CN104508118B - 微生物发酵方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于培养甲基杆菌属细菌的方法。具体地，所述方法提供了有效地且廉价地培养这些细菌的方法。另外，本发明提供了利用这些细菌培养物改善植物农业的方法。

Description

微生物发酵方法和组合物

相关申请的交叉引用

本国际专利申请要求以下申请的权益：2013年3月14日提交且通过引用整体并入本文的美国专利申请号61/784,375；2012年6月1日提交且通过引用整体并入本文的美国专利申请号61/654,504；和2012年6月1日提交且通过引用整体并入本文的美国专利申请号61/654,394。

背景技术

一碳有机化合物(one-carbon organic compounds)诸如甲烷和甲醇广泛地存在于自然界中，且被归类为甲烷氧化菌和甲基营养菌的细菌用作碳源。甲烷氧化细菌包括在甲基细菌属(Methylobacter)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、甲基球状菌属(Methylosphaera)、甲基暖菌属(Methylocaldum)和甲基细胞菌属(Methylocella)中的种(Lidstrom,2006)。甲烷氧化菌具有酶甲烷单加氧酶，该酶将来自O₂的氧原子掺入甲烷中，从而形成甲醇。所有甲烷氧化菌都是专性一碳利用者，不能利用含有碳-碳键的化合物。另一方面，甲基营养菌还可以利用更复杂的有机化合物，诸如有机酸、高级醇、糖等。因而，甲基营养细菌是兼性的甲基营养菌。甲基营养细菌包括在甲基杆菌属(Methylobacterium)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基芽孢杆菌属(Methylobacillus)、噬甲基菌属(Methylophaga)、氨基杆菌属(Aminobacter)、耗甲基杆菌属(Methylorhabdus)、甲基球形菌属(Methylopila)、Methylosulfonomonas、Marinosulfonomonas、副球菌属(Paracoccus)、黄色杆菌属(Xanthobacter)、弯杆菌属(Ancylobacter)(也被称作微环菌属(Microcyclus))、硫杆菌属(Thiobacillus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、Arthobacter和诺卡氏菌属(Nocardia)中的种(Lidstrom,2006)。

甲基杆菌属的大多数甲基营养细菌是粉红色的。它们常规地被称作PPFM细菌，是粉红色的兼性甲基营养菌。Green(2005,2006)在甲基杆菌属中鉴定了12个经验证的种，具体地是噬胺甲基杆菌(M.aminovorans)、氯甲烷甲基杆菌(M.chloromethanicum)、二氯甲烷甲基杆菌(M.dichloromethanicum)、扭脱甲基杆菌(M.extorquens)、藤泽氏甲基杆菌(M.fujisawaense)、嗜中温甲基杆菌(M.mesophilicum)、嗜有机甲基杆菌(M.organophilum)、耐辐射甲基杆菌(M.radiotolerans)、罗得西亚甲基杆菌(M.rhodesianum)、玫瑰红甲基杆菌(M.rhodinum)、硫氰酸盐甲基杆菌(M.thiocyanatum)和扎氏甲基杆菌(M.zatmanii)。但是，巢状甲基杆菌(M.nidulans)是一种非PPFM的固氮甲基杆菌(Sy等人,2001)。甲基杆菌属普遍存在于自然界中，在土壤、灰尘、淡水、沉淀物和叶表面中以及在工业和临床环境中发现(Green,2006)。

PPFM细菌作为大多数(如果不是全部的话)植物物种(范围从藻类、藓类和苔类至被子植物和裸子植物)的叶表面的定殖者的存在，提示PPFM细菌可能在植物生理学中起重要作用(Corpe和Rheem,1989；Holland和Polacco,1994；Holland,1997；Kutschera,2007)。植物产生和分泌甲醇(可能是作为生长中的植物细胞壁内的果胶代谢的废产物)的事实，提示这些研究人员存在共生关联：PPFM细菌以植物产生的甲醇为食，并且反过来给所述植物提供积极益处。提示的PPFM细菌对植物生理学的益处包括通过提供PPFM产生的细胞分裂素植物激素对氮代谢、种子发芽和植物生长刺激产生的积极效果。PPFM细菌用于改善植物生长、植物产率、种子发芽、雄性能育性和植物营养特性的用途，已经公开在美国专利5,512,069、美国专利5,961,687、美国专利6,174,837、美国专利6,329,320、美国专利7,435,878和美国专利申请公开号2006/0228797中。另外，已经发现PPFM细菌会增加培养的藻类的产率，从而提示它们用于生产藻类衍生的生物燃料的应用(美国专利申请公开号2011/0269219)。

甲基杆菌属用于行栽作物、蔬菜和其它种植植物、以及在基于藻类的生物燃料的生产中的广泛应用，需要极大量甲基杆菌属培养物的有效且廉价的培养。甲基杆菌属的其它工业应用也可以受益于有效的甲基杆菌属生产技术。这样的工业应用包括甲基杆菌属作为环境污染指示剂(因为某些甲基杆菌属可以在烟灰上生长)和作为包装食品工业中的辐照质量控制监视剂(因为某些甲基杆菌属表现出对γ-射线辐照的高抗性)的用途。其它工业应用包括甲基杆菌属用于降解环境污染物质(美国专利号US 5,418,161、US 5,487,834、US 6,107,067、US7,214,509)、用于生产有用的工业化合物、聚合前体或生物高分子(US5,236,930、US 5,686,276、US6,107,067)和重组蛋白(美国专利申请公开号20060234336)的用途。

但是，在PPFM培养的主题领域中的不同出版物提示，为了实现这些细菌的有效且廉价的大规模培养，需要克服重大障碍。Holland和Polacco(1994)报道称，“分离的PPFM不会在植物组织培养基(一种富含营养物的培养基)上较好地生长”，并且“PPFM是缓慢生长者”。Madhaiyan等人(2004)将PPFM细菌描述为，“它们的缓慢生长性质和在整个植株上的分布提示，它们的数目随着植物组织扩展远离生长点而通过稀释进行简单调节”。Abanda-Nkpwatt等人(2006)将PPFM细菌生长报告为，“在液体培养物中，溶液在4-5天内变浑浊”，没有详细说明达到的滴度(滴度是指每毫升的细菌细胞数目或菌落形成单位)。

指示PPFM细菌仅可以生长至相对较低滴度的其它研究进一步证实了和扩充了这些关于缓慢生长的一致报道。这些生长研究是在标准的液体微生物培养基中，所述培养基被有意制成为“水-澄清的”。这样的培养基允许目视观察和检测希望的和不希望的(即污染性的)微生物生长，表现为肉眼可见的浑浊的发展。

Corpe和Basile(1982)提出了不同PPFM细菌对多种碳源的生长应答的系统研究。他们利用Stanier等人(1966)采用的标准矿物碱作为他们的基础培养基。在该出版物中，Stanier等人将他们的基础培养基描述为，“它与次氮基乙酸和EDTA高度螯合，并在高压灭菌以后形成大量沉淀物。所述沉淀物随着培养基冷却而再溶解，以形成水-澄清的溶液”。

使用该“水-澄清的”溶液作为他们的基础培养基，Corpe和Basile(1982)试验了多种碳源支持PPFM细菌生长的能力。他们发现几种碳源比所有其它碳源相对更好，即甘油、谷氨酸盐、甲醇、葡萄糖、天冬氨酸盐、琥珀酸盐和苹果酸盐。但是，即使在孵育7天(分配给每个生长试验的时间)以后，没有培养物达到大于0.7光单位的光密度(在660纳米，用于测量微生物生长的标准波长)，并且大多数远低于该密度。Sy等人(2005)报道称，具有约0.05光学单位的光密度的PPFM细菌混悬液每毫升含有约5x10⁶菌落形成单位(CFU)的PPFM细菌。因而，Corpe和Basile在用他们鉴别出的最佳碳源孵育1周以后达到的最大滴度为约7x10⁷菌落形成单位/毫升。

Sy等人(2005)的报道也称，利用含有琥珀酸盐作为碳源的最低盐培养基，他们达到了约2.5x10⁸菌落形成单位/毫升的扭脱甲基杆菌的最终滴度。

Corpe和Rheem(1989)报道称，PPFM细菌“在营养物液体培养基和其它常见异养生物培养基中具有比其它叶异养生物长得多的倍增时间”，并且得出结论：由植物生产的甲醇“可能允许PPFM成功地竞争胜过”叶表面上的其它细菌。Corpe和Reehm实现的最大滴度(在未详细说明的孵育时段后)为约3x10⁸菌落形成单位/毫升。

因而，这些出版物指示，在标准的“水-澄清的”微生物生长培养基中，PPFM细菌的生长是缓慢的，并且通常在约3x10⁸菌落形成单位/毫升的相对较低的最终滴度达到稳定阶段。

为了满足PPFM细菌用于在行栽作物、蔬菜和其它种植植物中、以及在基于藻类的生物燃料的生产中的商业应用的潜在需求，需要生产极大量的这些细菌的制造能力。

仅以玉米作为一个例子，在美国每年种植约4000万公顷玉米。对于在该单个国家中和在该单一作物上的每1％的市场渗透(400,000公顷)，估计对PPFM细菌的需要是在约30升/公顷的PPFM培养物(具有约3x10⁸菌落形成单位/毫升的滴度)的范围内，其作为种子处理物或作为叶喷雾剂施用。这等同于每年需要约1200万升该滴度的PPFM培养物来处理1％的美国玉米作物。如果每批的生产时间是7天，即使具有以全容量(每年约250天)运行的市场上最大体积发酵罐(每批生产60,000升)的设备将需要这些巨大发酵罐中的5或6个(再次，仅仅供给对美国玉米的1％市场渗透的需要)。这样的设备可能不会以商业上可行的方式被构造和操作。

因而，需要开发甲基杆菌属的有效且廉价的大规模生产。

发明内容

本文提供了有效地生产大量甲基杆菌的方法。这些方法可以产生高滴度甲基杆菌培养物，其中每批的生产时间显著减短。本文中提供的甲基杆菌生产方法还可以使用由廉价且容易得到的组分构成的培养基。本文中还提供了包含甲基杆菌的有用发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物。本文中还提供了使用包含甲基杆菌的发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物处理植物或植物部分的方法。本文中提供的方法和组合物可以用于生产大量甲基杆菌，用于施用给植物或植物部分、用作生物治理中的接种物、用于生产有用产品和用于生产重组蛋白。通过本文中提供的方法和组合物可得到的有用产品包括、但不限于：聚-3-羟基丁酸、1,3-丙二醇和噁唑吡咯并喹啉(oxazopyrroloquinoline)。

本文提供了包含液相和可以悬浮于所述液相中的固相的发酵液，其中所述固相包含固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质，且其中所述发酵液基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述液体培养基还可以包含一种或多种特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。在某些实施方案中，按质量计，所述固相构成所述液体培养基的至少约0.02％至约0.5％。在某些实施方案中，所述固体物质为动物、植物、微生物、真菌或矿物来源的。在某些实施方案中，所述固体物质是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述固体物质是聚合物。在某些实施方案中，所述固体物质包含多糖、硅藻土或盐晶体。在某些实施方案中，所述多糖选自：纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。在某些实施方案中，所述甲基杆菌属处于以下滴度：至少约5x10⁸菌落形成单位/毫升，至少约1x10⁹菌落形成单位/毫升，至少约1x10¹⁰菌落形成单位/毫升，或至少约3x10¹⁰菌落形成单位/毫升。在某些实施方案中，所述甲基杆菌属的滴度为至少约5x10⁸菌落形成单位/毫升至至少约6x10¹⁰菌落形成单位/毫升。在某些实施方案中，所述甲基杆菌属中的至少一种是粉红色的兼性甲基营养菌(PPFM)。在某些实施方案中，所述粉红色的兼性甲基营养菌(PPFM)选自：噬胺甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、二氯甲烷甲基杆菌、扭脱甲基杆菌、藤泽氏甲基杆菌、嗜中温甲基杆菌、嗜有机甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、罗得西亚甲基杆菌、玫瑰红甲基杆菌、硫氰酸盐甲基杆菌、M.cerastii、M.gossipiicola、甲基杆菌属LMG6378菌株、M.phyllosphaerae、稻甲基杆菌(M.oryzae)、M.platani、M.populi和扎氏甲基杆菌。在某些实施方案中，所述甲基杆菌属中的至少一种是M.nodulans。在前述液体培养基中的任一种的某些实施方案中，发酵液中的至少10％的甲基杆菌属是附着于固体物质的甲基杆菌属。在前述液体培养基中的任一种的某些实施方案中，所述固体不是光合微生物。

还提供了包含可以悬浮于液体中的固相的发酵液产物或发酵产物，其中所述固相包含固体物质，其中甲基杆菌属的单培养物或共培养物附着于所述固体物质，且其中所述发酵液产物或发酵产物基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述发酵液产物或发酵产物还包含一种或多种非甲基杆菌属的特性预先确定的微生物。在某些实施方案中，所述固体物质包含多个可悬浮颗粒，所述颗粒具有附着的甲基杆菌属。在某些实施方案中，所述固体物质是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述固相的甲基杆菌属滴度为至少约5x10⁸菌落形成单位/克-至少约6x10¹⁰甲基杆菌属菌落形成单位/克固体。在前述发酵液产物或发酵产物中的任一种的某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。

还提供了包含多个可以悬浮于液体中的颗粒的组合物，其中所述颗粒中的每一个包含固体物质，其中甲基杆菌属的单培养物或共培养物附着于所述固体物质，且其中所述固体物质基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种非甲基杆菌属的特性预先确定的微生物。在某些实施方案中，所述固体物质包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述组合物还包含农业上可接受的佐剂、农业上可接受的赋形剂和/或杀虫剂中的至少一种。在某些实施方案中，所述组合物是基本上干燥的产品、在乳状液中固体物质与附着的甲基杆菌的混合物，或悬浮液。在某些实施方案中，每个颗粒是具有约2微米至约1000微米平均长度或平均直径的颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒的甲基杆菌滴度是至少约5x10⁸菌落形成单位/克颗粒-至少约6x10¹⁰甲基杆菌菌落形成单位/克颗粒。在前述组合物中的任一种的某些实施方案中，所述颗粒上的附着的甲基杆菌的密度是至少约1个甲基杆菌/20平方微米的颗粒表面积。在前述组合物中的任一种的某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。

还提供了培养甲基杆菌的方法，所述方法包括：在培养基中培养甲基杆菌的单培养物或共培养物，所述培养基包含液相和可以悬浮于所述液相中的固相，其中所述固相包含提供甲基杆菌的生长的固体物质，且其中所述培养基基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述培养基还包含一种或多种非甲基杆菌的特性预先确定的微生物。在某些实施方案中，按质量计，所述固相构成培养基的至少约0.02％至约0.5％。在某些实施方案中，所述固体物质是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述固体物质提供甲基杆菌的附着生长。在某些实施方案中，所述固体物质是聚合物或是动物、植物、微生物、真菌或矿物来源的。在某些实施方案中，所述固体物质包含多糖、硅藻土或盐晶体。在某些实施方案中，所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。在某些实施方案中，所述培养包括以下步骤：将甲基杆菌接种于所述培养基，以及在足以提供甲基杆菌的生长的条件下孵育经接种的培养基。在某些实施方案中，以至少约5x10⁴菌落形成单位/毫升或至少约1x10⁵菌落形成单位/毫升的滴度，将所述甲基杆菌接种于所述培养基中。在某些实施方案中，所述甲基杆菌选自：噬胺甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、二氯甲烷甲基杆菌、扭脱甲基杆菌、藤泽氏甲基杆菌、嗜中温甲基杆菌、嗜有机甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、罗得西亚甲基杆菌、玫瑰红甲基杆菌、硫氰酸盐甲基杆菌、结瘤甲基杆菌(M.nodulans)、M.cerastii、M.gossipiicola、甲基杆菌属LMG6378菌株、M.phyllosphaerae、稻甲基杆菌、M.platani、M.populi和扎氏甲基杆菌。在某些实施方案中，发酵液中的至少10％的存活甲基杆菌是附着的甲基杆菌。在某些实施方案中，达到至少约5x10⁸菌落形成单位/毫升至约6x10¹⁰菌落形成单位/毫升的滴度。在某些实施方案中，向培养基接种甲基杆菌的约48小时、约72小时或约96小时内，达到至少约5x10⁸菌落形成单位/毫升至约6x10¹⁰菌落形成单位/毫升的滴度。在前述方法中的任一种的某些实施方案中，所述方法还包括：收获甲基杆菌的步骤。在前述方法中的任一种的某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。还提供了通过任意前述方法得到的甲基杆菌单培养物或共培养物。在某些实施方案中，所述甲基杆菌的单培养物或共培养物基本上不含有污染性微生物。还提供了从通过所述方法得到的甲基杆菌单培养物或共培养物得到的甲基杆菌培养产物，其中所述甲基杆菌培养产物包含多个可以悬浮于液体中的颗粒，且所述颗粒包含固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。还提供了包含甲基杆菌培养产物、发酵液产物或发酵产物的组合物。在某些实施方案中，所述培养产物、发酵液产物或发酵产物包含基本上不含有污染性微生物的甲基杆菌的单培养物或共培养物。在某些实施方案中，所述组合物还包含农业上可接受的佐剂、农业上可接受的赋形剂和/或杀虫剂。本文还提供了用甲基杆菌处理植物或植物部分的方法，所述方法包括下述步骤：向所述植物或植物部分施加通过任意前述方法得到的甲基杆菌单培养物或共培养物、发酵液产物、发酵产物或组合物。在前述甲基杆菌属单培养物或共培养物、发酵液产物、发酵产物或组合物中的任一种的某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。

还提供了用甲基杆菌处理植物或植物部分的方法，所述方法包括下述步骤：向所述植物或植物部分施加包含固体物质的组合物，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述甲基杆菌的单培养物或共培养物基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述固体物质是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述组合物是基本上干燥的产物、在乳状液中的固体物质与附着的甲基杆菌的混合物，或悬浮液。在某些实施方案中，所述固体物质包含多个可悬浮颗粒。在某些实施方案中，所述可悬浮颗粒中的每一个是具有约2微米至约1000微米长度或直径的颗粒。在某些实施方案中，所述植物部分是种子，且所述组合物具有至少约5x10⁸菌落形成单位/克至约6x10¹⁰菌落形成单位/克组合物的甲基杆菌滴度。在某些实施方案中，所述组合物的甲基杆菌属滴度是至少约5x10⁸菌落形成单位/克组合物至至少约6x10¹⁰甲基杆菌菌落形成单位/克组合物。在某些实施方案中，植物部分是种子、茎、根、花、子叶、胚芽鞘或叶。在某些实施方案中，所述植物是玉米、芸苔属种、苜蓿、水稻、黑麦、高粱、珍珠粟、黍稷、狐尾粟、龙爪粟、向日葵、红花、大豆、烟草、马铃薯、花生、棉花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、甜菜、甘蔗、燕麦、大麦、番茄、生菜、绿豆、利马豆、豌豆、葫芦、观赏植物或针叶树植物。在某些实施方案中，所述植物是谷类植物，且所述部分是种子、胚芽鞘和/或叶。在某些实施方案中，所述植物是谷类植物，所述部分是种子，且所述组合物的施加量足以提供从经处理的种子长成的谷类植物中的节根生长的增加。在某些实施方案中，所述植物是谷类植物，所述部分是胚芽鞘和/或叶，且所述组合物的施加量足以提供包含经处理的胚芽鞘和/或叶的谷类植物中的节根生长的增加。在前述方法中的任一种的某些实施方案中，所述谷类植物选自：玉米、大麦、粟、燕麦、水稻、黑麦、高粱、黑小麦和小麦。在某些实施方案中，所述植物是玉米植物，且所述部分是是种子、胚芽鞘和/或叶。在某些实施方案中，所述植物是玉米植物，所述部分是种子，且所述组合物的施加量足以提供从经处理的种子长成的玉米植物中的玉米节根生长的增加。在某些实施方案中，所述植物是玉米植物，所述部分是胚芽鞘和/或叶，且所述组合物的施加量足以提供包含经处理的胚芽鞘和/或叶的玉米植物中的玉米节根生长的增加。在前述方法中的任一种的某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。还提供了通过任意前述方法得到的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分至少部分地涂有外源施加的固体物质，其中甲基杆菌属的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述植物部分是种子、茎、根、花、子叶、胚芽鞘或叶。还提供了从前述植物或植物部分中的任一种获得到的经加工的植物产品，其中所述经加工的产品含有外源固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述植物产物是粕、糊状物、粉状物、片状物或饲料。在某些实施方案中，前述经加工的产物中的任一种是不可再生的。在前述植物、植物部分或经加工的产物中的任一种的某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。

还提供了生产工业产品的方法，所述方法包括：在培养基中培养甲基杆菌的单培养物或共培养物，所述培养基包含液相和可以悬浮于所述液相中的固相，其中所述固相包含提供甲基杆菌的生长的固体物质，且其中所述培养基基本上不含有污染性微生物；以及在培养甲基杆菌以后从所述固相、所述液相或它们的组合收获所述工业产品。在某些实施方案中，固体物质提供甲基杆菌的附着生长。在某些实施方案中，工业产品是聚合物前体、生物聚合物、药用化合物前体、药用化合物或重组蛋白。在前述方法中的任一种的某些实施方案中，所述工业产品是聚-3-羟基丁酸、1,3-丙二醇、吡咯并喹啉醌或噁唑吡咯并喹啉。在前述方法中的任一种的某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。

本文还提供了得到甲基杆菌制备物的方法，所述方法包括在培养基中培养甲基杆菌的单培养物或共培养物，所述培养基包含液相和固相，其中与通过在单独液体培养基中培养甲基杆菌得到的产率相比，所述固相提供增加的甲基杆菌产率。在某些实施方案中，所述方法进一步还包括：收获在所述培养基中培养生长的甲基杆菌。在某些实施方案中，至少基本上所有的固相悬浮于液相中，或至少基本上所有的固相没有悬浮于液相中，或所述固相的某些部分悬浮于液相中且所述固相的某些部分没有悬浮于液相中。在某些实施方案中，所述培养基包含胶体，其中所述固相分散在液相中。在某些实施方案中，所述胶体是凝胶。在某些实施方案中，所述培养基中的固相是凝胶。在某些实施方案中，所述培养基的液相是乳状液。在某些实施方案中，所述乳状液包含水性液体以及在所述水性液体中不可混溶的或仅部分可混溶的液体。在某些实施方案中，所述培养基进一步还包含一种或多种非甲基杆菌属的具有预定特性预先确定的非光合微生物。在某些实施方案中，按质量计，所述固相构成培养基的至少约0.02％至约20％。在某些实施方案中，所述固相是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述固相提供甲基杆菌属的附着生长和/或所述固相不充当作为甲基杆菌的碳源。在某些实施方案中，所述固相包含选自以下的固体物质：人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。在某些实施方案中，所述固体物质是无生命的。在某些实施方案中，所述固相包含选自以下的固体物质：多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。在某些实施方案中，所述固相包含选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖的多糖。在某些实施方案中，培养甲基杆菌属的单培养物或共培养物包括以下步骤：给培养基接种甲基杆菌属，和在足以提供甲基杆菌属的生长的条件下孵育经接种的培养基。在某些实施方案中，或者(i)固相构成培养基的至少约0.02％至约0.5％且基本上所有的固相悬浮于液相中；或者(ii)所述固相构成培养基的至少约0.02％至约20％，且：(a)基本上所有的固相都没有悬浮于液相中；或(b)所述固相的部分悬浮于液相中且部分没有悬浮于液相中。在某些实施方案中，所述甲基杆菌选自：噬胺甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、二氯甲烷甲基杆菌、扭脱甲基杆菌、藤泽氏甲基杆菌、嗜中温甲基杆菌、嗜有机嗜有机甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、罗得西亚甲基杆菌、玫瑰红甲基杆菌、硫氰酸盐甲基杆菌、结瘤甲基杆菌、M.cerastii、M.gossipiicola、甲基杆菌属LMG6378菌株、M.phyllosphaerae、稻甲基杆菌、M.platani、M.populi和扎氏甲基杆菌。在某些实施方案中，所述发酵液中的至少10％的存活甲基杆菌是附着于固相的甲基杆菌。在某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物，和/或所述培养基基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，收获包括回收全部或部分带有与其附着的甲基杆菌的固相和/或从液相回收全部或部分未附着的甲基杆菌。在某些实施方案中，所述方法还包括：解离一些或全部附着有甲基杆菌的固相。在某些实施方案中，所述方法还包括：干燥解离的或部分地解离的材料。在某些实施方案中，所述方法还包括:i)干燥已经从液相分离的附着有甲基杆菌的固相；或者，ii)干燥从液相回收的附着有甲基杆菌的固相和未附着的甲基杆菌。在某些实施方案中，所述方法还包括：解离以下的一些或全部：i)干燥的附着有甲基杆菌的固相；或者，ii)干燥的附着有甲基杆菌的固相和未附着的甲基杆菌。

还提供了通过任意前述方法获得的甲基杆菌制备物，其中所述甲基杆菌制备物包含固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述制备物中的固体物质不是光合微生物。

还提供了用甲基杆菌处理植物或植物部分的方法，所述方法包括以下步骤：向所述植物或植物部分施加组合物，所述组合物包含通过任意前述方法制备的甲基杆菌制备物。在所述方法的某些实施方案中，所述组合物还包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在所述方法的某些实施方案中，所述组合物是基本上干燥的产品、在乳状液中所述固体与附着的甲基杆菌的混合物，或悬浮液。在所述方法的某些实施方案中，所述植物部分是种子，且所述组合物具有以下甲基杆菌滴度：至少约5x10⁸菌落形成单位/克组合物至约6x10¹⁰、3x10¹²、5x10¹²、1x10¹³或5x10¹³菌落形成单位/克组合物。在所述方法的某些实施方案中，所述植物部分是种子、茎、根、花、子叶、胚芽鞘、果实或叶。在所述方法的某些实施方案中，所述植物或植物部分是玉米、芸苔属种、苜蓿、水稻、黑麦、高粱、珍珠粟、黍稷、狐尾粟、龙爪粟、向日葵、红花、大豆、烟草、马铃薯、花生、棉花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、甜菜、甘蔗、燕麦、大麦、番茄、生菜、绿豆、利马豆、豌豆、葫芦、观赏植物或针叶树植物部分。

还提供了通过任意前述方法获得的植物或植物部分，其中所述植物或植物部分至少部分地涂有外源固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。还提供了从通过任意前述方法获得的植物或植物部分得到的经加工的植物产物，其中所述经加工的产物含有外源固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述经加工的植物产物是粕、糊状物、粉状物、片状物或饲料。在某些实施方案中，所述经加工的植物产物是不可再生的。

还提供了获得甲基杆菌制备物的方法，所述方法包括：(i)在(a)培养容器或者(b)培养基的任一种中培养甲基杆菌的单培养物或共培养物，以及(ii)收获附着于固体表面或固相的甲基杆菌，其中所述培养容器包含或含有一个或多个提供甲基杆菌的附着生长的固体表面；所述培养基包含液相和固相，其中与通过在单独液体培养基中培养甲基杆菌得到的产率相比，所述固相提供了增加的甲基杆菌产率。在所述方法的某些实施方案中，收获包括：通过使甲基杆菌暴露于物理处理和/或化学处理中的一种或多种，从所述固体表面或所述固相除去甲基杆菌。在所述方法的某些实施方案中，所述化学处理包括离子强度转换、pH转换、去污剂处理、溶剂处理和/或酶处理中的一种或多种。在所述方法的某些实施方案中，所述酶处理包括将附着于固体表面或固相的甲基杆菌暴露于蛋白酶、脂肪酶、葡聚糖酶或它们的任意组合。在所述方法的某些实施方案中，所述去污剂处理包括将附着于固体表面或固相的甲基杆菌暴露于离子型去污剂、非离子型去污剂或它们的任意组合。在所述方法的某些实施方案中，所述物理处理包括：将附着于固体表面或固相的甲基杆菌暴露于超声处理、刮削、增压液体、增压浆料、热或它们的任意组合。在某些实施方案中，所述方法还可以包括再使用(a)一个或多个已经从其除去甲基杆菌的固体表面或者(b)已经从其除去甲基杆菌的培养基的固相的步骤，用于培养和收获随后的甲基杆菌制备物。在所述方法的某些实施方案中:(i)至少基本上所有的固相悬浮于液相中；或(ii)至少基本上所有的固相没有悬浮于液相中；或(iii)所述固相的部分悬浮于液相中且所述固相的部分没有悬浮于液相中。在所述方法的某些实施方案中，所述固相提供甲基杆菌的附着生长和/或所述固相不作为甲基杆菌的碳源。在所述方法的某些实施方案中，所述固相包含选自以下的固体物质：人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。在所述方法的某些实施方案中，所述固体物质是无生命的。在所述方法的某些实施方案中，所述固相包含选自以下的固体物质：多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。在所述方法的某些实施方案中，所述培养基包含胶体，其中所述固相分散在液相中。在所述方法的某些实施方案中，液相是乳状液。在所述方法的某些实施方案中，所述乳状液包含水性液体以及在所述水性液体中不可混溶的或仅部分可混溶的液体。在所述方法的某些实施方案中，所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。在前述方法中的任一种的某些实施方案中，所述方法还可以包括干燥收获的甲基杆菌的步骤。

本文还提供了包含固体物质的发酵产物，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质，其中所述固体物质不是光合微生物，且其中所述发酵产物基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述发酵产物还包含一种或多种特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。在某些实施方案中，所述固体物质包含以下的一种或多种：(i)多个可悬浮颗粒，其附着有甲基杆菌；(ii)固体物质，其不能悬浮于发酵液中；或(iii)固体物质，其中所述物质的一部分能够悬浮于发酵液中，且所述物质的一部分不能悬浮于发酵液中。在某些实施方案中，所述固体物质是无生命的。在某些实施方案中，所述固体物质选自人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。在某些实施方案中，所述固体物质选自：多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。在某些实施方案中，所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。在某些实施方案中，所述固体物质是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在前述发酵产物中的任一种的某些实施方案中，所述固相的甲基杆菌属滴度是至少约5x10⁸菌落形成单位/克固体至至少约6x10¹⁰、3x10¹²、5x10¹²、1x10¹³或5x10¹³甲基杆菌属菌落形成单位/克固体。在前述发酵产物中的任一种的某些实施方案中，所述固体物质上的附着的甲基杆菌属的密度是至少约1个甲基杆菌属/20平方微米的颗粒表面积。

还提供了包含发酵产物的组合物，所述发酵产物包含固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述发酵产物包含由所述固体物质和液体形成的胶体。在某些实施方案中，所述胶体是凝胶。在某些实施方案中，所述组合物还包含农业上可接受的佐剂和/或农业上可接受的赋形剂中的至少一种。在某些实施方案中，所述固体物质包含多个颗粒，所述颗粒附着有甲基杆菌属。在某些实施方案中，所述颗粒包含约2微米至约1000微米平均长度或平均直径的颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒的甲基杆菌属滴度是至少约5x10⁸菌落形成单位/克颗粒至至少约6x10¹⁰、3x10¹²、5x10¹²、1x10¹³或5x10¹³甲基杆菌属菌落形成单位/克颗粒。在某些实施方案中，所述固体物质是无生命的。在某些实施方案中，所述固体物质选自：人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。在某些实施方案中，所述固体物质选自多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。在某些实施方案中，所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。在某些实施方案中，所述固体物质基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述组合物基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述组合物和/或所述固体物质可以还包含一种或多种特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。在某些实施方案中，所述固体物质包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。在某些实施方案中，所述组合物还包含至少一种杀虫剂和/或至少一种抑制细菌的试剂。在某些实施方案中，所述杀虫剂选自：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂和杀细菌剂，其中所述杀虫剂基本上不会抑制甲基杆菌的生长。在某些实施方案中，所述组合物是基本上干燥的产物、在乳状液中的所述固体物质与附着的甲基杆菌的混合物或悬浮液。在某些实施方案中，所述固体物质上附着的甲基杆菌的密度是至少约1个甲基杆菌/20平方微米的颗粒表面积。

本文还提供了用甲基杆菌处理植物或植物部分的方法，所述方法包括下述步骤：将前述组合物中的任一种施用于所述植物或植物部分。在某些实施方案中，所述植物部分是种子、茎、根、花、子叶、胚芽鞘、果实或叶。在某些实施方案中，所述植物或植物部分是玉米、芸苔属种、苜蓿、水稻、黑麦、高粱、珍珠粟、黍稷、狐尾粟、龙爪粟、向日葵、红花、大豆、烟草、马铃薯、花生、棉花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、甜菜、甘蔗、燕麦、大麦、番茄、生菜、绿豆、利马豆、豌豆、葫芦、观赏植物或针叶树植物或植物部分。在某些实施方案中，所述植物是玉米植物，所述部分是种子，且所述组合物的施用量足以提供从经处理的种子长成的玉米植物中的玉米节根生长的增加。在某些实施方案中，所述植物是玉米植物，所述部分是胚芽鞘和/或叶，且所述组合物的施用量足以提供包含经处理的胚芽鞘和/或叶的玉米植物中的玉米节根生长的增加。还提供了通过任一前述方法获得的植物，其中所述植物至少部分地涂有所述组合物的发酵产物。还提供了通过任一前述方法得到的植物部分，其中所述植物部分至少部分地涂有所述组合物的发酵产物。在某些实施方案中，所述植物部分是种子、茎、根、花、子叶、胚芽鞘、果实或叶。

还提供了植物，其至少部分地涂有包含固体物质的发酵产物，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述植物选自：玉米、芸苔属种、苜蓿、水稻、黑麦、高粱、珍珠粟、黍稷、狐尾粟、龙爪粟、向日葵、红花、大豆、烟草、马铃薯、花生、棉花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、甜菜、甘蔗、燕麦、大麦、番茄、生菜、绿豆、利马豆、豌豆、葫芦、观赏植物和针叶树植物。在某些实施方案中，所述固体物质包含多个颗粒，所述颗粒附着有甲基杆菌。在某些实施方案中，所述颗粒平均长度或平均直径为约2微米至约1000微米。在某些实施方案中，所述颗粒的甲基杆菌滴度是至少约5x10⁸菌落形成单位/克颗粒至至少约6x10¹⁰、3x10¹²、5x10¹²、1x10¹³或5x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克颗粒。在某些实施方案中，所述固体物质上附着的甲基杆菌的密度是至少约1个甲基杆菌/20平方微米的颗粒表面积。在某些实施方案中，所述固体物质是无生命的。在某些实施方案中，所述固体物质选自人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。在某些实施方案中，所述固体物质选自多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。在某些实施方案中，所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。在某些实施方案中，所述固体物质基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述固体物质还包含一种或多种特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。在某些实施方案中，所述固体物质包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。

还提供了植物部分，其至少部分地涂有组合物，所述组合物包含含有固体物质的发酵产物，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述植物部分选自：玉米、芸苔属种、苜蓿、水稻、黑麦、高粱、珍珠粟、黍稷、狐尾粟、龙爪粟、向日葵、红花、大豆、烟草、马铃薯、花生、棉花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、甜菜、甘蔗、燕麦、大麦、番茄、生菜、绿豆、利马豆、豌豆、葫芦、观赏植物和针叶树植物部分。在某些实施方案中，所述固体物质包含多个颗粒，所述颗粒具有附着的甲基杆菌。在某些实施方案中，所述颗粒包含约2微米至约1000微米平均长度或平均直径的颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒的甲基杆菌滴度是至少约5x10⁸菌落形成单位/克颗粒至至少约6x10¹⁰、3x10¹²、5x10¹²、1x10¹³或5x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克颗粒。在某些实施方案中，所述固体物质上附着的甲基杆菌的密度是至少约1个甲基杆菌/20平方微米的颗粒表面积。在某些实施方案中，所述固体物质是无生命的。在某些实施方案中，所述固体物质选自人造材料、动物来源的材料、植物部分来源的的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。在某些实施方案中，所述固体物质选自多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。在某些实施方案中，所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。在某些实施方案中，所述固体物质基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述固体物质还包含一种或多种特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。在某些实施方案中，所述固体物质包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。在某些实施方案中，所述组合物还包含至少一种杀虫剂。在某些实施方案中，所述杀虫剂选自：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂和杀细菌剂，其中所述杀虫剂不会抑制甲基杆菌。在前述实施方案中的任一个的某些实施方案中，所述植物部分是种子。还提供了经加工的植物产物，其从前述植物或植物部分中的任一种获得，其中所述经加工的产物含有可检测量的外源固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述经加工的产物是粕、糊状物、粉状物、片状物或饲料。在某些实施方案中，所述经加工的产物是不可再生的。

本文还提供了包含固体物质的组合物，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。在某些实施方案中，所述组合物包含胶体，其中所述固相分散在液相中。在某些实施方案中，所述胶体是凝胶。在某些实施方案中，所述组合物还包含农业上可接受的佐剂和/或农业上可接受的赋形剂中的至少一种。在某些实施方案中，所述固体物质包含多个颗粒，所述颗粒附着有甲基杆菌。在某些实施方案中，所述颗粒平均长度或平均直径为约2微米至约1000微米。在某些实施方案中，所述颗粒的甲基杆菌滴度是至少约5x10⁸菌落形成单位/克颗粒至至少约5x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克颗粒。在某些实施方案中，所述固体物质是无生命的。在某些实施方案中，所述固体物质选自：人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。在某些实施方案中，所述固体物质选自：多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。在某些实施方案中，所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。在某些实施方案中，所述固体物质基本上不含有污染性微生物。在某些实施方案中，所述组合物和/或所述固体物质还包含一种或多种特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。在某些实施方案中，所述固体物质包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，所述固体物质不是光合微生物。在某些实施方案中，所述组合物还包含至少一种杀虫剂和/或至少一种抑制细菌的试剂。在某些实施方案中，所述杀虫剂选自：杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂和杀细菌剂，其中所述杀虫剂基本上不会抑制所述甲基杆菌的生长。在某些实施方案中，所述组合物是基本上干燥的产物、乳状液中所述固体物质与附着的甲基杆菌的混合物，或悬浮液。在某些实施方案中，所述固体物质上附着的甲基杆菌的密度是至少约1个甲基杆菌/20平方微米的颗粒表面积。

附图简要说明

附图(其并入本说明书中并形成本说明书的一部分)解释了本发明的某些实施方案。在附图中：

图1是发酵产物的等分试样的显微照片，所述发酵产物包含液体培养基、固体(硅藻壳)和甲基杆菌。固体硅藻壳和附着的甲基杆菌在显微照片中用标记指示。

图2是发酵产物的等分试样的显微照片，所述发酵产物包含液体培养基、固体(硅藻壳)和甲基杆菌。固体硅藻壳、附着的甲基杆菌和未附着的甲基杆菌在显微照片中用标记指示。

图3A、B、C是含有液体培养基的试管的照片，所述液体培养基含有附着有甲基杆菌的非颗粒固体物质。在3A中，显示了含有棉花簇的液体培养基，所述棉花簇附着有赋予棉花深粉红色的甲基杆菌。在3B中，显示了含有玻璃绒的液体培养基，所述玻璃绒附着有赋予玻璃绒粉红色的甲基杆菌。在3C中，显示了含有身体磨砂材料的液体培养基，所述身体磨砂材料附着有赋予其粉红色的甲基杆菌。

图4是显示附着于棉花纤维的PPFM菌株ATCC-35065藤泽氏甲基杆菌的显微照片。棉花纤维、附着的甲基杆菌和未附着的甲基杆菌在显微照片中用标记指示。

详细说明

定义

本文中使用的短语“与其附着”和“附着的”表示，通过在固体物质上生长或已经在固体物质上生长而与固体物质结合的甲基杆菌。

本文中使用的短语“农业上可接受的佐剂”指这样的物质：其增强用于处理植物和/或植物部分的组合物中的活性剂的性能。在某些组合物中，活性剂可以包含甲基杆菌的单培养物或共培养物。

本文中使用的短语“农业上可接受的赋形剂”指基本上惰性的物质，其可以用作用于处理植物的组合物中的活性剂的稀释剂和/或载体。在某些组合物中，活性剂可以包含甲基杆菌的单培养物或共培养物。

本文中使用的术语“藻类”指微型或大型藻类中的任意类型。

本文中使用的术语“甲基杆菌”指甲基杆菌属的兼性甲基营养菌的细菌。因此，本文中使用的术语甲基杆菌不包括甲基细菌(Methylobacter)、甲基单胞菌(Methylomonas)、甲基微菌(Methylomicrobium)、甲基球菌(Methylococcus)、甲基弯曲菌(Methylosinus)、甲基孢囊菌(Methylocystis)、甲基球状菌(Methylosphaera)、甲基暖菌(Methylocaldum)和甲基细胞菌(Methylocella)属中的菌种，它们是专性甲烷氧化菌。

本文中使用的短语“甲基杆菌的共培养物”指包含甲基杆菌的至少2种菌株或甲基杆菌的至少2个菌种的甲基杆菌培养物。

本文中使用的短语“污染性微生物”指在引入培养物、发酵液、发酵液产物或组合物中之前没有被鉴别的所述培养物、发酵液、发酵液产物或组合物中的微生物。

本文中使用的术语“乳状液”指2种不能混溶的液体的胶体混合物，其中一种液体是连续相，以及另一种液体是分散相。在某些实施方案中，所述连续相是水性液体，且所述分散相是在所述水性液体中不可混溶的或部分地混溶的液体。

本文中使用的短语“基本上不含有污染性微生物”指这样的培养物、发酵液、发酵产物或组合物：其中按量或类型计，至少约95％的存在于培养物、发酵液、发酵产物或组合物中的微生物是希望的甲基杆菌或特性预先确定的其它希望的微生物。

本文中使用的短语“无生命的固体物质”指不溶于或部分地可溶于水或水溶液中的物质，所述物质是无生命的或者所述物质不是衍生该物质的仍然存活的生物体的一部分。

本文中使用的短语“甲基杆菌的单培养物”表示，由甲基杆菌的单一菌株组成的甲基杆菌培养物。

本文中使用的“杀虫剂”指杀昆虫的试剂、杀真菌的试剂、杀线虫的试剂、杀细菌的试剂或它们的任意组合。

本文中使用的短语“抑制细菌的试剂”指抑制细菌的生长、但是不会杀死细菌的试剂。

本文中使用的短语“杀虫剂基本上不会抑制所述甲基杆菌的生长”指这样的任何杀虫剂：当被提供在组合物(其包含含有固体物质的发酵产物，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物附着于所述固体物质)中时，将所述组合物施用于植物或植物部分时，与缺少所述杀虫剂的组合物相比，导致不超过50％的甲基杆菌生长的抑制。在某些实施方案中，当将所述组合物施用于植物或植物部分时，与缺少所述杀虫剂的组合物相比，所述杀虫剂导致不超过40％、20％、10％、5％或1％的甲基杆菌生长的抑制。

本文中使用的术语“PPFM细菌”指甲基杆菌属中的除了M.nodulans以外的细菌菌种，但不限于此。

本文中使用的短语“固体物质”指不溶于或部分地可溶于水或水性溶液中的物质。

本文中使用的短语“可以悬浮于液体中的固相”指通过搅拌可以分布在全部液体中的固体物质。

本文中使用的术语“不可再生的”指不能够再生成完整植物的植物部分或经加工的植物产物。

本文中使用的短语“基本上所有的固相悬浮于液相中”指这样的培养基：其中至少95％、98％或99％的构成固相的固体物质通过搅拌分布在全部液体中。

本文中使用的短语“基本上所有的固相没有悬浮于液相中”指这样的培养基：其中小于5％、2％或1％的固体是呈颗粒形式，所述颗粒形式通过搅拌分布在全部培养基中。

当结合在发酵中获得的甲基杆菌使用时，本文中使用的术语“产率”表示获得的甲基杆菌的数目。确定这样的产率的方法包括、但不限于：确定每单位体积或单位质量的所得材料的菌落形成单位(CFU)的数目，确定得到的甲基杆菌的湿重，和/或确定得到的甲基杆菌的干重。

就任何上述定义与通过引用并入本文中的任何专利或非专利参考文献、本文中引用的任何专利或非专利参考文献、或在别处发现的任何专利或非专利参考文献所提供的定义不一致而言，应当理解，将在本文中使用上述定义。

培养甲基杆菌的方法、组合物、及其用途

已经发现，与其中在单独液体培养基中培养甲基杆菌的方法相比，其中在包含液相和固体物质的两相培养基中培养甲基杆菌的方法会显著增加得到的甲基杆菌产率。在某些实施方案中，所述方法可以包括：在提供甲基杆菌生长的条件下，在含有颗粒固体物质的液体培养基中培养甲基杆菌，所述颗粒固体物质可以通过搅拌而悬浮于液体中。在某些其中使用颗粒固体物质的实施方案中，至少基本上所有的固相因而可以在搅拌后悬浮于液相中。这样的颗粒固体物质可以包含具有约1毫米或更小的长度或直径的材料。在某些实施方案中，搅拌的程度足以提供颗粒固体物质在液相中的均匀分布和/或最佳培养物通气水平。但是，在本文提供的其它实施方案中，至少基本上所有的固相没有悬浮于液相中，或所述固相的部分悬浮于液相中且所述固相的部分没有悬浮于液相中。在某些其中固相没有悬浮于液相中的两相培养基中，可以使用非颗粒固体物质。这样的非颗粒固体物质包括、但不限于长度或直径大于约1毫米的材料。这样的颗粒和非颗粒固体物质也包括、但不限于这样的材料：其为多孔的、纤维性的或以其它方式构造成提供增加的表面积用于甲基杆菌的附着生长。其中所述固相的部分悬浮于液相中且所述固相的部分没有悬浮于液相中的两相培养基可以包含颗粒和非颗粒固体物质的混合物。在前述两相培养基中的任一种中使用的这样的颗粒和非颗粒固体物质也包括、但不限于这样的材料：其为多孔的、纤维性的或以其它方式构造成提供增加的表面积用于甲基杆菌的附着生长。在某些实施方案中，所述培养基包含由固体和液相形成的胶体。包含固体和液体的胶体可以预形成并加入液体培养基中，或可以形成在含有固体和液体的培养基中。通过对某些固体物质进行化学和/或热变化，可以形成包含固体和液体的胶体。在某些实施方案中，所述胶体是凝胶。在某些实施方案中，所述培养基的液相是乳状液。在某些实施方案中，所述乳状液包含水性液体以及在所述水性液体中不可混溶的或仅部分可混溶的液体。在水中不可混溶的或仅部分地可混溶的液体包括、但不限于以下的任一种：(1)在25℃下在水中的混溶性等于或小于戊醇、己醇或庚醇的混溶性的液体；(2)包含醇、醛、酮、脂肪酸、磷脂或它们的任意组合的液体；(3)选自含有至少5个碳的脂肪醇和甾醇的醇；(4)动物油、微生物油、合成油、植物油或它们的组合；和/或，(5)选自以下的植物油：玉米油、大豆油、棉籽油、花生油、向日葵油、橄榄油、亚麻油、椰子油、棕榈油、油菜籽油、芝麻籽油、红花油和它们的组合。在某些实施方案中，按质量计，所述不可混溶的或部分地不可混溶的液体可以构成至少约0.02％至约20％的液相。在某些实施方案中，所述方法可以包括：获得包含液体、固体和甲基杆菌的两相培养基，并将所述培养物在提供甲基杆菌生长的条件下孵育。可以通过多种方法得到包含液体、固体和甲基杆菌的两相培养基，所述方法包括、但不限于以下的任一种：(a)向包含液体和固体物质的两相培养基接种甲基杆菌；(b)向固体物质接种甲基杆菌，然后将包含甲基杆菌的固体物质引入液体培养基中；(c)向固体物质接种甲基杆菌，孵育在固体物质上的甲基杆菌，然后将包含甲基杆菌的固体物质引入液体培养基中；或(d)(a)、(b)或(c)的任意组合。所述方法还可以进一步包括收获甲基杆菌的单培养物或共培养物的步骤。收获甲基杆菌的方法可以包括、但不限于：通过过滤、离心、倾析等，从液相分离甲基杆菌。通过这些方法得到的收获的甲基杆菌可以是附着于所述固体物质的甲基杆菌、没有附着于固体物质的甲基杆菌和它们的组合。

可以使用的搅拌方法包括、但不限于：搅动、倒转摇动、旋转摇动和它们的组合。在某些实施方案中，搅拌可以包括：将含有固体物质的液体培养基放在旋转振荡器上，所述旋转振荡器提供至少25、50、100、200、250、500或1000转/分(RPM)。通过搅动、倒转摇动和其它方法，也可以得到与至少设定在25、50、100、200、250、500或1000转/分(RPM)的旋转振荡器提供的搅拌等同的搅拌。在某些实施方案中，至少基本上所有的固相或固相的一部分在搅拌后可以悬浮于液相中，所述搅拌与至少设定在25、50、100、200、250、500或1000转/分(RPM)的旋转振荡器提供的搅拌等同。

在某些实施方案中，可以解离包含固体物质的收获物，所述固体物质附着有甲基杆菌。通过允许附着有甲基杆菌的固体物质分解成较小组成部分的任意技术，可以实现解离。可以使用解离技术将附着有甲基杆菌的固体物质破碎成较小组成部分，所述解离技术包括、但不限于：浸离、碾磨、压碎、超声处理和/或部分地溶解附着有甲基杆菌的固体物质。这种较小组成部分包括、但不限于附着有甲基杆菌的非颗粒固体物质和附着有甲基杆菌的固体物质颗粒。这样的附着有甲基杆菌的非颗粒和/或颗粒固体物质可以被直接地施用于植物或植物部分或并入可以施用于于植物或植物部分的组合物中。在某些实施方案中，将附着有甲基杆菌的固体物质分解成具有约1毫米或更小的直径的颗粒。在某些实施方案中，收获的附着有甲基杆菌的固体物质被解离成平均长度或平均直径约2微米至约1000微米的颗粒。在某些实施方案中，收获的附着有甲基杆菌的固体物质被解离成约1微米至约1000微米平均长度或平均直径的颗粒。在某些实施方案中，收获的附着有甲基杆菌的固体物质被解离成平均长度或平均直径约1、2、4、10、20或40微米至约100、200、500、750或1000微米中的任一种的颗粒。在某些实施方案中，通过解离得到的颗粒的甲基杆菌滴度是至少约5x10⁸菌落形成单位/克颗粒至至少约6x10¹⁰、3x10¹²、5x10¹²、1x10¹³或5x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克颗粒。在某些实施方案中，附着有甲基杆菌的固体物质还将包含未附着的甲基杆菌。在某些实施方案中，还可以解离进一步包含附着的甲基杆菌和未附着的甲基杆菌的固体物质以得到前述片段或颗粒中的任一种。在其它实施方案中，可以解离附着有甲基杆菌的固体物质，然后可以将未附着的甲基杆菌加入解离的包含附着的甲基杆菌的固体物质中。

当它们处于湿或潮湿形式或干燥形式时，可以解离附着有甲基杆菌的固体物质。通过维持大多数附着的甲基杆菌和未附着的甲基杆菌(如果存在的话)的存活力的任意技术，可以实现干燥具有甲基杆菌的固体物质。这种干燥技术包括、但不限于：冻干法、除湿、加热和它们的组合。因而在某些实施方案中，可以在解离附着有甲基杆菌的固体物质以获得附着有甲基杆菌的固体物质的片段或颗粒以后实现干燥。在其它实施方案中，可以干燥并且然后解离附着有甲基杆菌的固体物质或者进一步包含附着的甲基杆菌和未附着的甲基杆菌的固体物质。在干燥并且然后解离附着有甲基杆菌的固体物质或进一步包含附着的甲基杆菌和未附着的甲基杆菌的固体物质的某些实施方案中，在干燥后变脆的固体物质可以用作甲基杆菌发酵过程中的固体物质。在干燥后变脆且可以用于本文提供的方法中的这类固体物质的例子包括、但不限于：植物来源的的某些材料(例如包含纤维素、半纤维素和/或木素的某些材料)等。

在本文提供的方法中使用的两相发酵液可以是基本上不含有污染性微生物的未被污染的培养物。在某些实施方案中，按量或类型计至少约95％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％或100％的存在于本文提供的培养物、发酵液、发酵产物或组合物中的微生物是希望的甲基杆菌或其它希望的特性预先确定的微生物。希望的甲基杆菌或其它希望的特性预先确定的微生物是从纯培养物获得的微生物。为了提供这样的未被污染的培养物，在接种甲基杆菌和/或单培养物或共培养物中的任何其它希望的微生物之前，将在两相培养基中使用的液体和固体组分灭菌或以基本上无菌形式得到。各种固体和液体组分的灭菌可以通过多种方法实现，所述方法包括、但不限于高压灭菌、辐照、过滤除菌(对于液体)等。，可以获得基本上不含有污染性微生物的培养物、发酵液、发酵产物或组合物，其中在接种或提供希望的特性预先确定的微生物之前，所述培养物、发酵液、发酵产物或组合物的液体和/或固体组分是无菌的，以及采取合适的步骤来避免在希望的微生物生长过程中培养物的污染或组合物的污染。

在本文中提供的方法(其中在包含液相和固体物质的两相培养基中培养甲基杆菌)可以以分批模式发酵、补料分批模式发酵或连续发酵中的任一种来实践。本文中提供的发酵液、发酵液产物和组合物还可以从分批模式发酵、补料分批模式发酵或连续发酵中的任一种中获得。在某些实施方案中，可以在本文提供的方法中使用的分批模式发酵、补料分批模式发酵或连续发酵过程中的任一种中，控制诸如pH和氧浓度等因素。

在本文中提供的甲基杆菌的单培养物或共培养物和得到的发酵液和发酵液产物可以包含一种或多种甲基杆菌，所述甲基杆菌包括、但不限于：噬胺甲基杆菌、氯甲烷甲基杆菌、二氯甲烷甲基杆菌、扭脱甲基杆菌、藤泽氏甲基杆菌、嗜中温甲基杆菌、嗜有机甲基杆菌、耐辐射甲基杆菌、罗得西亚甲基杆菌、玫瑰红甲基杆菌、硫氰酸盐甲基杆菌、结瘤甲基杆菌、M.cerastii、M.gossipiicola、甲基杆菌属LMG6378菌株、M.phyllosphaerae、稻甲基杆菌、M.platani、M.populi和扎氏甲基杆菌。在某些实施方案中，在本文中提供的甲基杆菌的单培养物或共培养物和得到的发酵液和发酵液产物可以由一种或多种甲基杆菌组成。但是，本文提供的方法还可以用于其它甲基杆菌。甲基杆菌还可以通过各种公开的方法(Madhaiyan等人,2007)获得。在某些实施方案中，这样的可以使用的其它甲基杆菌是含有与其它已知甲基杆菌的16S RNA序列具有至少约60％、70％、80％、90％或95％序列同一性的16S RNA序列的甲基杆菌。至少由Cao等人,2011描述了通过使用16S RNA序列对比对甲基杆菌分型。在某些实施方案中，所述单培养物或共培养物和得到的产物可以包含能够定殖于植物和/或植物部分的甲基杆菌。能够定殖于植物和/或植物部分的甲基杆菌包括、但不限于：扭脱甲基杆菌、结瘤甲基杆菌和嗜中温甲基杆菌。能够定殖于植物和/或植物部分的甲基杆菌还包括、但不限于：Methylobacterium cerastii菌种(作为代表性菌株的DSM23679可从莱布尼茨研究中心的德国微生物和细胞培养中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(“DSMZ”),Braunschweig,德国)得到)，Methylobacterium gossipiicola菌种(作为代表性菌株的NRRLB-51692得自USDA ARS,Peoria,IL.,USA)，甲基杆菌属LMG6378菌株(可得自Belgian Co-ordinatedCollection of Micro-organisms/Laboratorium voor Microbiologie(“BCCLM”)Ghent,比利时)，Methylobacterium phyllosphaerae菌种(作为代表性菌株的DSM 19779T可得自DSMZ)，稻甲基杆菌种(作为代表性菌株的DSM18207T可得自DSMZ)，结瘤甲基杆菌种(作为代表性菌株的LMG21967可得自BCCLM)，Methylobacterium platani菌种(作为代表性菌株的KCTC 12901可得自Korean Collection for Type Cultures,Yusong-Ku,Taejon,KR(“KCTC”)，和Methylobacterium populi菌种(作为代表性菌株的ATCC BAA-705可得自ATCC)。因而提供了发酵液、发酵液产物、组合物、制备它们的方法和使用它们的方法，包括、但不限于，处理植物的方法，其中甲基杆菌是能够定殖于植物和/或植物部分的甲基杆菌属，其选自：扭脱甲基杆菌、结瘤甲基杆菌、嗜中温甲基杆菌、M.cerastii、M.gossipiicola、甲基杆菌属LMG6378菌株、M.phyllosphaerae、稻甲基杆菌、M.platani和M.populi。分离能够定殖于植物和/或植物部分的其它甲基杆菌的方法已经描述在不同的出版物中，且也可以被使用(参见Madhaiyan等人，和其中引用的参考文献)。不希望受理论限制，认为对于培养可以定殖于植物和/或植物部分或从植物和/或植物部分的表面分离的甲基杆菌属而言，本文提供的在包含液体和固体物质的两相培养基中培养甲基杆菌的方法可以是特别有利的。

可以用在本文提供的发酵液、发酵液产物、组合物和有关方法中的代表性甲基杆菌包括、但不限于表1的甲基杆菌。

表1.代表性的甲基杆菌

保藏索引

ATCC:美国典型组织培养物保藏中心(American Type Tissue CultureCollection),Manassas,VA,USA

CCUG:哥德堡大学培养物保藏中心(Culture Collection,University of),Sweden

CIP:巴斯德研究所保藏中心(Collection de l’Institut Pasteur),Paris,FR

DSM:DSMZ-德国微生物和细胞培养中心(DSMZ-German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures(“DSMZ”)),Braunschweig,Germany

JCM:日本微生物保藏中心(Japan Collection of Microorganisms),Saitama,Japan

LMG:比利时微生物保藏中心(Belgian Co-ordinated Collection of Micro-organisms/Laboratorium voor Microbiologie(“BCCLM”))Ghent,Belgium

NBRC:生物资源保藏中心(Biological Resource Center(NBRC)),Chiba,Japan

NCIMB:国立工业、食物和海洋细菌保藏中心(National Collections ofIndustrial,Food and Marine Bacteria),UK

NRRL:USDA ARS,Peoria,IL.,USA

在某些实施方案中，单培养物或共培养物和得到的发酵液和发酵液产物可以包含一种或多种甲基杆菌分离物或突变体，其生产升高水平的有用营养物或植物生长调节剂。美国专利号8,153,118公开了多种甲基杆菌分离物，其生产升高水平的可以用在本文中提供的方法和组合物中的维生素B-12和氨基酸。还提供了发酵液、发酵液产物和组合物，其包含一种或多种甲基杆菌，诸如过度产生维生素B-12的、具有登录号ATCC PTA-1561的甲基杆菌突变体B12-11，过度产生氨基酸苏氨酸的玫瑰红甲基杆菌(ATCC#43282)，过度产生氨基酸L-谷氨酸的甲基杆菌种(ATCC#21371)，过度产生氨基酸L-谷氨酸的甲基杆菌种(ATCC#21372)，过度产生氨基酸L-赖氨酸的甲基杆菌种(ATCC#21926)，过度产生氨基酸L-谷氨酸的甲基杆菌种(ATCC#21969)，过度产生氨基酸L-赖氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-精氨酸的甲基杆菌种(ATCC#21927)，和/或产生单细胞蛋白的甲基杆菌种(ATCC#21438)。

在某些实施方案中，本文中提供的发酵液、发酵液产物或组合物还可以包含一种或多种引入的特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。可以加入的其它微生物包括、但不限于这样的微生物：其为生物杀虫剂或当施用于植物或植物部分时提供一些其它益处。生物杀虫剂或在其它方面有益的微生物因而包括、但不限于各种芽孢杆菌菌种(Bacillussp.)、假单胞菌菌种(Pseudomonas sp.)、盾壳霉菌种(Coniothyrium sp.)、泛菌菌种(Pantoea sp.)、链霉菌菌种(Streptomyces sp.)和木霉菌种(Trichoderma sp.)。微生物生物杀虫剂可以是细菌、真菌、病毒或原生动物。特别有用的生物杀虫微生物包括各种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、绿木霉(Trichoderma virens)和利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)菌株。可以加入的其它微生物可以是遗传工程改造的或天然存在的分离物，其可作为纯培养物得到。在某些实施方案中，预见到，可以将细菌或真菌微生物以孢子形式提供在发酵液、发酵液产物或组合物中。可以加入的其它微生物包括、但不限于为光合微生物的微生物。这样的光合生物包括、但不限于藻类。这样的藻类可以包括、但不限于原球藻属(Protococcus)、石莼属(Ulva)、松藻属(Codium)、浒苔属(Enteromorpha)、新绿藻属(Neochloris)和/或衣藻属(Chlamydomonas)的藻类。

在某些实施方案中，所述液体培养基从廉价且容易得到的组分制成，所述组分包括、但不限于，无机盐诸如磷酸钾、硫酸镁等，碳源诸如甘油、甲醇、谷氨酸、天冬氨酸、琥珀酸等，和氨基酸掺合物诸如蛋白胨、胰蛋白胨等。可以使用的示例性的液体培养基包括、但不限于铵矿物盐(AMS)培养基(Whittenbury等人,1970)、Vogel-Bonner(VB)基本培养基(Vogel和Bonner,1956)和LB液体培养基(“Luria-Bertani Broth”)。

一般而言，在提供甲基杆菌的有效生长的方法和组合物中使用的固体物质可以是在水或水溶液中不溶的或仅部分地可溶的任何合适的固体物质。当将所述固体物质提供在液体培养基中时，这种合适的固体物质就甲基杆菌而言还是非杀细菌的的或非抑制细菌的。在某些实施方案中，这种合适的固体物质还是容易地以无菌形式得到的或使其无菌的固体物质。在本文中使用的固体物质可以通过提供除去污染性微生物的任意方法灭菌，且因而包括、但不限于诸如高压灭菌、辐照、化学处理和它们的任意组合的方法。这些固体物质包括动物、植物、微生物、真菌或矿物来源的的天然物质，人造物质，或天然物质和人造物质的组合。在某些实施方案中，所述固体物质是无生命的固体物质。动物、植物、微生物或真菌来源的的无生命的固体物质可以获自不能存活的(即不再活着的)或已被致使不能存活的动物、植物、微生物或真菌。当先前结合的硅藻已经被除去或以其它方式被致使不可存活时，硅藻壳因而是无生命的固体物质。由于硅藻壳是无生命的固体物质，它们没有被视作光合生物或光合微生物。在某些实施方案中，固体物质包括、但不限于：砂粒、粉砂、土壤、粘土、灰分、木炭、硅藻土和其它类似的矿物质、磨碎的玻璃或玻璃珠、磨碎的陶瓷材料、陶瓷珠、皂粘土、高岭土、滑石、珍珠岩、云母、蛭石、硅石、石英粉末、蒙脱石和它们的组合。在某些实施方案中，所述固体物质可以是聚合物或聚合物珠。可以用作固体物质的聚合物包括、但不限于：在水或水性溶液中不溶的或仅部分地可溶的各种多糖诸如纤维质聚合物和甲壳质聚合物，琼脂(即半乳聚糖)，和它们的组合。在某些实施方案中，所述固体物质可以是不溶性的或仅部分地可溶性的盐晶体。可以使用的盐晶体包括、但不限于：不溶性的或仅部分地可溶性的碳酸盐、铬酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、氢氧化物、氧化物和硫化物。在某些实施方案中，所述固体物质可以是微生物细胞、真菌细胞、微生物孢子或真菌孢子。在某些实施方案中，所述固体物质可以是微生物细胞或微生物孢子，其中所述微生物细胞或微生物孢子不是光合微生物。在某些实施方案中，所述微生物细胞或微生物孢子不是光合微生物，其中所述光合微生物选自：藻类、蓝细菌、硅藻、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、小球藻属(Chlorella)、杜氏盐藻(Dunaliella tertiolecta)、江蓠属(Gracilaria)、卡特肋黄草(Pleurochrysis carterae)、马尾藻属(Sargassum)和石莼属(Ulva)。在其它实施方案中，所述固体物质可以是灭活的(即不能存活的)微生物细胞、真菌细胞、微生物孢子或真菌孢子。在其它实施方案中，所述固体物质可以是休眠的(即可存活的，但是没有活跃地分裂)微生物细胞、真菌细胞、微生物孢子或真菌孢子。在其它实施方案中，所述固体物质可以是微生物来源的的细胞碎片。在其它实施方案中，所述固体物质可以是来自植物的任意部分的颗粒物。可以用于获得固体物质的植物部分包括、但不限于：穗轴、外壳、荚、叶、根、花、茎、皮、种子和它们的组合。还可以使用从经加工的植物部分获得的产物，包括但不限于，甘蔗渣、小麦麸、大豆渣、压碎的种子饼、秸杆等。可以研磨这样的植物部分、经加工的植物和/或经加工的植物部分以获得可以使用的颗粒形式的固体材料。在某些实施方案中，可以使用木材或木材产物，其包括但不限于木浆、锯屑、刨花等。在某些实施方案中，所述固体物质可以是来自动物的颗粒物，其包括但不限于，骨粉、明胶、研磨的或粉碎的壳、毛发、浸离的兽皮等。

在某些实施方案中，以颗粒形式提供固体物质，所述颗粒形式提供所述固体物质在培养基中的分布。在某些实施方案中，所述固体物质由平均长度或平均直径约2微米至约1000微米的颗粒构成。在某些实施方案中，所述固体物质由平均长度或平均直径约1微米至约1000微米的颗粒构成。在某些实施方案中，所述固体物质是平均长度或平均直径为约1、2、4、10、20或40微米至约100、200、500、750或1000微米中的任一种的颗粒。在本文提供的方法和组合物中使用的颗粒的理想特征包括合适的润湿性，使得所述颗粒在搅拌后可以悬浮于整个培养基中。

在某些实施方案中，所述固体物质提供在作为胶体的培养基中，其中连续相是液体，且分散相是固体。可以用于形成用于培养甲基杆菌的液体培养基中的胶体的合适固体包括、但不限于各种被称作水胶体的固体。在本文提供的培养基、方法和组合物中使用的这类水胶体可以是植物、动物、微生物或合成来源的的亲水聚合物。在所述方法中使用的水胶体聚合物可以含有许多羟基和/或可以是聚合电解质。在本文提供的组合物和方法中使用的水胶体聚合物包括、但不限于：琼脂、海藻酸盐、阿拉伯木聚糖、角叉菜胶、羧甲纤维素、纤维素、卡德兰胶、明胶、胶凝糖、β-葡聚糖、瓜尔胶、阿拉伯树胶、槐豆胶、果胶、淀粉、黄原胶、及其混合物。在某些实施方案中，在本文提供的培养基、方法和组合物中使用的胶体可以包含水胶体聚合物和一种或多种蛋白。

在某些实施方案中，所述固体物质可以是提供所述固体物质上甲基杆菌的附着生长的固体物质。附着于固体物质的甲基杆菌是如下的甲基杆菌：通过简单地用生长培养基洗涤具有附着的甲基杆菌的固体物质不能基本上除去的甲基杆菌，而未附着的甲基杆菌可以通过用液体生长培养基洗涤固体物质基本上除去。在上下文中，“基本上除去”是指，当用3倍体积的液体生长培养基洗涤固体物质时，至少约30％、40％、50％、60％、70％或80％的存在的甲基杆菌被除去。这样的洗涤可以通过多种方法实现，所述方法包括、但不限于从洗涤的固相倾析液体或使液体通过过滤器上的固相，所述过滤器允许液体中的细菌流动穿过。在某些实施方案中，与固体结合的附着的甲基杆菌可以包括与固体直接连接的甲基杆菌和/或与固体物质间接连接的甲基杆菌。与固体物质间接连接的甲基杆菌包括、但不限于：与连接至固体物质的另一种甲基杆菌或另一种微生物连接的甲基杆菌，通过连接至另一种物质(其连接至固体物质)而与固体物质连接的甲基杆菌等。在某些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％的在发酵液、发酵液产物或组合物中的甲基杆菌是附着于所述固体物质的甲基杆菌。在某些实施方案中，附着的甲基杆菌可以以下述密度存在于发酵液、发酵液产物或组合物中的固体物质的表面上：至少约1甲基杆菌/20平方微米，至少约1甲基杆菌/10平方微米，至少约1个甲基杆菌/10平方微米，至少约1个甲基杆菌/5平方微米，至少约1个甲基杆菌/2平方微米，或至少约1个甲基杆菌/平方微米。在某些实施方案中，附着的甲基杆菌可以以下述密度存在于发酵液、发酵液产物或组合物中的固体物质的表面上：至少约1甲基杆菌/20平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米，至少约1甲基杆菌/10平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米，至少约1个甲基杆菌/10平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米，至少约1个甲基杆菌/5平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米，或至少约1个甲基杆菌/2平方微米至约1个甲基杆菌/平方微米。在某些实施方案中，附着的甲基杆菌可以以下述密度存在于发酵液、发酵液产物或组合物中的固体物质的表面上：至少约1个甲基杆菌/20平方微米至约1个甲基杆菌/2平方微米，至少约1个甲基杆菌/10平方微米至约1个甲基杆菌/2平方微米，至少约1个甲基杆菌/10平方微米至约1甲基杆菌/2平方微米，或至少约1个甲基杆菌/5平方微米至约1个甲基杆菌/2平方微米。本文中提供的两相发酵液可以包含含有未附着的甲基杆菌的液相。在某些实施方案中，液相中的未附着的甲基杆菌的滴度可以小于约100,000、10,000或1,000CFU/ml。

提供的两相培养方法可以产生含有以下滴度的甲基杆菌的发酵液：大于约5x10⁸菌落形成单位/毫升的滴度，大于约1x10⁹菌落形成单位/毫升的滴度，大于约1x10¹⁰菌落形成单位/毫升的滴度，至少约3x10¹⁰菌落形成单位/毫升的滴度。在某些实施方案中，本文中提供的发酵液可以包含以下滴度的甲基杆菌：至少约5x10⁸菌落形成单位/毫升至至少约3x10¹⁰菌落形成单位/毫升，至少约5x10⁸菌落形成单位/毫升至至少约4x10¹⁰菌落形成单位/毫升，或至少约5x10⁸菌落形成单位/毫升至至少约6x10¹⁰菌落形成单位/毫升。在某些实施方案中，本文中提供的发酵液可以包含以下滴度的甲基杆菌：至少约1x10⁹菌落形成单位/毫升至至少约3x10¹⁰菌落形成单位/毫升，至少约1x10⁹菌落形成单位/毫升至至少约4x10¹⁰菌落形成单位/毫升，或至少约1x10⁹菌落形成单位/毫升至至少约6x10¹⁰菌落形成单位/毫升。在某些实施方案中，本文中提供的发酵液包含以下滴度的甲基杆菌：至少约1x10¹⁰菌落形成单位/毫升至至少约3x10¹⁰菌落形成单位/毫升，至少约1x10¹⁰菌落形成单位/毫升至至少约4x10¹⁰菌落形成单位/毫升，或至少约1x10¹⁰菌落形成单位/毫升至至少约6x10¹⁰菌落形成单位/毫升。在某些实施方案中，本文中提供的发酵液将包含以下滴度的甲基杆菌：至少约3x10¹⁰菌落形成单位/毫升至至少约4x10¹⁰菌落形成单位/毫升，或至少约3x10¹⁰菌落形成单位/毫升至至少约6x10¹⁰菌落形成单位/毫升。

本文还提供了获得甲基杆菌属制备物的方法，其中将甲基杆菌培养在培养容器中，或者包含液相和固相的培养基中，然后通过从甲基杆菌附着的固体表面或固相除去甲基杆菌而收获甲基杆菌，所述培养容器包含或含有一个或多个提供甲基杆菌的附着生长的固体表面。在其中使用提供甲基杆菌的附着生长的固体表面的某些实施方案中，所述固体表面可以形成培养容器本身的一部分。在其它实施方案中，包含在培养容器中的固体表面是可以从培养容器脱离(特别是在发酵进程之后或过程中)的固体表面，以促进附着的甲基杆菌的除去。示例性的和非限制性的固体表面包括珠子、环、圆柱体和提供改善的表面积/体积比的其它形状。在培养容器中使用的固体表面可以是多孔的或光滑的。在培养容器中使用的示例性固体表面可以由允许甲基杆菌的附着生长的材料制成，所述材料包括、但不限于：包被的或未包被的金属、玻璃、塑料、陶瓷制品或它们的组合。在培养以后，通过物理和/或化学处理中的一种或多种，可以收获已经附着于固体表面或固相的甲基杆菌。在这些方法的某些实施方案中，还可以收获已经累积在液相中的未附着的甲基杆菌。用于收获甲基杆菌的化学处理包括、但不限于：将附着的甲基杆菌暴露于离子强度的转换、pH的转换、去污剂处理、溶剂处理、酶处理和它们的组合。用于收获甲基杆菌的酶处理可以包括、但不限于将附着于固体表面或固相的甲基杆菌暴露于蛋白酶、脂肪酶、葡聚糖酶或它们的任意组合。用于收获甲基杆菌的去污剂处理可以包括、但不限于将附着于固体表面或固相的甲基杆菌暴露于离子型去污剂、非离子型去污剂或它们的任意组合。用于收获甲基杆菌的物理处理可以包括、但不限于：将附着于固体表面或固相的甲基杆菌暴露于超声处理、刮削、增压液体、增压浆料、热或它们的任意组合。在某些实施方案中，可以从培养容器中的液体收获未附着的甲基杆菌。在其它实施方案中，可以从培养容器中的液体收获未附着的甲基杆菌，且从固体表面收获附着的甲基杆菌。

不希望受理论限制，认为两相培养基中的固体提供甲基杆菌可以在其上附着和生长的表面。认为在两相培养基中的固体上这种附着生长比在没有所述固体存在下的生长更快速(即提供缩短的倍增时间)。甲基杆菌的数目(即菌落形成单位/毫升)和密度(甲基杆菌/平方微米)被认为在发酵进程中增加，直到达到最大数目和/或密度。在某些实施方案中，认为来自附着的母代细胞的子代细胞可以在固体表面上生长，在附着的母代细胞上生长，和/或脱落进液相中。因此还认为，液相中的甲基杆菌的数目(即菌落形成单位/毫升)可以增加，直到达到最大数目。

具有附着的甲基杆菌的固体物质可以用于制备用于处理植物或植物部分的多种组合物。可选地，包含具有附着的甲基杆菌的固体物质的发酵液或发酵液产物可以用于处理植物或植物部分。因而提供了已经至少部分地用发酵液产物或组合物涂布的植物、植物部分以及具体的植物种子。还提供了经加工的植物产物，其含有发酵液产物或组合物。具有附着的甲基杆菌的固体物质可以用于制备对于处理植物种子而言特别有用的多种组合物。因而提供了已经至少部分地用发酵液产物或组合物涂布的种子。还提供了经加工的种子产物，包括但不限于，含有本文中提供的发酵液产物或组合物的粕、粉状物、饲料和片状物。在某些实施方案中，所述经加工的植物产物将是不可再生的(即将不能发育成植物)。在某些实施方案中，在发酵产物或组合物(其至少部分地涂布于植物、植物部分或植物种子，或其被包含在经加工的植物、植物部分或种子产物中)中使用的固体物质包含固体物质和结合的或附着的甲基杆菌，其可以通过对比经处理的和未处理的植物、植物部分、植物种子或其经加工的产物而容易地鉴别。

包含具有附着的甲基杆菌的固体物质的发酵液、发酵液产物、发酵产物或其它组合物可以用于生产工业产品或重组蛋白或用在生物治理中。

可用于处理植物或植物部分的、包含具有附着的甲基杆菌的固体物质的组合物还可以包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂通常是当暴露于植物或植物部分时不会造成不适当的植物毒性或其它不良作用的成分。在某些实施方案中，所述固体物质本身可以是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂，只要它不是针对甲基杆菌杀细菌的或抑制细菌的。在其它实施方案中，所述组合物还包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂中的至少一种。前述组合物中的任一种还可以进一步包含杀虫剂。在所述组合物中使用的杀虫剂包括、但不限于杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂和杀细菌剂。在某些实施方案中，在所述组合物中使用的杀虫剂是基本上不会抑制甲基杆菌生长的杀虫剂。由于甲基杆菌是革兰氏阴性细菌，在所述组合物中使用的合适杀细菌剂可以包括但不限于：对革兰氏阳性细菌表现出活性、但是不对革兰氏阴性细菌表现出活性的杀细菌剂。在本文中提供的组合物也可以包含基本上不会抑制甲基杆菌生长的抑制细菌的试剂。适合用于本文提供的组合物中的抑制细菌的试剂包括、但不限于：对革兰氏阳性细菌表现出活性、但是不对革兰氏阴性细菌表现出活性的那些。任意前述组合物还可以是基本上干燥的产物(即具有约5％或更低的含水量)、所述组合物与乳状液的混合物或悬浮液。

在所述组合物中使用的农业上可接受的佐剂包括、但不限于：增强产品效力的组分和/或增加产品施用容易度的产品。增强产品效力的佐剂可以包括：促进组合物在植物部分上的附着和扩散的各种湿润剂/铺展剂剂，促进向植物部分的粘附的粘着剂，可以促进活性剂与内部组织接触的渗透剂，通过抑制环境降解而增加活性剂的半衰期的增量剂，和增加喷洒的组合物的密度或干燥时间的保湿剂。在所述组合物中使用的湿润剂/铺展剂可以包括、但不限于：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、有机-硅酸盐表面活性剂和/或酸化的表面活性剂。在所述组合物中使用的粘着剂可以包括但不限于：基于胶乳的物质、萜烯/松脂二烯和基于吡咯烷酮的物质。渗透剂可以包括矿物油、植物油、酯化的植物油、有机-硅酸盐表面活性剂和酸化的表面活性剂。在所述组合物中使用的增量剂可以包括、但不限于：硫酸铵或基于薄荷烯的物质。在所述组合物中使用的保湿剂可以包括、但不限于：甘油、丙二醇和二乙二醇。改善产品施用容易度的佐剂包括、但不限于：酸化剂/缓冲剂、防泡剂/消泡剂、相容性试剂、漂移减少剂(drift-reducingagents)、染料和水调节剂。在所述组合物中使用的防泡剂/消泡剂可以包括但不限于二甲基聚硅氧烷。在所述组合物中使用的相容性试剂可以包括、但不限于硫酸铵。在所述组合物中使用的偏移减小剂可以包括、但不限于聚丙烯酰胺和多糖。在所述组合物中使用的水调节剂可以包括、但不限于硫酸铵。

本文中还提供了用发酵液、发酵液产物和组合物处理植物和/或植物部分的方法。经处理的植物和从其得到的经处理的植物部分包括、但不限于：玉米、芸苔属种(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜(B.juncea))、苜蓿、水稻、黑麦、高粱、粟(例如，珍珠粟(御谷)、黍稷(稷)、狐尾粟(谷子)、龙爪粟(穆子))、向日葵、红花、大豆、烟草、马铃薯、花生、棉花、甘薯(甘薯)、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、甜菜、甘蔗、燕麦、大麦、番茄、生菜、绿豆、利马豆、豌豆、葫芦(诸如黄瓜、罗马甜瓜和香瓜)、观赏植物和针叶树。处理的植物部分包括、但不限于：叶、茎、花、根、种子、果实、块茎、胚芽鞘等。可以处理的观赏植物和植物部分包括、但不限于：杜鹃花、八仙花属、木槿、玫瑰、郁金香、黄水仙、碧冬茄属、香石竹、一品红和菊花。可以处理的针叶树植物和植物部分包括、但不限于：松树诸如火炬松、湿地松、西黄松、黑松和辐射松；花旗松；西部铁杉树；Sitka云杉；美国杉树；真正冷杉诸如银冷杉和香脂冷杉；和雪松诸如西方红色雪松和阿拉斯加黄色雪松。可以处理的草坪草植物和植物部分包括、但不限于：一年生蓝草、一年生黑麦草、加拿大蓝草、羊茅草、剪股颖、冰草、肯塔基蓝草、野茅、黑麦草、小糠草、狗牙根、圣奥古斯丁草和结缕草。可以用本文提供的发酵液、发酵液产物、发酵产物和/或组合物处理任意前述植物的种子或其它繁殖体。

在某些实施方案中，通过施加作为喷雾剂的发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物，处理植物和/或植物部分。这类喷雾施用包括但不限于处理单一植物部分或植物部分的任意组合。可以用将发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物分布至植物和/或植物部分的任一装置实现喷雾。有用的喷雾装置包括喷杆喷雾器、手或背包喷雾器、作物喷雾器(即飞机喷雾)等。还可以使用如下的喷雾装置和/或方法：其提供发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物向近轴表面和/或远轴表面中的一个或两个的施用。本文中还提供了这样的植物和/或植物部分：其至少部分地涂有包含附着有甲基杆菌的固体物质的两相发酵液、发酵液产物、发酵产物或组合物中的任一种。本文中还提供了经加工的植物产物，其包含附着有甲基杆菌的固体物质。

在某些实施方案中，通过将种子暴露于本文中提供的发酵液、发酵液产物、发酵产物和组合物，来处理种子。通过包括但不限于浸渗、涂布、喷雾等在内的方法，可以用本文中提供的发酵液、发酵液产物和组合物处理种子。可以用连续和/或分批种子处理器实现种子处理。在某些实施方案中，可以如下制备经涂布的种子：将种子与涂布组合物一起制浆，并风干得到的产物，所述涂布组合物含有提供的包含具有甲基杆菌的固体物质的发酵液、发酵液产物或组合物。风干可以在对种子或甲基杆菌无害的任何温度完成，但是通常不大于30摄氏度。包含固体物质和甲基杆菌的涂层的比例包括、但不限于以下范围：种子重量的0.1-25％，种子重量的0.5-5％以及种子重量的0.5-2.5％。在某些实施方案中，在种子涂布或处理中使用的固体物质具有附着其上的甲基杆菌。在某些实施方案中，在种子涂布或处理中使用的固体物质将与甲基杆菌结合，以及是通过本文提供的方法得到的发酵液、发酵液产物或组合物。公开在美国专利号5,106,648、5,512,069和8,181,388中的用于种子处理的多种种子处理组合物和方法通过引用整体并入本文，且可以适合用于与包含本文中提供的发酵液、发酵液产物或组合物的活性剂一起使用。在某些实施方案中，用于处理种子的组合物可以含有农业上可接受的赋形剂，其包括、但不限于：木粉、粘土、活性炭、硅藻土、细颗粒无机固体、碳酸钙等。可以与本文提供的发酵液、发酵液产物或组合物一起使用的粘土和无机固体包括但不限于：钙膨润土、高岭土、瓷土、滑石、珍珠岩、云母、蛭石、硅石、石英粉末、蒙脱石及其混合物。可以使用的、促进向种子的粘附的农业上可接受的佐剂包括但不限于：聚乙酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯共聚物、水解的聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯基甲基醚-马来酸酐共聚物、蜡类、胶乳聚合物、纤维素包括乙基纤维素和甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸盐、糊精、麦芽糊精、多糖、脂肪、油、蛋白、刺梧桐树胶、jaguar胶、黄蓍胶、多糖树胶、粘液、阿拉伯树胶、紫胶、偏二氯乙烯聚合物和共聚物、基于大豆的蛋白聚合物和共聚物、木素磺酸盐、丙烯酸共聚物、淀粉、聚乙烯基丙烯酸酯、玉米醇溶蛋白、明胶、羧甲纤维素、壳聚糖、聚氧化乙烯、丙烯基酰亚胺聚合物和共聚物、聚羟乙基丙烯酸酯、甲基丙烯基酰亚胺单体、海藻酸盐、乙基纤维素、聚氯丁二烯和糖浆或其混合物。可以促进涂布的其它有用的农业上可接受的佐剂包括、但不限于：乙酸乙烯酯的聚合物和共聚物、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物和水溶性的蜡类。在本文中和在美国专利号8,181,388中公开的各种表面活性剂、分散剂、抗结块剂、泡沫控制剂和染料可以适合用于与包含本文提供的发酵液、发酵液产物或组合物的活性剂一起使用。

本文中还提供了本文中提供的发酵液、发酵液产物和组合物用于促进谷类植物中的节根形成的用途。有力的节根系统的早期发育在建立谷类植物作物的站立中是重要的，所述谷类植物作物包括但不限于玉米、大麦、粟、燕麦、水稻、黑麦、高粱、黑小麦和小麦。从谷类植物种子出现的第一根(胚根和种子根)的主要功能是从土壤摄取水。胚根种子根不会提供其它营养，所述其它营养在幼苗生长的早期由内核中储备的能量和营养物提供。当节根从谷类植物茎长出时，种子根的生长显著减慢，并且它们对谷类植物的长季节维持几乎没有贡献。相反，节根系统发挥该作用。因而，节根系统早期的有力建立在谷类植物作物的均匀站立的发育中起关键作用。如果不能在早期建立起有力的节根系统会导致矮化的植物和其它缺陷，最终导致在收获时较低的产率。

本文提供了与没有暴露于发酵液、发酵液产物和组合物的未处理的谷类植物相比，增加谷类植物的节根生长的发酵液、发酵液产物和组合物。在某些实施方案中，可以用发酵液、发酵液产物和组合物处理谷类植物部分(包括但不限于，种子、叶或胚芽鞘)以增加谷类植物节根生长。处理或施用可以包括但不限于用本文中提供的发酵液、发酵液产物和组合物喷雾、涂布、部分地涂布、浸渍和/或浸渗谷类植物或谷类植物部分。在某些实施方案中，可以用发酵液、用已经部分地或完全地重悬浮于液体中的发酵液产物、或用本文中提供的组合物的液体、半液体或浆料浸渍和/或浸渗种子。与模拟或未处理的谷类植物中的节根生长相比，这样的种子浸渍或浸渗可以足以提供谷类植物的节根生长的增加。这样的节根生长的增加包括：与未处理的谷类植物相比，经处理的谷类植物的节根的数目、长度、干重和/或湿重的增加。在某些实施方案中，可以将谷类植物种子浸渍和/或浸渗至少1、2、3、4、5或6小时。在某些实施方案中，可以在对谷类植物种子或甲基杆菌属无害的温度进行这样的浸渍和/或浸渗。在某些实施方案中，可以在约15至约30摄氏度或在约20至约25摄氏度处理种子。在某些实施方案中，可以在轻轻搅拌下进行种子浸渗和/或浸渍。

因此，通过测量与未处理的谷类植物相比经处理的谷类植物的节根的数目、长度、干重和/或湿重的增加中的任一者或全部，可以确定足以提供谷类植物的节根生长的增加的发酵液、发酵液产物和组合物的量。在某些实施方案中，足以提供谷类植物的节根生长的增加的、本文中提供的发酵液的量可以是含有以下滴度的甲基杆菌的发酵液：至少约5x10⁸菌落形成单位/毫升，至少约1x 10⁹菌落形成单位/毫升，至少约1x 10¹⁰菌落形成单位/毫升，或至少约3x 10¹⁰菌落形成单位/毫升。在某些实施方案中，足以提供谷类植物的节根生长的增加的、本文中提供的发酵液的量可以是含有以下滴度的甲基杆菌的发酵液：约5x10⁸菌落形成单位/毫升至至少约6x 10¹⁰菌落形成单位/毫升。在某些实施方案中，足以提供谷类植物的节根生长增加的、本文中提供的发酵液产物的量可以是这样的发酵液产物：其具有至少约5x 10⁸菌落形成单位/克至至少约6x 10¹⁰甲基杆菌菌落形成单位/克固相的该产品固相的甲基杆菌滴度。在某些实施方案中，足以提供谷类植物的节根生长增加的、本文中提供的组合物的量可以是具有至少约5x 10⁸菌落形成单位/克至至少约6x 10¹⁰甲基杆菌菌落形成单位/克颗粒的甲基杆菌滴度的组合物，在含有包含固体物质的颗粒的组合物中，其中甲基杆菌属的单培养物或共培养物附着于所述固体物质。

实施例

包括以下实施例来证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员将理解，在下述实施例中公开的技术代表申请人发现的在本发明的实践中较好起作用且因而可以被视作构成它的实践的优选模式的技术。但是，本领域技术人员考虑到本发明的公开内容会明白，可以在公开的具体实施方案中做出许多变化，同时仍然得到相同或类似的结果，而不脱离本发明的范围。

实施例1.PPFM细菌在固体琼脂平板培养基上的生长.

关于PPFM细菌在固体琼脂平板培养基上的生长，测试了多种标准培养基。

使用的一种培养基是铵矿物盐(AMS)培养基(Whittenbury等人,1970)。AMS培养基每升含有700毫克无水磷酸氢二钾、540毫克无水磷酸二氢钾、1克七水合硫酸镁、500毫克无水氯化铵、200毫克脱水氯化钙、4毫克七水合硫酸铁、100微克七水合硫酸锌、30微克四水合氯化锰、300微克无水硼酸、200微克六水合氯化钴、10微克脱水氯化铜、20微克六水合氯化镍和60微克脱水钼酸钠。

从下面列出的4种储备溶液制备AMS培养基。

储备溶液I:对于在50X浓度的1升

无水磷酸氢二钾 35克

无水磷酸二氢钾 27克

储备溶液II:对于在50X浓度的1升

七水合硫酸镁 50克

无水氯化铵 25克

储备溶液III:对于在50X浓度的1升

二水合氯化钙 10克

痕量金属储备溶液:对于在1000X浓度的1升

将储备溶液I、II和III分别高压灭菌。痕量金属储备溶液不能高压灭菌，因为大部分盐在高压灭菌步骤中沉淀出来，所以将它通过0.2微米过滤器过滤除菌。为了确保制备出在溶液中含有所有成分的水-澄清的AMS培养基，这些步骤是必要的。如Whittenbury等人(1970)最初描述的，在培养基制备的最终完成步骤之前，将AMS培养基的含有磷酸盐的组分与其它组分分离，从而阻止不溶性的磷酸镁和磷酸钙晶体的形成。

为了用AMS基质制备1升固体琼脂平板培养基，将15克琼脂加入940ml蒸馏水中，并将该混合物高压灭菌。高压灭菌以后，将各20ml的储备溶液I、II和III与1ml过滤除菌的痕量金属储备溶液一起加入。

如果要掺入其它培养基组分(诸如碳源)，通常在高压灭菌之前将这些加入水和琼脂混合物中。这方面的一个例外是甲醇，其通过0.2微米过滤器过滤除菌，然后在已经将基础培养基高压灭菌后加入。

使用的第二种培养基是Vogel-Bonner(VB)基本培养基(Vogel和Bonner,1956)。VB培养基每升含有298毫克七水合硫酸镁、14.93克无水磷酸氢二钾、5.22克四水合磷酸氢氨钠和2.73克无水柠檬酸(游离酸形式)。

Vogel-Bonner基本培养基从盐和柠檬酸的25X储备溶液制成。通过将下述量的每种成分以列出的次序溶解在1升蒸馏水中，并确保每种在加入下一种之前完全溶解，来制备该25X储备溶液：7.46克七水合硫酸镁、68.23克无水柠檬酸、373.13克无水磷酸氢二钾和130.60克四水合磷酸氢氨钠。通过首先溶解硫酸镁，然后加入柠檬酸，镁离子被柠檬酸根离子螯合，从而防止当加入磷酸盐时形成不溶性的磷酸镁晶体。这确保了制备出在溶液中含有所有成分的水-澄清的培养基。

为了用VB基质制备1升固体琼脂平板培养基，将15克琼脂加入960ml蒸馏水中，并将该混合物高压灭菌。高压灭菌以后，加入40ml25X VB盐储备溶液。

如果要掺入其它培养基组分(诸如碳源)，通常在高压灭菌之前将这些加入水和琼脂混合物中。这方面的一个例外是甲醇，其通过0.2微米过滤器过滤除菌，然后在已经将基础培养基高压灭菌后加入。

使用的第三种培养基是LB液体培养基。LB液体培养基每升含有10克胰蛋白胨、5克酵母浸出物和10克氯化钠。将所有组分溶解在1升蒸馏水中并高压灭菌。该培养基是水-澄清的，所有成分都在溶液中。

为了用LB基质制备1升固体琼脂平板培养基，将15克琼脂加入1升LB液体培养基中，并将该混合物高压灭菌。

Corpe和Basile(1982)进行了不同PPFM细菌菌株在含有不同碳源的AMS培养基中的生长的系统研究。许多试验的物质几乎不或不支持PPFM细菌的生长。Corpe和Basile报道称，甘油和谷氨酸盐对于PPFM细菌而言是相对良好的碳源，并且甲醇、葡萄糖、天冬氨酸盐、琥珀酸盐和苹果酸盐是PPFM细菌的碳源的中间体。

申请人测量了扭脱甲基杆菌在LB平板上以及在补充了不同碳源的AMS和VB平板上的生长。下面列出的碳源都以10克/升加入AMS或VB基质盐培养基中。另外，测试了一些包括10克/升的蛋白胨的培养基组合物。将扭脱甲基杆菌在不同的琼脂平板上划线，并将它们在30℃孵育至多2周。将生长测量为菌落变成完整尺寸(约2毫米的直径)所需的孵育天数；对于其中完整尺寸的菌落甚至在延长孵育以后也没有形成的那些生长条件，将所述菌落评分为中等尺寸(约1毫米的直径)或小尺寸(约0.5毫米或更小的直径)。所有观察的菌落都是深的饱和粉红色，正如PPFM细菌的特征。结果如下：

PPFM细菌扭脱甲基杆菌在试验的固体琼脂平板培养基上的最快且最丰富的生长是在AMS+甘油和蛋白胨或AMS+谷氨酸盐和蛋白胨上，紧接着是AMS+甲醇或VB+甘油和蛋白胨。在其它试验的培养基上的生长显著变慢。

实施例2.PPFM细菌在澄清的单相液体培养基中的生长.

对于在实施例1中发现的支持PPFM细菌扭脱甲基杆菌的最快且最丰富生长的那4种固体琼脂平板培养基，制备和试验了对应的液体形式(也就是说，不加入琼脂)。按照实施例1中所述制备的这4种液体培养基(唯一例外是，它们不含有任何琼脂)都是水-澄清的液体，所有成分都在溶液中。向含有100毫升这4种液体培养基的烧瓶中，加入PPFM细菌扭脱甲基杆菌的接种物，以得到约1x10⁵菌落形成单位(CFU)/毫升的最初滴度。将烧瓶放在旋转振荡培养装置上，并在30℃和250rpm培养5天。在5天孵育结束时，确定烧瓶中的PPFM细菌的滴度。结果为：

这些结果的一个惊人方面是，在与这些培养基的固体琼脂平板形式(PPFM细菌在所述固体琼脂平板形式上面快速地且丰富地生长(如在实施例1中所述))中存在的营养物完全相同的营养物存在条件下，PPFM细菌在所有这些水-澄清的液体培养基中的生长都非常差。实际上，在所有这些烧瓶中，几乎不存在或根本不存在可见的浑浊(微生物生长的经典指示)，且不存在任何粉红色色调的迹象。

实施例3.PPFM细菌在含有不溶性盐晶体的两相培养基中的生长.

为了制备两相培养基，通过有意地形成磷酸镁和/或磷酸钙的不溶性晶体，使液体AMS+甘油和蛋白胨培养基变浑浊(即给其提供固体物质)。为了有意地在培养基中形成不溶性晶体，在实施例1中描述的制备方法进行如下改变。在高压灭菌之前，将除了痕量金属储备溶液以外的所有组分混合在一起。也就是说，向940ml蒸馏水中加入各20ml的储备溶液I、II和III，以及10克甘油和10克蛋白胨。高压灭菌以后，通过加入1ml过滤除菌的痕量金属储备溶液，完成培养基的制备。在高压灭菌之前混合到一起的储备溶液I、II和III的组分的高压灭菌导致不溶性盐晶体的形成，可能主要是磷酸氢镁和/或磷酸氢钙。高压灭菌以后，通过该制备方法制备的AMS+甘油和蛋白胨培养基产生了含有这些盐晶体的非常浑浊的液体培养基。该新液体培养基被命名为“浑浊的AMS+甘油和蛋白胨”。

向含有100毫升浑浊的AMS+甘油和蛋白胨的烧瓶中，加入PPFM细菌扭脱甲基杆菌的接种物，以得到约1x10⁵菌落形成单位(CFU)/毫升的最初滴度。将烧瓶放在旋转振荡培养装置上，并在30℃和250rpm培养3天。仅2天以后，烧瓶已经形成深的饱和粉红色浑浊，从而指示PPFM细菌的快速且丰富生长。在接种后2天和3天，确定烧瓶中的PPFM细菌的滴度。结果是：

该结果的2个惊人方面是，PPFM细菌的非常快速的生长，以及它们生长达到的滴度接近高于在澄清的AMS+甘油和蛋白胨液体培养基中达到的滴度(如在实施例2中所示)的10,000倍。

实施例4.PPFM细菌在含有琼脂的液体培养基中的生长.

为了制备固体琼脂平板培养基，通常以约15克/升培养基加入琼脂。为了测试更低量的琼脂(在过低以致不能胶凝或固化培养基的水平)是否可有效地促进PPFM细菌的快速且丰富的生长，将少量琼脂加入AMS+甘油和蛋白胨液体培养基中。按照在实施例1中所述制备该液体培养基，也就是说，通过设计的防止形成磷酸镁和磷酸钙的不溶性盐晶体的制备方法来制备该液体培养基。在高压灭菌之前，将如在实施例1中所述的琼脂加入水中。测试的琼脂的量为每升750毫克、1.5克和3克。这些新液体培养基被命名为“AMS+甘油和蛋白胨和琼脂”。

向含有100毫升AMS+甘油和蛋白胨和琼脂的烧瓶中，加入PPFM细菌扭脱甲基杆菌的接种物，以得到约1x10⁵菌落形成单位(CFU)/毫升的最初滴度。将烧瓶放在旋转振荡培养装置上，并在30℃和250rpm培养3天。仅2天以后，烧瓶都已经形成深的饱和粉红色浑浊，从而指示PPFM细菌的快速且丰富生长。在接种后2天和3天，确定烧瓶中的PPFM细菌的滴度。结果是：

该结果的2个惊人方面是，PPFM细菌的非常快速的生长，以及它们生长达到的滴度接近高于在澄清的AMS+甘油和蛋白胨液体培养基中达到的滴度(如在实施例2中所示)的1000倍。在生长3天以后获得的数据也指示，增加的生长量与增加的琼脂量相关。

实施例5.PPFM细菌在含有硅藻土的液体培养基中的生长.

为了测试硅藻土是否可以有效地促进PPFM细菌的快速且丰富的生长，将少量硅藻土加入AMS+甘油和蛋白胨液体培养基。按照在实施例1中所述制备该液体培养基，也就是说，通过设计的防止形成磷酸镁和磷酸钙的不溶性盐晶体的制备方法来制备该液体培养基。在高压灭菌之前，将硅藻土加入水中。测试的硅藻土的量为每升500毫克、1克、1.5克和2克。这些新液体培养基被命名为“AMS+甘油和蛋白胨和硅藻土”。

向含有100毫升的AMS+甘油和蛋白胨和硅藻土的烧瓶中，加入PPFM细菌扭脱甲基杆菌的接种物，以达到约1x10⁵菌落形成单位(CFU)/毫升的最初滴度。将烧瓶放在旋转振荡培养装置上，并在30℃和250rpm培养3天。仅2天以后，烧瓶已经形成深的饱和粉红色浑浊，从而指示PPFM细菌的快速且丰富生长。在接种后2天和3天，确定烧瓶中的PPFM细菌的滴度。结果是：

该结果的2个惊人方面是，PPFM细菌的生长非常快速，以及它们生长达到的滴度接近高于在澄清的AMS+甘油和蛋白胨液体培养基中达到滴度(如在实施例2中所示)的10,000倍。在生长2天以后获得的数据也表明，在0.5克至1.5克/100ml培养物的范围内，增加的生长量与增加的琼脂量相关。

实施例6.PPFM细菌在受控的生物反应器中的生长.

由生长培养基中的碳源的代谢引起的pH的变化，会限制在在旋转振荡器上孵育的烧瓶中的细菌的生长。受控的生物反应器(也被称作“发酵罐”或“发酵容器”)通过将pH维持在希望的水平(通过适当的酸或碱的受控添加)而避免该限制。能限制细菌生长的另一种因素是溶解氧的可用性。受控的生物反应器通过维持适当的溶解氧水平(通过进入反应器容器中的气流的受控调节、容器的搅拌速率和容器内的气压)而避免该限制。

当在受控的生物反应器(其含有实施例1中描述的AMS+甘油和蛋白胨液体培养基，还补充了如在实施例3、4和5中描述的固体物质诸如不溶性的盐、琼脂或硅藻土)中培养时，达到的最终PPFM细菌滴度将比在烧瓶中达到的滴度高至少30倍，具体地为至少3x 10¹⁰菌落形成单位/毫升。

实施例7.不同甲基杆菌在培养基中存在和不存在多种固体的条件下的生长

从指定的保藏机构得到在下表中列出的不同甲基杆菌，将其纯化为单个菌落分离物，并在存在和不存在固体的AMS+甘油+蛋白胨培养基中培养。将固体在培养基中通过高压灭菌进行灭菌。

保藏登记号	甲基杆菌菌种
		DSM-6343	扭脱甲基杆菌
DSM-1819	耐辐射甲基杆菌
		DSM-13060	扭脱甲基杆菌
DSM-18172	嗜有机甲基杆菌
		DSM-1708	嗜中温甲基杆菌
DSM-18207	稻甲基杆菌
		DSM-19779	Methylobacterium phyllosphaerae
ATCC-14718	扭脱甲基杆菌
		ATCC-14821	玫瑰红甲基杆菌
ATCC-21611	罗得西亚甲基杆菌
		ATCC-35065	藤泽氏甲基杆菌
ATCC-43883	扎氏甲基杆菌
		ATCC-51358	噬胺甲基杆菌
ATCC-700647	硫氰酸盐甲基杆菌

ATCC:美国典型组织培养物保藏中心,Manassas,VA,USA

DSM:DSMZ-德国微生物和细胞培养中心(“DSMZ”),Braunschweig,Germany

上表中的所有甲基杆菌在水-澄清的AMS+甘油+蛋白胨培养基中生长得非常差或根本不生长，并且都在用一种下述固体改进(以2克/升)的相同培养基中非常好地生长：硅藻土、琼脂、浑浊培养基(如在实施例3中所述，用磷酸镁的不溶性晶体造成混浊的)、骨粉、亚麻籽粉、“稀土(Rare Earth)”(叶蜡石硅酸盐粘土(pyrophyllitic silicate clay)和风化褐煤的混合物，其来自General Hydroponics of Sebastopol,CA,US)、“白色寄生蟹砂粒(White Hermit Crab Sand)”(碳酸钙和碳酸镁的混合物，其来自Zoo-Med Laboratories,Inc.,of San Luis Obispo,CA,USA)、干燥的和粉化的椰子肉、和压碎的蛋壳。

实施例8.在有固体存在下在培养基中生长的甲基杆菌的显微照相术.

将甲基杆菌纯化为单个菌落分离物，并在有硅藻壳存在下在液体生长培养基中进行培养。将硅藻壳在液体培养基中通过高压灭菌进行灭菌，然后将甲基杆菌接种于灭菌的培养基中。

扭脱甲基杆菌菌株DSM-6343培养物的显微照片分析的结果显示在图1和2中。在图1中，暴露了格子状的硅藻壳的一部分，而硅藻壳的其它部分被附着的甲基杆菌细胞遮蔽。图1也表明，在该培养物中存在非常少的没有附着的甲基杆菌细胞。图2显示了几乎完全被附着的甲基杆菌细胞包被的硅藻壳和在液体培养基中的少量明显地未附着的甲基杆菌细胞。

实施例9.包含具有附着的甲基杆菌的固体物质的植物种子或叶处理组合物

为了得到适合用于植物种子或叶处理的组合物，通过在本文中公开的或要求保护的任一方法，或如在上述实施例3-6中任一个中所述的方法，在含有固体物质的液体培养基中培养甲基杆菌。通常，将甲基杆菌培养至高滴度(即至少约5x10⁸菌落形成单位/克固体)。然后收获与固体结合的附着的甲基杆菌，在培养物中存在或不存在任何未附着的甲基杆菌。收获可以通过过滤、离心、倾析和它们的组合来实现。在某些情况下，可以将收获物直接施用于种子或植物。在其它情况下，在施用之前，将收获物通过冻干法或喷雾干燥等干燥。在施用于植物或种子之前，干燥的材料还可以用必要的或希望的液体复原。在某些情况下，具有附着的甲基杆菌的固体材料可以如本文中所述被解离，并直接施用于种子或植物，或者首先被干燥然后施用于种子或植物。具有附着的甲基杆菌的固体材料也可以首先被干燥，然后如本文中所述被解离，并直接施用于植物种子或用作用于植物或种子处理的其它组合物中的活性成分。也可能将额外的农业上可接受的赋形剂和/或佐剂加入收获的和/或解离的具有附着的甲基杆菌的固体材料中的任一种中。加入的赋形剂可以包括木粉、粘土、活性炭、硅藻土、细颗粒无机固体、碳酸钙等。可以作为赋形剂加入组合物中的粘土和无机固体包括：钙膨润土、高岭土、瓷土、滑石、珍珠岩、云母、蛭石、硅石、石英粉末、蒙脱石及其混合物。可以加入组合物中的、促进向种子或其它植物部分的粘附的农业上可接受的佐剂包括：聚乙酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯共聚物、水解的聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯基甲基醚-马来酸酐共聚物、蜡类、胶乳聚合物、纤维素包括乙基纤维素和甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸盐、糊精、麦芽糊精、多糖、脂肪、油、蛋白、刺梧桐树胶、jaguar胶、黄蓍胶、多糖树胶、粘液、阿拉伯树胶、紫胶、偏二氯乙烯聚合物和共聚物、基于大豆的蛋白聚合物和共聚物、木素磺酸盐、丙烯酸共聚物、淀粉、聚乙烯基丙烯酸酯、玉米醇溶蛋白、明胶、羧甲纤维素、壳聚糖、聚氧化乙烯、丙烯基酰亚胺聚合物和共聚物、聚羟乙基丙烯酸酯、甲基丙烯基酰亚胺单体、海藻酸盐、乙基纤维素、聚氯丁二烯和糖浆或其混合物。可以促进种子或其它植物部分的涂布的其它有用的农业上可接受的佐剂包括乙酸乙烯酯的聚合物和共聚物、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物和水溶性的蜡类。这些组合物可以维持在干燥或半干燥形式，或可以通过加入希望的液体配制成浆料。所述组合物然后可以用于喷洒或涂布植物或种子，以便得到与甲基杆菌向植物的施用有关的有益效果。

实施例10.不同甲基杆菌在存在和不存在多种固体下的培养基中的滴度

从DSMZ(Braunschweig,德国)和ATCC(马纳萨斯,VA,USA)购买甲基杆菌属的14种菌株。这14种菌株由12个不同种组成，因为在该集合中存在3种扭脱甲基杆菌：

1.DSM-6343扭脱甲基杆菌

2.DSM-1819耐辐射甲基杆菌

3.DSM-13060扭脱甲基杆菌

4.DSM-18172嗜有机甲基杆菌

5.DSM-1708嗜中温甲基杆菌

6.DSM-18207稻甲基杆菌

7.DSM-19779Methylobacterium phyllosphaerae

8.ATCC-14718扭脱甲基杆菌

9.ATCC-14821玫瑰红甲基杆菌

10.ATCC-21611罗得西亚甲基杆菌

11.ATCC-35065藤泽氏甲基杆菌

12.ATCC-43883扎氏甲基杆菌

13.ATCC-51358噬胺甲基杆菌

14.ATCC-700647硫氰酸盐甲基杆菌

对于下面的试验，接种物来自在水-澄清的AMS-GP培养基中生长的培养物。将这些培养物在200ml水-澄清的AMS-GP培养基中培养，滴定，然后浓缩10倍。这些PPFM培养物(不存在固体基质)用于接种试管，所述试管含有10ml水-澄清的AMS-GP培养基或加入了不同固体基质的AMS-GP培养基。将20mg不同固体基质加入每个10ml试管中，产生相当于2克/升的固体基质浓度。每个试管中的靶最初滴度是约1x 10⁵PPFM细胞/ml。将接种的试管放在旋转振荡器装置上，并在30℃和250rpm培养3天。生长3天以后，滴定PPFM培养物。

PPFM菌株在水-澄清的AMS-GP液体培养基中的生长

PPFM菌株在浑浊的AMS-GP液体培养基中的生长

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+硅藻土(以2克/升)中的生长

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+粉化的海带(以2克/升)中的生长

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+椰子壳纤维(以2克/升)中的生长

椰子壳纤维是被称作“Hermit Soil”的产品，具有被列出为“椰子纤维基质”的唯一成分，由Zoo-Med Laboratories,Inc.,of San Luis Obispo,CA销售。

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+棉籽粉(2克/升)中的生长

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+骨粉(2克/升)中的生长

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+血粉(2克/升)中的生长

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+砂粒(2克/升)中的生长

所述砂粒是被称作“白色寄生蟹砂粒(White Hermit Crab Sand)”的产品，具有作为碳酸钙和碳酸镁列出的成分，并由Zoo-Med Laboratories,Inc.,of San Luis Obispo,CA销售。

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+硅石-云母粘土(2克/升)中的生长

所述云母粘土是被称作“Profile”的产品，具有作为硅石和伊利石的掺合物列出的成分。伊利石是云母粘土。Profile由Profile Products,LLC,of Buffalo Grove,IL销售。

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+硅酸盐-准矿物粘土(2克/升)中的生长

准矿物粘土是被称作“稀土(Rare Earth)”的产品，具有作为叶蜡石硅酸盐粘土(pyrophyllitic silicate clay)和风化褐煤的掺合物列出的成分。风化褐煤是由氧化的褐煤组成的准矿物；它富含腐殖酸。稀土由General Hydroponics of Sebastopol,CA销售。

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+页硅酸铝粘土(2克/升)中的生长

页硅酸铝粘土是被称作“Bentonite”的产品，具有作为页硅酸铝粘土列出的成分。Bentonite由L.D.Carlson Co.of Kent,OH销售。

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+压碎的蛋壳(2克/升)中的生长

所述压碎的壳从鸡蛋壳获得。

用2种PPFM菌株测试了另外4种固体基质。尽管这些固体基质中的所有4种都使2种PPFM菌株能够生长至比在水-澄清的AMS-GP培养基中更高的滴度，但是与上面测试的其它固体基质相比，所述生长的颜色相对较浅。磨碎的小麦和磨碎的大麦是非常粗糙的，它们由于粗糙地磨碎的固体基质的相对低的表面积而促成这种相对浅色的生长。

因为这种相对浅色的生长，没有用其它PPFM菌株测试这4种固体基质。

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+亚麻籽粉(以2克/升)中的生长

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+磨碎的小麦(以2克/升)中的生长

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+磨碎的大麦(以2克/升)中的生长

PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+干燥的虾(以2克/升)中的生长

干燥的虾是粉化的丰年虾，由OmegaSea Ltd,of Sitka,AK销售。

实施例11.不同甲基杆菌在存在不同凝胶的培养基中的滴度

a.PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+粉化的椰子肉(以2克/升)中的生长

将粉化的椰子肉加入液体培养基中，随后高压灭菌，导致胶体凝胶在灭菌的培养基中的形成。以与其它培养基相同的方式用具有指示登录号的细菌接种含有上述凝胶的灭菌培养基，并如所描述的进行培养。

达到的PPFM细胞的滴度高于通过在澄清的AMS-GP液体培养基中培养PPFM达到的滴度(参见实施例10的代表性结果，其中在水澄清AMS-GP培养基中培养3天的PPFM没有超过10⁶菌落形成单位/ml)。

b.PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+明胶(以2克/升)中的生长

将明胶加入液体培养基中，随后高压灭菌，导致胶体凝胶在灭菌的培养基中的形成。以与其它培养基相同的方式用具有指示登录号的细菌接种含有上述凝胶的灭菌培养基，并如所描述的进行培养。

达到的PPFM细胞的滴度高于通过在澄清的AMS-GP液体培养基中培养PPFM达到的滴度(参见实施例10的代表性结果，其中在水澄清AMS-GP培养基中培养3天的PPFM没有超过10⁶菌落形成单位/ml)。

c.PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+琼脂(以2克/升)中的生长

将琼脂加入液体培养基中，随后高压灭菌，导致胶体凝胶在灭菌的培养基中的形成。以与其它培养基相同的方式用具有指示登录号的细菌接种含有上述凝胶的灭菌培养基，并如所描述的进行培养。

达到的PPFM细胞的滴度高于通过在澄清的AMS-GP液体培养基中培养PPFM达到的滴度(参见实施例10的代表性结果，其中在水澄清AMS-GP培养基中培养3天的PPFM没有超过10⁶菌落形成单位/ml)。

实施例12.PPFM细菌用于促进植物生长和早期发育的用途.

在生长季节早期建立玉米植物的有力且均匀的站立，是高产作物所必需的，并且主要依赖于有力节根系统的发育。从玉米种子出现的第一根(胚根和种子根)的主要功能是从土壤摄取水。胚根种子根不会提供其它营养，所述其它营养在幼苗生长的早期由内核中储存的能量和营养物提供。当节根从玉米茎长出时，种子根的生长显著减慢，并且它们对玉米植物的长季节维持几乎没有贡献。相反，节根系统发挥该作用。因而，节根系统的早期有力的建立在玉米的均匀站立的发育中起关键作用。如果不能在早期建立起有力的节根系统会导致矮化的植物和其它缺陷，最终导致在收获时较低的产率。

通过实施例3的方法(即通过在含有不溶性盐晶体的液体培养基中培养PPFM细菌)生产的PPFM细菌的培养物用于处理玉米种子。在容器中，向72粒玉米种子加入20毫升PPFM培养物，使得玉米种子完全浸入PPFM培养物中。作为对照，将等数目的玉米种子浸在实施例3的不含PPFM的培养基中。将玉米种子在这些溶液中在轻轻搅拌下在室温(约22℃)浸泡4小时。在该浸泡期结束时，将种子植入盆栽土壤中，并允许发芽和生长8天。在此时，将玉米幼苗挖出，冲洗以除去土壤，并计数和测量节根。结果显示在下面。

这些结果表明，使玉米种子与本发明提供的高滴度PPFM培养物接触会导致节根的更早出现和更快生长。

实施例13.甲基杆菌在含有非颗粒固体物质的液体培养基中的生长

将10种不同的甲基杆菌属(PPFM)菌株在200ml水-澄清的AMS-GP培养基中培养，滴定，然后浓缩10倍。使用这些PPFM培养物(不存在固体物质)接种含有10ml水-澄清AMS-GP培养基(含有加入的不同非颗粒固体物质)的试管。对于非颗粒固体，将20mg不同非颗粒固体物质加入每个10ml试管，产生相当于2克/升的非颗粒固体基质浓度。每个试管中的靶最初滴度是约1x 10⁵PPFM细胞/ml。将接种的试管放在旋转振荡装置上，并在30℃和250rpm培养3天。

a.PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+棉花簇(以2克/升)中的生长

生长3天以后，棉花簇具有深的明亮的粉红色颜色，被附着的PPFM细胞(图3A；扭脱甲基杆菌菌株DSM-6343)包被。通过有力涡旋除去这些附着的PPFM，并将得到的PPFM细胞悬液进行滴定。达到的PPFM细胞的滴度高于通过在澄清的AMS-GP液体培养基中培养PPFM达到的滴度(参见实施例10的代表性结果，其中在水澄清AMS-GP培养基中培养3天的PPFM没有超过10⁶菌落形成单位/ml)。在图4中提供了显微照片，其显示了附着于棉花纤维的PPFM菌株ATCC-35065藤泽氏甲基杆菌。

b.PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+玻璃绒簇(以2克/升)中的生长

生长3天以后，玻璃绒簇具有明亮的粉红色颜色，被附着的PPFM细胞(图3B,扭脱甲基杆菌菌株DSM-6343)包被。通过有力涡旋除去这些附着的PPFM，并将得到的PPFM细胞悬液进行滴定。达到的PPFM细胞的滴度高于在澄清的AMS-GP液体培养基中培养PPFM达到的滴度(参见实施例2的代表性结果)。达到的PPFM细胞的滴度高于通过在澄清的AMS-GP液体培养基中培养PPFM达到的滴度(参见实施例10的代表性结果，其中在水澄清AMS-GP培养基中培养3天的PPFM没有超过10⁶菌落形成单位/ml)。

c.PPFM菌株在AMS-GP液体培养基+合成海绵簇(2克/升)中的生长

使用的合成海绵为“Body Scrub”，由Compac Industries,Inc.of Decatur,GA制造。所述合成海绵由聚酯聚合材料制成。

生长3天以后，合成海绵簇具有明亮的粉红色颜色，被附着的PPFM细胞(图3C,扭脱甲基杆菌菌株DSM-6343)包被。通过有力涡旋除去这些附着的PPFM，并将得到的PPFM细胞悬液进行滴定。达到的PPFM细胞的滴度高于通过在澄清的AMS-GP液体培养基中培养PPFM达到的滴度(参见实施例10的代表性结果，其中在水澄清AMS-GP培养基中培养3天的PPFM没有超过10⁶菌落形成单位/ml)。

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已经解释和描述了本发明的原理，对本领域技术人员显而易见的是，本发明可以在安排和细节上做出修改，而不脱离这样的原理。

尽管已经结合多种实施方案和示例性实施例的方式描述了本发明的材料和方法，但是对本领域技术人员显而易见的是，可以将变化应用于本文描述的材料和方法，而不脱离本发明的概念、精神和范围。所有这种本领域技术人员容易想到的类似的替代物和修改都被视作在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (102)

1.一种用于获得甲基杆菌(Methylobacterium)制备物的方法，所述方法包括：在包含液相和固相的培养基中培养甲基杆菌的单培养物或共培养物，以提供甲基杆菌滴度为5x10⁸菌落形成单位/克固体至5x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克固体的发酵产物，以及收获在所述培养基中培养的甲基杆菌，由此获得所述甲基杆菌制备物，其中与通过在单独液体培养基中培养甲基杆菌获得的产率相比，所述固相提供增加的所述甲基杆菌产率，且其中所述固相不是存活的光合微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相包含多个可悬浮颗粒，以及所述发酵产物包含附着有甲基杆菌的所述可悬浮颗粒。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含胶体，其中所述固相分散在所述液相中。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述胶体是凝胶。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相是凝胶。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述液相是乳状液。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述乳状液包含水性液体以及在所述水性液体中不可混溶的或仅部分可混溶的液体。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基还包含一种或多种非甲基杆菌的特性预先确定的非光合微生物。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相构成所述培养基质量的0.02％至20％。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相提供所述甲基杆菌的附着生长和/或其中所述固相不作为所述甲基杆菌的碳源。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相包含选自以下的固体物质：人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述固体物质是无生命的。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相包含选自以下的固体物质：多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养包括以下步骤：用所述甲基杆菌接种所述培养基，以及在足以提供所述甲基杆菌生长的条件下孵育所述经接种的培养基。

17.根据权利要求2所述的方法，其中所述颗粒的平均长度或平均直径为2微米至1000微米。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述甲基杆菌选自：噬胺甲基杆菌(M.aminovorans)、氯甲烷甲基杆菌(M.chloromethanicum)、二氯甲烷甲基杆菌(M.dichloromethanicum)、扭脱甲基杆菌(M.extorquens)、藤泽氏甲基杆菌(M.fujisawaense)、嗜中温甲基杆菌(M.mesophilicum)、嗜有机甲基杆菌(M.organophilum)、耐辐射甲基杆菌(M.radiotolerans)、罗得西亚甲基杆菌(M.rhodesianum)、玫瑰红甲基杆菌(M.rhodinum)、硫氰酸盐甲基杆菌(M.thiocyanatum)、结瘤甲基杆菌(M.nodulans)、M.cerastii、M.gossipiicola、甲基杆菌属LMG6378菌株(Methylobacterium sp.strain LMG6378)、M.phyllosphaerae、稻甲基杆菌(M.oryzae)、M.platani、M.populi和扎氏甲基杆菌(M.zatmanii)。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵液中的至少10％的存活甲基杆菌是附着于所述固相的甲基杆菌。

20.根据权利要求1所述的方法，其中按量或类型计，所述发酵产物中至少95％的微生物是甲基杆菌。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述收获包括：回收全部或部分附着有甲基杆菌的固相和/或从所述液相回收全部或部分未附着的甲基杆菌。

22.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括：解离附着有甲基杆菌的所述固相中的一些或全部。

23.根据权利要求22所述的方法，所述方法还包括：干燥解离的或部分地解离的材料。

24.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括：i)干燥已经从所述液相分离的附着有甲基杆菌的固相；或者，ii)干燥从液相回收的附着有甲基杆菌的固相和未附着的甲基杆菌。

25.根据权利要求24所述的方法，所述方法还包括：解离以下的一些或全部：i)干燥的附着有甲基杆菌的固相；或者，ii)干燥的附着有甲基杆菌的固相和未附着的甲基杆菌。

26.通过根据权利要求1-25中的任一项所述的方法能获得的甲基杆菌制备物，其中所述甲基杆菌制备物包含固体物质，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物通过在所述固体物质上生长而附着于所述固体物质，以及其中所述固体物质具有5x10⁸菌落形成单位/克固体至5x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克固体的甲基杆菌滴度。

27.根据权利要求26所述的制备物，其中附着有甲基杆菌的单培养物或共培养物的所述固体物质具有5x10⁸菌落形成单位/克固体至1x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克固体的甲基杆菌滴度。

28.用甲基杆菌处理植物或植物部分的方法，所述方法包括下述步骤：将组合物施用于所述植物或植物部分，所述组合物包含权利要求26或27所述的甲基杆菌制备物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述组合物还包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述组合物是具有5％或更低的含水量的基本上干燥的产物、固体与附着的甲基杆菌在乳状液中的混合物，或者悬浮液。

31.根据权利要求28所述的方法，其中所述植物部分是种子。

32.根据权利要求28所述的方法，其中所述植物部分是茎、根、花、子叶、胚芽鞘、果实或叶。

33.根据权利要求28所述的方法，其中所述植物是玉米、芸苔属种、苜蓿、水稻、黑麦、高粱、珍珠粟、黍稷、狐尾粟、龙爪粟、向日葵、红花、大豆、烟草、马铃薯、花生、棉花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、甜菜、甘蔗、燕麦、大麦、番茄、生菜、绿豆、利马豆、豌豆、葫芦、观赏植物或针叶树植物。

34.一种获得甲基杆菌制备物的方法，所述方法包括：

(i)在(a)培养容器或者(b)培养基中培养甲基杆菌的单培养物或共培养物，所述培养容器包含或含有一个或多个提供所述甲基杆菌的附着生长的固体表面，所述培养基包含液相和固相，其中所述固相的甲基杆菌滴度是5x10⁸菌落形成单位/克固体至5x10¹³菌落形成单位/克固体，且其中与通过在单独液体培养基中培养甲基杆菌获得的产率相比，所述固相提供增加的甲基杆菌产率；和

(ii)收获附着于所述固体表面或所述固相的甲基杆菌，其中所述收获包括：通过使甲基杆菌暴露于物理处理和/或化学处理中的一种或多种，从所述固体表面或所述固相除去所述甲基杆菌，由此得到甲基杆菌制备物。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述培养容器的固体表面由允许甲基杆菌附着生长的包被的或未包被的金属、玻璃、塑料、陶瓷或它们的组合制成。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述化学处理包括离子强度转换、pH转换、去污剂处理、溶剂处理和/或酶处理中的一种或多种。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述酶处理包括将附着于所述固体表面或固相的甲基杆菌暴露于蛋白酶、脂肪酶、葡聚糖酶或它们的任意组合。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述去污剂处理包括将附着于所述固体表面或固相的甲基杆菌暴露于离子型去污剂、非离子型去污剂或它们的任意组合。

39.根据权利要求34所述的方法，其中所述物理处理包括将附着于所述固体表面或固相的甲基杆菌暴露于超声处理、刮削、增压液体、增压浆料、热或它们的任意组合。

40.根据权利要求34所述的方法，所述方法还包括再使用(a)一个或多个已经从其除去甲基杆菌的固体表面；或者(b)已经从其除去甲基杆菌的培养基的固相的步骤，用于培养和收获随后的甲基杆菌制备物。

41.根据权利要求34所述的方法，其中(b)中的所述固相包含平均长度或平均直径为2微米至1000微米的多个颗粒。

42.根据权利要求34所述的方法，其中所述固相提供所述甲基杆菌的附着生长和/或其中所述固相不作为所述甲基杆菌的碳源。

43.根据权利要求34所述的方法，其中所述固相包含选自以下的固体物质：人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述固体物质是无生命的。

45.根据权利要求34所述的方法，其中所述固相包含选自以下的固体物质：多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。

46.根据权利要求34所述的方法，其中所述培养基包含胶体，其中所述固相分散在所述液相中。

47.根据权利要求34所述的方法，其中所述液相是乳状液。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述乳状液包含水性液体以及在所述水性液体中不可混溶的或仅部分地混溶的液体。

49.根据权利要求45所述的方法，其中步骤(ii)中的所述固相的甲基杆菌滴度为5x10⁸菌落形成单位/克固体至1x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克固体。

50.根据权利要求34-49中任一项所述的方法，所述方法还包括干燥所述收获的甲基杆菌的步骤。

51.包含固体物质的发酵产物，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物在包含液相和固相的培养基中通过已经在所述固体物质上生长而附着于所述固体物质，其中所述固体物质不是存活的光合微生物，其中所述固体物质的甲基杆菌滴度为5x10⁸菌落形成单位/克固体至1x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克固体，且其中按量或类型计，所述发酵产物中至少95％的微生物是甲基杆菌。

52.根据权利要求51所述的发酵产物，其中所述产物还包含一种或多种特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。

53.根据权利要求51所述的发酵产物，其中所述固体物质包含平均长度或平均直径为2微米至1000微米的多个可悬浮颗粒。

54.根据权利要求51所述的发酵产物，其中所述固体物质是无生命的。

55.根据权利要求51所述的发酵产物，其中所述固体物质选自：人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。

56.根据权利要求51所述的发酵产物，其中所述固体物质选自多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。

57.根据权利要求56所述的发酵产物，其中所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。

58.根据权利要求51所述的发酵产物，其中所述固体物质是农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。

59.根据权利要求51-58中任一项所述的发酵产物，其中所述固体物质上附着的甲基杆菌的密度是至少1个甲基杆菌/20平方微米的颗粒表面积。

60.组合物，其包含含有固体物质的发酵产物，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物在包含液相和固相的培养基中通过已经在所述固体物质上生长而附着于所述固体物质，以及其中所述发酵产物的甲基杆菌滴度是5x10⁸菌落形成单位/克固体至5x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克固体。

61.根据权利要求60所述的组合物，其中所述发酵产物包含由所述固体物质和液体形成的胶体。

62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述胶体是凝胶。

63.根据权利要求60所述的组合物，其中所述组合物还包含农业上可接受的佐剂和/或农业上可接受的赋形剂中的至少一种。

64.根据权利要求60所述的组合物，其中所述固体物质包含多个附着有甲基杆菌的颗粒。

65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述颗粒的平均长度或平均直径为2微米至1000微米。

66.根据权利要求64所述的组合物，其中所述颗粒的甲基杆菌滴度是5x10⁸菌落形成单位/克颗粒至1x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克颗粒。

67.根据权利要求60所述的组合物，其中所述固体物质是无生命的。

68.根据权利要求60所述的组合物，其中所述固体物质选自人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。

69.根据权利要求60所述的组合物，其中所述固体物质选自多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。

70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。

71.根据权利要求60所述的组合物，其中按量或类型计，所述组合物中至少95％的微生物是甲基杆菌。

72.根据权利要求60所述的组合物，其中所述组合物和/或所述固体物质还包含一种或多种特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。

73.根据权利要求60所述的组合物，其中所述固体物质包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。

74.根据权利要求60所述的组合物，其中所述固体物质不是光合微生物。

75.根据权利要求60所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种杀虫剂和/或至少一种抑制细菌的试剂。

76.根据权利要求75所述的组合物，其中所述杀虫剂选自杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂和杀细菌剂，其中将所述组合物施用于植物或植物部分时，与缺少所述杀虫剂的组合物相比，所述杀虫剂导致不超过50％的甲基杆菌生长的抑制。

77.根据权利要求60所述的组合物，其中所述组合物是具有5％或更低的含水量的基本上干燥的产物、所述固体物质与乳状液的混合物，或悬浮液。

78.根据权利要求60所述的组合物，其中所述固体物质上附着的甲基杆菌的密度是至少1个甲基杆菌/20平方微米的颗粒表面积。

79.用甲基杆菌处理植物或植物部分的方法，所述方法包括下述步骤：将权利要求60-78中任一项所述的组合物施用于所述植物或植物部分。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述植物部分是种子、茎、根、花、子叶、胚芽鞘、果实或叶。

81.根据权利要求79或80所述的方法，其中所述植物或植物部分是玉米、芸苔属种、苜蓿、水稻、黑麦、高粱、珍珠粟、黍稷、狐尾粟、龙爪粟、向日葵、红花、大豆、烟草、马铃薯、花生、棉花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、扁桃、甜菜、甘蔗、燕麦、大麦、番茄、生菜、绿豆、利马豆、豌豆、葫芦、观赏植物或针叶树植物或者植物部分。

82.根据权利要求79所述的方法，其中所述植物是玉米植物，所述部分是种子，以及所述组合物的施用量足以提供从经处理的种子长成的玉米植物中的玉米节根生长的增加。

83.根据权利要求79所述的方法，其中所述植物是玉米植物，所述部分是胚芽鞘和/或叶，以及所述组合物的施用量足以提供包含经处理的胚芽鞘和/或叶的玉米植物中的玉米节根生长的增加。

84.包含固体物质的组合物，其中甲基杆菌的单培养物或共培养物在包含液相和固相的培养基中通过已经在所述固体物质上生长而附着于所述固体物质，以及其中所述固体物质的甲基杆菌滴度是5x10⁸菌落形成单位/克固体至5x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克固体。

85.根据权利要求84所述的组合物，其中所述组合物包含胶体，其中所述固体物质分散在液相中。

86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述胶体是凝胶。

87.根据权利要求84所述的组合物，其中所述组合物还包含农业上可接受的佐剂和/或农业上可接受的赋形剂中的至少一种。

88.根据权利要求84所述的组合物，其中所述固体物质包含多个附着有甲基杆菌的颗粒。

89.根据权利要求88所述的组合物，其中所述颗粒的平均长度或平均直径为2微米至1000微米。

90.根据权利要求88所述的组合物，其中所述颗粒的甲基杆菌滴度是5x10⁸菌落形成单位/克颗粒至1x10¹³甲基杆菌菌落形成单位/克颗粒。

91.根据权利要求84所述的组合物，其中所述固体物质是无生命的。

92.根据权利要求84所述的组合物，其中所述固体物质选自人造材料、动物来源的材料、植物来源的材料、微生物来源的材料、真菌来源的材料、矿物来源的材料和它们的组合。

93.根据权利要求84所述的组合物，其中所述固体物质选自多糖、硅藻土、盐晶体和它们的组合。

94.根据权利要求93所述的组合物，其中所述多糖选自纤维质多糖、甲壳质多糖和半乳聚糖多糖。

95.根据权利要求84所述的组合物，其中按量或类型计，所述组合物中至少95％的微生物是甲基杆菌。

96.根据权利要求84所述的组合物，其中所述组合物和/或所述固体物质还包含一种或多种特性预先确定的非甲基杆菌的微生物。

97.根据权利要求84所述的组合物，其中所述固体物质包含农业上可接受的佐剂或农业上可接受的赋形剂。

98.根据权利要求84所述的组合物，其中所述固体物质不是存活的光合微生物。

99.根据权利要求84所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种杀虫剂和/或至少一种抑制细菌的试剂。

100.根据权利要求99所述的组合物，其中所述杀虫剂选自杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂和杀细菌剂，其中将所述组合物施用于植物或植物部分时，与缺少所述杀虫剂的组合物相比，所述杀虫剂导致不超过50％的甲基杆菌生长的抑制。

101.根据权利要求84所述的组合物，其中所述组合物是具有5％或更低的含水量的基本上干燥的产物、乳状液中所述固体物质与附着的甲基杆菌的混合物，或悬浮液。

102.根据权利要求84所述的组合物，其中所述固体物质上附着的甲基杆菌的密度是至少1个甲基杆菌/20平方微米的颗粒表面积。