ES2320820T3 - Bioconversion de una fuente de carbono fermentable en 1,3-propanodiol mediante un solo cicroorganismo. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONA UN PROCESO PARA LA BIOCONVERSION DE UN SUSTRATO CARBONADO A 1,3 -PROPANODIOL POR UN UNICO ORGANISMO UTILIZANDO MICROORGANISMOS QUE CONTIENEN LOS GENES QUE CODIFICAN UN ENZIMA GLICEROL O DIOL DESHIDRATASA ACTIVO, PONIENDO EN CONTACTO ESTOS ORGANISMOS CON UN SUSTRATO CARBONADO BAJO LAS CONDICIONES DE FERMENTACION ADECUADAS.

Description

Bioconversión de una fuente de carbono fermentable en 1,3-propanodiol mediante un solo microorganismo.

Campo de la invención

Esta invención comprende un procedimiento para la bioconversión de una fuente de carbono fermentable en 1,3-propanodiol mediante un solo microorganismo.

Antecedentes

1,3-propanodiol es un monómero que tiene utilidad potencial en la producción de fibras de poliéster y en la preparación de poliuretanos y compuestos cíclicos.

Se conocen varias vías químicas para el 1,3-propanodiol. Por ejemplo el óxido de etileno puede convertirse en 1,3-propanodiol sobre un catalizador en presencia de fosfina, agua, monóxido de carbono, hidrógeno y un ácido, por hidratación catalítica en fase de solución de acroleína seguida de reducción, o a partir de hidrocarburos tal como glicerol, se hace reaccionar en presencia de monóxido de carbono e hidrógeno sobre catalizadores con átomos del grupo VIII de la tabla periódica. Aunque es posible generar 1,3-propanodiol por estos métodos, son costosos y generan corrientes residuales que contienen contaminantes medioambientales.

Se ha conocido desde hace más de un siglo que el 1,3-propanodiol puede producirse en la fermentación del glicerol. Se han descubierto cepas bacterianas capaces de producir 1,3-propanodiol, por ejemplo, en los grupos Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Ilyobacter, Klebsiella, Lactobacillus, y Pelobacter. Los documentos WO 91/15590 y EP-A-0361082, por ejemplo, dan a conocer una selección de cepas de Klebsiella, Clostridium y Citrobacter que expresan enzimas que permiten la conversión del glicerol en 1,3-propanodiol. En cada caso estudiado, el glicerol se convierte en 1,3-propanodiol en una secuencia de reacción enzimática catalizada en dos etapas. En la primera etapa, una deshidratasa cataliza la conversión de glicerol en 3-hidroxipropionaldehído (3-HP) y agua, Ecuación 1. En la segundo etapa, 3-HP es reducido a 1,3-propanodiol por una oxidorreductasa unida a NAD^{+}, Ecuación 2. El 1,3-propanodiol no se metaboliza más y, como resultado,

(Ecuación 1)Glicerol \rightarrow 3-HP + H_{2} \hskip4,2cm

(Ecuación 2)3-HP + NADH + H^{+} \rightarrow 1.3-propanodiol + NAD^{+}

se acumula en alta concentración en el medio. La reacción completa consume un equivalente reductor en forma de un cofactor, dinucleótido reducido de \beta-nicotinamida adenina (NADH), que se oxida a dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD^{+}).

La producción de 1,3-propanodiol a partir de glicerol se realiza generalmente en condiciones anaerobias utilizando glicerol como única fuente de carbono y en ausencia de otros receptores exógenos reductores equivalentes. En estas condiciones, en p. ej., cepas de Citrobacter, Clostridium, y Klebsiella, una serie de reacciones paralela para glicerol opera que en primer lugar implica la oxidación de glicerol a dihidroxiacetona (DHA) por un glicerol deshidrogenasa unida a NAD^{+}- (o NADP^{+}-), Ecuación 3. La DHA, después de la fosforilación a fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) por una DHA cinasa (Ecuación 4),

(Ecuación 3)Glicerol + NAD^{+} \rightarrow DHA + NADH + H^{+} \hskip1,8cm

(Ecuación 4)DHA + ATP \rightarrow DHAP + ADP \hskip3,3cm

estará disponible para la biosíntesis y para soportar la generación de ATP vía p. ej., glucólisis. A diferencia de la serie de reacciones del 1,3-propanodiol, esta serie de reacciones puede proporcionar carbono y energía a la célula y produce antes que consume NADH.

En Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii, los genes que codifican el grupo funcional relacionado con las actividades de glicerol deshidratasa (dhaB), 1,3-propanodiol oxidorreductasa (dhaT), glicerol deshidrogenasa (dhaD), y dihidroxiacetona cinasa (dhaK) están incluidos en el regulón dha. Los regulones dha de Citrobacter y Klebsiella se han expresado en Escherichia coli y se ha demostrado que convierten el glicerol en 1,3-propanodiol.

Se conocen procedimientos biológicos para la preparación de glicerol. La mayoría de la sobreprotección de los productores de glicerol son levaduras pero las de algunas bacterias, aparte de hongos y algas son también conocidas. Tanto las bacterias como las levaduras producen glicerol convirtiendo la glucosa u otros carbohidratos a través de la serie de reacciones de fructosa-1,6-bisfosfato en la glucólisis o la serie de reacciones de Embden Meyerhof Parnas, mientras que, determinadas algas convierten el dióxido de carbono disuelto o el bicarbonato en los cloroplastos en los compuestos intermedios con 3 carbonos del ciclo Calvin. En una serie de etapas, el compuesto intermedio de 3 carbonos, ácido fosfoglicérico, se convierte en gliceraldehído 3-fosfato que puede interconvertirse fácilmente en su isómero ceto, dihidroxiacetona fosfato y por último en glicerol. Aunque se conocen métodos biológicos tanto de producción de glicerol como de 1,3-propanodiol, no se ha demostrado nunca que el proceso completo pueda realizarlo un solo organismo.

Ni los métodos químicos ni los biológicos descritos anteriormente para la producción de 1,3-propanodiol son muy adecuados para la producción a escala industrial ya que los procesos químicos son de energía intensiva y los procesos biológicos requieren un material de partida costoso, glicerol. Se necesita un método que requiera poco aporte de energía y el material de partida económico. Un procedimiento más deseable incorporaría un microorganismo que tendría capacidad para convertir las fuentes básicas de carbono tales como los carbohidratos o azúcares en el producto final deseado 1,3-propanodiol.

Aunque una sola conversión de organismo de fuente de carbono fermentable aparte de glicerol o dihidroxiacetona en 1,3-propanodiol sería deseable, se ha documentado que existen dificultades significativas para superar dicho comportamiento. Por ejemplo, Gottschalk et al. (patente EP 373 230) da a conocer que el crecimiento de la mayoría de cepas útiles para la producción de 1,3-propanodiol, incluyendo Citrobacter freundii, Clostridium autobutylicum, Clostridium butylicum y Klebsiella pneumoniae, está alterado por la presencia de un donante de hidrógeno tal como fructosa o glucosa. Las cepas de Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchner, que producen 1,3-propanodiol en cofermentaciones de glicerol y fructosa o glucosa, no crecen cuando se proporciona glicerol como única fuente de carbono, y, aunque se ha demostrado que las células en reposo pueden metabolizar glucosa o fructosa, no producen 1,3-propanodiol. (Veiga DA Cunha et al., J. Bacteriol. 17e, 1013 (1992)). Asimismo, se ha demostrado que una cepa de Ilyobacter polytropus, que produce 1,3-propanodiol cuando se proporcionan glicerol y acetato, no producirán 1,3-propanodiol a partir de sustratos de carbono aparte de glicerol, incluyendo fructosa y glucosa. (Steib et al., Arch, Microbiol. 140, 139 (1984)). Por último Tong et al. (Appl. Biochem. Biotech. 34, 149 (1992) y Chem. Abst. 116 (9), nº 82153 ha dado a conocer que la Escherichia coli recombinante transformada con el regulón dha que codifica la glicerol deshidratasa no produce 1,3-propanodiol a partir de glucosa ni de xilosa en ausencia de glicerol exógeno.

Se han comunicado los intentos para mejorar el rendimiento de 1,3-propanodiol a partir de glicerol donde los cosustratos capaces de proporcionar equivalentes reductores, por lo general azúcares fermentables, se incluyen en el procedimiento. Se han reivindicado mejoras en el rendimiento para células en reposo de DSM 4270 de Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae que cofermentan glicerol y glucosa (Gottschalk et al., supra.; y Tran-Dinh et al., documento DE 3734 764); pero no para células en crecimiento de Klebsiella pneumoniae ATCC 25955 que cofermenta glicerol y glucosa, que no producía 1,3-propanodiol (I-T. Tong, Tesis doctoral, Universidad de Wisconsin-Madison (1992)). Se han publicado aumentos de rendimientos para la cofermentación de glicerol e glucosa o fructosa por una Escherichia coli; recombinante sin embargo, no se produce 1,3-propanodiol en ausencia de glicerol (Tong et al., supra.). En estos sistemas, los organismos individuales utilizan los carbohidratos como fuente de generación de NADH a la vez que proporcionan energía y carbono para el mantenimiento o crecimiento celular. Estas divulgaciones sugieren que los azúcares no se centran en la corriente de carbono que produce 1,3-propanodiol. En ningún caso se produce 1,3-propanodiol en ausencia de una fuente exógena de glicerol. Por lo tanto la autoridad de la bibliografía sugiere claramente que la

\hbox{producción de
1,3-propanodiol  a partir de una fuente de
carbohidratos por un solo organismo no es posible.}

El problema que debe resolver la presente invención es la producción biológica de 1,3-propanodiol por un solo organismo a partir de un sustrato de carbono económico tal como glucosa u otros azúcares. La producción biológica de 1,3-propanodiol requiere glicerol como sustrato para una reacción sucesiva en dos etapas en la que una enzima deshidratasa (por lo general una deshidratasa dependiente de la coenzima B_{12}) convierte el glicerol en un compuesto intermedio, 3-hidroxipropionaldehído, que es reducido a continuación a 1,3-propanodiol por una oxidorreductasa dependiente de NADH (o NADPH). La complejidad de los requisitos del cofactor necesita la utilización de un catalizador de la célula completa para un procedimiento industrial que utiliza esta secuencia de reacción para la producción de 1,3-propanodiol. Además, a fin de hacer el procedimiento económicamente viable, se necesita una materia prima menos costosa que el glicerol o la dihidroxiacetona. La glucosa y otros carbohidratos son sustratos adecuados, pero, como se expuso anteriormente, son conocidos por interferir con la producción de 1,3-propanodiol. Como resultado se ha demostrado que ningún organismo individual convierte la glucosa en 1,3-propano-diol.

Los solicitantes han resuelto el problema planteado y la presente invención proporciona el bioconvertir una fuente de carbono fermentable directamente en 1,3-propanodiol utilizando un solo organismo. La glucosa se utiliza como sustrato modelo y la bioconversión es aplicable a cualquier microorganismo existente. Los microorganismos que contienen el gen para una deshidratasa pueden convertir la glucosa y otros azúcares a través de la serie de reacciones de degradación del glicerol en 1,3-propanodiol con buenos rendimientos y selectividades. Además, la presente invención puede aplicarse generalmente para que incluya cualquier sustrato de carbono que se convierte fácilmente en 1) glicerol, 2) dihidroxiacetona o 3) compuestos de C_{3} en el estado de oxidación de glicerol (p. ej., glicerol 3-fosfato) o 4) compuestos de C_{3}

\hbox{en el estado de oxidación de
la dihidroxiacetona (p.  ej., fosfato de dihidroxiacetona o
gliceraldehído 3-fosfato).}

Sumario de la invención

La presente invención comprende un procedimiento para la bioconversión de un sustrato de carbono en 1,3-propanodiol por un solo microorganismo que tiene al menos un gen capaz de expresar una enzima deshidratasa activa poniendo en contacto dicho microorganismo con dicho sustrato en el que el sustrato de carbono tiene al menos un solo átomo de carbono y con la condición de que el sustrato de carbono sea otro aparte de glicerol o dihidroxiacetona. El microorganismo puede ser uno natural, o alterado genéticamente, tal como un microorganismo recombinante o un mutante de un microorganismo. Preferentemente, la enzima deshidratasa es una enzima glicerol deshidratasa o una enzima diol deshidratasa.

La presente invención comprende además la utilización en este procedimiento de un cósmido que comprende un fragmento de ADN de aproximadamente 35 kb aislado a partir de Klebsiella pneumoniae en el que dicho fragmento codifica la enzima activa glicerol deshidratasa con el digesto de restricción en la Figura 1, columnas 1 y 2. Este cósmido, cuando se transfiere a un microorganismo permite el metabolismo de un sustrato de carbono, en particular glucosa a 1,3-propanodiol.

La presente invención comprende además un microorganismo transformado que comprende un microorganismo hospedador y el cósmido anterior o cualquier fragmento de ADN de dicho cósmido que codifica una proteína funcional activa aparte de una enzima glicerol deshidratasa.

Preferentemente el gen codifica la glicerol deshidratasa y se aísla del grupo que consta de miembros de los géneros Klebsiella, Lactobacillus, Enterobacter, Citrobacter, Pelobacter, Ilyobacter, y Clostridium.

Los microorganismos hospedadores se seleccionan del grupo consistente en miembros de los géneros Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Methylobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces y Pseudomonas. Preferentemente el gen codifica la glicerol deshidratasa y se aísla del grupo consistente en miembros de los géneros Klebsiella y Salmonella.

Los microorganismos recombinantes que materializan la invención se publican en la Breve Descripción de los Depósitos Biológicos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta digestos de restricción (EcoR 1, BamH 1, EcoR V y NotI) de los cósmidos pkP1, pKP2 y pKP4 marcados como columnas 1, 2 y 4, respectivamente, y la separación en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Se cargaron marcadores de dimensión molecular en las bandas en el extremo. Las columnas marcadas como números 1 y 2 representan cósmidos que contienen una enzima glicerol deshidratasa.

La Figura 2 presenta una cartografía física parcial de pKP1 y la posición de los genes basada en la secuencia del ADN. Se identificaron los genes basándose en la comparación de marcos de lectura abiertos deducidos con la base de datos Genbank utilizando el programa Tfasta proporcionado por un programa informático de análisis de la secuencia de la Universidad de Wisconsin [Genetics Computer Group, Verison 7, Abril, 1991, 575 Science Drive, Madison, WI 53711].

Breve descripción de depósitos biológicos y listado de secuencias

La DH5\alpha de E. coli transformada que contienen el cósmido pKP1 que contiene una porción del genoma de Klebsiella que codifica la enzima glicerol deshidratasa se depositó el 18 de abril de 1995 con el ATCC bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest y se denominó ATCC 69789. La DH5\alpha de E. coli transformada que contienen el cósmido pKP1 que contiene una porción del genoma de Klebsiella que codifica una enzima diol deshidratasa se depositó el 18 de abril de 1995 con el ATCC bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest y se denominó ATCC 69790. La cepa PAO 2845:pDT9 de Pseudomonas aeruginosa, transformada con un plásmido que contiene el operón dhaB se depositó el 11 de abril de 1996 con el ATCC bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest y se denominó ATCC 55760. La cepa MSP42.81 de Pichia pastoris, transformada con plásmidos no replicadores que contienen casetes de expresión para los genes dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT, se depositó el 11 de abril de 1996 con el ATCC bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest y se denominó ATCC 74363. La cepa pMCK1/10/17(HM)#A de Saccharomyces cerevisiae, transformada con un plásmido que contiene los operones dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT, se depositó antes de la presentación de la presente solicitud internacional, el 9 de mayo de 1996, con el ATCC bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest y se denominó ATCC 74370. La cepa SL/14.2 de Streptomyces lividans, transformada con un plásmido que contiene los operones dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT, se depositó antes de la presentación de la presente solicitud internacional, el 9 de mayo de 1996, con el ATCC bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest y se denominó ATCC 98052. La cepa BG188/pM26 (Clon nº 8) de Bacillus licheniformis, transformada con un plásmido que contiene los operones dhaB1, dhaB2 y dhaB3, se depositó antes de la presentación de la presente solicitud internacional, el 9 de mayo de 1996, con el ATCC bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest y se denominó ATCC 98051. La cepa BG2864/pM27 (Clon nº 1) de Bacillus subtilis, transformada con un plásmido que contiene los operones dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT, se depositó antes de la presentación de la presente solicitud internacional, el 9 de mayo de 1996, con el ATCC bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest y se denominó ATCC 98050. La cepa TGR40-13 de Aspergillus niger, transformada con un plásmido que contiene los operones dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT, se depositó antes de la presentación de la presente solicitud internacional, el 9 de mayo de 1996, con el ATCC bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest y se denominó ATCC 74369. "ATCC" se refiera al depositario internacional American Type Culture Collection situado en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 E.U.A. Las denominaciones se refieren al número de registro del material depositado.

Los solicitantes han proporcionado cuarenta y seis secuencias en conformidad con las "Normas para la Representación Estandar de secuencias de nucleótidos y aminoácidos en de Solicitudes de Patente" (Anexos I y II a la Decisión del Presidente de la EPO, publicados en el Suplemento nº 2 a OJ EPO, 12/1992) y con 37 C.F.R. 1.821-1.825 y Apéndices A y B ("Requisitos para Descripciones de la Solicitud que contienen secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos").

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método para una producción biológica de 1,3-propanodiol a partir de una fuente de carbono fermentable en un organismo individual. El método incorpora un microorganismo que contiene una enzima deshidratasa que se pone en contacto con un sustrato de carbono y 1,3-propanodiol se aísla del medio de cultivo. El organismo individual puede ser un organismo natural, puede ser un organismo genéticamente alterado que contiene un gen codifica una enzima deshidratasa.

El presente método proporciona una fuente rápida, económica y responsable con el medio ambiente de monómero 1,3-propanodiol útil en la producción de poliésteres y otros polímeros.

Tal como se utiliza en la presente memoria las siguientes expresiones pueden utilizarse para la interpretación de las reivindicaciones y de la memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ácido nucleico" se refiere a una gran molécula que puede ser monocatenaria o bicatenaria, compuesta de (nucleótidos) que contienen un azúcar, fosfato y una purina o una pirimidina. Un "fragmento de ácido nucleico" es una fracción de una molécula de ácido nucleico dada. En plantas superiores, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es el material genético mientras que el ácido ribonucleico (ARN) está implicado en la transferencia de la información del ADN en las proteínas. Un "genoma" es el cuerpo entero del material genético contenido en cada célula de un organismo. La expresión "secuencia de nucleótidos" se refiere a un polímero de ADN o ARN que puede ser monocatenario o bicatenario, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o modificadas capaces de una incorporación en los polímeros de ADN o
ARN.

Como se utiliza en este documento, "esencialmente similar" se refiere a secuencias de ADN que pueden implicar cambios de bases que no causan un cambio en el aminoácido codificado, o que implican cambios de bases que pueden modificar uno o más aminoácidos, pero que no afectan a las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de ADN. Se sobrentiende por lo tanto que la invención abarca más que las secuencias ejemplares específicas. Las modificaciones en la secuencia, tales como eliminaciones, inserciones o sustituciones en la secuencia que producen cambios imperceptibles que no afectan sustancialmente a las propiedades funcionales de la molécula proteica resultante también están incluidas. Por ejemplo, se contempla la modificación en la secuencia génica que refleja la degeneración del código genético, o que da lugar a la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un punto dado; así, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrófobo, puede ser sustituido por un codón que codifique otro resto menos hidrófobo tal como glicina, o un resto más hidrófobo, tal como valina, leucina o isoleucina. Asimismo, los cambios que dan lugar a la sustitución de un resto con carga negativa por otro, tal como ácido aspártico por ácido glutámico, o un resto con carga positiva por otro, tal como lisina por arginina, puede esperarse también que produzca un producto biológicamente equivalente. Los cambios de nucleótidos que causan la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula proteica no es de esperar que modifiquen la actividad de la proteína. En algunos casos, puede de hecho ser deseable preparar mutantes de la secuencia con el fin de estudiar el efecto de la modificación sobre la actividad biológica de la proteína. Cada una de las modificaciones propuestas es correcta dentro de la pericia rutinaria de la técnica, como es la determinación de la retención de la actividad biológica en los productos codificados. Además, cualquier experto en la técnica reconoce que las secuencias "esencialmente similares" incluidas en esta invención se definen también por su capacidad de hibridarse, bajo condiciones severas (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65ºC), con las secuencias ilustradas en este documento.

"Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, que incluye secuencias reguladoras anteriores (5' no codificante) y siguientes a la zona de codificación (3' no codificante). Gen "natural" se refiere al gen que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras.

La expresión "genéticamente alterado o microorganismo genéticamente alterado" se refiera a cualquier microorganismo, adecuado para su utilización en la presente invención, que ha experimentado una alteración del sistema genético natural del microorganismo. Los microorganismos pueden modificarse genéticamente experimentando la transformación por vectores que comprenden fragmentos de ácido nucleico heterólogo, mutagénesis con agentes mutagenizantes (p. ej., luz UV, ácido etansulfónico) o por cualquier otro método mediante el cual se produzcan alteraciones estables del genoma celular.

El término "montaje" hace referencia a un plásmido, virus, secuencia replicadora de manera autónoma, genoma que integra la secuencia, fago o secuencia de nucleótidos, ADN o ARN lineal o circular, monocatenario o bicatenario, procedente de cualquier fuente, en el que numerosas secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una única construcción que es capaz de introducir un fragmento de activador y una secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con secuencia 3' no traducida apropiada en una célula.

El término "transformación" o "transfección" hace referencia a la obtención de nuevos genes en una célula tras la incorporación de ácido nucleico. Los genes obtenidos pueden estar integrados en el ADN cromosómico o estar introducidos como secuencias replicados extracromosómicas. El término "transformado" se refiere al producto de una transformación. La expresión "modificado genéticamente" se refiera al proceso de cambio del material hereditario por transformación o mutación.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción al producto génico de un gen que codifica la secuencia del producto génico.

El término "plásmido", "vector" o "cósmido" tal como se utiliza en la presente se refiera a un elemento cromosómico adicional que con frecuencia lleva genes que no forman parte del metabolismo central de la célula, y normalmente tienen forma de moléculas de ADN bicatenario circular.

La expresión "enzima deshidratasa" se referirá a cualquier enzima que sea capaz de isomerizar o convertir una molécula de glicerol en el producto 3-hidroxi-propionaldehído. Para los objetivos de la presente invención las enzimas deshidratasas comprenden una glicerol deshidratasa y una diol deshidratasa que tiene sustratos preferidos de glicerol y 1,2-propanodiol, respectivamente.

La expresión "sustrato de carbono" o "fuente de carbono" significa cualquier fuente de carbono capaz de ser metabolizada por un microorganismo en la que el sustrato contiene al menos un átomo de carbono, con la condición de que el sustrato de carbono sea distinto de glicerol o dihidroxiacetona.

Construcción de organismos recombinantes

Los organismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codificarán la serie de reacciones enzimáticas para la conversión de un sustrato de carbono en 1,3-propanodiol pueden construirse utilizando técnicas bien conocidas en la materia. En la presente invención se aislaron genes que codifican la enzima deshidratasa procedentes de un hospedador natural tal como Klebsiella y se utilizaron para transformar las cepas DH5\alpha, ECL707 y AA200 de la hospedadora E. coli.

Los métodos de obtención de los genes deseados procedentes de un genoma bacteriano son frecuentes y muy conocidos en materia de biología molecular. Por ejemplo, si se conoce la secuencia del gen, pueden crearse genotecas adecuadas por digestión con endonucleasa de restricción y pueden cribarse con sondas complementarias a la secuencia génica deseada. Una vez se aísla la secuencia, el ADN puede ampliarse utilizando métodos de ampliación dirigidos por un cebador convencional tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (documento U.S. nº 4.683.202) para obtener cantidades de ADN adecuado para la transformación utilizando vectores apropiados.

Alternativamente, pueden crearse bancos de cósmidos en los que grandes segmentos de ADN genómico (35-45 kb) pueden rellenarse dentro de los vectores y utilizarse para transformar hospedadores apropiados. Los vectores cósmidos son únicos en poder acomodar grandes cantidades de ADN. Generalmente vectores cósmidos tienen al menos una copia de la secuencia cos del ADN que se necesita para el encapsulado y subsiguiente ciclación del ADN extraño. Además de la secuencia cos estos vectores contendrán también un origen de replicación tal como ColE1 y marcadores con resistencia a fármacos tal como un gen resistente a la ampicilina o al neomicina. Los métodos de utilización de vectores cósmidos para la transformación de hospedadores bacterianos adecuados están bien descritos en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, en la presente memoria incorporada como referencia.

Por lo general para clonar cósmidos, se aísla y se liga el ADN extraño, utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas, adyacentes a la zona cos del vector cósmido. Los vectores cósmidos que contienen el ADN extraño linealizado se hace reaccionar a continuación con un vehículo de encapsulación de ADN tal como el bacteriófago \lambda. Durante el proceso de encapsulación las secuencias cos se escinden y el ADN extraño se encapsula en la parte de cabeza de la partícula vírica bacteriana. Estas partículas se utilizan a continuación para transfectar células hospedadoras adecuadas tal como E. coli. Una vez inyectado en la célula, el ADN extraño circula bajo la influencia de los extremos adhesivos cos. De esta manera grandes segmentos de ADN extraño pueden introducirse y expresarse en células hospedadoras recombinantes.

Los vectores cósmidos y los métodos de transformación de cósmidos se utilizaron dentro del contexto de la presente invención para clonar grandes segmentos de ADN genómico procedente de genes bacterianos conocidos por poseer genes capaces de transformar el glicerol hasta 1,3-propanodiol. Específicamente, el ADN genómico procedente de K. pneumoniae se aisló por métodos bien conocidos en la técnica y se digirió con la enzima de restricción Sau3A para su inserción en un vector cósmido Supercos 1^{TM} y se encapsuló utilizando extractos de encapsulación GigapackII. Después de la construcción del vector las células XL1-Blue MR de E. coli se transformaron con el ADN cósmido. Se identificó la capacidad de los transformados para convertir glicerol en 1,3-propanodiol cultivando las células en presencia de glicerol y analizando la formación de 1,3-propanodiol en el medio.

Dos de los transformados positivos a 1,3-propanodiol se analizaron y los cósmidos se denominaron pKP1 y pKP2. El secuenciado del ADN puso de manifiesto la extensa homología con el gen de glicerol deshidratasa de C. freundii, demostrando que estos transformados contenían ADN que codifica el gen de glicerol deshidratasa. Se analizaron otros transformados positivos a 1,3-propanodiol y los cósmidos se denominaron pKP4 y pKP5. El secuenciado del ADN puso de manifiesto que estos cósmidos llevaban ADN que codifica un gen de diol deshidratasa.

Aunque la presente invención utiliza los genes aislados del interior de un cósmido de Klebsiella, las fuentes alternativas de genes de deshidratasa incluyen, pero no se limitan a, Citrobacter, Clostridia y Salmonella.

Otros genes que afectarán positivamente la producción de 1,3-propanodiol pueden expresarse en hospedadores adecuados. Por ejemplo puede ser muy deseable sobreexpresar determinadas enzimas en la serie de reacciones de degradación de glicerol y/o de otras serie de reacciones a concentraciones mucho más mayores que las actualmente descubiertas en células naturales. Esto puede realizarse por clonación selectiva de los genes que codifican estos enzimas en plásmidos multicopia o colocando estos genes bajo un potente activador inducible o constitutivo. Los métodos para sobreexpresar las proteínas deseadas son frecuentes y bien conocidos en la técnica de biología molecular y ejemplos pueden encontrarse en Sambrook, supra. Además, la eliminación específica de determinados genes por métodos conocidos para los expertos en la materia afectará positivamente la producción de 1,3-propanodiol. Ejemplos de dichos métodos pueden encontrarse en Methods in Enzymology, Volumen 217, R. Wu editor, Academic Press:San Diego (1993).

Mutantes

Además de las células ilustradas se contempla que el presente método será capaz de hacer uso de las células que tienen individuales o múltiples mutaciones diseñadas de manera específica para aumentar la producción de 1,3-propanodiol. Las células que normalmente desvían una materia prima de carbono en series de reacciones improductivas, o que presentan represión significativa de catabolitos pudieron mutarse para evitar estas deficiencias fenotípicas. Por ejemplo, muchas células naturales se someten a la represión de catabolitos de la glucosa y los subproductos en el medio y se contempla que las cepas mutantes de estos organismos naturales, capaces de producción de 1,3-propanodiol que son resistentes a la represión de la glucosa, serían particularmente útiles en la presente inven-
ción.

Los métodos de creación de mutantes son comunes y bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las células naturales pueden exponerse a una variedad de agentes tales como la radiación o los mutágenos químicos y a continuación identificar el fenotipo deseado. Pueden utilizarse cuando se crean mutaciones mediante radiación ultravioleta (UV) o radiación de ionización. Longitudes de onda UV de onda corta adecuadas para mutaciones genéticas estarán comprendidas dentro del intervalo de 200 nm a 300 nm donde se prefiere 254 nm. La radiación UV en esta longitud de onda principalmente produce cambios en la secuencia de ácido nucleico desde guanidina y citosina hasta adenina y timidina. Como todas las células tienen mecanismos de reparación del ADN que repararían la mayoría de las mutaciones provocadas por UV, pueden añadirse agentes tales como cafeína y otros inhibidores para interrumpir el proceso de reparación y maximizar el número de mutaciones eficaces. Las mutaciones por UV de onda larga que utilizan luz en el intervalo de 300 nm a 400 nm son también posibles pero generalmente no son tan eficaces como la luz UV de onda corta a menos que se utilice junto con varios activadores tales como los colorantes psoralen que interactúan con el ADN.

La mutagénesis con agentes químicos es también eficaz para generar mutantes y frecuentemente las sustancias utilizadas comprenden productos químicos que afectan al ADN no replicador tales como HNO_{2} y NH_{2}OH, así como a los agentes que afectan al ADN replicador tales como los colorantes de acridina, notable para producir mutaciones frameshift. Los métodos específicos para crear mutantes que utilizan radiación o agentes químicos están bien documentados en la técnica. Véase por ejemplo Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. o Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992), en la presente memoria incorporadas como referencia.

Una vez se ha producido la mutagénesis, los mutantes con el fenotipo deseado pueden seleccionarse por una variedad de métodos. La identificación aleatoria es la más frecuente donde las células mutagenizadas se seleccionan por la capacidad para producir el producto deseado o intermedio. Alternativamente, el aislamiento selectivo de mutantes frecuente puede realizarse cultivando una población mutagenizada en medio selectivo donde únicamente pueden desarrollarse las colonias resistentes. Los métodos de selección mutante están muy desarrollados y son bien conocidos en la técnica de microbiología industrial. Véase Brock, Supra., DeMancilha et al., Food Chem., 14, 313,
(1984).

Mutaciones y transformaciones en la serie de reacciones de producción de 1,3-propanodiol

Serie de reacciones enzimáticas representativas. La producción de 1,3-propanodiol a partir de glucosa puede realizarse mediante la siguiente serie de etapas. Esta serie es representativa de numerosas series de reacciones conocidas por los expertos en la materia. La glucosa es convertida en una serie de etapas por enzimas de la serie de reacciones glucolítica en dihidroxiacetona fosfato de (DHAP) y 3-fosfogliceraldehído (3-PG). El glicerol se forma a continuación por hidrólisis de DHAP a dihidroxiacetona (DHA) seguida de reducción, o reducción de DHAP a glicerol 3-fosfato (G3P) seguida de hidrólisis. La etapa de hidrólisis puede ser catalizada por cualquier número de fosfatasas celulares que son conocidas por ser inespecíficas con respecto a sus sustratos o la actividad puede introducirse en el hospedador por recombinación. La etapa de reducción puede ser catalizada por una enzima hospedadora unida a NAD^{+} (o NADP^{+}) o la actividad puede ser introducida en el hospedador por recombinación. Es de destacar que el regulón dha contiene una glicerol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.6) que cataliza la reacción reversible de la Ecuación 3.

(Ecuación 1)Glicerol \rightarrow 3-HP + H_{2} \hskip4,05cm

(Ecuación 2)3-HP + NADH + H^{+} \rightarrow 1.3-propanodiol + NAD^{+}

(Ecuación 3)Glicerol + NAD^{+} \rightarrow DHA + NADH + H^{+} \hskip1,64cm

El glicerol se convierte en 1,3-propanodiol mediante el compuesto intermedio 3-hidroxi-propionaldehído (3-HP) como se ha descrito con detalle anteriormente. El compuesto intermedio 3-HP es producido a partir de glicerol, Ecuación 1, por una enzima deshidratasa que puede ser codificada por el hospedador o puede introducirse en el hospedador por recombinación. Esta deshidratasa puede ser glicerol deshidratasa (E.C. 4.2.1.30), diol deshidratasa (E.C. 4.2.1.28) o cualquier otra enzima capaz de catalizar esta transformación. El regulón dha codifica la glicerol deshidratasa, pero no la diol deshidratasa. El 1,3-propanodiol es producido a partir de 3-HP, Ecuación 2, por una enzima hospedadora unida a NAD^{+}- (o NADP^{+}) o la actividad puede introducirse en el hospedador por recombinación. Esta reacción final en la producción de 1,3-propanodiol puede ser catalizada por 1,3-propanodiol deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.202) u otras alcohol deshidrogenasas.

Mutaciones y transformaciones que afectan al canal del carbono. Una variedad de organismos mutantes que comprende variaciones en la serie de reacciones de producción de 1,3-propanodiol será útil en la presente invención. Por ejemplo, la introducción de una mutación de triosafosfato isomerasa (tpi-) en el microorganismo de la presente invención es un ejemplo de la utilización de una mutación para mejorar el rendimiento por el canal del carbono. La mutación puede dirigirse hacia un gen estructural para deteriorar o mejorar la actividad de una actividad enzimática o puede dirigirse hacia un gen regulador para modular el nivel de expresión de una actividad
enzimática.

Alternativamente, la transformación y las mutaciones pueden combinarse para controlar actividades enzimáticas específicas para la mejora de la producción de 1,3-propanodiol. Así está dentro del alcance de la presente invención anticipar modificaciones de un catalizador de la célula completa que conduce a un aumento de la producción de 1,3-propanodiol.

Medio y sustratos de carbono

El medio de fermentación en la presente invención debe contener sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir pero no se limitan a monosacáridos tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa o sus mezclas y mezclas no purificadas a partir de materias primas renovables tales como filtrado de suero de queso, licor de maíz fermentado, melazas de remolacha azucarera y malta de cebada. Además el sustrato de carbono puede ser también sustratos de un carbono tales como dióxido de carbono o metanol para cuya conversión metabólica en clave de compuestos intermedios bioquímicos se ha demostrado. La producción de glicerol a partir de fuentes de un solo carbono (p. ej., metanol, formaldehído o formato) se ha descrito en levaduras metilótrofas (K. Yamada et al., Agric. Biol. Chem., 53(2) 541-543, (1989)) y en bacterias (Hunter et.al., Biochemistry, 24, 4148-4155, (1985)). Estos organismos pueden asimilar compuestos de un solo carbono, que varían en el estado de oxidación desde el metano hasta el formato y producen glicerol. La serie de reacciones de la asimilación del carbono puede ser a través de monofosfato de ribulosa, a través de serina o a través de monofosfato de xilulosa (Gottschalk, Bacterial Metabolism, segunda edición, Springer-Verlag: Nueva York (1986)). La serie de reacciones de monofosfato de ribulosa implica la condensación de formato con ribulosa-5-fosfato para formar un azúcar de 6 carbonos que se convierte en fructosa y opcionalmente el producto de tres carbonos gliceraldehído-3-fosfato. Asimismo, la serie de reacciones de serina asimila el compuesto de un carbono en la serie de reacciones glucolíticas a través del metilentetrahidrofolato.

Además de sustratos con uno y dos carbonos los organismos metilótrofos son también conocidos por utilizar numerosos otros compuestos que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para actividad metabólica. Por ejemplo, las levaduras metilótrofas son conocidas por utilizar el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7^{a} (1993), 415-32. Editor(es): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK). Asimismo, varias especies de Candida metabolizarán la alanina o el ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol. (1990), 153(5), 485-9). Por lo tanto se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención puede comprende una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y solamente estarán limitados por la selección del organismo.

Aunque se contempla que todos los anteriormente mencionados sustratos de carbono y sus mezclas son adecuados en la presente invención, los sustratos de carbono preferidos son glucosa, fructosa, sacarosa o metanol.

Además de una fuente de carbono apropiada, el medio de fermentación debe contener minerales, sales, cofactores, tampones y otros componentes adecuados, conocidos por los expertos en la materia, adecuados para el crecimiento de los cultivos y promoción de las series de reacciones enzimáticas necesarias para la producción de 1,3-propanodiol. Se presta particular atención a las sales de Co (II) y/o a la vitamina B_{12} o a sus precursores.

Condiciones de cultivo

Por lo general las células se cultivan a 30ºC en un medio apropiado. Los medios de cultivo preferidos en la presente invención son medios corrientes comercialmente preparados tal como el caldo de cultivo Luria Bertani (LB), el caldo de cultivo con dextrosa Sabouraud (SD) o el caldo de cultivo con medio de levadura (YM). Otros medios de cultivo definidos o sintéticos también pueden utilizarse y el medio apropiado para el cultivo del microorganismo específico será conocido por algún experto en materia de microbiología o ciencia de fermentación. La utilización de agentes conocidos para modular la represión del catabolito directa o indirectamente, p. ej., 2':3'-monofosfato de adenosina cíclico, puede también incorporarse en los medios de reacción. Asimismo, la utilización de agentes conocidos por modular actividades enzimáticas (p. ej., metil viológeno) que conduce al aumento de producción de 1,3-propanodiol puede utilizarse conjuntamente o como alternativa a manipulaciones genéticas.

Los intervalos de pH adecuados para la fermentación están comprendidos entre pH 5,0 y pH 9,0 donde se prefiere entre pH 6,0 y pH 8,0 como condición inicial.

Las reacciones pueden realizarse en condiciones aerobias o anaerobias donde se prefieren las condiciones anaerobias o microaerobias.

Fermentaciones en lotes y continuas

El presente procedimiento emplea un método de fermentación en lotes. Una fermentación en lote clásica es un sistema cerrado donde la composición del medio se fija al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por lo tanto, al comienzo de la fermentación el medio se inocula con el organismo u organismos deseados y se deja que se produzca la fermentación sin añadir nada al sistema. Por lo general, sin embargo, una "fermentación en lotes" es discontinua con respecto a la adición de la fuente de carbono y a menudo se hacen intentos para controlar factores tales como pH y concentración de oxígeno. En los sistemas en lotes el metabolito y las composiciones de la biomasa del sistema cambian constantemente hasta que se interrumpe el periodo de fermentación. En los cultivos en lotes las células se moderan a través de una fase log estática hasta una fase log de alto crecimiento y por último hasta una fase estacionaria donde el ritmo de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria opcionalmente morirán. Las células en fase log generalmente son responsables de la mayor parte de la producción del producto final o intermedio.

Una variación en el sistema por lotes es el sistema semicontinuo. Los procedimientos de fermentación semicontinua son también adecuados en la presente invención y comprenden un sistema por lotes típico con la excepción de que el sustrato se añade en incrementos a medida que progresa la fermentación. Los sistemas semicontinuos son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células e donde se desee tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la concentración real de sustrato en sistemas semicontinuos es difícil y se estima por consiguiente sobre la base de los cambios de factores mensurables tales como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases residuales tal como el CO_{2}. Las fermentaciones por lotes y semicontinuas son frecuentes y bien conocidas en la técnica y los ejemplos pueden encontrarse en Brock, supra.

Aunque la presente invención se realiza en modo por lotes se contempla que el método sería adaptable a métodos continuos de fermentación. La fermentación continua es un sistema abierto donde un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medio acondicionado se elimina simultáneamente durante el tratamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una alta densidad constante en la que las células están principalmente en crecimiento en fase log.

La fermentación continua permite la modulación de un factor o de cualquier número de factores que afectan al crecimiento celular o a la concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitativo tal como la fuente de carbono o la concentración de nitrógeno en una cantidad fija y permitirá moderar todos los demás parámetros. En otros sistemas numerosos factores que afectan al crecimiento pueden alterarse continuamente mientras que la concentración celular, medida por la turbidez media, se mantenga constante. Los sistemas continuos se esfuerzan en mantener las condiciones de crecimiento del estado estacionario y así la pérdida celular debida al medio que se está trasegando debe equilibrarse frente a la velocidad de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos de modulación de los nutrientes y de los factores de crecimiento para los procesos de fermentación continua así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación del producto son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial y varios métodos son detallados por Brock, supra.

Se contempla que la presente invención pueda ponerse en práctica utilizando procesos por lotes, semicontinuo o continuo y que cualquier modo conocido de fermentación sería adecuado. Además, se contempla que las células pueden inmovilizarse en un sustrato como catalizadores de las células completas y someterse a condiciones de fermentación para la producción de 1,3-propanodiol.

Identificación y purificación de 1,3-propanodiol

Los métodos para la purificación de 1,3-propanodiol a partir del medio de fermentación son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los propanodioles pueden obtenerse a partir de medio celular sometiendo la mezcla de reacción a extracción con un disolvente orgánico, destilación y cromatografía en columna (documento U.S. 5.356.812). Un orgánico disolvente particularmente bueno para este proceso es el ciclohexano (documento U.S. 5.008.473).

El 1,3-propanodiol puede identificarse directamente sometiendo el medio a análisis de cromatografía líquida a alta presión (HPLC). En la presente invención se prefiere un método en el que el se analiza la fermentación media en una columna analítica de intercambio iónico que utiliza una fase móvil de ácido sulfúrico 0,01 N en modo isocrático.

Células

Las células adecuadas en la presente invención comprenden aquellas que contienen una enzima deshidratasa. Se contempla que las células adecuadas pueden ser procaróticas o eucarióticas y estarán limitadas únicamente por su capacidad para expresar una enzima deshidratasa activa. Serán particularmente útiles en la presente invención las células que son fácilmente adaptables a los métodos de fermentación a gran escala. Dichos organismos son bien conocidos en la técnica del biotratamiento industrial, cuyos ejemplos pueden encontrarse en "Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications", Murooka et al., eds., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York (1994), e incluyen bacterias fermentativas así como levaduras y hongos filamentosos. Por lo general la enzima será una glicerol deshidratasa o una diol deshidratasa con una especificidad de sustrato para glicerol o 1,2-propanodiol, respectivamente. Las enzimas deshidratasas son capaces de convertir glicerol en hidroxipropionaldehído (3-HPA) que se convierte a continuación en 1,3-propanodiol. Las células que contienen esta serie de reacciones pueden incluir organismos mutados o recombinantes que pertenecen a los géneros Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Samonella y Lactobacillus. Microorganismos conocidos por personas expertas en la materia para producir glicerol por fermentación, p. ej., Aspergillus, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Dunaliella, Debaryomyces, Mucor, Torylopsis y Metilobacteria, pueden ser los hospedadores para una enzima deshidratasa recombinante. Otras células adecuadas como hospedadores en la presente invención incluyen Bacillus, Escherichia, Pseudomonas y Streptomyces. Aunque no se desea estar ligado por la teoría, se cree que los organismos, que pertenecen a los anteriores grupos mencionados, existentes en la naturaleza que son adecuados para la presente invención.

Basándose en el trabajo experimental de los solicitantes se contempla que una amplia variedad de células pueden utilizarse en la presente invención. Los solicitantes han demostrado por ejemplo que las células que varían ampliamente en composición genética y fenotípica son capaces de bioconvertir un sustrato de carbono adecuado en 1,3-propanodiol. Las células ejemplificadas incluyen: una cepa mutante constitutiva de K. pneumoniae para los genes dha, cepas recombinantes de E. coli que comprenden elementos del genoma de Klebsiella que contienen genes que codifican glicerol o diol deshidratasa, cepas (tpi-) y de E. coli recombinantes asimismo transfectadas con elementos de los genomas de Klebsiella y que contienen una mutación en el gen que codifica la enzima triosafosfato isomerasa.

Aunque los transformados de E. coli que contienen el regulón dha de Klebsiella pneumonia eran capaces de convertir el glicerol en 1,3-propanodiol aun en presencia de glucosa o xilosa (Tong et al., Appl. Biochem. Biotech., 34, 149 (1992)) no fue detectado 1,3-propanodiol por estos organismos en presencia de glucosa sola. En contraste directo con esta descripción, los solicitantes han descubierto que las tres cepas de E. coli, que contienen cualquiera de los dos cósmidos independientemente aislados que comprende el regulón dha de Klebsiella pneumonia, produjo 1,3-propanodiol a partir de un alimento de glucosa con nada de glicerol exógenamente añadido presente. La cepa ECL707 de E. coli, que contiene los vectores cósmidos pKP-1 o pKP-2 que comprende el regulón K. pneumoniae dha, se mostraba detectable si bien la producción modesta de 1,3-propanodiol a partir de glucosa en ausencia de glicerol exógenamente añadido, (Ejemplo 4). Las cepas recombinantes de E. coli construidas a partir de un organismo hospedador alternativo, DH5\alpha, que contienen también los vectores cósmidos pKP-1 o pKP-2, se descubrió que eran más eficaces que los recombinantes de ECL707 para producir 1,3-propanodiol a partir de glucosa en condiciones apropiadas, (Ejemplo 3). Las más eficaces para producir 1,3-propanodiol a partir de glucosa en las condiciones del Ejemplo 4 fueron las cepas AA200 recombinantes de E. coli que contienen los vectores cósmidos pKP-1 o pKP-2, Ejemplo 2. La cepa AA200 de E. coli contiene una enzima triosafosfato isomerasa defectuosa (tpi^{-}).

Una cepa de AA200-pKP1, seleccionada para el estudio adicional a partir de una mezcla de cepas independientes procedentes de la reacción de transformación, convirtió la glucosa en 1,3-propanodiol en una reacción en dos etapas. En la primera etapa, la cepa AA200-pKP1-5 se cultivo hasta una densidad celular elevada en ausencia de glucosa y glicerol. En la segunda etapa, las células cultivadas, en suspensión en un medio que contiene glucosa pero no glicerol, convirtió la glucosa en 1,3-propanodiol con conversión y selectividad elevadas, Ejemplo 5. Aunque diferenciándose inmunoquímica, cromatográfica y genéticamente, las enzimas glicerol deshidratasa (E.C. 4.2.1.30) y diol deshidratasa (E.C. 4.2.1.28) dependientes de la coenzima B_{12} catalizan la conversión de glicerol a 3-hidroxipropionaldehído. El regulón dha contiene la glicerol deshidratasa, pero no la diol deshidratasa. La ATCC 8724 de K. pneumoniae, que contiene una diol deshidratasa pero no una glicerol deshidratasa convierte el glicerol en 1,3-propanodiol (Forage et al., J. Bacteriol., 149, 413, (1982)). Las cepas ECL707 y AA200 recombinantes de E. coli, que contienen el vector cósmido pKP4 que codifica genes para una diol deshidratasa, convirtieron la glucosa en 1,3-propanodiol, Ejemplo 2 y Ejemplo 4.

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ECL2106 de K. pneumoniae, preparada por mutagénesis a partir de una cepa natural (Ruch et al., J. Bacteriol. 124, 348 (1975)), presenta la expresión constitutiva del regulón dha (Ruch et al., supra; Johnson et al., J. Bacteriol. 164, 479 (1985)). Una cepa procedente de ATCC 25955 de K. pneumoniae, que presenta el mismo fenotipo, se ha preparado del mismo modo (Forage et al., J. Bacteriol. 149, 413 (1982)). La expresión de los genes estructurales de Klebsiella dha está, en parte, controlada por un represor (producto de dha R) (Sprenger et al., J. Gen Microbiol. 135, 1255 (1989)). Los solicitantes han demostrado que ECL2106, que es constitutiva para los genes estructurales dha, produjo 1,3-propanodiol a partir de un alimento de glucosa en ausencia de glicerol exógenamente añadido, Ejemplo 6. Esto está en contraste con la ATCC 25955 de K. pneumoniae natural que no produjo concentraciones detectables de 1,3-propanodiol en las mismas condiciones, Ejemplo 6.

La expresión de los estructurales genes dha en ECL2106 está controlada además por la expresión del catabolito (Sprenger et al., J. Gen Microbiol. 135, 1255 (1989)). La eliminación de la represión de catabolitos puede conseguirse colocando los genes estructurales necesarios bajo el control de activadores alternativos como se ha demostrado para 1,3-propanodiol oxidorreductasa (dhaT) procedente de C. freundii y diol deshidratasa procedente de ATCC 8724 de K. oxytoca (Daniel et al., J. Bacteriol. 177, 2151 (1995) y Tobimatsu et al., J. Biol. Chem. 270, 7142 (1995)). Eliminando la represión del catabolito de ECL2106 de esta manera, se consigue una mejora en la producción de 1,3-propanodiol a partir de glucosa en ausencia de una fuente exógena de glicerol. Se obtiene una mejora aún mayor mediante el canal de carbono apropiado como se describe, por ejemplo, con la mutación tpi^{-}.

Ya que los regulones dha de Citrobacter y Klebsiella sp. son notablemente similares, un experto en la materia apreciará que lo dado a conocer que conlleva la producción de 1,3-propanodiol a partir de glucosa en ausencia de una fuente exógena de glicerol para Klebsiella sp. aplica a Citrobacter sp también. Además, como el metabolismo del glicerol por C. butyricum es comparable al de K. pneumoniae [Zeng et al., Biotechnol. and Bioeng. 44, 902 (1994)], lo dado a conocer se extenderá también a Clostridia sp.

Ejemplos Métodos generales

Los procedimientos para fosforilaciones, ligaduras y transformaciones son bien conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para su utilización en los ejemplos siguientes pueden encontrarse en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son bien conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para su utilización en los ejemplos siguientes pueden encontrarse en el Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994) o Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates. Inc., Sunderland, MA. Todos los reactivos y materiales utilizados para el crecimiento y mantenimiento de las células bacterianas se adquirieron en Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que se especifique de otra manera.

El significado de las abreviaturas es el siguiente: "h" significa hora(s), "min" significa minuto(s), "s" significa segundo(s), "d" significa día(s), "ml" significa mililitros, "l" significa litros, 50 amp es 50 \mug/ml de ampicilina y LB-50 amp es caldo de cultivo Luria-Bertani que contiene 50 \mug/ml ampicilina.

En las tablas se utilizan las abreviaturas siguientes. "Con." es conversión, "Sel." es selectividad basada en el carbono y "nd" es no detectado.

Ensayos enzimáticos

Se determinó la actividad de glicerol deshidratasa en células exentas de extractos utilizando 1,2-propanodiol como sustrato. El ensayo, basado en la reacción de aldehídos con metilbenzo-2-tiazolona hidrazona, ha sido descrito por Forage y Foster (Biochim. Biophys. Acta, 569, 249 (1979)). La actividad de 1,3-propanodiol oxidorreductasa, a veces denominada 1,3-propanodiol deshidrogenasa, se determinó en solución o en geles planos (slab) utilizando 1,3-propanodiol y NAD^{+} como sustratos como se ha descrito también. Johnson y Lin, J. Bacteriol., 169, 2050 (1987).

Aislamiento e identificación de 1,3-propanodiol

La conversión de glicerol en 1,3-propanodiol fue controlada por HPLC. Se realizaron análisis utilizando técnicas normalizadas y materiales disponibles por un experto en materia de cromatografía. Un método apropiado utilizó un sistema de HPLC Waters Maxima 820 que utiliza UV (210 nm) y detección por IR. Se inyectaron muestras sobre una columna Shodex SH-1011 (8 mm x 300 mm, adquirida en Waters, Milford, MA) equipada con una precolumna Shodex SH-1011P (6 mm x 50 mm), temperatura controlada a 50ºC, utilizando H_{2}SO_{4} 0,01 N como fase móvil a un caudal de 0,5 ml/min. Cuando se deseaba análisis cuantitativo, las muestras se preparaban con una cantidad conocida de ácido trimetilacético como patrón externo. Por lo general, los tiempos de retención del glicerol (detección por IR),1,3-propanodiol (detección por IR) y ácido trimetilacético (UV y detección por IR) fueron 20,67 min., 26,08 min. y 35,03 min., respectivamente.

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La producción de 1,3-propanodiol se confirmó por GC/MS. Se realizaron análisis utilizando técnicas normalizadas y materiales disponibles para un experto en materia de GC/MS. Un método apropiado utilizó un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890 serie II acoplado a un detector selectivo de masas Hewlett Packard 5971 serie (EI) y una columna HP-INNOWax (30 m de longitud, 0,25 mm d.i., 0,25 micras de espesor de película). El tiempo de retención y el espectro de masas de 1,3-propanodiol generado se compararon con el del 1,3-propanodiol auténtico (m/e: 57, 58).

Un método alternativo para GC/MS implicaba la modificación de la muestra. A 1,0 ml de muestra (p. ej., sobrenadante del cultivo) se añadió 30 \mul de ácido perclórico concentrado (70% v/v). Después de mezclar, se congeló y se liofilizó la muestra. Una mezcla 1:1 de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida:piridina (300 \mul) se añadió al material liofilizado, se mezcló intensamente y se colocó a 65ºC durante una hora. La muestra se clarificó de material insoluble por centrifugación. El líquido resultante se dividió en dos fases, de las cuales la superior se utilizó para análisis. La muestra se cromatografió en una columna DB-5 (48 m, 0,25 mm D.I., 0,25 \mum de espesor de película; de J&W Scientific) y el tiempo de retención y el espectro de masas del derivado de 1,3-propanodiol obtenido de los sobrenadantes del cultivo se compararon con los obtenidos a partir de patrones auténticos. El espectro de masas de 1,3-propanodiol modificado con TMS contiene los iones característicos de 205, 177, 130 y 115 AMU.

Construcción de bancos de cósmidos de K. pneumoniae

Se cultivó K. pneumoniae (ATCC 25955) en 100 ml de medio LB durante 8 h a 37ºC con aireación. Se centrifugaron a 3.000 rpm durante 15 min. las bacterias (25 ml por tubo) en una centrifugadora GLC 2.B de DuPont Sorvall a temperatura ambiente. Se sedimentaron las bacterias y se decantó el sobrenadante. El sedimento celular bacteriano se congeló a -20ºC. El ADN cromosómico se aisló según se esboza a continuación con especial cuidado para evitar el cizallamiento del ADN (es decir, se evitó la formación del vórtice). Se volvió a poner en suspensión un tubo de bacterias en 2,5 ml de Tris 50 mM -EDTA 10 mM y se añadieron 500 \mul de lisozima (1 mg/ml). El sedimento se volvió a poner en suspensión suavemente y la suspensión se incubó a 37ºC durante 15 min. Se añadió dodecilsulfato sódico para llevar la concentración final a 0,5%. Esto produjo la solución que se volvió transparente. Se añadió proteinasa K (50 \mug/ml) y se incubó la suspensión a 55ºC durante 2 h. Se separó el tubo y se transfirió a un baño con hielo y se añadió cloruro sódico para dar una concentración final 0,4 M. Se añadieron dos volúmenes de etanol al líquido. Se insertó un tubo de vidrio a la interfaz y el ADN devanado con cuidado se sumergió en un tubo que contenía etanol al 70%. Tras secado al vacío, el ADN se volvió a poner en suspensión en 500 \mul de agua y se determinó por espectrofotometría la concentración de ADN. Se preparó una alícuota diluida de ADN en un gel de agarosa al 0,5% para determinar la naturaleza intacta del ADN.

El ADN cromosómico se digirió parcialmente con Sau3A como esboza Sambrook et al., supra. Se digirió ADN (2 \mug) con 2 unidades de Sau3A (Promega, Madison, WI) a temperatura ambiente en 200 \mul de volumen total. A los 0, 5, 10 y 20 min., se extrajeron las muestras (50 \mul) y se transfirieron a tubos que contenían 5 \mumoles de EDTA. Estos tubos se incubaron a 70ºC durante 10 min. Se retiró una alícuota (2 \mul) y se analizó en una electroforesis en gel de agarosa al 0,5% para determinar el nivel de digestión y el resto de la muestra (48 \mul) se almacenó a -20ºC. El gel se tiñó con bromuro de etidio y se observó bajo UV para determinar la digestión parcial del ADN cromosómico. Una disminución en el tamaño del ADN cromosómico con aumento en el tiempo se observó que demuestra que la disminución en el tamaño del ADN cromosómico es debido a la acción de Sau3A. El ADN se extrajo del resto de la muestra por métodos de protocolo habituales (Sambrook et al., supra).

Se preparó un banco de cósmidos de ADN parcialmente digerido procedente de K. pneumoniae utilizando el kit del vector cósmido Supercos y extractos de encapsulación GigapackII utilizando los reactivos adquiridos en Stratagene (La Jolla, CA). Se siguieron las instrucciones proporcionadas por el fabricante. La K. pneumoniae envasada contenía un valor del fago de 4 x 10^{4} a 1,0 x 10^{5} determinado transfectando E. coli XL1-Blue MR.

El ADN cósmido se aisló a partir de 6 de los transformados de E. coli y se descubrió que contiene una inserción grande de ADN (25 a 30 kb).

Ejemplo 1

Clonación y transformación de células hospedadoras de E. coli con ADN cósmido para la expresión de 1,3-propanodiol Medios

Se utilizó medio sintético S12 en la identificación de la capacidad de transformados bacterianos para preparar 1,3-propanodiol. El medio S12 contiene: sulfato amónico 10 mM, tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 7,0, MgCl_{2} 2 mM, CaCl_{2} 0,7 mM, MnCl_{2} 50 \muM, FeCl_{3} 1 \muM, ZnCl 1 \muM, CuSO_{4} 1,7 \muM, CoCl_{2} 2,5 \muM, Na_{2}MoO_{4} 2,4 \muM e hidrocloruro de tiamina 2 \muM.

El medio A utilizado para el crecimiento y la fermentación consistía en: sulfato amónico 10 mM; tampón de MOPS/KOH 50 mM, pH 7,5; tampón de fosfato potásico 5 mM, pH 7,5; MgCl_{2} 2 mM; CaCl_{2} 0,7 mM; MnCl_{2} 50 \muM; FeCl_{3} 1 \muM; ZnCl 1 \muM; CuSO_{4} 1,72 \muM; CoCl_{2} 2,53 \muM; Na_{2}MoO_{4} 2,42 \muM; hidrocloruro de tiamina 2 \muM; extracto de levadura al 0,01%; casaminoácidos al 0,01%; 0,8 \mug/ml de vitamina B_{12}; y 50 amp. El medio A se enriqueció con glicerol al 0,2% o glicerol al 0,2% más D-glucosa al 0,2% según se requiera.

Células

ECL2106 de Klebsiella pneumoniae (Ruch et al., J. Bacteriol., 124, 348 (1975)), también conocida en la bibliografía como K. aerogenes o Aerobacter aerogenes, se obtuvo a partir de E. C. C. Lin (Harvard Medical School, Cambridge, MA) y se mantuvo como cultivo de laboratorio.

ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae se adquirió en American Type Culture Collection (Rockville, MD).

DH5\alpha de E. coli se adquirió en Gibco/BRL y se transformó con el ADN cósmido aislado de ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae que contiene un gen codifica una enzima glicerol o diol deshidratasa. Los cósmidos que contienen la glicerol deshidratasa se identificaron como pKP1 y pKP2 y el cósmido que contiene la enzima diol deshidratasa se identifico como pKP4. Las células DH5\alpha transformadas se identificaron como DH5\alpha-pKP1, DH5\alpha-pKP2 y DH5\alpha-pKP4.

ECL707 de E. coli (Sprenger et al., J. Gen. Microbiol., 135,1255 (1989)) se obtuvo a partir de E. C. C. Lin (Harvard Medical School, Cambridge, MA) y se transformó asimismo con el ADN cósmido de Klebsiella pneumoniae. Estos transformados fueron identificados como ECL707-pKP1 y ECL707-pKP2, que contienen el gene de la glicerol deshidratasa y ECL707-pKP4 que contiene el gen de la diol deshidratasa.

AA200 de E. coli que contiene una mutación en el gen tpi (Anderson et al., J. Gen Microbiol., 62, 329 (1970)) se adquirió en el Genetic Stock Center de E. coli, Yale University (New Haven, CT) y se transformó con ADN cósmido de Klebsiella para dar los organismos recombinantes AA200-pKP1 y AA200-pKP2, que contienen el gen glicerol deshidratasa y AA200-pKP4, que contiene el gen de la diol deshidratasa.

DH5\alpha

Seis placas de transformación que contienen aproximadamente 1.000 colonias de XL1-Blue MR de E. coli transfectadas con ADN de K. pneumoniae se lavaron con 5 ml de medio LB y se centrifugaron. Se sedimentaron las bacterias y se volvieron a poner en suspensión en 5 ml de medio LB + glicerol. Se inoculó una alícuota (50 \mul) en un tubo de 15 ml que contenía medio sintético S 12 con glicerol al 0,2% + 400 ng por ml de vitamina B_{12} + extracto de levadura al 0,001% + 50 amp. El tubo se llenó con el medio hasta arriba y se envolvió con parafilm y se incubó a 30ºC. Se observó una ligera turbidez tras 48 h. Las alícuotas, analizadas para la distribución del producto como se describió anteriormente a las 78 h y 132 h, fueron positivas para 1,3-propanodiol, los últimos puntos de tiempo que contienen cantidades crecientes de 1,3-propanodiol.

Las bacterias, positivas a la prueba para la producción de 1,3-propanodiol, se diluyeron en serie y se colocaron en placas LB-50amp a fin de aislar colonias individuales. Se aislaron cuarenta y ocho colonias individuales y se comprobó de nuevo la producción de 1,3-propanodiol. El ADN cósmido se aisló en 6 clones independientes y se transformó en la cepa DH5\alpha de E. coli. Se comprobó de nuevo en los transformados la producción de 1,3-propanodiol. Se caracterizaron más dos transformados y se denominaron DH5\alpha-pKP1 y DH5\alpha-pKP2.

Un fragmento EcoRI-SalI de 12,1 kb procedente de pKP1, subclonado en pIBI31 (IBI Biosystem, New Haven, CN), se secuenció y se denominó pHK28-26 (SEQ. ID. nº: 1). El secuenciado puso de manifiesto los locus de los marcos de lectura abiertos relevantes del operón dha que codifica la glicerol deshidratasa y los genes necesarios para la regulación. Haciendo referencia a la SEQ. ID. nº: 1, un fragmento del marco de lectura abierto para dhaK que codifica la dihidroxiacetona cinasa se encuentra en las bases 1-399; el marco de lectura abierto dhaD que codifica la glicerol deshidrogenasa se encuentra en las bases 983-2107; el marco de lectura abierto dhaR que codifica el represor se encuentra en las bases 2209-4134; el marco de lectura abierto dhaT que codifica la 1,3-propanodiol oxidorreductasa se encuentra en las bases 5017-6180; el marco de lectura abierto dhaB1 que codifica la subunidad alfa de la glicerol deshidratasa se encuentra en las bases 7044-8711; el marco de lectura abierto dhaB2 que codifica la subunidad beta de la glicerol deshidratasa se encuentra en las bases 8724-9308; el marco de lectura abierto dhaB3 que codifica la subunidad gamma de la glicerol deshidratasa se encuentra en las bases 9311-9736; y el marco de lectura abierto dhaBX, que codifica una proteína de función desconocida se encuentra en las bases 9749-11572.

Colonias individuales XL1-Blue MR de E. coli transfectadas con ADN cósmido encapsulado procedente de K. pneumoniae se inocularon en pocillos de microvalorador que contenían 200 \mul de medio S 15 (sulfato amónico, 10 mM: tampón de fosfato potásico pH 7,0, 1 mM; tampón de MOPS/KOH, pH 7,0, 50 mM; MgCl_{2}, 2 mM; CaCl_{2}, 0,7 mM; MnCl_{2}, 50 \muM; FeCl_{3}, 1 \muM; ZnCl, 1 \muM; CuSO_{4}, 1,72 \muM; CoCl_{2}, 2,53 \muM; Na_{2}MoO_{4}, 2,42 \muM; e hidrocloruro de tiamina, 2 \muM) + glicerol al 0,2% + 400 ng/ml de vitamina B_{12} + 0,001% de extracto de levadura + 50 \mug/ml de ampicilina. Además de los pocillos del microvalorador, se inoculó también una placa modelo que contenía amp LB-50. Tras 96 h, se extrajeron 100 \mul y se centrifugaron en un tubo de microcentrifugadora Rainin que contenía un de filtro con membrana de nilón de 0,2 micras. Las bacterias quedaron retenidas y el filtrado se procesó para el análisis por HPLC. Los clones positivos que demuestran la producción de 1,3-propanodiol se identificaron después de identificar aproximadamente 240 colonias. Se identificaron tres clones positivos, dos de las cuales habían crecido en amp LB-50 y uno de los cuales no. Una sola colonia, se aísla a partir de uno de los dos clones positivos cultivados en amp LB-50 y se verificó la producción de 1,3-propanodiol, se diseñó como pKP4. El ADN cósmido se aisló a partir de cepas de E. coli que contenían pKP4 y se transformó la cepa DH5\alpha de E. coli. Se comprobó la producción de 1,3-propanodiol en un transformado independiente, denominado DH5\alpha-pKP4.

ECL707

La cepa ECL707 de E. coli se transformó con el ADN cósmido de K. pneumoniae correspondiente a pKP1, pKP2, pKP4 y el vector Supercos solo y denominado ECL707-pKP1 ECL707-pKP2, ECL707-pKP4 y ECL707-sc, respectivamente. ECL707 es defectuosa en glpK, gld y ptsD que codifican la glicerol cinasa dependiente de ATP, glicerol deshidrogenasa unida a NAD^{+} y la enzima II para la dihidroxiacetona del sistema fosfotransferasa dependiente del fosfoenolpiruvato, respectivamente.

Veinte colonias individuales de cada transformación del cósmido y cinco de la transformación del vector Supercos solo (referencia negativa), se aislaron en placas LB-50 amp, se transfectaron en una placa LB-50 amp modelo. En estas cepas se determinó asimismo su capacidad para convertir el glicerol en 1,3-propanodiol a fin de determinar si contenían actividad de deshidratasa. Los transformados se transfirieron con un palillo esterilizado a las placas de microvaloración que contenían 200 \mul de medio A enriquecido con glicerol al 0,2% o glicerol al 0,2% más D-glucosa al 0,2%. Tras la incubación durante 48 h a 30ºC, los contenidos de los pocillos de la placa de microvaloración se filtraron a través

\hbox{de un filtro de
nilón de 0,45  \mu  y se cromatografiaron por  HPLC. Los resultados
de estas pruebas se dan en la Tabla 1.}

TABLA 1

1

AA200

La cepa AA200 de E. coli se transformó con el ADN cósmido de K. pneumoniae correspondiente a pKP1, pKP2, pKP4 y el vector Supercos solo y se denominó AA200-pKP1, AA200-pKP2, AA200-pKP4 y AA200-sc, respectivamente. La cepa AA200 tiene defecto en la triosafosfato isomerasa, (tpi^{-}).

Veinte colonias individuales de cada transformación de cósmido y cinco de los vectores de transformación vacíos se aislaron y se determinó su capacidad para convertir el glicerol en 1,3-propanodiol como se describe para la cepa ECL707 de E. coli. Los resultados de estas pruebas se dan en la Tabla 2.

TABLA 2

2

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Ejemplo 2

Conversión de D-glucosa en 1,3-propanodiol por la cepa AA200 de E. coli transformada con ADN de Klebsiellia pneumoniae que contiene actividad de deshidratasa

Frascos de vidrio con suero, rellenos hasta su capacidad con medio (aprox. 14 ml de medio A como se define en el Ejemplo 1 enriquecido con 10 \mug/ml de kanamicina y D-glucosa al 0,2%, más o menos adenosina 2':3'-monofosfato cíclica (AMPc)) 0,5-1,0 mM, se inocularon con cepas de la colonia individual seleccionada de la cepa AA200 de E. coli que contenía los cósmidos pKP1 o pKP2 del regulón de K. pneumoniae pdu, el operón pKP4 de K. pneumoniae pdu, o el vector Supercos solo. A fin de impedir el contacto con glicerol, la inoculación se llevó a cabo en una placa de agar-agar de LB-50 amp o en un cultivo líquido del mismo medio. Las reacciones se incubaron durante aprox. 72 h a 30ºC agitando a 250 rpm. El crecimiento se determinó por el cambio en absorbancia a 600 nm donde la D.O._{600} inicial era de 0,020 AU. El alcance de la disminución de la glucosa y la distribución del producto se determinaron por HPLC. Las cepas de las colonias individuales se identificaron con un subfijo "-x" numerado, p. ej., AA200-pKP1-x. Los resultados acumulativos se presentan en la Tabla 3 y la Tabla 4.

TABLA 3

3

TABLA 4

4

Ejemplo 3

Conversión de D-glucosa en 1,3-propanodiol por la cepa DH5\alpha de E. coli, transformada con ADN de Klebsiellia pneumoniae que contiene actividad de deshidratasa

Se determinó la capacidad de la cepa DH5\alpha de E. coli, que contenía los cósmidos pKP1 o pKP2 del regulón de K. pneumoniae dha, para convertir D-glucosa en 1,3-propanodiol como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

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5

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Ejemplo 4

Conversión de D-glucosa en 1,3-propanodiol por la cepa ECL707 de E. coli, transformada con ADN de Klebsiellia pneumoniae que contiene actividad de deshidratasa

Se determinó la capacidad de la cepa ECL707 de E. coli, que contenía los cósmidos pKP1 o pKP2 del regulón K. pneumoniae dha, el operón pKP4 de K. pneumoniae pdu o el vector Supercos solo, para convertir la D-glucosa en 1,3-propanodiol como se describe en el Ejemplo 2. En cada caso, la conversión fue cuantitativa. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6

6

Ejemplo 5

Dos etapas de conversión de D-glucosa en 1,3-propanodiol por AA200-kP1-5 de Escherichia coli

Se inocularon colonias individuales de AA200-pKP1-5 en matraces tabicados (250 ml) que contenían 50 ml de medio LB-amp. Las células se cultivaron, por duplicado, durante la noche a 30 o 37ºC con agitación (250 rpm).

Se centrifugaron cultivos en desarrollo (10 minutos, 10.000 rpm, 4ºC) y se volvieron a poner en suspensión en el medio de producción sin glucosa (10 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}; tampón de fosfato potásico 5 mM, pH 7,5; MOPS 50 mM, pH 7,5; extracto de levadura al 0,01%; casaminoácidos al 0,01%; 0,8 \mug/ml de vitamina B_{12}; y 50 \mug/ml de ampicilina) que contenía vestigios de metales A: (CoCl_{2} 0,08 \muM, CuCl_{2} 0,06 \muM, FeSO_{4} 7 \muM, H_{3}BO_{4} 2 \muM, MnCl_{2} 0,2 \muM, Na_{2}MoO_{4} 0,1 \muM, NiCl_{2} 0,08 \muM, ZnSO_{4} 0,3 \muM y tiamina 0,03 mM) o vestigios de metales B: (CaCl_{2} 0,7 mM, CoCl_{2} 2,53 \muM, CuSO_{4} 1,72 \muM, FeCl_{3} 1,0 \muM, MgCl_{2} 2 mM, MnCl_{2} 0,05 mM, Na_{2}MoO_{4} 2,42 \muM, ZnCl_{2} 1,0 \muM y tiamina 0,03 mM). Se centrifugaron las células una segunda vez, se volvieron a poner en suspensión en 50 ml de medio de producción reciente que contenía D-glucosa y se distribuyó en frascos de suero de 60 ml que se taparon y se sellaron con septum de caucho butilo. Se agitaron los frascos (250 rpm) y se extrajeron muestras con una jeringuilla a través del septum y se filtraron a través de un filtro de 0,2 p antes del análisis. Los resultados se presentan en la Tabla 7 y la Tabla 8;la glucosa residual se determinó por análisis enzimático (Biochemistry Analyzer, Yellow Springs Instruments Co., Inc.) y el 1,3 propanodiol se analizó por HPLC.

TABLA 7

7

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TABLA 8

8

Ejemplo 6

Conversión de D-glucosa en 1,3-propanodiol por Klebsiella pneumoniae ECL2106 pero no por Klebsiella pneumoniae ATCC 25955

Frascos de vidrio con suero, llenos hasta su capacidad (aprox. 14 ml) con medio, se inocularon ligeramente en una placa con LB agar-agar que contenía ECL2106 de K. pneumoniae o ATCC 25955 de K. pneumoniae. El medio contenía glucosa 50 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 3 mM, CaCl_{2} 0,9 mM, CoCl_{2} 4 \muM, CuCl_{2} 0,06 \muM, FeSO_{4} 7 \muM, H_{3}BO_{4} 2 \muM, MgSO_{4} 0,8 mM, MnCl_{2} 0,2 \muM, Na_{2}MoO_{4} 0,1 \muM, NiCl_{2} 0,08 \muM, ZnSO_{4} 0,3 \muM, 0,1 mg/ml de DL-cisteína, ácido etilendiamintetraacético 10 \muM, 0,8 \mug/ml de vitamina B_{12}, fosfato potásico como se indica en la Tabla 9 y HEPES 50 mM o tampón MOPS 50 mM, pH 7,5. Se incubaron las reacciones durante 47 h a 30ºC agitando a 250 rpm. De otra manera, la reacción se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados se dan en la Tabla 9.

TABLA 9

9

Ejemplo 7

Producción de 1,3-propanodiol por Pichia pastoris recombinante Construcción del plásmido de expresión universal

El fragmento EcoR1/Xba1 de 0,9 kb en pHIL-D4 (Phillips Petroleum, Bartlesville, OK) se sustituyó por el fragmento EcoR1/Xba1 de 0,9 kb procedente del pAO815 (Invitrogen, San Diego, CA) para generar el plásmido pHIL-D4B2 que contiene los siguientes elementos: 5'AOX1, activador alcohol oxidasa I (AOX1) inducible por metanol de P. pastoris; término de AOX1, zona de terminación de transcripción de AOXI de P. pastoris ; gen que codifica la histidinol deshidrogenasa de HIS4, P. pastoris para la selección en hospedadores his4; kan, secuencia procedente del transposón Tn903 que codifica la aminoglucósido 3'-fosfotransferasa, que proporciona resistencia a la kanamicina, neomicina y G418 en una amplia variedad de hospedadores, y es útil como indicador de número de copia del casete, 3'AOX1, P. pastoris secuencia aguas abajo de AOX1, utilizada junto con 5'AOX1 para la integración del vector dirigida al sitio; ori, origen en el pBR322 de la replicación del ADN que permite manipulaciones del plásmido en E. coli; y amp, gen de \beta-actainasa procedente del pBR322 que proporciona resistencia a la ampicilina. Una característica adicional de pHIL-D4B2 es que los casetes de expresión múltiple (5'AOX1 - gene - AOX1term) pueden colocarse fácilmente en un plásmido subclonando casetes en fragmentos de Bg12/Xba1 en las secuencias BamH1/
Xba1.

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Construcción de plásmido para la coexpresión de dhaB1 y dhaB2

Los marcos de lectura abiertos para dhaB1 y dhaB2 se ampliaron a partir del cósmido pKP1 utilizando cebadores de PCR (SEQ. ID. nº: 2 con SEQ. ID. nº: 3 y SEQ. ID. nº: 4 con SEQ. ID. nº: 5 para dhaB1 y dhaB2, respectivamente) incorporando secuencias EcoR1 en los extremos 5' (Tris 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,0001%, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dGTP 200 \muM, dTTP 200 \muM, cada cebador 1 \muM, 1-10 ng de ADN diana, 25 unidades/ml de Amplitaq® ADN polimerasa Perkin Elmer Cetus, Norwalk CT). Los parámetros de PCR fueron 1 min. a 94ºC, 1 min. a 55ºC,1 1 min. a 72ºC, 35 ciclos. Se subclonaron los productos en la secuencia EcoR1 de pHIL-D4B2 para generar los plásmidos de expresión pMP19 y pMP20 que contenían dhaB1 y dhaB2, respecti-
vamente.

El casete de expresión dhaB1 en un fragmento Bg12/Xba1 procedente de pMP19 se subclonó en la secuencia BamH1/Xba1 de pMP20 para generar el pMP21. El plásmido pMP21 contiene los casetes de expresión tanto para dhaB2 como para dhaB1 y el marcador seleccionable HIS4.

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Construcción de plásmido para la coexpresión de dhaB3 y dhaT

Los marcos de lectura abiertos para dhaT y dhaB3 se ampliaron por PCR a partir del cósmido pKP1 utilizando cebadores (SEQ. ID. nº: 6 con SEQ. ID. nº: 7 y SEQ. ID. nº: 8 con SEQ. ID. nº: 9 para dhaT y dhaB3, respectivamente) incorporando las secuencias EcoR1 en los extremos 5'. Se subclonaron los productos en la secuencia EcoR1 de pHIL-D4B2 para generar los plásmidos de expresión pMP17 y pMP18 que contenían dhaT y dhaB3, respectivamen-
te.

El casete de expresión dhaT en un fragmento Bg12/Xba1 procedente del pMP17 se subclonó en la secuencia BamH1/Xba1 del pMP18 para generar el pMP22 que contiene casetes de expresión tanto para dhaT como para
dhaB3.

El fragmento EcoR1 de 4,1 kb que contenía SUC2 se eliminó de pRK20 (Phillips Petroleum, Bartlesville, OK) para generar el pMP2. SUC2 codifica una invertasa que puede utilizar un segundo marcador seleccionable en Pichia. El fragmento Hind3 de 4,0 kb que contenía lacZ se eliminó del pMP2 para generar el pMP3. El fragmento Hind3 de 0,4 kb que contenía el término AOX1 de pHIL-D4 se subclonó en la secuencia Hind3 del pMP3 para generar el pMP10.

El fragmento Bg12/Xba1 de 2,0 kb en el pMP10 fue sustituido por el fragmento Bg12/Xba1 de 5,0 kb que contenía los casetes de expresión dhaB3 y dhaT procedentes de pMP22 para generar pMP23. El fragmento Pst1/Bg12 de 5,4 kb que contenía SUC2 procedente de pRK20 se subclonó en las secuencias Pst1/Bg12 del pSP73 (Promega, Madison, WI) para generar el pMP11a. El plásmido pMP11a se cortó con EcoR1, se rellenó con T4 ADN polimerasa y se volvió a ligar para generar pMP11b. El fragmento Pst/Bg12 de 1,1 kb en pMP10 fue sustituido por el fragmento Bg12/Pst1 de 5,4 kb que contenía SUC2 procedente del pMP11b para generar el pMP12.

El fragmento Sca1/Bg12 de 1,0 kb en el pMP23 fue sustituido por el fragmento Sca1/Bg12 de 5,2 kb que contenía SUC2 procedente del pMP12 para generar el pMP24. El plásmido pMP24 contiene los casetes de expresión tanto para dhaT como para dhaB3 y el marcador seleccionable SUC2.

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Transformación de P. pastoris con el plásmido pMP21 de expresión de daB1/dhaB2

La cepa GTS115(his4) de P. pastoris (Phillips Petroleum, Bartlesville, OK) se transformó con 1 a 2 \mug de plásmido pMP21 linealizado con Bg12 utilizando el método de transformación spheroplast descrito por Cregg et al., (Mol. Cell. Biol. 5, 3376, (1985)). Se regeneraron las células en placas sin histidina durante 3 a 4 días a 30ºC. Todos los transformados se producen después de la integración del ADN plásmido en el cromosoma. Los transformados se parchearon sobre una placa modelo con YPD (extracto de levadura Bacto al 1%, peptona al 2%, glucosa al 2%).

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Identificación de transformados de P. pastoris para dhaB1 y dhaB2

Se preparó el ADN cromosómico a partir de sus transformados ^{+} descritos anteriormente y se sometieron a análisis de PCR con cebadores específicos para dhaB1 y dhaB2. Se seleccionaron cepas con número de copias elevado a partir de transformados que contenían tanto dhaB1 como dhaB2 por cultivo en medio YPD enriquecido con concentraciones crecientes de G418 (Sigma, St. Louis, MO) hasta 2000 \mug/ml. La resistencia a una alta concentración de G418 sugiere duplicación significativa de casetes de expresión.

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Transformación secundaria de P. pastoris con plásmido de expresión pMP24 para dhaB3/dhaT

Se volvieron a transformar los transformados con resistencia a una alta concentración de G418 como se describió anteriormente con el plásmido pMP24 utilizando el método de transformación spheroplast. Se regeneraron en primer lugar las células en placas no selectivas durante 2 días a 30ºC, tras lo cual agar-agar en la parte superior que contenía células regeneradas se raspó de la placa y se agitó extensamente en 20 ml de agua. Tras pasar a través de 4 pliegues de estopilla, se sedimentaron las células por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 10 ml de agua. Se colocaron en placas de sacarosa alícuotas de 200 \mul y se incubaron durante 2 días a 30ºC. Todos los transformados se producen después de la integración del ADN plásmido en el cromosoma. Los transformados aparecen en forma de grandes colonias en un fondo de pequeñas colonias, y requieren aislamiento. Después de 24 h se cultivó con agitación a 30ºC en medio Msu (por l, 13,4 g de base nitrogenada de levadura y/o aminoácidos, 10 g de sacarosa, 0,4 g de biotina), los transformados se rayaron en las placas con Msu (medio Msu más 15 g/l de agar-agar) y se cultivó durante 2 días a 30ºC. Se parchearon colonias grandes aisladas sobre una placa modelo YPD.

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Identificación de transformados dobles de P. pastoris para dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT y sus correspondientes actividades enzimáticas

Se preparó el ADN cromosómico a partir de transformados dobles de suc^{+} descritos anteriormente y se sometieron a análisis de PCR con cebadores específicos para dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT. Así, se confirmó la presencia de los cuatro marcos de lectura abiertos.

Se demostró la presencia de glicerol deshidratasa activa (dhaB) y 1,3-propanodiol oxido-reductasa (dhaT) utilizando análisis enzimático in vitro. Además, el análisis por inmunotransferencia Western confirmó la expresión de la proteína a partir de los cuatro marcos de lectura abiertos. Se prepararon extractos exentos de células para estas caracterizaciones de proteínas de la manera siguiente. Transformados dobles que contenían dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT se cultivaron en medio aerobio con agitación a 30ºC en MGY (Por l., 13,4 g de base nitrogenada de levadura w/o aminoácidos, 0,4 mg de biotina, 10 ml de glicerol) durante 2 días. Se sedimentaron las células por centrifugación, se volvieron a poner en suspensión en MM (Por l, 13,4 g de base nitrogenada de levadura w/o aminoácidos, 0,4 mg de biotina, 5 ml de glicerol) y se incubaron como anteriormente. Después de aproximadamente 24 h, las células se recogieron, se volvieron a poner en suspensión en tampón (tampón triceno 0,1 M/KOH, pH 8,2, KCl 50 mM y 1,2-propanodiol al 2%), se destruyeron mecánicamente (utilizando una varilla de vidrio mientras se agitaba en presencia de bolitas de vidrio) y se centrifugó.

Una cepa que se mostró positiva a la presencia de los cuatro marcos de lectura abiertos (dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT) y sus correspondientes actividades se denominó MSP42.81 y se seleccionó para un estudio posterior.

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Producción in vivo de 1,3-propanodiol utilizando Pichia pastoris recombinante

Se cultivó MSP42.81 (ATCC 74363) de P. pastoris en un fermentador BiostatB (B Braun Biotech, Inc.) en 1,5 l de medio mínimo que contenía 8,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 2,1 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/l de glicerol, 2,3 g/l de MgSO_{4}7H_{2}O, 0,18 g/l de CaSO_{4}\cdot2H_{2}O y 0,29 ml/l de PTMI. PTNB es una solución madre mineral que contiene CuSO_{4} 24 mM, KI 4,8 mM, MnSO_{4} 18 mM, Na_{2}MoO_{4} 0,8 mM, H_{3}BO_{3} 0,3 mM, CoCl_{2} 2,1 mM, ZnSO_{4} 70 mM, H_{2}SO_{4} 26 mM, FeSO_{4} 234 mM y biotina 0,8 mM. El fermentador se controló a pH 5,0 con adición de NH_{4}OH 2 M, 30ºC y 30% de tensión de oxígeno disuelto por control de la agitación. Un cultivo de MSP42.81 de P. pastoris cultivado en caldo de cultivo YM a 30ºC se utilizó como inóculo; Se utilizaron 20 ml del cultivo para inocular el fermentador.

Cuando se vio que el glicerol se había eliminado (24 h después de la inoculación), se inició la inducción de los activadores de AOX mediante la adición de un alimento con metanol. El alimento contenía 1 litro de metanol, 5 ml de PTMI y 5 ml de una solución madre de biotina preparada en forma de 0,2 g/l en agua. La solución de metanol se añadió manualmente para mantener una concentración media de 0,5% determinada por análisis HPLC. Cincuenta ml de células (D.O._{600} = 20 AU) se extrajeron del reactor después de 15 h de inducción.

Los 50 ml de suspensión celular se sedimentaron y se volvieron a poner en suspensión en 12,5 ml de medio básico barboteado con nitrógeno (6,7 g/l de base nitrogenada de levadura, 3,0 g/l de extracto de levadura, 1,0 g/l de K_{2}HPO_{4}, 1,0 g/l de KH_{2}PO_{4}, 3,0 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, valorado hasta pH 7,2 y esterilizado por filtración). La coenzima B_{12}, preparada como solución madre a 2 mg/ml en agua barboteada con nitrógeno, se añadió a la suspensión celular para dar una concentración final de 20 \mug/ml. Se prepararon tres soluciones madre del medio en medio básico que contenía 1% de glucosa, 0,5% de glucosa, 0,5% de glicerol (p/v) y 1,0% de glicerol (p/v). Se preparó también una solución madre de cloroquina (1,06 g/50 ml, pH 7,2).

Dos ml de las soluciones madre del medio y 1 ml de mezclas de cloroquina y agua para dar las concentraciones finales listadas en la Tabla 10 se colocaron en frascos de suero de 10 ml engastados y barboteados con nitrógeno antes de añadir 1 ml de células con mezcla de coenzima B_{12}. Los frascos de suero se incubaron a 30ºC con agitación. Las muestras tomadas inmediatamente tras la adición de células y después de 24 h de incubación se analizaron por HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

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TABLA 10

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10

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Ejemplo 8

Utilización de un transformado doble de Pichia pastoris para la producción de 1,3-propanodiol a partir de D-glucosa

Se cultivó MSP42.81 de P. pastoris en un fermentador BiostatB (B Braun Biotech, Inc.) en 1,5 l de medio mínimo que contenía 8,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 2,1 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/l de glucosa, 2,3 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,18 g/l de CaSO_{4}\cdot2H_{2}O y 0,29 ml/l PTMI. De otra manera, las condiciones de fermentación e inducción eran idénticas a las descritas en el Ejemplo 7. Cincuenta ml de células se extrajeron del reactor después de 15 h de inducción.

La suspensión celular se manipuló como se describe en el Ejemplo 7, a excepción de que se utilizó un medio básico modificado (6,7 g/l de base nitrogenada de levadura, 1,0 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de (NH_{4})_{2}
SO_{4}, valorado hasta pH 7,2 y esterilizado por filtración). Se prepararon tres soluciones madre del medio también en este medio básico modificado. Todas las demás soluciones eran iguales. Se prepararon mezclas de reacción como se describe y se incubaron a 30ºC con agitación. Las muestras tomadas inmediatamente tras la adición de células y después de 75 horas de incubación se analizaron por HPLC. En una reacción que contenía glucosa como fuente de carbono y cloroquina 5 mM, se produjo 1,3 propanodiol 0,17 mM.

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Ejemplo 9

Construcción de plásmido para la transformación y expresión de dhaB y dhaT en Saccharomyces cerevisiae Construcción de plásmidos de expresión universal

Se crearon dos tipos de plásmidos de expresión, los que podían integrarse por recombinación en los cromosomas y los que podían existir como elementos episómicos de replicación. Para cada tipo de plásmido de expresión general estaba presente un activador de levadura y separado de un terminador de transcripción de la levadura por fragmentos de puntos de reconocimiento que contienen ADN para una o más endonucleasas de restricción. Cada tipo de plásmido de expresión general contenía también el gen para la \beta-lactainasa destinado a la selección en E. coli en el medio que contiene ampicilina, un origen de replicación para el mantenimiento del plásmido en E. coli, y un origen de replicación de 2 micras para elementos episómicos o secuencias homólogas a las encontradas en los cromosomas de S. cerevisiae para la recombinación e integración del ADN introducido en los cromosomas. Los marcadores nutritivos seleccionables utilizados para levaduras y presentes en los plásmidos de expresión fueron uno de los siguientes: el gen HIS3 que codifica la imidazolglicerolfosfato deshidratasa, el gen URA3 que codifica la orotidina 5'-fosfato decarboxilasa, el gen TRP1 que codifica la N-(5'-fosforribosil)-antranilato isomerasa y el gen LEU2 que codifica la \beta-isopropilmalato deshidrogenasa. Los activadores de levadura utilizados fueron ADH1 o GAL1, y los terminadores de transcripción ADH1, CYC1 o AOX1; este último procedente de Pichia pastoris.

El plásmido pGADGH (Clontech, Palo Alto, CA) se digirió con HindIII y los extremos monocatenarios convertidos en extremos EcoRI por ligadura con los adaptadores HindIII-XmnI y EcoRI-XmnI (New England Biolabs, Beverly, MA). La selección de plásmidos con extremos EcoRI correctos se consiguió por ligadura a un gen con resistencia a la kanamicina en un fragmento EcoRI del plásmido pUC4K (Pharmacia Biotech, Uppsala), por transformación en la cepa DH5\alpha de E. coli y en la selección en placas LB que contenían 25 \mug/ml de kanamicina. El plásmido resultante (pGAD/KAN2) se digirió con SnaBI y EcoRI y se aisló un fragmento de 1,8 kb con el activador ADH1. Se digirió el plásmido pGBT9 (Clontech, Palo Alto, CA) con SnaBI y EcoRI y se sustituyó el fragmento ADH1/GAL4 de 1,5 kb por el fragmento del activador ADH1 de 1,8 kb aislado del pGAD/KAN2 por digestión con SnaBI y EcoRI. El vector resultante (pMCK11) es un plásmido replicador en levadura con el activador ADH1 y terminador y un marcador
TRP1.

El plásmido pGADGH se digirió con SnaBI e HindIII y un fragmento de 1,8 kb que contenía el activador ADH1 aislado. Este fragmento estaba ligado en el vector pRS405 (Stratagene, La Jolla, CA) previamente digerido con SmaI e HindIII. Se identificaron los clones positivos por inactivación de la inserción del péptido lacZ alfa codificado por el plásmido y la presencia del fragmento activador ADH1. El plásmido (pMCK4) resultante contenía un activador ADH1 y un marcador LEU2.

El fragmento NaeI-EcoRI de 0,2 kb procedente del pGBT9 que contenía el terminador ADH1 se ligó al pRS403 digerido con EcoRI-HincII (Stratagene, La Jolla, CA) para dar el plásmido pRVN5 de \sim4,8 kb. El fragmento SnaBI-EcoRI de 2,0 kb procedente del pGAD/KAN2 que contenía el activador ADH1 se ligó al pRVN5 digerido con SmaI-EcoRI para dar el plásmido pRVN6 de \sim6,8 kb con el activador y terminador ADH1 y una zona de clonación EcoRI único entre ellos.

El fragmento HindIII de 0,4 kb o del pGADGH que contiene el fragmento XmnI adicional se eliminó y el vector se volvió a ligar para dar el vector pGAD-D3 de 7,0 kb. El vector pGAD-D3 se digirió con XmnI y el fragmento de \sim2,4 kb que contenía el activador y terminador ADH1 y se purificó una zona de clonación HindIII interventora. El vector pRS404 (Stratagene, La Jolla, CA) se digirió con PvuII y el fragmento mayor de 3,8 kb con TRP1 se purificó y se ligó al activador XmnI y al fragmento terminador procedente del pGAD-D3 para dar el plásmido pRVN11.

Los marcos de lectura abiertos para dhaT, dhaB3 y dhaB1 se ampliaron a partir del pHK28-26 (SEQ. ID. nº 1) utilizando cebadores de PCR (SEQ. ID. nº: 6 con SEQ. ID. nº: 7, SEQ. ID. nº:8 con SEQ. ID. nº:9 y SEQ. ID. nº: 2 con SEQ. ID. nº: 3 para dhaT, dhaB3 y dhaB1 respectivamente) incorporando zonas EcoR1 en los extremos 5' (Tris 10 mM pH 8,3, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,0001%, dATP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dGTP 200 \muM, dTTP 200 \muM, cada cebador 1 \muM, 1-10 ng de ADN diana, 25 unidades/ml de Amplitaq® ADN polimerasa (Perkin Elmer Cetus, Norwalk CT). Los parámetros de la PCR fueron 1 min. a 94ºC, 1 min. a 55ºC,1 min. a 72ºC, 35 ciclos. Se subclonaron los productos en la zona EcoR1 de pHIL-D4 (Phillips Petroleum, Bartlesville, OK) para generar los plásmidos pMP13, pMP14 y pMP15 que contenían dhaT, dhaB3 y dhaB1, respectivamente.

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Construcción de plásmidos para la expresión de dhaT

El plásmido replicador pGAD/KAN2 se digirió con EcoRI para eliminar el fragmento con resistencia a la kanamicina, se desfosforiló y se ligó al fragmento EcoRI de dhaT procedente del pMP13. El plásmido resultante (pMCK13) había orientado correctamente dhaT para la transcripción del activador ADH 1 y contenía un marcador LEU2.

El plásmido pRNV6 se digirió con EcoRI y se ligó al fragmento EcoRI de dhaT procedente del pMP13. El plásmido resultante (pRVN6T) había orientado correctamente dhaT para la transcripción del activador ADH1 y contenía un marcador HIS3.

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Construcción de plásmidos para la expresión de dhaB1

El plásmido replicador pGADGH se digirió con HindIII, se desfosforiló y se ligó al fragmento HindIII de dhaB1 procedente del pMP15. El plásmido resultante (pMCK10) había orientado correctamente dhaB1 para la transcripción del activador ADH1 y contenía un marcador LEU2.

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Construcción de plásmidos para la expresión de dhaB2

El plásmido replicador pMCK11 se digirió con EcoRI, se desfosforiló y se ligó al fragmento EcoRI de dhaB2 procedente del pMP20. El plásmido resultante (pMCK17) había orientado correctamente dhaB2 para la transcripción del activador ADH1 y contenía un marcador TRP1.

El plásmido pRS403 se digirió con SmaI y se ligó a un fragmento SnaBI/NaeI de dhaB2 procedente del puck17. El plásmido resultante (pMCK21) había orientado correctamente dhaB2 para la transcripción del activador ADH1 y contenía un marcador HIS3.

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Construcción de plásmidos para la expresión de dhaB3

El plásmido replicador pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) se digirió con EcoRI, se desfosforiló y se ligó al fragmento EcoRI de dhaB3 procedente del pMP14. El plásmido resultante (pMCK1) había orientado correctamente dhaB3 para la transcripción del activador GAL1 y contenía un marcador URA3.

El plásmido replicador pGAD/KAN2 se digirió con EcoRI, se desfosforiló y se ligó al fragmento EcoRI de dhaB3 procedente del pMP14. El plásmido resultante (puck15) había orientado correctamente dhaB3 para la transcripción del activador ADH1 y contenía un marcador LEU2.

El plásmido pRS404 se digirió con Pst y HincII y se ligó al PstI/EeoRV del dhaB3 fragmento procedente del pMCK15. El plásmido resultante (pMCK20) había orientado correctamente dhaB3 para la transcripción del activador ADH1 y contenía un marcador TRP1.

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Transformación de S. cerevisiae con plásmidos de expresión de dha

La cepa YPH499 de S. cerevisiae (ura3-52 lys2-801 ade2-101 typl-del63 his3-del200 leu2-dell) (Stratagene, La Jolla, CA) se transformó con 1 a 2 \mug de ADN plásmido utilizando un protocolo de LiCl/polietilenglicol publicado por Stratagene (nº de catálogo 217406). Alternativamente, la transformación se consiguió utilizando un Frozen-EZ Kit de Transformación de levaduras (nº de catálogo T2001) de Zymo Research (Orange, CA). Se cultivaron colonias en medio mínimo enriquecido (SMM - base nitrogenada de levadura al 0,67% sin aminoácidos, glucosa al 2%) durante 3 a 4 días a 29ºC con una o más de las siguientes adiciones: sulfato de adenina (20 mg/l), uracilo (20 mg/l), L-triptófano (20 mg/l), L-histidina (20 mg/l), L-leucina (30 mg/l), L-lisina (30 mg/l). Se rayaron las colonias en placas selectivas y se utilizaron para inocular el medio líquido. Dependiendo del vector utilizado, las colonias aparecieron tras la integración del ADN plásmido o en la replicación de un episoma. Además de las transformaciones con tipos de plásmidos individuales, se realizaron transformaciones conjuntas con dos o más plásmidos.

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Expresión de la actividad de dhaB en S. cerevisiae transformada

La cepa YPH499 transformada con los plásmidos pMCK1, pMCK10 y pMCK17 se cultivó en medio mínimo enriquecido que contenía base nitrogenada de levadura al 0,67% sin aminoácidos, galactosa al 2%, rafinosa al 2%, 20 mg/l de sulfato de adenina, 30 mg/l de L-lisina y 20 mg/l de histidina. Las células se homogeneizaron y se analizó la actividad de dhaB en los extractos. Se obtuvo una actividad específica de 0,021 unidades por mg.

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Ejemplo 10

Construcción de plásmidos de replicación e integración alternativos para la transformación de S. cerevisiae

Se construye un plásmido de expresión universal aislando un fragmento SnaBI/EcoRI de activador ADH1 procedente del pGAD/KAN2 y ligando este fragmento en el vector pRS406 (Stratagene, La Jolla, CA) digerido previamente con HincII y EcoRI. Se identificaron los clones positivos por inactivación de la inserción del péptido lacZ alfa codificado por el plásmido y la presencia del fragmento del activador ADH1. El plásmido resultante (pMCK3) se digiere con EcoRI y SmaI y se liga al fragmento del terminador ADH1 de 0,2 kb liberado del plásmido pGBT9 por digestión con EcoRI y NaeI. El plásmido resultante (pMCK5) contiene las secuencias tanto del activador y terminador ADH1 como de un marcador URA3.

Construcción de plásmidos para la expresión de dhaT

El vector pMCK5 se digiere con EcoRI y se desfosforila. El gen dhaT se escinde como un fragmento EcoRI a partir del plásmido pMP13 y se liga al pMCK5. El plásmido resultante (pMCK7) había orientado correctamente dhaT para la transcripción del activador ADH1 y contenía un marcador URA3.

El vector de integración pRS404 se digiere con KpnI y SacI. El gen dhaT con el activador y el terminador flanqueantes se escinde como un fragmento KpnI/SacI del plásmido pMCK7 y se liga al pRS404. El plásmido resultante ha orientado correctamente dhaT para la transcripción del activador ADH1 y contiene un marcador TRP1.

Construcción de plásmidos para la expresión de dhaB1

El vector pMCK5 se digiere con EcoRI y se desfosforila. El gen dhaB1 se escinde del plásmido pMP15 como un fragmento EcoRI y se liga al pMCK5. El plásmido resultante (pMCK8) ha orientado correctamente dhaB1 para la transcripción del activador ADH1 y contiene un marcador URA3.

El vector de integración pRS403 se digiere con ClaI y AatII. El gen dhaB1 con el activador y el terminador flanqueantes se escinde como un fragmento ClaI/AatII del plásmido pMCK8 y se liga al pRS403. El plásmido resultante ha orientado correctamente dhaB1 para la transcripción del activador ADH1 y contiene un marcador HIS3.

El plásmido replicador pYES2 se digiere con HindIII y SnaBI, y el elemento activador GAL1 se sustituye por ligadura con un fragmento del activador ADH1 digerido con SnaBI y HindIII procedente del pGADGH. Un fragmento HindIII y XbaI de dhaB1 procedente del pMP19 se liga a aquellas zonas en la modificada, versión del activador ADH1 del pYES2. El plásmido resultante ha orientado correctamente dhaB1 para la transcripción del activador ADH1 y contiene un marcador URA3.

El vector pMCK4 se digiere con HindIII y se desfosforila. El gen dhaB1 se escinde del plásmido pMP15 como un fragmento HindIII y se liga al pMCK4. El plásmido resultante ha orientado correctamente dhaB1 para la transcripción del activador ADH1 y contiene un marcador LEU2.

Construcción de plásmidos para la expresión de dhaB2

Los vectores pRS404, pRS405 y pRS406 se digieren con SmaI. El gene dhaB2 con activador y terminador flanqueantes se escinde como un fragmento SnaBI/NaeI del plásmido pMCK17 y se liga a cada uno de los vectores de integración. Los plásmidos resultantes han orientado correctamente dhaB2 para la transcripción del activador ADH1 y contienen los marcadores LEU2, TRP1 o URA3.

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Ejemplo 11

Identificación de S. cerevisiae para los transformados de dha y conversión de D-glucosa en 1,3-piranodiol Identificación de S. cerevisiae para los genes dha

El ADN cromosómico procedente de transformados de Ura^{+}, His^{+}, Trp^{+} o Leu^{+}, construido como se describe en los Ejemplos 9 y10, se analiza por PCR utilizando cebadores específicos para cada gen, como se describe para Pichia pastoris (SEQ. ID. nº 2-9).

Producción de 1,3-propanodiol a partir de D-glucosa por S. cerevisiae transformada con genes dha

Transformados que contienen dhaT, dhaB1, dhaB2 y dhaB3, construidos como se describe en los Ejemplos 9 y 10, se cultivan aeróbica o anaeróbicamente con agitación a 29ºC en SMM enriquecido con 20 mg/l de sulfato de adenina, 30 mg/l de L-lisina, 1 mg/l de vitamina B_{12}. El crecimiento continua hasta que se alcanza la fase estacionaria y se determina por HPLC la presencia de 1,3-propanodiol. El transformado del pMCKI/10/17(HM)#A de S. cerevisiae se depositó y se denominó ATCC 74370.

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Ejemplo 12

Producción de 1,3-propanodiol a partir de D-glucosa por ATCC 6013 de Clostridium pasteurianum bajo una atmósfera de hidrógeno Condiciones generales de crecimiento para Clostridium pasteurianum

Se cultivó la ATCC 6013 de Clostridium pasteurianum en frascos de suero de 60 ml engastados que contenían 10 ml de medio, a menos que se indique. Los frascos engastados que contenían el medio se rociaron asépticamente con nitrógeno antes de la inoculación. El medio basal (medio A), ajustado a pH 7,2, contenía los siguientes componentes en g/l: KH_{2}PO_{4}, 1,4; NaH_{2}PO_{4}, 0,69; NH_{4}Cl, 1,8-2,5; KCl, 0,50; MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,50; CaCl_{2}, 0,025; NaCl, 1,0; extracto de levadura, 2,0; cisteína\cdotHCl, 0,50; bicarbonato sódico, 2,5; ácido p-amino benzoico, 0,0080; biotina, 0,000040; citrato sódico\cdot2H_{2}O, 0,10; FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,050; CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,010; MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,0010; ZnCl_{2}, 0,00050; Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 0,0025; NiCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,010; y CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,0050; al que se añadieron los componentes de carbono indicados a continuación. Todas las incubaciones se realizaron a 30ºC con agitación a 250 rpm.

Un lote de 10 ml de Medio A enriquecido con 5% de glucosa se inoculó con 1 ml de una solución madre helada de ATCC 6013 de Clostridium pasteurianum que contenía aproximadamente 15% (v/v) de glicerol, por duplicado. Después de 96 h, 0,5 ml de las suspensiones de las células en crecimiento se pasaron en 10 ml de medio reciente y se continuó el crecimiento. Después de 24 h, se presurizó la atmósfera en los viales recién inoculados a 2 atm. con gas hidrógeno y la incubación se continuó durante 96 h más. Se tomaron muestras de la fase acuosa al comienzo y al final de las 96 h finales para análisis por HPLC como se describe en los Métodos Generales. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

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TABLA 11

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Ejemplo 13

Producción de 1,3-propanodiol a partir de D-glucosa por ATCC 6013 de Clostridium pasteurianum en presencia de metil viológeno

Experimento 1

Todas las células se cultivaron según las protocolo en el Ejemplo 12. Un lote de 10 ml de Medio A (descrito en el Ejemplo 12) enriquecido con 5% de glucosa se inoculó con 1 ml de una solución madre helada de ATCC 6013 de Clostridium pasteurianum que contenía aproximadamente 15% (v/v) de glicerol, por duplicado. Después de 96 h, 0,5 ml de las suspensiones de las células en crecimiento se pasaron en 10 ml de medio reciente y se continuó el crecimiento. Después de 24 h, se añadió metil viológeno (dicloruro de 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridinio) a los viales recién inoculados hasta una concentración final de 1 mM y la incubación se continuó durante 96 h más. Se tomaron muestras de la fase acuosa al comienzo y al final de las 96 h finales para análisis por HPLC como se describe en los Métodos Generales. Los resultados se muestran en la Tabla 12.

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TABLA 12

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Experimento 2

Medio A enriquecido con 1% (v/v) de glicerol + 1% (p/v) de glucosa se inoculó en una solución madre congelada de ATCC 6013 de Clostridium pasteurianum que contenía aproximadamente 15% (v/v) de glicerol, en una proporción de 0,2 ml de solución madre congelada por 20 ml de medio. Después de 48 h, se añadieron 10 ml de la suspensión celular a 90 ml de medio reciente y el crecimiento se continuó durante 24 h. Los 100 ml de suspensión celular se enfriaron en hielo y las células se recogieron por centrifugación en condiciones anaerobias. Las células se lavaron 3 veces en tampón anaerobio (tampón fosfato 50 mM, pH 7,2 + 0,5 g/l de cisteína\cdotHCl, previamente gasificado con N_{2} y esterilizado bajo N_{2}) y se volvieron a poner en suspensión en tampón anaerobio hasta un volumen de 8 ml. En los experimentos por duplicado, se inoculó un ml de esta suspensión celular en 10 ml de Medio A enriquecido con glucosa al 1% y metil viológeno 0 mM, 1 mM, 5 mM o 10 mM y se incubó durante 240 h. Se tomaron muestras de la fase acuosa al principio y al final de las 240 h finales para análisis por HPLC como se describe en los Métodos Generales. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

TABLA 13

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13

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Experimento 3

La ATCC 6013 de Clostridium pasturanium se mantuvo inicialmente en medio de tioglicolato (Difco®) y se transfirió al Medio A enriquecido con glucosa al 0,4% para todos los estudios posteriores. Después de varias transferencias a través de este último medio, se preparó un inóculo cultivando una alícuota de 1 ml de cultivo madre en 10 ml del medio descrito, durante la noche. Una serie de frascos de suero que contenían metil viológeno en las concentraciones indicadas en la Tabla 14 en frascos con medio reciente se inocularon con 1 ml del cultivo de toda la noche y se incubaron de nuevo durante los tiempos indicados en la Tabla 14. Se tomaron muestras periódicamente de los frascos para la utilización de la glucosa y se analizó la presencia de 1,3-propanodiol y de glucosa por HPLC como se describe en los Métodos Generales. La Tabla 14 resume los resultados analíticos.

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TABLA 14

14

Ejemplo 14

Construcción de plásmidos de expresión universal para su utilización en la transformación de Bacillus. Especies Streptomyces y Pseudomonas El vector de expresión pTacIQ

El vector de expresión de E. coli, pTacIQ contiene el gen lacIq (Farabaugh, Nature 274, 5673 (1978)) y el activador tac (Amann et al., Gene 25, 167 (1983)) insertado en el EcoRI del pBR322 (Sutcliffe et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 43, 77 (1979)). Una zona de clonación múltiple y la secuencia del terminador (SEQ. ID. nº: 10) sustituye a la secuencia del pBR322 desde EcoRI hasta SphI.

Subclonación de los genes de glicerol deshidratasa (dhaB1, 2, 3)

El marco de lectura abierto para el gen dhaB3 se amplió a partir del pHK28-26 por PCR utilizando cebadores (SEQ. ID. nº: 41 y 42), incorporando una zona EcoRI en el extremo 5' y una zona XbaI en el extremo 3'. El producto se subclonó en pLitmus29 (New England Biolab, Inc., Beverly, MA) para generar el plásmido pDHAB3 que contenía dhaB3.

La zona que contenía la zona de codificación completa para los cuatro genes del operón dhaB procedente del pHK28-26 se clonó en pBluescriptII KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando las enzimas de restricción KpnI y EcoRI para crear el plásmido pM7.

Se eliminó el gen dhaBX digiriendo el plásmido pM7, que contiene dhaB(1,2,3,4), con ApaI y XbaI (suprimiendo parte de dhaB3 y todo el dhaBX). El fragmento resultante de 5,9 kb se purificó y se ligo con el fragmento ApaI-XbaI de 325 bp del plásmido pDHAB3 (restableciendo el gen dhaB3) para crear el pM11, que contiene dhaB(1,2,3).

El marco de lectura abierto para el gen dhaB1 se amplió en el pHK28-26 por PCR utilizando cebadores (SEQ. ID. nº: 11 y SEQ. ID. nº: 12) incorporando una zona HindIII y un punto de fijación al ribosoma RBS de consenso que se une al terminal 5' y una zona XbaI en el extremo 3'. El producto se subclonó en pLitmus28 (New England Biolab, Inc.) para generar el plásmido pDT1 que contenía dhaB1.

Un fragmento NotI-XbaI procedente del pM11 que contenía parte del gen dhaB1, el gen dhaB2 y el gen dhaB3 se insertó en el pDT1 para crear el plásmido de expresión de dhaB, pDT2. El fragmento HindIII-XbaI que contiene los genes dhaB(1,2,3) del pDT2 se insertó en el pTacIQ para crear el pDT3.

Subclonación del gen 1,3-propanodiol deshidrogenasa (dhaT)

El fragmento KpnI-SacI del pHK28-26, que contenía el gen (dhaT) completo con 1,3-propanodiol deshidrogenasa gene, se subclonó en el pBluescriptII KS+ creando el plásmido pAH1. El gen dhaT se amplió a partir del pAH1 por PCR utilizando cebadores sintéticos (SEQ. ID. nº: 13 con la SEQ. ID nº:14), incorporando una zona XbaI en el extremo 5' y una zona BamHI en el extremo 3'. El producto se subclonó en el pCR-Script (Stratagene) en la zona SrfI para generar los plásmidos pAH4 y pAH5 que contienen dhaT. El plásmido pAH4 contiene el gen dhaT en la orientación correcta para la expresión del activador lac en el pCR-Script y pAH5 contiene el gen dhaT en la orientación opuesta. El fragmento XbaI-BamHI del pAH4 que contiene el gen dhaT se insertó en el pTacIQ para generar el plásmido pAH8. El fragmento HindIII-BamHI del pAH8 que contiene el RBS y el gen dhaT se insertó en el pBluescriptII KS+ para crear el pAH11.El fragmento HindIII-SaII del pAH8 que contiene el RBS y el gen dhaT y el terminador se insertó en el pBluescriptII SK+ para crear el pAH12.

Construcción de un casete de expresión para dhaB(1,2,3) y dhaT

Un casete de expresión para el dhaB(1,2,3) y dhaT se montó a partir de los subclones individuales dhaB(1,2,3) y dhaT descritos anteriormente utilizando métodos habituales de biología molecular. El fragmento SpeI-KpnI del pAH8 que contiene el RBS, el gen dhaT y el terminador se insertó en las zonas XbaI-KpnI de pDT3 para crear el pAH23. El fragmento SmaI-EcoRI entre el gen dhaB3 y dhaT del pAH23 se eliminó para crear el pAH26. El fragmento SpeI-NotI que contiene una zona EcoRI del pDT2 se utilizó para remplazar el fragmento SpeI-NotI del pAH26 para generar el pAH27.

Construcción de un casete de expresión para dhaT y dhaB(1,2,3)

Un casete de expresión para dhaT y dhaB(1,2,3) se montó a partir de los subclones individuales dhaB(1,2,3) y dhaT descritos anteriormente utilizando métodos habituales de biología molecular. Un fragmento SpeI-SacI que contenía los genes dhaB(1,2,3) del pDT3 se insertó en el pAH11 en las zonas SpeI-SacI para crear el pAH24.

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Ejemplo 15

Producción de 1,3-propanodiol por Streptomyces lividans recombinante Subclonación del activador de glucosa isomerasa

Se ampliaron por PCR dos versiones del activador de glucosa isomerasa procedente del vector pCOs121 (SEQ. ID. nº: 15) o del pCO1211ow (SEQ. ID. nº: 16) utilizando cebadores (SEQ. ID. nº: 17 y 18) incorporando las zonas SpeI y EcoRI en el extremo 5' y una zona HindIII en el extremo 3'. Se subclonaron los productos en el pLitmus29 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) para generar los plásmidos pDT7 y pDT8.

Construcción de un casete de expresión para dhaB(1,2,3) y dhaT

La casete de expresión de 4,1 kb para dhaB(1,2,3) y dhaT del pAH27 (Ejemplo 14) se insertó en pDT7 o pDT8 utilizando las enzimas de restricción HindIII y SalI para crear pDT11 y pDT12, respectivamente.

Construcción de un plásmido para la expresión conjunta de dhaB(1,2,3) y dhaT en Streptomyces

El casete de expresión de 4,3 kb para dhaB(1,2,3) y dhaT se eliminó del pDT11 o del pDT12 por digestión con EcoRI y SalI. Se digirió el vector pIJ488-101 con las enzimas de restricción EcoRI y XbaI. El casete de expresión y el vector se ligaron junto con un enlazador Sal-Xba (SEQ. ID. nº: 19 y 20) para crear el pDT13 y el pDT14, respectivamente.

El pIJ488-101 consiste en el origen de replicación del pIJ101 de Streptomyces lividans (Kendall y Cohen, J. Bacteriol. 170, 4634 ((1988)) y pUC18 de E. coli (Norrander et al., Gene, 26, 101 ((1983)). Las secuencias proceden de la manera siguiente: las bases 1 a 2086 son del p1J101 (1-2086), y las bases 7688 a 8437 son del pIJ101 (8080-8830). Las bases 2087 a 3368 son del gen con resistencia a tioestreptona procedente de S. azureus (Thompson et al., Gene, 20, 51 (1982)). Las bases 3369-7687 son del pUC 18 que contiene el gen con resistencia a la eritromicina procedente de S. erythreus (Thompson et al., supra) insertado en la zona KpnI.

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Transformación de Streptomyces lividans con dhaB(1,2.3) y dhaT

Los plásmidos pDT13 o pDT14 se transformaron en TK23 de Streptomyces lividans utilizando técnicas habituales de transformación del protoplasto (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces, The John Innes Foundation (1985)). Se seleccionaron los transformados en placas que contenían 50 \mug/ml de tioestreptona incubada a 30ºC. Se volvieron a colocar en placas esporas de los transformados para obtener cultivos puros.

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Detección de la actividad de glicerol deshidratasa

Los transformados de Streptomyces se cultivaron en 25 ml de TSB (caldo de cultivo triptona soja, Difco, Detroit, MI) más 1% de glucosa, 2% de glicerol, 1 mg/l de vitamina B_{12,} 50 \mug/ml de tioestreptona a 30ºC durante 3 días. Las células se recogieron por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de tampón Tris 100 mM, pH 7,4. Las células se rompieron utilizando una French Press (1.360 atm.) y en el extracto celular se analizó glicerol deshidratasa como se describe en Métodos Generales. El extracto celular de TK23 de S. lividans transformado con pDT13 (Clon nº 8) o pDT14 (Clon nº2) contenía glicerol deshidratasa con una actividad específica de
0,1 U/mg.

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Producción de 1,3-propanodiol en Streptomyces lividans recombinante

TK23 de S. lividans/pDT14 (Clon nº 2) (ATCC 98052, también identificado como cepa SL 14.2 de S. lividans), inoculada en una placa TSA, se cultivó en 25 ml de TSB (caldo de cultivo Triptona-Soja, Difco, Detroit, MI) más 1% de glucosa, 2% de glicerol, 1 mg/l de vitamina B_{12}, 50 \mug/ml de tioestreptona en un matraz de 250 ml. El matraz en agitación se incubó a 30ºC con agitación intensa durante tres días, tras lo cual se detectaron 3 mg/l de 1,3-propanodiol por análisis GC-MS (derivado de TMS) en el sobrenadante como se describe en Métodos Generales.

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Ejemplo 16

Producción de 1,3-propanodiol procedente de D-glucosa utilizando Streptomyces lividans recombinante

El cultivo para la demostración de la producción de 1,3-propanodiol por TK23 de Streptomyces lividans que contenía pDT13 o pDT14 procede en medio aerobio a 30ºC en cultivos en matraz en agitación (matraces erlenmeyer, volumen de líquido 1/10º del volumen total). Los cultivos en matraces en agitación ricos con medios enriquecidos empezaron por la inoculación en placas TSA de dos días (trypticase soy agar, BBL nº 11043). Medios enriquecidos son TSB (caldo de cultivo de tripticasa-soja; BBL nº 11768), caldo de cultivo líquido (que contiene por litro: 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl), medio B (TSB enriquecido con por l: 10,0 de g de glucosa, 2 ml de solución de Balch modificada con vestigios de elementos en la que el ANT se sustituye por ácido cítrico, 2,0 g de Na_{2}CO_{3}, 4,0 g de K_{2}HPO_{4}, 1 mg de vitamina B_{12}, pH final = 7,2) o medio C (medio B, a pH 6,4). La composición de la solución de Balch modificada con vestigios de elementos puede encontrarse en Methods for General and Molecular Bacteriology (P. Gerhardt et al., eds, pág. 158, American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)). Los cultivos en matraces en agitación con medio mínimo empiezan por la inoculación de cultivos líquidos TSB de dos días, utilizando un inóculo 1/30 (v/v). Los medios mínimos son MM322 (que contiene por litro: 12,0 g de glucosa,11,3 g de K_{2}HPO_{4}, 1,0 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,2 g de extracto de levadura Difco, 0,1 g de NaCl, 2 mg de vitamina B_{12} y 10 ml de solución de Balch modificada con vestigios de elementos como anteriormente, pH final 6,7 (HCl)); medio D (medio MM322 enriquecido con 2 g de Na_{2}CO_{3}/l, pH final 7,2); o medio E (medio D, pH final 6,4). Los medios B y C y el medio mínimo se esterilizan por filtración, los demás medios en
autoclave.

Los matraces se incuban a los 30ºC con agitación durante dos días, tras los cuales se toman muestras para análisis HPLC del sobrenadante. Se añade glucosa, se incuba el cultivo durante 1 h en condiciones aerobias, tras lo cual se transfiere el cultivo a tubos de vidrio de 25 ml de volumen (que están llenos casi hasta el borde). Estos tubos se incuban posteriormente en condiciones anaerobias a 30ºC. Tras la incubación durante 2 a 5 días, se detecta por HPLC 1,3-propanodiol en el sobrenadante como se describe en Métodos Generales.

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Ejemplo 17

Construcción de plásmidos universales. Plásmidos para la sobreexpresión de dhaB(1-3) y dhaT en Bacillus y producción de 1,3-propanodiol por B. licheniformis y B. subtilis recombinantes Construcción de plásmidos de expresión universal

El elevado número de copias replicadoras del vector lanzadera pVS02 se utiliza para coexpresar dhaB(1-3) y dhaT en Bacillus. El pVS02 se construyó clonando un fragmento EcoRI/BamH1 que lleva una serina proteasa alcalina de Bacillus lentus fusionada al activador apr en B. subtilis en el pBS19. El pBS19 es un derivado del pBS42 (Band y Henner, DNA 3, 17 (1984)) en el que el fragmento EcoRI/BamHI se ha sustituido por el polienlazador EcoRI/HindIII procedente del pUC19 (Boehringer Mannheim). Para facilitar el secuenciado y las reacciones PCR, se introdujo por PCR un enlazador sintético de 45 bp (SEQ. ID. nº: 21) entre el extremo del gen de la proteasa y el terminador de la transcripción.

El bajo número de copias replicadoras del vector lanzadera pSS15-B se utiliza para expresar conjuntamente dhaB(1-3) y dhaT en Bacillus. El plásmido pSS15-B se construyó digiriendo el plásmido pHP13 (Haima et al., Mol. Gen. Genet. 209, 335 (1987)) con HindIII/SalI (zonas presentes en el polienlazador), rellenando los extremos con T4 ADN polimerasa y volviendo a ligarlos para generar el pSS13. Un fragmento EcoRI/BamHI de 2 kb del pVS02 se insertó en la zona EcoRI/BamHI del plásmido pSS 13 para crear el pSS15-B.

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Plásmidos para la sobreexpresión de casetes dhaB(1-3) y dhaT

Con objeto de crear un punto de unión al ribosoma de consenso del Bacillus en el extremo 5' de dhaT, se insertó un enlazador EcoRI/Xba obtenido por hibridación de cebadores sintéticos (SEQ. ID. nº: 22 con SEQ. ID. nº: 23) en la zona EcoRI/XbaI del pAH23 para crear el pM17. Un enlazador HindIII/BglII, que utiliza cebadores sintéticos (SEQ. ID. nº: 24 con SEQ. ID. nº: 25) se añadió en la zona HindII/BglII del plásmido pM17 para introducir una zona SalI en el extremo 5' de dhaB1 para crear el pM20. El fragmento MluI/KpnI de 0,3 kb del plásmido pM20 se sustituyó con el MluI/KpnI de 0,3 kb procedente del plásmido pAH4 para introducir una zona HindIII para crear el
pM21.

Un enlazador SalI-XbaI (SEQ. ID. nº: 26 y 27) se insertó en pAH5 el cual se digirió con las enzimas de restricción, SalI-XbaI para crear el pDT15. El enlazador destruye la zona XbaI y cambia el marco de lectura de modo que el gen dhaT se fusiona al marco de lectura abierto de la secuencia de codificación de proteasa de los plásmidos pSS15-B y pVS2. El fragmento SalI-MluI de 1 kb del pDT15 se insertó a continuación en el pAH24, sustituyendo al fragmento SalI-MluI existente para crear el pDT17.

Un enlazador SalI-XbaI (SEQ. ID. nº: 28 y 29) se insertó en pAH5 el cual se digirió con las enzimas de restricción SalI-XbaI, para crear el pDT16. El enlazador destruye la zona XbaI y cambia el marco de lectura de modo que el gen dhaT se fusiona al marco de lectura abierto de la secuencia de codificación poli-His del pUSH1 (Schon y Schuman, Gene 147, 91 (1994)). El fragmento SalI-MluI de 1 kb del pDT16 se insertó a continuación en el pAH24, sustituyendo al fragmento SalI-MluI existente para crear el pDT18.

El plásmido pDT4 (que contiene dhaB(1-3)) se construyó introduciendo el fragmento EcoRI/XbaI de 2,7 kb procedente del pDT2 en el pUC18 (Boehringer Mannheim) digerido con EcoRI/XbaI.

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Plásmidos para la sobreexpresión de casetes dhaT y dhaB(1-3) en Bacillus

El pDT17 se digirió con SacI, los extremos se completaron con T4 ADN polimerasa, y el ADN se digirió con SalI para liberar el fragmento que contenía dhaT y dhaB. El fragmento se ligó a continuación al pSS15-B digerido con HindIII (extremos truncados con T4 ADN polimerasa) y SalI que creó el pM27.

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Plásmidos para la sobreexpresión de dha B(1-3) en Bacillus utilizando un sistema inducible basado en lac

Un fragmento BglII/HindIII de 2,7 kb que contenía dhaB(1-3) del plásmido pDT4 se clonó en la zona HindIII/BamHI en el polienlazador del pUSH1 para crear el pM26. El gen dhaB1 se fusionó al marco de lectura abierto de la secuencia de codificación poli-His del pUSH1.

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Transformación de plásmidos en Bacillus

Los plásmidos pM26 y pM27 se transformaron en BG307 de B. licheniformis por transformación natural (McCuen y Thorne, J. Bacteriol. 107, 636-645 (1971)) y se seleccionaron en 10 \mug/ml de kanamicina y 30 \mug/ml de cloranfenicol, respectivamente. Los mismos plásmidos se transformaron en la cepa BG188 de B. licheniformis utilizando técnicas habituales de transformación del protoplasto (Pragai et al., Microbiology, 140, 305 (1994)) y se seleccionaron como anteriormente. La cepa BG2864 de B. subtilis se transformó con el plásmido pM27 por transformación natural. Los transformados que contenían plásmidos se seleccionaron en placas LA que contenían 10 \mug/ml de
cloranfenicol.

El plásmido pM26 se transformó también en la cepa 1E62 de B. subtilis (Saito et al., Mol. Gen. Genet., 170, 117 (1979)) y los transformados que contenían plásmidos se seleccionaron en placas LA que contenían 10 \mug/ml de eritromicina y 20 \mug/ml de kanamicina.

Todos los transformados se cultivaron a 30ºC.

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Detección de la actividad de glicerol deshidratasa

La cepa BG188 de B. licheniformis transformada con el pM26 (Clon nº8) se cultivó en 25 ml de LB (Difco) más 1% de glucosa y 10 \mug/ml de kanamicina a 30ºC durante la noche. Se recogieron las células por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de tampón Tricina/KOH 0,1 M, pH 8,2, KCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 200 \muM. El extracto celular se obtuvo rompiendo las células en la French Press (1.360 atm.) y se realizó el análisis de la glicerol deshidratasa como se describe en Métodos Generales. Se obtuvo una actividad específica de 0,036 U/mg. La actividad específica de la 1,3-propanodiol deshidrogenasa, medida como se describe en Métodos Generales, fue de 0,2 U/mg.

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Producción de 1,3-propanodiol en Bacillus recombinante

La cepa BG188 de B. licheniformis transformada con el pM26 (Clon nº 8) (ATCC 98051) se cultivó en un matraz en agitación que contenía 25 ml de LB (Difco) más glucosa al 1% y 10 \mug/ml de kanamicina a 30ºC durante la noche con agitación intensa, tras lo cual se utilizó 1 ml para inocular 25 ml de LB más glucosa al 1%, glicerol al 1%, 0,33 \mug/ml de vitamina B_{12}, y 10 \mug/ml de kanamicina en un matraz de 250 ml. Se incubaron matraces en agitación a 30ºC con agitación intensa y tras 9 h de cultivo se detectaron 300 \mug/l de 1,3-propanodiol por GC/MS (modificación por TMS) como se describe en Métodos Generales.

La cepa BG2864 de B. subtilis transformada con el pM27 (clon nº 1) (ATCC 98050) se cultivó en un matraz con agitación que contenía 25 ml de LB más glucosa al 1%, glicerol al 1%, 0,33 \mug/ml de vitamina B_{12}, y 10 \mug/ml de cloranfenicol en un matraz de 250 ml. Los matraces en agitación se incubaron a 30ºC con agitación intensa y tras 43 h de cultivo, se detectó 1,3-propanodiol.

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Producción de 3-hidroxipropionaldehído por Bacillus recombinante

Las fermentaciones de Bacillus se realizaron en fermentadores Biolafitte de 15,5 l de volumen total, operando inicialmente con un volumen de 7 litros, aumentando hasta 9,5 litros durante la prueba. Se aseguraron condiciones aerobias por aireación con aire a un caudal de 7 litros/minuto, a una velocidad del ventilador de 650 rpm y una contrapresión de 0,8 bar (las condiciones aerobias están definidas por el % de oxígeno disuelto (100% O.D. definido a presión ambiental), medido con detectores de O.D. instalados; un valor mínimo del 35% de O.D. se consideró aerobio). El pH se mantuvo a 6,70 mediante la adición automática de H_{2}SO_{4} al 10% o NH_{4}OH al 28%. La temperatura se mantuvo a 30ºC.

Los compuestos siguientes se mezclaron en el depósito y se esterilizaron a 121ºC durante 30 minutos: (gramos por litro) 6 NaH_{2}PO_{4}\cdot1H_{2}O, 10 K_{2}HPO_{4}, 1.5 NaCl, 10 (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0.2 FeCl_{3}, 1.5 triptona, 6 extracto de levadura, 10 ml de solución de Balch modificada con vestigios de elementos (Methods for General and Molecular Bacteriology (P. Gerhardt et al., eds) pág. 158, American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)) y 2 MAZU DF204 (antiespumante a medida). Tras la esterilización, se añadieron 350 gramos del alimento con glucosa al 50%, junto con kanamicina y cloranfenicol (ambos hasta una concentración final de 10 mg/litro).

0,6 litros de un matraz en agitación con BG188/pM26 (clon nº 8) de Bacillus licheniformis de 24 horas de vida, creciendo en LBG al 1% (= 10 g triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 10 g de glucosa), se utilizaron para inocular el fermentador. Se dejó crecer el cultivo a continuación y consumir la glucosa; un aumento de pH por encima de 6,60 activó el alimento de glucosa (glucosa al 50%, esterilizada, a un ritmo de 0,7 gramos/minuto). Tras 45 horas, se realizó la adición de un nutriente (50 ml de solución de Balch con vestigios de elementos, 14 gramos de K_{2}HPO_{4}, 14 gramos de extracto de levadura, 14 ml de solución de vitaminas, pH fijado a 6,60, esterilizado por filtración). Después de 70 horas, se añadió vitamina B 12 hasta una concentración final de 10 mg/l. El % D.O. se mantuvo a niveles aeróbicos durante las primeras 92 horas. La glucosa estuvo presente en (pequeño) exceso en toda la prueba (0,2-12 g/l durante la parte aeróbica (primeras 92 horas); 0,2-36 g/l durante la parte limitada de O_{2} (de 92-164 horas)). En una muestra tomada a las 87 horas, las presencia de 3-hidroxipropionaldehído se sospechó y confirmó mediante la detección de 1,3-propanodiol después de tratar la muestra de sobrenadante con el agente reductor borohidruro
sódico.

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Ejemplo 18

Plásmidos alternativos para la sobreexpresión de los casetes dhaT y dhaB(1-3) en Bacillus Plásmidos para la sobreexpresión de casetes dhaT y dhaB(1-3) en Bacillus

Un fragmento SalI/HindIII del plásmido pM21, que contiene dhaB(1-3) y dhaT, se liga con el vector pVS02 con Sal/HindIII de 5 kb para crear el pM22. El pM22 tiene dhaB y dhaT bajo el activador apr en un vector con elevado número de copias.

Un fragmento SalI/HindIII del plásmido pM21, se liga con el fragmento Sal/HindIII de 5,8 kb procedente del pSS15-B para crear el pM23. El pM23 tiene dhaB y dhaT bajo el activador apr en un vector con bajo número de copias.

Plásmidos para la sobreexpresión de casetes dhaT y dhaB(1-3) en Bacillus

El pDT17 se digirió con SacI, los extremos se completan con T4 ADN polimerasa, y el ADN se digiere con SalI para liberar el fragmento que contiene dhaT y dhaB. El fragmento se liga a continuación al pVS02 digerido con HindIII (extremos truncados con T4 ADN polimerasa) y SalI que creó el pM25.

Plásmidos para la sobreexpresión de un casete con dhaT y dha B(1-3) en Bacillus utilizando un sistema inducible basado en lac

El pDT18 se digirió con SacI, los extremos se completaron con T4 ADN polimerasa, y el ADN se digiere con SalI para liberar el fragmento que contiene dhaT y dhaB, conteniendo ambos genes un punto de fijación al ribosoma de consenso del Bacillus. El fragmento se liga a continuación al pUSH1 (Schon y Schuman, supra) digerido con HindIII (extremos truncados con T4 ADN polimerasa) y SalI para crear el pM24.

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Ejemplo 19

Conversión de D-glucosa en 1,3-propanodiol por el Bacillus recombinante Condiciones del cultivo para el Bacillus

El cultivo para la demostración de la producción de 1,3-propanodiol por Bacillus licheniformis y Bacillus subtilis procede en medio aerobio a 30ºC o 35ºC (como se indica) en cultivos en matraces en agitación (matraces erlenmeyer) y en fermentadores Biolafitte de 15,5 l (volumen total) (7-10 l de volumen de operación).

Cultivos en matraces en agitación con LBG (que contienen por l: 16 g de triptona, 10 g de glucosa, 10 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl) se empieza por la inoculación procedente de placas TSA de un día (Trypticase Soy Agar, BBL nº 11043). Estos matraces en agitación se utilizan a continuación para inocular fermentadores o matraces en agitación en los que se demuestra de manera apropiada la conversión de D-glucosa en 1,3-propanodiol.

Cultivos por lotes en matraces en agitación

Medios enriquecidos son TSB (caldo de cultivo de tripticasa-soja; BBL nº 11768), LBG, medio B (TSB enriquecido con por l: 10,0 de g de glucosa, 2 ml de solución de Balch modificada con vestigios de elementos en la que el ANT se sustituye por ácido cítrico, 2,0 g de Na_{2}CO_{3}, 4,0 g de K_{2}HPO_{4}, 1 mg de vitamina B_{12}, pH final = 7,2) o medio C (medio B, a pH 6,4). La composición de la solución de Balch modificada con vestigios de elementos puede encontrarse en Methods for General and Molecular Bacteriology (P. Gerhardt et al., eds, pág. 158, American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)). Los medios mínimos son: MM322 (que contiene por litro: 12,0 g de glucosa,11,3 g de K_{2}HPO_{4}, 1,0 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,2 g de extracto de levadura Difco, 0,1 g de NaCl, 2 mg de vitamina B_{12} y 10 ml de solución de Balch modificada con vestigios de elementos como anteriormente, pH final 6,7 (HCl)); medio D (medio MM322 enriquecido con 2 g/l de Na_{2}CO_{3}, pH final 7,2); o medio E (medio D, pH final 6,4). Los medios B y C y el medio mínimo se esterilizan por filtración, los demás medios en autoclave.

Los matraces en agitación se incuban a 30ºC con agitación intensa durante un día, tras el cual se toman muestras para análisis HPLC del sobrenadante. Se añade glucosa, se incuba el cultivo durante 1 h en condiciones aerobias, tras lo cual se transfiere el cultivo a tubos de vidrio de 25 ml de volumen (que están llenos casi hasta arriba). Estos tubos se incuban posteriormente en condiciones anaerobias a 30ºC. Tras la incubación durante 1 a 5 días, se detecta por HPLC 1,3-propanodiol en el sobrenadante como se describe en Métodos Generales.

Cultivos por lotes y alimentados en continuo en fermentadores

Un cultivo de volumen total de 600 ml de un matraz en agitación (medio LBG) se utiliza para inocular un fermentador con 6,4 l de medio, se mezcla y se esteriliza en autoclave durante 30 minutos (medio mínimo) o 45 min. (medio enriquecido). El medio mínimo típico en el fermentador es el medio D, el medio enriquecido' típico es el medio D con un extracto de levadura adicional de 50 g/l. Adiciones esterilizadas por filtración (vitamina B_{12} o compensaciones para auxotrofía) se realizan una vez el fermentador se ha esterilizado en autoclave, utilizando una jeringuilla y una boca con septum en la tapa del fermentador.

La contrapresión (BP, 0,1-0,5 bar), aireación (l de aire por min., 0,4-1 vvm), agitación (rpm, 200-600), temperatura (T, 30-37ºC), oxígeno disuelto (%O.D.) y pH (5,8-7,2 por adición de NH_{4}OH y H_{2}SO_{4} o H_{3}PO_{4}) se comprueban y controlan en los valores deseados, como se indica.

Tras la inoculación, las células se cultivan en modo discontinuo durante las primeras 14 h, tras las cuales se inicia una alimentación con glucosa. Para el cultivo/producción anaerobio, el %O.D. se deja ir hasta 0% mediante reducción de rpm y BP, remplazando además el aire que entra por N_{2}, como se indica.

Se toman muestras de los fermentadores y de los matraces en agitación para lecturas de O.D._{550} (crecimiento) y el ensayo enzimático de la glucosa en el sobrenadante; se prepara también el sobrenadante para el análisis HPLC por el procedimiento estándar de los autores, como se esboza en Métodos Generales. El 1,3-propanodiol está presente en el sobrenadante.

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Ejemplo 20

Transformación de Pseudomonas con dhaB(1,2,3) y dhaT y demostración de la producción de 1,3-propanodiol Construcción de plásmidos para la expresión conjunta de dhaB(1,2,3) y dhaT en Pseudomonas

El casete de expresión de 4,1 kb para dhaB(1,2,3) y dhaT procedente del pAH27 se insertó en los vectores pMMB66EH (Füste et al., Gene, 48,119 (1986)) y pMMB207 (Morales et al., Gene, 97, 39 (1991)) utilizando las enzimas de restricción EcoRI y SalI para crear pDT10 y pDT9, respectivamente.

Transformación de PAO 2845 de P. aeruginosa con el plásmido de expresión pDT9

Se prepararon células PAO 2845 de P. aeruginosa para la transformación por cultivo durante la noche a 37ºC en agitación a 200 rpm en caldo de cultivo L. Se hizo una inoculación 1:25 del cultivo en 25 ml de caldo de cultivo L reciente, precalentado y preaireado. El cultivo reciente se incubó 2 a 3 h hasta la fase log inicial a 37ºC y 200 rpm. Las células, recogidas por centrifugación, se lavaron dos veces en 10 ml de 0,15 M MgCl_{2} enfriado con hielo que contenía 5% sulfóxido de dimetilo y se volvió a poner en suspensión en 2 ml de la solución de sulfóxido de dimetilo. La suspensión celular (0,2 ml) se combinó con 100-200 ng de ADN pDT9 y se colocó en hielo durante 60 min. La mezcla de reacción se calentó por microondas a 37ºC durante 2 min. y se transfirió a hielo durante 5 min. Se añadió caldo de cultivo L (0,5 ml) y se incubaron las células durante 20 min. a 37ºC. Se obtuvieron colonias aisladas procedentes de placas con agar-agar nutriente enriquecido con 37,5 \mug/ml de cloranfenicol.

Transferencia conyugal del pDT10 en PAO1 de P. aeruginosa

Se pareó el plásmido, pDT10 en PAO1 por el método de Figurski y Helinski (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 76, 1648 (1979)). El pDT10 se transformó en AC80 de E. coli (Chakrarty et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 75, 3109 (1978)) para crear una cepa donante. La cepa colaboradora era HB 101 de E. coli que contenía el pRK2013 (Figurski y Helinski, supra). La cepa receptora era PAO1 de Pseudomonas aeruginosa (Royle et al., J. Bacteriol., 145, 145 (1981)). Cultivos (5 ml) de cada una de las cepas se cultivaron durante la noche en LB a 37ºC. Las células se lavaron en NaCl al 0,9% y se volvieron a poner en suspensión en 200 pl. Las células se mezclaron y se extendieron sobre una placa LA (Luria Agar, Difco). La placa se incubó a 37ºC durante 6 h. Las células se extrajeron de la placa y se transfirieron a placas PIA (Difco) que contenían 250 \mug/ml de carbencilina y se cultivaron durante la noche. Se aislaron colonias individuales en el mismo medio.

Detección de actividad de glicerol deshidratasa y de 1,3-propanodiol deshidrogenasa

Se cultivó PAO1/pDT10 de Pseudomonas aruginosa en 25 ml de 2XYT (16 g/l de extracto de levadura, 16 g/l de triptona, 5 g/l de NaCl) más 250 \mug/ml de carbenicilina, IPTG 0,1 mM durante la noche a 37ºC. Las células se recogieron por centrifugación y se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de tampón Tris 100 mM, pH 7,4. Se rompieron las células con la French Press a 1.020 atm. En el extracto en bruto se analizó a continuación la actividad de la glicerol deshidratasa y de la 1,3-propanodiol deshidrogenasa utilizando los análisis habituales. La determinación de proteínas fue por el análisis de proteínas Bio-Rad (Bradford). La actividad específica de la glicerol deshidratasa fue de 5 U/mg. La actividad específica de la 1,3-propanodiol deshidrogenasa fue de 20 U/mg. Asimismo el extracto en bruto preparado a partir de PAO 2845 de P. aeruginosa transformada con el pDT9 contenía 0,05 U/mg de actividad de glicerol deshidratasa.

Producción de 1,3-propanodiol por Pseudomonas aeruginosa que contiene el plásmido pDT9

PAO 2845 de Pseudomonas aeruginosa que contenía el plásmido pDT9 (ATCC 55760) se cultivó durante la noche a 37ºC y 200 rpm de agitación en medio 2XYT enriquecido con 25 \mug/ml de cloranfenicol. Después del cultivo durante la noche, una alícuota de la suspensión celular se transfirió al medio de cultivo (3 partes de medio 2XYT + 1 parte de medio HEPES 0.1, enriquecido con glucosa al 0,25% (p/v), KNO_{3} al 0,2% (p/v), 25 \mug/ml de cloranfenicol, 50 mg/l de extracto de levadura y 80 mg/l de caldo de cultivo nutriente) dando como resultado una suspensión celular con un O.D. a 660 nm de 0,5-0,8 AU. El medio HEPES 0.1 contiene los siguientes componentes: NH_{4}Cl, 9,52 mM; MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,523 mM; K_{2}SO_{4}, 0,276 mM; HEPES (ácido N-[2-hidroxietil]piperazina-N-[2-etansulfónico]), 40 mM; tricina (N-tris (hidroximetil) metil glicina), 4 mM; FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,010 mM; K_{2}HPO_{4}, 0,132 mM; y vestigios de minerales para dar concentraciones finales de los componentes siguientes en g/l: citrato sódico\cdot6H_{2}O, 0,001; FeSO_{4}\cdot7H_{4}O, 0,0005; CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,0001; MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,00001; ZnCl_{2}, 0,000005; Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O, 0,000025; NiCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,0001; CuSO_{4}\cdot2H_{2}O, 0,00005. Después de aproximadamente 1 h de cultivo a 30ºC con agitación a 250 rpm, se añadió IPTG 0,5 mM (isopropil-\beta-D-tiogalactósido) al medio de cultivo y se continuó el cultivo celular. Después de aproximadamente 5 h de cultivo adicional, se recogieron las células por centrifugación a temperatura ambiente. Se lavaron las células 3 veces con medio de producción: medio HEPES 0.1 enriquecido con glucosa al 0,25% (p/v), KNO_{3} al 0,2% (p/v), 25 \mug/ml de cloranfenicol, 50 mg/l de extracto de levadura y 80 mg/l caldo de cultivo nutriente, por duplicado, las células lavadas se pusieron en suspensión en el volumen original recogido en el medio de producción que contenía glicerol al 0,2% (v/v). Se incubaron suspensiones celulares en una atmósfera de nitrógeno a 30ºC en agitación a 250 rpm. Después de aproximadamente 1 h, se añadieron a la suspensión celular 5 \mug/ml de coenzima B_{12} (5,6-dimetil-benzimidazolilcobamida 5-desoxiadenosina) y la incubación continuó a 30ºC en agitación a 250 rpm. Se recogieron muestras periódicamente de la suspensión celular para el análisis del producto. Durante la recogida, se extrajeron células de las muestras por centrifugación y el sobrenadante acuoso se almacenó congelado, a -20ºC, hasta que se analizó.

Se demostró por análisis HPLC con calibraciones basadas en patrones auténticos que estas suspensiones celulares producían 1,3-propanodiol. Los resultados se muestran en la Tabla 15. La identidad del producto se confirmó por análisis GC/MS como se describe en los Métodos Generales.

TABLA 15

15

Ejemplo 21

Producción de 1.3-propanodiol procedente de D-glucosa utilizando Pseudomonas aeruginosa Condiciones generales del cultivo

La cepa PAO2845 de Pseudomonas aeruginosa procedente del PGSC (Pseudomonas Genetic Stock Center, East Carolina School of Medicine, Greenville, NC) se cultiva en medio basal, HEPES 0,1, con los siguientes componentes: NH_{4}Cl, 9,52 mM; MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,523 mM; K_{2}SO_{4}, 0,276 mM; HEPES (ácido N-[2-hidroxietil]piperazina-N-[2-etansulfónico]), 40 mM; tricina (N-tris (hidroximetil) metil glicina), 4 mM; FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,010 mM; K_{2}HPO_{4}, 0,132 mM; y vestigios de minerales para dar concentraciones finales de los componentes siguientes en g/l: citrato sódico\cdot6H_{2}O, 0,001; FeSO_{4}\cdot7H_{4}O, 0,0005; CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,0001; MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,00001; ZnCl_{2}, 0,000005; Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O,
0,000025; NiCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,0001; CuSO4\cdot2H_{2}O, 0,00005. HEPES 0,1 se utiliza en todos los experimentos; se indican enriquecimientos cuando se producen.

Construcción de un mutante de glicerol negativo de PAO 2845 P. aeruginosa por interrupción génica

PAO 2845 de P. aeruginosa se cultiva durante la noche en Nutrient Broth (Difco, Detroit, MI) a 37ºC y agitación a 200 rpm. Se recuperan las células por centrifugación y se extrae ADN de las células utilizando un procedimiento de lisis alcalina convencional (Sambrook 1989). El marco de lectura abierto para glpR (gen de la proteína reguladora del catabolismo del glicerol, nº de registro en Genbank M60805) se amplía en PAO 2845 P. aeruginosa por PCR utilizando los cebadores JJ-gplR-5' y JJ-glpR-3' (SEQ. ID. nº:30 y nº 31, respectivamente), incorporando las secuencias EcoR1 en los extremos 5'. Este fragmento de ADN se liga a continuación en el plásmido pARO180 (Parke, Gene 93,135, (1990)) en su secuencia de restricción única EcoR1 dando como resultado el plásmido pJJ10. E. coli transformada con ADN procedente de la mezcla de ligadura del pJJ10 se extienden en Nutrient Agar (Difco, Detroit, MI) que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y 0,08 mg/ml de XgaI (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido). Las colonias blancas, que indican una gran probabilidad de inserción de glpR, se seleccionan y se transfieren al medio LB enriquecido con 50 \mug/ml de ampicilina. En las células recogidas tras el cultivo durante la noche a 37ºC y agitación a 200 rpm, se recupera el ADN del pJJ10.

La zona del casete de kanamicina del pUC4K (Pharmacia nº Cat. 27-4958-01) se amplía por PCR utilizando cebadores (SEQ. ID. nº: 32 y nº: 33) diseñados apropiadamente para ampliar la zona y modificar los terminales del fragmento que han de ser compatibles con la enzima de restricción Sry1 (Promega, Madison, WI) dando como resultado el fragmento de 4 kb -sty del pUC4K1. El fragmento de ADN sty1 del pUC4R se subclona en la zona Sty1 dentro del gen glpR del plásmido pJJ10, generando el plásmido pJJ11. E. coli transformadas con ADN procedente de la mezcla de ligadura del pJJ11 se extienden sobre agar-agar LB enriquecido con 25 \mug/ml de kanamicina y 50 \mug/ml de ampicilina. El ADN de 5 a 20 colonias aisladas se recoge individualmente después del cultivo durante la noche a 37ºC en medio LB enriquecido con 25 \mug/ml de kanamicina y 50 \mug/ml de ampicilina. La presencia del ADN plásmido deseado se confirma por electroforesis en gel.

PAO 2845 de P. aeruginosa se transforma con ADN pJJ11 siguiendo protocolos habituales. En resumen, se prepararon células de P. aeruginosa para la transformación por cultivo durante la noche a 37ºC en agitación a 200 rpm en caldo de cultivo L. Se hace una inoculación 1:25 de este cultivo de toda la noche en 25 ml de caldo de cultivo L reciente, precalentado y preaireado. El cultivo reciente se incuba durante 2 a 3 h (hasta la fase log inicial) a 37ºC y 200 rpm. Las células se centrifugan y se decanta el sobrenadante. Las células recogidas se vuelven a poner en suspensión en 10 ml de MgCl_{2} 0,15 M esterilizado enfriado con hielo que contiene sulfóxido de dimetilo al 5% y mantenido en hielo durante 5 a 10 min. Las células se centrifugan, se separan del sobrenadante y se vuelven a poner en suspensión en 10 ml de MgCl_{2} 0,15 M esterilizado enfriado en hielo que contiene sulfóxido de dimetilo al 5% y mantenido en hielo durante 5 a 10 min. Después de una centrifugación final y separación del sobrenadante, las células se vuelven a poner en suspensión en 2 ml de MgCl_{2} 0,15 M esterilizado enfriado con hielo que contiene sulfóxido de dimetilo al 5%. Una alícuota de 0,2 ml del concentrado celular frío se combina con 100 a 200 ng de ADN pJJ11 en un tubo de centrifugadora de polipropileno de 1,5 ml preenfriado y la mezcla se mantiene en hielo durante 60 min. El tubo se transfiere a continuación rápidamente a un baño de agua a 37ºC durante 2 min. e inmediatamente se devuelve al hielo durante 5 min. Se añaden aproximadamente 0,5 ml de caldo de cultivo L y las células se incuban durante 0,3 a 1 hora con agitación suave a 37ºC. Después de la incubación de recuperación, alícuotas de 10 \mul y 50 \mul de la suspensión celular se extienden en placas con nutriente agar-agar enriquecido con 50 \mug/ml de kanamicina. En las colonias que se desarrollan en el medio selectivo se identifica el crecimiento en placas de agar-agar con medio HEPES 0.1 enriquecido con ácido succínico al 1% o glicerol al 1%. Clones incapaces de crecer en glicerol, pero capaces de crecer en succinato, se conservan para su utilización posterior por congelación en glicerol al 15%.

Transformación de PAO 2845 de gplR^{-} P. aeruginosa con pDT9

P. aeruginosa se prepara para la transformación por el método descrito anteriormente. Una alícuota de 0,2 ml del concentrado celular frío se combina con 100 a 200 ng de ADN pDT9 en un tubo de centrifugadora de polipropileno de 1,5 ml preenfriado y la mezcla se mantiene en hielo durante 60 min. El tubo se transfiere a continuación rápidamente a un baño de agua a 37ºC durante 2 min. e inmediatamente se devuelve al hielo durante 5 min. Se añaden aproximadamente 0,5 ml de caldo de cultivo L y las células se incuban durante 0,3 a 1 h con agitación suave a 37ºC. Después de la incubación de recuperación, alícuotas de 10 \mul y 50 \mul de la suspensión celular se extienden en placas con nutriente agar-agar enriquecido con 37.5 \mug/ml de cloranfenicol.

Identificación de PAO 2845 de glpR^{-} P. aeruginosa transformados para la presencia del pDT9

Los transformados procedentes de lo anteriormente se colocan en placas con nutriente agar-agar enriquecido con 37,5 \mug/ml de cloranfenicol y se cultivan durante la noche a 37ºC. De las colonias que aparecen en estas placas selectivas, se seleccionan aproximadamente veinte y se transfieren a 10 ml de Nutrient Broth (Difco, Detroit, MI) que contiene 37,5 \mug/ml de cloranfenicol y se cultivan durante la noche a 37ºC y agitación a 200 rpm. Para confirmar la presencia del plásmido pDT9 en los transformados seleccionados, se extrae el ADN plásmido, se purifica y se corta con EcoR1 (Promega, Madison, WI). El peso molecular del ADN linealizado se analiza por electroforesis en gel. Además, la ampliación por PCR utilizando pares de cebadores con secuencias comunes a dhaT, dhaB1, dhaB2 y dhaB3 (SEQ. ID. nº: 34 y nº: 35, nº: 36 y nº: 37, nº: 8 y nº: 9, nº: 4 y nº: 5, respectivamente) seguida de caracterización del peso molecular del fragmento utilizando electroforesis en gel se utiliza para confirmar la presencia de los genes deseados.

Identificación metabólica de PAO 2845 de glpR^{-} P. aeruginosa transformado con pDT9

Uno a veinte clones se seleccionan los transformados positivos anteriormente para caracterización adicional. Se cultivan células en medio aerobio en Nutrient Broth enriquecido con 37,5 \mug/l de cloranfenicol durante la noche a 30ºC con agitación a 250 rpm. Se transfieren las células a una dilución 1:8 en el mismo medio con IPTG 1,5 mM (isopropil-\beta-D-tiogalactósido) y se cultivan durante 4 a 6 h. Se recogen las células a continuación por centrifugación y se lavan una vez con medio HEPES 0.1 enriquecido con 10 g/l de glicerol, 0,03 g/l extracto de carne de vaca, 0,05 g/l de peptona, 0,05 g/l de extracto de levadura (todo de Difco, Detroit, MI) y KNO_{3} al 0,2%. Las células se vuelven a poner en suspensión a continuación a 1/5 del volumen original, sin espacio de aire, en un vial pequeño y se incuban a 30ºC con agitación a 100 rpm durante 18 a 72 h. Se separan las células por centrifugación y se analizan la presencia de 1,3-propanodiol en los sobrenadantes por HPLC. Además, se confirma la identidad química del 1,3-propanodiol por cromatografía de gases-espectrometría de masas.

Producción de 1,3-propanodiol a partir de glucosa por PAO 2845 de glpR^{-} P. aeruginosa transformada con el pDT9 (ATCC 55760)

A partir del procedimiento de identificación anterior, uno a cinco clones que producen la mayor cantidad de 1,3-propanodiol a partir de glicerol se cultivan en medio aerobio en caldo de cultivo nutriente enriquecido con 37,5 pg/l de cloranfenicol durante la noche a 30ºC con agitación a 250 rpm. Se transfieren las células a una dilución 1:8 en el mismo medio con IPTG 1,5 mM, se dejan cultivar durante 4 a 6 h, se recogen por centrifugación y se lavan una vez con medio HEPES 0.1 enriquecido con 10 g/l de glucosa, 0,03 g/l extracto de carne de vaca, 0,05 g/l de peptona, 0,05 g/l de extracto de levadura y KNO_{3} al 0,2%. Las células se vuelven a poner en suspensión a continuación a 1/5 del volumen original, sin espacio de aire, en un vial pequeño. Las células se incuban a 30ºC con agitación a 100 rpm durante aproximadamente 36 h. Las células se separan por centrifugación y se analiza la presencia de 1,3-propanodiol en los sobrenadantes por HPLC. Además, se confirma la identidad química del 1,3-propanodiol por cromatografía de gases-espectrometría de masas.

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Ejemplo 22

Construcción de casetes de expresión para la expresión de dhaB1. dhaB2, dhaB3 y dhaT en Aspergillus niger Casete de expresión general (pAEX)

El fragmento Spe1-EcoRV de 1,4 kb procedente del plásmido pGPTpyrG (Berka et al., "The development of gene expression systems for filamentous fungi", Biotechnol. Adv., 7:127-154 (1989)), que contiene porciones suficientes para la regulación apropiada del Aspergillus niger gla Se ligó un activador y terminador en las secuencias Spe1 y EcoRV en el polienlazador del pLITMUS39 (New England Biolabs, Beverly, MA).

Casetes de expresión del clon individual para A. niger

Los marcos de lectura abiertos (ORF) para subunidades B individuales de Klebsiella pneumoniae dha y dhaT se clonaron y se ligaron en el vector de expresión general (pAEX) por separado, utilizando la misma estrategia de clonación:

Los pares de cebador para ampliación por PCR de cada ORF de dhaB individual y el ORF de dhaT se diseñaron para emparejar la secuencia de los extremos 5' y 3' para cada ORF basándose en la conocida secuencia del operón del gen completo (dhaB1, dhaB2, dhaB3, dhaBX y dhaT: SEQ. ID. nº: 38 y nº: 12, nº: 39 y nº: 40, nº: 41 y nº: 42, nº: 45 y nº: 46, nº: 43 y nº: 44, respectivamente). Además la secuencia de emparejamiento, los cebadores para el extremo 5' de cada ORF se diseñaron para incluir la secuencia de restricción EcoR1 seguida de una secuencia de restricción Bgl II en la mayor parte del terminal 5' de la secuencia así como las cinco secuencias básicas CAGCA aguas arriba del primer ATG de cada ORF. Los cebadores diseñados para emparejar los extremos 3' de cada ORF colocaron una secuencia de restricción Xba1 aguas abajo del codón de interrupción de la traducción, en la mayor parte del terminal 3' del clon.

Los fragmentos individuales del clon para los ORF de dhaB y dhaT se ampliaron por PCR a partir del plásmido pHK26-28, que contenía el operón K. pneumoniae dha completo, utilizando los cebadores descritos anteriormente. Los fragmentos individuales del clon del ORF se aislaron basándose en sus respectivos pesos moleculares (dhaB1 = 1540 bp; dhaB2 = 607 bp; dhaB3 = 448 bp; dhaBX = 1846 bp; dhaT = 1187 bp). Utilizando las únicas secuencias de restricción EcoR1 y Xba1 diseñadas en los cebadores de la PCR, cada fragmento individual dhaB y dhaT de ORF se ligó en las secuencias de restricción EcoR1 y Xba1 en el polienlazador del pLITMUS29 (New England Biolabs). Los clones dhaB2 y dhaB3 en pLITMUS29 se confirmó que son correctos por secuenciado. Un único fragmento de restricción NcoI-EcoRV de 1363 bp procedente de la zona de codificación del clon dhaB1 en el pLITMUS29 se eliminó y se sustituyó por el fragmento de restricción correspondiente del pHK26-28. Un único fragmento de restricción Tth111 I-Mlu I de 783 bp procedente de la zona de codificación del clon dhaT en el pLITMUS29 se sustituyó por el fragmento de restricción correspondiente del pHK26-28. Un único fragmento de restricción EcoRV de 1626 bp procedente de la zona de codificación del clon dhaBX en el pLITMUS29 se sustituyó por el fragmento de restricción correspondiente procedente del pM7 (que contiene el operón dhaB de K. pneumoniae). Se confirmó que las secuencias de los extremos 5' y 3' de los clones dhaB1, dhaBX y dhaT, aproximadamente de 250 bp que incluyen alguna secuencia del fragmento sustituido, eran correctas por secuenciado.

Los únicos fragmentos de restricción Bgl II-Xba1 que contienen los ORF de los clones dhaB1, dhaB2, dhaB3, dhaBX y dhaT en pLITMUS29 se ligaron en las secuencias de restricción Bgl II-Xba1 en el vector de expresión general pAEX por separado, colocando la expresión de cada clon bajo el control del activador y terminador A. niger glaA. Cada vector resultante se denominó por el ORF respectivo, es decir: pAEX:dhaB1, pAEX:dhaB2, pAEX:dhaB3, pAEX:dhaBX y pAEX:dhaT.

Vectores del casete de expresión doble para A. niger

El fragmento de restricción único SnaB1-Stu1 que contiene el casete de expresión dhaB1 (consistente en el activador A. niger glaA, el ORF dhaB1 y el terminador) se aisló del vector pAEX:dhaB 1 y se ligó en la única secuencia de restricción SnaB1 en el vector pAEX:dhaB2. El fragmento de restricción Sca1-Sma1 de aprox. 2,2 kb procedente del pBH2 (Ward et. al., Exp. Myc., 13, 289 (1989)) que contiene el marcador seleccionable para auxotrofía de Aspergillus nidulans pyrG, se ligó en la única secuencia de restricción Stu1 en el vector que contiene los casetes de expresión dhaB1 y dhaB2. Este vector se denominó pAEX:B1+B2.

Los únicos fragmentos de restricción Spe1-Hind III que contienen los casetes de expresión completos para dhaB3 y dhaT se aislaron de los respectivos vectores pAEX:dhaB3 y pAEX:dhaT. Los dos fragmentos del casete de expresión se ligaron simultáneamente, en tándem, en la única secuencia de restricción Hind III en el vector pUC18. Este vector se denominó pAEX:B3+T.

Transformación, aislamiento de transformados, confirmación de la integración de casetes de expresión y expresión de los genes dhaB y dhaT en Aspergillus

La cepa FS 1 (pyrG^{-}) de Aspergillis niger se transformó junto con los dos vectores de expresión pAEX:B1+B2 y pAEX:B3+T utilizando el método de (Campbell et al., "Improved transformación efficiency of A. niger using homologous niaD gene for nitrate reductase", Curr. Genet., 16:53-56 (1989)). Se seleccionaron transformados por su capacidad para cultivar en medio selectivo sin uridina. Se digirió el ADN genómico de transformados con Hind III y Spe1 para liberar los fragmentos de pesos moleculares previstos, demostrando la integración de casetes de expresión intactos. La detección de cada casete de expresión se realizó por análisis Southern, sondando con genes individuales por separado. La presencia de la proteína dhaB2 se detectó por análisis western utilizando anticuerpo anti-dhaB.

La expresión de cada ORF se determinó cultivando transformados, que tienen los vectores pAEX:B1+B2 y
pAEX:B3+T integrados, en medio CSL al 10% (licor de maíz fermentado (50% de sólidos), 10% (p/v); NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O, 1,0 g/l; MgSO_{4}, 0,50 g/l; maltosa, 100,0 g/l; glucosa, 10,0 g/l; y antiespumante Mazu, 0,003% (v/v)) como cultivo de semillas transfiriendo a continuación 1/10 de volumen del cultivo de semillas al medio de carbono MBM (NaH_{2}PO_{4}, 0,70 g/l; K_{2}HPO_{4}, 0,70 g/l; KH_{2}PO_{4}, 0,70 g/l; MgSO_{4}7H_{2}O, 1,40 g/l; (NH_{4})_{2}SO_{4}, 10,5 g/l; CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,70 g/l; NH_{4}NO_{3}, 3,50 g/l; citrato sódico, 14 g/l; FeCl_{2}\cdot4H_{2}O, 1,0 mg/l; ZnCl_{2}, 5,87 mg/l; CuCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,42 mg/l; MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,21 mg/l; Na_{2}B_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O, 0,07 mg/l; ácido fólico, 0,174 mg/l; piridoxina\cdotHCl, 6,12 mg/l; riboflavina, 1,83 mg/l; ácido pantoténico, 23,60 mg/l; ácido nicotínico, 26,66 mg/l; biotina, 0,49 mg/l; tiamina\cdotHCl, 1,39 mg/l; maltosa, 120,0 g/l; carbenicilina, 0,035 mg/l; estreptomicina, 0,035 mg/l; Tween 80. 0,07% (p/v); y antiespumante Mazu, 0,14% (v/v)) para la inducción del activador glaA. Se aisló el ARNm de los cultivos del transformado (Fast Track 2 Kit, Invitrogen Corp.) y el análisis Northern se realizó con quimioluminiscencia (Genius® System, Boehringer-Manaheim) para detectar el mensaje transcrito procedente de cada gen. Se demostró por hibridación Northern la transcripción coordinada de los genes dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT en cultivos en matraz agitado, sondando con fragmentos génicos de cada ORF dhaB y dhaT.

Las colonias aisladas presentadas para transcribir todos los genes transformados se seleccionaron para transformarse más con pAEX:dhaBX. Estas cepas se transformaron junto con el pAEX:dhaBX y el pAA10 (fragmento de restricción Acc1-Asp718 de 3,2 kb. que contenía el marcador seleccionable Aspergillus nidulans amdS en pUC18). Estos cultivos recién transformados se seleccionaron para un medio que contenía acetamida como única fuente de carbono. Se demostró que las colonias de transformado capaces de utilizar acetamida como única fuente de carbono que tienen el ORF dhaBX integrado por ampliación por PCR del ORF dhaBX del ADN genómico utilizando los cebadores KpdhaBX-5' y KpdhaBX-3' (SEQ. ID. nº: 45 y nº: 46).

Producción de glicerol por A. Niger, cepa FS1

La cepa FS 1 de Aspergillus niger se cultivó en medio CSL al 10% como cultivo de semillas y se transfirió en forma de una dilución 1:10 al medio de carbono MBM + maltosa al 12%. Se demostró que el sobrenadante del cultivo contiene 6 g/l de glicerol producido por Aspergillus. El análisis de glicerol se realizó por HPLC.

Producción de 1,3-propanodiol por A. niger recombinante

Las fermentaciones de Aspergillus se realizaron en fermentadores Biolafitte de 15,5 l de volumen total, operando inicialmente con un volumen de 8 l., aumentando hasta 11 l. durante la prueba. Se aseguraron condiciones aerobias por aireación con aire a un caudal de 10 l/min., a una velocidad del ventilador de 700 a 800 rpm y una contrapresión de 1,1 bar (las condiciones aerobias están definidas por el % de oxígeno disuelto) (100% O.D. definido a presión ambiental), medidas con detectores de O.D. instalados; un valor mínimo del 35% de O.D. se consideró aerobio). El pH se mantuvo a 5,60 mediante la adición automática de H_{3}PO_{4} al 10% o NH_{4}OH al 28%. La temperatura se mantuvo a 32ºC.

Los compuestos siguientes se mezclaron en el depósito y se esterilizaron a 121ºC durante 30 minutos: 2 g/l de NaH_{2}PO_{4} H_{2}O, 17 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de MgSO_{4}, 2 g/l de Tween 80, 45 g/l de Promosoy-100 (concentrado de soja con 70% de proteínas), 6 g/l de licor de maíz fermentado (50% de sólidos), 10 g/l de maltosa y 2 g/l de MAZU DF204 (un antiespumante a medida). Tras la esterilización, se añadieron 500 gramos del alimento Maltrin 150 al 50%, junto con carbenicilina y estreptomicina (ambos hasta una concentración final de 10 mg/l).

Un litro de una cepa de Aspergillus niger de 45 h de vida (cepa TGR40) transformada con los dos vectores de expresión pAEX:B1+B2 y pAEX:B3+T, cultivándose en un matraz en agitación que contenía CSL al 10% se utilizó para inocular el fermentador. El cultivo se dejó a continuación crecer en discontinuo, completamente aerobio, durante 28 h antes de una alimentación (solución Maltrin 150 al 50%, esterilizada térmicamente) se empezó a un ritmo de 0,8 a 1,0 g/min. El cultivo se desarrolló entonces durante otras 20 h, durante las cuales el %O.D. disminuyó hasta prácticamente cero debido a la demanda de O_{2} de las células (el cultivo permaneció en cero a 5% en todo el resto de la prueba). Después de esto (48 h después de la inoculación), el glicerol se alimentó durante un periodo de 8 h, hasta una concentración final de glicerol de 163 g/l. La alimentación de Maltrin se interrumpió 97 h después de la inoculación, la contrapresión y la aireación se redujeron a 0,2 bar y 4 l/min. respectivamente (0,5 vvm), y se añadió coenzima B_{12} hasta una concentración final de 10 mg/l. A las 122 h de cultivo, se recogió el caldo de cultivo, se centrifugó y se añadieron 0,2 l de etanol a 1 l de sobrenadante.

Un l. de caldo de fermentación exento de células se destiló al vacío, proporcionando aproximadamente 60 ml de una lechada oscura. La lechada se centrifugó y se recogieron aproximadamente 40 ml de líquido sobrenadante. Este líquido se trató a continuación con 40 ml de etanol con objeto de precipitar los sólidos residuales, que se eliminaron por centrifugación. Una pequeña muestra del líquido decantado se analizó por HPLC y se encontró que contenía 1,3-propanodiol: la identidad del propanodiol se confirmó por GC/MS.

Los solicitantes han depositado una cepa TGR40-13 de Aspergillus niger recombinante, que comprende un fragmento de ADN que codifica dhaB(1-3), dhaBx y dhaT (ATCC 74369).

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Ejemplo 23

Producción de 1,3-propanodiol a partir de maltosa utilizando A. niger recombinante

Las fermentaciones de Aspergillus se realizan en fermentadores Biolafitte de 15,5 l de volumen total, operando inicialmente con un volumen de 8 l., aumentando hasta 11 l. durante la prueba. Se aseguran condiciones aerobias por aireación con aire a un caudal de 10 l/min., a una velocidad del ventilador de 700 a 800 rpm y una contrapresión de 1,1 bar (las condiciones aerobias están definidas por el % de oxígeno disuelto) (100% O.D. definido a presión ambiental), medidas con detectores de O.D. instalados; un valor mínimo del 35% de O.D. se consideró aerobio). El pH se mantiene a 5,60 mediante la adición automática de H_{3}PO_{4} al 10% o NH_{4}OH al 28%. La temperatura se mantiene a 32ºC.

Los compuestos siguientes se mezclaron en el depósito y se esterilizaron a 121ºC durante 30 min.: 2 g/l de NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O, 17 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 1 g/l de MgSO_{4}, 2 g/l de Tween 80, 45 g/l de Promosoy-100 (concentrado de soja con 70% de proteínas), 6 g/l de licor de maíz fermentado (50% de sólidos), 10 g/l de maltosa y 2 g/l de MAZU DF204 (un antiespumante a medida). Tras la esterilización, se añadieron 500 gramos de alimento Maltrin 150 al 50%, junto con carbenicilina y estreptomicina (ambos hasta una concentración final de 10 mg/l).

Un l. de una cepa de Aspergillus niger de 40-48 h de vida transformada con los genes dhaB1, dhaB2, dhaB3, dhaB4 y dhaT, que se cultiva en un matraz en agitación que contiene CSL al 10% (definido en el Ejemplo 22), se utiliza para inocular el fermentador. El cultivo se deja a continuación desarrollarse durante 30 a 35 h antes de iniciar la alimentación (solución Maltrin 150 al 50%, esterilizada térmicamente), a un ritmo de 1 g/min. El cultivo se controla a continuación durante otras 5 h en condiciones limitadas de O_{2} (%O.D. cero, con aireación total). Después de esto, se interrumpe el alimento Maltrin y cuando la glucosa medida en el sobrenadante es prácticamente cero, las rpm se disminuyen a 150, la BP a 0,2 y se interrumpe la aireación. El fermentador se enjuaga con una mezcla anaeróbica de gas (H_{2} al 5%, CO_{2} al 5%, N_{2} al 90%) a un ritmo de 7 l/min durante 30 min. El gas de entrada y de salida se cierra a continuación, la BP se mantiene a 0,4 bar y se añade coenzima B_{12} hasta una concentración final de 5 mg/l. Todo el tiempo, las muestras de caldo de cultivo se centrifugan y los sobrenadantes se preparan para los análisis de HPLC y GC. El 1,3-propanodiol se detecta en el sobrenadante.

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Ejemplo 24

Producción de 1,3-propanodiol a partir de sustratos distintos de glicerol por Lactobacillus reuteri (ATCC 23272)

Lactobacillus reuteri (ATCC 23272) se mantuvo en placas MRS (Difco, Detroit, MI). Se utilizaron colonias procedentes de una placa para inocular 70 ml de caldo de cultivo de Lactobacillus en MRS (Difco nº 0881-17) enriquecido con NaHCO_{3} 25 mM en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Se incubó el matraz en una atmósfera anaeróbica (5 a 7% de H_{2}, 2 a 8% de CO_{2} y 85 a 93% de N_{2}) a 32ºC.

El análisis por HPLC de caldo de cultivo de Lactobacillus en MRS mostró un componente con el tiempo de retención del glicerol. El caldo de cultivo de Lactobacillus en MRS se trató por ebullición alcalina y se analizó el glicerol por HPLC y análisis enzimático. Como máximo, se pudo detectar 0,25 g/l de glicerol en el medio inicial; si todo este glicerol se transformaba en 1,3-propanodiol, puede decirse que 0,21 g/l de propanodiol se han producido a partir de glicerol.

Después de 10 días de incubación, una muestra procedente del matraz con cultivo de Lactobacillus reuteri se eliminó, se analizó por HPLC y GC-MS y se comparó con una muestra de medio inicial. Corrigiendo el glicerol presente en el medio, Lactobacillus reuteri produjo 1,35 g/l de 1,3-propanodiol a partir de sustratos distintos de glicerol.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN: E. I. DUPONT DE NEMOURS AND COMPANY

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1007 MARKET STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: WILMINGTON

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: DELAWARE

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: E.U.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19898

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 302-892-8112

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 302-773-0164

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN: GENENCOR INTERNATIONAL, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 4 CAMBRIDGE PLACE 1870 SOUTH WINTON ROAD

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: ROCHESTER

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: NUEVA YORK

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: E.U.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 14618

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO:

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: BIOCONVERSIÓN DE UNA FUENTE DE CARBONO FERMENTABLE EN 1,3-PROPANODIOL POR UN SOLO MICROORGANISMO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 46

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: DISQUETE DE 3,50 PULGADAS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MICROSOFT WINDOWS 3.1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: MICROSOFT WORD 6.0

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/440.293

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 DE MAYO, 1995

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN: LINDA AXAMETHY FLOYD

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.692

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: CR-9715-B

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12.145 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

19

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:4:

\hskip1,3cm

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

1100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 181 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 149 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

116

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:34:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:35:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:36:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:41:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:42:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:43:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:44:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

138

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:45:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,3cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID. nº:46:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. nº:46:

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\hskip1,3cm

140

Claims (28)

1. Un procedimiento de bioconversión para producir 1,3-propanodiol que comprende poner en contacto, en condiciones apropiadas, un sustrato de carbono en el que el sustrato de carbono tiene al menos un solo átomo de carbono y con la condición de que el sustrato de carbono sea distinto de glicerol o dihidroxiacetona, con un solo microorganismo que tiene al menos un gen que expresa una enzima deshidratasa activa en el que el microorganismo se selecciona del grupo consistente en miembros de los géneros Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter, Lactobacillus, Aspergillus, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Torulopsis, Metilobacter, Escherichia, Salmonella, Bacillus, Streptomyces y Pseudomonas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el gen codifica la glicerol deshidratasa y se aísla del grupo consistente en miembros de los géneros Klebsiella, Lactobacillus, Enterobacter, Citrobacter, Pelobacter, Ilyobacter, y Clostridium.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el gen codifica la diol deshidratasa y se aísla del grupo consistente en miembros de los géneros Klebsiella y Salmonella.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la enzima deshidratasa es una enzima glicerol deshidratasa o una enzima diol deshidratasa.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el microorganismo se transforma con al menos un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2 y dhaB3 (E.C.4.2.1.30) y/o dhaT (E.C.1.1.1,202) mediante el cual el organismo expresa la enzima deshidratasa activa.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el microorganismo se selecciona del grupo consistente en microorganismos recombinantes transformados con un gen que codifica una enzima glicerol deshidratasa o un gen que codifica una enzima diol deshidratasa y microorganismos mutantes con fenotipos que aumentan la producción de 1,3-propanodiol.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el microorganismo se selecciona del grupo consistente en miembros de los géneros Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, o es una Escherichia recombinante.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el microorganismo es E. coli recombinante.

9. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el microorganismo se selecciona del grupo consistente en Streptomyces sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Saccharomyces sp, Aspergillus sp., Lactobacillus sp. y Pichia sp. recombinantes, el microorganismo recombinante se transforma con al menos un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2 y dhaB3 (E.C.4.2.1.30) y/o dhaT (E.C.1.1.1.202) por lo que el organismo expresa la enzima deshidratasa activa y el sustrato de carbono es un monosacárido.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el microorganismo se selecciona del grupo consistente en Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Pichia pastoris y Bacillus licheniformis recombinantes, el microorganismo recombinante se transforma con al menos un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2 y dhaB3 (E.C.4.2.1.30) y/o dhaT (E.C.1,1.1.202) por lo que el organismo expresa la enzima deshidratasa activa y el sustrato de carbono es un monosacárido.

11. El procedimiento de las reivindicaciones 1 u 8, en el que el microorganismo es una E. coli recombinante que contiene un gen de glicerol deshidratasa procedente de Klebsiella pneumoniae.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sustrato de carbono se selecciona del grupo consistente en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el sustrato de carbono es la glucosa.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sustrato de carbono es un alcohol.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además el cultivo del microorganismo en un medio antes de ponerlo en contacto con el sustrato de carbono.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además recuperar el 1,3-propanodiol.

17. Utilización, en un procedimiento según la reivindicación 1, de un cósmido que comprende un fragmento de ADN de aproximadamente 35 kb aislado de Klebsiella pneumoniae, en la que el fragmento de ADN codifica la enzima glicerol deshidratasa activa que tiene el digesto de la enzima de restricción de la Figura 1, columnas 1 y 2.

18. Utilización, en un procedimiento según la reivindicación 1, de un microorganismo transformado que comprende un microorganismo hospedador y el cósmido definido en la reivindicación 17.

19. La utilización de la reivindicación 18, en la que el microorganismo hospedador es E. coli, el microorganismo designado por el registro de la ATCC nº 69789.

20. Utilización, en un procedimiento según la reivindicación 1, de un microorganismo transformado que comprende un microorganismo hospedador y un primer fragmento de ADN aislado de Klebsiella pneumoniae, el primer fragmento de ADN que codifica la enzima glicerol deshidratasa activa que tiene el digesto de la enzima de restricción de la Figura 1, columnas 1 y 2, y al menos un segundo fragmento de ADN aislado de Klebsiella pneumoniae, el segundo fragmento de ADN que codifica la proteína funcional activa distinta de una enzima glicerol deshidratasa.

21. Una Pseudomonas sp. recombinante que comprende un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2 y dhaB3 y dhaT y se designa por el registro de la ATCC nº 55760.

22. Una Pichia pastoris recombinante que comprende un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2 y dhaB3 y dhaT y se designa por el registro de la ATCC nº 74363.

23. Una cepa pMCK1/10/17 (MH) #A de Saccharomyces cerevisiae recombinante, que comprende un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT y se designa por el registro de la ATCC nº 74370.

24. Una cepa BG188/pM26 (clon nº 8) de Bacillus licheniformis recombinante, que comprende un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2 y dhaB3 y se designa por el registro de la ATCC nº 98051.

25. Una cepa BG2864/pM27 (clon nº 1) de Bacillus subtilis recombinante, que comprende un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT y se designa por el registro de la ATCC nº 98050.

26. Una cepa SL 14.2 de Streptomyces lividans recombinante, que comprende un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT y se designa por el registro de la ATCC nº 98052.

27. Una cepa TGR40-13 de Aspergillus niger recombinante, que comprende un fragmento de ADN que codifica dhaB1, dhaB2, dhaB3 y dhaT y se designa por el registro de la ATCC nº 74369.

28. Un microorganismo eucariota recombinante seleccionado del grupo consistente en levadura y hongos filamentosos transformados con al menos un gen que expresa la enzima deshidratasa, en el que dicho gen está integrado en el ADN cromosómico.