CN117363554A - 一种工程改造的嗜盐微生物及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种工程改造的嗜盐微生物及其构建方法和应用,通过敲除或敲低转座子上一个或两个以上编码转座酶的基因,获得一种稳定的嗜盐微生物,其生长情况良好,可稳定合成聚羟基脂肪酸酯,有效避免菌株的自发突变,对于微生物生长及工业微生物产业的发展具有重要的意义和实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域,尤其是一种工程改造的嗜盐微生物及其构建方法和应用。
背景技术
工业微生物发酵是利用微生物进行生物转化的一种工业生产方式,与微生物菌种密切相关,工业微生物发酵要求微生物具有较高的代谢活性,将底物转化为所需的产物,因此微生物的性状稳定直接影响其生长及产物的稳定性。以嗜盐微生物为例,在利用微生物发酵生产目的产物(如聚羟基脂肪酸酯,PHA)中,采用开放性发酵,有细胞密度高、产量高等特点,但是如果微生物性状不稳定,会直接影响产品的产量、产率及原料到终产品的转化率,甚至影响产品的品质。严重的情况下,大规模发酵中,由于性状不稳定会引起微生物大量死亡,使得工业生物生产的经济成本和风险大大提高,非常不利于产业的健康发展。
微生物的稳定与本身和环境都有关系,任何生物在遗传物质DNA复制的时候,都存在一定的错误率。如果这些错误没有被及时修复,则会在细菌传代的过程中不断积累,最终引起性状的改变。
转座子又称跳跃基因,是广泛存在于动植物和微生物基因组上的移动的DNA序列。转座子能够在基因组内或基因组间进行转移,其结构功能多样。其在转座酶的作用下,转座子可实现从基因组一个位置到另一个位置的“转座”,从而引起遗传变异,转座子编码转座酶,主要用于转座子的转移和切除。基于此特性,目前常被用于CRISPR相关转座酶系统,专利CN116234918A公开一种或多种CRISPR相关Tn7转座酶向靶向核苷酸引入一个或多个突变的组合物或方法。
但转座子的存在对基因组上基因的稳定表达造成了一定的潜在威胁。
例如,转座子插入宿主基因组会造成基因重组,引起基因表达干扰(参见RebolloR, Romanish MT, Mager DL. Transposable elements: an abundant and naturalsource of regulatory sequences for host genes. Annu Rev Genet. 2012;46:21-42.doi: 10.1146/annurev-genet-110711-155621.),转座子插入会使受体基因失活或引起DNA缺失、倒位等变化,影响基因组正常表达(参见尹洋.转座子中关于转座机制及相关技术的探究[J].赤峰学院学报(自然科学版),2015,31(18):190-191.)。
进一步的,文献:Defensive Function of Transposable Elements in Bacteria(Catherine Fan等,Synthetic Biology,2019,8,2141-2151)也记载了将设计好的基因通路引入宿主进行基因改造,提高产物的产量,但是传30代后产量与改造前差不多,意味着转座子的存在可能影响基因改造的稳定性。
发明内容
鉴于上述问题,本申请发明人预测嗜盐微生物的转座酶序列以及尝试敲除转座酶,避免了原本微生物工业生产不同批次之间性状差异大的问题,意外的获得了生产性状稳定的工业生产底盘菌株,且提高了细胞干重和产物的产量。具体技术方案如下:
本发明第一方面,提供了一种工程改造的嗜盐微生物,所述的嗜盐微生物中转座子失活或活性降低。
所述的失活或活性降低包括通过基因编辑使得嗜盐微生物中转座子失活或活性降低。
例如转座子不能与转座酶结合发挥作用或结合强度降低,或者,转座子不能表达转座酶,或者表达的转座酶失活或活性降低。
所述的转座酶包括IS3家族转座酶。
优选的,所述嗜盐微生物中一个或两个以上转座酶失活或活性降低。例如嗜盐微生物中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个转座酶失活或活性降低。
优选的,所述的转座酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO:43-53中的一种或两种以上。
优选的,编码所述转座酶的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1-21中的一种或两种以上。
优选的,所述的嗜盐微生物通过敲除或敲低转座子上编码转座酶的基因制备获得。优选敲除或敲低一个或两个以上编码转座酶的基因制备获得,例如敲除或敲低1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个编码转座酶的基因。
优选的,所述敲除或敲低的转座酶基因包括但不限于tns1、tns2、tns3、tns4、 tns5、tns6、tns7、tns8、tns9、tns10、tns11、tns12、tns13、tns14、tns15、tns16、tns17、 tns18、tns19、tns20、tns21中的一种两种以上的种组合。
优选的,所述敲除或敲低的转座酶基因包括但不限于tns1、tns2、tns3、tns4、tns12、tns13、tns14、tns15、tns16、tns17、tns20、tns21中的一种两种以上的种组合。
例如:tns3和tns4的组合;tns5和tns9的组合;tns8和tns12的组合;tns19和tns21的组合;tns3、tns4和tns5的组合;tns5、tns9、tns10和tns11的组合;tns8、tns12、tns13、 tns15、tns19和tns21的组合;tns1、tns8、Tns12和tns13的组合;tns1、tns8、Tns12、tns13、 tns15、tns19和tns21的组合;tns1、tns3、tns4和tns13的组合;tns1、tns3、tns13和tns21的组合;tns1、tns3、tns21的组合;tns8、tns12、tns13和tns1的组合;tns15、tns19和tns21的组合;tns1、tns3和tns5的组合;tns6和tns8的组合;tns2、tns9和tns17的组合;tns3和tns19的组合;tns2、tns9、tns10、tns11、tns12、tns13、tns14和tns20的组合,tns1、tns2、tns3、tns4、tns12、tns13、tns14、tns15、tns16、tns17、tns20和tns21的组合;tns1-21的组合;等等。
优选的,使用靶向转座子的sgRNA进行敲除或敲低编码一个或两个以上转座酶的基因。进一步优选的,所述sgRNA靶向一个或两个以上转座酶的基因。更进一步优选的,所述sgRNA的靶位点序列包含转座酶编码基因的功能域,例如一种或两种以上外显子区域或者例如外显子区域之前或者例如内含子区域或者例如在起始密码子区域等。
在本发明的一个具体实施方式中,所述sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO:22-42中的一种或两种以上。
优选的,所述嗜盐微生物是指微生物生长需要一定的盐浓度、并且在一定盐浓度的环境中生长最佳的微生物。可以是嗜盐细菌、嗜盐古菌和藻类。更具体地,嗜盐微生物可以是嗜盐细菌,优选包括盐单胞菌属(Halomonas)。
所述的盐单胞菌包括Halomonas bluephagenesis或其衍生菌、Halomonas campaniensis或其衍生菌、Halomonas aydingkolgenesis或其衍生菌中的一种或两种以上。
例如Halomonas bluephagenesis TD01(CGMCC No. 4353)、Halomonas campaniensis LS21(CGMCC No. 6593)、Halomonas bluephagenesis TDH4AB(CGMCCNo.22795)、Halomonas aydingkolgenesis M1 (CGMCC No.19880)、Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2、Halomonas bluephagenesis WZY254、Halomonas bluephagenesis WZY278中的一种或两种的组合,或其衍生菌。
所述的嗜盐微生物生产性状稳定,通过一个或两个以上转座酶基因的敲除或敲低实现提高微生物代谢生产的稳定性。
所述的性状包括但不限于:生长速率、可达到的最大细胞密度、各种胞内产品的产量和产率、各种胞外产品的产量和产率等。
优选的,所述的嗜盐微生物经改造后,维持和敲除前基本相同的培养基和培养方法。
本发明的第二方面,提供了一种上述的嗜盐微生物的构建方法,包括通过基因编辑使得嗜盐微生物中转座子失活或活性降低。
优选的,所述的构建方法包括在嗜盐微生物基因组上敲除或敲低转座酶基因。
优选的,所述的构建方法为分子生物学手段,优选基因编辑技术,例如CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
所述的构建方法包括使用靶向转座子的sgRNA进行敲除或敲低编码一个或两个以上转座酶的基因。优选的,所述sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO:22-42中的一种或两种以上。
本发明的第三方面,提供了一种上述构建方法获得的性状稳定的嗜盐微生物。
本发明的第四方面,提供了一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法,所述的方法包括培养上述的嗜盐微生物或上述构建方法获得的嗜盐微生物。
所述方法使用的培养基可以为固体培养基、液体培养基或半固体培养基。
所述方法使用的培养基包括碳源。在本发明中,所述碳源是为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质,也可以理解为用于合成产物的底物。在本发明中,“碳源”是本发明的嗜盐微生物用以合成PHA的来源,因此,其在本文中可以与“底物”可互换地使用。更优选的,所述碳源来自葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸酯或者其组合,进一步优选地,所述碳源来自葡萄糖。所述的葡萄糖酸盐可以是任意一种或多种葡萄糖酸盐,只要其可以用作本发明所涉及微生物的碳源用于聚合物生产即可,例如,葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钙等。
更优选的,所述碳源的浓度可以在1-100g/L、进一步优选地,所述碳源浓度可以是上述范围内的任一范围或者数值,例如:约1-90 g/L、约1-80 g/L、约1-70 g/L、或约1-60g/L的范围内;更优选地,该浓度可以在约3-60 g/L、约3-50 g/L 或约3-40 g/L的范围内;进一步优选约5-60 g/L、约10-60 g/L、约20-40g/L的范围内,具体地可以是,约10g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L等等。
所述的培养基中还包括氮源、无机盐以及微量元素、生长因子和其他有利于菌体生长和代谢的物质。
所述的氮源可以为无机氮源和/或有机氮源。所述的无机氮源例如硝酸盐、铵盐、亚硝酸盐或氨水等中的一种或两种以上。所述的有机氮源例如花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、酵母提取物、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨、胰蛋白胨、麸皮或废菌丝体等中的一种或两种以上。
所述的无机盐用于维持所述嗜盐微生物所需的渗透压。例如钾盐和/或钠盐等。
所述的培养基还可以适当地额外添加有其他物质如用于抗性筛选的抗生素。
所述的培养基可以为现有技术常规配方例如LB培养基、MM培养基等,也可以在其基础上进行改造。
LB培养基的一般配方包括:4-6g/L酵母提取物,8-12g/L蛋白胨,8-12g/L氯化钠,其余为蒸馏水(pH调至7.0-7.2);优选为:5g/L酵母提取物,10g/L蛋白胨,10g/L氯化钠,其余为蒸馏水(pH调至7.0-7.2)。
MM培养基的一般配方包括:0.1‰-2‰(NH4)2SO4或者尿素,0.1‰-1‰ MgSO4,5‰-10‰ Na2HPO4·12H2O,0.5‰-2‰ KH2PO4,0.1%的其他微量元素(Fe(III)-NH4-Citrate,CaCl2·2H2O,ZnSO4·7H2O,MnCl2·4H2O,H3BO3,CoCl2·6H2O,CuSO4·5H2O,NiCl2·6H2O,NaMoO4·2H2O微量(pH调至约9.0))。
MM培养基优选包括:0.1% (NH4)2SO4或者0.2%尿素,0.02%MgSO4,1.0% Na2HPO4·12H2O,0.15% KH2PO4,不超过0.1%的其他微量元素(Fe(III)-NH4-Citrate,CaCl2·2H2O,ZnSO4·7H2O,MnCl2·4H2O,H3BO3,CoCl2·6H2O,CuSO4·5H2O,NiCl2·6H2O,NaMoO4·2H2O(pH调至约9.0))。
本发明所述的培养基是在基础培养基上基础培养基的基础上添加碳源和无机盐而得到的,其中碳源可被嗜盐微生物利用以合成期望的产物,而无机盐则用于为嗜盐微生物提供适合其生长的渗透压环境。所述基础培养基是指包含营养物质可以用于支持本发明微生物的生长的培养基。上述基础培养基可以是本领域常规用于微生物培养的培养基,比如矿物质培养基、LB培养基、MM培养基或牛肉膏蛋白胨等等,也可以是在这些培养基的基础上根据期望目的进行改良的培养基。也就是说,本领域技术人员可以常规选择合适的基础培养基,只要其能够允许微生物,尤其是嗜盐微生物的生长即可。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的培养基为MM基础培养基,碳源10-50g/L,5-100g/L无机盐。
PHA,其根据单体组成可以分为均聚物和共聚物。根据单体的碳原子数,本发明的PHA包括但不限于短链PHA(即,单体为C3-C5的羟基脂肪酸)和中长链PHA(即,单体为C6-C16的羟基脂肪酸)。
在本发明的一些实施方式中,PHA可以是均聚物,包括但不限于聚羟基丙酸酯、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯等等,例如,聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚-3-羟基丙酸酯(P3HP)或聚-3-羟基戊酸酯(P3HV)等。
在本发明的一些实施方式中,PHA可以是包括但不限于共聚物如二聚物、三聚物等,例如,共聚物可以是羟基丙酸酯与羟基丁酸酯的共聚物;羟基丙酸酯与羟基戊酸酯的共聚物;羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物;羟基丙酸酯、羟基丁酸酯、羟基戊酸酯三者的共聚物等等。
更具体地,在本发明的一些实施方式中,PHA可以是聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯(P3HB3HV)或聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯(P34HB3HV)、或其组合等。
本发明方法对嗜盐微生物进行转座酶基因敲除后,即便是全部转座酶基因被敲除后,嗜盐微生物的生长情况良好,并未发生如其他代谢相关基因敲除的情况下生长减弱的情况,并且产物合成也没有降低。采用敲除转座酶的嗜盐微生物进行开放式发酵时,提供基本相同的培养基成分,可以更有效地避免微生物产生自发突变,甚至略微提高嗜盐微生物及产物,例如PHA的产量。
本申请英文简写与中文全称对照见表1。
表1英文简写与中文全称对照
以上只是概括了本发明的一些方面,不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本申请提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到,对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明,不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
具体实施方式
下面通过具体的实施例来进一步解释本发明,需理解,这些实施例仅仅是以示例的方式描述和帮助理解本发明,而并不意在将本发明局限于这些实施例。
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例中使用的Halomonas bluephagenesis TD01记载于专利申请公开号CN102120973A以及文献“Tan D, Xue Y, Aibaidula G, et al. Unsterile andcontinuous production of polyhydroxybutyrate byHalomonas TD01 [J].Bioresource Technology, 2011, 102:8130-8136”;公众可以从清华大学获得该菌。
实施例中使用的Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2:是Halomonas bluephagenesis TD01的衍生菌株,具体公开于“Ye J, Hu D, Che X, Jiang X, Li T,Chen J, Zhang HM, Chen GQ. Engineering ofHalomonas bluephagenesis for lowcost production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from glucose.Metab Eng. 2018 May;47:143-152”中。
实施例中使用的Halomonas campaniensis LS21:是本实验室筛选得到的一株革兰氏阴性嗜盐微生物,具有非常好的工业化生产应用前景,公开于“Jiang X, Yao Z, ChenG Q. Controlling cell volume for efficient PHB production by Halomonas [J].Metabolic Engineering, 2017, 44:30-37”一文,公众可以从清华大学获得该菌。实施例中使用的Halomonas bluephagenesisWZY278,是Halomonas bluephagenesis TD01的衍生菌株,经一系列基因编辑后,其最适盐浓度大幅下降,具体公开于“JI M, ZHENG T, WANGZ, et al. PHB production from food waste hydrolysates byHalomonas bluephagenesisHarboring PHB operon linked with an essential gene[J/OL].Metabolic Engineering, 2023, 77: 12-20. DOI:10.1016/j.ymben.2023.03.003.”一文。
本申请中所使用的盐单胞菌进行的基因编辑,例如敲除转座酶,使用的方法为CRISPR/Cas9技术,可参见文献Qin et.al. CRISPR/Cas9 editing genome ofextremophile Halomonas spp. Metabolic Engineering. 47 (2018) 219-229。
实施例中用于培养嗜盐微生物的MM培养基的具体配方如下:
尿素0.5g/L;MgSO40.2g/L;KH2PO41.5g/L;以及合计<0.1g/L的Fe(III)-NH4-Citrate,CaCl2·2H2O,ZnSO4·7H2O,MnCl2·4H2O,H3BO3,CoCl2·6H2O,CuSO4·5H2O,NiCl2·6H2O,NaMoO4·2H2O。
向培养基中另外添加葡萄糖10-50g/L作为碳源,添加5-100g/L氯化钠以提供嗜盐微生物生长所需的渗透压环境;并将pH调节在8.0-9.0。
实施例中用于培养嗜盐微生物的LB60培养基的具体配方如下:
含60g/L NaCl,10g/L蛋白胨(购自英国OXIOD公司,产品目录号LP0042)、5g/L酵母提取物(购自英国OXIOD公司,产品目录号LP0021)、余量为水。
气相色谱检测聚羟基脂肪酸酯(PHA)含量的方法:
设定炉温为80℃,进样器温度为200℃,检测器温度为220℃,柱头压力为0.25Mpa,程序升温条件为:80℃停留1.5分钟,以30℃/min的速度升温至140℃,接着以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5分钟。样品的进样量为1μL,使用安捷伦公司生产的微量进样器。
气相样品准备:取40-60 mg待测样品的干细胞(取菌液于10000 rpm下常温离心10分钟,所得细胞沉淀水洗一次之后,冰干,得到干细胞,均聚物产于细胞中),加2mL氯仿,2mL酯化液(纯甲醇中含3%(v/v)的浓硫酸及1g/L苯甲酸作内标)于酯化管中,加盖密封后于100℃下加热4小时。冷却后加入1mL蒸馏水,充分振荡后静置,待氯仿相与水相完全分层后,取下层氯仿相1μL注入气相色谱仪(HP公司Hewlett Packard 6890)中进行色谱分析。依照HP公司Hewlett Packard 6890气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。
标准样品准备:取10-20mg的标准样品于酯化管中,加2mL氯仿,2mL酯化液,加盖密封后在100℃进行酯化。
结果分析:以标准样品为对照,如果待测细胞的酯化样品(待测样品)在标样处有明显的出峰,则可以根据峰面积计算各个单体的质量,然后根据各个单体的质量分数计算出摩尔比例;根据加入的样品量可以计算出细胞干重中含有聚合物的比重(wt%)。
所述的细胞干重(CDW,g/L)是干燥菌体的质量与发酵产物体积的比值。
所述的P3HB含量(wt%)为P3HB占干燥菌体的质量比例。
P34HB含量(wt%)为P34HB占干燥菌体的质量比例。
P34HB中4HB比例(mol%)=4HB的摩尔数÷(3HB的摩尔数+4HB的摩尔数)×100%。
本申请所述的转座酶或假定转座酶及敲除所用的sgRNA的靶序列见表2,转座酶对应的氨基酸序列见表3。
表2:转座酶序列及敲除转座酶所用sgRNA的靶序列(下划线为上下游序列)
表3:转座酶的氨基酸序列表
转座酶 | 氨基酸序列 |
Tns1 | SEQ ID NO:43:MSHPRYTEEFKIEAVKQVVERGHRVAEVAERLGVSGHSLYNWIKRYDKPVEQRQEDDDLQAENRRLKAELKRVLEERDILKKATAYFARESD |
Tns2 | SEQ ID NO:44:MMAVHPSGYYAWCKKALSNRAREDERLLGLIKHSWLESGGVYGYRKVYQDLREAGEACGKHRVARLMNREGLRSQTGYRRRPGGYGDGKPTAVSPNHLDRQFEVTAPNIAWVTDITYIRTYEGWLYLSVVIDLFSRQVIGWSMKSRMTTELALDALLSAVWRRKPQGTVMVHSDQGSQFSSGDWQSFLKANCLVGSMSRRGNCHDNAVAESFFQLLKRERIKRQIYSTREAARRDVFNYIEMFYNPKRRHGTSDNLSPVDYERRYFKSLTGV |
Tns3 | SEQ ID NO:44 |
Tns4 | SEQ ID NO:43 |
Tns5 | SEQ ID NO:45:MKKRFSEEQIIGFLGEAEAGLPIKELCRRHGFSEASYYLWRSKFGGMSVPDAKRLKELEAENGRLKKLLAESLLEMEVTREALRKKW |
Tns6 | SEQ ID NO:46:MSAPARRDVVRFMVSRGLSERRALRVMRMSASALRYQPAPDRNETLRERIVALAHRHRRYGAGMIYLKLRQAGEQVNHKRVERLYAAARLQVKRRKRKKIPLSERKPLGRPGAANQVWSMDFVFDRTAEGRVIKNLTIVDDATHEAVAIVPDRAIDGLSLTRILDHLVLQRGLPSALRTDNGKEFCGRAMLTWAHQRGVALFLIEPGKPNQNAYIESFNGRFRDECLNEHWFTSLHHARVIIEAWRREYNEERPKKGLGGLTPSAYAEQLVLKHDKVTSDSKPGCY |
Tns7 | SEQ ID NO:47:MFGNIGTTKRLNRFILRGKKKVQSQWQLYCLVHNIEELANYGQLAAS |
Tns8 | SEQ ID NO:46 |
Tns9 | SEQ ID NO:45 |
Tns10 | SEQ ID NO:45 |
Tns11 | SEQ ID NO:46 |
Tns12 | SEQ ID NO:48:MVSLPRFKAYNYDQNAMVVINYQDQLQPGTFEHAVHYLIEHKLDVSVFYPQYRNDATGRLANIETLANYGHLAAP |
Tns13 | SEQ ID NO:43 |
Tns14 | SEQ ID NO:44 |
Tns15 | SEQ ID NO:49:MATYRRAYIPGGTYFFTVVTHHRQPLLAEQQNIDALGQAFRRVKENAPFIMDAFVLLPDHLHCLWTLPKDDTDYSSRWRDIKKYASKNFLLPGNATGTWQRGFWEHVIRDEQDWQQHMDYIHYNPVKHGWANAPRDWQWSSFKRCVKKGWYQDDWGANDAPSIADINGE |
Tns16 | SEQ ID NO:50:MPRFKAYSYDQNAMVVINYQDQIQLGTFEHAVHYLIDWMKHRVDSPPGAKKFTAIVCQSWSPSSATLAQRKGMKGLERSMLLFKSKRPSSTSFSWVPKWLNTDIKITQSDDRLSK |
Tns17 | SEQ ID NO:51:MPRFKAYSYDQNAMVVINYQDQIQLGTFEHAVHYLIDWMKHRVDSPPGAKKFTAIVCQSWSPSSATLAQRKG |
Tns18 | SEQ ID NO:52:MLTFEQAYNEQHLHSGIQYVTPAERHRGLDHVHLEQRKAVYEEAKRRHPKRWSGNTRYWALTGSVSLNPGKVHEIELNKQAA |
Tns19 | SEQ ID NO:53:MAGRYELSDQRWQMIEDIVSPPQTMGRPRRDDRQMLNGILWILCSGAQWRDLPERYGPWKTVYQRFRQLRDDGTFDRILARLHLRLREDGYMDLDTWMVDSTSIRATRSASGAGKKGDL |
Tns20 | SEQ ID NO:44 |
Tns21 | SEQ ID NO:43 |
实施例1:在菌株Halomonas bluephagenesis TD01中敲除单个转座酶进行P3HB生产发酵
在本实施例中,发明人尝试用Halomonas bluephagenesis TD01基因组上敲除了单个转座酶基因的嗜盐微生物来进行P3HB生产发酵实验,同时,以野生型Halomonas bluephagenesis TD01作为对照菌株进行发酵培养,以前述的MM培养基作为基础培养基,并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样。发酵过程中使用的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L,葡萄糖添加量为40 g/L,发酵温度为37℃,摇瓶转速为200rpm。实验结果如表4所示。
表4:敲除转座酶基因前后Halomonas bluephagenesis的摇瓶培养结果比较
实验序号 | 敲除的转座酶 | 干重(CDW;g/L) | P3HB含量 |
1-1 | 未敲除 | 10.16±0.91 | 71.38±3.42% |
1-2 | Tns3 | 11.35±0.32 | 76.36±1.29% |
1-3 | Tns5 | 12.65±0.29 | 79.29±1.92% |
1-4 | Tns8 | 12.03±0.30 | 80.56±0.92% |
1-5 | Tns19 | 11.62±0.27 | 78.61±0.99% |
其中,干重与P3HB含量的数值以xx±误差表示,其中误差越小,表明菌株生长和产物合成越稳定。
结果显示,与野生型Halomonas bluephagenesis TD01菌株培养实验1-1相比,当将其基因组上的转座酶基因进行单基因敲除时,Halomonas bluephagenesis TD01菌的生长和产物合成的稳定性有显著提高。由此,可以实现利用敲除单个转座酶基因,来实现更加稳定的生产。
实施例2:在菌株Halomonas bluephagenesis TD01中组合敲除两个转座酶进行P3HB生产发酵
在该实验中,以Halomonas bluephagenesis TD01作为对照发酵菌株进行发酵培养,以前述的MM培养基作为基础培养基,并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样,结果取均值。发酵过程中使用的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L,葡萄糖添加量为40 g/L,发酵温度为37℃,摇瓶转速为200rpm。实验结果如表5所示。
表5:组合敲除两个转座酶培养Halomonas bluephagenesis的摇瓶结果
实验序号 | 敲除的转座酶 | 干重(CDW;g/L) | P3HB含量 |
2-1 | 未敲除 | 10.91±1.05 | 72.55±5.01% |
2-2 | Tns3+Tns4 | 11.58±0.22 | 77.36±1.09% |
2-3 | Tns5+Tns9 | 12.04±0.25 | 78.21±1.22% |
2-4 | Tns8+Tns12 | 11.90±0.32 | 80.56±0.87% |
2-5 | Tns19+Tns21 | 11.62±0.26 | 79.62±0.95% |
在该实验中,对菌株的转座酶基因进行组合敲除,实现了2个转座酶基因的敲除。表5的结果证明,当将其基因组上的转座酶基因进行双基因组合敲除时,Halomonas bluephagenesis TD01菌的生长和产物合成的稳定性有显著提高。由此,可以实现利用组合敲除两个转座酶基因,来实现更加稳定的生产。
实施例3:在菌株Halomonas bluephagenesis TD01中敲除两个以上转座酶基因进行稳定的P3HB生产发酵
在该实验中,以Halomonas bluephagenesis TD01作为发酵菌株进行发酵培养,以前述的MM培养基作为基础培养基,并添加无机盐和葡萄糖。该实验与实施例2的区别在于敲除了更多数量的转座酶基因。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样,结果取均值。发酵过程中使用的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L,葡萄糖添加量为40 g/L,发酵温度为37℃,摇瓶转速为200rpm。实验结果如表6所示。
表6:组合敲除三个以上转座酶基因Halomonas bluephagenesis的摇瓶结果
实验序号 | 敲除的转座酶 | 干重(CDW;g/L) | P3HB含量 |
3-1 | 未敲除 | 10.81±1.25 | 73.55±4.02% |
3-2 | Tns3+Tns4+Tns5 | 12.58±0.32 | 75.36±1.29% |
3-3 | Tns5+Tns9+Tns10+Tns11 | 12.84±0.25 | 78.21±1.12% |
3-4 | Tns8+Tns12+Tns13+Tns15+Tns19+Tns21 | 12.90±0.22 | 80.56±0.57% |
3-5 | Tns1+Tns8+Tns12+Tns13+Tns15+Tns19+Tns21 | 12.62±0.20 | 79.62±0.75% |
在该实验中,对菌株的转座酶基因进行组合敲除,实现了3个及3个以上转座酶基因的敲除。表6的结果证明,当将其基因组上的转座酶基因进行多基因组合敲除时,Halomonas bluephagenesis TD01菌的生长和产物合成的稳定性有显著提高。由此,可以实现利用组合敲除三个或三个以上转座酶基因,来实现更加稳定的P3HB生产。
实施例4:在菌株Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2中敲除转座酶基因进行稳定的P34HB生产发酵
在该实验中,以Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2作为发酵菌株进行发酵培养,该菌株具有利用葡萄糖生产P34HB的能力。以前述的MM培养基作为基础培养基,并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样,结果取均值。发酵过程中使用无机盐的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L,葡萄糖添加量为40 g/L,发酵温度为37℃,摇瓶转速为200rpm。在该实验中,该菌株发酵生产的产物为聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB),结果如表7所示。
表7:敲除转座酶培养Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2的摇瓶结果
实验序号 | 敲除的转座酶 | 干重(CDW;g/L) | P34HB含量(%) | 4HB比例(mol %) |
4-1 | 未敲除 | 10.19±1.27 | 78.3±3.57% | 12±3% |
4-2 | 敲除全部转座酶(敲除转座酶Tns1-21) | 11.48±0.32 | 80.4±1.13% | 13±1% |
结果显示,在利用敲除了转座酶基因的Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2生产P34HB时,细菌生长良好,PHA产量及4HB比例与未敲除菌株相比,其产量相当。由此,可以实现利用组合敲除三个或三个以上转座酶基因,来实现更加稳定的P3HB4HB生产。
实施例5:在Halomonas campaniensis LS21中敲除转座酶基因进行P3HB发酵
以前述的MM培养基作为基础培养基,并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样,结果取均值。发酵过程中使用无机盐的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L,葡萄糖添加量为40 g/L,发酵温度为37℃,摇瓶转速为200rpm,实验结果如表8所示。
表8:培养转座酶敲除前后Halomonas campaniensis LS21的摇瓶结果比较
实验序号 | 敲除的转座酶 | 干重(CDW;g/L) | P3HB含量 |
5-1 | 未敲除 | 10.16±1.87 | 77.38±4.57% |
5-2 | Tns3+Tns4 | 11.25±0.29 | 80.36±0.52% |
5-3 | Tns3+Tns1+Tns4+Tns13 | 11.49±0.27 | 79.24±1.33% |
5-4 | Tns21+Tns3+Tns13+Tns1 | 12.13±0.27 | 80.36±0.71% |
5-5 | Tns3+Tns1+Tns21 | 12.54±0.31 | 81.62±0.50% |
对于菌株Halomonas campaniensis LS21,将转座酶进行单个或者全部敲除,同样不会影响其P3HB合成量,并且通过这样的敲除,同样可以减少因转座引起的微生物性状不稳定的问题。由此,可以实现利用组合敲除转座酶基因,来实现更加稳定的P3HB生产。
实施例6:敲除转座酶的Halomonas bluephagenesis TD01的P3HB发酵罐实验
以Halomonas bluephagenesis TD01和敲除转座酶后的菌株分别作为发酵菌株进行发酵培养,以前述的MM培养基作为基础培养基,并添加葡萄糖20g/L和氯化钠10g/L,进行发酵罐实验,此次发酵罐使用的是7L的发酵罐,发酵液体积3 L,pH设定在9.0,温度保持在37℃。嗜盐微生物发酵的一大优势在于,其可以进行开放式发酵而无需额外灭菌,同时,发酵过程中不需要加各类空气滤膜和复杂的无菌操作来减少染菌的可能性,大大节约了生产成本以及人力物力。常规的开放式发酵依托于高盐高pH的环境,以抑制其他的杂菌生长,结果如表9所示。
表9:敲除转座酶Halomonas bluephagenesis TD01的P3HB发酵罐实验结果
对于菌株TD01,将转座酶进行单个或者全部敲除,在7L发酵罐规模的生产实验中,同样不会影响其P3HB合成量,并且通过这样的敲除,同样可以减少因转座引起的微生物性状不稳定的问题。由此,可以实现利用组合敲除转座酶基因,来实现更加稳定的P3HB生产。
在该实验中意外地发现,转座酶敲除基因菌株进行发酵时可以获得更多的PHA,相比之下,对照菌株发酵时发酵体系的干重较低,这对于大规模开放式发酵生产PHA来说有着重大的产业价值和意义。
实施例7:敲除转座酶的Halomonas campaniensis LS21的发酵罐实验
Halomonas campaniensis LS21为嗜盐微生物中的一种,同样具有与实施例6所示的开放式发酵的优势。以Halomonas campaniensis LS21作为工程菌株进行发酵培养,以前述的MM培养基作为基础培养基,并添加葡萄糖20g/L和氯化钠10g/L,进行发酵罐实验,此次发酵使用7L的发酵罐,发酵液体积3 L,pH设定在8.5,温度保持在37℃。对照组在相同的实验条件下进行,区别在于对照组未敲除任何转座酶基因,结果如表10所示。
表10:敲除转座酶的Halomonas campaniensis LS21的P3HB发酵罐结果
根据表10结果所示,对于Halomonas campaniensis LS21,将转座酶进行单个或者全部敲除,在7L发酵罐规模的生产实验中,同样不会影响其P3HB合成量,并且通过这样的敲除,同样可以减少因转座引起的微生物性状不稳定的问题。由此,可以实现利用组合敲除转座酶基因,来实现更加稳定的P3HB生产。
实施例8:在菌株Halomonas bluephagenesis WZY278中敲除转座酶基因进行P3HB生产发酵
在该试验中,以Halomonas bluephagenesis WZY278作为发酵菌株进行发酵培养,以前述的MM培养基作为基础培养基,并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样,结果取均值。发酵过程中使用无机盐的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.684 mol/L,葡萄糖添加量为40 g/L,发酵温度为37℃,摇瓶转速为200rpm,实验结果如表11所示。
表11:敲除转座酶培养Halomonas bluephagenesis WZY278的摇瓶结果比较
实验序号 | 敲除的转座酶 | 干重(CDW;g/L) | P3HB含量 |
8-1 | 未敲除 | 11.54±1.42 | 75.38±4.27% |
8-2 | Tns3+Tns4+Tns5 | 12.25±0.28 | 80.36±0.22% |
8-3 | Tns5+Tns9+Tns10+Tns11 | 12.41±0.32 | 79.24±1.13% |
8-4 | Tns8+Tns12+Tns13+Tns1 | 12.32±0.34 | 80.36±0.81% |
8-5 | Tns15+Tns19+Tns21 | 12.53±0.31 | 81.62±0.51% |
根据表11结果所示,对于Halomonas bluephagenesis WZY278,将转座酶进行单个或者全部敲除,在摇瓶水平的生产实验中,同样不会影响其P3HB合成量,并且通过这样的敲除,同样可以减少因转座引起的微生物性状不稳定的问题。由此,可以实现利用组合敲除转座酶基因,来实现更加稳定的P3HB生产。
实施例9:敲除转座酶的Halomonas bluephagenesis WZY278的P3HB发酵罐实验
在该试验中,以敲除转座酶的Halomonas bluephagenesis WZY278作为发酵菌株进行发酵培养,该菌株同实施例8的菌株。
以前述的MM培养基作为基础培养基,并添加无机盐和葡萄糖(同实施例8)。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样,结果取均值。本实验葡萄糖添加量为40 g/L,发酵温度为37℃,摇瓶转速为200rpm。此次发酵使用7L的发酵罐,发酵液体积3 L,pH设定在8.5,温度保持在37℃。对照组在相同的实验条件下进行,区别在于对照组未敲除任何转座酶基因,结果如表12所示。
表12:敲除转座酶的Halomonas bluephagenesis WZY278的P3HB发酵罐结果
结果显示,在Halomonas bluephagenesis WZY278中,将转座酶进行单个或者全部敲除,在7L发酵罐规模的生产实验中,同样不会影响其P3HB合成量,并且通过这样的敲除,同样可以减少因转座引起的微生物性状不稳定的问题。由此,可以实现利用组合敲除转座酶基因,来实现更加稳定的P3HB生产。
实施例10:敲除转座酶的Halomonas bluephagenesis WZY278突变率测定实验
在该试验中,以敲除转座酶的Halomonas bluephagenesis WZY278作为发酵菌株进行发酵培养,该菌株同实施例8中的8-4实验菌株。
使用利福平抗性实验来确定菌株的突变率,将敲除转座酶的Halomonas bluephagenesis WZY278和原本的Halomonas bluephagenesis WZY278菌株接种在LB60的培养基中,在37℃200rpm的条件下培养过夜后,以1%的浓度转接到LB60的培养基中继续培养,至OD=1时,稀释涂布在分别含有利福平(100mg/L)和无抗的LB60平板上。统计不同条件下克隆数,并利用突变率=(抗性平板上的克隆数稀释倍数)/(无抗平板上的克隆数稀释倍数)。
表13:敲除转座酶的Halomonas bluephagenesis WZY278的突变率结果
结果显示,在Halomonas bluephagenesis WZY278中,将转座酶进行单个或者全部敲除,在培养过程中不同时间点的突变率均显著低于对照组,因此可以使用该菌来实现更加稳定的P3HB生产。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种工程改造的嗜盐微生物,其特征在于,所述嗜盐微生物中转座子失活或活性降低,所述的失活或活性降低包括通过基因编辑使得嗜盐微生物中转座子失活或活性降低,所述的嗜盐微生物包括盐单胞菌属(Halomonas)。
2.根据权利要求1所述的嗜盐微生物,其特征在于,所述嗜盐微生物中一个或两个以上转座酶失活或活性降低。
3.根据权利要求2所述的嗜盐微生物,其特征在于,所述的转座酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO:43-53中的一种或两种以上。
4.根据权利要求2或3所述的嗜盐微生物,其特征在于,编码所述转座酶的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1-21中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1所述的嗜盐微生物,其特征在于,所述的嗜盐微生物通过敲除或敲低转座子上编码转座酶的基因制备获得。
6.根据权利要求5所述的嗜盐微生物,其特征在于,使用靶向转座子的sgRNA进行敲除或敲低编码一个或两个以上转座酶的基因,所述sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO:22-42中的一种或两种以上。
7.根据权利要求1所述的嗜盐微生物,其特征在于,所述的盐单胞菌属(Halomonas)包括Halomonas bluephagenesis 或其衍生菌、Halomonas campaniensis或其衍生菌、Halomonas aydingkolgenesis或其衍生菌中的一种或两种以上。
8.一种权利要求1-7任一所述的嗜盐微生物的构建方法,其特征在于,包括通过基因编辑使得嗜盐微生物中转座子失活或活性降低。
9.根据权利要求8所述的构建方法,其特征在于,所述的构建方法包括使用靶向转座子的sgRNA进行敲除或敲低编码一个或两个以上转座酶的基因,所述sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO:22-42中的一种或两种以上。
10.一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法,其特征在于,所述的方法包括培养权利要求1-7任一所述的嗜盐微生物。
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN117363554B (zh) | 2024-04-09 |
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