CN112368385A - 突变型聚羟基烷酸酯合成酶、其基因及转化体、以及聚羟基烷酸酯的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其具有显示出与序列号1表示的氨基酸序列的85％以上的序列同一性、且包含序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第27位至第33位、第39位、第56位、第106位、第129位、第144位、第165位、第170位、以及第172位至第187位的氨基酸中至少1个以上的氨基酸被置换为其它氨基酸的突变的氨基酸序列。

Description

突变型聚羟基烷酸酯合成酶、其基因及转化体、以及聚羟基烷 酸酯的制造方法
技术领域
本发明涉及突变型聚羟基烷酸酯合成酶、编码该酶的基因、具有该基因的转化体、以及使用了该转化体的聚羟基烷酸酯的制造方法。
背景技术
聚羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkanoate；以下简称为“PHA”)是在很多的微生物细胞内作为储能物质而生产、积蓄的热塑性聚酯。由微生物利用各种天然的碳源而生产的PHA是可被土壤中、水中的微生物完全生物分解的环境友好型的塑料。
作为PHA，已知作为3-羟基丁酸(3-hydroxybutyrate；以下简称为“3HB”)的均聚物的聚羟基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate；以下简称为“PHB”)，但PHB为高结晶性，由于结晶度高，因此硬且脆，而且具有熔融加工性低的问题。
作为对PHB的脆性、熔融加工性进行了改善的PHA，已报告了3HB与3-羟基己酸(3-hydroxyhexanoate；以下简称为“3HH”)的共聚聚酯Poly(3HB-共-3HH)(以下简称为“PHBH”)。PHBH通过具有3HH作为单体单元而使结晶度比PHB低，因此是具有柔软的物性的共聚物。
作为PHBH的制造方法，报告了使用以土壤细菌钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)作为宿主并导入了来自于豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的PHA合成酶的转化体进行发酵生产的方法，为了提高PHBH的柔软性，进行了提高PHBH中的3HH比率的探讨。
在非专利文献1及2中，为了提高PHBH中的3HH比率，探讨了向PHA合成酶导入突变的方法。具体而言，在非专利文献1中报告了，通过对来自于A.caviae的PHA合成酶导入第149位的天冬酰胺置换为丝氨酸的突变、或第171位的天冬氨酸置换为甘氨酸的突变，可以制造PHA合成酶的活性和对3HH-CoA的底物特异性得到提高、且具有最大18摩尔％的3HH比率的PHBH。
另外，在非专利文献2中报告了，利用使该两个突变重复的PHA合成酶(以下简称为“NSDG”)，可以生产3HH比率更高的PHBH。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：T.Kichise,S.Taguchi,Y.Doi,Appl.Environ.Microbiol.,68,pp.2411-2419(2002)
非专利文献2：T.Tsuge,S.Watanabe,D.Shimada,H.Abe,Y.Doi,S.Taguchi,FEMSMicrobiol.Lett.,277,pp.217-222(2007)
发明内容
发明要解决的课题
目前，可以通过转化体的培养而生产的PHA共聚物的3HH比率受到限定。因此，希望构建可以制造3HH比率更高的PHA共聚物的PHA合成酶库。
因此，本发明的目的在于提供在保持了PHA的生产性的情况下实现高3HH比率的PHA共聚物的制造的突变型PHA合成酶、编码该酶的基因、具有该基因的转化体、以及使用了该转化体的PHA的制造方法。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过在来自于由序列号1表示的氨基酸序列构成的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的PHA合成酶PhaC Ac中，对从N末端起第27位至第33位的氨基酸、第39位、第56位、第106位、第129位、第144位、第165位及第170位的氨基酸、以及第172位至第187位的氨基酸中的至少1个氨基酸导入突变，可以在保持了PHA的生产性的情况下制造高3HH比率的PHA共聚物，从而完成了本发明。
即，本发明涉及一种突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其具有显示出与序列号1表示的氨基酸序列85％以上的序列同一性、且包含下述(A)～(C)中任意1种以上突变的氨基酸序列。
突变(A)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第27位至第33位的氨基酸中至少1个以上氨基酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(B)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第39位、第56位、第106位、第129位、第144位、第165位、以及第170位的氨基酸中至少1个以上氨基酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(C)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第172位至第187位的氨基酸中至少1个以上氨基酸被置换为其它氨基酸的突变。
优选上述(A)～(C)中任意1种以上的突变为下述(a)～(q)中任意1种以上的突变。
突变(a)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第27位的谷氨酰胺被置换为其它氨基酸的突变
突变(b)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第29位的谷氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(c)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第30位的精氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(d)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第31位的苏氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(e)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第33位的谷氨酰胺被置换为其它氨基酸的突变
突变(f)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第39位的天冬酰胺被置换为其它氨基酸的突变
突变(g)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第56位的谷氨酰胺被置换为其它氨基酸的突变
突变(h)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第106位的脯氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(i)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第129位的亮氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(j)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第144位的苏氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(k)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第165位的赖氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(l)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第170位的丝氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(m)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第176位的缬氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(n)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第179位的亮氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(o)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第180位的丙氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(p)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第181位的亮氨酸被置换为其它氨基酸的突变
突变(q)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第187位的谷氨酸被置换为其它氨基酸的突变。
以下，示例出具体的实施方式。突变(a)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第27位的谷氨酰胺被置换为丝氨酸的突变。突变(b)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第29位的谷氨酸被置换为天冬酰胺或丝氨酸的突变。突变(c)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第30位的精氨酸被置换为甘氨酸或脯氨酸的突变。突变(d)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第31位的苏氨酸被置换为脯氨酸的突变。突变(e)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第33位的谷氨酰胺被置换为异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸的突变。突变(f)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第39位的天冬酰胺被置换为丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺或色氨酸的突变。突变(g)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第56位的谷氨酰胺被置换为脯氨酸的突变。突变(h)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第106位的脯氨酸被置换为丙氨酸的突变。突变(i)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第129位的亮氨酸被置换为谷氨酰胺的突变。突变(j)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第144位的苏氨酸被置换为亮氨酸的突变。突变(k)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第165位的赖氨酸被置换为缬氨酸的突变。突变(l)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第170位的丝氨酸被置换为谷氨酰胺的突变。突变(m)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第176位的缬氨酸被置换为色氨酸的突变。突变(n)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第179位的亮氨酸被置换为精氨酸或谷氨酰胺的突变。突变(o)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第180位的丙氨酸被置换为甘氨酸、赖氨酸或精氨酸的突变。突变(p)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第181位的亮氨酸被置换为酪氨酸的突变。突变(q)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第187位的谷氨酸被置换为缬氨酸的突变。
在一个实施方式中，包含上述突变的氨基酸序列可以进一步包含序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第149位的天冬酰胺被置换为丝氨酸的突变。在另一个实施方式中，包含上述突变的氨基酸序列可以进一步包含序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第171位的天冬氨酸被置换为甘氨酸的突变。在另一个实施方式中，包含上述突变的氨基酸序列可以进一步包含序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第389位的丝氨酸被置换为半胱氨酸、异亮氨酸、苏氨酸或缬氨酸的突变。
另外，本发明涉及编码上述突变型聚羟基烷酸酯合成酶的基因。另外，也涉及具有该基因的转化体。该转化体的宿主可以是真细菌。该真细菌可以是属于贪铜菌属的细菌，也可以是钩虫贪铜菌，可以是钩虫贪铜菌H16。
另外，本发明还涉及聚羟基烷酸酯的制造方法，该方法包括对上述的转化体进行培养的工序。上述聚羟基烷酸酯优选含有3-羟基己酸作为单体单元，更优选为3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物。
发明的效果
根据本发明，可以提供在保持了PHA的生产性的状态下实现高3HH比率的PHA共聚物的制造的突变型PHA合成酶、编码该酶的基因、以及具有该基因的转化体。另外，通过对该转化体进行培养，可以发酵生产3HH比率高的PHA共聚物而不降低PHA的生产性。
具体实施方式
以下，对本发明详细地进行说明。
(突变型PHA合成酶)
本发明的突变型PHA合成酶具有显示出与序列号1表示的氨基酸序列的85％以上的序列同一性、且包含下述(A)～(C)中任意1种以上的突变的氨基酸序列。另外，本发明也提供编码该突变型PHA合成酶的基因(以下，简称为“突变型PHA合成酶基因”)。
本发明的突变型PHA合成酶是具有PHA合成活性的酶，且具有与序列号1表示的氨基酸序列为85％以上的序列同一性的氨基酸序列。序列号1表示的氨基酸序列是来自于豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的PHA合成酶PhaC Ac的氨基酸序列。本发明的突变型PHA合成酶可以在满足上述序列同一性的范围具有除下述(A)～(C)的突变以外的突变。
本发明的突变型PHA合成酶可以与具有不同功能的异种蛋白结合而形成了融合蛋白。在该情况下，计算上述序列同一性时，不考虑异种蛋白的氨基酸序列。
在本发明的突变型PHA合成酶中，与序列号1表示的氨基酸序列的序列同一性可以为85％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为97％以上，更进一步优选为98％以上，特别优选为99％以上。
本发明的突变型PHA合成酶基因的碱基序列只要是编码构成本发明的突变型PHA合成酶的氨基酸序列的碱基序列即可，没有特别限定。
对于本发明的突变型PHA合成酶及突变型PHA合成酶基因的来源，没有特别限定，优选来自于气单胞菌(Aeromonas)属，更优选来自于豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)。
接下来，对本发明的突变型PHA合成酶所包含的突变(A)～(C)进行说明。本发明的突变型PHA合成酶可以包含突变(A)～(C)中的任意1种，也可以包含2种以上的这些突变。
突变(A)：在序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第27位至第33位的氨基酸中，至少1个以上的氨基酸被置换为其它氨基酸。被置换的氨基酸可以是序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第27位、第28位、第29位、第30位、第31位、第32位、或第33位的氨基酸中的任意氨基酸。优选为第27位、第29位、第30位、第31位、或第33位的氨基酸中的任意氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。
突变(B)：在序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第39位、第56位、第106位、第129位、第144位、第165位及第170位的氨基酸中，至少1个以上的氨基酸被置换为其它氨基酸。其中，最优选为第39位的氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。
突变(C)：在序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第172位至第187位的氨基酸序列中，至少1个以上的氨基酸被置换为其它氨基酸。被置换的氨基酸可以是序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第172位、第173位、第174位、第175位、第176位、第177位、第178位、第179位、第180位、第181位、第182位、第183位、第184位、第185位、第186位、或第187位的氨基酸中的任意氨基酸。优选为第176位至第187位的氨基酸中的任意氨基酸，更优选为第176位、第179位、第180位、第181位或第187位的氨基酸中的任意氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。
另外，本发明的一个实施方式的突变型PHA合成酶具有显示出与序列号1表示的氨基酸序列的85％以上的序列同一性、且包含下述(a)～(q)中任意1种以上的突变的氨基酸序列。
接下来，对本发明的突变型PHA合成酶所包含的突变(a)～(q)进行说明。本发明的突变型PHA合成酶可以包含突变(a)～(q)中的任意1种，也可以包含2种以上的这些突变。
突变(a)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第27位的谷氨酰胺被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第27位的谷氨酰胺被置换成除谷氨酰胺以外的非极性氨基酸(例如，天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸)的突变，更优选为被置换成丝氨酸的突变。
突变(b)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第29位的谷氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第29位的谷氨酸被置换成非极性氨基酸(例如，天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺)的突变，更优选为被置换成天冬酰胺或丝氨酸的突变。
突变(c)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第30位的精氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第30位的精氨酸被置换成不容易构成α螺旋的氨基酸(例如，甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或酪氨酸)的突变，更优选为被置换成甘氨酸或脯氨酸的突变。
突变(d)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第31位的苏氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第31位的苏氨酸被置换成不容易构成α螺旋的氨基酸(例如，甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、或酪氨酸)的突变，更优选为被置换成甘氨酸或脯氨酸的突变，进一步优选为被置换成脯氨酸的突变。
突变(e)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第33位的谷氨酰胺被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第33位的谷氨酰胺被置换成疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸)的突变，从侧链的大小的观点考虑，更优选为被置换成疏水性的脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸或缬氨酸)的突变，进一步优选为被置换成异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸的突变。
突变(f)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第39位的天冬酰胺被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第39位的天冬酰胺被置换成丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺或色氨酸的突变。
突变(g)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第56位的谷氨酰胺被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第56位的谷氨酰胺被置换成不容易构成α螺旋的氨基酸(例如，甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、或酪氨酸)的突变，更优选为被置换成甘氨酸或脯氨酸的突变，进一步优选为被置换成脯氨酸的突变。
突变(h)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第106位的脯氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第106位的脯氨酸被置换成疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸)的突变，从侧链的大小的观点考虑，更优选为被置换成疏水性的脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸或缬氨酸)的突变，进一步优选为被置换成丙氨酸的突变。
突变(i)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第129位的亮氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第129位的亮氨酸被置换成非极性氨基酸(例如，天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺)的突变，更优选为被置换成谷氨酰胺的突变。
突变(j)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第144位的苏氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第144位的苏氨酸被置换成疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸)的突变，从侧链的大小的观点考虑，更优选为被置换成疏水性的脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸或缬氨酸)的突变，进一步优选为被置换成亮氨酸的突变。
突变(k)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第165位的赖氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第165位的赖氨酸被置换成疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸)的突变，从侧链的大小的观点考虑，更优选为被置换成疏水性的脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸或缬氨酸)的突变，进一步优选为被置换成缬氨酸的突变。
突变(l)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第170位的丝氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第170位的丝氨酸被置换成除丝氨酸以外的非极性氨基酸(例如，天冬酰胺、苏氨酸或谷氨酰胺)的突变，更优选为被置换成谷氨酰胺的突变。
突变(m)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第176位的缬氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第176位的缬氨酸被置换成除缬氨酸以外的疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色氨酸或酪氨酸)的突变，更优选为被置换成疏水性的芳香族氨基酸(例如，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)的突变，进一步优选为被置换成色氨酸的突变。
突变(n)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第179位的亮氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第179位的亮氨酸被置换成非极性氨基酸(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸或苏氨酸)或碱性氨基酸(例如，组氨酸、赖氨酸或精氨酸)的突变，更优选为被置换成谷氨酰胺或精氨酸的突变。
突变(o)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第180位的丙氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第180位的丙氨酸被置换成不容易构成α螺旋的氨基酸(例如，甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或酪氨酸)或碱性氨基酸(例如，组氨酸、赖氨酸或精氨酸)的突变，更优选为被置换成甘氨酸、赖氨酸或精氨酸的突变。
突变(p)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第181位的亮氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第181位的亮氨酸被置换成除亮氨酸以外的疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸)的突变，更优选为被置换成疏水性的芳香族氨基酸(例如，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)的突变，进一步优选为被置换成酪氨酸的突变。
突变(q)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第187位的谷氨酸被置换为其它氨基酸。置换后的氨基酸可以考虑到PHA生产性及生产的PHA的3HH比率来进行选择。为了在保持PHA生产性的情况下生产3HH比率高的PHA，优选为第187位的谷氨酸被置换成疏水性氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸)的突变，从侧链的大小的观点考虑，更优选为被置换成疏水性的脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸或缬氨酸)的突变，进一步优选为被置换成缬氨酸的突变。
为了进一步提高PHA的3HH比率，除了以上说明的突变以外，优选本发明的突变型PHA合成酶的氨基酸序列进一步包含序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第149位的天冬酰胺被置换为丝氨酸的突变、和/或进一步包含序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第171位的天冬氨酸被置换为甘氨酸的突变。
另外，为了进一步提高PHA的3HH比率，除了以上说明的突变以外，优选本发明的突变型PHA合成酶的氨基酸序列进一步包含序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第389位的丝氨酸被置换为半胱氨酸、异亮氨酸、苏氨酸或缬氨酸的突变。
(生产含有3HH单元的共聚PHA的转化体)
本发明的转化体是具有编码本发明的突变型PHA合成酶的基因的转化体，可以通过将该基因导入宿主微生物来制造。
作为本发明的转化体的宿主，没有特别限定，可以利用真菌(霉菌、蘑菇、酵母等)、真细菌(bacteria)、古细菌等任意微生物，优选为真细菌。作为该真细菌，例如可以举出属于罗尔斯通氏菌(Ralstonia)属、贪铜菌(Cupriavidus)属、沃特斯氏菌(Wautersia)属、气单胞菌(Aeromonas)属、埃希氏菌(Escherichia)属、产碱菌(Alcaligenes)属、假单胞菌(Pseudomonas)属等的细菌作为优选的例子。从安全性及生产性的观点考虑，更优选为属于罗尔斯通氏菌属、贪铜菌属、气单胞菌属、或沃特斯氏菌属的细菌，进一步优选为属于贪铜菌属或气单胞菌属的细菌，进一步更优选为属于贪铜菌属的细菌，特别优选为钩虫贪铜菌，最优选为钩虫贪铜菌H16株。
在制造本发明的转化体时，作为将本发明的突变型PHA合成酶基因导入宿主微生物的方法，可以利用任意的方法。作为一个例子，可以使用公知的基因重组技术将本发明的突变型PHA合成酶基因导入作为宿主的微生物所具有的染色体、质粒、巨型质粒(megaplasid)等DNA，另外，也可以将导入了该基因的质粒载体或人工染色体导入宿主微生物。但是，从保持被导入的基因的观点考虑，优选为将该基因导入微生物所具有的染色体或巨型质粒的方法，更优选为将该基因导入微生物所具有的染色体的方法。
在微生物所具有的DNA上位点特异性地置换或插入任意碱基序列的方法、或者使微生物所具有的DNA中的任意碱基序列缺失的方法是本领域技术人员已知的，可以在制造本发明的转化体时使用。尽管没有特别限定，但作为代表性的方法，可以列举：利用与转位子同源重组的机制的方法(Ohman等，J.Bacteriol.,vol.162:p.1068(1985))；以由同源重组的机制引起的位点特异性的引入和由第二阶段的同源重组所致的脱落作为原理的方法(Noti等，Methods Enzymol.,vol.154,p.197(1987))；使来自于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的sacB基因共存，并通过第二阶段的同源重组将基因脱落的微生物株作为蔗糖添加培养基抗性菌株而容易地分离的方法(Schweizer,Mol.Microbiol.,vol.6,p.1195(1992)；Lenz等，J.Bacteriol.,vol.176,p.4385(1994))等。另外，作为向微生物导入载体的方法，也没有特别限定，例如可列举出氯化钙法、电穿孔法、聚乙二醇法、原生质球法等。
需要说明的是，关于基因克隆、基因重组技术，可以利用Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989或2001)等中记载的技术。
在导入本发明的突变型PHA合成酶基因时，可以将该基因连接于任意的表达调节序列。在本说明书中，表达调节序列记载为由启动子和SD序列(Shine-Dalgarno sequence)构成的序列。作为这样的表达调节序列，可以使用例如钩虫贪铜菌的phaC1基因的表达调节序列(序列号2)、phaP1基因的表达调节序列(序列号3)。或者，将来自于大肠杆菌的lac启动子(序列号4)、trp启动子(序列号5)、或人工制备的lacUV5启动子(序列号6)、trc启动子(序列号7)、tic启动子(序列号8)、tac启动子(序列号9)、lacN17启动子(序列号10)等与来自钩虫贪铜菌H16株的SD序列(序列号11)连接而作为表达调节序列来使用。
(PHA的制造方法)
通过对本发明的转化体进行培养，使该转化体生产PHA，并对得到的PHA进行回收，由此可以制造PHA。
在本发明的PHA的生产中，优选在包含碳源、作为除碳源以外的营养源的氮源、无机盐类、其它有机营养源的培养基中对上述转化体进行培养。
作为碳源，只要是本发明的转化体能够同化的包含油脂和/或脂肪酸等的碳源即可，没有特别限定，可以使用任意的碳源，可具体列举出棕榈油、棕榈仁油、玉米油、椰子油、橄榄油、大豆油、菜籽油、麻疯树油(Jatropha oil)等油脂、其分离油类；月桂酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等脂肪酸、其衍生物等。
作为氮源，例如可列举出氨；氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐；蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等。
作为无机盐类，例如可列举出磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。
作为其它有机营养源，例如可列举出甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸；维生素B1、维生素B12、维生素C等维生素等。
本发明的转化体进行培养时的培养温度、培养时间、培养时pH、培养基等的条件可以是在培养例如罗尔斯通氏菌属、贪铜菌属、沃特斯氏菌属、气单胞菌属、埃希氏菌属、产碱菌属、假单胞菌属等的微生物时通常使用的条件，没有特别限定。
作为本发明中生产的PHA的种类，只要是含有3HH作为单体单元的PHA共聚物即可，没有特别限定。其中，优选为将选自碳原子数4～16的2-羟基烷酸、3-羟基烷酸(3HH除外)及4-羟基烷酸中的1种以上单体与3HH聚合而得到的PHA共聚物，最优选为作为3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物的P(3HB-共-3HH)。需要说明的是，生产的共聚PHA的种类可以根据待使用的微生物所具有的或另行导入的PHA合成酶基因的种类、参与PHA合成的代谢体系的基因的种类、培养所使用的碳源、其它培养条件等而适当选择。
在本发明中，对培养转化体后从菌体回收PHA没有特别限定，例如可以通过公知的方法来进行。作为一个例子，可以通过以下的方法来回收PHA。在培养结束后，利用离心分离机等从培养液中分离菌体，通过蒸馏水、甲醇等对该菌体进行清洗，使其干燥。使用氯仿等有机溶剂从该干燥菌体中提取PHA。通过过滤等从包含该PHA的有机溶剂溶液中去除菌体成分，在该滤液中加入甲醇、己烷等不良溶剂，使PHA沉淀。进一步，通过过滤、离心分离去除上清液，使其干燥，回收PHA。
得到的PHA中包含的3HH单元等的单体单元组成(mol％)的分析例如可以利用气相色谱法、核磁共振法等来实施。
实施例
以下，通过实施例详细地对本发明进行说明，但本发明并不受这些实施例的限定。
以下说明的基因操作可以参照Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))的记载来实施。另外，基因操作中使用的酶、克隆宿主等可以从市场供应商处购入，并按照其说明来使用。需要说明的是，作为上述酶，只要可用于基因操作即可，没有特别限定。
(制造例1)H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株的制备
首先，制备了phaC1基因破坏用质粒。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有phaC1基因的上游及下游的碱基序列的DNA片段(序列号12)。用限制性酶SwaI将得到的DNA片段消化。将该DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB连接，制备了具有phaC1的上游及下游的碱基序列的基因破坏用质粒载体pNS2X-sacB-phaC1UL。
接下来，使用pNS2X-sacB-phaC1UL制备了ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株。将pNS2X-sacB-phaC1UL导入大肠杆菌S17-1株(ATCC47055)。将得到的转化体和KNK005 trc-phaJ4bΔphaZ1,2,6株(参照国际公开第2015/115619号)在Nutrient Agar培养基(Difco公司制)上进行混合培养，进行了接合转移(conjugation transfer)。
将得到的培养液接种于包含250mg/L的卡那霉素的Simmons’琼脂培养基(柠檬酸钠2g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢铵1g/L、磷酸氢二钾1g/L、琼脂15g/L、pH6.8)，得到了在KNK005 trc-phaJ4bΔphaZ1,2,6株的染色体上导入了pNS2X-sacB-phaC1UL的菌株。将该菌株用Nutrient Broth培养基(Difco公司制)进行两代培养后，稀释并涂布在包含15％的蔗糖的Nutrient Agar培养基上，得到了质粒脱落后的菌株。通过基于PCR及DNA测序仪的分析，从得到的转化体中分离出了将染色体上的phaC1基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该基因破坏株命名为H16ΔphaC1Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株。
得到的H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株是如下菌株：使钩虫贪铜菌H16株的染色体上的phaZ1基因及phaZ6基因的起始密码子至终止密码子缺失，进一步将phaZ2基因的第16位的密码子至终止密码子缺失，染色体上的R体特异性烯酰辅酶A水合酶基因的表达增强，进一步使phaC1基因的起始密码子至终止密码子缺失的菌株。
(制造例2)pCUP2-Ptrp-NSDG的制备
通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号13所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。利用In-fusion HD Cloning Kit(TAKARA BIO公司)将得到的DNA片段与使用MunI和SpeI对日本特开2007-259708号公报中记载的pCUP2载体进行消化而得到的DNA片段连接，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG。pCUP2-Ptrp-NSDG是在trp启动子下表达NSDG的质粒。
NSDG是由序列号14表示的氨基酸序列组成的突变型PHA合成酶，其是对序列号1表示的氨基酸序列导入了N末端起第149位的天冬酰胺置换为丝氨酸及第171位的天冬氨酸置换为甘氨酸这2种突变而成的突变型PHA合成酶。
(制造例3)pCUP2-Ptrp-NSDG-Q27S的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号15所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-Q27S。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q27S是在trp启动子下表达NSDG-Q27S的质粒。
NSDG-Q27S是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第27位的谷氨酰胺置换为丝氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例4)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号16所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N是在trp启动子下表达NSDG-E29N的质粒。
NSDG-E29N是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为天冬酰胺的突变型PHA合成酶。
(制造例5)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号17所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S是在trp启动子下表达NSDG-E29S的质粒。
NSDG-E29S是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为丝氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例6)pCUP2-Ptrp-NSDG-R30G的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号18所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-R30G。pCUP2-Ptrp-NSDG-R30G是在trp启动子下表达NSDG-R30G的质粒。
NSDG-R30G是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第30位的精氨酸置换为甘氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例7)pCUP2-Ptrp-NSDG-R30P的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号19所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-R30P。pCUP2-Ptrp-NSDG-R30P是在trp启动子下表达NSDG-R30P的质粒。
NSDG-R30P是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第30位的精氨酸置换为脯氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例8)pCUP2-Ptrp-NSDG-T31P的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号20所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-T31P。pCUP2-Ptrp-NSDG-T31P是在trp启动子下表达NSDG-T31P的质粒。
NSDG-T31P是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第31位的苏氨酸置换为脯氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例9)pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33I的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号21所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33I。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33I是在trp启动子下表达NSDG-Q33I的质粒。
NSDG-Q33I是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第33位的谷氨酰胺置换为异亮氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例10)pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33L的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号22所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33L。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33L是在trp启动子下表达NSDG-Q33L的质粒。
NSDG-Q33L是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第33位的谷氨酰胺置换为亮氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例11)pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33V的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号23所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33V。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33V是在trp启动子下表达NSDG-Q33V的质粒。
NSDG-Q33V是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第33位的谷氨酰胺置换为缬氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例12)pCUP2-Ptrp-NSDG-N39A的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号24所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-N39A。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39A是在trp启动子下表达NSDG-N39A的质粒。
NSDG-N39A是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第39位的天冬酰胺置换为丙氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例13)pCUP2-Ptrp-NSDG-N39C的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号25所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-N39C。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39C是在trp启动子下表达NSDG-N39C的质粒。
NSDG-N39C是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第39位的天冬酰胺置换为半胱氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例14)pCUP2-Ptrp-NSDG-N39F的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号26所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-N39F。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39F是在trp启动子下表达NSDG-N39F的质粒。
NSDG-N39F是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第39位的天冬酰胺置换为苯丙氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例15)pCUP2-Ptrp-NSDG-N39H的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号27所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-N39H。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39H是在trp启动子下表达NSDG-N39H的质粒。
NSDG-N39H是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第39位的天冬酰胺置换为组氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例16)pCUP2-Ptrp-NSDG-N39I的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号28所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-N39I。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39I是在trp启动子下表达NSDG-N39I的质粒。
NSDG-N39I是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第39位的天冬酰胺置换为异亮氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例17)pCUP2-Ptrp-NSDG-N39M的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号29所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-N39M。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39M是在trp启动子下表达NSDG-N39M的质粒。
NSDG-N39M是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第39位的天冬酰胺置换为蛋氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例18)pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Q的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号30所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Q。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Q是在trp启动子下表达NSDG-N39Q的质粒。
NSDG-N39Q是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第39位的天冬酰胺置换为谷氨酰胺的突变型PHA合成酶。
(制造例19)pCUP2-Ptrp-NSDG-N39W的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号31所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-N39W。pCUP2-Ptrp-NSDG-N39W是在trp启动子下表达NSDG-N39W的质粒。
NSDG-N39W是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第39位的天冬酰胺置换为色氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例20)pCUP2-Ptrp-NSDG-Q56P的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号32所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-Q56P。pCUP2-Ptrp-NSDG-Q56P是在trp启动子下表达NSDG-Q56P的质粒。
NSDG-Q56P是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第56位的谷氨酰胺置换为脯氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例21)pCUP2-Ptrp-NSDG-P106A的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号33所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-P106A。pCUP2-Ptrp-NSDG-P106A是在trp启动子下表达NSDG-P106A的质粒。
NSDG-P106A是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第106位的脯氨酸置换为丙氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例22)pCUP2-Ptrp-NSDG-L129Q的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号34所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-L129Q。pCUP2-Ptrp-NSDG-L129Q是在trp启动子下表达NSDG-L129Q的质粒。
NSDG-L129Q是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第129位的亮氨酸置换为谷氨酰胺的突变型PHA合成酶。
(制造例23)pCUP2-Ptrp-NSDG-T144L的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号35所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-T144L。pCUP2-Ptrp-NSDG-T144L是在trp启动子下表达NSDG-T144L的质粒。
NSDG-T144L是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第144位的苏氨酸置换为亮氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例24)pCUP2-Ptrp-NSDG-K165V的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号36所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-K165V。pCUP2-Ptrp-NSDG-K165V是在trp启动子下表达NSDG-K165V的质粒。
NSDG-K165V是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第165位的赖氨酸置换为缬氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例25)pCUP2-Ptrp-NSDG-S170Q的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号37所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-S170Q。pCUP2-Ptrp-NSDG-S170Q是在trp启动子下表达NSDG-S170Q的质粒。
NSDG-S170Q是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第170位的丝氨酸置换为谷氨酰胺的突变型PHA合成酶。
(制造例26)pCUP2-Ptrp-NSDG-V176W的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号38所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-V176W。pCUP2-Ptrp-NSDG-V176W是在trp启动子下表达NSDG-V176W的质粒。
NSDG-V176W是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第176位的缬氨酸置换为色氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例27)pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Q的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号39所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Q。pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Q是在trp启动子下表达NSDG-L179Q的质粒。
NSDG-L179Q是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第179位的亮氨酸置换为谷氨酰胺的突变型PHA合成酶。
(制造例28)pCUP2-Ptrp-NSDG-L179R的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号40所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-L179R。pCUP2-Ptrp-NSDG-L179R是在trp启动子下表达NSDG-L179R的质粒。
NSDG-L179R是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第179位的亮氨酸置换为精氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例29)pCUP2-Ptrp-NSDG-A180G的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号41所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-A180G。pCUP2-Ptrp-NSDG-A180G是在trp启动子下表达NSDG-A180G的质粒。
NSDG-A180G是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第180位的丙氨酸置换为甘氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例30)pCUP2-Ptrp-NSDG-A180K的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号42所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-A180K。pCUP2-Ptrp-NSDG-A180K是在trp启动子下表达NSDG-A180K的质粒。
NSDG-A180K是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第180位的丙氨酸置换为赖氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例31)pCUP2-Ptrp-NSDG-A180R的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号43所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-A180R。pCUP2-Ptrp-NSDG-A180R是在trp启动子下表达NSDG-A180R的质粒。
NSDG-A180R是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第180位的丙氨酸置换为精氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例32)pCUP2-Ptrp-NSDG-L181Y的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号44所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-L181Y。pCUP2-Ptrp-NSDG-L181Y是在trp启动子下表达NSDG-L181Y的质粒。
NSDG-L181Y是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第181位的亮氨酸置换为酪氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例33)pCUP2-Ptrp-NSDG-E187V的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号45所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-E187V。pCUP2-Ptrp-NSDG-E187V是在trp启动子下表达NSDG-E187V的质粒。
NSDG-E187V是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第187位的天冬氨酸置换为缬氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例34)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号46所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K是在trp启动子下表达NSDG-E29N-A180K的质粒。
NSDG-E29N-A180K是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为天冬酰胺、并将第180位的丙氨酸置换为赖氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例35)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号47所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R是在trp启动子下表达NSDG-E29N-A180R的质粒。
NSDG-E29N-A180R是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为天冬酰胺、并将第180位的丙氨酸置换为精氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例36)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号48所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K是在trp启动子下表达NSDG-E29S-A180K的质粒。
NSDG-E29S-A180K是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为丝氨酸、并将第180位的丙氨酸置换为赖氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例37)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号49所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R是在trp启动子下表达NSDG-E29S-A180R的质粒。
NSDG-E29S-A180R是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为丝氨酸、并将第180位的丙氨酸置换为精氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例38)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K-S389T的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号50所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NS DG-E29N-A180K-S389T。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K-S389T是在trp启动子下表达NSDG-E29N-A180K-S389T的质粒。
NSDG-E29N-A180K-S389T是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为天冬酰胺、将第180位的丙氨酸置换为赖氨酸、并将第389位的丝氨酸置换为苏氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例39)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R-S389T的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号51所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NS DG-E29N-A180R-S389T。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R-S389T是在trp启动子下表达NSDG-E29N-A180R-S389T的质粒。
NSDG-E29N-A180R-S389T是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为天冬酰胺、将第180位的丙氨酸置换为精氨酸、并将第389位的丝氨酸置换为苏氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例40)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K-S389T的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号52所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K-S389T。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K-S389T是在trp启动子下表达NSDG-E29S-A180K-S389T的质粒。
NSDG-E29S-A180K-S389T是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为丝氨酸、将第180位的丙氨酸置换为赖氨酸、并将第389位的丝氨酸置换为苏氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例41)pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R-S389T的制备
以制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG作为模板，通过使用了合成寡聚DNA等的PCR，对具有序列号53所示的碱基序列的DNA片段进行了扩增。通过与制造例2相同的方法将其克隆至pCUP2载体，得到了pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R-S389T。pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R-S389T是在trp启动子下表达NSDG-E29S-A180R-S389T的质粒。
NSDG-E29S-A180R-S389T是对于序列号14表示的氨基酸序列，将N末端起第29位的天冬氨酸置换为丝氨酸、将第180位的丙氨酸置换为精氨酸、并将第389位的丝氨酸置换为苏氨酸的突变型PHA合成酶。
(制造例42)对H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6导入各质粒
首先，用Nutrient Broth培养基(DIFCO)将制造例1中制备的H16ΔphaC1Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6株培养过夜。将得到的培养液0.5mL接种于Nutrient Broth培养基100mL，在30℃下培养3小时。在冰上将得到的培养液快速冷却，回收菌体，并用冰冷的蒸馏水充分清洗，然后将得到的菌体悬浮于2mL蒸馏水。将菌体液与制造例2中制备的pCUP2-Ptrp-NSDG质粒溶液混合，注入样品杯(cuvette)进行了电穿孔。电穿孔使用MicroPulser电穿孔仪(Bio-Rad公司)在电压1.5kV、电阻800Ω、电流25μF的条件下进行。在电穿孔后，将菌体溶液回收，添加5mL的Nutrient Broth培养基，在30℃下培养3小时。将得到的培养液涂布于包含100mg/L卡那霉素硫酸盐的Nutrient Agar培养基。在30℃下培养3天，从得到的菌落中得到了导入质粒的菌株。将得到的菌株命名为H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG株。
通过相同的方法导入制造例3～41中制备的各质粒，将得到的菌株分别命名为：H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q27S株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4bdZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-R30G株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-R30P株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-T31P株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33I株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33L株、H16 ΔphaC1Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33V株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39A株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39C株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39F株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4bdZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39H株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39I株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39M株、H16ΔphaC1Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Q株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39W株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q56P株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-P106A株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L129Q株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-T144L株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ 1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-K165V株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-S170Q株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4bdZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-V176W株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Q株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-179R株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-A180G株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4bdZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-A180K株、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-A180R株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L181Y株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E187V株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4bdZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R株、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K株、H16 Δp haC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R株、H16 ΔphaC1Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K-S389T株、H16 ΔphaC1Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R-S389T株、H16 ΔphaC1Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K-S389T株、H16 Δpha C1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R-S389T株。
(PHA中的3HH比率的分析方法)
向包含PHA的干燥菌体约20mg中添加1mL的硫酸-甲醇混合液(15∶85)和1mL的氯仿并密封，在100℃下加热140分钟，由此得到了PHA分解物的甲酯。在冷却后，向其中加入0.5mL的去离子水并充分进行混合，然后放置，直至水层和有机层发生分离。然后，利用毛细管气象色谱仪对分离得到的有机层中的PHA分解物的单体单元组成进行分析。根据得到的峰面积计算出3HH比率。
气象色谱仪使用了株式会社岛津制作所制造的GC-17A，毛细管柱使用了GLSCIENCE公司制造NEUTRA BOND-1(柱长25m、色谱柱内径0.25mm、液膜厚0.4μm)。作为载气，使用了He，柱入口压力设为100kPa，样品注入了1μL。温度条件为从起始温度50℃至200℃以8℃/分的速度升温，进一步从200℃至290℃以30℃/分的速度升温。
(比较例1)基于H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG株进行的PHA生产
种子培养基的组成设为10g/L肉提取物、10g/L Bacto胰蛋白胨、2g/L酵母提取物、9g/L磷酸二氢钠十二水合物、1.5g/L磷酸氢二钾、100μg/L卡那霉素硫酸盐。
PHA生产培养基的组成设为11g/L磷酸氢二钠十二水合物、1.9g/L磷酸氢二钾、1.3g/L硫酸铵、5mL/L镁溶液、1mL/L微量金属盐溶液。镁溶液将200g/L硫酸镁七水合物溶于水中而制备。微量金属盐溶液将0.218g/L氯化钴六水合物、16.2g/L氯化铁(III)六水合物、10.3g/L氯化钙二水合物、0.118g/L氯化镍六水合物、0.156g/L硫酸铜五水合物溶于0.1N盐酸中而制备。
将制造例42中制备的H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG株的甘油原液50μL接种于种子培养基10mL，在30℃下振荡培养24小时。将得到的培养液作为前培养液。
PHA生产培养在烧瓶中进行。在500mL容量的振荡烧瓶中加入PHA生产培养基50mL。在即将进行菌株接种前添加镁溶液250μL、微量金属溶液50μL、棕榈仁油1g。在制备培养基后，向振荡烧瓶中接种前培养液500μL，在30℃下进行了72小时振荡培养。在培养结束后，从培养液10mL中回收菌体，用乙醇清洗后，在60℃下真空干燥，得到包含PHA的干燥菌体，测定了干燥菌体重量。
将干燥菌体重量及3HH比率的结果示于表1及表2。
(实施例1～39)利用各质粒导入株进行的PHA生产
使用制造例42中制备的以下菌株用与比较例1相同的方法进行培养并分析了干燥菌体重量及3HH比率：H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q27S株(实施例1)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N株(实施例2)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S株(实施例3)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-R30G株(实施例4)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-R30P株(实施例5)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-T31P株(实施例6)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33I株(实施例7)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33L株(实施例8)、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q33V株(实施例9)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39A株(实施例10)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39C株(实施例11)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39F株(实施例12)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39H株(实施例13)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39I株(实施例14)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39M株(实施例15)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39Q株(实施例16)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-N39W株(实施例17)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-Q56P株(实施例18)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-P106A株(实施例19)、H16 Δp haC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L129Q株(实施例20)、H16 Δp haC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-T144L株(实施例21)、H16 Δph aC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-K165V株(实施例22)、H16 Δph aC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-S170Q株(实施例23)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-V176W株(实施例24)、H16 Δph aC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L179Q株(实施例25)、H16 Δph aC1 Ptrc-phaJ4bdZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-179R株(实施例26)、H16 Δpha C1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-A180G株(实施例27)、H16 Δpha C1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-A180K株(实施例28)、H16 Δpha C1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-A180R株(实施例29)、H16 Δpha C1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-L181Y株(实施例30)、H16 Δpha C1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E187V株(实施例31)、H16 Δpha C1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K株(实施例32)、H16ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R株(实施例33)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K株(实施例34)、H16 ΔphaC1Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R株(实施例35)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180K-S389T株(实施例36)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29N-A180R-S389T株(实施例37)、H16 ΔphaC1 Ptrc-phaJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180K-S389T株(实施例38)、H16 ΔphaC1 Ptrc-ph aJ4b dZ1,2,6/pCUP2-Ptrp-NSDG-E29S-A180R-S389T株(实施例39)。将结果示于表1及表2。
[表1]
Figure BDA0002833714220000301
[表2]
Figure BDA0002833714220000311
＜考察＞
根据表1的结果可以确认，对于具有Q27S、E29N、E29S、R30G、R30P、T31P、Q33I、Q33L、Q33V、N39A、N39C、N39F、N39H、N39I、N39M、N39Q、N39W、Q56P、P106A、L129Q、T144L、K165V、S170Q、V176W、L179Q、L179R、A180G、A180K、A180R、L181Y、或E187V的突变的实施例1～31的PHA合成酶而言，3HH比率升高。另外，由于在任意的实施例中干燥菌体重量与比较例1为相同程度，因此可以认为PHA生产性没有变化。根据以上的结果可知，具有这些突变的PHA合成酶对于在保持聚合物生产性的情况下制造3HH比率高的PHA是有用的。
另外，通过实施例1～9可知，为了提高3HH比率，对PHA合成酶的氨基酸序列从N末端起第27～33位的氨基酸进行突变导入特别有效。另外，通过实施例10～17可知，为了提高3HH比率，对PHA合成酶的氨基酸序列从N末端起第39位的天冬酰胺进行突变导入特别有效。另外，通过实施例18～23可知，为了提高3HH比率，对PHA合成酶的氨基酸序列从N末端起第56位、第106位、第129位、第144位、第165位及第170位的氨基酸进行突变导入是有效的。此外，通过实施例24～31可知，为了提高3HH比率，对PHA合成酶的氨基酸序列从N末端起第172～187位的氨基酸进行突变导入特别有效。根据以上的结果，本领域技术人员可以容易地类推，PHA合成酶的氨基酸序列从N末端起第27～33位、第39位、第56位、第106位、第129位、第144位、第165位、第170位、以及172～187位的氨基酸是在提高3HH组成方面极其有效的突变导入位点。
接下来，根据表2所示的实施例32～35可知，E29N或E29S的突变和A180K或A180R的突变的组合均可通过突变重复而获得相加的效果。由此可知，为了进一步提高3HH组成，通过将对于PHA合成酶的氨基酸序列从N末端起第27～33位、第39位、第56位、第106位、第129位、第144位、第165位、第170位、以及第172～187位的氨基酸的突变中2个以上突变任意组合并重复导入，可以得到有用的突变型PHA合成酶。
同样地根据表2所示的实施例36～39可知，通过将E29N-A180K、E29N-A180R、E29S-A180K、或E29S-A180R的突变与S389T的突变组合并重复导入，3HH比率进一步提高。目前已知，作为对于S389的突变，S389C、S389F、S389I及S389T对3HH组成的提高是有效的。根据以上可知，为了进一步提高3HH组成，通过将对于PHA合成酶的氨基酸序列从N末端起第27～33位、第39位、第56位、第106位、第129位、第144位、第165位、第170位、以及172～187位的氨基酸的突变、与S389C、S389F、S389I或S389T突变中的任意突变进行组合并重复导入，可以得到有用的突变型PHA合成酶。
序列表
<110> 株式会社钟化（Kaneka Corporation）
<120> 突变型聚羟基烷酸酯合成酶、其基因及转化体、以及聚羟基烷酸酯的制造方法
<130> B180347
<150> JP 2018-114298
<151> 2018-06-15
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 594
<212> PRT
<213> 豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)
<400> 1
Met Ser Gln Pro Ser Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ala His Tyr
1 5 10 15
Asn Asp Lys Leu Leu Ala Met Ala Lys Ala Gln Thr Glu Arg Thr Ala
20 25 30
Gln Ala Leu Leu Gln Thr Asn Leu Asp Asp Leu Gly Gln Val Leu Glu
35 40 45
Gln Gly Ser Gln Gln Pro Trp Gln Leu Ile Gln Ala Gln Met Asn Trp
50 55 60
Trp Gln Asp Gln Leu Lys Leu Met Gln His Thr Leu Leu Lys Ser Ala
65 70 75 80
Gly Gln Pro Ser Glu Pro Val Ile Thr Pro Glu Arg Ser Asp Arg Arg
85 90 95
Phe Lys Ala Glu Ala Trp Ser Glu Gln Pro Ile Tyr Asp Tyr Leu Lys
100 105 110
Gln Ser Tyr Leu Leu Thr Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Val Asp Ala
115 120 125
Leu Glu Gly Val Pro Gln Lys Ser Arg Glu Arg Leu Arg Phe Phe Thr
130 135 140
Arg Gln Tyr Val Asn Ala Met Ala Pro Ser Asn Phe Leu Ala Thr Asn
145 150 155 160
Pro Glu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Glu Ser Asp Gly Gln Asn Leu Val
165 170 175
Arg Gly Leu Ala Leu Leu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Ser Ala Asp Gln
180 185 190
Leu Asn Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Leu Gly Arg Asp
195 200 205
Leu Ala Leu Thr Pro Gly Arg Val Val Gln Arg Thr Glu Leu Tyr Glu
210 215 220
Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Thr Val Gly Lys Thr Pro Val
225 230 235 240
Leu Ile Val Pro Pro Phe Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Met Asp Met Arg
245 250 255
Pro Gln Asn Ser Leu Val Ala Trp Leu Val Ala Gln Gly Gln Thr Val
260 265 270
Phe Met Ile Ser Trp Arg Asn Pro Gly Val Ala Gln Ala Gln Ile Asp
275 280 285
Leu Asp Asp Tyr Val Val Asp Gly Val Ile Ala Ala Leu Asp Gly Val
290 295 300
Glu Ala Ala Thr Gly Glu Arg Glu Val His Gly Ile Gly Tyr Cys Ile
305 310 315 320
Gly Gly Thr Ala Leu Ser Leu Ala Met Gly Trp Leu Ala Ala Arg Arg
325 330 335
Gln Lys Gln Arg Val Arg Thr Ala Thr Leu Phe Thr Thr Leu Leu Asp
340 345 350
Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gly Ile Phe Ile His Glu Pro Ile Ile
355 360 365
Ala Ala Leu Glu Ala Gln Asn Glu Ala Lys Gly Ile Met Asp Gly Arg
370 375 380
Gln Leu Ala Val Ser Phe Ser Leu Leu Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Trp
385 390 395 400
Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Gly Gln Ser Pro Val Ala Phe
405 410 415
Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Ser Thr Asn Val Ala Gly Lys Thr
420 425 430
His Asn Ser Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Leu Glu Asn Gln Leu Val Lys
435 440 445
Gly Glu Leu Lys Ile Arg Asn Thr Arg Ile Asp Leu Gly Lys Val Lys
450 455 460
Thr Pro Val Leu Leu Val Ser Ala Val Asp Asp His Ile Ala Leu Trp
465 470 475 480
Gln Gly Thr Trp Gln Gly Met Lys Leu Phe Gly Gly Glu Gln Arg Phe
485 490 495
Leu Leu Ala Glu Ser Gly His Ile Ala Gly Ile Ile Asn Pro Pro Ala
500 505 510
Ala Asn Lys Tyr Gly Phe Trp His Asn Gly Ala Glu Ala Glu Ser Pro
515 520 525
Glu Ser Trp Leu Ala Gly Ala Thr His Gln Gly Gly Ser Trp Trp Pro
530 535 540
Glu Met Met Gly Phe Ile Gln Asn Arg Asp Glu Gly Ser Glu Pro Val
545 550 555 560
Pro Ala Arg Val Pro Glu Glu Gly Leu Ala Pro Ala Pro Gly His Tyr
565 570 575
Val Lys Val Arg Leu Asn Pro Val Phe Ala Cys Pro Thr Glu Glu Asp
580 585 590
Ala Ala
<210> 2
<211> 842
<212> DNA
<213> 富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
<400> 2
cccgggcaag taccttgccg acatctatgc gctggcgcgc acgcgcctgg cgcgcgccgg 60
ctgtaccgag gtctacggcg gcgacgcctg caccgtggcc gacgccggtc gcttctactc 120
ctatcggcgc gatggcgtga ccggccgcat ggccagcctg gtctggctgg cggactgagc 180
ccgccgctgc ctcactcgtc cttgcccctg gccgcctgcg cgcgctcggc ttcagccttg 240
cgtcggcggc ggccgggcgt gcccatgatg tagagcacca gcgccaccgg cgccatgcca 300
tacatcagga aggtggcaac gcctgccacc acgttgtgct cggtgatcgc catcatcagc 360
gccacgtaga gccagccaat ggccacgatg tacatcaaaa attcatcctt ctcgcctatg 420
ctctggggcc tcggcagatg cgagcgctgc ataccgtccg gtaggtcggg aagcgtgcag 480
tgccgaggcg gattcccgca ttgacagcgc gtgcgttgca aggcaacaat ggactcaaat 540
gtctcggaat cgctgacgat tcccaggttt ctccggcaag catagcgcat ggcgtctcca 600
tgcgagaatg tcgcgcttgc cggataaaag gggagccgct atcggaatgg acgcaagcca 660
cggccgcagc aggtgcggtc gagggcttcc agccagttcc agggcagatg tgccggcaga 720
ccctcccgct ttgggggagg cgcaagccgg gtccattcgg atagcatctc cccatgcaaa 780
gtgccggcca gggcaatgcc cggagccggt tcgaatagtg acggcagaga gacaatcaaa 840
tc 842
<210> 3
<211> 268
<212> DNA
<213> 富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
<400> 3
catggccctc gccggagcgc cccggagtgg cgtcacagcc gctcccgtgt atcgccagca 60
acgttgtttg tgcattgcac aaaatccact tgacattgga tctggcgccc ctaaaatagg 120
aattgttgcg gcgcaccaaa taagaaatgc gccttgaccc acccacacgc ctgggctggc 180
cgaatcgggc acaacaccgt cacggccctg acatctaggc ggcttaattt gctagacctt 240
gaagttcacc actggagacc agcaattg 268
<210> 4
<211> 123
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 4
gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 60
gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacaa 120
ttg 123
<210> 5
<211> 232
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 5
tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc tgtggtatgg ctgtgcaggt cgtaaatcac 60
tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc ccgttctgga taatgttttt tgcgccgaca 120
tcataacggt tctggcaaat attctgaaat gagctgttga caattaatca tcgaactagt 180
taactagtac gcaagttcac agcggataac aatttcacac aggaaacaat tg 232
<210> 6
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mutated promoter sequence derived from Escherichia coli
<400> 6
gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 60
gcttccggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacaa 120
ttg 123
<210> 7
<211> 236
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mutated promoter sequence derived from Escherichia coli
<400> 7
caattgtgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta 60
aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 120
ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg 180
gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa caattg 236
<210> 8
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mutated promoter sequence derived from Escherichia coli
<400> 8
caattgtgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta 60
aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 120
ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgc 180
ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acaattg 237
<210> 9
<211> 235
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mutated promoter sequence derived from Escherichia coli
<400> 9
caattgtgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta 60
aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg 120
ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg 180
ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac aattg 235
<210> 10
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mutated promoter sequence derived from Escherichia coli
<400> 10
caattggcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 60
cttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga 120
aacaattg 128
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
<400> 11
cacgtgcaga gagacaatca aatc 24
<210> 12
<211> 1056
<212> DNA
<213> 富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
<400> 12
gcgcgcattt aaatctgcca ccacgttgtg ctcggtgatc gccatcatca gcgccacgta 60
gagccagcca atggccacga tgtacatcaa aaattcatcc ttctcgccta tgctctgggg 120
cctcggcaga tgcgagcgct gcataccgtc cggtaggtcg ggaagcgtgc agtgccgagg 180
cggattcccg cattgacagc gcgtgcgttg caaggcaaca atggactcaa atgtctcgga 240
atcgctgacg attcccaggt ttctccggca agcatagcgc atggcgtctc catgcgagaa 300
tgtcgcgctt gccggataaa aggggagccg ctatcggaat ggacgcaagc cacggccgca 360
gcaggtgcgg tcgagggctt ccagccagtt ccagggcaga tgtgccggca gaccctcccg 420
ctttggggga ggcgcaagcc gggtccattc ggatagcatc tccccatgca aagtgccggc 480
cagggcaatg cccggagccg gttcgaatag tgacggcaga gagacaatca aatccgcttg 540
catgagtgcc ggcgtgcgtc atgcacggcg ccggcaggcc tgcaggttcc ctcccgtttc 600
cattgaaagg actacacaat gactgacgtt gtcatcgtat ccgccgcccg caccgcggtc 660
ggcaagtttg gcggctcgct ggccaagatc ccggcaccgg aactgggtgc cgtggtcatc 720
aaggccgcgc tggagcgcgc cggcgtcaag ccggagcagg tgagcgaagt catcatgggc 780
caggtgctga ccgccggttc gggccagaac cccgcacgcc aggccgcgat caaggccggc 840
ctgccggcga tggtgccggc catgaccatc aacaaggtgt gcggctcggg cctgaaggcc 900
gtgatgctgg ccgccaacgc gatcatggcg ggcgacgccg agatcgtggt ggccggcggc 960
caggaaaaca tgagcgccgc cccgcacgtg ctgccgggct cgcgcgatgg tttccgcatg 1020
ggcgatgcca agctggtcga caatttaaat gcgcgc 1056
<210> 13
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 13
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 120
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 180
ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg aactagttaa ctagtacgca agttcacagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacaattgc acgtgcagag agacaatcaa atcatgagcc 300
aaccatctta tggcccgctg ttcgaggccc tggcccacta caatgacaag ctgctggcca 360
tggccaaggc ccagacagag cgcaccgccc aggcgctgct gcagaccaat ctggacgatc 420
tgggccaggt gctggagcag ggcagccagc aaccctggca gctgatccag gcccagatga 480
actggtggca ggatcagctc aagctgatgc agcacaccct gctcaaaagc gcaggccagc 540
cgagcgagcc ggtgatcacc ccggagcgca gcgatcgccg cttcaaggcc gaggcctgga 600
gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
tggcctcggt ggatgccctg gagggcgtcc cccagaagag ccgggagcgg ctgcgtttct 720
tcacccgcca gtacgtcagc gccatggccc ccagcaactt cctggccacc aaccccgagc 780
tgctcaagct gaccctggag tccggcggcc agaacctggt gcgcggactg gccctcttgg 840
ccgaggatct ggagcgcagc gccgatcagc tcaacatccg cctgaccgac gaatccgcct 900
tcgagctcgg gcgggatctg gccctgaccc cgggccgggt ggtgcagcgc accgagctct 960
atgagctcat tcagtacagc ccgactaccg agacggtggg caagacacct gtgctgatag 1020
tgccgccctt catcaacaag tactacatca tggacatgcg gccccagaac tccctggtcg 1080
cctggctggt cgcccagggc cagacggtat tcatgatctc ctggcgcaac ccgggcgtgg 1140
cccaggccca aatcgatctc gacgactacg tggtggatgg cgtcatcgcc gccctggacg 1200
gcgtggaggc ggccaccggc gagcgggagg tgcacggcat cggctactgc atcggcggca 1260
ccgccctgtc gctcgccatg ggctggctgg cggcgcggcg ccagaagcag cgggtgcgca 1320
ccgccaccct gttcactacc ctgctggact tctcccagcc cggggagctt ggcatcttca 1380
tccacgagcc catcatagcg gcgctcgagg cgcaaaatga ggccaagggc atcatggacg 1440
ggcgccagct ggcggtctcc ttcagcctgc tgcgggagaa cagcctctac tggaactact 1500
acatcgacag ctacctcaag ggtcagagcc cggtggcctt cgatctgctg cactggaaca 1560
gcgacagcac caatgtggcg ggcaagaccc acaacagcct gctgcgccgt ctctacctgg 1620
agaaccagct ggtgaagggg gagctcaaga tccgcaacac ccgcatcgat ctcggcaagg 1680
tgaagacccc tgtgctgctg gtgtcggcgg tggacgatca catcgccctc tggcagggca 1740
cctggcaggg catgaagctg tttggcgggg agcagcgctt cctcctggcg gagtccggcc 1800
acatcgccgg catcatcaac ccgccggccg ccaacaagta cggcttctgg cacaacgggg 1860
ccgaggccga gagcccggag agctggctgg caggggcgac gcaccagggc ggctcctggt 1920
ggcccgagat gatgggcttt atccagaacc gtgacgaagg gtcagagccc gtccccgcgc 1980
gggtcccgga ggaagggctg gcccccgccc ccggccacta tgtcaaggtg cggctcaacc 2040
ccgtgtttgc ctgcccaaca gaggaggacg ccgcatgagc ctgacctgcc ggcctggttc 2100
aaccagtcgg cagccgacta gtggatccga gc 2132
<210> 14
<211> 594
<212> PRT
<213> 豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)
<400> 14
Met Ser Gln Pro Ser Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ala His Tyr
1 5 10 15
Asn Asp Lys Leu Leu Ala Met Ala Lys Ala Gln Thr Glu Arg Thr Ala
20 25 30
Gln Ala Leu Leu Gln Thr Asn Leu Asp Asp Leu Gly Gln Val Leu Glu
35 40 45
Gln Gly Ser Gln Gln Pro Trp Gln Leu Ile Gln Ala Gln Met Asn Trp
50 55 60
Trp Gln Asp Gln Leu Lys Leu Met Gln His Thr Leu Leu Lys Ser Ala
65 70 75 80
Gly Gln Pro Ser Glu Pro Val Ile Thr Pro Glu Arg Ser Asp Arg Arg
85 90 95
Phe Lys Ala Glu Ala Trp Ser Glu Gln Pro Ile Tyr Asp Tyr Leu Lys
100 105 110
Gln Ser Tyr Leu Leu Thr Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Val Asp Ala
115 120 125
Leu Glu Gly Val Pro Gln Lys Ser Arg Glu Arg Leu Arg Phe Phe Thr
130 135 140
Arg Gln Tyr Val Ser Ala Met Ala Pro Ser Asn Phe Leu Ala Thr Asn
145 150 155 160
Pro Glu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asn Leu Val
165 170 175
Arg Gly Leu Ala Leu Leu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Ser Ala Asp Gln
180 185 190
Leu Asn Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Leu Gly Arg Asp
195 200 205
Leu Ala Leu Thr Pro Gly Arg Val Val Gln Arg Thr Glu Leu Tyr Glu
210 215 220
Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Thr Val Gly Lys Thr Pro Val
225 230 235 240
Leu Ile Val Pro Pro Phe Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Met Asp Met Arg
245 250 255
Pro Gln Asn Ser Leu Val Ala Trp Leu Val Ala Gln Gly Gln Thr Val
260 265 270
Phe Met Ile Ser Trp Arg Asn Pro Gly Val Ala Gln Ala Gln Ile Asp
275 280 285
Leu Asp Asp Tyr Val Val Asp Gly Val Ile Ala Ala Leu Asp Gly Val
290 295 300
Glu Ala Ala Thr Gly Glu Arg Glu Val His Gly Ile Gly Tyr Cys Ile
305 310 315 320
Gly Gly Thr Ala Leu Ser Leu Ala Met Gly Trp Leu Ala Ala Arg Arg
325 330 335
Gln Lys Gln Arg Val Arg Thr Ala Thr Leu Phe Thr Thr Leu Leu Asp
340 345 350
Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gly Ile Phe Ile His Glu Pro Ile Ile
355 360 365
Ala Ala Leu Glu Ala Gln Asn Glu Ala Lys Gly Ile Met Asp Gly Arg
370 375 380
Gln Leu Ala Val Ser Phe Ser Leu Leu Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Trp
385 390 395 400
Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Gly Gln Ser Pro Val Ala Phe
405 410 415
Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Ser Thr Asn Val Ala Gly Lys Thr
420 425 430
His Asn Ser Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Leu Glu Asn Gln Leu Val Lys
435 440 445
Gly Glu Leu Lys Ile Arg Asn Thr Arg Ile Asp Leu Gly Lys Val Lys
450 455 460
Thr Pro Val Leu Leu Val Ser Ala Val Asp Asp His Ile Ala Leu Trp
465 470 475 480
Gln Gly Thr Trp Gln Gly Met Lys Leu Phe Gly Gly Glu Gln Arg Phe
485 490 495
Leu Leu Ala Glu Ser Gly His Ile Ala Gly Ile Ile Asn Pro Pro Ala
500 505 510
Ala Asn Lys Tyr Gly Phe Trp His Asn Gly Ala Glu Ala Glu Ser Pro
515 520 525
Glu Ser Trp Leu Ala Gly Ala Thr His Gln Gly Gly Ser Trp Trp Pro
530 535 540
Glu Met Met Gly Phe Ile Gln Asn Arg Asp Glu Gly Ser Glu Pro Val
545 550 555 560
Pro Ala Arg Val Pro Glu Glu Gly Leu Ala Pro Ala Pro Gly His Tyr
565 570 575
Val Lys Val Arg Leu Asn Pro Val Phe Ala Cys Pro Thr Glu Glu Asp
580 585 590
Ala Ala
<210> 15
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 15
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 120
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 180
ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg aactagttaa ctagtacgca agttcacagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacaattgc acgtgcagag agacaatcaa atcatgagcc 300
aaccatctta tggcccgctg ttcgaggccc tggcccacta caatgacaag ctgctggcca 360
tggccaaggc ctctacagag cgcaccgccc aggcgctgct gcagaccaat ctggacgatc 420
tgggccaggt gctggagcag ggcagccagc aaccctggca gctgatccag gcccagatga 480
actggtggca ggatcagctc aagctgatgc agcacaccct gctcaaaagc gcaggccagc 540
cgagcgagcc ggtgatcacc ccggagcgca gcgatcgccg cttcaaggcc gaggcctgga 600
gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
tggcctcggt ggatgccctg gagggcgtcc cccagaagag ccgggagcgg ctgcgtttct 720
tcacccgcca gtacgtcagc gccatggccc ccagcaactt cctggccacc aaccccgagc 780
tgctcaagct gaccctggag tccggcggcc agaacctggt gcgcggactg gccctcttgg 840
ccgaggatct ggagcgcagc gccgatcagc tcaacatccg cctgaccgac gaatccgcct 900
tcgagctcgg gcgggatctg gccctgaccc cgggccgggt ggtgcagcgc accgagctct 960
atgagctcat tcagtacagc ccgactaccg agacggtggg caagacacct gtgctgatag 1020
tgccgccctt catcaacaag tactacatca tggacatgcg gccccagaac tccctggtcg 1080
cctggctggt cgcccagggc cagacggtat tcatgatctc ctggcgcaac ccgggcgtgg 1140
cccaggccca aatcgatctc gacgactacg tggtggatgg cgtcatcgcc gccctggacg 1200
gcgtggaggc ggccaccggc gagcgggagg tgcacggcat cggctactgc atcggcggca 1260
ccgccctgtc gctcgccatg ggctggctgg cggcgcggcg ccagaagcag cgggtgcgca 1320
ccgccaccct gttcactacc ctgctggact tctcccagcc cggggagctt ggcatcttca 1380
tccacgagcc catcatagcg gcgctcgagg cgcaaaatga ggccaagggc atcatggacg 1440
ggcgccagct ggcggtctcc ttcagcctgc tgcgggagaa cagcctctac tggaactact 1500
acatcgacag ctacctcaag ggtcagagcc cggtggcctt cgatctgctg cactggaaca 1560
gcgacagcac caatgtggcg ggcaagaccc acaacagcct gctgcgccgt ctctacctgg 1620
agaaccagct ggtgaagggg gagctcaaga tccgcaacac ccgcatcgat ctcggcaagg 1680
tgaagacccc tgtgctgctg gtgtcggcgg tggacgatca catcgccctc tggcagggca 1740
cctggcaggg catgaagctg tttggcgggg agcagcgctt cctcctggcg gagtccggcc 1800
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ccgtgtttgc ctgcccaaca gaggaggacg ccgcatgagc ctgacctgcc ggcctggttc 2100
aaccagtcgg cagccgacta gtggatccga gc 2132
<210> 16
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 16
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 120
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 180
ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg aactagttaa ctagtacgca agttcacagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacaattgc acgtgcagag agacaatcaa atcatgagcc 300
aaccatctta tggcccgctg ttcgaggccc tggcccacta caatgacaag ctgctggcca 360
tggccaaggc ccagacaaat cgcaccgccc aggcgctgct gcagaccaat ctggacgatc 420
tgggccaggt gctggagcag ggcagccagc aaccctggca gctgatccag gcccagatga 480
actggtggca ggatcagctc aagctgatgc agcacaccct gctcaaaagc gcaggccagc 540
cgagcgagcc ggtgatcacc ccggagcgca gcgatcgccg cttcaaggcc gaggcctgga 600
gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
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tcacccgcca gtacgtcagc gccatggccc ccagcaactt cctggccacc aaccccgagc 780
tgctcaagct gaccctggag tccggcggcc agaacctggt gcgcggactg gccctcttgg 840
ccgaggatct ggagcgcagc gccgatcagc tcaacatccg cctgaccgac gaatccgcct 900
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tgccgccctt catcaacaag tactacatca tggacatgcg gccccagaac tccctggtcg 1080
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ccgtgtttgc ctgcccaaca gaggaggacg ccgcatgagc ctgacctgcc ggcctggttc 2100
aaccagtcgg cagccgacta gtggatccga gc 2132
<210> 17
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 17
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 120
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 180
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ggataacaat ttcacacagg aaacaattgc acgtgcagag agacaatcaa atcatgagcc 300
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tggccaaggc ccagacaagt cgcaccgccc aggcgctgct gcagaccaat ctggacgatc 420
tgggccaggt gctggagcag ggcagccagc aaccctggca gctgatccag gcccagatga 480
actggtggca ggatcagctc aagctgatgc agcacaccct gctcaaaagc gcaggccagc 540
cgagcgagcc ggtgatcacc ccggagcgca gcgatcgccg cttcaaggcc gaggcctgga 600
gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
tggcctcggt ggatgccctg gagggcgtcc cccagaagag ccgggagcgg ctgcgtttct 720
tcacccgcca gtacgtcagc gccatggccc ccagcaactt cctggccacc aaccccgagc 780
tgctcaagct gaccctggag tccggcggcc agaacctggt gcgcggactg gccctcttgg 840
ccgaggatct ggagcgcagc gccgatcagc tcaacatccg cctgaccgac gaatccgcct 900
tcgagctcgg gcgggatctg gccctgaccc cgggccgggt ggtgcagcgc accgagctct 960
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tgccgccctt catcaacaag tactacatca tggacatgcg gccccagaac tccctggtcg 1080
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<210> 18
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 18
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 120
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 180
ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg aactagttaa ctagtacgca agttcacagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacaattgc acgtgcagag agacaatcaa atcatgagcc 300
aaccatctta tggcccgctg ttcgaggccc tggcccacta caatgacaag ctgctggcca 360
tggccaaggc ccagacagag gggaccgccc aggcgctgct gcagaccaat ctggacgatc 420
tgggccaggt gctggagcag ggcagccagc aaccctggca gctgatccag gcccagatga 480
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cgagcgagcc ggtgatcacc ccggagcgca gcgatcgccg cttcaaggcc gaggcctgga 600
gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
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ccgaggatct ggagcgcagc gccgatcagc tcaacatccg cctgaccgac gaatccgcct 900
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tgccgccctt catcaacaag tactacatca tggacatgcg gccccagaac tccctggtcg 1080
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tccacgagcc catcatagcg gcgctcgagg cgcaaaatga ggccaagggc atcatggacg 1440
ggcgccagct ggcggtctcc ttcagcctgc tgcgggagaa cagcctctac tggaactact 1500
acatcgacag ctacctcaag ggtcagagcc cggtggcctt cgatctgctg cactggaaca 1560
gcgacagcac caatgtggcg ggcaagaccc acaacagcct gctgcgccgt ctctacctgg 1620
agaaccagct ggtgaagggg gagctcaaga tccgcaacac ccgcatcgat ctcggcaagg 1680
tgaagacccc tgtgctgctg gtgtcggcgg tggacgatca catcgccctc tggcagggca 1740
cctggcaggg catgaagctg tttggcgggg agcagcgctt cctcctggcg gagtccggcc 1800
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aaccagtcgg cagccgacta gtggatccga gc 2132
<210> 19
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 19
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 120
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 180
ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg aactagttaa ctagtacgca agttcacagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacaattgc acgtgcagag agacaatcaa atcatgagcc 300
aaccatctta tggcccgctg ttcgaggccc tggcccacta caatgacaag ctgctggcca 360
tggccaaggc ccagacagag ccgaccgccc aggcgctgct gcagaccaat ctggacgatc 420
tgggccaggt gctggagcag ggcagccagc aaccctggca gctgatccag gcccagatga 480
actggtggca ggatcagctc aagctgatgc agcacaccct gctcaaaagc gcaggccagc 540
cgagcgagcc ggtgatcacc ccggagcgca gcgatcgccg cttcaaggcc gaggcctgga 600
gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
tggcctcggt ggatgccctg gagggcgtcc cccagaagag ccgggagcgg ctgcgtttct 720
tcacccgcca gtacgtcagc gccatggccc ccagcaactt cctggccacc aaccccgagc 780
tgctcaagct gaccctggag tccggcggcc agaacctggt gcgcggactg gccctcttgg 840
ccgaggatct ggagcgcagc gccgatcagc tcaacatccg cctgaccgac gaatccgcct 900
tcgagctcgg gcgggatctg gccctgaccc cgggccgggt ggtgcagcgc accgagctct 960
atgagctcat tcagtacagc ccgactaccg agacggtggg caagacacct gtgctgatag 1020
tgccgccctt catcaacaag tactacatca tggacatgcg gccccagaac tccctggtcg 1080
cctggctggt cgcccagggc cagacggtat tcatgatctc ctggcgcaac ccgggcgtgg 1140
cccaggccca aatcgatctc gacgactacg tggtggatgg cgtcatcgcc gccctggacg 1200
gcgtggaggc ggccaccggc gagcgggagg tgcacggcat cggctactgc atcggcggca 1260
ccgccctgtc gctcgccatg ggctggctgg cggcgcggcg ccagaagcag cgggtgcgca 1320
ccgccaccct gttcactacc ctgctggact tctcccagcc cggggagctt ggcatcttca 1380
tccacgagcc catcatagcg gcgctcgagg cgcaaaatga ggccaagggc atcatggacg 1440
ggcgccagct ggcggtctcc ttcagcctgc tgcgggagaa cagcctctac tggaactact 1500
acatcgacag ctacctcaag ggtcagagcc cggtggcctt cgatctgctg cactggaaca 1560
gcgacagcac caatgtggcg ggcaagaccc acaacagcct gctgcgccgt ctctacctgg 1620
agaaccagct ggtgaagggg gagctcaaga tccgcaacac ccgcatcgat ctcggcaagg 1680
tgaagacccc tgtgctgctg gtgtcggcgg tggacgatca catcgccctc tggcagggca 1740
cctggcaggg catgaagctg tttggcgggg agcagcgctt cctcctggcg gagtccggcc 1800
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aaccagtcgg cagccgacta gtggatccga gc 2132
<210> 20
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 20
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
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<211> 2132
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<211> 2132
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<400> 31
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<213> 人工序列
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<400> 32
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<210> 33
<211> 2132
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<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
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<211> 2132
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<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 35
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<210> 36
<211> 2132
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<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 36
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
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<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 37
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<210> 38
<211> 2132
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<213> 人工序列
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<400> 38
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cgagcgagcc ggtgatcacc ccggagcgca gcgatcgccg cttcaaggcc gaggcctgga 600
gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
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tcacccgcca gtacgtcagc gccatggccc ccagcaactt cctggccacc aaccccgagc 780
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ccgaggatct ggagcgcagc gccgatcagc tcaacatccg cctgaccgac gaatccgcct 900
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ccgccctgtc gctcgccatg ggctggctgg cggcgcggcg ccagaagcag cgggtgcgca 1320
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<400> 46
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<210> 51
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<400> 51
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cgagcgagcc ggtgatcacc ccggagcgca gcgatcgccg cttcaaggcc gaggcctgga 600
gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
tggcctcggt ggatgccctg gagggcgtcc cccagaagag ccgggagcgg ctgcgtttct 720
tcacccgcca gtacgtcagc gccatggccc ccagcaactt cctggccacc aaccccgagc 780
tgctcaagct gaccctggag tccggcggcc agaacctggt gcgcggactg aggctcttgg 840
ccgaggatct ggagcgcagc gccgatcagc tcaacatccg cctgaccgac gaatccgcct 900
tcgagctcgg gcgggatctg gccctgaccc cgggccgggt ggtgcagcgc accgagctct 960
atgagctcat tcagtacagc ccgactaccg agacggtggg caagacacct gtgctgatag 1020
tgccgccctt catcaacaag tactacatca tggacatgcg gccccagaac tccctggtcg 1080
cctggctggt cgcccagggc cagacggtat tcatgatctc ctggcgcaac ccgggcgtgg 1140
cccaggccca aatcgatctc gacgactacg tggtggatgg cgtcatcgcc gccctggacg 1200
gcgtggaggc ggccaccggc gagcgggagg tgcacggcat cggctactgc atcggcggca 1260
ccgccctgtc gctcgccatg ggctggctgg cggcgcggcg ccagaagcag cgggtgcgca 1320
ccgccaccct gttcactacc ctgctggact tctcccagcc cggggagctt ggcatcttca 1380
tccacgagcc catcatagcg gcgctcgagg cgcaaaatga ggccaagggc atcatggacg 1440
ggcgccagct ggcggtcacc ttcagcctgc tgcgggagaa cagcctctac tggaactact 1500
acatcgacag ctacctcaag ggtcagagcc cggtggcctt cgatctgctg cactggaaca 1560
gcgacagcac caatgtggcg ggcaagaccc acaacagcct gctgcgccgt ctctacctgg 1620
agaaccagct ggtgaagggg gagctcaaga tccgcaacac ccgcatcgat ctcggcaagg 1680
tgaagacccc tgtgctgctg gtgtcggcgg tggacgatca catcgccctc tggcagggca 1740
cctggcaggg catgaagctg tttggcgggg agcagcgctt cctcctggcg gagtccggcc 1800
acatcgccgg catcatcaac ccgccggccg ccaacaagta cggcttctgg cacaacgggg 1860
ccgaggccga gagcccggag agctggctgg caggggcgac gcaccagggc ggctcctggt 1920
ggcccgagat gatgggcttt atccagaacc gtgacgaagg gtcagagccc gtccccgcgc 1980
gggtcccgga ggaagggctg gcccccgccc ccggccacta tgtcaaggtg cggctcaacc 2040
ccgtgtttgc ctgcccaaca gaggaggacg ccgcatgagc ctgacctgcc ggcctggttc 2100
aaccagtcgg cagccgacta gtggatccga gc 2132
<210> 52
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 52
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 120
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 180
ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg aactagttaa ctagtacgca agttcacagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacaattgc acgtgcagag agacaatcaa atcatgagcc 300
aaccatctta tggcccgctg ttcgaggccc tggcccacta caatgacaag ctgctggcca 360
tggccaaggc ccagacaagt cgcaccgccc aggcgctgct gcagaccaat ctggacgatc 420
tgggccaggt gctggagcag ggcagccagc aaccctggca gctgatccag gcccagatga 480
actggtggca ggatcagctc aagctgatgc agcacaccct gctcaaaagc gcaggccagc 540
cgagcgagcc ggtgatcacc ccggagcgca gcgatcgccg cttcaaggcc gaggcctgga 600
gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
tggcctcggt ggatgccctg gagggcgtcc cccagaagag ccgggagcgg ctgcgtttct 720
tcacccgcca gtacgtcagc gccatggccc ccagcaactt cctggccacc aaccccgagc 780
tgctcaagct gaccctggag tccggcggcc agaacctggt gcgcggactg aagctcttgg 840
ccgaggatct ggagcgcagc gccgatcagc tcaacatccg cctgaccgac gaatccgcct 900
tcgagctcgg gcgggatctg gccctgaccc cgggccgggt ggtgcagcgc accgagctct 960
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tgccgccctt catcaacaag tactacatca tggacatgcg gccccagaac tccctggtcg 1080
cctggctggt cgcccagggc cagacggtat tcatgatctc ctggcgcaac ccgggcgtgg 1140
cccaggccca aatcgatctc gacgactacg tggtggatgg cgtcatcgcc gccctggacg 1200
gcgtggaggc ggccaccggc gagcgggagg tgcacggcat cggctactgc atcggcggca 1260
ccgccctgtc gctcgccatg ggctggctgg cggcgcggcg ccagaagcag cgggtgcgca 1320
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ggcgccagct ggcggtcacc ttcagcctgc tgcgggagaa cagcctctac tggaactact 1500
acatcgacag ctacctcaag ggtcagagcc cggtggcctt cgatctgctg cactggaaca 1560
gcgacagcac caatgtggcg ggcaagaccc acaacagcct gctgcgccgt ctctacctgg 1620
agaaccagct ggtgaagggg gagctcaaga tccgcaacac ccgcatcgat ctcggcaagg 1680
tgaagacccc tgtgctgctg gtgtcggcgg tggacgatca catcgccctc tggcagggca 1740
cctggcaggg catgaagctg tttggcgggg agcagcgctt cctcctggcg gagtccggcc 1800
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ccgaggccga gagcccggag agctggctgg caggggcgac gcaccagggc ggctcctggt 1920
ggcccgagat gatgggcttt atccagaacc gtgacgaagg gtcagagccc gtccccgcgc 1980
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ccgtgtttgc ctgcccaaca gaggaggacg ccgcatgagc ctgacctgcc ggcctggttc 2100
aaccagtcgg cagccgacta gtggatccga gc 2132
<210> 53
<211> 2132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因表达盒(Gene expressing cassette)
<400> 53
cctagggtgt acattgcgct gaaagaaggg ccaattgtgc ttctggcgtc aggcagccat 60
cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg 120
cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt 180
ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg aactagttaa ctagtacgca agttcacagc 240
ggataacaat ttcacacagg aaacaattgc acgtgcagag agacaatcaa atcatgagcc 300
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gcgaacaacc catctatgac tacctcaagc agtcctacct gctcaccgcc aggcacctgc 660
tggcctcggt ggatgccctg gagggcgtcc cccagaagag ccgggagcgg ctgcgtttct 720
tcacccgcca gtacgtcagc gccatggccc ccagcaactt cctggccacc aaccccgagc 780
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tcgagctcgg gcgggatctg gccctgaccc cgggccgggt ggtgcagcgc accgagctct 960
atgagctcat tcagtacagc ccgactaccg agacggtggg caagacacct gtgctgatag 1020
tgccgccctt catcaacaag tactacatca tggacatgcg gccccagaac tccctggtcg 1080
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cccaggccca aatcgatctc gacgactacg tggtggatgg cgtcatcgcc gccctggacg 1200
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Claims (31)

1.一种突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其具有显示出与序列号1表示的氨基酸序列的85％以上的序列同一性、且包含下述(A)～(C)中任意1种以上的突变的氨基酸序列，
突变(A)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第27位至第33位的氨基酸中至少1个以上氨基酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(B)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第39位、第56位、第106位、第129位、第144位、第165位、以及第170位的氨基酸中至少1个以上氨基酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(C)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第172位至第187位的氨基酸中至少1个以上氨基酸被置换为其它氨基酸的突变。
2.根据权利要求1所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，所述(A)～(C)中任意1种以上的突变为下述(a)～(q)中任意1种以上的突变：
突变(a)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第27位的谷氨酰胺被置换为其它氨基酸的突变，
突变(b)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第29位的谷氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(c)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第30位的精氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(d)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第31位的苏氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(e)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第33位的谷氨酰胺被置换为其它氨基酸的突变，
突变(f)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第39位的天冬酰胺被置换为其它氨基酸的突变，
突变(g)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第56位的谷氨酰胺被置换为其它氨基酸的突变，
突变(h)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第106位的脯氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(i)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第129位的亮氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(j)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第144位的苏氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(k)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第165位的赖氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(l)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第170位的丝氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(m)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第176位的缬氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(n)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第179位的亮氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(o)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第180位的丙氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(p)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第181位的亮氨酸被置换为其它氨基酸的突变，
突变(q)：序列号1表示的氨基酸序列从N末端起第187位的谷氨酸被置换为其它氨基酸的突变。
3.根据权利要求2所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(a)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第27位的谷氨酰胺被置换为丝氨酸的突变。
4.根据权利要求2或3所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(b)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第29位的谷氨酸被置换为天冬酰胺或丝氨酸的突变。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(c)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第30位的精氨酸被置换为甘氨酸或脯氨酸的突变。
6.根据权利要求2～5中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(d)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第31位的苏氨酸被置换为脯氨酸的突变。
7.根据权利要求2～6中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(e)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第33位的谷氨酰胺被置换为异亮氨酸、亮氨酸、或缬氨酸的突变。
8.根据权利要求2～7中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(f)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第39位的天冬酰胺被置换为丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、或色氨酸的突变。
9.根据权利要求2～8中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(g)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第56位的谷氨酰胺被置换为脯氨酸的突变。
10.根据权利要求2～9中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(h)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第106位的脯氨酸被置换为丙氨酸的突变。
11.根据权利要求2～10中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(i)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第129位的亮氨酸被置换为谷氨酰胺的突变。
12.根据权利要求2～11中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(j)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第144位的苏氨酸被置换为亮氨酸的突变。
13.根据权利要求2～12中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(k)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第165位的赖氨酸被置换为缬氨酸的突变。
14.根据权利要求2～13中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(l)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第170位的丝氨酸被置换为谷氨酰胺的突变。
15.根据权利要求2～14中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(m)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第176位的缬氨酸被置换为色氨酸的突变。
16.根据权利要求2～15中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(n)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第179位的亮氨酸被置换为精氨酸或谷氨酰胺的突变。
17.根据权利要求2～16中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(o)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第180位的丙氨酸被置换为甘氨酸、赖氨酸或精氨酸的突变。
18.根据权利要求2～17中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(p)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第181位的亮氨酸被置换为酪氨酸的突变。
19.根据权利要求2～18中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，突变(q)是序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第187位的谷氨酸被置换为缬氨酸的突变。
20.根据权利要求1～19中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，包含所述突变的氨基酸序列进一步包含序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第149位的天冬酰胺被置换为丝氨酸的突变。
21.根据权利要求1～20中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，包含所述突变的氨基酸序列进一步包含序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第171位的天冬氨酸被置换为甘氨酸的突变。
22.根据权利要求1～21中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶，其中，包含所述突变的氨基酸序列进一步包含序列号1所示的氨基酸序列从N末端起第389位的丝氨酸被置换为半胱氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、或缬氨酸的突变。
23.一种基因，其编码权利要求1～22中任一项所述的突变型聚羟基烷酸酯合成酶。
24.一种转化体，其具有权利要求23所述的基因。
25.根据权利要求24所述的转化体，其中，宿主为真细菌。
26.根据权利要求25所述的转化体，其中，真细菌为属于贪铜菌(Cupriavidus)属的细菌。
27.根据权利要求25所述的转化体，其中，真细菌为钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)。
28.根据权利要求25所述的转化体，其中，真细菌为钩虫贪铜菌H16。
29.一种聚羟基烷酸酯的制造方法，该方法包括：
对权利要求24～28中任一项所述的转化体进行培养的工序。
30.根据权利要求29所述的聚羟基烷酸酯的制造方法，其中，聚羟基烷酸酯含有3-羟基己酸作为单体单元。
31.根据权利要求29所述的聚羟基烷酸酯的制造方法，其中，聚羟基烷酸酯为3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物。
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