BR122020001306B1 - Métodos e composições de fermentação bacteriana - Google Patents

Abstract

A presente invenção proporciona métodos para a cultura de bactérias do gênero Methylobacterium. Em particular, o método fornece métodos para o cultivo eficiente e de baixo custo destas bactérias. Além disso, a invenção proporciona métodos para a utilização destas culturas bacterianas para melhorar a agricultura de plantas.

Description

[0001] Dividido do pedido de patente BR 11 2015 029890 7 depositado em 30/05/2014”.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0002] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente número de série US 61/829,987, depositado em 31 de maio de 2013, toda a divulgação da qual é aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Compostos orgânicos de um carbono, tais como metano e metanol são encontrados amplamente na natureza, e são utilizados como fontes de carbono pelas bactérias classificadas como metanotróficas e metilotróficas. Bactérias metanotróficas incluem espécies dos gêneros Methylobacter, methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum, e Methylocella (Lidstrom, 2006). Metanotróficas possuem a enzima matano mono-oxigenase, a qual incorpora um átomo de oxigênio 02 no metano, formando metanol. Todas as metanotróficas são utilizadoras obrigatórios de um carbono, incapazes de utilizar os compostos que contêm ligações carbono-carbono. Metilotróficas, por outro lado, também pode utilizar compostos orgânicos mais complexos, tais como ácidos orgânicos, álcoois superiores, açúcares e similares. Assim, as bactérias metilotróficas são metilotróficas facultativas. Bactérias metilotróficas incluem espécies dos gêneros Methylobacterium, Hyphomicrobium, Methylophilus, Methylobacillus, Methylophaga, Aminobacter, Methylorhabdus, Methylopila, Methylosulfonomonas, Marinosulfonomonas, Paracoccus, Xanthobacter, Ancylobacter (também conhecido como Microcyclus), Thiobacillus, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Acetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Arthobacter, e Nocardia (Lidstrom, 2006).

[0004] A maioria das bactérias metilotróficas do gênereo Methylobacterium são rosa-pigmentada. Elas são convencionalmente referidas como bactérias PPFM, sendo metilotróficas facultativas rosa-pigmentada. Green (2005, 2006) identificou doze espécies validadas no gênerode Methylobacterium, especificamente, M. aminovorans, M. chloromethanicum, M. dichloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum e M. zatmanii.

[0005] No entanto, M. nidulans é uma Methylobacterium que não é um PPFM de fixação de nitrogênio (Sy et al., 2001). Methylobacterium são ubíquas na natureza, sendo encontradas no solo, poeira, água potável, sedimentos e superfícies foliares, bem como em ambientes industriais e clínicos (Green, 2006).

[0006] A existência de bactérias PPFM como colonizadores das superfícies foliares da maioria (se não todas) espécies de plantas (variando de algas, musgos e hepáticas e angiospermas e gimnospermas) sugere que as bactérias PPFM podem desempenhar um papel importante na fisiologia da planta (Corpe e Rheem, 1989; Holanda e Polacco, 1994; Holland, 1997; Kutschera, 2007). O fato de que as plantas produzem e excretam metanol, provavelmente como um produto residual do metabolismo pectina, em que crescem as paredes celulares das plantas, sugeriu a esses pesquisadores que existe uma relação simbiótica com as bactérias PPFM alimentando do metanol produzido de plantas e por sua vez proporcionando benefícios positivos para as plantas. Os benefícios sugeridos de bactérias PPFM na fisiologia das plantas incluem efeitos positivos sobre o metabolismo do nitrogênio, germinação das sementes, e estimulação do crescimento das plantas através do fornecimento de hormônios vegetais citocinia gerada pelo PPFM. O uso de bactérias PPFM para melhorar o crescimento da planta, rendimento de plantas, germinação de sementes, fertilidade masculina e qualidades de plantas nutricionais foi divulgado na Patente US 5,512,069, Patente US 5,961,687, Patente US 6,174,837, Patente US 6,329,320, Patente US 7,435,878, e no pedido de patente US No. US 2006/0228797. Além disso, as bactérias PPFM foram encontradas para aumentar o rendimento de algas cultivadas, sugerindo a sua aplicação para a produção de biocombustíveis derivados de algas (Pedido de Patente No. US 2011/0269219).

[0007] A larga aplicação de Methylobacterium em cultura de fileiras de legumes e outras plantas cultivadas, assim como na produção de biocombustíveis à base de algas, exigiria o cultivo eficiente e barato de enormes quantidades de culturas de Methylobacterium. Outras aplicações industriais de Methylobacterium também podem se beneficiar eficiente técnicas de produção Methylobacterium. Tais aplicações industriais incluem a utilização de Methylobacterium como indicadores de poluição ambiental (como determinado Methylobacterium podem crescer em fuligem) e como monitores de controle de qualidade de irradiação nas indústrias alimentares de embalados (como determinado Methylobacterium exibem alta resistência à irradiação de raios gama). Outras aplicações industriais incluem a utilização de Methylobacterium para degradar poluentes ambientais (Patentes US Nos. US 5,418,161, US 5,487,834, US 6,107,067, US 7,214,509) para produzir compostos úteis industriais, precursores poliméricos ou biopolímeros (US 5,236,930, US 5,686,276, US 6,107,067) e proteínas recombinantes (Pedido de Patente No. US 20060234336).

[0008] No entanto, várias publicações na área sujeitada do cultivo de PPFM sugerem que existem dificuldades significativas para superar a fim de alcançar o cultivo eficiente e barato em larga escala dessas bactérias. Holanda e Polaco (1994) relataram que "PPFMs isoladas não crescem bem em meios de cultura de tecido vegetal", um meio que é rico em nutrientes, e que "PPFMs são de crescimento lento". Madhaiyan et al. (2004) afirmaram que bactérias PPFM "o seu crescimento de natureza e distribuição lenta em toda a planta sugerem que seus números são regulados simplesmente por diluição como o tecido da planta se expande longe de pontos de crescimento." Abanda-Nkpwatt et ai. (2006) relataram de crescimento de bactérias PPFM que "na cultura líquida, a solução tornou-se turva dentro de 4-5 dias" sem especificar o título atingido (título referindo-se ao número de células bacterianas, ou unidades formadoras de colónia por mililitro).

[0009] Estes relatórios consistentes de crescimento lento são ainda confirmados e ampliados por outros estudos que indicam que as bactérias PPFM só poderiam ser aumentadas para relativamente baixos títulos. Estes estudos foram de crescimento em meios microbiológicos líquido de referência, os quais são preparados propositadamente, de modo a ser "livre de água". Tais meios permitir a observação visual e detecção de ambos desejada e indesejada (por exemplo, contaminantes) o crescimento microbiano, como o manifesto desenvolvimento de turbidez visível a olho nu.

[0010] Corpe e Basile (1982) apresentaram uma investigação sistemática das respostas de crescimento de várias bactérias PPFM a uma ampla variedade de fontes de carbono. Eles utilizaram como meio de base da base mineral padrão empregado por Stanier et al. (1966). Nessa publicação Stanier et ai. declarou do seu meio de base que "é fortemente quelado com ácido nitriloacético e EDTA , e forma-se um precipitado copioso mediante autoclavagem. Os redissolve precipitado como o meio arrefece, para formar uma solução límpida em água".

[0011] Usando esta solução "livre de água", tal como a sua forma de base, e Corpe Basile (1982) testou uma grande variedade de fontes de carbono para a sua capacidade para suportar o crescimento de bactérias PPFM. Eles descobriram diversas fontes de carbono que eram relativamente melhor do que todos os outros, ou seja, glicerol, glutamato, metanol, glicose, aspartato, succinato e malato. No entanto, mesmo depois de 7 dias de incubação (o tempo previsto para cada teste de crescimento), nenhuma das culturas atingiu uma densidade óptica (a 660 nm, o comprimento de onda padrão para medir o crescimento microbiano) maior do que 0,7 unidades ópticas, e a maioria foram bem abaixo desta densidade. Sy et al. (2005) relataram que uma suspensão de bactérias PPFM com uma densidade óptica de cerca de 0,05 unidades ópticas continha cerca de 5 x 106 unidades formadoras de colônias (UFC) de bactérias por mililitro PPFM. Assim, o título máximo que Corpe e Basile alcançado após uma semana de incubação com as melhores fontes de carbono eles identificados foi de cerca de 7 x 107 unidades formadoras de colônias por mililitro.

[0012] Sy et al. (2005) também relataram que com um meio mínimo contendo sais de succinato como fonte de carbono, que atingiu um título final de M. extorquens de cerca de 2,5 x 10 colônias formadoras de unidades-por mililitro.

[0013] Corpe e Rheem (1989) relataram que PPFM bactérias "tinha muito mais tempo de duplicação do que outras folhas heterotróficas, em caldo de nutrientes e outros meios de comunicação heterotróficos comum", e concluiu que o metanol produzido por plantas "pode permitir que os PPFMs para competir com sucesso "com outras bactérias em superfícies foliares. A título máximo que Corpe e Reehm alcançado (após um período de incubação não especificado) foi cerca de 3 x 108 unidades formadoras de colônias por mililitro.

[0014] Assim, estas publicações indicam que, em meios de crescimento microbiológico padrão "livre de água", o crescimento de bactérias PPFM é lenta e tipicamente a uma planaltos relativamente baixo título final de cerca de 3 x 108 unidades formadoras de colônias por mililitro.

[0015] A fim de atender às necessidades potenciais para as bactérias PPFM para aplicações comerciais em plantações em fileiras, legumes e outras plantas cultivadas, bem como na produção de biocombustíveis à base de algas, capacidades de produção seria necessário para produzir enormes quantidades de estas bactérias.

[0016] Tomando o milho como apenas um exemplo, existem cerca de 40 milhões de hectares de milho cultivados em cada ano nos Estados Unidos. Para cada 1% de penetração no mercado (400.000 hectares) nesta única nação e nesta única cultura, a necessidade de bactérias PPFM podem ser estimados como sendo na faixa de cerca de 30 litros por hectare de cultura PPFM com um título de cerca de 3 x 10 unidades formadoras de colônias por mililitro, aplicado quer como um tratamento de semente ou como uma pulverização foliar. Isso equivale a cerca de 12 milhões de litros de cultura PPFM naquele título que está sendo exigida a cada ano para tratar a 1% da safra de milho dos Estados Unidos. Se o tempo de produção por lote foi de 7 dias, uma instalação com até mesmo os maiores fermentadores de volume no mercado (produção de 60.000 litros por lote) funcionando em plena capacidade (cerca de 250 dias por ano) exigiria 5 ou 6 desses grandes fermentadores (novamente , apenas para fornecer a necessidade de 1% a penetração no mercado de milho nos Estados Unidos da América). Uma instalação desse tipo provavelmente não poderiam ser construídas e exploradas de uma forma comercialmente viável.

[0017] Assim, existe uma necessidade para o desenvolvimento de uma produção eficiente e barato em larga escala de Methylobacterium.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0018] Os métodos aqui proporcionados são para a produção eficiente de grandes quantidades de Methylobacterium. Estes métodos podem resultar em títulos elevados de culturas de Methylobacterium, onde o tempo de produção por lote é significativamente reduzida. Os métodos de produção de Methylobacterium aqui proporcionados também podem utilizar o meio de cultura constituído por componentes de baixo custo e facilmente disponíveis. Também proporcionam aqui são caldos de fermentação, produtos úteis caldo de fermentação, produtos de fermentação, e as composições que compreendem Methylobacterium. Os métodos de utilização dos caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, e composições compreendendo Methylobacterium para tratar plantas ou partes de plantas são também aqui fornecidos. Os métodos e composições aqui proporcionados podem ser usados para produzir grandes quantidades de Methylobacterium para aplicação a plantas ou partes de plantas, para utilização como inoculo em biorremediação, para a produção de produtos úteis e para a produção de proteínas recombinantes. Os produtos úteis que podem ser obtidos através dos métodos e composições aqui proporcionados incluem, mas não estão limitados a, ácido poli-3-hidroxi-butírico, 1,3-propanodiol, e oxazopirroloquinolinas.

[0019] Os métodos para a obtenção de uma preparação de Methylobacterium compreende o crescimento de Methylobacterium em uma emulsão compreendendo uma fase contínua e uma fase dispersa que é imiscível ou apenas parcialmente miscíveis na fase contínua são aqui proporcionados. Em certas concretizações, a Methylobacterium é uma mono-cultura ou de co-cultura de Methylobacterium. Em certas concretizações, o (a), a fase dispersa compreende um líquido não aquoso e a fase contínua compreende um líquido aquoso ou (b) a fase dispersa compreende um líquido aquoso e a fase contínua compreende um líquido não-aquoso. Em certas concretizações, o líquido não aquoso tem uma miscibilidade na água que é igual ou menor do que a de n-pentanol a 25 ° C. Em certas concretizações, a fase dispersa prevê o aumento do rendimento da referida Methylobacterium relativa a um rendimento obtido por crescimento a Methylobacterium sob condições idênticas, com excepção para serem cultivadas em um não-emulsão, que compreende um líquido que corresponde ao da fase contínua. Em certas concretizações, os métodos compreendem ainda a colheita de Methylobacterium crescido nos meios Em certas concretizações, a emulsão compreende ainda um emulsionante em uma quantidade suficiente para estabilizar a emulsão. Em certas concretizações, o emulsionante é selecionado a partir do grupo consistindo de espessantes, surfactantes e as suas combinações. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, o líquido não aquoso compreende um álcool, um aldeído, uma cetona, um ácido graxo, um fosfolipídeo, ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas concretizações, o álcool é selecionado a partir do grupo que consiste em álcoois alifáticos que contêm pelo menos 5 átomos de carbono e esteróis. Em certas concretizações de qualquer uma dos métodos acima mencionados, o líquido não aquoso compreende um ou mais animal, microbiana, sintéticos, ou os óleos vegetais. Em certas concretizações, o óleo vegetal é selecionado a partir do grupo que consiste em milho, soja, algodão, amendoim, girassol, azeitona, linhaça, coco, palma, semente de colza, semente de sésamo, cártamo e suas combinações. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, a emulsão não contiver um microrganismo fotossintética. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, a emulsão compreende ainda um ou mais microorganismos não fotossintéticos de identidade pré-determinada diferente de Methylobacterium. Em certos concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, a fase dispersa compreende, pelo menos, cerca de 0,02% a cerca de 20% da referida emulsão, em massa. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, o líquido não aquoso é um adjuvante agricolamente aceitável ou excipiente agricolamente aceitável. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, a cultura compreende as etapas de inoculação da referida emulsão com o referido Methylobacterium e incubar a referida emulsão inoculado sob condições suficientes para proporcionar um crescimento da referida Methylobacterium. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, o Methylobacterium é selecionada a partir do grupo constituído por M. aminovorans, M. chloromethanicum, M. dichloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum, M. nodulans, M. cerastii, M. gossipiicola, cepa LMG6378 de Methylobacterium sp., M. phyllosphaerae, M. oryzae, M. platani, M. populi, e M. zatmanii. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, a emulsão é essencialmente isenta de contaminação de microorganismos. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, o método compreende ainda recuperar a totalidade ou uma porção do Methylobacterium a partir da emulsão. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, o método compreende ainda a desidratação da porção recuperada do Methylobacterium.

[0020] São também proporcionados preparações Methylobacterium, obtidas por qualquer um dos métodos acima mencionados, em que ou a fase dispersa ou a fase contínua compreende um líquido não-aquoso que tem uma miscibilidade na água que é igual ou menor do que a de n-pentanol a 25 ° C.

[0021] São também proporcionados métodos para o tratamento de uma planta ou de uma parte da planta com Methylobacterium compreendendo o passo de aplicar à referida planta ou parte da planta uma composição que compreende qualquer uma das preparações acima mencionadas Methylobacterium. Em certas concretizações, a composição compreende ainda um adjuvante agricolamente aceitável ou um excipiente aceitável em agricultura. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, a composição carece de uma substância sólida. Em certas concretizações, a parte da planta é uma semente e a referida composição tem uma titulação Methylobacterium de pelo menos cerca de 5 x 10 unidades formadoras de colônias por grama da referida composição de cerca de 5 x 1013 unidades formadoras de colônias por grama da referida composição. Em certas concretizações, a parte da planta é uma semente, caule, raiz, flor, cotilédone, um coleóptilos, fruta, ou uma folha. Em certas concretizações, a parte da planta ou planta é uma milho, Brassica sp., Alfalfa, arroz, centeio, sorgo, painço pérola, painço, Setaria italica, milho miúdo, girassol, cártamo, soja, tabaco, batata, amendoim, algodão, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, citros, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, verde-oliva, mamão, caju, macadâmia, amêndoas, açúcar de beterraba, cana de açúcar, aveia, cevada, tomate, alface, feijão verde, lima feijão, ervilha, abóbora, ornamental, ou vegetal coníferas ou parte da planta. Em certas concretizações, a parte de planta ou planta está pelo menos parcialmente revestido com uma preparação de Methylobacterium acima mencionado. São também proporcionados aqui são produtos vegetais transformados obtidos a partir de qualquer um dos acima mencionados plantas ou partes de plantas, em que o referido produto processado contém a emulsão. Em certas concretizações, o produto vegetal processado é uma refeição, pasta, farinha, flocos, ou alimentos para animais. Em certas concretizações, o produto processado é não regenerável.

[0022] Aqui proporcionados são produtos de fermentação que compreendem uma emulsão compreendendo uma fase contínua e uma fase dispersa que é imiscível ou apenas parcialmente miscíveis na fase contínua, e uma mono-cultura ou co-cultura de Methylobacterium. Em certas concretizações, o (a), a fase dispersa compreende um líquido não-aquoso e a fase contínua compreende um líquido aquoso ou b) a fase dispersa compreende um líquido aquoso e a fase contínua compreender um líquido não aquoso. Em certas concretizações, o líquido não aquoso tem uma miscibilidade na água que é igual ou menor do que a de n-pentanol a 25 ° C. Em certas concretizações, o produto de fermentação é essencialmente isenta de contaminação de microorganismos. Em certas concretizações, o produto de fermentação compreende ainda um ou mais microorganismos de pré-determinado diferente do da identidade Methylobacterium. Em certas concretizações, o produto de fermentação carece de uma substância sólida. Em certas concretizações, o produto de fermentação não contém um microorganismo fotossintéticp. Em certas concretizações, a Methylobacterium estão a um título de pelo menos cerca de 5 x 107, pelo menos, cerca de 1 x 10 unidades por mililitro, pelo menos cerca de 5 x 10 unidades por mililitro de colônias formando, formadoras de colônias nove unidades formadoras de colônias por mililitro, pelo menos, cerca de 1 x 1010 unidades por mililitro, ou de formação de colônias pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades por mililitro de formação de colônias. Em certas concretizações, o Methylobacterium estão a um título de pelo menos cerca de 5 x 107 unidades formadoras de colônias por mililitro de pelo menos cerca de 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas concretizações, pelo menos um dos Methylobacterium é um pimento rosa facultativo de Methylotroph (PPFM). Em certas concretizações, o rosa pigmentado Facultativo de Methylotroph (PPFM) é selecionado a partir do grupo constituído por M. aminovorans, M. chloromethanicum, M. dichloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum, M. cerastii, M. gossipiicola, cepa LMG6378 de Methylobacterium sp., M. phyllosphaerae, M. oryzae, M. platani, M. populi, e M. zatmanii. Em certas concretizações, pelo menos um dos Methylobacterium é M. nodulans.

[0023] Também são proporcionadas composições que compreendem uma emulsão compreendendo uma fase contínua e uma fase dispersa, e uma mono-cultura ou de co-cultura de Methylobacterium. Em certas concretizações, o (a), a fase dispersa compreende um líquido não-aquoso e a fase contínua compreende um líquido aquoso ou (b) a fase dispersa compreende um líquido aquoso e a fase contínua compreende um líquido não-aquoso. Em certas concretizações, o líquido não aquoso tem a miscibilidade em água que é igual ou menor do que a de n-pentanol a 25 ° C. Em certas concretizações, a composição é essencialmente isenta de contaminação de microorganismos. Em certas concretizações, a composição compreende ainda, pelo menos, um de um adjuvante agricolamente aceitável e / ou um excipiente aceitável em agricultura. Em certas concretizações, a composição não tem uma substância sólida. Em certas concretizações, o segundo líquido compreende um álcool, um aldeído, uma cetona, um ácido graxo, um fosfolipídeo, ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas concretizações, o álcool é selecionado a partir do grupo que consiste em álcoois alifáticos que contêm pelo menos 5 átomos de carbono e esteróis. Em certas concretizações, o líquido não aquoso compreende um ou mais óleos vegetais. Em certas concretizações, o óleo vegetal é selecionado a partir do grupo que consiste em milho, soja, algodão, amendoim, girassol, azeitona, linhaça, coco, palma, semente de colza, semente de sésamo, cártamo, e suas combinações. Em certas concretizações, a substância sólida compreende ainda um adjuvante agricolamente aceitável ou um excipiente aceitável em agricultura. Em certas concretizações, a composição não contém um microorganismo fotossintético. Em certas concretizações, a composição compreende ainda, pelo menos um pesticida e / ou, pelo menos, um agente bacteriostático. Em certas concretizações, o pesticida é selecionado do grupo que consiste de um insecticida, um fungicida, um nematocida, e um bactericida, em que o referido pesticida não inibe consideravelmente o crescimento da referida Methylobacterium.

[0024] Além disso, proporcionam-se aqui métodos para o tratamento de uma planta ou de uma parte da planta com Methylobacterium compreendendo a etapa de aplicar à referida planta ou parte da planta de qualquer dos produtos de fermentação acima mencionados ou composições. Em certas concretizações dos métodos, a parte da planta é uma semente, caule, raiz, flor, cotilédone, um coleóptilos, fruta, ou uma folha Em certas concretizações da parte métodos, de planta ou planta é uma milho, Brassica sp., Alfalfa , arroz, centeio, sorgo, milheto, painço, painço foxtail, painço dedo, girassol, cártamo, soja, tabaco, batata, amendoim, algodão, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, citros, cacau, chá , banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, mamão, caju, macadâmia, amêndoas, açúcar de beterraba, cana de açúcar, aveia, cevada, tomate, alface, feijão verde, lima feijão, ervilha, abóbora, ornamental, ou vegetal coníferas ou parte da planta. Em certas concretizações dos métodos, a parte da planta é uma semente e a composição tem um título de Methylobacterium de pelo menos cerca de 5 x 107 unidades formadoras de colônias por grama da composição para cerca de 6 x 1010, 3 x 1012, 5 X 1012, 1 x 1013 ou 5 x 1013 unidades formadoras de colônias por grama da composição.

[0025] As plantas ou partes de plantas, obtidos pelos métodos, em que a parte de planta ou planta está pelo menos parcialmente revestidas com o produto de fermentação da composição, são também fornecidos.

[0026] Uma parte de planta ou planta, em que a parte de planta ou planta está pelo menos parcialmente revestido com uma emulsão compreendendo um primeiro líquido aquoso, um segundo líquido que tem uma miscibilidade na água que igual ou menor do que a de n-pentanol e um grupo mono- cultura ou co-cultura de uma Methylobacterium exógena. Os produtos processados de plantas obtidas a partir de plantas ou partes de plantas, obtidos por qualquer um dos acima referida planta ou partes da planta, em que o produto transformado contém qualquer um dos acima mencionados, emulsões ou produtos de fermentação de caldos de fermentação.

[0027] As composições são também aqui fornecidas. Em certas concretizações, o produto vegetal processado é uma refeição, pasta, farinha, flocos, ou alimentos para animais. Em certas concretizações, o produto vegetal processado é não regenerável.

[0028] São também proporcionados métodos para a produção de um produto industrial, caracterizado por compreender cultivar um mono-cultura ou de co-cultura de Methylobacterium em uma emulsão compreendendo uma fase contínua e uma fase dispersa que é imiscível ou apenas parcialmente miscíveis na fase contínua e a colheita do produto industrial após o crescimento a Methylobacterium. Em certas concretizações, a emulsão compreende um primeiro líquido aquoso e um segundo líquido não aquoso que seja não miscível ou parcialmente miscível no primeiro líquido aquoso em certa concretizações, a emulsão é essencialmente isenta de contaminação por microrganismos, a partir da fase sólida, a fase líquida, ou a combinação dos mesmos Em certas concretizações, o produto industrial é um precursor polimérico, um biopolímero, um precursor de um composto medicinal, um composto medicinal, ou uma proteína recombinante. Em certos concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, o produto industrial é o ácido poli-3-hidroxi-butírico, 1,3-propanodiol, um pirroloquinolinequinona ou um oxazopyrroloquinolina. Em certas concretizações de qualquer dos métodos acima mencionados, a emulsão não contem um microrganismo fotossintético.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0029] Tal como aqui usado, as frases "aderente ao mesmo" e "aderente" referem-se à Methylobacterium que estão associadas com uma substância sólida por crescimento, ou que tenham sido cultivadas, sobre uma substância sólida.

[0030] Tal como aqui utilizada, a frase "adjuvante agricolamente aceitável" refere-se a uma substância que melhora o desempenho de um agente ativo em uma composição para o tratamento de plantas e / ou partes de plantas. Em certas composições, um agente ativo pode compreender uma mono-cultura ou de co-cultura de Methylobacterium.

[0031] Tal como aqui utilizada, a frase "excipiente agricolamente aceitável" refere-se a uma substância, essencialmente inerte que pode ser usada como um diluente e / ou veículo de um agente ativo em uma composição para o tratamento de plantas. Em certas composições, um agente ativo pode compreender uma mono-cultura ou co-cultura de Methylobacterium.

[0032] Tal como aqui utilizado, o termo "algas" refere-se a qualquer tipo de micro- ou macroalgas.

[0033] Tal como aqui utilizado, o termo "Methylobacterium" refere-se a bactérias que são metilotróficas facultativa do gênero Methylobacterium. O termo Methylobacterium, tal como aqui utilizado, assim, não inclui incluem espécies dos gêneros Methylobacter, methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum e Methylocella, que são metanotróficas obrigatórias.

[0034] Tal como aqui utilizada, a frase "co-cultura de Methylobacterium" refere-se a uma cultura de Methylobacterium compreendendo, pelo menos, duas cepas de Methylobacterium ou, pelo menos, duas espécies de Methylobacterium.

[0035] Tal como aqui utilizada, a frase "microrganismo contaminante" refere-se a microrganismos em cultura, um caldo de fermentação, o produto de caldo de fermentação, ou composição que não foram identificados antes da introdução na cultura, caldo de fermentação, o produto caldo de fermentação, ou composição.

[0036] Tal como aqui utilizado, o termo "emulsão" refere-se a uma mistura coloidal de dois líquidos imiscíveis, em que um líquido é a fase contínua e o outro líquido, é a fase dispersa. Em certas concretizações, a fase contínua é um líquido aquoso e a fase dispersa é um líquido não aquoso, que não é miscível no líquido aquoso.

[0037] Tal como aqui utilizada, a frase "essencialmente isento de microrganismos contaminantes" refere-se a uma cultura, caldo de fermentação, produtos de fermentação, ou a composição em que pelo menos cerca de produto de fermentação, ou a composição são Methylobacterium desejado ou outros microrganismos desejados de pré- determinada identidade.

[0038] Tal como aqui utilizada, a frase "substância sólida inanimada" refere-se a uma substância que é insolúvel ou parcialmente solúvel em água ou em soluções aquosas e que é ou não-vivo ou que não é uma parte de um organismo ainda vivo a partir do qual ela foi derivada .

[0039] Tal como aqui utilizada, a frase "monocultura de Methylobacterium" refere-se a uma cultura de Methylobacterium que consiste em uma única cepa de Methylobacterium.

[0040] Tal como aqui utilizado, um "pesticida" refere-se a um agente que é insecticida, fungicida, nematocida, bactericida, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0041] Tal como aqui utilizada, a frase "agente bacteriostático" refere-se a agentes que inibem o crescimento de bactérias, mas não matam as bactérias.

[0042] Tal como aqui utilizada, a frase "pesticida não inibe consideravelmente o crescimento da referida Methylobacterium" refere-se a qualquer pesticida que, quando fornecida em uma composição que compreende um produto de fermentação em que uma mono-cultura ou co-cultura de Methylobacterium, não resulta em mais do que uma 50 % de inibição de crescimento Methylobacterium quando a composição é aplicada a uma planta ou parte da planta em comparação com uma composição sem o pesticida. Em certas concretizações, os resultados de pesticidas em não mais do que 40%, 20%, 10%, 5%, ou% de inibição de crescimento Methylobacterium, quando a composição é aplicada a uma planta ou parte da planta em comparação com uma composição sem o pesticida.

[0043] Tal como aqui utilizado, o termo "bactérias" refere-se PPFM sem limitação para as espécies bacterianas no gênereo Methylobacterium diferente de M. nodular.

[0044] Tal como aqui utilizada, a frase "substância sólida" refere-se a uma substância que é insolúvel ou parcialmente solúvel em água ou soluções aquosas.

[0045] Tal como aqui utilizada, a frase "em fase sólida que podem ser nele suspensas" refere-se a uma substância sólida que pode ser distribuída ao longo de um líquido por meio de agitação.

[0046] Tal como aqui utilizado, o termo "não- regenerável" refere-se a uma parte da planta ou produto vegetal processado que não pode ser regenerada em uma planta completa.

[0047] Tal como aqui utilizada, a frase "substancialmente toda a fase sólida é suspensa na fase líquida" refere-se aos meios de comunicação, em que, pelo menos, 95%, 98%, ou 99% da substância sólida (s) que compreende a fase sólida são distribuídos por todo o líquido por agitação.

[0048] Tal como aqui utilizada, a frase "substancialmente toda a fase sólida não é suspenso na fase líquida" refere-se a meios em que menos de 5%, 2%, ou 1% do sólido está na forma de partículas que é distribuída ao longo dos meios por agitação.

[0049] Tal como aqui utilizado, o termo "rendimento", quando utilizado em referência a Methylobacterium obtido em uma fermentação, refere-se aos números de Methylobacterium obtido. Métodos para a determinação do rendimento incluem, mas não estão limitados a, determinação do número de unidades formadoras de colônias (CFU) por unidade de volume ou unidade de massa do material obtido, determinar um peso molhado do Methylobacterium obtido, e / ou determinar um peso seco de ao Methylobacterium obtido.

[0050] Para a extensão em que qualquer das definições anteriores é incompatível com as definições fornecidas em qualquer patente ou de referência não patentária aqui incorporada por referência, qualquer patente ou referência não patentária aqui citada, ou em qualquer referência de patente ou não patente encontradas em outros lugares, entende-se que a definição anterior irá ser aqui utilizada. Métodos para a cultura de Methylobacterium, composições e usos dos mesmos

[0051] Métodos onde Methylobacterium são cultivadas em meios compreendendo uma emulsão foram encontradas para aumentar significativamente o rendimento resultante de Methylobacterium em relação a métodos onde o Methylobacterium são cultivadas em meio líquido por si só. Em certas concretizações, os métodos podem incluir o crescimento de Methylobacterium em uma emulsão sob condições que proporcionam o crescimento de Methylobacterium. Meios compreendendo a emulsão e Methylobacterium pode ser obtido por uma variedade de métodos que incluem, mas não estão limitados a, qualquer um de: (a) inoculando meios AC compreendendo a emulsão com Methylobacterium; (b) inoculação do líquido aquoso com Methylobacterium, introduzindo o líquido não aquoso, e mistura para formar uma emulsão; (c) inocular o líquido aquoso com Methylobacterium, introduzindo o líquido não aquoso, e mistura para formar uma emulsão; ou (d) qualquer combinação de (a), (b), ou (c). Em certas concretizações, a cultura compreende as etapas de inoculação de meios com o Methylobacterium e incubando o meio inoculado sob condições suficientes para proporcionar um crescimento do Methylobacterium. Em certas concretizações, a Methylobacterium são inoculadas em meios a um título de pelo menos cerca de 5 x 104 unidades formadoras de colônias por mililitro ou pelo menos cerca de 1 x 105 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas concretizações, a Methylobacterium é selecionada a partir do grupo constituído por M. aminovorans, M. chloromethanicum, M. dichloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum, M. nodular, M. cerastii, M. gossipiicola, cepa LMG6378 de Methylobacterium sp., M. phyllosphaerae, M. oryzae, M. platani, M. populi e zatmanii. Os métodos também podem compreender ainda as etapas de colher a mono ou co-cultura de Methylobacterium. Os métodos para a colheita da Methylobacterium podem incluir, mas não estão limitadas a, separação da Methylobacterium a partir da fase líquida por filtração, centrifugação, decantação, e semelhantes.

[0052] Os métodos de agitação que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, agitação, agitação recíproca, de agitação rotativa, e suas combinações. Em certas concretizações, a agitação pode compreender colocar meios que compreendem a emulsão em um agitador rotativo que fornece, pelo menos, 25, 50, 100, 200, 250, 500, ou 1000 revoluções por minuto (RPM). A agitação equivalente à que é fornecida por um conjunto agitador rotativo, pelo menos, 25, 50, 100, 200, 250, 500, ou 1000 revoluções por minuto (RPM) pode também ser obtida por agitação, agitação recíproca, e outros métodos. Em certas concretizações, a separação dos líquidos aquosos e não- aquosos na emulsão pode ser eliminado ou reduzido mediante agitação equivalente à que é fornecida por um conjunto rotativo agitador, pelo menos, 25, 50, 100, 200, 250, 500, ou 1000 revoluções por minuto (RPM).

[0053] Os caldos de fermentação contendo as emulsões que são usados nos métodos aqui proporcionados podem ser culturas axénicas que são essencialmente livres de microrganismos contaminantes. Em certas concretizações, pelo menos cerca de 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9%, ou 100% dos microrganismos presentes, por quantidade ou tipo da cultura, o caldo de fermentação, produtos de fermentação, ou composições aqui proporcionadas são a Methylobacterium desejada ou outros microrganismos desejados de pré- determinada identidade. Methylobacterium desejados ou outros microrganismos desejados de pré-determinada identidade são microrganismos obtidos a partir de uma cultura pura. Para proporcionar tais culturas axénicas, os componentes utilizados nos meios de cultura que compreende a emulsão são esterilizados ou obtidos em uma forma essencialmente estéril antes da inoculação de Methylobacterium e / ou quaisquer microrganismos desejados adicionais no mono- ou co-cultura. A esterilização de vários componentes dos meios que compreende a emulsão pode ser conseguida por métodos, incluindo, mas não se limitando a, tratamento em autoclave, a irradiação, a esterilização de filtro (para líquidos), e semelhantes. Uma cultura, o caldo de fermentação, produtos de fermentação, ou composição que é essencialmente isenta de contaminação de microorganismos pode ser obtido, em que o líquido ou líquido e qualquer adição de componentes sólidos de que a cultura, o caldo de fermentação, produtos de fermentação, ou a composição foram estéril antes da inoculação ou disposição dos microrganismos desejados de identidade e adequados as etapas pré-determinadas são tomadas para evitar a contaminação da cultura durante o crescimento dos microorganismos desejados ou contaminação da composição.

[0054] Os métodos aqui proporcionados onde Methylobacterium são cultivadas em meios que compreendem uma emulsão pode ser praticado em qualquer um de uma fermentação em modo de lotes, um modo de fermentação Fed-batch, ou uma fermentação contínua. Os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, e composições aqui proporcionadas também podem ser obtidos a partir de qualquer um de uma fermentação em modo de lotes, um modo de fermentação Fed- batch, ou uma fermentação contínua. Em certas concretizações, os factores, tais como o pH e concentração de oxigénio pode ser controlado em qualquer um dos fermentação em modo batelada, o modo descontínuo alimentado de fermentação, ou processos de fermentação contínua utilizados nos métodos aqui proporcionados.

[0055] As monoculturas ou co-culturas de Methylobacterium e caldos de fermentação, produtos resultantes caldo de fermentação, e as composições aqui proporcionadas podem compreender um ou mais Methylobacterium que incluem, mas não estão limitados a, M. aminovorans, M. chloromethanicum, M. dichloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum, M. nodular, M. cerastii, M. gossipiicola, cepa LMG6378 de Methylobacterium sp., M. phyllosphaerae, M. oryzae, M. platani, M. populi e M. zatmanii. Em certas concretizações, as monoculturas ou co-culturas de Methylobacterium e caldos de fermentação e produtos resultantes dos caldos de fermentação aqui proporcionados podem consistir de um ou mais de Methylobacterium. No entanto, os métodos aqui proporcionados podem também ser utilizados em outras Methylobacterium. As Methylobacterium também podem ser obtidas por vários métodos publicados (Madhaiyan et al., 2007). Em certas concretizações, tais como outras Methylobacterium que podem ser usados será Methylobacterium 16S tendo sequências de ARN de, pelo menos, cerca de 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de identidade de sequência com as sequências de ARN 16S de outra conhecida Methylobacterium. Tipagem de Methylobacterium através da utilização de comparações de sequências 16S RNA é, pelo menos, descrita por Cao et al, 2011. Em certas concretizações, os monoculturas ou co-culturas e produtos resultantes pode compreender uma Methylobacterium que pode colonizar plantas e / ou partes de plantas. Methylobacterium que pode colonizar plantas e / ou partes de plantas incluem, mas não estão limitados a, M. extorquens, M. nodulans e M. mesophilicum. A Methylobacterium que pode colonizar plantas e / ou partes de plantas também incluem, mas não estão limitados a, espécies de Methylobacterium cerastii (com uma cepa representativa disponíveis como DSM 23679 da coleção Leibniz Institute DSMZ-Alemã de Microrganismos e celular

[0056] As culturas ("DSMZ"), Braunschweig, Alemanha), espécies gossipiicola Methylobacterium (com uma cepa representativa disponível como NRRL B-51692 a partir das ARS USDA, Peoria, IL., EUA), Cepa LMG6378 de Methylobacterium sp. (disponível a partir da Colecção Coordenada Belga de Microrganismos / Laboratorium voor Microbiologie ("BCCLM") Ghent, Bélgica), espécie Methylobacterium phyllosphaerae (com uma cepa representativa disponíveis tão disponível como DSM 19779T do DSMZ), espécies Methylobacterium oryzae (com uma cepa representativa disponível como DSM 18207T do DSMZ), espécies Methylobacterium nodulans (com uma cepa representativa disponível como LMG 21967 do BCCLM), espécies Methylobacterium Platani (com uma cepa representativa disponível como KCTC 12901 da coleção coreana por Tipo as culturas, Yusong-ku, Taejon, KR ( "KCTC") e espécies Methylobacterium populi (com uma cepa representativa disponíveis como ATCC BAA-705 da ATCC). Os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, composições, métodos para a sua preparação, e métodos de utilização do mesmo, incluindo, mas não limitado a, métodos de tratamento de plantas, onde a Methylobacterium é uma Methylobacterium que pode colonizar uma planta e / ou uma parte da planta que é selecionado a partir do grupo constituído por M. extorquens, M. nodular, M. mesophilicum, M. cerastii, M. gossipiicola, cepa LMG6378 de Methylobacterium sp., M. phyllosphaerae, M. oryzae, M. Platani, e M. populi são, assim, fornecido. Os métodos de isolamento de outras Methylobacterium que pode colonizar plantas e / ou partes de plantas têm sido descritos em várias publicações e também podem ser utilizados (ver Madhaiyan et al., E as referências aí citadas).

[0057] Sem pretender ser limitado pela teoria, acredita-se que os métodos de cultura de Methylobacterium em meios compreendendo uma emulsão aqui proporcionada pode ser especialmente vantajosos para a cultura de Methylobacterium que pode colonizar plantas e / ou partes de plantas ou que foram isolados a partir das superfícies das plantas e / ou partes de plantas.

[0058] Methylobacterium representativas que podem ser usadas nos caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, composições e métodos relacionados aqui proporcionados incluem, mas não estão limitados a, a Methylobacterium da Tabela 1. Tabela 1. Methylobacterium representativas

Principais Centros Depositários ATCC: American Type Tissue Culture Collection, Manassas, VA, USA CCUG: Culture Collection, University of Goteborg, Sweden CIP: Collection de l’Institut Pasteur, Paris, FR DSM: DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (“DSMZ”), Braunschweig, Germany JCM: Japan Collection of Microorganisms, Saitama, Japan LMG: Belgian Co-ordinated Collection of Micro- organisms/Laboratorium voor Microbiologie (“BCCLM”) Ghent, Belgium NBRC: Biological Resource Center (NBRC), Chiba, Japan NCIMB: National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria, UK NRRL: USDA ARS, Peoria, IL., USA

[0059] Em certas concretizações, os mono-culturas ou co-culturas e caldos de fermentação e produtos resultantes caldo de fermentação pode compreender um ou mais Methylobacterium isolados ou mutantes que produzem níveis aumentados de nutrientes úteis ou reguladores do crescimento das plantas. A Patente N° US 8,153,118 descreve vários isolados de Methylobacterium que produzem níveis aumentados de vitamina B-12 e os aminoácidos que podem ser utilizados nos métodos e composições aqui proporcionados. Caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, e as composições que compreendem um ou mais dos Methylobacterium, tal como Methylobacterium mutante B 11/12 tendo o número de acesso ATCC PTA-1561 que produz em excesso de vitamina B-12, Methylobacterium rhodinum (ATCC # 43282) que super-produz o aminoácido treonina, Methylobacterium sp. (ATCC # 21371) que super-produz o aminoácido ácido L-glutâmico, Methylobacterium sp. (ATCC # 21372) que super-produz o aminoácido ácido L-glutâmico, Methylobacterium sp. (ATCC # 21926) que super-produz o aminoácido L-lisina, Methylobacterium sp. (ATCC # 21969) que super-produz o aminoácido ácido L-glutâmico, Methylobacterium sp. (ATCC # 21927) que super-produz os aminoácidos L-lisina, ácido L- aspártico, L-alanina, L-valina, L-leucina e L-arginina e / ou Methylobacterium sp. (ATCC # 21438) que produz a proteína de célula única, também é fornecido.

[0060] Em certas concretizações, o caldo de fermentação, o produto de caldo de fermentação, ou composições aqui proporcionadas podem ainda compreender um ou mais microrganismos pré-determinados introduzidos de diferente identidade de Methylobacterium. Outros microorganismos que podem ser adicionados incluem, mas não estão limitados a, microrganismos que são biopesticida ou proporcionam algum outro benefício, quando aplicada a uma planta ou parte de planta. Biopesticida ou de outra forma microrganismos benéficos incluem assim, mas não estão limitados a, vários Bacillus sp., Pseudomonas sp., Coniothyrium sp., Pantoea sp., Streptomyces sp., e Trichoderma sp. Os biopesticidas microbianos podem ser uma bactéria, fungo, vírus, ou protozoário. Os microorganismos biopesticidas particularmente úteis incluem várias cepas de Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilis, Pseudomonas syringae, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens, e Streptomyces lydicus. Outros microrganismos que são adicionados podem ser geneticamente modificados ou de ocorrência natural isolados que estão disponíveis como culturas puras. Em certas concretizações, prevê-se que o microorganismo bacteriano ou fúngico pode ser fornecido no caldo de fermentação, o produto caldo de fermentação, ou a composição sob a forma de um esporo. Ainda outros microorganismos que podem ser adicionados incluem, mas não estão limitados a, microrganismos que são microorganismos fotossintéticos. Tais organismos fotossintéticos incluem, mas não estão limitados a, algas. Essas algas podem incluir, mas não estão limitados a, algas do gênero de Protococcus, Ulva, Codium, Enteromorpha, Neochloris, e / ou Chlamydomonas.

[0061] Em certas concretizações, o componente líquido aquoso da emulsão utilizada no meio de cultura é preparado a partir de componentes de baixo custo e facilmente disponíveis, incluindo, mas não limitados a, sais inorgânicos tais como fosfato de potássio, sulfato de magnésio e semelhantes, fontes de carbono, tais como glicerol, metanol, ácido glutâmico, ácido aspártico, ácido succínico e semelhantes, e misturas de aminoácido, tais como a peptona, triptona, e semelhantes. Meios líquidos exemplificativos que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, sais minerais de amónio (AMS) forma (Whittenbury et al., 1970), Vogel-Bonner (VB) meio mínimo cultura (Vogel e Bonner, 1956), e LB caldo ("Luria broth - Bertani").

[0062] Em certas concretizações, a emulsão compreende um líquido aquoso e um líquido que não é miscível ou parcialmente miscível, no líquido aquoso. Líquidos não- aquoso que não são miscíveis ou apenas parcialmente miscíveis em água incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos seguintes: (1) Líquidos com uma miscibilidade na água que é igual ou menor do que a de n-pentanol , n-hexanol ou n- heptanol em 25 graus C; (2) os líquidos que compreendem um álcool, um aldeído, uma cetona, um ácido graxo, um fosfolipídeo, ou qualquer sua combinação; (3) álcoois é selecionado a partir do grupo que consiste em álcoois alifáticos que contêm pelo menos 5, 6, ou 7 átomos de carbono e esteróis; (4) um óleo animal, óleo microbiano, óleo sintético, o óleo vegetal, ou uma combinação destes; e / ou, (5) um óleo vegetal é selecionado a partir do grupo que consiste em milho, soja, algodão, amendoim, girassol, azeitona, linhaça, coco, palma, semente de colza, semente de sésamo, cártamo, e suas combinações. Em certas concretizações, o líquido não-aquoso ou parcialmente imiscível imiscível pode compreender, pelo menos, cerca de 0,02% a cerca de 20% da emulsão da massa. Em certas concretizações, o líquido não-aquoso ou parcialmente imiscível imiscível pode compreender pelo menos cerca de qualquer de cerca de 0,05%, 0,1%, 0,5%, ou 1% a cerca de 3%, 5%, 10%, ou 20% da emulsão da massa.

[0063] Em geral, o componente líquido não aquoso utilizado nas emulsões que asseguram o crescimento eficiente de Methylobacterium pode ser qualquer líquido não aquoso que seja não miscível ou parcialmente miscível em água ou soluções aquosas. Tais líquidos não-aquosos adequados também são não-bactericida ou bacteriostática não no que diz respeito a Methylobacterium quando fornecido no meio de cultura líquido. Em certas concretizações, tais líquidos não-aquosos adequados também são líquidos não aquosos que são prontamente obtidos na forma estéril ou tornados estéreis. Os líquidos não aquosos aqui utilizados podem ser esterilizados por qualquer método que fornece para a remoção de microrganismos contaminantes e, portanto, incluem, mas não estão limitados a métodos tais como autoclavagem, radiação, tratamento químico, e qualquer combinação dos mesmos.

[0064] Em certas concretizações aqui proporcionadas, uma substância sólida pode ser adicionada à emulsão dos métodos, produtos de fermentação, ou as composições aqui proporcionadas. Métodos e composições para o cultivo de Methylobacterium em meio bifásico compreendendo um líquido e um sólido é divulgado no pedido de Patente No. US 13/907,161, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade, e no Pedido de Patente Internacional PCT/US13/43722, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Estas substâncias sólidas incluem substâncias naturais de origem animal, vegetal, microbiana, fungos, ou de origem mineral, substâncias artificiais, ou combinações de substâncias naturais e artificiais. Em certas concretizações, as substâncias sólidas são substâncias sólidas inanimadas. Substâncias sólidas inanimados de animal, vegetal, microbiana ou origem fúngica pode ser obtido a partir de animais, plantas, microorganismos ou fungos que são inviáveis (ou seja, não estar) ou que tenham sido prestado inviável. Conchas de diatomáceas são, portanto, as substâncias sólidas inanimadas quando algas diatomáceas previamente associadas foram removidos ou não prestados inviável. Uma vez que os reservatórios de diatomáceas são substâncias sólidas inanimadas, eles não são considerados como sendo organismos fotossintéticos ou microorganismos fotossintéticos. Em certas concretizações, as substâncias sólidas incluem, mas não estão limitados a, areia, sedimentos, solos, argila, cinzas, carvão vegetal, terra de diatomáceas e outros minerais semelhantes, vidro moído ou esferas de vidro, materiais cerâmicos solo, grânulos de cerâmica, bentonite, caulino, talco, perlite, mica, vermiculite, sílicas, quartzo em pó, montmorilonite, e as suas combinações. Em certas concretizações, a substância sólida pode ser um polímero ou pérolas poliméricas. Polímeros que podem ser utilizados como uma substância sólida incluem, mas não estão limitados a, vários polissacarídeos, tais como os polímeros celulósicos e polímeros quitinosos que são insolúveis ou apenas parcialmente solúvel em água ou soluções aquosas, ágar (isto é, galactanos), e suas combinações. Em certas concretizações, a substância sólida pode ser um cristal de sal insolúvel ou apenas parcialmente solúvel. Cristais de sal que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, insolúveis ou parcialmente solúveis em carbonatos, cromatos, sulfitos, fosfatos, hidróxidos, óxidos, e sulfuretos. Em certas concretizações, a substância sólida pode ser uma célula microbiana, células de fungos, esporos microbianos ou esporos de fungos. Em certas concretizações, a substância sólida pode ser uma célula microbiana ou esporo microbiano em que a cula microbiana ou de esporos microbianos não é um microorganismo fotossintético. Em certas concretizações, a célula microbiana ou esporos microbianos não é um microorganismo fotossintético, em que o microorganismo é selecionado a partir do grupo fotossintético constituído por algas, cianobactérias, diatomáceas, Botryococcus braunii, Chlorella, Dunaliella tertiolecta, Gracilaria, Pleurochrysis carterae, Sargassum e Ulva. Em ainda outras concretizações, a substância sólida pode ser uma (ou seja, inviável) célula microbiana, células de fungos, esporos microbianos, ou esporos de fungos inativados. Em ainda outras concretizações, a substância sólida pode ser uma de repouso (isto é viável, mas não em divisão ativa) de células microbianas, células de fungos, esporos microbianos, ou esporos de fungos. Em ainda outras concretizações, a substância sólida pode ser restos celulares de origem microbiana. Em ainda outras concretizações, a substância sólida pode ser material particulado a partir de qualquer parte de uma planta. As partes das plantas que podem ser usados para se obter a substância sólida incluem, mas não estão limitados a espigas, casca, casca, folhas, raízes, flores, caules, casca, sementes, e suas combinações. Os produtos obtidos a partir de partes de plantas processadas, incluindo, mas não se limitando a, bagaço, farelo de trigo, grãos de soja, bolo de semente esmagada, Stover, e outros semelhantes também podem ser usados. Tais partes de plantas, as plantas transformadas e / ou partes de plantas transformadas pode ser moído até se obter o material sólido em uma forma de partículas que pode ser usado. Em certas concretizações, a madeira ou um produto de madeira incluindo, mas não limitados a pasta de madeira, serragem, aparas, e semelhantes pode ser utilizado. Em certas concretizações, a substância sólida pode ser um material particulado a partir de um animal (s), incluindo, mas não limitado a farinha de ossos, gelatina, terra ou conchas em pó, cabelo, pele macerado, e semelhantes.

[0065] Em certas concretizações, a substância sólida adicionada à emulsão é fornecida em uma forma de partículas que proporciona a distribuição da substância sólida no meio de cultura. Em certas concretizações, a substância sólida é composta de partículas de cerca de 2 micrometros a cerca de 1000 micra de comprimento médio ou diâmetro médio. Em certas concretizações, a substância sólida é composta de partículas de cerca de 1 micron e cerca de 1000 micra de comprimento médio ou diâmetro médio. Em certas concretizações, a substância sólida é uma partícula de cerca de 1, 2, 4, 10, 20, ou 40 microns a cerca de qualquer de 100, 200, 500, 750, ou 1000 mícrones de comprimento médio ou diâmetro médio. As características desejáveis de partículas utilizadas nos métodos e composições aqui proporcionados incluem molhabilidade adequado tal que as partículas possam ser suspensas ao longo dos meios de comunicação mediante agitação.

[0066] Em certas concretizações, um líquido ou um sólido adicionado a uma emulsão nos produtos de fermentação, composições e métodos aqui proporcionados é um emulsionante que proporciona a estabilização da emulsão. Tais emulsionantes podem incluir, mas não estão limitados a agentes tensioativos e espessantes. Os tensioativos podem incluir, mas não estão limitados a vários detergentes iónicos ou não iónicos, incluindo, mas não limitados a agentes tensioativos aniónicos, surfactantes catiónicos, surfactantes anfotéricos, surfactantes de organo-silicatos, e / ou tensioativos acidificado. Os polímeros hidrocolóides utilizados como emulsionantes em produtos de fermentação, composições e métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitados a agar, alginato, arabinoxilano, carragenano, carboximetilcelulose, celulose, curdlano, gelatina, gelano, β-glucano, goma de guar, goma arábica, goma de semente de alfarroba, pectina, amido, goma de xantano, e misturas dos mesmos. Outros emulsionantes incluem, mas não estão limitados a proteínas e várias argilas. Certos excipientes e adjuvantes aqui descritos noutro local e agricolamente aceitáveis, também podem ser utilizados como emulsionantes.

[0067] Em certas concretizações, a substância sólida adicionada à emulsão é fornecida nos meios de comunicação, produto de fermentação, ou a composição como um colóide em que a fase contínua é um líquido e a fase descontínua é o sólido. Os sólidos adequados que podem ser utilizados de forma colóides em meios líquidos utilizados para cultivar Methylobacteriwn incluem, mas não estão limitados a vários sólidos que são referidos como hidrocolóides. Tais hidrocolóides utilizados nos meios, os métodos e composições aqui proporcionados podem ser polímeros hidrofílicos, de origem vegetal, animal, microbiana ou de origem sintética. Os polímeros hidrocolóides utilizados nos métodos podem conter vários grupos hidroxilo e / ou pode ser polielectrólitos. Os polímeros hidrocolóides utilizados nas composições e métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitados a agar, alginato, arabinoxilano, carragenina, carboximetilcelulose, celulose, curdlano, gelatina, gelano, goma de guar, goma arábica, goma de semente de alfarroba β-glucano, pectina, amido, goma de xantano, e misturas dos mesmos. Em certas concretizações, o colóide usado nos meios, os métodos e composições aqui proporcionadas podem compreender um polímero hidrocolóide e uma ou mais proteínas.

[0068] Em certas concretizações, a substância sólida adicionada à emulsão pode ser uma substância sólida que fornece para o crescimento aderente da Methylobacterium na substância sólida. Methylobacterium que são aderidas a uma substância sólida são Methylobacterium que não pode ser substancialmente removida por simples lavagem do sólido com a substância aderente de Methylobacterium com meio de crescimento, enquanto que Methylobacterium não aderente pode ser substancialmente removido por lavagem da substância sólida com o meio de crescimento líquido. Neste contexto, "substancialmente removido" significa que pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ou 80% a Methylobacterium presentes são removidos quando a substância sólida é lavada com três volumes de meio de crescimento líquido. Essa lavagem pode ser efectuada por uma variedade de métodos incluindo, mas não se limitando a, decantando o líquido a partir de uma fase sólida lavada ou líquido que passa através de uma fase sólida através de um filtro que permite o escoamento através de bactérias no líquido. Em certas concretizações, o Methylobacterium aderente que estão associados com o sólido pode incluir tanto Methylobacterium que está directamente ligado ao sólido e / ou de Methylobacterium que está indirectamente ligado à substância sólida. Methylobacterium que está indirectamente ligado à substância sólida incluem, mas não estão limitados a Methylobacterium que está ligada a uma outra Methylobacterium ou para outro microorganismo que é ligado à substância sólida, Methylobacterium que estão ligados à substância sólida por estar ligada a uma outra substância que está ligado à substância sólida, e semelhantes. Em certas concretizações, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% do Methylobacterium no caldo de fermentação, o produto de caldo de fermentação, ou composições são Methylobacterium que sejam respeitadas a substância sólida. Em certas concretizações, Methylobacterium aderente pode estar presente sobre a superfície da substância sólida no caldo de fermentação, o produto caldo de fermentação, ou a composição com uma densidade de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium/ 20 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 10 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium \ 10 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 5 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 2 micrômetros quadrados, ou de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / micrômetro quadrado. Em certas concretizações, Methylobacterium aderente podem estar presente sobre a superfície da substância sólida no caldo de fermentação, o produto de caldo de fermentação, ou composição, a uma densidade de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 20 micrômetros quadrados de cerca de 1 Methylobacterium / micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 10 micrômetros quadrados para cerca de 1 Methylobacterium / micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 10 micrômetros quadrados para cerca de 1 Methylobacterium / micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 5 micrômetros quadrados e cerca de 1 Methylobacterium / micrômetros quadrados, ou de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / l2 micrômetros quadrados para cerca de 1 Methylobacterium / micrômetro quadrado. Em certas concretizações, Methylobacterium aderente pode estar presente sobre a superfície da substância sólida no caldo de fermentação, o produto caldo de fermentação, ou composição, a uma densidade de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 2 micrômetros quadrados e cerca de 1 Methylobacterium / 2 quadrado micrômetros, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 10 micrômetros quadrados para cerca de 1 Methylobacterium / 2 micrômetros quadrados, de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 10 micrômetros quadrados e cerca de 1 Methylobacterium / 2 micrômetros quadrados, ou de pelo menos cerca de 1 Methylobacterium / 5 micrômetros quadrados e cerca de 1 Methylobacterium / 2 micrômetros quadrados.

[0069] Os produtos de fermentação e caldos aqui proporcionadas podem compreender uma fase líquida que contém Methylobacterium não aderente. Em certas concretizações, os títulos de Methylobacterium não-aderente na fase líquida pode ser inferior a cerca de 100.000, 10.000, ou 1.000 UFC / ml.

[0070] Os métodos de cultura fornecida podem produzir produtos de fermentação com Methylobacterium a um título superior a cerca de 5 x 107 unidades formadoras de colônias por mililitro, cerca de 5 x 108 unidades por mililitro, com um título superior a cerca de 1 x 109 de unidades formadoras de colônias por mililitro com um título superior a cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, a um título de pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas concretizações, caldos de fermentação aqui proporcionadas podem compreender Methylobacterium a um título de pelo menos cerca de 5 x 107 unidades formadoras de colônias por mililitro de pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades por mililitro, de formação de colônias pelo menos cerca de 5 x 107 unidades formadoras de colônias por mililitro de pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, ou pelo menos cerca de 5 x 107 unidades por mililitro de pelo menos cerca de 6 x 1010 de unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certos concretizações, caldos de fermentação aqui proporcionados podem compreender Methylobacterium a um título de pelo menos cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por mililitro de pelo menos cerca de 3 x 1010, pelo menos, cerca de 1 x 109 unidades formadoras de colônias por mililitro de pelo menos cerca cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, ou, pelo menos, cerca de 1 x 109 unidades por mililitro de pelo menos cerca de 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas concretizações, caldos de fermentação aqui proporcionados compreenderá Methylobacterium a um título de pelo menos cerca de 1 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro de pelo menos cerca de 3 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, pelo menos, cerca de 1 x 1010 unidades por mililitro de colônias formando a pelo menos cerca de 4 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro, ou, pelo menos, cerca de 1 x 1010 unidades por mililitro de pelo menos cerca de 6 x 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro. Em certas concretizações, caldos de fermentação aqui proporcionados compreenderá Methylobacterium com uma concentração de, pelo menos cerca de 3 X 1010 unidades por mililitro de pelo menos cerca de 4 X1010 de unidades formadoras de colônias por mililitro, ou pelo menos cerca de 3 X 1010 unidades por mililitro de pelo menos cerca de 6 X 1010 unidades formadoras de colônias por mililitro.

[0071] Os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, ou outras composições que compreendem emulsões com Methylobacterium pode ser usado para fazer várias composições úteis para o tratamento de plantas ou partes de plantas. Alternativamente, caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, ou outras composições que compreendem emulsões com Methylobacterium pode ser pode ser utilizado para tratar as plantas ou partes de plantas. As plantas, partes de plantas, e, em particular, sementes de plantas que tenham sido pelo menos parcialmente revestidos com os produtos de caldo de fermentação ou composições são, portanto, fornecida. Além disso, desde que sejam processados produtos vegetais que contêm os produtos de caldos de fermentação ou composições. Os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, ou outras composições que compreendem emulsões com Methylobacterium são particularmente úteis para o tratamento de sementes de plantas. As sementes que tenham sido pelo menos parcialmente revestidas com os produtos de caldo de fermentação ou composições são, portanto, fornecida. Além disso, desde que sejam processados produtos de sementes, incluindo, mas não limitado a, farinha, farinha, ração, e flocos que contêm os produtos de caldo de fermentação ou composições aqui proporcionadas. Em certas concretizações, o produto vegetal processado será não regenerável (por exemplo, serão incapazes de se desenvolver em uma planta). Em certas concretizações, a emulsão usada no produto de fermentação ou composição que, pelo menos, reveste parcialmente a planta, parte da planta, ou semente da planta ou que está contido na planta transformadas, parte de planta, ou produto de sementes compreende Methylobacterium associada, que pode ser facilmente identificado comparando um produto tratado e uma planta não tratada, parte da planta, semente de planta ou processados da mesma.

[0072] Os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, ou outras composições que compreendem emulsões com Methylobacterium pode ser usado para produzir produtos industriais ou proteínas recombinantes ou de biorremediação.

[0073] As composições úteis para o tratamento de plantas ou partes de plantas que compreendem emulsões que compreendem Methylobacterium também pode compreender um adjuvante agricolamente aceitável ou um excipiente aceitável em agricultura. Um adjuvante agricolamente aceitável ou um excipiente aceitável em agricultura é normalmente um ingrediente que não causar fitotoxicidade indevidas ou outros efeitos adversos, quando exposto a uma parte de planta ou planta. Em certas concretizações, a emulsão pode ser em si um adjuvante agricolamente aceitável ou um excipiente agricolamente aceitável, desde que ele não é bactericida ou bacteriostático ao Methylobacterium. Em outras concretizações, a composição compreende ainda, pelo menos, um de um adjuvante agricolamente aceitável ou um excipiente aceitável em agricultura. Qualquer uma das composições acima mencionadas podem também compreender adicionalmente um pesticida. Os pesticidas usados na composição incluem, mas não estão limitados a um inseticida, um fungicida, um nematocida e um bactericida. Em certas concretizações, o pesticida utilizado na composição é um pesticida que não inibe consideravelmente o crescimento da Methylobacterium. Como Methylobacterium são bactérias gram-negativas, bactericidas adequados utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a bactericidas que exibem atividade contra bactérias gram-positivas, mas não as bactérias gram-negativas. As composições aqui proporcionadas podem também compreender um agente bacteriostático que não inibe consideravelmente o crescimento da Methylobacterium. Agentes bacteriostáticos adequados para utilização nas composições aqui proporcionados incluem, mas não estão limitados a aqueles que apresentam atividade contra bactérias Gram-positivas, mas não bactérias gram-negativas. Qualquer uma das composições acima referidas também podem ser um produto essencialmente seco (isto é, tendo cerca de 5% ou menos do teor de água), uma mistura da composição com uma emulsão ou uma suspensão.

[0074] Os adjuvantes agricolamente aceitáveis utilizados nas composições incluem, mas não estão limitados a componentes que aumentam a eficácia e / ou produtos que melhoram a facilidade de aplicação do produto. Os adjuvantes que intensificam a eficácia do produto podem incluir vários agentes umidificantes / espalhadores que promovem a adesão e espalhamento da composição em partes de plantas, em etiquetas que promovem a adesão à parte da planta, agentes de penetração que podem promover o contacto do agente ativo com os tecidos interiores, extensores que aumentam a meia- vida do agente ativo pela inibição da degradação do meio ambiente, e humectantes que aumentam o tempo de secagem ou a densidade das composições pulverizadas. Wetters / espalhadores utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a, surfactantes não iônicos, surfactantes aniônicos, surfactantes catiônicos, surfactantes anfotéricos, surfactantes organo-silicatos, e / ou surfactantes acidificado. Veículos utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitadas a substâncias à base de látex, terpeno / pinolene, e substâncias à base de pirrolidona. Penetrantes podem incluir óleo mineral, óleo vegetal, óleo vegetal esterificado, tensioativos organo-silicatos, agentes tensioativos e acidificado. Extensores utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a sulfato de amônio, ou substâncias à base de menteno. Os humectantes utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a glicerol, propileno glicol, e dietil-glicol. Os adjuvantes que melhoram a facilidade de aplicação do produto incluem, mas não estão limitados a agentes acidificantes / tamponamento, agentes anti-espuma / agentes de formação de espuma, agentes de compatibilidade, agentes de redução de movimento, corantes, e condicionadores de água. Agentes de Anti-formação de espuma / agentes de formação de espuma utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a dimethopolisiloxano. Agentes de compatibilidade utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a sulfato de amônio. Deriva-agentes redutores utilizados nas composições podem incluir, mas não estão limitados a poliacrilamidas e polissacarídeos. Condicionadores de água usada nas composições podem incluir, mas não estão limitados a sulfato de amônio.

[0075] Os métodos de tratamento de plantas e / ou partes de plantas com os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação e as composições são também aqui fornecidos. As plantas tratadas, e partes de plantas tratadas provenientes destes, incluem, mas não estão limitadas a milho, Brassica sp. (Por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), alfafa, arroz, centeio, sorgo, painço (por exemplo, milheto(Pennisetum glaucum), painço (Panicum miliaceum), painço foxtail (Setaria italicd), dedo milho (Eleusine coracana), girassol, cártamo, soja, tabaco, batata, amendoim, algodão, batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca, café, coco, abacaxi, citros, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, mamão, caju, macadâmia, amêndoas, beterraba, cana de açúcar, aveia, cevada, alface tomate, feijão verde, feijão, ervilhas, cucurbitáceas, como pepino, melão e melão musk, plantas ornamentais, e coníferas. As partes de plantas que são tratadas incluem, mas não estão limitados a folhas, caules, flores, raízes, sementes, fruta, tubérculos, coleóptilos e semelhantes. Plantas ornamentais e partes de plantas que podem ser tratadas incluem, mas não estão limitados a azálea, hortênsia, hibiscos, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravo, poinsétia e crisântemo. As plantas coníferas e partes de plantas que podem ser tratadas incluem, mas não estão limitados a pinheiros, tais como o pinheiro Loblolly, pinheiro Slash, pinheiro ponderosa, Pinus contorta, e pinheiro de Monterey; Douglas Fir; cicuta Ocidental; Sitka abeto; pau-brasil; abetos verdadeiros, tais como abeto e abeto balsâmico; e cedros tais como cedro vermelho ocidental e cedro amarelo do Alasca. As plantas de gramado e partes de plantas que podem ser tratados incluem, mas não estão limitados a, bluegrass anuais, azevém, Canadá bluegrass, festuca, bentgrass, wheatgrass, Kentucky bluegrass, grama do pomar, azevém, redtop, grama Bermuda, St. Augustine grama, e grama esmeralda. Sementes ou outros propágulos de qualquer uma das plantas atrás mencionados podem ser tratados com os produtos de caldos de fermentação, caldo de fermentação, produtos de fermentação, e / ou as composições aqui proporcionadas.

[0076] Em certas concretizações, as plantas e / ou partes de plantas são tratadas por aplicação dos caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, e composições na forma de spray. Tais aplicações de pulverização incluem, mas não se limitam a, tratamentos de uma única planta ou parte de qualquer combinação de partes da planta. A pulverização pode ser alcançada com qualquer dispositivo que irá distribuir os produtos de caldos de fermentação, caldo de fermentação, produtos de fermentação, e as composições para a planta e / ou parte (s) da planta. Dispositivos de pulverização úteis incluem um pulverizador de barra, um pulverizador de mão ou mochila, aviões agrícolas (ou seja, pulverização aérea), e semelhantes. Os dispositivos ou métodos que fornecem para a aplicação dos caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, e composições para um ou ambos de a superfície adaxial e / ou a superfície abaxial para pulverização também podem ser utilizadas. As plantas e / ou partes de plantas que são pelo menos parcialmente revestidos com qualquer de um caldo de fermentação, um produto de caldo de fermentação, produtos de fermentação, ou composições que compreendem uma emulsão com Methylobacterium são também aqui fornecidos. Também fornecidos produtos vegetais neste documento são processados que compõem uma substância sólida com Methylobacterium aderido à mesma.

[0077] Em certas concretizações, as sementes são tratadas por exposição das sementes aos caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, produtos de fermentação, e as composições que compreendem as emulsões aqui proporcionados. As sementes podem ser tratadas com os produtos de caldos de fermentação, caldo de fermentação, e as composições aqui fornecidos por processos incluindo, mas não se limitando a, embebição, revestimento, pulverização e semelhantes. O tratamento de sementes pode ser efetuado tanto com um tratadores de semente de batelada e/ou contínuo. Em certas concretizações, as sementes revestidas podem ser preparadas por mistura das sementes com uma composição de revestimento que contém um caldo de fermentação, o produto de caldo de fermentação, ou composições, desde que compreendem a emulsão com Methylobacterium e do ar de secagem do produto resultante. A secagem ao ar pode ser realizada a qualquer temperatura que não é prejudicial para a semente ou a Methylobacterium, mas tipicamente não irá ser superior a 30 graus centígrados. A proporção de revestimento que compreende uma emulsão e Methylobacterium inclui, mas não está limitado a um intervalo de 0,1 a 25% em peso da semente, 0,5 a 5% em peso da semente, e 0,5 a 2,5% em peso de semente. Em certas concretizações, uma emulsão que compreende ainda uma substância sólida usada no revestimento ou tratamento de sementes terão Methylobacterium aderido nela. Em certas concretizações, uma emulsão que compreende ainda uma substância sólida usada no revestimento ou o tratamento das sementes será associada com Methylobacterium e vai ser um caldo de fermentação, o produto caldo de fermentação, ou composição obtida pelos métodos aqui fornecidos. Várias composições e métodos de tratamento de sementes para o tratamento de sementes divulgada nas Patentes Nos US 5,106,648; 5,512,069, e 8,181,388 são aqui incorporados por referência na sua totalidade e pode ser adaptado para utilização com um agente ativo que compreende os produtos de caldos de fermentação, caldo de fermentação, ou as composições aqui proporcionadas. Em certas concretizações, a composição usada para tratar a semente pode conter excipientes aceitáveis em agricultura que incluem, mas não estão limitados a farinha de madeira, argilas, carbono ativado, terra de diatomáceas, de grão fino sólidos inorgânicos, carbonato de cálcio e semelhantes. Argilas e sólidos inorgânicos que podem ser usados com os caldos de fermentação, produtos de caldo de fermentação, ou composições aqui proporcionadas incluem, mas não estão limitados a cálcio bentonita, caulina, argila de porcelana, talco, perlite, mica, vermiculite, sílicas, quartzo em pó, montmorilonite e suas misturas. Os adjuvantes agricolamente aceitáveis que promovem aderindo à semente que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, acetatos de polivinilo, copolímeros de acetato de polivinila, acetatos de polivinila hidrolisado, copolímero de acetato de polivinilpirrolidona-vinilo, álcoois polivinílicos, copolímeros de álcool polivinílico, éter polivinílico metilo, polivinil éter metil-anidrido maleico, ceras, polímeros de látex, celuloses incluindo etilceluloses e metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilcelulose, hidroximetilpropilceluloses, polivinil-pirrolidonas, alginatos, dextrinas, malto- dextrinas, polissacarídeos, gorduras, óleos, proteínas, goma karaya, goma jaguar, goma de tragacanto, gomas de polissacarídeos, mucilagem, gomas arábicas, shellacs, cloreto de vinilideno polímeros e copolímeros, polímeros à base de proteína de soja e copolímeros, lignossulfonatos, os copolímeros acrílicos, amidos, polyvinylacrylates, zeínas, gelatina, carboximetilcelulose, quitosana, óxido de polietileno, polímeros acrylimide e copolímeros, acrilato de polihidroxietilo, monómeros methylacrylimide, alginato, etilcelulose, policloropreno e os seus xaropes ou misturas. Outros adjuvantes agricolamente aceitáveis úteis que podem promover revestimento incluem, mas não estão limitados a polímeros e copolímeros de acetato de vinila, copolímero de acetato de vinilo e polivinilpirrolidona-ceras solúveis em água. Vários surfactantes, dispersantes, agentes anti- aglomerantes-, agentes de controle de espuma e corantes aqui e na Patente N° US 8,181,388 descritos podem ser adaptados para utilização com um agente ativo que compreende os produtos de caldos de fermentação, caldo de fermentação, ou as composições aqui proporcionadas. EXEMPLOS

[0078] Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar concretizações preferidas da invenção. Será apreciado pelos técnicos versados no assunto que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelos requerentes para funcionar bem na prática da invenção, e, assim, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para a sua prática. No entanto, os técnicos versados no assunto devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas concretizações específicas que são reveladas, enquanto ainda se obtém como resultado ou semelhantes, sem se afastar do escopo da invenção. Exemplo 1. Crescimento das bactérias PPFM em meios de placa de agar sólido.

[0079] Para o crescimento de bactérias PPFM em meios de placa de agar sólido, uma variedade de meios padrões foi testado.

[0080] Um meio utilizado foi o meio de sais minerais de amônio (AMS) (Whittenbury et al., 1970). O meio AMS contém, por litro, 700 mg de dibásico de fosfato de potássio anidro, 540 mg de fosfato monobásico de fosfato de potássio anidro, um grama de sulfato de magnésio heptahidratado, 500 miligramas de cloreto de amónio anidro, 200 mg de cloreto de cálcio di-hidratado, 4 miligramas de sulfato férrico heptahidrato, 100 microgramas de sulfato de zinco heptahidrato, 30 microgramas de cloreto de manganês tetrahidrato, 300 microgramas de ácido bórico anidro e 200 microgramas de cloreto de cobalto hexahidrato, 10 microgramas de cloreto de cobre desidratado, 20 microgramas de cloreto de níquel hexahidrato e 60 microgramas de molibdato de sódio dihidratado.

[0081] O médio AMS foi preparado a partir de quatro soluções estoque, listadas abaixo. Solução estoque I: para um litro na concentração de 50X Fosfato de potássio dibásico, anidro 35 gramas Fosfato de potássio monobásico, anidro 27 gramas Solução estoque II: para um litro na concentração de 50X Sulfato de magnésio heptahidratado 50 gramas Cloreto de amônio, anidro 25 gramas Solução estoque III: para um litro na concentração de 50X Cloreto de cálcio dihidratado 10 gramas Solução estoque com traços de metal: para um litro na concentração de 1000X Sulfato férrico heptahidratado 4 gramas Sulfato de zinco heptahidratado 100 milligramas Cloreto de magnésio tetrahidratado 30 milligramas Ácido bórico, anidro 300 milligramas Cloreto de cobalto hexahidratado 200 milligramas Cloreto de cobre dihidratado 10 milligramas Cloreto de níquel hexahidratado 20 milligramas Molibdato sódico dihidratado 60 milligramas

[0082] As soluções de estoque I, II, e III foram autoclavadas separadamente. A solução de estoque de traços de metais não pode ser autoclavada, tal como a maior parte dos sais precipitados para fora durante a etapa de tratamento em autoclave, e então foi filtrada e esterilizada, através de um aparelho de filtro de 0,2 micrômetro. Estas etapas foram necessárias para assegurar a preparação de um meio de cultura de AMS-água clara com todos os ingredientes na solução. Tal como inicialmente descrito por Whittenbury et al. (1970), os componentes contendo fosfato do meio AMS foram separados dos outros componentes até que as etapas finais de acabamento da preparação forma, evitando a formação de insolúveis de fosfato de magnésio e fosfato de cálcio cristais.

[0083] Para preparar um litro de meios de placa de agar sólido com uma base AMS, 15 gramas de agar foram adicionados a 940 ml de água destilada, e esta mistura foi autoclavada. Após autoclavagem, 20 ml cada de soluções estoque I, II, e III foram adicionados, juntamente com um ml de solução de traços de metais estoque esterilizada por filtração.

[0084] Se outros componentes do meio, tal como uma fonte de carbono, foram a ser incorporado, na sua maior parte destes foram adicionados à mistura de água e de agar antes da autoclavagem. A única excepção a isto foi metanol, que foi por meio de um aparelho de filtro de 0,2 micrômetro e adicionado depois do meio de base tivesse sido autoclavado e esterilizado por filtração.

[0085] Um segundo meio utilizado foi Vogel-Bonner (VB) meio mínimo de cultura (Vogel e Bonner, 1956). Meio VB contém, por litro, 298 mg de sulfato de magnésio heptahidratado, 14,93 gramas de fosfato de potássio dibásico anidro, 5,22 gramas de fostato sódico amónio tetrahidratado, e 2,73 gramas de ácido cítrico anidro (sob a forma de ácido livre).

[0086] Meio mínimo Vogel-Bonner foi preparado a partir de uma solução-mãe 25X de sais e ácido cítrico. Esta solução de estoque 25X foi preparada por dissolução em um litro de água destilada, as seguintes quantidades de cada ingrediente, na ordem listada, e para garantir que cada um estava totalmente dissolvido antes da adição do seguinte: 7,46 gramas de sulfato de magnésio heptahidrato, 68,23 gramas de ácido cítrico anidro, 373,13 gramas de fosfato de potássio dibásico anidro e 130,60 g de fosfato sódico de amônio tetrahidrato. Dissolvendo em primeiro lugar o sulfato de magnésio e, em seguida, adicionando o ácido cítrico, os íons de magnésio foram quelados pelos íons de citrato, impedindo a formação de cristais insolúveis de fosfato de magnésio, quando os sais de fosfato são adicionados. Isto assegurou a preparação de um meio de cultura livre de água com todos os ingredientes na solução.

[0087] Para preparar um litro de meio VB de placa de agar sólido com uma base, 15 gramas de agar foram adicionados a 960 ml de água destilada e esta mistura foi autoclavada. Após autoclavagem, adicionaram-se 40 ml da solução de sais de estoque 25X de VB.

[0088] Se outros componentes do meio, tal como uma fonte de carbono, foram a ser incorporado, na sua maior parte destes foram adicionados à mistura de água e de agar antes da autoclavagem. A única excepção a isto foi metanol, que foi por meio de um aparelho de filtro de 0,2 micrómetro e adicionado depois do meio de base tinha sido autoclavado esterilizada por filtração.

[0089] Um terceiro meio utilizado foi caldo LB. Caldo LB contém, por litro, 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, e 10 gramas de cloreto de sódio. Todos os componentes foram dissolvidos em um litro de água destilada e autoclavada. Este meio foi claro em água, com todos os ingredientes na solução.

[0090] Para preparar um litro de meios de placa de agar sólido com uma base LB, 15 gramas de agar foram adicionadas a um litro de caldo de LB, e esta mistura foi autoclavada.

[0091] Corpe e Basile (1982) conduziram um estudo sistemático do crescimento de várias cepas de bactérias PPFM em meio AMS contendo várias fontes de carbono. Muitas das substâncias testadas suportado pouco ou nenhum crescimento de bactérias PPFM. Corpe e Basile relatado que o glicerol e o glutamato foram relativamente boas fontes de carbono para bactérias PPFM, e que o metanol, glicose, aspartato, succinato e malato foram intermediários como fontes de carbono para bactérias PPFM.

[0092] Os requerentes mediram o crescimento de extorquens Methylobacterium em placas de LB, bem como em placas de AMS e VB suplementados com várias fontes de carbono. As fontes de carbono, listados abaixo, todos foram adicionados aos AMS ou VB media sais de base em 10 gramas por litro. Além disso, algumas composições foram utilizadas os meios que incluiu peptona a 10 gramas por litro. Os extorquens Methylobacterium foi estrias nas várias placas de ágar e elas foram incubadas a 30 graus C, durante até duas semanas. O crescimento foi medido como o número de dias de incubação necessário para que as colônias se tornam cheios de tamanho (cerca de 2 milímetros de diâmetro); para as condições de crescimento, onde colônias de tamanho normal não formam ainda de incubação após prolongada, as colônias foram classificadas como (cerca de 1 mm de diâmetro) de tamanho médio ou pequeno porte (cerca de 0,5 milímetros de diâmetro ou menor). Todas as colônias observadas foram de, uma cor rosa profunda saturado, como é característico das bactérias PPFM.

[0093] Os resultados foram os seguintes:

[0094] O crescimento mais rápido e mais abundante dos extorquens de bactéria PPFM Methylobacteriwn no meio de placa de ágar sólido testado estava no MAS mais glicerol e peptona ou AMS mais glutamato e peptona, seguido de perto por AMS mais metanol ou VB mais glicerol e peptona. O crescimento do outro meio testado foi significativamente mais lento.

Exemplo 2. Crescimento de bactérias PPFM em meio líquido claro, monofásico.

[0095] Para os quatro meios de placa de agar sólido encontrados no Exemplo 1 ter suportado o crescimento mais rápido e mais abundante dos extorquens de bactéria PPFM Methylobacteriwn, as versões líquidas correspondentes (isto é, sem ágar adicionados) foram preparadas e testadas. Estes quatro meios líquidos, preparados como descrito no Exemplo 1 (com a única exceção de que não continha qualquer agar) foram todos os líquidos de água clara, com todos os ingredientes na solução.

[0096] Para frascos contendo 100 mililitros de quatro desses meios líquidos, foi adicionado um inóculo dos extorquens de bactéria PPFM Methylobacterium para dar uma titulação inicial de cerca de 1 x 105 unidades formadoras de colônias (CFU) por mililitro. Os frascos foram colocados num conjunto incubador agitador rotativo e cultivadas durante 5 dias a 30 graus C e 250 rpm. No final dos 5 dias de incubação, foram determinados os títulos de bactérias PPFM nos frascos. Os resultados foram os seguintes:

[0097] Um aspecto 1,7 x 105 notável destes 1,3 x 105 resultados é o crescimento muito fraco das bactérias PPFM em todos estes meios líquidos de água clara, na presença de exatamente os mesmos nutrientes como estavam presentes nas de agar sólidas destes meios, nos quais as bactérias PPFM cresceram rapidamente e abundantemente (tal como, descrito no Exemplo 1). Na verdade, em todos esses frascos, houve pouca ou nenhuma turbidez visível (a indicação clássica do crescimento microbiano) e nenhum indício quer seja de uma cor-de-rosa.

Exemplo 3. Crescimento das bactérias PPFM em um meio de cultura bifásico contendo cristais de sal insolúvel.

[0098] Para a preparação dos meios de cultura bifásica, AMS líquido mais glicerol médio e peptona foi feita turva (isto é fornecida com uma substância sólida) através da formação de deliberadamente cristais insolúveis de fosfato de magnésio e/ou fosfato de cálcio. Para formar deliberadamente cristais insolúveis nos meios, o método de preparação descrito no Exemplo 1 foi alterado como se segue. Todos os componentes, exceto a solução estoque de traços de metais foram misturados antes da autoclavagem. Isto é, para 940 ml de água destilada foram adicionados 20 ml de cada uma das soluções estoque I, II, e III, juntamente com 10 gramas de glicerol e 10 g de peptona. Após esterilização em autoclave, o meio foi completado pela adição de 1 ml de solução estoque de traços de metais esterilizada por filtração. A autoclavagem dos componentes das soluções de I, II, e III, misturadas em conjunto antes da autoclavagem, resultou na formação de cristais de sal insolúvel, presumivelmente principalmente fosfato de magnésio dibásico e / ou fosfato de cálcio dibásico. Após autoclavagem, o AMS mais glicerol e meio de peptona feita por este método de preparação proporcionou um meio líquido que foi muito turvo com estes cristais de sal. Este novo meio líquido foi designado "MAS turvo mais glicerol e peptona".

[0099] A um balão contendo 100 ml de MAS turvo mais glicerol e peptona, foi adicionado um inóculo dos extorquens de bactéria PPFM Methylobacterium para se obter uma titulação inicial de cerca de 1 x 105 unidades formadoras de colônias (CFU) por mililitro. O balão foi colocado em um conjunto incubadora rotativa de agitador e cultivadas durante 3 dias a 30 graus C e 250 rpm. Depois de apenas dois dias, o balão tinha desenvolvido, uma turbidez rosa saturada de profundidade, indicando um crescimento rápido e abundante de bactérias PPFM. Em ambos os dias 2 e 3 dias após a inoculação, foram determinados os títulos de bactérias PPFM no balão. Os resultados foram os seguintes:

[0100] Dois aspectos marcantes deste resultado foram o crescimento muito rápida das bactérias PPFM, e o seu crescimento a títulos que se aproximam a 10.000 vezes mais elevada do que os obtidos no meio líquido AMS clara mais glicerol e peptona (como se mostra no Exemplo 2).

Exemplo 4. Crescimento de bactérias PPFM em meios líquidos contendo terra de diatomáceas.

[0101] Para testar se a terra de diatomáceas seria eficaz em promover o crescimento rápido de bactérias e abundante PPFM, pequenas quantidades de terra de diatomáceas AMS foram adicionados a mais glicerol meio líquido e peptona. Este meio líquido foi preparado como descrito no Exemplo 1, isto é, o método de preparação destinado a prevenir a formação de cristais de sal insolúvel de fosfato de magnésio e fosfato de cálcio. A terra de diatomáceas foi adicionada à água antes da autoclavagem. As quantidades de diatomáceas foram testados, por litro, 500 mg, 1 g, 1,5 gramas, e 2 gramas. Estes novos meios líquidos foram designados "AMS mais glicerol e peptona e terra de diatomácea".

[0102] Para frascos contendo 100 ml de AMS mais glicerol e peptona e terra de diatomáceas, adicionou-se um inoculo de extorquens de bactéria PPFM Methylobacterium para se obter uma titulação inicial de cerca de 1 x 105 unidades formadoras de colônias (CFU) por mililitro. Os frascos foram colocados num conjunto incubador agitador rotativo e cultivadas durante 3 dias a 30 graus C e 250 rpm. Depois de apenas dois dias, os frascos tinham desenvolvido, uma turbidez rosa saturada de profundidade, indicando um crescimento rápido e abundante de bactérias PPFM. Em ambos os dias 2 e 3 dias após a inoculação foram determinados os títulos de bactérias PPFM nos frascos. Os resultados foram os seguintes:

[0103] Dois aspectos marcantes deste resultado foram o crescimento muito rápido das bactérias PPFM, e o seu crescimento a títulos que se aproximam a 10.000 vezes mais elevado do que os obtidos em meio AMS claro mais glicerol médio e peptona líquido (como se mostra no Exemplo 2). Os dados obtidos após 2 dias de crescimento também indicam que o aumento da quantidade de crescimento está correlacionado com o aumento da quantidade de ágar dentro da gama de 0,5 gramas a 1,5 gramas por 100 ml de cultura. Exemplo 5. Títulos de várias Methylobacterium, na presença e na ausência de vários meios sólidos

[0104] Quatorze cepas do gênero Methylobacterium foram adquiridas no DSMZ (Braunschweig, Alemanha) e no ATCC (Manassas, VA, EUA). Estas 14 cepas consistiram de 12 espécies diferentes, como as três M. extorquens já definidas: 11. ATCC-35065 Methylobacterium fujisawaense 12. ATCC-43883 Methylobacterium zatmanii 13. ATCC-51358 Methylobacterium aminovorans 14. ATCC-700647 Methylobacterium thiocyanatum

[0105] Para os testes abaixo, os inóculos vieram a partir de culturas cultivadas em meio AMS-GP de água clara. Estas culturas foram cultivadas em 200 ml do meio de AMS-GP de água clara, titulados, e depois concentrou-se dez vezes. Estas culturas PPFM, sem substratos sólidos presentes, foram usadas para inocular tubos de ensaio contendo 10 ml de meio de AMS-água-GP claro, médio ou AMS-GP com vários substratos sólidos adicionados. 20 mg dos diferentes substratos sólidos foram adicionados a cada tubo de 10 ml, obtendo-se uma concentração de substrato sólido equivalente a 2 gramas por litro. O título inicial alvo em cada tubo era de cerca de 1 X 105 células de PPFM por ml. Os tubos de teste inoculadas foram colocadas num conjunto sacudidor rotativo e cultivadas durante três dias a 30 graus C e 250 rpm. Depois de três dias de crescimento, as culturas PPFM foram tituladas.

[0106] Crescimento de cepas PPFM em meio líquido AMS- GP de água-clara.

[0107] Crescimento de PPFM cepas em meio líquido turvo AMS-GP contendo cristais de sal insolúveis

Exemplo 6. Crescimento de Methyl obacterium em uma emulsão

[0108] Dez cepas PPFM de Methylobacterium foram cultivadas em 200 ml do meio de AMS-GP de água clara, tituladas, e depois concentrou-se dez vezes. Estas culturas PPFM, sem substratos sólidos presentes foram usadas para inocular tubos de ensaio contendo 10 ml de meio de AMS-GP clara em água, compreendendo uma emulsão feita com meio AMS- FP-água clara e um óleo. Para as emulsões, adicionaram-se os óleos a uma concentração equivalente a 20 mililitros por litro. O título inicial de destino em cada tubo foi de cerca de 1 x 105 unidades formadoras de colônias PPFM por ml.

[0109] Para se preparar as emulsões, duas seringas luer lock estéreis de 60 mililitros foram ligadas a uma torneira de fechamento estéril de 3 vias Luer (número de catálogo S7521, da Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). Uma seringa estava vazia, e a outra continha 49 ml de meio líquido AMS-GP-claro água estéril e um mililitro de óleo estéril. O líquido foi vigorosamente empurrado para trás e para frente entre as duas seringas. Esta mistura forçada através do pequeno orifício da torneira produzida uma emulsão dos dois líquidos.

[0110] Os tubos de teste inoculadas foram colocadas em um conjunto agitador rotativo e cultivadas durante três dias a 30 graus C e 250 rpm. a. Crescimento de cepas PPFM em meio líquido AMS-GP feita em uma emulsão com óleo de gergelim (em 20 mililitros por litro).

[0111] Depois de três dias de crescimento, as emulsões eram de uma coloração rica em rosa, indicando que as PPFMs tinha crescido bem na emulsão. Estas foram agitadas vigorosamente, e, em seguida, tituladas. Os títulos de células PPFM alcançados foram superiores aos atingidos pelo crescimento do PPFM em meio AMS-GP líquido claro (ver resultados representativos do Exemplo 5, onde PPFM cultivadas durante 3 dias em meio AMS-GP água-clara não excedeu 106 unidades formadoras de colônias por ml). b. Crescimento das cepas em meio líquido PPFM AMS-GP feita em uma emulsão com o óleo de coco (em 20 mililitros por litro).

[0112] Depois de três dias de crescimento, as emulsões eram uma cor-de-rosa forte indicando que as PPFMs tinham crescido bem na emulsão. Estas foram agitadas vigorosamente, e, em seguida, tituladas. Os títulos de células PPFM alcançados foram superiores aos atingidos pelo crescimento do PPFM em meio AMS-GP líquido claro (ver resultados representativos do Exemplo 10, onde PPFM cultivadas durante 3 dias em meio AMS-GP água clara não excedeu 106 unidades formadoras de colônias por ml). Exemplo 7. Crescimento das bactérias PPFM num biorreactor controlado.

[0113] O crescimento de bactérias em frascos, incubada num agitador rotativo é limitada por alterações no pH provocada pelo metabolismo da (s) fonte (s) de carbono no meio de crescimento.

[0114] Os biorreatores controlados (também conhecidos como "fermentadores" ou "recipientes de fermentação") evitam esta limitação, mantendo o pH no nível desejado através da adição controlada de ácidos ou bases, conforme apropriado. Um outro factor que pode limitar o crescimento de bactérias é a disponibilidade de oxigénio dissolvido. Os biorreatores controlados evitam esta limitação, através da manutenção de níveis adequados de oxigênio dissolvido através do ajuste controlado do fluxo de ar para dentro do vaso do reator, a velocidade de agitação do recipiente, e a pressão do ar no interior do vaso.

[0115] Quando cultivada num biorreator controlado contendo o meio AMS mais glicerol e peptona líquido descrito no Exemplo 1, ainda complementado com um segundo líquido imiscível, de modo a formar uma emulsão por qualquer dos métodos divulgados ou reivindicados aqui, ou como descrito no exemplo anterior 6, o título final de bactérias PPFM alcançados será pelo menos cerca de 10 ou pelo menos cerca de 30 vezes maior do que o obtido nos frascos.

Exemplo 8. Composições de tratamento foliar ou de sementes de planta que compreendem emulsões com Methylobacterium.

[0116] Para obter composições adequadas para tratamento foliares ou sementes de plantas, Methylobacterium são cultivadas em uma emulsão por qualquer dos métodos divulgados ou reivindicados aqui, ou como descrito no exemplo anterior 6. Tipicamente, as Methylobacterium são cultivadas a um título elevado (isto é, pelo menos cerca de 5 X 107 unidades formadoras de colônias por ml). Methylobacterium na emulsão são então colhidas. A coleta pode ser conseguida por filtração, centrifugação, decantação e suas combinações. O produto da coleta pode ser aplicado diretamente a plantas ou sementes, em certos casos. Em outros casos, o material de coleta é seco por liofilização ou secagem por pulverização e outros semelhantes, antes da aplicação. O material seco também pode ser reconstituído com líquidos como necessário ou desejado antes da aplicação a plantas ou sementes. É também possível adicionar excipientes e / ou adjuvantes agricolamente aceitáveis adicionais a qualquer do caldo de fermentação compreendendo a emulsão contendo Methylobacterium ou para a Methylobacterium colhida. Excipientes adicionados podem incluir farinha de madeira, argilas, carbono ativado, terra de diatomáceas, grão fino sólidos inorgânicos, carbonato de cálcio e semelhantes. Argilas e sólidos inorgânicos que podem ser adicionados como excipientes nas composições incluem cálcio bentonite, caulina, argila de porcelana, talco, perlite, mica, vermiculite, sílicas, quartzo em pó, montmorilonite e suas misturas. Adjuvantes agricolamente aceitáveis que promovem aderindo às sementes ou outras partes da planta que podem ser adicionados às composições incluem acetatos de polivinila, copolímeros de acetato de polivinila, acetatos de polivinila hidrolisados, aceta de polivinilpirrolidona de vinilo, álcoois polivinílicos, copolímeros de álcool polivinílico, éter metílico de polivinilo, polivinil metil copolímero anidrido éter-maleico, ceras, polímeros de látex, celuloses incluindo etilceluloses e metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilcelulose, hidroximetilpropilceluloses, polivinil-pirrolidonas, alginatos, dextrinas, malto-dextrina, polissacarídeos, gorduras, óleos, proteínas, goma de karaya, goma de jaguar, goma de tragacanto, gomas de polissacarídeos, mucilagem, arables goma, goma laca, cloreto de vinilideno polímeros e copolímeros, polímeros de proteína à base de soja e copolímeros, lignossulfonatos, copolímeros acrílicos, amidos, polivinilacrilatos, zeínas, gelatina, carboximetilcelulose, quitosana, óxido de polietileno, polímeros e copolímeros acrilimida, acrilato de polihidroxietil, monômeros metilacrilimida, alginato, etilcelulose, policloropreno e os seus xaropes ou misturas destes. Outros adjuvantes úteis agricolamente aceitáveis que podem promover o revestimento de sementes ou outras partes da planta incluem polímeros e copolímeros de acetato de vinila, copolímero de acetato de vinila e ceras- polivinilpirrolidona solúveis em água. Estas composições podem ser mantidas em uma forma seca ou semi-seca ou podem ser formulados em suspensões por adição de líquidos como desejado. As composições podem então ser usadas para pulverizar ou revestir as plantas ou sementes para obter efeitos benéficos associados com a aplicação de Methylobacterium para as plantas.

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[0135] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para os técnicos versados no assunto que a invenção pode ser modificada na disposição e detalhes sem se afastar de tais princípios.

[0136] Embora os materiais e os métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos de várias concretizações e exemplos ilustrativos, será evidente para os técnicos versados no assunto que variações podem ser aplicadas aos materiais e aos métodos aqui descritos sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos esses substitutos semelhantes e modificações aparentes aos técnicos versados no assunto são consideradas como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, tal como definida pelas reivindicações anexas.

Claims (5)

1.Processo para tratar uma planta ou uma parte de planta com Methylobacterium caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de aplicar à referida planta ou parte de planta um produto de fermentação que compreende uma emulsão em que a fase contínua compreende um líquido aquoso, em que a fase dispersa que é imiscível ou parcialmente miscível na fase contínua é de 1% a 20% em massa da referida emulsão; e uma mono-cultura ou co-cultura de Methylobacterium.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fase dispersa compreende um líquido não-aquoso, o qual compreende um álcool, um aldeído, uma cetona, um ácido graxo, um fosfolipídio ou qualquer combinação dos mesmos.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a emulsão compreende ainda um emulsionante em uma quantidade suficiente para estabilizar a emulsão, em particular, em que o emulsionante é selecionado do grupo que consiste em espessantes, surfactantes e suas combinações.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida emulsão é livre de microrganismos contaminantes.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a emulsão compreende um ou mais microrganismos não-fotossintéticos de identidade pré- determinada diferente de Methylobacterium.