CN106455580B - 用于改良玉米产量的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)的产量和早期活力增强组合物、用于改良玉米产量和早期活力的方法以及制备所述组合物的方法。还提供经分离的产量增强甲基杆菌属。

Description

用于改良玉米产量的方法和组合物
技术领域
本国际专利申请案要求2013年12月4日申请的美国专利申请案第61/911,780号的权利。
背景技术
在自然界中广泛发现一碳型有机化合物(one-carbon organic compounds)，如甲烷和甲醇，并且被归类为甲烷氧化菌和甲基营养生物的细菌用作碳源。甲烷氧化菌(Methanotrophic bacteria)包括甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基球形菌属(Methylosphaera)、甲基暖菌属(Methylocaldum)和甲基细胞菌属(Methylocella)中的物种(Lidstrom,2006)。甲烷氧化菌具有甲烷单氧酶，其将来自O2的氧原子并入甲烷，形成甲醇。所有甲烷氧化菌都是专性的一碳使用者(one-carbon utilizers)，其不能使用含有碳-碳键的化合物。另一方面，甲基营养生物还可以利用更复杂的有机化合物，如有机酸、高级醇、糖等。因此，甲基营养菌是兼性甲基营养生物。甲基营养菌包括甲基杆菌属、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基小杆菌属(Methylobacillus)、噬甲基菌属(Methylophaga)、氨基杆菌属(Aminobacter)、耗甲基杆菌属(Methylorhabdus)、甲基球形菌属(Methylopila)、甲基磺酰菌属(Methylosulfonomonas)、马氏磺酰菌属(Marinosulfonomonas)、副球菌属(Paracoccus)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、屈曲杆菌属(Ancylobacter)(也称为微环菌属(Microcyclus))、硫杆菌属(Thiobacillus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、节杆菌属(Arthobacter)和诺卡菌属(Nocardia)中的物种(Lidstrom,2006)。
甲基杆菌属中的大部分甲基营养菌是粉红色的。其常规上称为PPFM细菌，是粉红色兼性甲基营养生物。Green(2005,2006)发现甲基杆菌属中的十二种经验证的物种，具体来说噬氨基甲基杆菌(M.aminovorans)、氯甲烷甲基杆菌(M.chloromethanicum)、二氯甲烷甲基杆菌(M.dichloromethanicum)、扭脱原单胞甲基杆菌(M.extorquens)、福氏甲基杆菌(M.fujisawaense)、嗜中温甲基杆菌(M.mesophilicum)、嗜有机甲基杆菌(M.organophilum)、耐辐射甲基杆菌(M.radiotolerans)、罗得西亚甲基杆菌(M.rhodesianum)、罗氏甲基杆菌(M.rhodinum)、硫氰基甲基杆菌(M.thiocyanatum)和扎氏甲基杆菌(M.zatmanii)。然而，嗜构巢曲霉甲基杆菌(M.nidulans)是固氮甲基杆菌而非PPFM(Sy等人,2001)。甲基杆菌在自然界中普遍存在，其可在土壤、灰尘、淡水、沉积物和树叶表面以及工业和临床环境中发现(Green,2006)。
发明内容
本文中提供经分离的产量增强甲基杆菌属、包含产量增强甲基杆菌属的组合物、使用所述组合物增加玉米植物、植物部分和由此衍生的玉米植物的产量的方法以及制备所述组合物的方法。在某些实例中,这类产量增强甲基杆菌属在本文中简称为“甲基杆菌”。在某些实施例中，通过在受控环境(即生长箱或温室)中或在场地测试中相比于未经处理的对照植物或相比于用对产量无影响或对产量具有不良影响的甲基杆菌属和其组合处理的对照植物分析甲基杆菌属的产量改良来区分产量增强甲基杆菌属与其它对产量无影响或对产量具有不良影响的甲基杆菌属。在某些实施例中，产量增强甲基杆菌属是选自由以下各者组成的群组的甲基杆菌属分离物：ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、ISO11(NRRL B-50939)和其衍生物。
本文中提供用于改良玉米植物产量的方法，其包含在约V6到约R3发育期向玉米植物施用包含甲基杆菌属的组合物。在某些实施例中，所述方法包含(a)在约V6到约R3发育期向玉米植物施用包含甲基杆菌属的组合物，其中所述组合物包含：(i)上面生长和粘附有甲基杆菌的固体物质；(ii)其中生长甲基杆菌的乳液；或(iii)甲基杆菌分离物ISO02(NRRLB-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、ISO11(NRRL B-50939)或其衍生物和农业上可接受的佐剂、赋形剂或其组合；和(b)使玉米植物生长到成熟期，由此改良玉米植物的产量。在某些实施例中，在液体或乳液中提供上面生长和粘附有甲基杆菌的固体物质。在所述方法的某些实施例中，组合物包含上面生长和粘附有甲基杆菌的固体物质或其中生长甲基杆菌的乳液。在所述方法的某些实施例中，组合物包含固体物质或乳液并且其中甲基杆菌属是选自由以下各者组成的群组：ISO02(B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)和其衍生物。在所述方法的某些实施例中，所述方法进一步包含使玉米植物生长到成熟期。在所述方法的某些实施例中，在约V6到约R2发育期、约R1到R2发育期、约R1到R3发育期或约R1发育期施用组合物。在所述方法的某些实施例中，组合物包含：(i)上面生长和粘附有甲基杆菌的固体物质。在所述方法的某些实施例中，组合物是按照约1×106CFU/gm到约1×1014CFU/gm的效价包含甲基杆菌属的固体。在所述方法的某些实施例中，组合物是含有固体物质或乳液的液体并且其甲基杆菌属效价是约1×106CFU/mL到约1×1011CFU/mL。在所述方法的某些实施例中，甲基杆菌属是选自由以下各者组成的群组：ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)和其衍生物。在某些实施例中，甲基杆菌属是ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)或ISO04(NRRL B-50932)的草甘膦抗性或草铵膦抗性衍生物。在上述方法中的任一种的某些实施例中，所施用的组合物涂布或部分涂布玉米植物或其一部分。在上述方法中的任一种的某些实施例中，向玉米植物的簇叶施用组合物。在上述方法中的任一种的某些实施例中，组合物进一步包含杀真菌剂。在上述方法中的任一种的某些实施例中，所述方法进一步包含从成熟玉米植物收集种子的步骤。在上述方法中的任一种的某些实施例中，与从未接受甲基杆菌属施用的对照玉米植物获得的所收集的种子的产量相比，所收集的种子的产量增加。
本文还提供涂有或部分涂有包含甲基杆菌属的组合物的玉米植物或玉米植物部分。在某些实施例中，甲基杆菌属是选自由以下各者组成的群组：ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、ISO11(NRRL B-50939)和其衍生物。在某些实施例中，甲基杆菌属是ISO11(NRRL B-50939)或其衍生物。在某些实施例中，组合物包含：(i)上面生长和粘附有甲基杆菌属的固体物质；或(ii)其中生长甲基杆菌属的乳液。在某些实施例中，组合物按照约1×106CFU/gm到约1×1014CFU/gm的效价(对于固体组合物)或约1×106CFU/mL到约1×1011CFU/mL的效价(对于含有固体物质的液体组合物或乳液)包含甲基杆菌属。在某些实施例中，甲基杆菌属是甲基杆菌分离物ISO11或其衍生物。在前述实施例中的任一种的某些实施例中，玉米植物部分是选自由以下各者组成的群组：种子、叶子、穗或穗形雄花。
本文还提供改良玉米植物产量的方法，其包含：(i)在约VE到约V5玉米植物发育期向玉米种子或玉米植物施用包含甲基杆菌属的组合物。在某些实施例中，用于改良玉米植物产量的的方法包含：(a)在约VE到约V5玉米植物发育期向玉米种子或玉米植物施用包含甲基杆菌属的组合物，其中组合物包含：(i)上面生长和粘附有甲基杆菌的固体物质；(ii)其中生长甲基杆菌的乳液；或(iii)甲基杆菌分离物ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、ISO11(NRRL B-50939)或其衍生物和农业上可接受的佐剂、赋形剂或其组合；和(b)从种子生长玉米植物或使玉米植物生长到成熟期，由此改良玉米植物的产量。在所述方法的某些实施例中，组合物包含上面生长和粘附有甲基杆菌的固体物质或其中生长甲基杆菌的乳液。在某些实施例中，在液体或乳液中提供上面生长和粘附有甲基杆菌的固体物质。在所述方法的某些实施例中，所述方法进一步包含从种子生长玉米植物或使玉米植物生长到成熟期。在所述方法的某些实施例中，在约VE到约V3发育期、约V3到约V5发育期、约V2到V4发育期或V3发育期施用组合物。在所述方法的某些实施例中，组合物按照约1×106CFU/gm到约1×1014CFU/gm的效价(对于固体组合物)或约1×106CFU/mL到约1×1011CFU/mL的效价(对于含有固体物质的液体组合物或乳液)包含甲基杆菌属。在所述方法的某些实施例中，甲基杆菌属是甲基杆菌分离物ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRLB-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、ISO11(NRRL B-50939)或其衍生物。在某些实施例中，其衍生物是所选择的对杀菌剂具有抗性的植株。在上述方法中的任一种的某些实施例中，所选择的甲基杆菌分离物的衍生物具有草甘膦抗性或草铵膦抗性。在上述方法中的任一种的某些实施例中，玉米植物是草甘膦耐受性玉米植物并且还在约V2到约V4玉米植物发育期施用含有草甘膦的配方。在所述方法的某些实施例中，甲基杆菌属是甲基杆菌分离物ISO11或其衍生物。在上述方法中的任一种的某些实施例中，所述方法进一步包含从成熟玉米植物收集种子。在上述方法中的任一种的某些实施例中，与从未接受甲基杆菌属施用的对照玉米植物获得的所收集的种子的产量相比，所收集的种子的产量增加。在上述方法中的任一种的某些实施例中，所施用的组合物涂布或部分涂布玉米种子或玉米植物或其一部分。
本文还提供用于改良玉米植物早期活力的的方法，其包含：(a)在约VE到约V3玉米植物发育期向玉米种子或玉米植物施用包含甲基杆菌属的组合物，其中组合物包含：(i)上面生长和粘附有甲基杆菌的固体物质；(ii)其中生长甲基杆菌的乳液；或(iii)甲基杆菌分离物ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、ISO11(NRRL B-50939)或其衍生物和农业上可接受的佐剂、赋形剂或其组合；和(b)从种子生长玉米植物或使玉米植物生长到V3到V6发育期，由此改良玉米植物的早期活力。在所述方法的某些实施例中，在约VE到约V2发育期、约VE到约V1发育期或在VE发育期施用组合物。在某些实施例中，在液体或乳液中提供上面生长和粘附有甲基杆菌的固体物质。在所述方法的某些实施例中，组合物按照约1×106CFU/gm到约1×1014CFU/gm的效价(对于固体组合物)或约1×106CFU/mL到约1×1011CFU/mL的效价(对于含有固体物质的液体组合物或乳液)包含甲基杆菌属。在所述方法的某些实施例中，组合物包含固体或乳液并且甲基杆菌属是甲基杆菌分离物ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、ISO11(NRRL B-50939)或其衍生物。在所述方法的某些实施例中，所选择的其衍生物对杀菌剂具有抗性。在所述方法的某些实施例中，所选择的甲基杆菌分离物具有草甘膦抗性或草铵膦抗性。在所述方法的某些实施例中，玉米植物是草甘膦耐受性玉米植物并且还在约V2到约V4玉米植物发育期施用含有草甘膦的配方。在上述方法中的任一种的某些实施例中，与未接受甲基杆菌属施用的对照玉米植物的活力相比，步骤(b)中的玉米植物的活力增加。在上述方法中的任一种的某些实施例中，增加的活力包含增加的高度、增加的叶子面积、增加的叶绿素含量、增加的茎秆直径、关于V1-V6量表的高级营养生长期、根体积、根长度、根端数目和其组合。在上述方法中的某些实施例中，所施用的组合物涂布或部分涂布玉米种子或玉米植物或其一部分。
具体实施方式
定义
如本文中所使用，短语“上面粘附有”和“粘附性”是指通过在固体物质上生长或生长在固体物质上而与固体物质相关联的甲基杆菌。
如本文中所使用，短语“农业上可接受的佐剂”是指促进组合物中的活性剂处理植物和/或植物部分的性能的物质。在某些组合物中，活性剂可包含甲基杆菌的单培养物或共培养物。
如本文中所使用，短语“农业上可接受的赋形剂”是指实质上惰性物质，其可按用于处理植物和/或植物部分的组合物中活性剂的稀释剂和/或载剂的形式使用。在某些组合物中，活性剂可包含甲基杆菌的单培养物或共培养物。
如本文所使用，术语“甲基杆菌”是指作为甲基杆菌属中的兼性甲基营养生物的细菌。因此，如本文中所使用的术语甲基杆菌不涵盖甲基杆菌属、甲基单胞菌属、甲基微菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基孢囊菌属、甲基球形菌属、甲基暖菌属和甲基细胞菌属中的专性甲烷氧化菌物质。
如本文中所使用，短语“对照植物”是指在种子或任何后续对照植物发育期都未接受用产量或早期活力增强甲基杆菌或包含其的组合物进行的处理的植物。在某些实施例中，对照植物可以是用对产量无影响的甲基杆菌属处理的植物。
如本文中所使用，短语“甲基杆菌的共培养物”是指包含至少两种甲基杆菌的菌株或至少两种甲基杆菌物种的甲基杆菌培养物。
如本文中所使用，短语“受污染的微生物”是指培养物、发酵液、发酵液产物中的微生物，或在引入培养物、发酵液、发酵液产物或组合物之前未发现的组合物。
如本文中所使用，当在甲基杆菌分离物的情形中使用时，短语“其衍生物”是指任何从甲基杆菌分离物获得的菌株。甲基杆菌分离物的衍生物包括(但不限于)通过选择获得的菌株的变异体、通过突变诱发和选择而选择的菌株的变异体和从甲基杆菌分离物获得的基因转型菌株。
如本文中所使用，当在向玉米种子、植物或植物部分施用含有甲基杆菌的组合物的情形中使用时，短语“早期玉米活力”或“早期活力”是指玉米植物在V3到V6发育期中的任何生长特征，其表示与未经处理的玉米植物相比改良的生长。这类生长特征可包括(但不限于)增加的高度、增加的叶子面积、增加的叶绿素含量、增加的茎秆直径、关于V1-V6量表的高级营养生长期、增加的根体积、增加的根长度、增加的根端数目和其组合。
如本文所使用，术语“乳液”是指两种不可混溶液体的胶态混合物，其中一种液体是连续相并且另一种液体是分散相。在某些实施例中，连续相是水性液体并且分散相是在所述水性液体中不可混溶或部分可混溶的液体。
如本文中所使用，短语“基本上不含受污染的微生物”是指一种培养物、发酵液、发酵产品或组合物，其中按量或类型计，培养物、发酵液、发酵产品或组合物中至少约95％微生物是所需甲基杆菌或其它具有预定身份的所需微生物。
如本文中所使用，短语“无生命固体物质”是指满足以下条件的物质：在水或水性溶液中不可溶或部分可溶并且无生命或不是产生其的仍然具有活力的有机体的一部分。
如本文中所使用，短语“甲基杆菌的单培养物”是指由甲基杆菌的单一菌株组成的甲基杆菌培养物。
如本文所使用，术语“肽”是指任何具有50个或更少个氨基酸残基的多肽。
如本文所使用，术语“蛋白质”是指任何具有51个或更多个氨基酸残基的多肽。
如本文中所使用，“农药”是指一种试剂，其为杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀菌剂或其任何组合。
如本文中所使用，短语“抑菌剂”是指抑制细菌生长，但不杀死细菌的试剂。
如本文中所使用，短语“不实质上抑制所述甲基杆菌生长的农药”是指任何满足以下条件的农药：当在包含发酵产物的组合物中提供时，在组合物施用于植物或植物部分时，与不含农药的组合物相比，引起不超过50％的甲基杆菌生长抑制，其中所述发酵产物包含上面粘附有甲基杆菌的单培养物或共培养物的固体物质。在某些实施例中，当组合物施用于植物或植物部分时，与不含农药的组合物相比，农药引起不超过40％、20％、10％、5％或1％的甲基杆菌生长抑制。
如本文所使用，术语“PPFM细菌”是指(但不限于)甲基杆菌属中除结节性甲基杆菌(M.nodularis)以外的细菌物种。
如本文中所使用，短语“固体物质”是指在水或水性溶液中不可溶或部分可溶的物质。
如本文中所使用，短语“可悬浮于其中的固相”是指可通过搅拌而分布在整个液体中的固体物质。
如本文所使用，术语“非可再生”是指无法再生成为完整植物的植物部分或经处理的植物产品。
如本文中所使用，短语“基本上所有固相悬浮于液相中”是指其中至少95％、98％或99％的包含固相的固体物质通过搅拌分布于整个液体中的培养基。
如本文中所使用，短语“基本上所有固相不悬浮于液相中”是指其中小于5％、2％或1％的固体呈粒子形式的培养基，所述固体通过搅拌分布于整个培养基中。
应理解，当任何前述定义与以引用的方式并入本文中的任何专利或非专利参考文献、本文中列举的任何专利或非专利参考文献或在别处发现的任何专利或非专利参考文献中所提供的定义不一致时，本文中将使用前述定义。
产量和早期活力增强甲基杆菌、包含产量和早期活力增强甲基杆菌的组合物、其使用方法以及制备方法
本文中提供多种产量增强甲基杆菌分离物、包含这些甲基杆菌的组合物、使用所述组合物改良玉米植物产量的方法以及制备所述组合物的方法。可以通过相对于未经处理的植物或植物部分测量任一种或所有产量变化来测定足以提供改良的玉米植物产量的包含产量增强甲基杆菌属的组合物的量。在某些实施例中，可通过以每单位面积为基础测量种子的产出来评估产量(即蒲式耳/英亩、千克/公顷等)，其中经产量增强甲基杆菌属处理的植物或由经甲基杆菌属处理的种子生长的植物在与对照植物大致相同的密度下生长。在某些实施例中，可通过与未经处理的对照植物相比，以经产量增强甲基杆菌属处理的植物中的每个植物或每个植物部分为基础测量产出来评估产量(每个植物的种子(克)、每个玉米穗轴的种子(克)、每个植物的果仁、每个玉米穗轴的果仁等)。
本文中提供经分离的产量增强甲基杆菌属。在某些实施例中，甲基杆菌选自由以下各者组成的群组：噬氨基甲基杆菌、扭脱原单胞甲基杆菌、福氏甲基杆菌、嗜中温甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、罗得西亚甲基杆菌、结节性甲基杆菌、费氏甲基杆菌(M.phyllosphaerae)、硫氰基甲基杆菌和稻甲基杆菌(M.oryzae)。在某些实施例中，甲基杆菌不是耐辐射甲基杆菌或稻甲基杆菌。在某些实施例中，产量或早期活力增强甲基杆菌分离物选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04、ISO11和其衍生物。在某些实施例中，当在玉米发育的繁殖期之前或在繁殖期间施用时，产量增强甲基杆菌分离物可增强产量，并且是选自由ISO02、ISO03和ISO04组成的群组的甲基杆菌属。在某些实施例中，当施用于玉米种子或在玉米发育的无性繁殖期施用时，产量增强甲基杆菌分离物可增强产量。在其中产量增强甲基杆菌分离物施用于玉米种子或在玉米发育的无性繁殖期施用的某些实施例中，甲基杆菌属是ISO11。在某些实施例中，与未经处理的对照植物或由未经处理的种子生长的植物相比，产量增强甲基杆菌使经处理的植物或由经处理的种子产生的植物的产量增加至少约2％、至少约5％、至少约10％或至少约15％。在某些实施例中，与未经处理的对照植物或由未经处理的种子产生的植物相比，产量增强甲基杆菌使经处理的植物或由经处理的种子产生的植物的产量增加至少约2％或至少约5％到至少约10％或至少约20％。
在某些实施例中，甲基杆菌不是耐辐射甲基杆菌或稻甲基杆菌。在某些实施例中，当施用于种子时，产量或早期活力增强甲基杆菌使产量和/或早期活力增加。在某些实施例中，当仅在玉米发育的繁殖期之前或在繁殖期间施用时，产量增强甲基杆菌使产量增加。在上述组合物中的任一种的某些实施例中，组合物包含上面粘附有甲基杆菌的单培养物或共培养物的固体物质。在其中甲基杆菌粘附于固体物质的某些实施例中，组合物包含由上面粘附有甲基杆菌的单培养物或共培养物的固体物质和液体形成的胶体。在某些实施例中，胶体是凝胶。在某些上述组合物的某些实施例中，组合物是不含固体物质的乳液。在上述组合物中的任一种的某些实施例中，产量或早期活力增强甲基杆菌是选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04、ISO11和其衍生物。在上述组合物中的任一种的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04和其衍生物。
在某些实施例中，可以通过处理植物、种子、其中种植植物或由种子产生的植物的土壤或其它其中种植植物或由种子产生的植物的植物生长培养基，并且分析所增加的产量或所改良的早期活力来鉴别经分离的产量或早期活力增强甲基杆菌属。
在某些实施例中，用产量或早期活力增强甲基杆菌属处理玉米种子或处于发育的无性繁殖期的植物。玉米的无性繁殖期如下：VE(胚芽鞘出现到第一片叶子即将带圈之前)、VI(第一片叶子带圈)、V2(第一和第二片叶子带圈)、V3(第一到第三片叶子带圈)、V4(第一到第四片叶子带圈)、V5(第一到第五片叶子带圈)、V6(第一到第六片叶子带圈)等到V18(植物具有18片带圈的叶子)。玉米无性繁殖期的说明可见于万维网(因特网)agronext.iastate.edu/corn/production/management/growth/CornGrowthandDevelopment.html和Abendroth等人的“《玉米生长和发育(Corn Growthand Development)》”,爱荷华州大学扩展和推广出版物PMR 1009(Iowa State UniversityExtension and Outreach publication PMR 1009),2011年3月中。在某些实施例中，在约VE到约V4、V5或V6发育期施用产量增强甲基杆菌属。在某些实施例中，在约VE、V1、V2或V3到约V4、V5或V6发育期施用产量增强甲基杆菌属。在某些实施例中，施用于种子或在无性繁殖期间施用的产量或早期活力增强甲基杆菌是ISO11。
在某些实施例中，在向草甘膦耐受性转殖基因玉米植物施用草甘膦之前、在施用草甘膦期间或在施用草甘膦之后施用产量或早期活力增强甲基杆菌。可使用的市售草甘膦配方包括(但不限于)Roundup Original
Figure GDA0001009518450000091
Roundup
Figure GDA0001009518450000092
Roundup
Figure GDA0001009518450000093
或RoundUp
Figure GDA0001009518450000094
(Monsanto Co.,St.Louis,MO.,USA)；Touchdown
Figure GDA0001009518450000095
或Touchdown
Figure GDA0001009518450000096
(Syngenta,Wilmington,Delaware,USA)；
Figure GDA0001009518450000097
Glyphomax
Figure GDA0001009518450000098
或Glyphomax
Figure GDA0001009518450000099
(Dow Agrosciences LLC,Indianapolis,IN,USA)。通常在约V3和/或约V6无性繁殖发育期用草甘膦对玉米植物进行喷雾。在某些实施例中，在施用草甘膦之前、在施用草甘膦期间或在施用草甘膦期间之后施用的产量增强甲基杆菌是所选择的具有草甘膦抗性的甲基杆菌。已描述的关于草甘膦抗性细菌的选择方法(Comai等人,《科学(Science)》221(4608):370-371)可适用于产量增强甲基杆菌的选择。本文中提供来自甲基杆菌的诱变型或其它群体(如ISO02、ISO03、ISO04、ISO11和其衍生物)的草甘膦抗性产量或早期活力增强甲基杆菌的选择和使用方法。
在某些实施例中，用产量增强甲基杆菌属处理处于发育的晚期无性繁殖期到繁殖期的玉米种子或植物。如本文中所使用，玉米的晚期无性繁殖期是发育的V6到V(n)(第n片叶子，其中最终叶子数目取决于玉米品种和环境条件)或VT(抽穗)期。玉米发育的繁殖期是：R1(开始开花-在任何结节上的至少一朵花)；R2(完全开花-在两个最上部结节中的一个处的开放式花朵)；R3(开始结荚-位于四个最上部结节中的一个处的5mm豆荚)；R4(完全结荚-位于四个最上部结节中的一个处的2cm豆荚)；R5(开始播种-种子在主茎干上四个最上部结节中的一个处的豆荚中的长度是3mm)；R6(完全播种-含有绿色种子的豆荚，所述种子填满位于主茎干上的四个最上部结节中的一个处的豆荚空间)；R7(开始成熟-主茎干上的一个正常豆荚已达到其成熟豆荚颜色)；和R8(完全成熟-95％的豆荚已到达其完全成熟颜色)。玉米无性繁殖期的说明可见于万维网(因特网)agronext.iastate.edu/corn/production/management/growth/CornGrowthandDevelopment.html和Abendroth等人的“《玉米生长和发育》”,爱荷华州大学扩展和推广出版物PMR1009,2011年3月中。在某些实施例中，在约V5、V6到约Vn发育期或VT期到约R2、R3、R4、R5或R6发育期施用产量增强甲基杆菌属。在某些实施例中，在约V12、V16、V18、Vn或VT发育期到约R2、R3或R4发育期施用产量增强甲基杆菌属。在某些实施例中，在约R1发育期施用产量增强甲基杆菌属。在某些实施例中，施用于晚期无性繁殖或繁殖期玉米植物的产量增强甲基杆菌选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04和其衍生物。
本文提供的多种甲基杆菌属分离物披露于表1中。
表1.甲基杆菌属分离物
分离物编号 NLS编号 USDA ARS NRRL编号<sup>1</sup>
ISO01 NLS0046 NRRL B-50929
ISO02 NLS0020 NRRL B-50930
ISO03 NLS0017 NRRL B-50931
ISO04 NLS0042 NRRL B-50932
ISO05 NLS0089 NRRL B-50933
ISO06 NLS0068 NRRL B-50934
ISO07 NLS0065 NRRL B-50935
ISO08 NLS0069 NRRL B-50936
ISO09 NLS0062 NRRL B-50937
ISO10 NLS0064 NRRL B-50938
ISO11 NLS0021 NRRL B-50939
ISO12 NLS0066 NRRL B-50940
ISO13 NLS0037 NRRL B-50941
ISO14 NLS0038 NRRL B-50942
1出于专利程序的目的，由美国农业部(U.S.Department of Agriculture)，国家农业利用研究、农业研究服务中心(National Center for Agricultural UtilizationResearch,Agricultural Research Service)(1815North University Street,Peoria,Illinois 61604U.S.A.)的农业研究服务培养物收集中心(AGRICULTURAL RESEARCHSERVICE CULTURE COLLECTION；NRRL)在关于国际承认微生物寄存物(InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms)的布达佩斯条约下寄存的菌株的寄存号受制于37CFR§1.808(b)，由寄存人赋予的关于所寄存材料的公开可得性的所有限制将在授予本专利申请案任何专利权后不可撤销地撤除。
披露表1中的甲基杆菌菌株的其它特定用途的共同指定的专利申请案如：(1)增加大豆产量(US 61/911698，2013年12月4日申请；和要求2014年12月4日申请的相同申请案的权利的国际申请案)；(2)改良莴苣培养(国际专利申请案PCT/US14/68558，2014年12月4日申请)；(3)改良番茄生长(2014年12月4日申请的国际专利申请案PCT/US 14/68611)并且各自以引用的方式并入本文中。全部以引用的方式特定并入本文中的是2014年12月4日申请的国际申请案PCT/US 14/68558中所披露的NLS017、NLS020、NLS037、NLS042、NLS065和NLS066的氨基酸和基因体核酸序列。全部以引用的方式特定并入本文中的还有2014年2月4日申请的国际专利申请案PCT/US14/68611中所披露的NLS017和NLS066的基因体核酸序列。这类氨基酸和基因体核酸序列可用于鉴别包含甲基杆菌属NLS017、NLS020、NLS037、NLS042、NLS065和NLS066的组合物、植物部分、植物种子或经处理的植物产物。
本文还提供用于改良玉米产量的方法，其包含按照与未接受组合物施用的对照植物、植物部分或由其获得的植物的产量相比，可提供植物、植物部分或由其获得的植物中增加的玉米产量的量向植物或植物部分施用任一种本文中提供的上述组合物。在某些实施例中，与对照植物、植物部分或由其获得的植物的感染相比，施用组合物可使植物、植物部分或由其衍生的植物中的玉米产量增加至少约50％、至少约75％、至少约85％或至少约95％。在某些实施例中，植物部分是选自由以下各者组成的群组：叶子、茎干、花、根和种子。在某些实施例中，所述方法进一步包含收集至少一个植物部分的步骤，所述至少一个植物部分是选自由以下各者组成的群组：叶子、茎干、花、根或来自植物或植物部分的种子。在上述方法中的任一种的某些实施例中，所述方法进一步包含从植物或植物部分获得加工食品或饲料组合物。在某些实施例中，加工食品或饲料组合物是食物或糊状物。在上述方法中的任一种的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04、ISO11和其衍生物。在其中在玉米发育的繁殖期之前或在繁殖期间施用组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04和其衍生物。在其中向种子或在玉米发育的无性繁殖期间施用组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是ISO11。
还提供用于制造适用于改良玉米产量或早期活力的组合物的方法，其包含组合产量或早期活力增强甲基杆菌与农业上可接受的赋形剂和/或农业上可接受的佐剂。在所述方法的某些实施例中，甲基杆菌属是选自由以下各者组成的群组：噬氨基甲基杆菌、扭脱原单胞甲基杆菌、福氏甲基杆菌、嗜中温甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、罗得西亚甲基杆菌、结节性甲基杆菌、费氏甲基杆菌、硫氰基甲基杆菌和稻甲基杆菌。在所述方法的某些实施例中，甲基杆菌不是耐辐射甲基杆菌或稻甲基杆菌。在所述方法的某些实施例中，所述甲基杆菌粘附于固体物质。在所述方法的某些实施例中，甲基杆菌粘附于固体物质，所述固体物质与液体组合以形成组合物，其是胶体。在所述方法的某些实施例中，胶体是凝胶。在所述方法的某些实施例中，通过在固体物质存在下培养甲基杆菌来提供粘附于固体物质的甲基杆菌。在所述方法的某些实施例中，组合物包含乳液。在所述方法的某些实施例中，通过在乳液中培养甲基杆菌来提供甲基杆菌。在上述方法中的任一种的某些实施例中，产量或早期活力增强甲基杆菌是选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04、ISO11和其衍生物。在其中在玉米发育的繁殖期之前或在繁殖期间施用组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04和其衍生物。在其中向种子或在玉米发育的无性繁殖期间施用组合物的某些实施例中，产量或早期活力增强甲基杆菌是ISO11。
已经发现与在单独的液体培养基中培养甲基杆菌的方法相比，在包含液相和固体物质的两相培养基中培养甲基杆菌的方法可显著增加甲基杆菌的所得产量。在某些实施例中，所述方法可包含使甲基杆菌在具有粒状固体物质的液体培养基中生长，所述粒状固体物质可在提供用于甲基杆菌生长的条件下通过搅拌悬浮于液体中。在其中使用粒状固体物质的某些实施例中，至少基本上所有固相可由此在搅拌时悬浮于液相中。这类粒状固体物质可包含长度或直径是约1毫米或更小的材料。在某些实施例中，搅拌程度足以提供粒状固体物质于液相中的均匀分布和/或最佳培养物掺气含量。然而，在本文中提供的其它实施例中，至少基本上所有固相不悬浮于液相中，或部分固相悬浮于液相中且部分固相悬浮于液相中。某些固相悬浮于液相中之两相培养基中可使用非粒状固体物质。这类非粒状固体物质包括(但不限于)长度或直径大于约1毫米的材料。这类粒状和非粒状固体物质还包括(但不限于)多孔、纤维或按其它方式配置以提供增加的用于甲基杆菌的粘附性生长的表面积的材料。其中部分固相悬浮于液相中并且部分固相不悬浮于液相中的两相培养基可包含粒状和非粒状固体物质的混合物。任一种前述两相培养基中使用的这类粒状和非粒状固体物质还包括(但不限于)多孔、纤维或按其它方式配置以提供增加的用于甲基杆菌的粘附性生长的表面积的材料。在某些实施例中，培养基包含由固体和液相形成的胶体。可预先形成包含固体和液体的胶体并且添加到液体培养基中或可在含有固体和液体的培养基中形成。包含固体和液体的胶体可通过使某些固体物质经历化学和/或热变化来形成。在某些实施例中，胶体是凝胶。在某些实施例中，培养基的液相是乳液。在某些实施例中，乳液包含水性液体和在水性液体中不可混溶或仅可部分混溶的液体。在水中不可混溶或仅可部分混溶的液体包括(但不限于)以下各者中的任一种：(1)在25℃下，在水中的互混性等于或小于戊醇、己醇或庚醇在水中的互混性的液体；(2)包含醇、醛、酮、脂肪酸、磷脂或其任何组合的液体；(3)选自由以下各者组成的群组的醇：含有至少5个碳的脂肪醇和固醇；(4)动物油、微生物油、合成油、植物油或其组合；和/或(5)选自由以下各者组成的群组的植物油：玉米、大豆、棉花、花生、葵花、橄榄、亚麻、椰子、棕榈、油菜籽、芝麻籽、红花和其组合。在某些实施例中，按质量计，不可混溶或部分不可混溶的液体可包含至少约0.02％到约20％液相。在某些实施例中，所述方法可包含获得包含液体、固体和甲基杆菌的两相培养基，并且在提供用于甲基杆菌生长的条件下培育培养物。包含液体、固体和甲基杆菌的两相培养基可通过多种方法获得，其包括(但不限于)以下各者中的任一种：(a)用甲基杆菌接种包含液体和固体物质的两相培养基；(b)用甲基杆菌接种固体物质并且接着将包含甲基杆菌的固体物质引入液体培养基；(c)用甲基杆菌接种固体物质，在固体物质上培育甲基杆菌，并且接着将包含甲基杆菌的固体物质引入液体培养基；或(d)(a)、(b)或(c)的任何组合。用于在包含液体和固体的两相培养基中生长甲基杆菌的方法和组合物披露于2013年5月31日申请的共同指定的美国专利申请案第13/907,161号(其以全文引用的方式并入本文中)和2013年5月31日申请的共同指定的国际专利申请案PCT/US13/43722(其以全文引用的方式并入本文中)中。
也已经发现与在单独的液体培养基中培养甲基杆菌的方法相比，在包含乳液的培养基中培养甲基杆菌的方法可显著增加甲基杆菌的所得产量。在某些实施例中，用于制备本文中提供的组合物的方法可包含使产量增强甲基杆菌试剂在提供用于甲基杆菌生长的条件下，在乳液中生长。可通过多种方法获得包含乳液和产量增强甲基杆菌的培养基，所述方法包括(但不限于)以下各者中的任一种：(a)用甲基杆菌接种包含乳液的培养基；(b)用甲基杆菌接种水性液体，引入非水性液体并且混合以形成乳液；(c)用甲基杆菌接种水性液体，引入非水性液体并且混合以形成乳液；或(d)(a)、(b)或(c)的任何组合。在某些实施例中，乳液包含水性液体和在水性液体中不可混溶或仅可部分混溶的液体。在水中不可混溶或仅可部分混溶的非水性液体包括(但不限于)以下各者中的任一种：(1)在25℃下，在水中的互混性等于或小于正戊醇、正己醇或正庚醇在水中的互混性的液体；(2)包含醇、醛、酮、脂肪酸、磷脂或其任何组合的液体；(3)选自由以下各者组成的群组的醇：含有至少5、6或7个碳的脂肪醇和固醇；(4)动物油、微生物油、合成油、植物油或其组合；和/或(5)选自由以下各者组成的群组的植物油：玉米、大豆、棉花、花生、葵花、橄榄、亚麻、椰子、棕榈、油菜籽、芝麻籽、红花和其组合。在某些实施例中，按质量计，不可混溶或部分不可混溶的非水性液体可包含至少约0.02％到约20％乳液。在某些实施例中，按质量计，不可混溶或部分不可混溶的非水性液体可包含至少约0.05％、0.1％、0.5％或1％中的任一种到约3％、5％、10％或20％乳液。用于在包含乳液的培养基中生长甲基杆菌的方法和组合物披露于2014年5月30日申请的共同指定的国际专利申请案PCT/US2014/040218中，其以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，包含产量或早期活力增强甲基杆菌属的发酵液、发酵液产物或组合物可进一步包含除甲基杆菌以外的一或多种具有预定身份的引入的微生物。可添加的其它微生物包括(但不限于)生物杀虫性或在施用于植物或植物部分时提供某种其它益处的微生物。因此，生物杀虫性或在其它方面有利的微生物包括(但不限于)多种芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、盾壳霉属(Coniothyrium sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)和木霉属(Trichoderma sp.)。微生物性生物杀虫剂可以是细菌、真菌、病毒或原虫。尤其适用的生物杀虫性微生物包括多种枯草杆菌(Bacillus subtilis)、苏力菌(Bacillus thuringiensis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、绿木霉菌(Trichoderma virens)和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)菌株。所添加的其它微生物可以是经基因工程改造的或野生型分离物，其可按纯培养物形式使用。在某些实施例中，预期可在发酵液、发酵液产物或组合物中以孢子形式提供细菌或真菌微生物。
在某些实施例中，由便宜和易于获得的组分制备液体培养基，包括(但不限于)无机盐，如磷酸钾、硫酸镁等；碳源，如丙三醇、甲醇、谷氨酸、天冬氨酸、丁二酸等；和氨基酸掺合物，如蛋白胨、胰蛋白胨等。可使用的例示性液体培养基包括(但不限于)铵矿物质盐(AMS)培养基(Whittenbury等人,1970)、沃格尔-邦纳(Vogel-Bonner；VB)最小培养基(Vogel和Bonner,1956)和LB培养液(“卢里亚-贝尔塔尼培养液(Luria-Bertani Broth)”)。
通常，提供甲基杆菌的有效生长的方法和组合物中使用的固体物质可以是在水或水性溶液中不可溶或仅部分可溶的任何适合的固体物质。当在液体培养基中提供固体物质时，与产量增强甲基杆菌属相比，这类适合的固体物质也是非杀菌性或非抑菌性。在某些实施例中，这类适合的固体物质也是易于以无菌形式获得或使其无菌的固体物质。本文所使用的固体物质可通过任何可移除受污染的微生物的方法除菌且因此包括(但不限于)如高压灭菌、辐射、化学处理和其任何组合的方法。这些固体物质包括动物、植物、微生物、真菌或矿物质源的天然物质、人工物质或天然和人工物质的组合。在某些实施例中，固体物质是无生命固体物质。动物、植物、微生物或真菌来源的无生命固体物质可以从不再生存(即不再存活)或已使其不再生存的动物、植物、微生物或真菌获得。因此，当已经移除先前相关的硅藻或按其它方式使其不再存活时，硅藻壳是无生命固体物质。因为硅藻壳是无生命固体物质，其不被视为光合生物体或光合微生物。在某些实施例中，固体物质包括(但不限于)砂、粉砂、土壤、泥土、白蜡木、墨绿、硅藻土和其它类似矿石、毛玻璃或玻璃珠粒、磨砂陶瓷材料、瓷珠、膨润土、高岭土、滑石、珍珠岩、云母、蛭石、二氧化硅、石英粉末、蒙脱石和其组合。在某些实施例中，固体物质可以是聚合物或聚合珠粒。可以固体物质形式使用的聚合物包括(但不限于)多种多糖，如纤维素聚合物和壳质聚合物(其在水或水性溶液不可溶或仅部分可溶)、琼脂(即半乳聚糖)和其组合。在某些实施例中，固体物质可以是不可溶或仅部分可溶的盐晶体。可使用的盐晶体包括(但不限于)不可溶或仅部分可溶的碳酸盐、铬酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、氢氧化物、氧化物和硫化物。在某些实施例中，固体物质可以是微生物细胞、真菌细胞、微生物孢子或真菌孢子。在某些实施例中，固体物质可以是微生物细胞或微生物孢子，其中微生物细胞或微生物孢子不是光合微生物。在某些实施例中，微生物细胞或微生物孢子不是光合微生物，其中光合微生物选自由以下各者组成的群组：藻类、蓝细菌、硅藻、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、小球藻(Chlorella)、盐生杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)、江蓠(Gracilaria)、颗石藻(Pleurochrysis carterae)、马尾藻(Sargassum)和石莼(Ulva)。在其它实施例中，固体物质可以是非活性(即不再存活的)微生物细胞、真菌细胞、微生物孢子或真菌孢子。在其它实施例中，固体物质可以是休眠(即存活，但不主动分裂)微生物细胞、真菌细胞、微生物孢子或真菌孢子。在其它实施例中，固体物质可以是微生物来源的细胞碎片。在其它实施例中，固体物质可以是来自植物的任一部分的颗粒物质。可用于获得固体物质的植物部分包括(但不限于)穗轴、外皮、壳、叶子、根、花、茎干、树皮、种子和其组合。还可以使用从经处理的植物部分获得的产物，包括(但不限于)甘蔗渣、麦麸、大豆渣、碎籽饼、秸秆等。可研磨这类植物部分、经处理的植物和/或经处理的植物部分以便获得可使用的粒状形式的固体材料。在某些实施例中，可使用木材或木材产物，包括(但不限于)木浆、锯屑、刨花等。在某些实施例中，固体物质可以是来自动物的颗粒物质，包括(但不限于)骨粉、明胶、研磨或粉末状壳、毛发、浸软兽皮等。
在某些实施例中，以粒状形式提供固体物质，其实现固体物质在培养基中的分布。在某些实施例中，固体物质包含平均长度或平均直径是约2微米到约1000微米的粒子。在某些实施例中，固体物质包含平均长度或平均直径是约1微米到约1000微米的粒子。在某些实施例中，固体物质是平均长度或平均直径是约1、2、4、10、20或40微米到约100、200、500、750或1000微米中的任一种的粒子。本文中提供的方法和组合物中使用的粒子的理想特征包括适合的可湿性，使得粒子在搅拌时可悬浮于整个培养基中。
在某些实施例中，以胶体形式在培养基中提供固体物质，其中连续相是液体并且分散相是固体。可用于在用于生长产量增强甲基杆菌属的液体培养基中形成胶体的适合的固体包括(但不限于)多种被称为亲水胶体的固体。本文中提供的培养基、方法和组合物中使用的这类亲水胶体可以是植物、动物、微生物或合成来源的亲水性聚合物。所述方法中使用的亲水胶体聚合物可含有多个羟基和/或可以是聚电解质。本文中提供的组合物和方法中使用的亲水胶体聚合物包括(但不限于)琼脂、海藻酸盐、阿拉伯木聚糖、角叉菜胶、羧甲基纤维素、纤维素、卡德兰(curdlan)、明胶、结冷胶、P-葡聚糖、瓜尔豆胶(guar gum)、阿拉伯胶、刺槐豆胶、果胶、淀粉、三仙胶和其混合物。在某些实施例中，本文中提供的培养基、方法和组合物中使用的胶体可包含亲水胶体聚合物和一或多种蛋白质。
在某些实施例中，固体物质可以是实现固体物质上产量增强甲基杆菌属的粘附性生长的固体物质。粘附于固体物质的产量增强甲基杆菌属是无法通过简单地用生长培养基洗涤具有粘附性产量增强甲基杆菌属的固体物质实质上移除的甲基杆菌，而非粘附性甲基杆菌可通过用液体生长培养基洗涤固体物质来实质上移除。在这一情形中，“实质上移除”意指当用三倍体积的液体生长培养基洗涤固体物质时移除至少约30％、40％、50％、60％、70％或80％的甲基杆菌。这类洗涤可通过多种方法实现，包括(但不限于)从经洗涤的固相倾析液体或使液体通过过滤器上的固相，所述过滤器允许液体中的细菌流过。在某些实施例中，与固体相关联的粘附性产量增强甲基杆菌属可包括直接连接到固体的甲基杆菌和/或间接连接到固体物质的甲基杆菌。间接连接到固体物质的甲基杆菌包括(但不限于)连接到另一种甲基杆菌或另一种微生物的甲基杆菌，所述另一种甲基杆菌或另一种微生物连接到固体物质；通过连接到另一种物质(其连接到固体物质)而连接到固体物质的甲基杆菌等。在某些实施例中，发酵液、发酵液产物或组合物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％的甲基杆菌是粘附于固体物质的甲基杆菌。在某些实施例中，粘附性产量增强甲基杆菌属可按以下密度存在于发酵液、发酵液产物或组合物中固体物质的表面上：至少约1个甲基杆菌/20平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米、至少约1个甲基杆菌/5平方微米、至少约1个甲基杆菌/2平方微米或至少约1个甲基杆菌/平方微米。在某些实施例中，粘附性产量增强甲基杆菌属可按以下密度存在于发酵液、发酵液产物或组合物中固体物质的表面上：至少约1个甲基杆菌/20平方微米到约1个甲基杆菌/平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米到约1个甲基杆菌/平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米到约1个甲基杆菌/平方微米、至少约1个甲基杆菌/5平方微米到约1个甲基杆菌/平方微米或至少约1个甲基杆菌/2平方微米到约1个甲基杆菌/平方微米。在某些实施例中，粘附性产量增强甲基杆菌属可按以下密度存在于发酵液、发酵液产物或组合物中固体物质的表面上：至少约1个甲基杆菌/20平方微米到约1个甲基杆菌/2平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米到约1个甲基杆菌/2平方微米、至少约1个甲基杆菌/10平方微米到约1个甲基杆菌/2平方微米或至少约1个甲基杆菌/5平方微米到约1个甲基杆菌/2平方微米。本文中提供的两相发酵液可包含液相，其含有非粘附性甲基杆菌。在某些实施例中，液相中非粘附性甲基杆菌的效价可小于约100,000、10,000或1,000CFU/ml。在上述组合物中的任一种的某些实施例中，产量或早期活力增强甲基杆菌是选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04、ISO11和其衍生物。在其中在玉米发育的繁殖期之前或在繁殖期间施用组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04和其衍生物。在其中向种子或在玉米发育的无性繁殖期间施用组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是ISO11或其衍生物。
所提供的两相培养方法可产生按以下效价具有产量或早期活力增强甲基杆菌属的发酵液：大于约5×108个集落形成单位/毫升、大于约1×109个集落形成单位/毫升、大于约1×1010个集落形成单位/毫升、至少约3×1010个集落形成单位/毫升。在某些实施例中，本文中提供的发酵液可按以下效价包含产量增强甲基杆菌属：至少约5×108个集落形成单位/毫升到至少约3×1010个集落形成单位/毫升、至少约5×108个集落形成单位/毫升到至少约4×1010个集落形成单位/毫升或至少约5×108个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个集落形成单位/毫升。在某些实施例中，本文中提供的发酵液可按以下效价包含产量增强甲基杆菌属：至少约1×109个集落形成单位/毫升到至少约3×1010个集落形成单位/毫升、至少约1×109个集落形成单位/毫升到至少约4×1010个集落形成单位/毫升或至少约1×109个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个集落形成单位/毫升。在某些实施例中，本文中提供的发酵液可按以下效价包含产量增强甲基杆菌属：至少约1×1010个集落形成单位/毫升到至少约3×1010个集落形成单位/毫升、至少约1×1010个集落形成单位/毫升到至少约4×1010个集落形成单位/毫升或至少约1×1010个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个集落形成单位/毫升。在某些实施例中，本文中提供的发酵液将按以下效价包含产量增强甲基杆菌属：至少约3×1010个集落形成单位/毫升到至少约4×1010个集落形成单位/毫升，或至少约3×1010个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个集落形成单位/毫升。在上述组合物中的任一种的某些实施例中，产量增强甲基杆菌是选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04、ISO11和其衍生物。在其中在玉米发育的繁殖期之前或在繁殖期间施用组合物的某些实施例中，产量增强甲基杆菌选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03和ISO04。在其中向种子或在玉米发育的无性繁殖期间施用组合物的某些实施例中，产量或早期活力增强甲基杆菌是ISO11。
具有粘附性产量或早期活力增强甲基杆菌属的固体物质可以发酵产物形式获得，所得发酵产物可用于制备适用于处理植物或植物部分的多种组合物，以便改良玉米产量或早期活力。或者，本文中提供的组合物可用于处理植物或植物部分，所述组合物包含产量或早期活力增强甲基杆菌属、上面生长有产量或早期活力增强甲基杆菌属的固体物质或包含乳液和其中生长的产量或早期活力增强甲基杆菌属。因此提供至少部分涂有或涂有包含产量增强甲基杆菌属的发酵液产物或组合物的植物、植物部分并且具体来说，植物种子。植物、植物部分或种子的部分涂布包含(但不限于)涂布植物、植物部分或植物种子的表面积的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约99.5％。还提供经处理的植物产物，其含有具有产量增强甲基杆菌属或粘附性产量增强甲基杆菌属的发酵液产物或组合物。具有粘附性产量增强甲基杆菌属的固体物质可用于制备尤其适用于处理植物种子的多种组合物。因此提供已至少部分涂有发酵液产物或组合物的种子。种子的部分涂布包含(但不限于)涂布种子的表面积的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约99.5％。还提供经处理的种子产物，其包括(但不限于)含有本文中提供的发酵液产物或组合物的食品、粉末、饲料和薄片。在某些实施例中，经处理的植物产物将是不可再生的(即将不能发育成植物)。在某些实施例中，至少部分涂布植物、植物部分或植物种子或经处理的植物、植物部分或种子产物中所含的发酵产物或组合物中使用的固体物质包含固体物质和相关或粘附性产量增强甲基杆菌属，其可容易地通过比较经处理和未经处理的植物、植物部分、植物种子或其经处理的产物来鉴别。在某些实施例中，产量或早期活力增强甲基杆菌选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03、ISO04、ISO11和其衍生物。在某些实施例中，产量或早期活力增强甲基杆菌选自由以下各者组成的群组：ISO02、ISO03和ISO04。
适用于处理植物或植物部分的组合物还可以进一步包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂，所述组合物包含产量或早期活力增强甲基杆菌属、具有粘附性产量或早期活力增强甲基杆菌属的固体物质或包含乳液和其中的产量或早期活力增强甲基杆菌属。农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂通常是在暴露于植物或植物部分时不引起不当植物毒性或其它副作用的成分。在某些实施例中，固体物质本身可以是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂，只要其对甲基杆菌不是杀菌性或抑菌性即可。在其它实施例中，组合物进一步包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂中的至少一种。任何上述组合物还可以进一步包含农药。组合物中使用的农药包括(但不限于)杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂和杀细菌剂。在某些实施例中，组合物中使用的农药是不实质上抑制甲基杆菌生长的农药。由于甲基杆菌是革兰氏阴性细菌(gram negative bacteria)，组合物中使用的适合的杀细菌剂可包括(但不限于)呈现针对革兰氏阳性细菌(grampositive bacteria)而非革兰氏阴性细菌的活性的杀细菌剂。本文中提供的组合物还可以包含抑菌剂，其不会实质上抑制甲基杆菌的生长。本文中提供的组合物中适用的抑菌剂包括(但不限于)呈现针对革兰氏阳性细菌而非革兰氏阴性细菌的活性的抑菌剂。上述组合物中的任一种还可以是实质上干燥产物(即具有约5％或更低的水含量)、组合物与乳液的混合物，或悬浮液。
组合物中使用的包含产量或早期活力增强甲基杆菌属的农业上可接受的佐剂包括(但不限于)增强产物功效的组分和/或增强产物应用简易性的产品。增强产物功效的佐剂可包括多种润湿剂/散布剂(其促进植物部分上组合物的粘附和扩散)、促进与植物部分的粘附的粘着剂、可促进活性剂与内部组织的接触的渗透剂、通过抑制环境降解来增加活性剂的半衰期的延长剂和增加喷雾组合物的密度或干燥时间的保湿剂。组合物中使用的润湿剂/散布剂可包括(但不限于)非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性表面活性剂、有机硅酸盐表面活性剂和/或酸化表面活性剂。组合物中使用的粘着剂可包括(但不限于)基于乳胶的物质、萜/松脂二烯和基于吡咯烷酮的物质。渗透剂可包括矿物油、植物油、酯化植物油、有机硅酸盐表面活性剂和酸化表面活性剂。组合物中使用的延长剂可包括(但不限于)硫酸铵或基于薄荷烯的物质。组合物中使用的保湿剂可包括(但不限于)丙三醇、丙二醇和二乙二醇。改良产物应用简易性的佐剂包括(但不限于)酸化/缓冲剂、去泡/消泡剂、相容性试剂、偏移减小剂、染料和水调节剂。组合物中使用的去泡/消泡剂可包括(但不限于)二甲聚硅氧烷。组合物中使用的相容性试剂可包括(但不限于)硫酸铵。组合物中使用的偏移减小剂可包括(但不限于)聚丙烯酰胺和多糖。组合物中使用的水调节剂可包括(但不限于)硫酸铵。
本文还提供用包含产量或早期活力增强甲基杆菌属的发酵液、发酵液产物和组合物处理植物和/或植物部分的方法。由其获得的经处理的植物和经处理的植物部分包括(但不限于)玉米。所处理的玉米植物部分包括(但不限于)叶子、茎秆、主根、结节根、种子、果实、穗、玉米穗丝、外皮、外鞘、轴杆、胚芽鞘等。可用本文中提供的发酵液、发酵液产物、发酵产物和/或组合物处理任何前述玉米植物的种子或其它繁殖体。
在某些实施例中，通过以喷雾形式施用包含产量或早期活力增强甲基杆菌属的发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物来处理植物和/或植物部分。这类喷雾施用包括(但不限于)治疗单一植物部分或植物部分的任何组合。可用任何将发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物散布到植物和/或植物部分的装置实现喷雾。适用喷雾装置包括博姆喷雾器(boom sprayer)、手持式或背负式喷雾器、作物喷粉机(即空中喷雾)等。还可以使用实现向近轴面和/或背轴面中的任一个或两个施用发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物的喷雾装置和/或方法。本文还提供至少部分涂有两相发酵液、发酵液产物、发酵产物或组合物中的任一种的植物和/或植物部分，所述两相发酵液、发酵液产物、发酵产物或组合物包含上面粘附有产量增强甲基杆菌属的固体物质。部分涂布植物、植物部分或种子包括(但不限于)涂布植物、植物部分或植物种子的表面积的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或约99.5％。本文还提供经处理的植物产物，其包含上面粘附有产量或早期活力增强甲基杆菌属的固体物质。
在某些实施例中，通过使种子暴露于包含产量或早期活力增强甲基杆菌属的发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物来处理种子。可通过包括(但不限于)渗吸、涂布、喷雾等方法用本文中提供的发酵液、发酵液产物和组合物处理种子。可用连续和/或分批种子处理器实现种子处理。在某些实施例中，可以通过用含有发酵液、发酵液产物或组合物的涂料组合物浆化种子并且风干所得产物来制备经涂布的种子，所述发酵液、发酵液产物或组合物包含具有产量增强甲基杆菌属的固体物质。风干可在任何不会对种子或甲基杆菌有害的温度下实现，但通常将不超过摄氏30度。包含固体物质和产量增强甲基杆菌属的涂层的比例包括(但不限于)种子的0.1到25重量％、种子的0.5到5重量％和种子按重量计0.5到2.5重量％的范围。在某些实施例中，种子涂布或处理中使用的固体物质上面粘附有产量增强甲基杆菌属。在某些实施例中，种子涂布或处理中使用的固体物质将与产量增强甲基杆菌属相关联并且将是通过本文中提供的方法获得的发酵液、发酵液产物或组合物。美国专利第5,106,648号、第5,512,069号和第8,181,388号中披露的多种种子处理组合物和用于种子处理的方法以全文引用的方式并入本文中并且可适于与包含本文中提供的发酵液、发酵液产物或组合物的活性剂一起使用。在某些实施例中，使用处理种子的组合物可含有农业上可接受的赋形剂，其包括(但不限于)木屑、粘土、活性碳、硅藻土、细粒无机固体、碳酸钙等。可与本文中提供的发酵液、发酵液产物或组合物一起使用的粘土和无机固体包括(但不限于)钙膨润土、高岭土、瓷土、滑石、珍珠岩、云母、蛭石、二氧化硅、石英粉末、蒙脱石和其混合物。可使用的促进与种子的粘着的农业上可接受的佐剂包括(但不限于)聚乙酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯共聚物、水解聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯甲基醚、聚乙烯甲基醚-顺丁烯二酸酐共聚物、蜡、乳胶聚合物、纤维素(包括乙基纤维素和甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基甲基丙基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸酯、糊精、麦芽糊精、多糖、脂肪、油、蛋白质、剌梧桐树胶、瓜尔胶、黄蓍胶、多糖胶、胶浆、阿拉伯胶、虫胶、偏二氯乙烯聚合物和共聚物、基于大豆的蛋白质聚合物和共聚物、木质磺酸酯、丙烯酸共聚物、淀粉、聚乙烯丙烯酸酯、玉米蛋白、明胶、羧甲基纤维素、聚氨基葡萄糖、聚氧化乙烯、丙烯酰胺聚合物和共聚物、聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体、海藻酸酯、乙基纤维素、聚氯丁二烯和糖浆或其混合物。可促进涂布的其它适用的农业上可接受的佐剂包括(但不限于)乙酸乙烯酯的聚合物和共聚物、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物和水溶性蜡。本文中和美国专利第8,181,388号中披露的多种表面活性剂、分散剂、防结块剂、泡沫控制剂和染料可适于与包含本文中提供的发酵液、发酵液产物或组合物的活性剂一起使用。
本文中提供包含产量或早期活力增强甲基杆菌属的组合物，与未暴露于所述组合物的未经处理的植物、植物部分和由其获得的植物相比，其实现玉米植物的产量或早期活力增加。在某些实施例中，可用本文中提供的组合物处理植物部分(包括(但不限于)种子、叶子、果实、茎干、根或胚芽鞘)以便增加玉米植物产量。处理或施用可包括(但不限于)用本文中提供的组合物喷雾、涂布、部分涂布、浸没和/或渗吸植物或植物部分。在某些实施例中，可用本文中提供的组合物的液体、半液体、乳液或浆料浸没和/或渗吸种子、叶子、果实、茎干、根、根瘤或胚芽鞘。与未经处理的玉米植物或由未经处理的种子生长的玉米植物相比，这类种子浸没或渗吸可足以实现经处理的玉米植物或由经处理的种子生长的玉米植物的产量增加。在某些实施例中，植物种子可浸没和/或渗吸至少1、2、3、4、5或6小时。在某些实施例中，这类浸没和/或渗吸可在不会对植物种子或甲基杆菌有害的温度下进行。在某些实施例中，可在约摄氏15度到约摄氏30度或约摄氏20度到约摄氏25度下处理种子。在某些实施例中，可在温和搅拌下进行种子渗吸和/或浸没。在某些实施例中，通过在槽沟中提供组合物使种子和/或胚芽鞘暴露于组合物。在槽沟中提供组合物代表本文中提供的用于向玉米种子或在玉米植物发育的约VE期向玉米植物施用组合物若干种方法中的一种。
因此，预期本文中提供的包含产量或早期活力增强甲基杆菌属的组合物和相关方法适用于改良广泛多种玉米植物的产量和/或早期活力，包括(但不限于)多种玉米(Zeamays)杂交物、自交物、单倍体、亚种和变种。在某些实施例中，可改良臼齿形玉米(马齿型玉米变种(Zea mays var.indentata))、硬质型玉米(硬粒型玉米变种(Zea maysvar.indurata))、粉质玉米(粉型玉米变种(Zea mays var.amylacea))、玉米花(爆粒型玉米变种(Zea mays var.everta))、有稃种玉米(稃型玉米变种(Zea mays var.tunicata)，Larranaga ex A.St.Hil.)、条纹玉米(山茶玉米变种(Zea mays var.japonica))、甜玉米(甜粉型玉米变种(Zea mays var.saccharata)和水果玉米变种(Zea maysvar.saccharata))和/或蜡质种玉米(糯玉米变种(Zea mays var.ceratina))。
在某些实施例中，本文中提供的足以提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是按以下效价具有产量或早期活力增强甲基杆菌属的组合物：至少约1×106个集落形成单位/毫升、至少约5×106个集落形成单位/毫升、至少约1×107个集落形成单位/毫升、至少约5×108个集落形成单位/毫升、至少约1×109个集落形成单位/毫升、至少约1×1010个集落形成单位/毫升或至少约3×1010个集落形成单位/毫升。在某些实施例中，本文中提供的足以为植物或植物部分提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是按以下效价具有产量或早期活力增强甲基杆菌属的液体或乳液的组合物：至少约1×106个集落形成单位/毫升、至少约5×106个集落形成单位/毫升、至少约1×107个集落形成单位/毫升或至少约5×108个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个集落形成单位/毫升。在某些实施例中，本文中提供的足以提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是具有以下产物的固相的产量或早期活力增强甲基杆菌属的发酵液产物：至少约1×106个集落形成单位/毫升、至少约5×106个集落形成单位/毫升、至少约1×107个集落形成单位/毫升，或至少约5×108个集落形成单位/克到至少约6×1010个甲基杆菌的集落形成单位/克固相。在某些实施例中，本文中提供的足以提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是具有以下甲基杆菌效价的组合物：每克至少约1×106个集落形成单位、每克至少约5×106个集落形成单位、每克至少约1×107个集落形成单位或每克至少约5×108个集落形成单位到含有粒子的组合物中每克粒子至少约6×1010个甲基杆菌的集落形成单位，所述粒子包含上面粘附有产量增强甲基杆菌属的单培养物或共培养物的固体物质。在某些实施例中，本文中提供的足以为植物或植物部分提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是具有以下甲基杆菌效价的组合物：在包含乳液的组合物中至少约1×106个集落形成单位/毫升、至少约5×106个集落形成单位/毫升、至少约1×107个集落形成单位/毫升或至少约5×108个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个甲基杆菌的集落形成单位/毫升，所述乳液中提供有或生长有粘附于固体物质的产量或早期活力增强甲基杆菌属的单培养物或共培养物。在某些实施例中，本文中提供的足以为植物或植物部分提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是具有以下甲基杆菌效价的组合物：在包含乳液的组合物中至少约1×106个集落形成单位/毫升、至少约5×106个集落形成单位/毫升、至少约1×107个集落形成单位/毫升或至少约5×108个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个甲基杆菌的集落形成单位/毫升，所述乳液中提供有或生长有产量或早期活力增强甲基杆菌属的单培养物或共培养物。
在某些实施例中，本文中提供的足以提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是按以下效价具有甲基杆菌属的组合物：至少约1×104个集落形成单位/毫升、至少约1×105个集落形成单位/毫升、至少约1×106个集落形成单位/毫升、至少约5×106个集落形成单位/毫升、至少约1×107个集落形成单位/毫升、至少约5×108个集落形成单位/毫升、至少约1×109个集落形成单位/毫升、至少约1×1010个集落形成单位/毫升或至少约3×1010个集落形成单位/毫升。在某些实施例中，本文中提供的足以提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是按以下效价具有甲基杆菌属的组合物：至少约1×104个集落形成单位/毫升、至少约1×105个集落形成单位/毫升、至少约1×106个集落形成单位/毫升、至少约5×106个集落形成单位/毫升、至少约1×107个集落形成单位/毫升或至少约5×108个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个集落形成单位/毫升液体或乳液。在某些实施例中，本文中提供的足以提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是具有以下所述产物的固相的甲基杆菌属效价的发酵液产物：至少约1×104个集落形成单位/克、至少约1×105个集落形成单位/克、至少约1×106个集落形成单位/克、至少约5×106个集落形成单位/克、至少约1×107个集落形成单位/克或至少约5×108个集落形成单位/克到至少约6×1010个甲基杆菌的集落形成单位/克、至少约1×1011个甲基杆菌的集落形成单位/克、至少约1×1012个甲基杆菌的集落形成单位/克、至少约1×1013个甲基杆菌的集落形成单位/克或至少约5×1013个甲基杆菌的集落形成单位/克固相。在某些实施例中，本文中提供的足以提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是具有以下甲基杆菌效价的组合物：含有粒子的组合物中每克粒子至少约1×106个集落形成单位、至少约5×106个集落形成单位、至少约1×107个集落形成单位或至少约5×108个集落形成单位到至少约6×1010个甲基杆菌的集落形成单位、至少约1×1011个甲基杆菌的集落形成单位、至少约1×1012个甲基杆菌的集落形成单位、至少约1×1013个甲基杆菌的集落形成单位或至少约5×1013个甲基杆菌的集落形成单位，所述粒子包含上面粘附有甲基杆菌属的单培养物或共培养物的固体物质。在某些实施例中，本文中提供的足以提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是具有以下甲基杆菌效价的组合物：在包含乳液的组合物中至少约1×106个集落形成单位/毫升、至少约5×106个集落形成单位/毫升、至少约1×107个集落形成单位/毫升或至少约5×108个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个甲基杆菌的集落形成单位/毫升，所述乳液中提供有或生长有粘附于固体物质的甲基杆菌属的单培养物或共培养物。在某些实施例中，本文中提供的足以提供增加的玉米产量和/或早期活力的组合物的量可以是具有以下甲基杆菌效价的组合物：在包含乳液的组合物中至少约1×106个集落形成单位/毫升、至少约5×106个集落形成单位/毫升、至少约1×107个集落形成单位/毫升或至少约5×108个集落形成单位/毫升到至少约6×1010个甲基杆菌的集落形成单位/毫升，所述乳液中提供有或生长有甲基杆菌属的单培养物或共培养物。在上述组合物中的任一种的某些实施例中，甲基杆菌属是甲基杆菌分离物ISO02(NRRL B-50930)、ISO03(NRRL B-50931)、ISO04(NRRL B-50932)、IS011(NRRL B-50939)或其衍生物。还提供涂有或部分涂有上述组合物中的任一种的玉米植物和玉米植物部分(例如种子)。还提供通过使用上述组合物中的任一种来改良玉米产量或早期玉米活力的方法。
实例
包括以下实例以便说明披露内容的说明性、非限制性实施例。本领域的技术人员应了解，以下实例中披露的技术表示由申请人发现的在本发明的实践中起良好作用的技术。然而，根据本发明，本领域的技术人员应了解，可在不脱离本发明的范畴的情况下在所披露的特定实施例中进行多种变化，同时仍获得相同或类似结果。
实例1.通过施用甲基杆菌组合物实现的玉米产量增加
出于评估14种PPFM(甲基杆菌物种的粉红色兼性甲基营养生物)分离物的目的，在美国伊利诺伊州(Illinois)的六处地点进行玉米田间试验(Com field trials)，所述分离物以叶面喷雾形式在早期无性繁殖期(V3)以及繁殖期(R1)施用于玉米植物。地点设在克罗普西(Cropsey)、德纳(Dana)、荷马(Homer)、法默城(Farmer City)、法明顿(Farmington)和荷马，均位于伊利诺伊州。在克罗普西进行的试验在无性繁殖生长期间经历严重玉米根虫噬咬损害并且在荷马经历的试验经历由七月上旬直线风事件引起的折断；因此玉米叶面试验分析中不包括这两个地点。
实验设计
试验以由四个30英寸行(20英尺长)组成的裂区设计形式进行。两个中间行是处理行，使用两个外部行作为未经处理的边界行。存在用于V3和R1生长期施用的14种PPFM处理物中的每一个的八个复制品。14种PPFM处理物加对照物(非PPFM，也称为“检验物”)组成完全曲线，并且生长期V3和R1组成裂区。8个复制品中的每一个中包括V3和R1对照物。
方法
在准备田间试验时，PPFM培养物在AMS+丙三醇+蛋白胨+硅藻土中在30℃向生长6天。每升铵矿物质盐(AMS)培养基含有700毫克无水磷酸氢二钾、540毫克无水单碱性磷酸钾、一克七水合硫酸镁、500毫克无水氯化铵和200毫克二水合氯化钙。
由下文列举的三种储备溶液制备AMS基底培养基：
储备溶液I：一升，SOX浓度
无水磷酸氢二钾 35克
无水单碱性磷酸钾 27克
储备溶液II：一升，SOX浓度
七水合硫酸镁 50克
无水氯化铵 25克
储备溶液III：一升，SOX浓度
脱水氯化钙 10克
分别高压处理储备溶液I、II和III。
为了制备一升具有丙三醇、蛋白胨和硅藻土的液态AMS培养基，向920ml蒸馏水中添加以下物质：
20ml储备溶液I
20ml储备溶液II
20ml储备溶液III
20ml 50％丙三醇储备溶液
10克蛋白胨
2克硅藻土
通过高压灭菌将具有悬浮的硅藻土的所得溶液灭菌。通过在5000rpm下离心15分钟来收集培养物并且接着在10×浓度下与作为低温保护剂的20％丙三醇一起再悬浮于AMS+丙三醇+蛋白胨中。将培养物等分并且在-80℃下冷冻直到解冻供使用。使用背负式化学喷雾器，按每英亩15盖尔的比率在V3或R1期向玉米植物施用液体PPFM制剂。对于R1和V3PPFM施用，多个位置处施用的PPFM的效价分别提供于表5和6中。在现有农场田间进行试验并且用养殖者在整个生长季实践的局部农艺方法管理。所使用的所有杂交物是Roundup ReadyTM杂交物，并且在V4生长期用草甘膦对试验物进行喷雾。用市售采集组合在生理学成熟期收集试验物以便获得产量。表2说明四个玉米叶田中种植的杂交物、种植日期和采集日期。
表2.四个玉米叶田中种植的杂交物、种植日期和采集日期
Figure GDA0001009518450000251
Figure GDA0001009518450000261
结果
用分析-拟合模型程序(JMP版本11.0，SAS Institute)进行方差分析(ANOVA)。在从模型获得参数评估值之后，检验残差曲线和学生化残差(studentized residuals)的表格与正态和恒定差的假设值的一致性。在零假设(平均值差是零)下，用双尾t测试来进行分离物与检验物在施用时相同生长期内的比较，所述t测试用于由ANOVA模型评估的最小二乘平均值之间的配对差。
在四个个别地点对裂区设计应用以下模型：
[1]Yijk＝M+Ii+Sj+ISij+Rk+IRik+eijk，
其中Yijk是复制品k中分离物i在j期的产量，M表示总平均值，Ii是分离物i的固定作用，Sj是j期的固定作用，ISij是分离物i与j期的相互相用的固定作用，Rk是复制品k的随机作用，IRik是分离物i与复制品k的相互相用的随机作用，并且eijk是随机误差。
根据以下模型进行四个地点的跨地点分析：
[2]Yhijk＝M+Ii+Sj+ISij+Lh+R(L)k(h)+LIhi+IR(L)ik(h)+LShj+LIShij+ehijk，
其中Yhijk是地点h处复制品k中分离物i在j期的产量，M表示总平均值，Ii是分离物i的固定作用，Sj是j期的固定作用，ISij是分离物i与j期的相互相用的固定作用，Lh是地点h的随机作用，R(L)k(h)是在地点h内筑巢的复制品k的随机作用，LIhi是地点h与分离物i的相互相用的随机作用，IR(L)ik(h)是分离物i与在地点h内筑巢的复制品k的相互相用的随机作用，LShj是地点h与j期的相互相用的随机作用，LIShjk是地点h与分离物i和j期的三向相互相用的随机作用，并且ehijk是随机误差。
14种PPFM分离物种的十三种与V3或R1检验物相比展示显著(p＝0.25)产量反应，其在至少一个地点进行比较(表3)。仅一个位置，佩索特姆，未展示显著产量增加。在R1期，跨越四个组合地点，六种分离物与检验物相比展示显著增加(表4)。
表3.生长期内四个地点中的每一个处PPFM分离物平均产量、产量排行和p值
Figure GDA0001009518450000262
Figure GDA0001009518450000271
Figure GDA0001009518450000281
Figure GDA0001009518450000291
表4.生长期内跨越组合的四个地点的PPFM分离物的平均产量、产量排行和p值
Figure GDA0001009518450000292
Figure GDA0001009518450000301
表5.指示地点处在R1期施用的PPFM的效价(CFU/mL)
Figure GDA0001009518450000302
1ND：未测定。
表6.指示地点处在V3期施用的PPFM的效价(CFU/mL)
Figure GDA0001009518450000311
1ND：未测定。
实例2.在2014年田间测试实验设计中通过施用甲基杆菌组合物实现的玉米产量增加
出于评估三种PPFM(甲基杆菌物种的粉红色兼性甲基营养生物)的目的，在七个地点进行玉米田间试验。在早期无性繁殖期(V3)以叶面喷雾形式并且在种植时在槽沟中向玉米植物施用分离物。以每英亩五和2.5升方式进行叶面施用。使用1.25升/英亩和0.625升/英亩在播种时施用槽沟内施用。田地设在爱荷华州(Iowa)、伊利诺伊州、内布拉斯加州(Nebraska)、密苏里州(Missouri)、俄亥俄州(Ohio)、南达科他州(South Dakota)和威斯康星州(Wisconsin)。使用常规行间距(30英寸)进行试验，其中四个行的最小样地大小是20英尺。在随机完全区组设计中使用六个复制品进行每次处理(除非另外指出)。从样地的中央两个行获得所有观察结果。从外部两个行进行所有破坏性取样。在覆盖之前，用开放种子槽沟上方的喷嘴在种植槽沟内施用处理物。调节直式物料流喷嘴或扁平风扇喷嘴，使得风扇模式与种子槽沟平行。使用扁平风扇或锥形喷射嘴，用常规吊杆施用叶面喷雾。最少五加仑/英亩总量用于沟槽内施用并且15加仑/英亩用于叶面施用。在发芽之后第20天和第60天评定早期植物活力。植物活力的目视评估是基于1到5量表，其中1是不良并且5是极佳。活力的目视评估考虑如高度、叶子面积、叶子颜色和/或雨棚密封百分比等因素。使用常规计量组合，根据标准种植者操作采集植物。
方法
在准备田间试验时，PPFM培养物在AMS+丙三醇+蛋白胨+硅藻土中在30℃向生长6天。每升铵矿物质盐(AMS)培养基含有700毫克无水磷酸氢二钾、540毫克无水单碱性磷酸钾、一克七水合硫酸镁、500毫克无水氯化铵和200毫克二水合氯化钙。
由下文列举的三种储备溶液制备AMS基底培养基：(第[93]段)
储备溶液I：一升，SOX浓度
无水磷酸氢二钾 35克
无水单碱性磷酸钾 27克
储备溶液II：一升，SOX浓度
七水合硫酸镁 50克
无水氯化铵 25克
储备溶液III：一升，SOX浓度
脱水氯化钙 10克
分别高压处理储备溶液I、II和III。
为了制备一升具有丙三醇、蛋白胨和硅藻土的液态AMS培养基，向920ml蒸馏水中添加以下物质：
20ml储备溶液I
20ml储备溶液II
20ml储备溶液III
20ml 50％丙三醇储备溶液
10克蛋白胨
2克硅藻土
通过高压灭菌将具有悬浮的硅藻土的所得溶液灭菌。
通过在5000rpm下离心15分钟来收集培养物并且接着在10×浓度下与作为低温保护剂的20％丙三醇一起再悬浮于AMS+丙三醇+蛋白胨中。将培养物等分并且在-80下冷冻直到解冻供使用。在现有农场田间进行试验并且用养殖者在整个生长季实践的局部农艺方法管理。田间施用的不同NLS菌株的效价范围如下：NLS0017＝4.7×108-2.2×109CFU/mL；NLS0020＝3.0×108-3.1×109CFU/mL；和NLS021＝2.3×108-3.7×108CFU/mL。
结果
用Statistix软体9.0版本进行方差分析(ANOVA)、Tukey HSD和使用LSD的平均分隔。在90％置信区间内进行初始Tukey HSD分析，评估处理作用的活力和产量的所有配对比较测试。在α等于0.1时，平均值之间不存在显著配对差。然而，当在α等于0.20时分析活力和产量的LSD所有配对比较测试时，在所有处理地点，(80％CI)若干处理物与检验物相比显示显著更好的活力和更高的产量。
表7：关于TRT在种植之后第60天活力的LSD所有配对比较测试
Figure GDA0001009518450000331
在α＝0.20时，相同字母后的平均值不显著不同。
槽沟处理中“H”＝1.25升/英亩(Fur)
槽沟处理中“L”＝0.625升/英亩(Fur)
“H”＝5.0升/英亩，叶面处理(Fol)
“L”＝2.5升/英亩，叶面处理(Fol)
表8：关于TRT的产量(蒲式耳/英亩)的LSD配对比较测试
Figure GDA0001009518450000332
在α＝0.20时，相同字母后的平均值不显著不同。槽沟处理中“H”＝1.25升/英亩(Fur)
槽沟处理中“L”＝0.625升/英亩(Fur)
“H”＝5.0升/英亩，叶面处理(Fol)
“L”＝2.5升/英亩，叶面处理(Fol)
当使用强制排行通过处理进行评估时，可发现支持活力和产量资料评估的趋势。
表9.玉米产量分析：所有地点的平均值(蒲式耳/英亩)。
Figure GDA0001009518450000341
粗体和带下划线的栏值是其中产量>平均检验值的平均处理值
在所测试的三种PPFM分离物(NLS017、NLS020和NLS021)中，两种分离物在其通过这些分析在所有七个地点进行比较时展示显著(α＝0.20)产量反应。当以625毫升/英亩施用时，分离物NLS021实现最大产量增加，如在槽沟处理中。当以高沟槽内(1,250毫升/英亩)和叶面施用量(5升/英亩)施用时，分离物NLS017提供显著产量改良。
还使用JMP统计分析软件包(版本9.0)分析产量资料。首先拟合具有所有随机作用的完全模型，并且接着基于阿科伊科(Akaike)信息规则(AIC)值缩减到最佳拟合模型。在α＝0.05、0.10和0.20情况下使用费舍尔LSD测试(Fisher's LSD test)进行跨地点平均值比较(表10)。表9中报导的未经处理的平均值与通过用于分析表10中呈现的资料的混合作用模型计算的经调节的平均值不同。这一模型调节地点和复制品的随机作用。因此，统计差未必反映未经处理的产量值中的数值差。此外，第[93]段中描述的统计分析方法与这一方法略微不同，引起两种分析之间的或多或少地不同结果。表10中呈现的分析和结果不包括第二检验，仅在七个地点中的四个地点包括‘处理物14’。
表10.与检验物相比的跨地点产量增加
Figure GDA0001009518450000351
1最小二乘平均值
以与跨地点资料相同的方式分析个别位置处相对于检验物的处理物产量(表11)。在下表中，在α＝0.05、0.10和0.20时显著大于检验物的产量是分别由‘XXX’、‘XX’和‘X’表示。
表11.与检验物相比，跨地点产量数值增加
编号 处理物 AgPro Buckeye FC Homer Maloney Rains Auch
1 检验物
2 NLS017_L_Inf X
3 NLS017_H_Inf X XX
4 NLS017_L_Fol XXX
5 NLS017_H_Fol XXX XXX
6 NLS020_L_Inf X
7 NLS020_H_Inf XXX
8 NLS020_L_Fol XXX
9 NLS020_H_Fol XXX
10 NLS021_L_Inf XXX XXX XXX XXX X
11 NLS021_H_Inf XXX XXX
12 NLS021_L_Fol XXX
13 NLS021_H_Fol XXX XXX X
结果
在所测试的三种PPFM分离物(NLS017、NLS020和NLS021)中，两种分离物在其进行比较时展示跨越所有七个地点的显著(α＝0.20)产量反应。当以625毫升/英亩施用时，分离物NLS021实现最大产量增加，如在槽沟处理中。当以高沟槽内(1,250毫升/英亩)和叶面施用量(5升/英亩)施用时，分离物NLS017提供显著产量改良。
个别地点资料表明PPFM通常对玉米产量具有有利作用。法默城(PPFM未积极影响玉米产量的地点)具有尤其高的总产量。这可表示法默城具有‘理想’产量环境并且表明在其它地点，这些实验中使用的PPFM处理物在多种生物和/或非生物应激源存在下提供产量保护和增加的产量，但在法默城的理想生长条件下不显著影响产量。
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已说明和描述本发明的原理，本领域的技术人员应显而易见，可在不脱离这类原理的情况下修改本发明的配置和细节。
尽管已经关于各种实施例和说明性实例描述本发明的材料和方法，本领域的技术人员将显而易见，可在不脱离本发明的、概念精神和范畴的情况下对本文中所描述的材料和方法做出变化。对本领域的技术人员显而易见的所有这类类似取代和修改视为在由所附权利要求书所定义的本发明的精神、范畴和概念内。

Claims (19)

1.一种用于改良玉米植物产量的方法，其包含：
（a）在约V6到约R3发育期向玉米植物施用包含分离的保藏的甲基杆菌（Methylobacterium）分离物和农业上可接受的佐剂、赋形剂或其组合的组合物，其中所述甲基杆菌分离物选自保藏为NRRL B-50930的ISO02、保藏为NRRL B-50931的ISO03、保藏为NRRL B-50932的ISO04和保藏为NRRL B-50939的ISO11；和
（b）使所述玉米植物生长到成熟期，由此改良所述玉米植物的产量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在约V6到约R2发育期、约R1到R2发育期、约R1到R3发育期或约R1发育期施用所述组合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含上面生长有和上面粘附有甲基杆菌分离物保藏为NRRL B-50930的ISO02、保藏为NRRL B-50931的ISO03、保藏为NRRL B-50932的ISO04或保藏为NRRL B-50939的ISO11的固体物质。
4.根据权利要求1所述的方法，其中当所述组合物为固体组合物时，其按约1×106 CFU/gm到约1×1014 CFU/gm的效价包含甲基杆菌属，或当所述组合物为液体组合物时，其按约1×106 CFU/mL到约1×1011 CFU/mL的效价包含甲基杆菌属。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含乳液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述施用的组合物涂布或部分涂布所述玉米植物或其一部分。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述组合物施用于所述玉米植物的簇叶。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述组合物进一步包含杀真菌剂。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包含从所述成熟玉米植物收集种子的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中与从未接受甲基杆菌属分离物施用的对照玉米植物获得的所收集的种子的产量相比，所收集的种子的产量增加。
11.一种用于改良玉米植物产量的方法，其包含：
（a）向玉米种子或在约VE到约V5玉米植物发育期向玉米植物施用包含分离的保藏的甲基杆菌分离物和农业上可接受的佐剂、赋形剂或其组合的组合物，其中所述甲基杆菌分离物选自保藏为NRRL B-50930的ISO02、保藏为NRRL B-50931的ISO03、保藏为NRRL B-50932的ISO04、保藏为NRRL B-50939的ISO11；和，
（b）从所述种子生长玉米植物或使所述玉米植物生长到成熟期，由此改良所述玉米植物的产量。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在约VE到约V3发育期、约V3到约V5发育期、约V2到V4，或V3发育期施用所述组合物。
13.根据权利要求11所述的方法，其中当所述组合物为固体组合物时，其按约1×106CFU/gm到约1×1014 CFU/gm的效价包含甲基杆菌属，或当所述组合物为液体组合物时，其按约1×106 CFU/mL到约1×1011 CFU/mL的效价包含甲基杆菌属。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述组合物包含乳液，其中生长有甲基杆菌乳液。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述玉米植物是草甘膦耐受性玉米植物并且在约V2到约V4玉米植物发育期施用含有草甘膦的配方。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法进一步包含从所述成熟玉米植物收集种子。
17.根据权利要求16所述的方法，其中与从未接受甲基杆菌属施用的对照玉米植物获得的所收集的种子的产量相比，所收集的种子的产量增加。
18.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述施用的组合物涂布或部分涂布所述玉米种子或所述玉米植物或其一部分。
19.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中在槽沟中向玉米种子或约VE发育期的玉米植物提供所述组合物。
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