CN115651874A - 一种培养嗜盐微生物的培养基和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种培养嗜盐微生物的培养基和培养方法，在该培养基和培养方法中，常规用于为嗜盐微生物提供高盐环境的氯化钠被全部或者部分地替换为钾盐，在发酵结束后，发酵液中剩余的钾离子将用于农业肥料使用。本发明避免了原本以钠离子为主的培养基的废水回收利用难的问题。

Description

一种培养嗜盐微生物的培养基和培养方法

技术领域

本发明涉及微生物培养领域，尤其是一种改进的培养嗜盐微生物的培养基和培养方法。

背景技术

1.嗜盐菌发酵

在利用微生物发酵生产目的产物比如聚羟基脂肪酸酯（PHA）的领域中，采用嗜盐微生物发酵无需灭菌即可进行开放性发酵，并且细胞密度高、产量高等，因此具有非常高的产业价值。在嗜盐微生物的开放式发酵中，常用的培养基中往往添加高浓度钠盐（例如60g/L的氯化钠），其有助于维持较高的胞外渗透压，为嗜盐菌提供相对合适的外部条件，以免除其他杂菌的影响，达到开放式发酵的目的。

2.高钠离子发酵对下游的废水处理造成的问题

高盐废水处理的问题主要在于在这样的高渗情况下，微生物很难生存，导致用于处理废水的微生物活性污泥难以驯化和稳定存在。同时，为了达到城市污水的排放标准，其中的离子浓度也需降低到一定的数值。但是如果采用高氯化钠浓度的培养基，不仅难以用生物方法处理，而且钠离子作为活泼金属阳离子，是一种相对难以处理和分离的离子。绝大部分的钠盐都可溶，而且溶解度非常高，很难沉淀析出。且该废水无法被其他产业所利用，造成了资源的浪费。

因此，开发一种减少使用氯化钠、甚至不使用氯化钠的培养基和培养方法对于嗜盐微生物发酵和生产具有重要意义。

发明内容

本发明的发明人进行了大量实验研究以解决以上问题。结果发现，当将用于嗜盐微生物培养中添加的钠盐全部或者部分地用钾盐替代时，可以克服上述缺陷，

基于以上内容，本发明提供以下方面：

本发明第一方面，本发明提供一种嗜盐微生物的培养基，所述培养基包括基础培养基和添加的钾盐，所述添加的钾盐用于替换至少20%的添加的钠盐，所述钾盐替换钠盐的添加量适于维持所述嗜盐微生物所需的渗透压。

在现有技术中，用于嗜盐微生物培养的培养基包括基础培养基和添加的高浓度钠盐，其有助于维持较高的胞外渗透压。本发明采用钾盐部分或者全部替换上述添加的高浓度钠盐，并维持所述嗜盐微生物所需的渗透压。

优选地，所述培养基中的被替换的钠盐可以是大于等于20%的任一数值，例如22%、25%、28%、30%、33%、35%、38%、40%、42%、45%、47%、50%、52%、55%、58%、60%、62%、65%、67%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、90%、92%、95%、98%、100%等等，进一步优选地，所述培养基中的钠盐至少50%或者全部被钾盐替换。

优选地，所述钠盐被钾盐替换后，维持和替换前基本相同的渗透压。

优选地，所述钾盐包括但不限于氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、柠檬酸钾、乙酸钾、葡萄糖酸钾、硝酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种组合。

例如：氯化钾、碳酸氢钾或者磷酸钾；氯化钾与磷酸钾的组合；硫酸钾，磷酸钾与氯化钾的组合；磷酸钾与硫酸钾的组合；硫酸钾、磷酸钾、柠檬酸钾、乙酸钾与葡萄糖酸钾的组合，或者任意钾盐与氯化钾的组合，等等。

更优选地，所述钾盐为氯化钾或者包括氯化钾时，钾离子的浓度可以在0.05 mol/L至2mo/L之间，优选为0.1mo/L至1 mol/L之间。

其他钾盐（氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、柠檬酸钾、乙酸钾、葡萄糖酸钾、硝酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种组合）培养时，钾离子浓度浓度可以在0.05 mol至2mol之间，优选为0.1mol至1 mol之间。

优选地，所述培养基还包括碳源，在本发明中，所述碳源是为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质，也可以理解为用于合成产物的底物。在本发明中，“碳源”是本发明的嗜盐微生物用以合成PHA的来源，因此，其在本文中可以与“底物”可互换地使用。

更优选地，所述碳源来自葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸盐、葡萄糖酸酯或者其组合，进一步优选地，所述碳源来自葡萄糖。

以上提及的葡萄糖酸盐可以是任意一种或多种葡萄糖酸盐，只要其可以用作本发明所涉及微生物的碳源用于聚合物生产即可，例如，葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钙等。

更优选地，所述碳源的浓度可以在1-100 g/L、进一步优选地，所述碳源浓度可以是上述范围内的任一范围或者数值，例如：约1-90 g/L、约1-80 g/L、约1-70 g/L、或约1-60g/L的范围内；更优选地，该浓度可以在约3-60 g/L、约3-50 g/L 或约3-40 g/L的范围内；进一步优选约5-60 g/L、约10-60 g/L、约20-40g/L的范围内，具体地可以是，约10g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L、约35g/L等等。

优选地，所述基础培养基是指包含营养物质可以用于支持本发明微生物生长的培养基。上述基础培养基可以是本领域常规用于微生物培养的培养基，比如矿物质培养基、LB培养基、MM培养基或牛肉膏蛋白胨等等，也可以是在这些培养基的基础上根据期望目的进行改良的培养基。也就是说，本领域技术人员可以常规选择合适的基础培养基，只要其能够允许微生物，尤其是嗜盐微生物的生长即可。

根据实际需求，培养基可以适当地额外添加有其他物质如用于抗性筛选的抗生素、用于维持特殊微生物如嗜盐微生物生长所需盐度的钾盐、用于供微生物代谢以合成产物的碳源等等。

在一个具体的实施方式中，

MM培养基的一般配方为：0.1-2g/L(NH4)2SO4或者尿素，0.1g/L-1g/L MgSO4，5g/L-10g/L Na2HPO4·12H2O，0.5g/L-2g/L KH2PO4，0.1%的其他微量元素（Fe(III)-NH4-Citrate，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，H3BO3，CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，NiCl2·6H2O，NaMoO4·2H2O微量（pH调至约9.0））；

MM培养基优选为：1g/L (NH4)2SO4 或0.5 g/L尿素，0.2g/L MgSO4，10g/LNa2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4，不超过0.1g/L的其他微量元素（Fe(III)-NH4-Citrate，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，H3BO3，CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，NiCl2·6H2O，NaMoO4·2H2O（pH调至约9.0））。

LB液体培养基的一般配方为：4-6 g/L酵母提取物，8-12 g/L蛋白胨，8-12 g/L 氯化钠，其余为蒸馏水（pH调至7.0-7.2）；优选为：5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化钠，其余为蒸馏水（pH调至7.0-7.2）。

本发明的嗜盐微生物的培养基是在基础培养基的基础上添加碳源和钾盐而得到的，其中碳源可被嗜盐微生物利用以合成期望的产物，而钾盐则用于为嗜盐微生物提供适合其生长的渗透压环境。

在一个具体的实施方式中，所述培养基包括：MM基础培养基，葡萄糖30g/L，5-100g/L 钾盐。

本发明第二方面，提供一种上述任一的培养基在培养嗜盐微生物中的用途。

优选地，所述嗜盐微生物是指微生物生长需要一定的盐浓度、并且在一定盐浓度的环境中生长最佳的微生物。可以是嗜盐细菌、嗜盐古菌和藻类。更具体地，嗜盐微生物可以是嗜盐细菌，优选为盐单胞菌属（Halomonas）的细菌及它们衍生菌株或其组合，更优选为盐单胞菌属下的任意种，例如Candidatus Halomonas phosphatis、Halomonasbluephagenesis、 Halomonascampaniensis、Halomonasaydingkolgenesis、Halomonas aerodenitrificans、Halomonas halocynthiae

以及

所列出的任意种。

进一步优选地，所述嗜盐细菌为Halomonasbluephagenesis TD01（CGMCC No.4353）、Halomonascampaniensis LS21（CGMCC No. 6593）、Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2、Halomonasaydingkolgenesis M1（CGMCC No.19880）、Halomonasbluephagenesis WZY254及它们衍生菌株或其组合。

本发明第三方面，提供一种嗜盐微生物的培养方法，所述培养方法包括用上述任一的培养基对嗜盐微生物进行培养。

优选地，所述嗜盐微生物是指微生物生长需要一定的盐浓度、并且在一定盐浓度的环境中生长最佳的微生物。可以是嗜盐细菌、嗜盐古菌和藻类。更具体地，嗜盐微生物可以是嗜盐细菌，优选为盐单胞菌属（Halomonas）的细菌及它们衍生菌株或其组合，更优选为盐单胞菌属下的任意种，例如Candidatus Halomonas phosphatis、Halomonasbluephagenesis、 Halomonas campaniensis、Halomonas aydingkolgenesis、Halomonaseelongata、Halomonas halocynthiae

以及

所列出的任意种。

进一步优选地，所述嗜盐细菌为Halomonas bluephagenesis TD01（CGMCC No.4353）、Halomonas campaniensis LS21（CGMCC No. 6593）、Halomonas bluephagenesis TD△gabD2-D2、Halomonas aydingkolgenesis M1（CGMCC No.19880）、Halomonasbluephagenesis WZY254及它们衍生菌株或其组合。

优选地，所述培养方法包括用上述任一的培养基对嗜盐微生物进行培养产生PHA。

本文所提及的PHA是指聚羟基脂肪酸酯，其根据单体组成可以分为均聚物和共聚物。根据单体的碳原子数，本发明的PHA包括但不限于短链PHA（即，单体为C3-C5的羟基脂肪酸）和中长链PHA（即，单体为C6-C16的羟基脂肪酸）。

在本发明的一些实施方式中，PHA可以是均聚物，包括但不限于聚羟基丙酸酯、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯等等，例如，聚-3-羟基丁酸酯（P3HB）、聚-4-羟基丁酸酯（P4HB）、聚-3-羟基丙酸酯（P3HP）或聚-3-羟基戊酸酯（P3HV）等。

在本发明的一些实施方式中，PHA可以是包括但不限于共聚物如二聚物、三聚物等，例如，共聚物可以是羟基丙酸酯与羟基丁酸酯的共聚物；羟基丙酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物；羟基丙酸酯、羟基丁酸酯、羟基戊酸酯三者的共聚物等等。

更具体地，在本发明的一些实施方式中，PHA可以是聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯（P3HB4HB）、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯（P3HB3HV）或聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚酯（P34HB3HV）、或其组合等。

有益技术效果：

1、本发明采用钾盐代替钠盐后，即便是在100%进行替换后，嗜盐微生物的生长情况良好。

2、采用钾盐如氯化钾代替氯化钠提供基本相同的高盐浓度，和基本相同的渗透压，可以进行开放式发酵，更有效地避免杂菌产生，甚至略微提高嗜盐菌及产物，例如PHA的产量。

3、使用钾盐替代钠盐后的发酵废水经浓缩后，钠离子浓度下降，钾离子浓度增加，浓缩后的废水可以作为农业肥料使用，提高植物单果的重量，大大减少了资源的浪费。

具体实施方式

下面通过具体的实施例来进一步解释本发明。需理解，这些实施例仅仅是以示例的方式描述和帮助理解本发明，而并不意在将本发明局限于这些实施例。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例中采用的细菌为Halomonasbluephagenesis TD01，该菌株于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCCNo.4353，分类命名为盐单胞菌Halomonas sp. TD01（也称为Halomonasbluephagenesis TD01；其记载于专利申请公开号CN102120973A；公众可以从清华大学获得该菌。

盐单胞菌HalomonascampaniensisLS21：是本实验室筛选得到的一株革兰氏阴性嗜盐细菌，具有非常好的工业化生产应用前景，公众可以从清华大学获得该菌。

用于培养嗜盐微生物的MM培养基的具体配方如下：

尿素 0.5g/L；MgSO4 0.2g/L；KH2PO41.5g/L；以及合计<0.1g/L的Fe(III)-NH4-Citrate，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，H3BO3，CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，NiCl2·6H2O，NaMoO4·2H2O。

向培养基中另外添加葡萄糖30g/L作为碳源，添加5-100g/L 钾盐以提供嗜盐菌生长所需的渗透压环境；并将pH调节在9.0。

气相色谱检测聚羟基脂肪酸酯（PHA）含量的方法：

设定炉温为80℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25Mpa，程序升温条件为：80℃停留1.5分钟，以30℃/min 的速度升温至140℃，接着以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5分钟。样品的进样量为1μl，使用安捷伦公司生产的微量进样器。

气相样品准备：取40-60 mg待测样品的干细胞（取菌液于10000 rpm下常温离心10分钟，所得细胞沉淀水洗一次之后，冰干，得到干细胞，均聚物产于细胞中），加2 ml氯仿，2ml酯化液（纯甲醇中含3％（v/v）的浓硫酸及1 g/L苯甲酸作内标）于酯化管中，加盖密封后于100℃下加热4小时。冷却后加入1 ml蒸馏水，充分振荡后静置，待氯仿相与水相完全分层后，取下层氯仿相1μl注入气相色谱仪（HP公司Hewlett Packard 6890）中进行色谱分析。依照HP公司Hewlett Packard 6890气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。

标准样品准备：取10-20 mg的标准样品于酯化管中，加2 ml氯仿，2 ml酯化液，加盖密封后在100℃进行酯化。

结果分析：以标准样品为对照，如果待测细胞的酯化样品（待测样品）在标样处有明显的出峰，则可以根据峰面积计算各个单体的质量，然后根据各个单体的质量分数计算出摩尔比例；根据加入的样品量可以计算出细胞干重中含有聚合物的比重（wt％）。

下文所提及的细胞干重（CDW，g/L）是干燥菌体的质量与发酵产物体积的比值。

下文所提及的P3HB含量（wt%）为P3HB占干燥菌体的质量比例。

实施例1 使用氯化钾替代氯化钠作为渗透压提供剂在菌株Halomonasbluephagenesis TD01中进行P3HB生产发酵

在本实施例中，发明人尝试用氯化钾部分或者完全替代氯化钠来提供合适的渗透压环境，同时，以仅使用氯化钠作为钠盐的实验作为对照。在该实验中，以Halomonasbluephagenesis TD01（Tan D, Xue Y, Aibaidula G, et al. Unsterile andcontinuous production of polyhydroxybutyrate by Halomonas TD01 [J].Bioresource Technology, 2011, 102:8130-8136.）作为发酵菌株进行发酵培养，以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样，结果取均值。发酵过程中各实验组使用钠盐、钾盐或者钠盐与钾盐的组合的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L（以下实施例钠盐、钾盐或者钠盐与钾盐的组合的浓度参照本实施例），葡萄糖添加量为40 g/L，发酵温度为37℃，摇瓶转速为200rpm。实验结果如表1所示。

表1：氯化钾和氯化钠培养Halomonasbluephagenesis的摇瓶结果比较

结果显示，与仅采用氯化钠作为钠盐的实验1-1相比，当将用于提供渗透压环境的氯化钠部分地或全部使用氯化钾替代时，Halomonasbluephagenesis TD01菌的生长和产物合成基本不受影响。由此，可以实现利用钾盐替代钠盐进行菌体培养。产生的含钾废水，可以用作农业化肥使用。

实施例2 使用磷酸钾和氯化钾作为渗透压提供剂在菌株Halomonasbluephagenesis TD01中进行P3HB生产发酵

在该实验中，以Halomonasbluephagenesis TD01作为发酵菌株进行发酵培养，以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样，结果取均值。发酵过程中使用的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L，葡萄糖添加量为40 g/L，发酵温度为37℃，摇瓶转速为200rpm。实验结果如表2所示。

表2：磷酸钾和氯化钾培养Halomonasbluephagenesis的摇瓶结果

在该实验中，使用磷酸钾或搭配使用氯化钾为培养基提供渗透压。表2的结果证明，磷酸钾的确可以替代氯化钾进行发酵。细菌生长良好，PHA产量与采用氯化钾进行发酵时的产量相当，换言之，采用磷酸钾替代氯化钾作为钾盐进行发酵也可以在不影响目标产物合成的情况下减少因氯离子存在导致发酵体系对发酵设备产生的腐蚀作用，降低发酵体系中的氯离子浓度从而有利于后续废水处理与回收利用。

实施例3 使用混合钾盐作为渗透压提供剂在菌株HalomonasbluephagenesisTD01中进行P3HB生产发酵

在该实验中，以Halomonasbluephagenesis TD01作为发酵菌株进行发酵培养，以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加无机盐和葡萄糖。该实验与实施例2的区别在于添加的无机盐是硫酸钾、磷酸钾、柠檬酸钾、乙酸钾、葡糖糖酸钾这几种钾盐的混合。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样，结果取均值。发酵过程中使用的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L，葡萄糖添加量为40 g/L，发酵温度为37℃，摇瓶转速为200rpm。实验结果如表3所示。

表3：混合钾盐培养Halomonasbluephagenesis的摇瓶结果

在该实验中，使用混合钾盐为培养基提供渗透压。表3的结果证明，多种混合钾盐的确可以替代氯化钾进行发酵。细菌生长良好，PHA产量与采用氯化钾进行发酵时的产量相当，换言之，采用混合钾盐替代氯化钾进行发酵也可以在不影响目标产物合成的情况下减少因氯离子存在导致发酵体系对发酵设备产生的腐蚀作用，降低发酵体系中的氯离子浓度从而有利于后续废水处理与回收利用。

实施例4 用氯化钾替代氯化钠作为渗透压提供剂在菌株Halomonasbluephagenesis TD△gabD2-D2中进行P34HB生产发酵

在该实验中，以Halomonasbluephagenesis TD△gabD2-D2作为发酵菌株进行发酵培养，该菌株具有利用葡萄糖生产P34HB的能力（Ye, J.; Hu, D.; Che, X.; Jiang, X.;Li, T.; Chen, J.; Zhang, H. M.; Chen, G. Q., Engineering ofHalomonasbluephagenesis for low cost production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from glucose. MetabEng 2018, 47, 143-152.）。以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样，结果取均值。发酵过程中使用无机盐的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L，葡萄糖添加量为40 g/L，发酵温度为37℃，摇瓶转速为200rpm。在该实验中，使用氯化钾为培养基提供渗透压。实验组和对照组的氯化钾和氯化钠摩尔浓度相同。该菌株发酵生产的产物为聚3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚酯（P3HB4HB）。结果如表4所示：

表4：氯化钾和氯化钠培养Halomonasbluephagenesis TD△gabD2-D2的摇瓶结果

结果显示，使用氯化钾替代氯化钠组合作为无机盐发酵生产P34HB时，细菌生长良好，PHA产量与采用提供等摩尔量Na离子的NaCl进行发酵时的产量相当。由此，可以实现利用钾盐替代钠盐进行菌体培养。产生的含钾废水，可以用作农业化肥使用。

实施例5 利用Halomonascampaniensis LS21采用替代钾盐进行P3HB发酵

以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样，结果取均值。发酵过程中使用无机盐的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L，葡萄糖添加量为40 g/L，发酵温度为37℃，摇瓶转速为200rpm。在该实验中，使用氯化钾为培养基提供渗透压。实验组和对照组的氯化钾和氯化钠摩尔浓度相同。实验结果如表5所示：

表5：氯化钾和氯化钠培养Halomonascampaniensis LS21的摇瓶结果比较

对于菌株LS21，将氯化钠替换为氯化钾或其他钾盐的组合，同样不会影响其P3HB合成量，并且通过这样的替换，可以减少因钠离子存在导致发酵体系下游废水难以回收利用的问题。利用钾盐替代钠盐进行菌体培养产生的含钾废水，可以用作农业化肥使用。

实施例6 使用氯化钾替代氯化钠作为渗透压提供剂在菌株Halomonasaydingkolgenesis M1中进行P3HB生产发酵

盐单胞菌Halomonas aydingkolgenesis M1：一种有自凝絮能力的盐单胞菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO. 19880，其可在发酵条件下免灭菌开放培养，并高效积累聚羟基脂肪酸酯( PHA )和/或小分子化合物等。

在本实施例中，发明人尝试用氯化钾部分或者完全替代氯化钠来提供合适的渗透压环境，同时，以仅使用氯化钠作为钠盐的实验作为对照。在该实验中，以Halomonasaydingkolgenesis M1作为发酵菌株进行发酵培养，以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样，结果取均值。发酵过程中使用的对应的氯化钠的摩尔浓度为0.171 mol/L，葡萄糖添加量为20 g/L，发酵温度为37℃，摇瓶转速为200rpm。实验结果如表6所示。

表6： 氯化钾和氯化钠培养Halomonasaydingkolgenesis M1的摇瓶结果比较

结果显示，与仅采用氯化钠作为钠盐的实验6-1相比，当将用于提供渗透压环境的氯化钠部分地或全部使用氯化钾替代时，Halomonasaydingkolgenesis M1菌株的生长和产物合成基本不受影响。由此，可以实现利用钾盐替代钠盐进行菌株培养及P3HB生产，其产生的含钾废水，可以作为农业化肥使用。

实施例7使用氯化钾替代氯化钠作为渗透压提供剂在菌株Halomonasbluephagenesis WZY254中进行P3HB生产发酵

在该试验中，以Halomonasbluephagenesis WZY254作为发酵菌株进行发酵培养，该菌株是Halomonasbluephagenesis TD01的衍生菌株，在进行一系列基因组编辑后，其最适盐浓度大幅下降(Wang, Z., Zheng, Y., Ji, M., Zhang, X., Wang, H., Chen, Y.,Wu, Q., Chen, G.Q. 2022. Hyperproduction of PHA copolymers containing highfractions of 4-hydroxybutyrate (4HB) by outer membrane-defectedHalomonasbluephagenesis grown in bioreactors. MicrobBiotechnol, 15(5), 1586-1597.)，废水中的盐离子浓度降低，有利于保护金属不被腐蚀，减少下游废水处理成本。以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加无机盐和葡萄糖。采用摇瓶实验。每组实验设三个平行样，结果取均值。发酵过程中使用无机盐的对应的氯化钠的摩尔浓度分别为0.342mol/L，0.513 mol/L葡萄糖添加量为40 g/L，发酵温度为37℃，摇瓶转速为200rpm。在该实验中，使用氯化钾为培养基提供渗透压。实验组和对照组的氯化钾和氯化钠摩尔浓度相同。实验结果如表7所示：

表7：氯化钾和氯化钠培养Halomonasbluephagenesis WZY254的摇瓶结果比较

结果显示，与采用氯化钠作为钠盐的实验相比，当将用于提供环境渗透压的氯化钠全部替换为等摩尔的氯化钾时，Halomonasbluephagenesis WZY254菌的生长基本不受影响。

实施例8 使用氯化钾替代氯化钠作为渗透压提供剂在菌株Halomonasbluephagenesis TD01中的P3HB发酵罐实验

以Halomonasbluephagenesis TD01作为发酵菌株进行发酵培养，以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加葡萄糖20g/L和氯化钾10g/L，进行发酵罐实验，此次发酵罐使用的是7L的发酵罐，发酵液体积3 L，pH设定在9.0，温度保持在37℃。对照组在相同的实验条件下进行，区别在于使用氯化钠10g/L为发酵体系提供渗透压。嗜盐菌发酵的一大优势在于，其可以进行开放式发酵而无需额外灭菌，同时，发酵过程中不需要加各类空气滤膜和复杂的无菌操作来减少染菌的可能性，大大节约了生产成本以及人力物力。常规的开放式发酵依托于高盐高pH的环境，以抑制其他的杂菌生长。结果如表8所示：

表8：Halomonasbluephagenesis TD01的P3HB发酵罐实验结果

通过利用氯化钾替代氯化钠作为渗透剂的发酵结果意外地发现，采用KCl作为无机盐进行发酵时可以获得更多的PHA，相比之下，采用NaCl作为钠盐进行发酵时发酵体系的干重较低。由此证明了当采用合适浓度KCl进行发酵时，相比常规采用的NaCl能够略微提升产量，这对于大规模开放式发酵生产PHA来说有着重大的产业价值和意义。此外，利用钾盐替代钠盐进行菌体培养产生的含钾废水，可以用作农业化肥使用。

实施例9 使用氯化钾替代氯化钠作为渗透压提供剂进行菌株HalomonascampaniensisLS21的发酵罐实验

Halomonas campaniensisLS21（Jiang X, Yao Z, Chen G Q. Controlling cellvolume for efficient PHB production by Halomonas [J]. Metabolic Engineering,2017, 44:30-37）为嗜盐菌中的一种，同样具有与实施例8所示的开放式发酵的优势。以Halomonas campaniensisLS21作为工程菌株进行发酵培养，以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加葡萄糖20g/L和氯化钾10g/L，进行发酵罐实验，此次发酵使用7L的发酵罐，发酵液体积3 L，pH设定在8.5，温度保持在37℃。对照组在相同的实验条件下进行，区别在于对照组使用浓度为10g/L的氯化钠为发酵体系渗透压提供剂。结果如表9所示：

表9：Halomonas campaniensisLS21的P3HB发酵罐实验结果

根据表9结果所示，相比之下，以氯化钾替代氯化钠作为渗透剂进行发酵生产PHA，具有与NaCl作为钠盐进行发酵生产PHA具有相同的产量水平。此外，由于钾盐相比于钠盐在废水处理等问题上的优势，采用合适浓度KCl取代NaCl进行发酵，尤其是对于大规模开放式发酵生产PHA来说，具有重大的产业价值和意义。

实施例10使用碳酸氢钾作为渗透压提供剂在菌株HalomonasbluephagenesisWZY254中进行P3HB的发酵罐生产发酵

在该试验中，以Halomonasbluephagenesis WZY254作为发酵菌株进行发酵培养，该菌株同实施例10的菌株。发酵罐的发酵方法同实施例8-9。以前述的MM培养基作为基础培养基，并添加葡萄糖20g/L和碳酸氢钾10g/L，进行发酵罐实验，此次发酵使用7L的发酵罐，发酵液体积3 L，pH设定在8.5，温度保持在37℃。对照组在相同的实验条件下进行，区别在于对照组使用浓度为10g/L的氯化钠为发酵体系渗透压提供剂。结果如表10所示：

表10：碳酸氢钾作为渗透压提供剂在菌株Halomonas bluephagenesis WZY254中进行的发酵罐实验

表10的结果证明，碳酸氢钾的确可以替代氯化钠进行发酵。细菌生长良好。采用碳酸氢钾替代氯化钠进行发酵也可以在不影响目标产物合成的情况下减少因氯离子存在导致发酵体系对发酵设备产生的腐蚀作用，降低发酵体系中的氯离子和钠离子浓度从而有利于后续废水处理与回收利用。

实施例11 含钾盐的发酵废水作为农业肥料使用

按照实施例8-10中的方法进行扩大化生产后，获得的含钾发酵废水作为回收肥料使用。种植苹果树进行肥料的肥力实验。处理1对照（CK）不施肥，处理2施有机肥150公斤/亩，处理3施发酵废水处理后肥料150公斤/亩。实验重复三次，选择树龄和群体生长一致且地力水平均匀的田块，随机排列，统计苹果树的单果重量数据。结果如表11所示：

表11使用含钾盐发酵废液施肥下单果重量（单位：g）

从上表结果可以看出，含钾发酵废水处理后作为作物肥料使用，可以增加作物产量。因此使用钾盐替代钠盐进行微生物培养，可以减少资源的浪费，回收生产成本，形成环保的生态产业链。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (12)

1.一种嗜盐微生物的培养基，其特征在于，所述的培养基包括基础培养基和添加的钾盐，所述添加的钾盐用于替换至少20%的添加的钠盐，所述钾盐替换钠盐的添加量适于维持所述嗜盐微生物所需的渗透压。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的钾盐选自但不限于：氯化钾、硫酸钾、磷酸钾、柠檬酸钾、乙酸钾、葡萄糖酸钾、硝酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种组合。

3.根据权利要求1-2任一所述的培养基，其特征在于，所述钾盐选自氯化钾、碳酸氢钾或者磷酸钾；氯化钾与磷酸钾的组合；硫酸钾，磷酸钾与氯化钾的组合；磷酸钾与硫酸钾的组合；硫酸钾、磷酸钾、柠檬酸钾、乙酸钾与葡萄糖酸钾的组合，或者任意钾盐与氯化钾的组合。

4.根据权利要求1-2任一所述的培养基，其特征在于，所述钾盐浓度在5-200g/L。

5.根据权利要求1-2任一所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基是指包含营养物质用于所述微生物生长的培养基。

6.权利要求1-5任一所述的培养基在培养嗜盐微生物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述嗜盐微生物是指微生物生长需要一定的盐浓度、并且在一定盐浓度的环境中生长最佳的微生物。

8.一种嗜盐微生物的培养方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一所述的培养基对嗜盐微生物进行培养。

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述嗜盐微生物为嗜盐细菌。

10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述嗜盐微生物为盐单胞菌属（Halomonas）的细菌及它们衍生菌株或其组合。

11.根据权利要求8-9任一所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括对嗜盐微生物进行培养产生PHA。

12.根据权利要求8-9任一所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括开放式发酵培养方法。