CN117904020A - 大肠杆菌乙酰化突变菌株的构建及其生产3-羟基丙酸的应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌乙酰化突变菌株，是通过以合适的质粒为载体，构建含有外源dtsR1、accBC、以及mcr基因的生产质粒，然后转入大肠杆菌生产菌株而得到；并且还使用不同的启动子来替换生产质粒上原有的启动子，以调控所述三个基因mcr、dtsR1和accBC的转录水平。还公开了所述突变菌株的应用。本发明通过在已构建的外源表达3‑羟基丙酸途径的基础上，从去乙酰化方向入手，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株在以乙酸或其盐为碳源的培养基中生产3‑羟基丙酸，其中最优菌株的产量为3.15g/L，产率可达0.46g/g，乙酸或其盐的利用速率为0.214g/L/h，为通过大肠杆菌基因工程菌使用乙酸或其盐作为碳源合成3‑羟基丙酸开辟了一条新的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种大肠杆菌乙酰化突变菌株的构建及其生产3-羟基丙酸的应用。
背景技术
3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)是美国能源部提出的12种重要的平台化合物之一，可转化为各种商业用途的化学品，如丙烯酸、丙二酸、1,3-丙二醇和丙烯酰胺等，此外，3-HP还可以生成丙内酯、聚酯和低聚物等，如：聚3-羟基丙酸酯，这是一种非自然聚合物，具有生物降解性和生物相容性。此外，有研究初步证明其自身作为一种弱有机酸，可以改变土壤中重金属的状态，从而起到修复土壤的作用(田超，2022，3-羟基丙酸发酵条件的优化及发酵液在土壤修复中的应用，硕士)；3-HP还可作为一种抗线虫剂，用于植物保护等。
传统上，微生物可以利用葡萄糖、甘油等优质底物生产3-HP。近年来，使用廉价易得的可再生资源作为碳源合成高附加值化合物成为研究热点，故也有研究者使用乙酸作为碳源通过基因工程大肠杆菌合成3-HP(Lai等,2021,One stone two birds:Biosynthesisof 3-hydroxypropionic acid from CO2and syngas-derived acetic acid inEscherichia coli,Synthetic and Systems Biotechnology,6:144-52)。在该研究中通过引入来自Corynebacterium glutamicum的乙酰辅酶A羧化酶(Acc)和来自Chloroflexusaurantiacus的经密码子优化的丙二酰辅酶A还原酶(MCR)。使用包括促进乙醛酸途径、抑制脂肪酸合成、动态调节TCA循环、增强乙酸同化等代谢工程策略，通过全细胞生物催化，积累了15.8g/L 3-HP，产率为0.71g/g。Lee等通过引入来自Chloroflexus aurantiacus的mcr，过表达acs，敲除iclR，以激活乙酸同化和乙醛酸分流途径，最后抑制脂肪酸生成途径，发酵得到3.00g/L 3-HP，产率为0.30g/g(Lee等,2018,Efficient Conversion of Acetate to3-Hydroxypropionic Acid by Engineered Escherichia coli,Catalysts,8:525)。
乙酸是温室气体二氧化碳生物转化、木质纤维素生物质预处理和微生物发酵过程中的主要副产品。利用乙酸并将其转化为高附加值产品，有助于碳足迹的减少，助力碳循环经济的发展。一方面生物基工业需要寻找能够替代粮食基资源，且更加利于可持续发展的底物，另一方面，随着合成生物学的发展，可以通过基因工程提高微生物对乙酸的利用，为以乙酸为底物的生物基产品开发奠定了基础(Noh.等,2018,Production of itaconicacid from acetate by engineering acid-tolerant Escherichia coli W,Biotechnology and Bioengineering,115:729-38；Li,Y.J.等,2016,Production ofSuccinate from Acetate by Metabolically Engineered Escherichia coli,AcsSynthetic Biology,5:1299-307；Lai等2021,One stone two birds:Biosynthesis of 3-hydroxypropionic acid from CO2and syngas-derived acetic acid in Escherichiacoli,Synthetic and Systems Biotechnology,6:144-52)。
蛋白质的翻译后修饰(Post Translational Modification，PTM)通常由酶活性介导，Nε赖氨酸的乙酰化修饰是蛋白质翻译后修饰的一种重要形式，其广泛存在于细菌体内，是乙酰基供体(如乙酰辅酶A)通过酶学或非酶学的方式将乙酰基团共价结合到赖氨酸残基上的过程。酶促机制由两组蛋白控制，赖氨酸乙酰蛋白转移酶(lysineacetyltransferases,KATs)和赖氨酸脱乙酰化酶(lysine deacetylases,KDACs)。KATs利用活性位点中的谷氨酸使目标赖氨酸底物去质子化产生中性氨基，并攻击供体乙酰辅酶A的羰基，导致赖氨酸的乙酰化和游离酰基的释放。而非酶促机制则是利用乙酰磷酸(AcP)或乙酰辅酶A(Ac-CoA)为供体，将乙酰基转移至去质子化的Nε赖氨酸位点。在大肠杆菌K12中，乙酸盐代谢受一对可逆的赖氨酸乙酰蛋白转移酶PatZ(又称YfiQ)和NAD+依赖性脱乙酰酶CobB的调节(等,2011,cAMP-CRP co-ordinates the expression of theprotein acetylation pathway with central metabolismin Escherichia coli,Molecular Microbiology,82:1110-28)。在乙酰辅酶A合成酶(ACS)侧链K609位点，PatZ和CobB对其进行可逆调节，影响其翻译水平。简而言之，由Patz编码的乙酰蛋白转移酶可以阻碍ACS的催化活性，但这可以通过蛋白质的脱乙酰化来缓解(/>等,2011,cAMP-CRP co-ordinates the expression of the protein acetylation pathway withcentral metabolismin Escherichia coli',Molecular Microbiology,82:1110-28)。此外，在之前的研究中认为大肠杆菌中只存在唯一的乙酰转移酶PatZ，而现已鉴定出了其他几种新的乙酰转移酶YiaC、YjaB和PhnO。除了关键乙酰化修饰目标物ACS外，糖酵解、乙醛酸循环上多个位点也会受到乙酰化的修饰，影响着中枢代谢；此外乙酰化修饰还与其他多种生理代谢相关，对细胞代谢呈现复杂且精细的全局性调控(Christensen,D.G.等,2018,Identification of Novel Protein Lysine Acetyltransferases in Escherichiacoli,Mbio,9)。
发明内容
有鉴于现有技术中对于使用乙酸作为碳源通过基因工程大肠杆菌合成3-羟基丙酸的需求，本发明致力于对现有大肠杆菌菌株进行改造，以使其能够以乙酸或其盐作为碳源发酵生产3-羟基丙酸。
为实现上述目的，本发明的第一个方面，提供了一种大肠杆菌乙酰化突变菌株，所述突变菌株是通过以合适的质粒为载体，构建含有来源于Corynebacterium glutamicum的基因dtsR1和accBC、以及来源于Chloroflexus aurantiacus的基因mcr的生产质粒，然后转入大肠杆菌生产菌株而得到；并且还使用不同的启动子来替换生产质粒上原有的启动子，以调控下游的所述三个基因mcr、dtsR1和accBC的转录水平，其中：
所述启动子为J23113或yhfGp，所述启动子J23113的序列如SEQ ID No.4所示，所述启动子yhfGp的序列如SEQ ID No.6所示。
进一步优选的，所述启动子为yhfGp。
根据本发明，所述基因dtsR1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述基因accBC的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述基因mcr的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
根据一个优选实施例，所述突变株还敲除了以下乙酰蛋白转移酶基因patz、yiac、yjaB、phno中的一个或两个。
进一步优选的，所述突变株敲除的乙酰蛋白转移酶基因为单独的patz，或者是patz与yiac、yjaB、phno中任一个的组合。
根据另一个优选实施例，所述突变株还过表达了去乙酰化基因cobB。
进一步的，所述过表达去乙酰化基因cobB是在cobB基因前端插入一段启动子PJ23119，该启动子PJ23119的序列如SEQ ID No.12所示。
本发明的第二个方面，提供了上述的大肠杆菌乙酰化突变菌株用于以乙酸或其盐为碳源发酵生产3-羟基丙酸的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过在已构建的外源表达3-羟基丙酸途径的基础上，对代谢调控分析，从去乙酰化方向入手，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株在以乙酸或其盐为碳源的培养基中生产3-羟基丙酸，其中最优菌株的产量为3.15g/L，产率可达0.46g/g，为最大理论值(0.75g/g)的61.3％，乙酸或其盐的利用速率为0.214g/L/h，为通过大肠杆菌基因工程菌使用乙酸或其盐作为碳源合成3-羟基丙酸开辟了一条新的途径。
附图说明
图1为大肠杆菌利用乙酸或其盐生产3-HP的代谢通路，以及可逆乙酰化/去乙酰化调控示意图。
图中：Acetate为乙酸盐；AcP为乙酰磷酸；ACS为乙酰-CoA合成酶；AckA为乙酸激酶；Pta为磷酸转乙酰酶；AcCoA为乙酰-CoA；Malonyl-CoA为丙二酰-CoA；acc为乙酰-CoA羧化酶；mcr为丙二酰-CoA还原酶；CobB为NAD+依赖性脱乙酰化酶；PatZ、PhnO、YjaB和YiaC为乙酰蛋白转移酶；3-HP为3-羟基丙酸；OAADPr为2′-O-乙酰基-ADP-核糖。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中所使用的生物材料来源说明：
质粒ptrc99a、pRedCas9、pGRB：商业化质粒。
质粒pET28a-M*DA：按照文献(Lai等2021.One stone two birds:Biosynthesisof 3-hydroxypropionic acid from CO2and syngas-derived acetic acid inEscherichia coli,Synthetic and Systems Biotechnology,6:144-52)报道的方法获得，该质粒上含有RBS-mcr-RBS-dtsR1-RBS-accBC片段，该片段上的基因(mcr、dtsR1、accBC)是过表达来源于Chloroflexus aurantiacus和Corynebacterium glutamicum的3-HP生产途径的关键酶；其中，来源于Corynebacterium glutamicum的基因dtsR1和accBC编码由乙酰-CoA生成3-羟基丙酸的酶的乙酰-CoA羧化酶，来源于Chloroflexus aurantiacus的基因mcr编码由乙酰-CoA生成3-羟基丙酸的酶的丙二酰-CoA还原酶。
大肠杆菌E.coli MG1655、E.coli DH5α：商业化菌株。
图1为大肠杆菌利用乙酸或其盐生产3-羟基丙酸(3-HP)的代谢通路，以及可逆乙酰化/去乙酰化调控示意图。根据图1所示的代谢通路，乙酰-CoA羧化酶和丙二酰-CoA还原酶是3-HP生产途径的关键酶，本发明以大肠杆菌E.coli MG1655为出发菌株，通过过表达来源于Corynebacterium glutamicum的基因dtsR1和accBC(编码由乙酰-CoA生成3-羟基丙酸的酶的乙酰-CoA羧化酶)，以及来源于Chloroflexus aurantiacus的基因mcr(编码由乙酰-CoA生成3-羟基丙酸的酶的丙二酰-CoA还原酶)，以初步获得3-HP的生产能力。与此同时，本发明还采用了不同的启动子，以期调控下游三个基因(mcr、dtsR1、accBC)的转录水平，从而进一步提高3-HP的产量。
结合图1的可逆乙酰化/去乙酰化调控示意图，在大肠杆菌中主要通过Acka-Pta途径和ACS途径来同化乙酸或其盐，乙酸或其盐的代谢也会受到乙酰蛋白转移酶PatZ和去乙酰化酶CobB的调节。其中，ACS的活性是通过底物结合口袋附近特定赖氨酸残基的乙酰化影响的，其中Ac-CoA供体分子提供的乙酰基团在赖氨酸乙酰蛋白转移酶的催化下转移至赖氨酸上。PatZ可使ACS的保守位点乙酰化从而使其失去催化活性，而CobB可使乙酰化的ACS去乙酰化而有催化活性。
因此，本发明还尝试了通过敲除乙酰蛋白转移酶PatZ的基因patz、同时过表达NAD+依赖性脱乙酰化酶的基因cobB，以期提高改造菌株对乙酸或其盐的同化能力。此外，我们还敲除了编码其他三种新鉴定出的乙酰蛋白转移酶YiaC、YjaB、PhnO的基因yiac、yiaB、phno，以验证是否可以达到类似的效果。
以下通过具体实施例详细描述。
实施例1、3-HP生产质粒的构建
本实施例以ptrc99a质粒为载体，克隆pET28a-M*DA质粒上的RBS-mcr-RBS-dtsR1-RBS-accBC片段，得到重组质粒ptrc99a-RBS-mcr-RBS-dtsR1-RBS-accBC(简称Ptrc-M*DA)。该RBS-mcr-RBS-dtsR1-RBS-accBC片段上的基因(mcr、dtsR1、accBC)是过表达来源于Chloroflexus aurantiacus和Corynebacterium glutamicum的3-羟基丙酸生产途径的关键酶；其中，来源于Corynebacterium glutamicu的基因dtsR1(SEQ ID No.1)和accBC(SEQIDNo.2)编码由乙酰-CoA生成3-羟基丙酸的酶的乙酰-CoA羧化酶，来源于Chloroflexusaurantiacus的基因mcr(SEQ ID No.3)编码由乙酰-CoA生成3-羟基丙酸的酶的丙二酰-CoA还原酶。
在此基础上使用不同强度的启动子替换替换Ptrc-M*DA上的trc启动子，调控下游三个基因的转录水平，得到7种重组质粒：PyhfGp-M*DA；PJ23113-M*DA；PJ23105-M*DA；PcsrA-M*DA；PYD-M*DA；Prpohp3-M*DA；以及PraiAz-M*DA。
此外，这些新的重组质粒上删除了ptrc99a载体上编码lac阻遏蛋白一段基因lacI，使该质粒可以在不添加IPTG诱导剂下完成组成型表达。
具体构建方法如下：
以pET28a-M*DA质粒为模板，以扩增引物(M*DA-F/M*DA-R)克隆生产基因片段RBS-mcr-RBS-dtsR1-RBS-accBC(M*DA)；
通过同源重组的方式将得到的片段RBS-mcr-RBS-dtsR1-RBS-accBC(M*DA)与含同源臂的ptrc99a的线性片段相连接，得到生产质粒Ptrc-M*DA。
通过委托南京金斯瑞生物公司进行序列合成，合成分别由启动子PJ23113(SEQ IDNo.4)和PJ23105(SEQ ID No.5)，以及来源于大肠杆菌自身的启动子PyhfGp(SEQ ID No.6)、PcsrA(SEQ ID No.7)、PYD(SEQ ID No.8)、Prpohp3(SEQ ID No.9)、和PraiAz(SEQ ID No.10)与含B0034RBS的eGFP绿色荧光蛋白(SEQ ID No.11)相串联的质粒，合成时将基因克隆在ptrc99a载体上，且去除编码lac阻遏蛋白一段基因lac I，使这些启动子可以完成组成型表达，得到质粒PJ23113-eGFP；PJ23105-eGFP；PyhfGp-eGFP；PcsrA-eGFP；PYD-eGFP；Prpohp3-eGFP；以及PraiAz-eGFP。
以PJ23113-M*DA质粒的构建为例，以质粒PJ23113-eGFP为模板，使用扩增引物(ptrc99a-F/J23113-R)克隆含PJ23113的ptrc99a载体，通过使用无缝克隆试剂采用无缝克隆的方式与含同源臂的M*DA生产线性片段相连接，使PJ23113调控下游三个基因(mcr、dtsR1、accBC)的转录水平，得到生产质粒PJ23113-M*DA。
其他6种质粒的构建方法一致，区别在于：PJ23105-M*DA的构建，是以质粒PJ23105-eGFP为模板，使用扩增引物(ptrc99a-F/J23105-R)克隆；PyhfGp-M*DA的构建，是以质粒PyhfGp-eGFP为模板，使用扩增引物(ptrc99a-F/yhfGp-R)克隆；PcsrA-M*DA的构建，是以质粒PcsrA-eGFP为模板，使用扩增引物(ptrc99a-F/csrA-R)克隆；Prpohp3-M*DA的构建，是以质粒Prpohp3-eGFP为模板，使用扩增引物(ptrc99a-F/rpohp3-R)克隆；PraiAz-M*DA的构建，是以质粒PraiAz-eGFP为模板，使用扩增引物(ptrc99a-F/raiAz-R)克隆。
通过上述方法得到生产质粒PJ23105-M*DA；PyhfGp-M*DA；PcsrA-M*DA；PYD-M*DA；Prpohp3-M*DA；以及PraiAz-M*DA。
以上质粒构建及启动子替换所使用的引物序列如以下表1所示。
表1：质粒构建及启动子替换的引物序列
实施例2、乙酰化基因缺失菌株的构建
本实施例利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在E.coli MG1655的基础上敲除乙酰蛋白转移酶基因patz、yiaC、yjaB和phnO中的一种或两种。
以patz的基因敲除为例：首先以pGRB质粒为模版，利用扩增引物(pazt sgRNA-F/R)克隆pazt sgRNA的线性片段，胶回收后将该线性片段通过钙转的方式转化进E.coli DH5α感受态中进行自环化，过夜培养后，挑单菌落送测序，进行序列比对，测序正确的菌落提取质粒，即为正确的pazt sgRNA。之后，以E.coli MG1655为模板，利用扩增引物(pazt up-F/R和pazt down-F/R)对donor上下游片段进行扩增，胶回收后，再利用overlap PCR的方式将含同源臂的上下游片段连接起来，观察条带大小正确胶回收后即得到donor片段。在制备完含pRedCas9质粒的MG1655电转感受态后，将pazt sgRNA和donor片段通过电转化的方式转化进入E.coli MG1655中，之后涂于氨苄霉素和奇霉素双抗平板过夜培养。利用验证引物(pazt yan-F/R)对双抗平板上的单菌进行菌落PCR，条带大小正确的即为敲除掉pazt基因的单菌。再将此单菌落利用消抗步骤消除pGRB质粒和pRedCas9质粒，即得到ZWR01：E.coliMG1655△patz工程菌。
其它基因(yiac、yjaB、phno)的敲除步骤同上，仅相应的扩增引物不同。由此得到重组菌株ZWR02：E.coli MG1655△phno工程菌，ZWR03：E.coli MG1655△yjaB工程菌，ZWR04：E.coli MG1655△yiac工程菌，ZWR05：E.coli MG1655△patz△phno工程菌，ZWR06：E.coli MG1655△patz△yjaB工程菌，ZWR07：E.coli MG1655△patz△yiac工程菌。
以上基因敲除所使用的引物序列如以下表2所示。
表2：基因敲除的引物列表
更为具体基因敲除操作如下：
大肠杆菌CRISPR-Cas9基因组编辑主要依赖于CRISPR-Cas9对基因组的特异性剪切以及Red重组系统对宿主的同源修复，该系统主要由pGRB质粒和pRedCas9质粒构成。运用CRISPR-Cas9基因组编辑技术可对大肠杆菌基因组进行单碱基突变、启动子替换、基因敲除以及基因组整合。具体流程为基因组编辑位点选择、sgRNA构建、DNA供体扩增、电转感受态制备、电转化、菌落PCR验证、质粒消除以及测序验证。
2.1、sgRNA构建
通过Benchling在线工具选择合适的sgRNA，选取目的基因上下500bp序列作为同源臂，根据基因编辑方式建立相应的电子克隆。
pGRB载体构建：以sgRNA载体为模板时，需要DpnI酶消除模板或将模板稀释后再使用，PCR扩增得到的sgRNA片段经纯化回收后可直接转化DH5α钙转化感受态细胞，测序正确后备用。
2.2、DNA供体的扩增
DNA供体的扩增需要获取基因组上下游同源臂片段，根据基因组编辑方式准备替换入基因组的片段。通过Overlap PCR将DNA片段进行融合，得到DNA供体。
2.3、大肠杆菌电转化感受态的制备
S1：将宿主菌株划线于LB平板，待菌落生长后挑取单菌落接种于4mL液体LB，培养8h左右。使用25％终浓度的甘油对宿主菌株保种后，取1mL菌液接种于50mL液体LB，培养菌体OD600至0.4～0.6后，4℃冰浴20min。
S2：将菌液转移至50mL离心管，4℃、5500rpm离心5min。
S3：去除上清液，菌体用20mL预冷的10％甘油重悬，5500rpm离心5min。
S4：重复上一步骤。
S5：去除上清液，加入400μL预冷的10％甘油重悬，按照100μL体积分装至1.5mL无菌离心管，-80℃保存。
2.4、大肠杆菌电转化
S1：取出电转化感受态细胞置于冰上化冻5min。
S2：加入200ng pRedCas9质粒至感受态细胞，轻柔混匀后，加至预冷的l mm电击杯。
S3：使用Biored电转仪的细菌电击模式对细胞进行电击，电击后迅速加入900μL液体LB，离心管置于30℃培养90min。
S4：取100μL菌液涂布于奇霉素抗性平板，培养12h左右，待菌落长出后培养并保种。
2.5、CRISPR电转化感受态的制备
S1：将携带pRedCas9的宿主细胞接种于4mL液体LB，于30℃培养8h。
S2：保种后取1mL菌液接种于含有100μg/μL奇霉素、0.2mM IPTG的50mL液体LB中，30℃培养菌体浓度至OD600为0.4～0.6，冰浴20min。
S3：将预冷的菌液转移至50mL离心管，4℃、5500rpm离心5min。
S4：去除上清液，菌体用20mL预冷的10％甘油重悬。
S5：重复上一步骤。
S6：去除上清液，加入400μL预冷的10％甘油重悬，按照100μL体积分装至1.5mL无菌离心管，-80℃冻存。
2.6、CRISPR感受态的电转化
S1：取出感受态细胞置于冰上化冻5min。
S2：往感受态细胞中加入100ng相应正确的sgRNA质粒，DNA供体按照每1000bp长度加入100ng的量添加，混匀后加至预冷的l mm电击杯。
S3：使用Biored电转仪在细菌电击模式下对细胞进行电击，电击后迅速加入900μLLB，离心管置于30℃摇床培养1～2h。
S4：取100μL菌液涂布于奇霉素、氨苄青霉素双抗性平板，培养12h左右。
2.7、CRISPR基因编辑阳性菌落验证与质粒消除
基因敲除、基因组整合可采取菌落PCR验证。基因组启动子替换验证，由于替换效率较高，直接挑选单菌落测序即可。
pGRB消除步骤：挑选阳性单菌落接种于含奇霉素和2g/L阿拉伯糖的4mL液体LB培养基中，30℃培养8h后吸取微量菌液转接至新鲜培养基；菌液划线于含奇霉素和2g/L阿拉伯糖的LB平板；待菌落长出后，划线于奇霉素和氨苄青霉素双抗性平板和奇霉素单抗板，单抗性平板生长而双抗性平板不生长，则为成功消除pGRB质粒。
Cas9质粒消除的原理为该质粒在高温下会停止复制。pRedCas9质粒消除步骤：挑选消除pGRB的单菌落接种于4mL液体LB中，42℃培养8h后转接于新鲜培养基；重复一次；菌液划线于无抗板，待菌落长出后，划线于无抗性平板和奇霉素单抗板，无抗性平板生长而单抗性平板不生长，则成功消除Cas9质粒。
实施例3、过表达去乙酰化基因cobB菌株的构建
在大肠杆菌内，CobB蛋白与乙酰蛋白转移酶PatZ为一对互补的调节蛋白，推断过表达cobB可加强细胞内的去乙酰化作用。
使用CRISPR-Cas9基因编辑技术完成基因整合的操作，以达到过表达cobB的目的。分别在大肠杆菌MG1655及改造菌ZWR01菌株上的cobB基因前端插入一段启动子PJ23119(SEQID No.12，该序列包含在cobB相应的扩增引物内，详细引物见表3)强组成型启动子序列，增强其转录，得到ZWR08、ZWR09菌株。基因编辑操作方法同实施例2。
以上过表达去乙酰化基因cobB所使用的引物序列如以下表3所示。
表3：过表达去乙酰化基因引物序列
实施例4、由不同强度启动子调控的3-HP生产质粒的摇瓶发酵
4.1、生产菌株的构建
以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌，首先制备钙转感受态细胞：取MG1655甘油菌5μL，接种于4mL液体LB培养基中37℃培养8～12h；将菌液取1mL转接到50mL液体LB培养基中，在37℃继续培养1.5～2小时，使其OD600达到0.4～0.6之间；将菌液冰上放置20min后转移至50mL离心管中，然后离心(4℃，5500rpm，5min)，去除上清；随后加入20mL预冷的0.1M的CaCl2重悬菌体，然后离心(4℃，5500rpm，5min)，去除上清；再次重复上一步骤；最后加入约1.5mL预冷的含10％甘油的0.1M的CaCl2重悬菌体，再分装至预冷的1.5mL离心管中，每管100μL，-80℃保存。
通过钙转转入含3-羟基丙酸生产途径的质粒，操作如下：取质粒2μL加入制备的MG1655 100μL钙转感受态中，冰上放置10min以上；42℃热激活90s，冰上放置4min以上；加入900μL液体LB培养基，37℃振荡培养1～1.5h；5500rpm离心5min，去除450μL上清，用剩余液体重悬菌体，再取100μL涂于含氨苄青霉素抗性的平板上；最后37℃培养8～12h。长出的菌落即为克隆有3-HP生产质粒的MG1655基因工程菌。
按照上述方法，分别得到过表达mcr、dtsR1、accBC三个基因的大肠杆菌基因工程菌MG1655(Ptrc-M*DA)，以及进一步替换了不同启动子的7种基因工程菌：MG1655(PyhfGp-M*DA)，MG1655(PJ23113-M*DA)，MG1655(PJ23105-M*DA)，MG1655(PcsrA-M*DA)，MG1655(PYD-M*DA)，MG1655(Prpohp3-M*DA)，以及MG1655(PraiAz-M*DA)。
以上基因工程菌构建完成后，保存于甘油中(25％v/v)备用。
4.2、摇瓶发酵
挑取平板上的单菌落，接种于含氨苄青霉素的4mL LB的试管中培养过夜，然后以2％的接种量转入摇瓶发酵培养基(M9培养基)，培养条件均为37℃、220rpm。
M9培养基中添加10g/L乙酸钠，1g/L NaHCO3，5g/L酵母提取物和40mg/L的生物素。培养过程中利用3M H2SO4维持pH值为7。上述培养基中必要时加入抗生素(氨苄青霉素终浓度为100mg/L)。
M9培养基组成(每升)：Na2HPO4·12H2O 15.12g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCl2 0.011g，NH4Cl 1g以及1％维生素B1 0.2mL。
3-羟基丙酸及乙酸的测定方法：摇瓶发酵培养期间，间隔8h取样，12000rpm离心10min分离菌体和上清。发酵液上清经0.22μm微孔膜过滤，采用岛津高效液相色谱仪监测发酵液上清中的3-羟基丙酸及乙酸有机酸。色谱柱为BioRadAminex HPX-87离子色谱柱(300mm*7.8mm)，配有紫外检测器和示差折光检测器。流动相为5mM的H2SO4，流速0.6mL/min，柱温65℃。
细胞浓度的测定采用分光光度计法测定600nm下的吸光值。
在大肠杆菌MG1655中由不同强度启动子调控的摇瓶发酵结果如表4所示。
表4：不同强度启动子调控下3-HP产量、产率及乙酸利用速率
由表4的结果可见，过表达mcr、dtsR1、accBC三个基因的工程菌经替换不同的启动子后，替换了启动子J23113和yhfGp的工程菌MG1655(PJ23113-M*DA)和MG1655(PyhfGp-M*DA)的3-HP产量相比未替换启动子的MG1655(Ptrc-M*DA)得到了明显提升，其余工程菌的3-HP产量则出现了不同程度的下降；其中MG1655(PyhfGp-M*DA)的产量最高，达到了2.54g/L，较MG1655(Ptrc-M*DA)产量提高了38％，而且发酵时间缩短，乙酸消耗速率提升，展示出该生产质粒的强大优势。
实施例5、乙酰化基因缺失菌株的摇瓶发酵
5.1、乙酰化基因缺失菌株的构建
分别以野生型大肠杆菌MG1655及其缺失菌ZWR01-07为出发菌，首先制备钙转感受态细胞，制备方法同实施例4。
通过钙转转入构建3-羟基丙酸生产途径的质粒PyhfGp-M*DA，操作同实施例4，分别得到乙酰化基因缺失的大肠杆菌基因工程菌MG1655(PyhfGp-M*DA)和ZWR01-07(PyhfGp-M*DA)。
以上基因工程菌构建完成后，保存于甘油中(25％v/v)备用。
5.2、摇瓶发酵
摇瓶发酵操作、M9培养基组成、3-羟基丙酸和乙酸的测定方法以及细胞浓度的测定方法同实施例4。
乙酰蛋白转移酶敲除菌的摇瓶发酵结果如表5所示。
表5：基因工程菌3-HP产量、产率及乙酸利用速率
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由表5的结果可见，过表达mcr、dtsR1、accBC三个基因且替换了启动子yhfGp的工程菌经进一步敲除乙酰化基因后，得到的工程菌ZWR01-07(PyhfGp-M*DA)均展现出较好的生产性能，较野生型相比，产量均有提升，其中最优菌ZWR01(PyhfGp-M*DA)产量达到3.15g/L，较野生型MG1655(PyhfGp-M*DA)产量提升24％，产率为0.46g/g，达到理论产量的61.3％。
实施例6、过表达去乙酰化基因cobB菌株的摇瓶发酵
6.1、过表达去乙酰化基因cobB菌株的构建
以实施例3得到的野生型E.coli MG1655的改造菌ZWR08、ZWR09为出发菌，首先制备感受态细胞，方法同实施例4；之后通过钙转转入构建3-羟基丙酸生产途径的质粒PyhfGp-M*DA，操作同实施例4，分别得到过表达去乙酰化基因cobB的工程菌ZWR08(PyhfGp-M*DA)和ZWR09(PyhfGp-M*DA)。
以上基因工程菌构建完成后，保存于甘油中(25％v/v)备用。
6.2、摇瓶发酵
摇瓶发酵操作、M9培养基组成、3-羟基丙酸和乙酸的测定方法以及细胞浓度的测定方法同实施例4。
摇瓶发酵结果如表6所示。
表6：基因工程菌3-HP产量、得率及乙酸利用速率
由表6的结果可知，过表达mcr、dtsR1、accBC三个基因且替换了启动子yhfGp的工程菌经进一步过表达去乙酰化基因cobB后，得到的工程菌ZWR08(PyhfGp-M*DA)和ZWR09(PyhfGp-M*DA)的3-HP产量较野生型都有提高，其中，工程菌ZWR09(PyhfGp-M*DA)的产量达到2.97g/L，较野生型MG1655(PyhfGp-M*DA)提升了16.9％，产率为0.423g/g。
以上实施例应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的范围。
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Claims (8)
1.一种大肠杆菌乙酰化突变菌株，其特征在于，所述突变菌株是通过以合适的质粒为载体，构建含有来源于Corynebacterium glutamicum的基因dtsR1和accBC、以及来源于Chloroflexus aurantiacus的基因mcr的生产质粒，然后转入大肠杆菌生产菌株而得到；并且还使用不同的启动子来替换生产质粒上原有的启动子，以调控下游的所述三个基因mcr、dtsR1和accBC的转录水平，其中：
所述启动子为J23113或yhfGp，所述启动子J23113的序列如SEQ ID No.4所示，所述启动子yhfGp的序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌乙酰化突变菌株，其特征在于，所述启动子为yhfGp。
3.根据权利要求1或2所述的大肠杆菌乙酰化突变菌株，其特征在于：
所述基因dtsR1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述基因accBC的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述基因mcr的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌乙酰化突变菌株，其特征在于，所述突变株还敲除了以下乙酰蛋白转移酶基因patz、yiac、yjaB、phno中的一个或两个。
5.根据权利要求4所述的大肠杆菌乙酰化突变菌株，其特征在于，所述突变株敲除的乙酰蛋白转移酶基因为单独的patz，或者是patz与yiac、yjaB、phno中任一个的组合。
6.根据权利要求4或5所述的大肠杆菌乙酰化突变菌株，其特征在于，所述突变株还过表达了去乙酰化基因cobB。
7.根据权利要求6所述的大肠杆菌乙酰化突变菌株，其特征在于，所述过表达去乙酰化基因cobB是在cobB基因前端插入一段启动子PJ23119，该启动子PJ23119的序列如SEQ ID No.12所示。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的大肠杆菌乙酰化突变菌株的应用，其特征在于，用于以乙酸或其盐为碳源发酵生产3-羟基丙酸。
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