaC突变基因，其中所述引入的phaC突变基因的表达使得所述重组富养罗尔斯通氏菌合成3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯。

2.根据权利要求1的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，通过同源重组的方式，在phaJ基因上游插入上调phaJ基因的启动子序列，其中所述phaJ基因是phaJ4b基因，所述启动子序列选自phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3、phaJ210启动子序列SEQ ID NO.8、phaJ183启动子序列SEQ ID NO.9和phaJ225启动子序列SEQ ID NO.10中的一种。

3.根据权利要求1或2的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中的原始phaC基因失活；phaC突变基因通过同源重组被引入至基因组或通过含有其的稳定质粒被引入而在重组富养罗尔斯通氏菌中稳定表达。

4.根据权利要求3的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求1或2的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述重组富养罗尔斯通氏菌的基因组中引入了上调phaJ基因的启动子，所述上调phaJ基因的启动子序列是phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3；并且敲除了原基因组phaC和原基因组proC基因，具体地所述原基因组phaC基因序列如SEQ ID NO.1所示，且具体地所述原基因组proC基因序列如SEQ IDNO.2所示；所述重组富养罗尔斯通氏菌中还引入了在富养罗尔斯通氏菌中稳定存在的质粒，所述质粒上装载有引入的phaC突变基因和引入的proC基因，其中所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示，并且所述引入的proC基因序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求5的重组富养罗尔斯通氏菌，其特征在于，所述重组富养罗尔斯通氏菌为菌株BPS-050，保藏编号为CGMCC No. 23600。

7.一种制备重组富养罗尔斯通氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：以富养罗尔斯通氏菌为出发菌，在所述富养罗尔斯通氏菌基因组中引入上调phaJ基因的启动子，并且在所述富养罗尔斯通氏菌中引入phaC突变基因，其中引入的phaC突变基因的表达使得所述重组富养罗尔斯通氏菌合成3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于，通过同源重组的方式，在phaJ基因上游插入启动子序列来上调phaJ基因，其中所述phaJ基因是phaJ4b基因，并且所述启动子序列选自phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3、phaJ210启动子序列SEQ ID NO.8、phaJ183启动子序列SEQID NO.9和phaJ225启动子序列SEQ ID NO.10中的一种。

9.根据权利要求7或8的方法，其特征在于，所述重组富养罗尔斯通氏菌基因组中的原始phaC基因失活；phaC突变基因通过同源重组被引入至基因组或通过含有其的稳定质粒被引入而在重组富养罗尔斯通氏菌中稳定表达。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示。

11.根据权利要求7或8的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以富养罗尔斯通氏菌为出发菌，敲除原基因组phaC和proC基因，所述敲除通过分别构建phaC基因敲除质粒和proC基因敲除质粒进行，具体地所述原基因组phaC基因序列如SEQ ID NO.1所示且具体地所述原基因组proC基因序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）在所述富养罗尔斯通氏菌基因组中引入上调phaJ基因的启动子，所述上调phaJ基因的启动子序列是phaJ43启动子序列SEQ ID NO.3；

（3）引入在富养罗尔斯通氏菌中稳定存在的质粒，所述质粒上装载有引入的phaC突变基因和/或引入的proC基因，其中所述引入的phaC突变基因序列如SEQ ID NO.5所示，并且所述引入的proC基因序列如SEQ ID NO.4所示；

所述出发菌为富养罗尔斯通氏菌Re0980。