CN117946225A - 提高聚羟基脂肪酸酯产量的重组工程菌及其应用 - Google Patents

提高聚羟基脂肪酸酯产量的重组工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及提高聚羟基脂肪酸酯产量的重组工程菌及其应用。本发明发现H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低能够显著提升PHA生产菌的PHA生产性能，由此构建的重组工程菌在PHA产量、底物转化率、生长速率等方面均有显著提高，有效降低了PHA工业生产的成本，提升了PHA在传统塑料和生物基可降解塑料市场中的竞争力与其商业化应用价值。

Description

提高聚羟基脂肪酸酯产量的重组工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及提高聚羟基脂肪酸酯产量的重组工程菌及其应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类由微生物合成的高分子聚酯，具有良好的生物可降解性，可以在多种场景中替代传统塑料。罗氏真养菌(Ralstonia eutropha，也称为Cupriavidus necator)是研究PHA合成的重要模式细菌，也是目前研究较多的用于PHA工业生产的菌种。常用的罗氏真养菌H16及其衍生菌株等可作为平台底盘，在工业条件下实现高细胞密度的分批补料发酵，以糖类、油脂等生物质原料为底物，高效生产包括不同种类PHA在内的产物。
当前PHA的生产成本相比其他传统塑料和生物基可降解塑料仍然较高，在一定程度上限制了其商业化应用。提高PHA生产菌株的生产性能是降低PHA生产成本的关键，然而，目前针对PHA合成的优化，多集中在PHA合成通路的筛选和改造，少有针对底盘菌背景基因组改造的报道。
发明内容
本发明提供提高聚羟基脂肪酸酯产量的重组工程菌及其应用。
本发明在提高PHA生产性能的研发过程中发现了两个新的与PHA合成相关的靶点——H16_A3043、H16_A3044，经实验验证，H16_A3043、H16_A3044的弱化或失活能够显著提高PHA的产量和底物转化率，进而提高菌株的PHA生产性能。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低在提高PHA生产菌的PHA生产性能中的应用。
第二方面，本发明提供H16_A3043蛋白的同源蛋白和/或H16_A3044蛋白的同源蛋白的表达和/或活性降低在提高PHA生产菌的PHA生产性能中的应用。
本发明中，所述PHA生产菌是指能够合成并积累PHA的微生物，包括但不限于罗尔斯通氏菌属细菌(例如罗氏真养菌)、产碱杆菌属细菌(例如真养产碱杆菌)、埃希氏菌属细菌(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌属细菌(例如枯草芽孢杆菌)、棒杆菌属细菌(例如谷氨酸棒杆菌)、嗜盐菌和酵母菌。
优选地，所述PHA生产菌为罗尔斯通氏菌属细菌。
进一步优选地，所述PHA生产菌为罗氏真养菌。
本发明中，H16_A3043、H16_A3044为蛋白的编码基因在GenBank中的locus_tag，本领域技术人员可从GenBank中获得H16_A3043、H16_A3044蛋白及其编码基因的序列。
具体地，H16_A3043蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，H16_A3043基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，H16_A3044蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，H16_A3044基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明中，所述H16_A3043蛋白的同源蛋白为来源于罗尔斯通氏菌属细菌且与H16_A3043蛋白的氨基酸序列具有至少70％同源性(优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、更优选为至少91％、更优选为至少92％、更优选为至少93％、更优选为至少94％、更优选为至少95％、更优选为至少96％、更优选为至少97％、更优选为至少98％、更优选为至少99％、更优选为至少99.5％)的蛋白。所述H16_A3044蛋白的同源蛋白为来源于罗尔斯通氏菌属细菌且与H16_A3044蛋白的氨基酸序列具有至少70％(优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、更优选为至少91％、更优选为至少92％、更优选为至少93％、更优选为至少94％、更优选为至少95％、更优选为至少96％、更优选为至少97％、更优选为至少98％、更优选为至少99％、更优选为至少99.5％)同源性的蛋白。
在本发明的一些实施方式中提供H16_A3043蛋白的表达和/或活性降低在提高罗氏真养菌的PHA生产性能中的应用。
在本发明的一些实施方式中提供H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低在提高罗氏真养菌的PHA生产性能中的应用。
在本发明的一些实施方式中提供H16_A3043和H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低在提高罗氏真养菌的PHA生产性能中的应用。
本发明中，所述PHA生产性能包括PHA产量和/或底物转化率。
所述底物转化率是指发酵生产PHA所利用的底物到PHA的转化率。优选地，所述底物转化率为生物质底物转化率。
上述应用中，表达和/或活性降低包括减弱所述蛋白的表达和/或活性，或者使得所述蛋白不表达或失活。
对于实现表达和/或活性降低的方式和技术手段，本发明没有特殊限制，例如，可采用常用的基因工程手段和基因编辑方法对所述蛋白、其编码基因、其调控元件和/或其调节基因或蛋白进行修饰，以使得所述蛋白的表达和/或活性降低。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白的表达和/或活性降低通过以下(1)～(3)中的任意一种或多种方式的组合实现：
(1)对蛋白的氨基酸序列进行突变以使得蛋白的表达和/或活性降低；
(2)对蛋白的编码基因的核苷酸序列进行突变以使得蛋白的表达和/或活性降低；
(3)将蛋白的编码基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更弱的元件以使得蛋白的表达降低。
以上所述的氨基酸序列的突变包括缺失、插入或替换一个或多个氨基酸。
以上所述的核苷酸序列的突变包括缺失、插入或替换一个或多个核苷酸。
以上所述的转录、翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点等。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白的表达和/或活性降低通过失活所述蛋白实现。
在本发明的一些实施方式中，H16_A3043蛋白的表达和/或活性降低通过将其第57位氨基酸突变为脯氨酸和/或第173位氨基酸突变为脯氨酸实现。
作为示例，本发明通过实验验证发现H16_A3043失活、H16_A3044失活、H16_A3043和H16_A3044失活均能够显著提高菌株的PHA生产性能，而且，相较于H16_A3044失活、H16_A3043和H16_A3044失活，H16_A3043失活菌株的PHA生产性能更优，具体表现为PHA产量更高，且底物转化率更高。
第三方面，本发明提供H16_A3043蛋白的突变体，所述突变体与H16_A3043蛋白相比，含有第57位氨基酸突变为脯氨酸和/或第173位氨基酸突变为脯氨酸的突变。
本发明发现，将H16_A3043蛋白第57位氨基酸突变为脯氨酸、第173位氨基酸突变为脯氨酸能够显著提高菌株的PHA产量和底物转化率，有效促进PHA的合成，而且，第57位氨基酸突变为脯氨酸对PHA产量和底物转化率的提升效果明显更优。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体与H16_A3043蛋白相比的突变为将第57位氨基酸突变为脯氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述突变体与H16_A3043蛋白相比的突变为第173位氨基酸突变为脯氨酸。
第四方面，本发明提供编码所述突变体的核酸分子。
基于上述突变体的氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员能够获得编码所述突变体的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码所述突变体的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码所述突变体的核酸分子均在本发明的保护范围内。
第五方面，本发明提供包含所述核酸分子或表达所述突变体的生物材料。
以上所述的生物材料包括表达盒、载体或宿主细胞。
其中，所述表达盒为将所述核酸分子与转录和/或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。
所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子。
所述宿主细胞包括微生物细胞。优选为大肠杆菌或罗氏真养菌。
第六方面，本发明提供以上所述的突变体或所述核酸分子或所述生物材料在构建产PHA的重组工程菌中的应用。
第七方面，本发明提供重组工程菌，所述重组工程菌被修饰以使得其中H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低。
在本发明的一些实施方式中，所述重组工程菌被修饰以使得其中H16_A3043蛋白的表达和/或活性降低。
在本发明的一些实施方式中，所述重组工程菌被修饰以使得其中H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低。
在本发明的一些实施方式中，所述重组工程菌被修饰以使得其中H16_A3043和H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低。
上述表达和/或活性降低包括减弱所述蛋白的表达和/或活性，或者，使得所述蛋白不表达或失活。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白的表达和/或活性降低通过以下(1)～(3)中的任意一种或多种方式的组合实现：
(1)对蛋白的氨基酸序列进行突变以使得蛋白的表达和/或活性降低；
(2)对蛋白的编码基因的核苷酸序列进行突变以使得蛋白的表达和/或活性降低；
(3)将蛋白的编码基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更弱的元件以使得蛋白的表达降低。
以上所述的氨基酸序列的突变包括缺失、插入或替换一个或多个氨基酸。
以上所述的核苷酸序列的突变包括缺失、插入或替换一个或多个核苷酸。
以上所述的转录、翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点等。
优选地，所述重组工程菌含有以下任一种修饰：
(1)H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白失活；
(2)不表达H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白；
(3)不表达H16_A3043蛋白，且表达所述H16_A3043蛋白的突变体。
应当理解的是，本发明在具体实施方式中分别采用以上手段作示例性说明，在本领域技术人员已知本发明降低H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白的表达和/或活性的目的的基础上，采用其他同样能够实现上述目的的技术手段，均属于本发明技术手段的等同变形，故均在本发明的保护范围之中。
上述重组工程菌的PHA生产性能显著提升，具体表现为PHA的产量和底物转化率的显著提高。
优选地，上述重组工程菌为产PHA的重组工程菌。与出发菌株相比，所述重组工程菌的PHA产量和/或底物转化率提高。
进一步地，本发明发现，在降低H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白的表达和/或活性的基础上，增强卡尔文循环相关基因cbbL和cbbS编码蛋白的表达和/或活性，能够进一步提高PHA的产量和底物转化率，上述组合改造对于PHA产量和底物转化率的提升效果明显优于各靶点单独改造；同时，重组工程菌能够利用不同碳源(例如：植物油、餐厨废油等)为底物高效合成PHA。
具体地，以上所述的重组工程菌还可含有以下修饰：增强卡尔文循环相关基因编码蛋白的表达和/或活性；
所述卡尔文循环相关基因包括cbbL，优选为增强cbbL和cbbS基因编码蛋白的表达和/或活性。
本发明中，增强cbbL和cbbS基因编码蛋白的表达和/或活性可通过以下(1)-(4)中的任意一种或多种方式实现：
(1)修饰所述基因的调控蛋白；
(2)修饰所述基因的转录调控元件和/或翻译调控元件；
(3)修饰所述基因的序列；
(4)增加所述基因的拷贝数。
上述(1)中，所述调控蛋白包括cbbR编码蛋白。修饰所述基因的调控蛋白为通过突变cbbR使得cbbR编码蛋白对基因的调控方式改变，进而提高基因的表达。
在本发明的一些实施方式中，通过失活cbbR提高所述基因的表达。
上述(2)中，所述转录调控元件包括启动子、终止子、增强子等。所述翻译调控元件包括核糖体结合位点等。所述修饰转录调控元件和/或翻译调控元件为改变负责所述基因转录、翻译的调控元件的序列，例如：在cbbL基因编码区上游插入其它转录调控元件、翻译调控元件，或者在原始转录调控元件、翻译调控元件的基础上进行突变(如突变启动子中cbbR的结合区域序列使得启动子不再受cbbR的调控)，或者将原始转录调控元件、翻译调控元件替换为其它转录调控元件、翻译调控元件等。
在本发明的一些实施方式中，将cbbL前的野生型启动子替换为组成型启动子以提高cbbL和cbbS基因的表达量。
在本发明的一些实施方式中，将cbbL前的野生型启动子替换为组成型启动子，同时失活染色体原始cbbR基因。
所述组成型启动子优选为p52启动子(SEQ ID NO.5)、p53启动子(p53启动子为专利CN108977890B的SEQ ID NO:53)或p68启动子(p68启动子为专利CN 108977890B的SEQ IDNO:68)。
在本发明的一些实施方式中，所述启动子为p52启动子(SEQ ID NO.5)。
上述(3)中，可通过改变所述基因的序列提高其表达，或者通过改变基因的序列提高其编码蛋白的活性。
上述(4)中，增加基因的拷贝数可通过在染色体和/或内源质粒上增加所述基因的拷贝数实现，或者通过导入含有所述基因的外源质粒实现。
应当理解的是，本发明在具体实施方式中分别采用以上手段作示例性说明，在本领域技术人员已知本发明提高cbbL基因表达和/或活性的目的的基础上，采用其他同样能够实现上述目的的技术手段，均属于本发明技术手段的等同变形，故均在本发明的保护范围之中。
第八方面，本发明提供以上所述的重组工程菌在PHA发酵生产中的应用。
优选地，所述应用包括：培养所述重组工程菌，收集包含PHA的培养物的步骤。
在本发明的一些实施方式中，所述培养为以植物油(包括但不限于棕榈油、棕榈仁油、花生油、大豆油、亚麻油、菜籽油、棉籽油、蓖麻油、玉米油中的一种或多种的混合物)为碳源进行。
在本发明的另一些实施方式中，所述培养为以餐厨废油为碳源进行。
上述培养使用的培养基中还可包含氮源(包括但不限于铵盐等)、无机盐(包括但不限于磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等)、微量元素(包括但不限于镁、钙、锌、锰、钴、硼、铜、镍、钼等)。
第九方面，本发明提供一种PHA的生产方法，所述方法包括：培养以上所述的重组工程菌，收集包含PHA的培养物。
第十方面，本发明提供一种提高罗氏真养菌的PHA产量和/或底物转化率的方法，所述方法包括：对罗氏真养菌进行修饰以使得H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低。
优选地，所述方法还包括：对罗氏真养菌进行修饰以使得cbbL基因编码蛋白的表达和/或活性增强。
本发明的有益效果至少包括：本发明发现H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低能够显著提升菌株的PHA生产性能，由此构建的重组工程菌在PHA产量、底物转化率、生长速率等方面均有显著提高，有效降低了PHA工业生产的成本，提升了PHA在传统塑料和生物基可降解塑料市场中的竞争力与其商业化应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中基因敲除重组工程菌以棕榈油为碳源发酵合成PHA的质量转化率对比，其中，横坐标为罗氏真养菌的对照菌株H16和经过基因敲除改造的测试菌XX01、XX02、XX03，纵坐标为质量转化率，t-test统计学检验：p<0.05，以*表示；p<0.01，以**表示；p<0.001，以***表示。
图2为实施例1中基因敲除重组工程菌相比对照菌株H16发酵合成PHA产量的提升幅度对比，其中，横坐标为经过基因敲除改造的罗氏真氧菌测试菌株XX01、XX03、XX02，纵坐标为PHA产量提升的相对比例；t-test统计学检验：p<0.05，以*表示；p<0.01，以**表示；p<0.001，以***表示。
图3为实施例2中单碱基突变重组工程菌相比对照菌株H16发酵合成PHA产量的提升幅度对比，其中，横坐标为经过单碱基突变改造的罗氏真氧菌测试菌XX04、XX05，纵坐标为PHA产量提升的相对比例；t-test统计学检验：p<0.05，以*表示；p<0.01，以**表示；p<0.001，以***表示。
图4为实施例4中H16_A3043基因敲除叠加cbbL改造的重组工程菌XX06与对照菌株H16的生长曲线对比；以餐厨废油为碳源，进行为期24h的孔板生长，每2h测量一次菌液在吸光度600nm时的OD值，得到图4的生长曲线，圆形数据点曲线代表对照菌株H16，方形数据点曲线代表重组菌株XX06；t-test统计学检验：p<0.05，以*表示；p<0.01，以**表示；p<0.001，以***表示，p<0.0001，以****表示。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，所用酶试剂购自New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。
以下实施例中使用的培养基配方如下：
种子培养基I：10g/L peptone，5g/L Yeast Extract，3g/L Fructose。
种子培养基II：0.15％棕榈油，10g/L peptone，5g/L Yeast Extract。
生产培养基：1.0％棕榈油，9.85g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4，3.0g/LNH4Cl，10mL/L微量元素溶液I和1mL/L微量元素溶液II。其中微量元素溶液I的组成为：20g/L MgSO4，2g/L CaCl2。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO4·7H2O，30mg/L MnCl2·4H2O，300mg/L H3BO3，200mg/L CoCl2·6H2O，10mg/L CuSO4·5H2O，20mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L NaMoO4·2H2O。上述试剂均购自国药集团化学试剂公司。
以下实施例中所述的PHA产量的计算公式如下：
PHA产量＝CDW×PHA％；其中，CDW为细胞干重，PHA％为PHA占细胞干重的百分比。
以下实施例中所述的PHA产量提升百分比的计算公式如下：
PHA产量提升百分比＝(测试菌株的PHA产量-对照菌株的PHA产量)/对照菌株的PHA产量×100％。
以下实施例中所述的底物到PHA质量转化率的计算公式如下：
质量转化率＝发酵产生的PHA总量(g)/发酵消耗的棕榈油(g)×100％。
实施例1：H16_A3043、H16_A3044基因敲除的重组工程菌构建及性能测试
本实施例以罗氏真养菌H16(简称H16)菌株为出发菌株，利用本领域常用基因编辑方法将基因组上的H16_A3043和H16_A3044基因敲除，得到的双基因敲除重组工程菌命名为罗氏真养菌XX01；将基因组上的H16-A3043基因敲除，得到的单基因敲除重组工程菌命名为罗氏真养菌XX02；将基因组上的H16-A3044基因敲除，得到的单基因敲除重组工程菌命名为罗氏真养菌XX03。进一步对各重组工程菌进行菌株性能测试。具体方法和结果如下：
步骤1：构建H16_A3043和H16_A3044双基因敲除的重组工程菌XX01
1.1以罗氏真养菌H16基因组为模板进行PCR扩增，获得A3043+A3044上游同源臂A3043+A3044-H1，A3043+A3044下游同源臂A3043+A3044-H2；以修饰后的质粒pK18mob(Orita I,Iwazawa R,Nakamura S,et al.Identification of mutation points inCupriavidus necator NCIMB 11599 and genetic reconstitution of glucose-utilization ability in wild strain H16 for polyhydroxyalkanoate production[J].Journal of Bioscience&Bioengineering,2012,113(1):63-69)为模板，通过PCR扩增得到载体片段。将A3043+A3044-H1、A3043+A3044-H2通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到编辑质粒pKO-ΔA3043+A3044，编辑质粒的亚克隆构建由药明生物有限公司完成。其中同源臂A3043+A3044-H1和A3043+A3044-H2的序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
1.2将重组质粒pKO-ΔA3043+A3044转化至大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌H16中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有250μg/mL卡那霉素与100μg/mL安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中携带同源片段的重组质粒整合到基因组的A3043-H1和A3043-H2所在的特定位置，由此得到第一次同源重组菌株。将第一次同源重组菌株在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并进行PCR鉴定，测序确认重组菌株正确编辑，得到H16_A3043和H16_A3044双基因敲除的罗氏真养菌ReΔA3043+A3044，本发明中命名为XX01。
步骤2：构建H16_A3043基因敲除的重组工程菌XX02
按照上述步骤1中1.1的同源重组方法设计A3043-H1和A3043-H2同源臂，以修饰后的质粒pK18mob为模板，通过PCR扩增得到载体片段。再利用Gibson Assembly方法，将同源臂与载体片段连接，得到编辑质粒pKO-ΔA3043，编辑质粒的亚克隆构建由药明生物有限公司完成。其中同源臂A3043-H1和A3043-H2的序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。按照上述步骤1中1.2的接合转化方法获得正确编辑的重组菌株，得到H16_A3043基因敲除的罗氏真养菌ReΔA3043，本发明中命名为XX02。
步骤3：构建H16_A3044基因敲除的重组工程菌XX03
按照上述步骤1中1.1的同源重组方法设计A3044-H1和A3044-H2同源臂，以修饰后的质粒pK18mob为模板，通过PCR扩增得到载体片段。再利用Gibson Assembly方法，将同源臂与载体片段连接，得到编辑质粒pKO-ΔA3044，编辑质粒的亚克隆构建由药明生物有限公司完成。其中同源臂A3044-H1和A3044-H2的序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。按照上述步骤1中1.2的接合转移方法获得正确编辑的重组菌株，得到H16_A3044基因敲除的罗氏真养菌ReΔA3044，本发明中命名为XX03。
步骤4：重组工程菌发酵生产PHA的性能测试
本实施例以罗氏真养菌H16为对照菌株，对重组工程菌XX01、XX02、XX03的发酵性能进行测试。
4.1将甘油管保存的实施例1构建的各菌株(1000μL)分别接种于种子培养基I中(20mL)，进行12小时的种子一级培养；然后，将1v/v％的种子培养液I接种于种子培养基II中(100mL)，进行二级种子培养，培养13h；然后将10v/v％的种子培养液II接种于装有250mL生产培养基的500mL小型发酵罐(迪必尔公司)中。运行条件为培养温度30℃、搅拌速度800rpm、通气量1L/min，将pH控制为6.7～6.8之间。pH控制中使用了28％的氨水溶液。在培养过程中，持续的使用棕榈油作为碳源，培养时间为54小时。
4.2取上述发酵液进行离心得到菌体。将菌体烘干至恒重。测定干燥菌体的重量记为干重。向所得的干燥菌体中加入25mL氯仿，于室温搅拌一昼夜，抽提菌体内的聚酯。滤去菌体残渣后，用蒸发器浓缩至总容积为约7.5mL，然后缓慢加入约22.5mL的己烷，在缓慢搅拌下放置1小时。将析出的聚酯滤出后，于5CTC真空干燥3小时。测定干燥聚酯的质量，计算菌体内的聚酯含量。
4.3结果如图1和图2所示，出发菌株H16的质量转化率为82.69％；XX01的质量转化率为89.66％；XX02的质量转化率为92.66％；XX03的质量转化率为90.84％。相比出发菌株H16，XX01的PHA产量提升19.53％；XX02的PHA产量提升28％；XX03的PHA产量提升21.67％，可见XX02的PHA产量提升比例显著高于XX03和XX01。
实施例2：H16_A3043单碱基突变重组工程菌的构建及性能测试
本实施例以罗氏真养菌H16(简称H16)为出发菌株，利用本领域常见的基因编辑方法将基因组上H16_A3043基因编码区第170位碱基由T突变为C，使得该位点编码的亮氨酸突变为脯氨酸(即第57位亮氨酸突变为脯氨酸)，得到的单碱基突变重组工程菌为罗氏真养菌XX04；将基因组上H16-A3043基因编码区第518位碱基由T突变为C，使得该位点编码的亮氨酸变为脯氨酸(即第173位亮氨酸突变为脯氨酸)，得到的单碱基突变重组工程菌为罗氏真养菌XX05；并对重组工程菌进行菌株性能测试。
步骤1：构建H16_A3043-L57P单碱基突变的重组工程菌XX04
按照实施例1中步骤1的同源重组方法设计A3043-L57P同源臂；以修饰后的质粒pK18mob为模板，通过PCR扩增得到载体片段。再利用Gibson Assembly方法，将同源臂与载体片段连接，得到编辑质粒pKO-ΔA3043-L57P，编辑质粒的亚克隆构建由药明生物有限公司完成。其中同源臂A3043-L57P的序列如SEQ ID NO.12所示。按照实施例1中步骤1的接合转移方法获得正确编辑的重组菌株，得到的重组工程菌为罗氏真养菌Re_A3043-L57P，本发明中命名为XX04。
步骤2：构建H16_A3043-L173P单碱基突变的重组工程菌XX05
按照实施例1中步骤1的同源重组方法设计A3043-L173P同源臂；以修饰后的质粒pK18mob为模板，通过PCR扩增得到载体片段。再利用Gibson Assembly方法，将同源臂与载体片段连接，得到编辑质粒pKO-ΔA3043-L173P，点突变质粒的亚克隆构建由药明生物有限公司完成。其中同源臂A3043-L173P的序列如SEQ ID NO.13所示。按照实施例1中步骤1的接合转化方法获得正确编辑的重组菌株，得到的重组工程菌为罗氏真养菌Re_A3043-L173P，本发明中命名为XX05。
步骤3：重组工程菌发酵生产PHA的性能测试
本实施例以罗氏真养菌H16为对照菌株，对重组工程菌XX04、XX05的发酵性能进行测试。具体操作步骤同上述实施例1中步骤4.1和4.2。结果如图3所示，相比出发菌株H16，XX04的PHA产量提升28％；XX05的PHA产量提升17％，可见菌株XX04的PHA产量提升比例显著高于菌株XX05。
实施例3：H16_A3043基因敲除叠加cbbL和cbbS改造的重组工程菌构建与性能测试
本实施例以罗氏真养菌XX02为出发菌株，利用本领域常见的基因编辑方法沉默cbbR基因，并将cbbL前的野生型启动子替换为中强度组成型启动子(启动子来源于专利CN108977890B的SEQ ID NO:52，以下称为p52)；该组成型启动子p52的序列如SEQ ID NO.5所示。得到的H16_A3043基因敲除叠加cbbL和cbbS改造的重组工程菌为罗氏真养菌XX06，并对重组工程菌进行菌株性能测试。
步骤1：构建H16_A3043基因敲除叠加cbbL和cbbS改造的重组工程菌XX06
按照实施例1中步骤1的同源重组方法设计p52-cbbL-H1和p52-cbbL-H2同源臂；以修饰后的质粒pK18mob为模板，通过PCR扩增得到载体片段。再利用Gibson Assembly方法，将同源臂与载体片段连接，得到编辑质粒pKO-p52-cbbL，编辑质粒的亚克隆构建由药明生物有限公司完成。其中同源臂p52-cbbL-H1和p52-cbbL-H2的序列如SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15所示。按照实施例1中步骤1的接合转移方法获得正确编辑的重组菌株，得到的重组工程菌为罗氏真养菌ReΔA3043_ΔcbbR-p52-cbbL，本发明中命名为XX06，该重组工程菌沉默了基因H16_A3043与cbbR，并将cbbL的启动子替换为中强度组成型启动子p52。
步骤2：H16_A3043基因敲除叠加cbbL和cbbS改造的重组工程菌发酵生产PHA的性能测试
本实施例以专利CN202310277052.2中构建的Re 03菌株(以H16为出发菌株，沉默cbbR基因，并将cbbL前的野生型启动子替换为中强度组成型启动子p52)为对照，对重组菌株XX01、XX06的发酵性能进行测试。
2.1将甘油管保存的实施例1构建的各菌株(1000μL)分别接种于种子培养基I中(100mL)，进行12小时的种子一级培养；然后，将10v/v％的种子培养液I接种于种子培养基II(50L)中，进行二级种子培养，培养13h；然后将15v/v％的种子培养液II接种于装有50L生产培养基的75L中型发酵罐中，运行条件为培养温度30℃、搅拌速度500rpm、通气量50L/min，将pH控制为6.7～6.8之间。pH控制中使用了28％的氨水溶液。在培养过程中，持续的使用棕榈油作为碳源，培养时间为48小时。
2.2按照实施例1中步骤4.2的方法检测菌体内的PHA聚酯含量，计算底物到PHA质量转化率，结果如表1所示，测试菌株XX06的质量转化率98.0％，远高于对照菌株Re 03的质量转化率(86.7％)，略高于对照菌XX01的质量转化率(95.9％)。
表1
菌株 质量转化率(％)
Re 03 86.7±1.0
XX01 95.9±1.0
XX06 98.0±0.9
实施例4：不同碳源为底物的重组工程菌性能测试
本实施例以罗氏真养菌H16为对照菌株，实施例3所构建的重组菌株XX06为实验菌株，测试在不同生物质底物(餐厨废油)条件下，本发明重组工程菌的生长曲线与发酵性能。餐厨废油由山高环能集团股份有限公司提供，从城市餐厨废弃的泔水中经过三相分离获得，其中餐厨废油的质控检测数据为水分：0.9％(检测标准:GB 5009.236-2016)，杂质：0.1％(检测标准：GB 5009.236-2016)，酸价：10.7(mgKOH/g，检测标准：ISO 660:2009)，总硫：56mg/kg(检测标准：ASTM D 5453-19a)，总氯：29mg/kg(检测标准UOP 779-2008)，碘值：101glz/100g(检测标准：GB/T5532)，皂化值：195mgKOH/g(检测标准：GB/T5534)，不皂化物：0.81％(检测标准：GB/T5535.1)。
步骤1：以餐厨废油为唯一碳源进行XX06菌株生长曲线测试
将甘油管保存的H16菌株以及实施例3的重组工程菌XX06进行LB平板划线，获取单克隆后，使用24深孔板进行后续的种子培养与发酵培养。将单克隆接种于种子培养基I中(2mL)，进行15小时的种子一级培养；然后将10v/v％的种子培养液I接种于种子培养基II中(2mL)，进行二级种子培养，培养5h；然后将15v/v％的种子培养液II接种于装有3mL生产培养基的24深孔板中微量发酵，发酵培养箱温度30℃，450rpm转速连续培养24h，期间每隔2h进行取样测试600nm的吸光度值，计算得知该时间该菌株的生长OD。本发明中的生长曲线测试共计12个取样时间点，得到12个菌株生长OD，结果如图4所示，以餐厨废油为碳源进行微量发酵，XX06菌株的生长速率显著高于H16，可见，XX06相较H16具有显著的生长优势。
步骤2：以餐厨废油为唯一碳源进行XX06菌株发酵生产PHA的性能测试
本实施例以罗氏真养菌H16为对照菌株，以餐厨废油为唯一碳源，对重组工程菌XX06的发酵性能进行测试。具体操作步骤同上述实施例1的步骤4.1和4.2，发酵使用的生产培养基中1.0％的棕榈油替换为1.0％餐厨废油。结果如表2所示，经全流程发酵后，对照菌株H16的PHA％为49.86％，PHA产量为36.04g/L；重组菌株XX06的PHA％为71.60％，PHA产量为101.76g/L。相比出发菌株H16，XX06菌株的PHA％提升43.6％，PHA产量提升182.4％。
表2
菌株 PHA(％) PHA产量(g/L)
H16 49.86±0.1 36.04±0.8
XX06 71.60±0.5 101.76±8.6
上述结果表明，本发明构建的重组工程菌XX06相比出发菌株H16表现的生长速率更快、PHA产量更高、生物质底物转化率更高。这一结果说明本发明的发明构思不受限于碳源的具体选择，使用常见的生物质碳源均可实现PHA的更高产量和底物转化率。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.H16_A3043蛋白或其同源蛋白和/或H16_A3044蛋白或其同源蛋白的表达和/或活性降低在提高PHA生产菌的PHA生产性能中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述PHA生产菌为罗尔斯通氏菌属细菌；
优选地，所述PHA生产菌为罗氏真养菌。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述PHA生产性能包括PHA产量和/或底物转化率。
4.H16_A3043蛋白的突变体，其特征在于，所述突变体与H16_A3043蛋白相比，含有第57位氨基酸突变为脯氨酸和/或第173位氨基酸突变为脯氨酸的突变。
5.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求4所述的突变体。
6.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求5所述的核酸分子或表达权利要求4所述的突变体。
7.重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌被修饰以使得其中H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白的表达和/或活性降低。
8.根据权利要求7所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌含有以下任一种修饰：
(1)H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白失活；
(2)不表达H16_A3043蛋白和/或H16_A3044蛋白；
(3)不表达H16_A3043蛋白，且表达权利要求4所述的突变体；
优选地，所述重组工程菌还含有以下修饰：增强卡尔文循环相关基因编码蛋白的表达和/或活性；
所述卡尔文循环相关基因包括cbbL。
9.权利要求7或8所述的重组工程菌在PHA发酵生产中的应用。
10.一种提高PHA生产菌的PHA产量和/或转化率的方法，其特征在于，将所述PHA生产菌内源的H16_A3043蛋白及其同源蛋白和/或H16_A3044蛋白及其同源蛋白的表达和/或活性降低。
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