KR100567274B1

KR100567274B1 - 단일 미생물에 의한 발효가능한 탄소원의1,3-프로판디올로의 생물 전환

Info

Publication number: KR100567274B1
Application number: KR1020047008388A
Authority: KR
Inventors: 리사 앤 라펜드; 바산타 나가라얀; 찰스 에드윈 나까무라
Original assignee: 이.아이,듀우판드네모아앤드캄파니; 제넨코 인터내셔날 인코포레이티드
Priority date: 1995-05-12
Filing date: 1996-05-10
Publication date: 2006-04-05
Also published as: IN189532B; CN1189854B; KR20040071157A; JPH11502718A; BR9608831A; CN102304551A; US7135309B1; WO1996035796A1; EP0826057A1; CN100506991C; CN1189854A; MX9708687A; ATE421588T1; KR19990014710A; US5686276A; CN101144086B; US6025184A; ES2320820T3; IL118169A; AU725012B2

Abstract

활성 글리세롤 또는 디올 데히드라타제 효소를 코딩하는 유전자를 함유한 미생물을 적당한 발효 조건 하에서 탄소 기질과 접촉시켜, 단일 생물체에 의해 탄소 기질을 1,3-프로판디올로 생물전환하는 방법이 제공된다.

글리세롤 데히드라타제, 디올 데히드라타제, 1,3-프로판디올, 생물전환방법

Description

단일 미생물에 의한 발효가능한 탄소원의 1,3-프로판디올로의 생물전환 {Bioconversion of a Fermentable Carbon Source to 1,3-Propanediol by a Single Microorganism}

도 1은 각각 컬럼 1, 2 및 4로 표지되어 있는 코스미드 pKP1, pKP2 및 pKP4의 제한 소화 (EcoR1, BamH 1, EcoR V 및 Not1) 및 0.8 % 아가로오즈 겔 전기영동 상에서의 분리를 보여준다. 분자 크기 마커는 마지막 레인에 로딩되었다. 숫자 1 및 2로 표지된 컬럼은 글리세롤 데히드라타제 효소를 포함하는 코스미드를 대표한다.

도 2는 pKP1의 부분적 물리 지도 및 DNA 서열을 기초로 한 유전자 위치를 보여준다. 유전자는 위스콘신대학의 서열 분석 소프트웨어에 의해 제공된 Tfasta 프로그램을 사용하여 젠뱅크 (Genbank) 데이터를 사용하여 추론된 전사해독프레임 (open reading frame) 비교를 통해 판별했다. (Genetics Computer Group, Verison 7, April, 1991, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)

<기술분야>

본 발명은 하나의 미생물에 의해 발효가능한 탄소원을 1,3-프로판디올로 생물전환하는 방법을 포함한다.

<배경기술>

1,3-프로판디올은 폴리에스테르 섬유의 제조와 폴리우레탄 및 시클릭 화합물의 제조에서 잠재적 유용성이 있는 단량체이다.

1,3-프로판디올의 여러 화학적 제조방법이 공지되어 있다. 예를 들면, 산화에틸렌이 포스핀, 물, 일산화탄소, 수소 및 산의 존재시 촉매 상에서 아크롤레인의 촉매적 용액상 수화 후 환원되어, 또는 글리세롤과 같은 탄화수소로부터 주기율표의 VIII족 원소를 갖는 촉매 상에서 일산화탄소 및 수소의 존재하에 반응하여 1,3-프로판디올로 전환될 수 있다. 이런 방법으로 1,3-프로판디올을 제조할 수 있지만 이 방법은 비용이 많이 들고 환경 오염물질을 함유한 폐유출물을 발생시킨다.

1,3-프로판디올이 글리세롤을 발효시켜 제조할 수 있다는 사실은 일세기 전부터 알려져 있었다. 1,3-프로판디올을 제조할 수 있는 박테리아 균주는 예를 들면, 시트로박터 (Citrobacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 엔트로박터 (Enterobacter), 일리오박터 (Ilyobacter), 클렙시엘라 (Klebsiella), 유산균 (Lactobacillus) 및 펠로박터 (Pelobacter) 군으로 밝혀졌다. 각각의 연구 사례에서, 글리세롤은 2 단계의 효소 촉매 반응을 거쳐 1,3-프로판디올로 전환된다. 첫 단계에서는 데히드라타제가 글리세롤에서 3-히드록시프로피온알데히드 (3-HP) 및 물로 전환되는 것을 촉매한다 (반응식 1). 제2 단계에서는, 3-HP가 NAD+-결합된 산화환원효소에 의해 1,3-프로판디올로 환원된다 (반응식 2). 1,3-프로판디올은 더이상 물질대사로 변환되지 않아, 결과적으로 고농도로 배지에 축적된다.

글리세롤 → 3-HP + H₂O

3-HP + NADH + H⁺ → 1,3-프로판디올 + NAD⁺

전체 반응에서는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD⁺)로 산화되는 환원된 β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH)가 보조인자의 형태로 1 환원 당량이 소비된다.

글리세롤로부터 1,3-프로판디올의 제조는 통상적으로 유일한 탄소원으로 글리세롤을 사용하는 혐기적 조건하에서 다른 외래 환원 당량 수용체가 없을 경우 일어난다. 이러한 조건하에서, 예를 들면, 시트로박터, 클로스트리듐 및 클렙시엘라의 균주에서 글리세롤에 대한 수평적 경로가 작동하는데, 이는 먼저 NAD⁺-(또는 NADP⁺-) 결합된 글리세롤 탈수소효소에 의해 글리세롤이 디히드록시아세톤 (DHA)로 산화되는 것을 포함한다 (반응식 3). DHA는 DHA 키나아제에 의해 인산화되어 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)로 된 후 (반응식 4), 해당과정 등을 통한 ATP 생성의 보조 및 생합성에 사용될 수 있게 된다. 1,3-프로판디올 경로와 반대로, 이 경로는 세포에 탄소와 에너지를 제공할 수 있으며, NADH를 소비하기보다는 생산한다.

글리세롤 + NAD⁺ → DHA + NADH + H⁺

DHA + ATP → DHAP + ADP

폐렴간균 (Klebsiella pneumoniae) 및 시트로박터 프로인디 (Citrobacter freundii)에서는, 글리세롤 데히드라타제 (dhaB), 1,3-프로판디올 산화환원효소 (dhaT), 글리세롤 탈수소효소 (dhaD) 및 디히드록시아세톤 키나아제 (dhaK)의 기능적으로 연결된 활성을 코딩하는 유전자들이 dha 레귤론으로 포괄된다. 시트로박터와 클렙시엘라에서 얻은 dha 레귤론을 대장균에서 발현시켰을 때 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시키는 것으로 나타났다.

글리세롤의 생물학적 제조 방법이 알려져 있다. 글리세롤 생산자중 압도적인 다수는 효모이지만, 일부 박테리아와 기타 곰팡이 및 조류 (藻類)도 또한 알려져 있다. 박테리아와 효모는 모두 해당과정 또는 EMP 경로 (Embden Meyerhof Parnas pathway)에서 프룩토오즈-1,6-비스포스페이트 경로를 통해 포도당 또는 다른 탄수화물을 전환시켜 글리세롤을 생산하는 반면, 어떤 조류는 엽록체에서 용해된 이산화탄소 또는 중탄산염을 칼빈 회로의 3-탄소 중간체로 전환한다. 일련의 단계에서, 3-탄소 중간체인 포스포글리세르산은 글리세랄데히드 3-포스페이트로 전환되고 이는 자신의 케토 이성질체인 디히드록시아세톤 포스페이트로 용이하게 상호전환되며 궁극적으로는 글리세롤로 용이하게 상호전환될 수 있다. 글리세롤과 1,3-프로판디올의 생물학적 제조 방법이 공지되어 있지만, 전체 공정이 하나의 생물체에 의해 수행될 수 있음이 증명된 적은 없다.

상기한 1,3-프로판디올 제조의 화학적 방법과 생물학적 방법은 모두 산업적 규모 제조에 별로 적합하지 않은데, 왜냐하면, 화학적 방법은 에너지 집약적이고, 생물학적 방법은 고가의 출발 물질인 글리세롤을 사용하기 때문이다. 저에너지 공급과 저가의 출발 물질을 필요로하는 방법이 필요하다. 더욱 바람직한 방법은 탄수화물 또는 당과 같은 기본 탄소원을 원하는 1,3-프로판디올 최종생성물로 전환하는 능력이 있는 미생물을 도입할 것이다.

글리세롤 또는 디히드록시아세톤 이외의 다른 발효가능한 탄소원을 1,3-프로판디올로 하나의 생물체에 의해 전환하는 것이 바람직하지만, 이러한 시도에는 극복해야할 상당한 난점이 있다는 것이 문헌에 기록된 바 있었다. 예를 들면, 고츠쇼오크 등의 유럽특허 제373 230호는 시트로박터 프로인디, 클로스트리듐 아우토부틸리쿰 (Clostridium autobutylicum), 클로스트리듐 부티리쿰 및 폐렴간균을 비롯한 1,3-프로판디올의 제조에 유용한 대부분의 균주의 증식은 과당 또는 포도당과 같은 수소 공여자가 있으면 방해를 받는다고 교시한다. 균주, 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 및 락토바실러스 부크너 (Lactobacillus buchner) 균주는 글리세롤과 과당 또는 포도당의 동시발효 (co-fermentation)에서 1,3-프로판디올을 생산하며, 글리세롤을 유일한 탄소원으로 공급받을 때는 성장하지 않으며, 휴지 세포는 포도당 또는 과당을 물질대사할 수 있는 것으로 증명되었지만, 이들은 1,3-프로판디올을 생산하지 않는다 (Veiga DA Cunha 등, J. Bacteriol. 174, 1013 (1992)). 이와 유사하게 일리오박터 폴리트로푸스 (Ilyobacter polytropus) 균주는 글리세롤과 아세테이트가 제공될 때 1,3-프로판디올을 생산하고 과당 및 포도당을 비롯한 글리세롤 이외의 탄소 기질로부터는 1,3-프로판디올을 생산하지 않을 것임이 밝혀져 있다 (Steib 등, Arch. Microbiol. 140, 139 (1984)). 마지막으로 문헌 [Tong 등, Appl. Biochem. Biotech. 34, 149 (1992)]는 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 dha 레귤론으로 형질전환된 재조합 대장균이 외래 글리세롤이 없는 경우 포도당 또는 크실로오즈로부터 1,3-프로판디올을 생산하지 않는다는 것이 교시되어 있다.

환원 등가물을 제공할 수 있는 보조 기질, 전형적으로는 발효가능한 당을 공정에 포함시켜 글리세롤로부터 1,3-프로판디올의 수율을 개선하려는 시도가 보고되었었다. 글리세롤 및 포도당을 동시발효시키는 시트로박터 프로인디 및 폐렴간균 DSM 4270의 휴지 세포에 대해서는 수율의 개선이 요구되어 왔지만 (Gottschalk 등. supra.; 및 Tran-Dinh 등., 독일특허 제3734 764호), 글리세롤 및 포도당을 동시발효시키는 폐렴간균 ATCC 25955의 증식 중인 세포에 대해서는 그렇지 않았는데, 이들은 1,3-프로판디올을 전혀 생산하지 않았다 [I-T. Tong, Ph.D. Thesis, University of Wisconsin-Madison (1992)]. 재조합 대장균에 의한 글리세롤과 포도당 또는 과당의 동시발효에 있어서 수율 증가가 보고되었지만, 글리세롤이 없으면 1,3-프로판디올이 생산되지 않았다 (Tong 등, supra). 이러한 계에서 하나의 생물체는 NADH 생성원으로 탄수화물을 사용하여 세포 유지 또는 증식에 필요한 에너지와 탄소를 공급한다. 이러한 밝혀진 사실들은 당이 1,3-프로판디올을 생산하 는 탄소 흐름으로 들어가지 않는다는 것을 의미한다. 어떠한 경우에도 외래의 글리세롤이 없다면 1,3-프로판디올은 생성되지 않는다. 따라서 이 문헌은 단일 생물체에 의해 탄수화물 원료로부터 1,3-프로판디올을 제조하는 것은 불가능하다는 것을 의미한다.

본 발명으로 해결하려는 문제는 포도당 또는 다른 당과 같은 저가의 탄소 기질로부터 단일 생물체에 의해 1,3-프로판디올을 생물학적으로 제조하는 것이다. 1,3-프로판디올의 생물학적 제조는 데히드라타제 효소 (전형적으로는 보조효소 B12-의존적 데히드라타제)가 글리세롤을 중간체인 3-히드록시프로피온알데히드로 전환한 후 이것이 NADH-(또는 NADPH) 의존적 산화환원효소에 의해 1,3-프로판디올로 환원되는 2 단계 연속 반응을 위한 기질로서 글리세롤을 필요로 한다. 보조인자 필요요건의 복잡성 때문에 1,3-프로판디올의 제조를 위해 이런 반응 순서를 이용하는 산업 공정에 완전한 세포 촉매 (whole cell catalyst)를 사용할 필요가 있다. 더욱이, 공정을 경제적으로 살아남을 수 있도록 하기 위해 글리세롤이나 디히드록시아세톤 보다는 저가의 공급 원료가 필요하다. 포도당 및 다른 탄수화물이 적당한 기질이지만, 상기한 바와 같이 이들은 1,3-프로판디올 제조를 억제하는 것으로 알려져 있다. 결과적으로 포도당을 1,3-프로판디올로 전환시키는 것으로 밝혀진 단일한 생물체는 없다.

본 출원인들은 상기한 문제를 해결했으며, 본 발명은 단일 생물체를 사용하여 발효가능한 탄소 원료를 1,3-프로판디올로 직접 생물전환하는 방법을 제공한다. 포도당은 모델 기질로 사용되며, 이 생물전환법은 임의의 기존 미생물에 응용할 수 있다. 데히드라타제 유전자를 갖고 있는 미생물은 양호한 수율과 선택도로 포도당 및 다른 당을 글리세롤 분해 경로를 통해 1,3-프로판디올로 전환할 수 있다. 또한, 본 발명은 통상적으로 1) 글리세롤, 2) 디히드록시아세톤, 또는 3) 글리세롤의 산화 상태의 C3 화합물 (예를 들면, 글리세롤 3-포스페이트) 또는 4) 디히드록시아세톤의 산화 상태의 C3 화합물 (예를 들면, 디히드록시아세톤 포스페이트 또는 글리세르알데히드 3-포스페이트)로 용이하게 전환될 수 있는 모든 탄소 기질을 포함하도록 응용될 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 데히드라타제 효소를 발현시킬 수 있는 유전자를 하나 이상 갖고 있는 단일 미생물을 탄소 기질과 접촉시킴으로써, 단일 미생물에 의해 탄소 기질을 1,3-프로판디올로 생물전환하는 방법을 포함한다. 미생물은 야생형이거나 또는 재조합 미생물 또는 미생물의 돌연변이체와 같이 유전적으로 변형된 것일 수 있다. 바람직하게는, 데히드라타제 효소는 글리세롤 데히드라타제 효소 또는 디올 데히드라타제 효소이다.

본 발명은 또한 상기 방법의 생성물을 포함한다.

본 발명은 또한 폐렴간균으로부터 분리된 약 35 kb의 DNA 단편을 포함하는 코스미드 (cosmid)를 포함하며, 여기서 상기 단편은 도 1의 컬럼 1 및 2와 같이 제한효소에 의해 소화되며, 활성 글리세롤 데히드라타제 효소를 코딩한다. 이 코스 미드는 미생물로 옮겨지면, 탄소 기질 특히 포도당을 1,3-프로판디올로 대사되도록 한다.

본 발명은 또한 숙주 미생물과 상기의 코스미드 또는 글리세롤 데히드라타제 효소 이외의 활성 기능 단백질을 코딩하는 상기의 코스미드의 DNA 단편을 포함하는 형질전환된 미생물을 포함한다.

본 발명은 또한 적당한 조건 하에서, 데히드라타제 효소를 발현할 수 있는 유전자를 하나 이상 갖고 있는 단일 미생물을 글리세롤과 접촉시켜 1,3-프로판디올을 제조하는 생물전환 방법을 포괄하며, 이때 미생물은 아스페르길러스 (Aspergillus), 사카로마이시즈 (Saccharomyces), 지고사카로마이시즈 (Zygosaccharomyces), 피키아 (Pichia), 클루이베로마이시즈 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula), 데바리오마이시즈 (Debaryomyces), 무코르 (Mucor), 토룰롭시스 (Torulopsis), 메틸로박터 (Methylobacter), 살모넬라 (Salmonella), 간균 (Bacillus), 스트렙토마이시즈 (Streptomyces) 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 (屬)에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.

본 발명은 또한 적당한 조건 하에서, 데히드라타제 효소를 발현할 수 있는 유전자를 하나 이상 갖고 있는 단일 미생물을 탄소 기질과 접촉시켜 1,3-프로판디올을 제조하는 생물전환 방법을 포괄하며, 상기 유전자는 글리세롤 데히드라타제를 코딩하며 클렙시엘라 (Klebsiella), 유산균 (Lactobacillus), 엔테로박터 (Enterobacter), 시트로박터 (Citrobacter), 펠로박터 (Pelobacter), 일리오박터 (Ilyobacter) 및 클로스트리듐 (Clostridium) 속 (屬)에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 분리된 것이다.

본 발명은 또한 적당한 조건 하에서, 데히드라타제 효소를 발현할 수 있는 유전자를 하나 이상 갖고 있는 단일 미생물을 탄소 기질과 접촉시켜 1,3-프로판디올을 제조하는 생물전환 방법을 포괄하며, 상기 유전자는 글리세롤 데히드라타제를 코딩하며 클렙시엘라 (Klebsiella) 및 살모넬라 (Salmonella) 속 (屬)에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 분리된 것이다.

바람직한 숙주 미생물은 시트로박터 (Citrobacter), 엔테로박터 (Enterobacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 클렙시엘라 (Klebsiella), 에로박터 (Aerobacter), 유산균 (Lactobacillus), 아스페르길러스 (Aspergillus), 사카로마이시즈 (Saccharomyces), 지고사카로마이시즈 (Zygosaccharomyces), 피키아 (Pichia), 클루이베로마이시즈 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hansenula), 데바리오마이시즈 (Debaryomyces), 무코르 (Mucor), 토룰롭시스 (Torulopsis), 메틸로박터 (Methylobacter), 에쉐리히아 (Escherichia), 살모넬라 (Salmonella), 간균 (Bacillus), 스트렙토마이시즈 (Streptomyces) 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 속에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명을 실현하는 재조합 미생물은 하기 “생물 기탁의 간단한 설명”에서 설명한다.

생물 기탁의 간단한 설명 및 서열 리스팅

글리세롤 데히드라타제 효소를 코딩하는 클렙시엘라 게놈 일부를 포함하는 코스미드 pKP1을 포함하는 형질전환된 대장균 DH5α는 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 1995년 4월 18일 기탁되었고 ATCC 69789로 지정되었다. 디올 데히드라타제 효소를 코딩하는 클렙시엘라 게놈 일부를 포함하는 코스미드 pKP4를 포함하는 형질전환된 대장균 DH5α는 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 1995년 4월 18일 기탁되었고 ATCC 69790으로 지정되었다. dhaB 오페론을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 균주 PAO 2845:pDT9는 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 1996년 4월 11일 기탁되었고 ATCC 55760으로 지정되었다. dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaT 유전자를 위한 발현 카세트를 포함하는 비복제형 플라스미드로 형질전환된 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주 MSP42.81은 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 1996년 4월 11일에 기탁되었고 ATCC 74363으로 지정되었다. dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaT 오페론을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 사카로마이시즈 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae) 균주 pMCK1/10/17(HM)#A는 본 국제 출원의 출원 전에 1996년 5월 9일 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 기탁되었고 ATCC 74370으로 지정되었다. dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaT 오페론을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 스트렙토마이시즈 리비단스 (Streptomyces lividans) 균주 SL/14.2를 본 국제 출원의 출원 전에 1996년 5월 9일 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 기탁했고 ATCC 98052로 지정되었다. dhaB1, dhaB2 및 dhaB3 오페론을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 리케니포르미스균 (Bacillus licheniformis) 균주 BG188/pM26 (클론 #8)는 본 국제 출원의 출원 전에 1996년 5월 9일 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 기탁되었고 ATCC 98051로 지정되었다. dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaT 오페론을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 고 초균 (Bacillus subtilis) 균주 BG2864/pM27 (클론 #1)은 본 국제 출원의 출원 전에 1996년 5월 9일 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 기탁되었고 ATCC 98050으로 지정되었다. dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaT 오페론을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 아스페르길러스 니거 (Aspergillus niger) 균주 TGR40-13은 본 국제 출원의 출원 전에 1996년 5월 9일 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 기탁되었고 ATCC 74369로 지정되었다. “ATCC”는 미국 20852 메릴랜드주 록빌, 파크로운 드라이브 12301에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection) 국제 기탁기관을 의미한다. 수탁번호는 기탁된 물질의 수납 번호를 의미한다.

본 발명자들은 “특허 출원에서 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 표준 표현을 위한 규칙”(OJ EPO 12/1997에 대한 부록 제2호에 공개되어 있는 EPO 청장의 결정에 따른 부칙 I 및 II) 및 37 C.F.R. 1.821-1.825 및 부록 A 및 B (핵산 및(또는) 아미노산 서열을 포함하는 출원 공개를 위한 요건)을 준수하여 46개의 서열을 제공한다.

<발명의 상세한 설명>

본 발명은 단일 생물체에서 발효가능한 탄소원으로부터 1,3-프로판디올의 생물학적 생산을 위한 방법을 제공한다. 그 방법에서는 데히드라타제 효소를 갖는 미생물이 사용되며, 이 미생물이 탄소 기질과 접촉하여 생성된 1,3-프로판디올을 증식 배지로부터 분리한다. 단일 생물체는 야생형 생물체이거나 또는 데히드라타제 효소를 코딩하는 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 생물체일 수 있다.

본 발명의 방법은 폴리에스테르 및 기타 중합체의 제조에 유용한 1,3-프로판 디올 단량체의 신속하고 환경적으로 신뢰할 수 있는 저가의 원료를 제공한다.

본원에서 사용된 하기 용어가 청구의 범위 및 명세서의 이해를 위해 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 “핵산”은 당, 포스페이트 및 퓨린 또는 피리미딘을 포함하는 단량체 (뉴클레오타이드)로 이루어진 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 큰 분자이다. “핵산 단편”은 주어진 핵산 분자의 일부이다. 고등 식물에서 데옥시리보핵산 (DNA)은 유전 물질이며, 리보핵산 (RNA)이 DNA에서 단백질로의 정보 전달에 관여한다. “게놈 (genome)”은 생물체의 각 세포에 포함된 유전 물질 전체이다. 용어 “뉴클레오타이드 서열”은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 DNA 또는 RNA 중합체를 의미하는 것으로서, 임의로는 DNA 또는 RNA 중합체에 혼입될 수 있는 합성, 비천연 또는 변형된 뉴클레오타이드 염기를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 “본질상 유사한 (essentially similar)”은 코딩된 아미노산의 변화는 유발하지 않는 염기 변화를 포함할 수 있는 유전자 서열을 가리키거나 또는 아미노산을 하나 이상 변화시킬 수는 있으나 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질의 기능성에 영향을 주지 않는 염기 변화를 포함하는 DNA 서열을 가리킨다. 따라서 본 발명은 구체적인 예시 서열보다 더 많은 서열을 포괄하는 것으로 이해된다. 또한, 생성되는 단백질 분자의 기능적 성질에는 실질적인 영향을 주지 않는 침묵 (silent) 변화를 유발하는 서열의 변형, 예컨데 서열에서의 결실, 삽입 또는 치환 등도 예상된다. 예를 들면, 유전자 코드의 축퇴를 반영하거나 특정 위치에서 화학적으로 동등한 아미노산을 제조하는 유전자 서열의 변화를 생각할 수 있다. 즉, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 글리신과 같은 또다른 덜 소수성인 잔기 또는 발린, 루이신 또는 이소루이신과 같이 더욱 소수성인 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환될 수 있다. 이와 유사하게, 아스파르트산을 글루탐산으로 치환하는 것과 같이 음으로 대전된 잔기를 음으로 대전된 다른 잔기로 치환하거나, 리신을 아르기닌으로 치환하는 것과 같이 양으로 대전된 잔기를 음으로 대전된 다른 잔기로 치환하는 결과를 내는 변화도 생물학적으로 동등한 생성물을 제조하는 것으로 예상할 수 있다. 단백질 분자중 N-말단 및 C-말단 일부의 변경을 초래하는 뉴클레오타이드 변화도 또한 단백질의 활성에 영향을 주지 않을 것이다. 몇 가지 경우에, 사실상 단백질의 생물학적 활성의 변화에 대한 영향 연구를 위해 서열 변이를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 각각의 제안된 변형은 당분야에서 정례화된 기술에 포함되는 것으로서 코딩된 생성물이 생물학적 활성을 보유하는 지를 확인하는 기술이다. 더욱이, 당분야의 숙련가들은 본 발명이 포괄하는 “본질상 유사한” 서열이 본원에 예시된 서열과 엄격한 조건 (0.1X SSC, 0.1 % SDS, 65 ℃) 하에 혼성화되는 그들의 능력에 의해 정의된다는 것을 인식하고 있을 것이다.

“유전자 (gene)”는 코딩 부위의 선행 (5' 비코딩) 및 후행 (3' 비코딩) 조절 서열을 포함하는, 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 가리킨다. “천연” 또는 “야생형” 유전자는 자기자신의 조절 서열을 가진 자연에서 발견된 유전자를 가리킨다.

용어 “유전적으로 변형된 또는 유전적으로 변형된 미생물”이란 본 발명에 사용되기에 적합한 모든 미생물로서, 미생물의 천연 유전적 기관의 변화를 경험한 것이다. 미생물은 이종(異種) 핵산 단편을 포함하는 벡터로 형질전환되거나 돌연변이 유발원 (예를 들면, UV광, 에탄술폰산)으로 돌연변이로 되거나 또는 세포 게놈의 안정적 변화를 유발하는 임의의 다른 방법에 의해 유전적으로 변형될 수 있다.

용어 “제작물”이란 임의의 공급원으로부터 유도된, 플라스미드, 바이러스, 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파아지 또는 뉴클레오타이드 서열로서, 선형 또는 환형의 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA을 가리키는 뜻이며, 여기서 많은 뉴클레오타이드 서열은 적당한 3' 비번역 서열과 함께 프로모터 단편 및 선택된 유전자 생성물을 위한 DNA 서열을 세포내로 도입할 수 있는 단일한 구조로 연결되고 재조합된다.

용어 “형질전환” 또는 “트랜스펙션”은 핵산의 도입 후에 세포에서 새로운 유전자가 획득됨을 가리킨다. 획득된 유전자는 염색체 DNA로 통합되거나 또는 염색체외의 복제 서열로 도입될 수 있다. 용어 “형질전환체 (transformant)”는 형질전환의 생성물을 가리킨다. “유전적으로 변형된”이란 용어는 형질전환 또는 돌연변이에 의해 유전성 물질을 변화시키는 과정을 의미한다.

“발현”이란 용어는 유전자 생성물의 서열을 코딩하는 유전자로부터 유전자 생성물로의 전사 및 번역을 의미한다.

본원에 사용된 용어 “플라스미드” 또는 “벡터” 또는 “코스미드”는 세포의 중심적 물질대사의 일부는 아닌 유전자를 운반하는 염색체외의 요소로 통상적으로 환형 이중 가닥 DNA 분자 형태이다.

용어 “데히드라타제 효소”는 글리세롤 분자를 이성질화하거나 변형하여 3-히드록시프로피온 알데히드를 생성할 수 있는 임의의 효소를 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 데히드라타제 효소는 각각 바람직한 기질이 글리세롤과 1,2-프로판디올인 글리세롤 데히드라타제와 디올 데히드라타제를 포함한다.

용어 “탄소 기질” 또는 “탄소원 (carbon source)”은 글리세롤 또는 디히드록시아세톤을 제외한 탄소 원자 1 개 이상을 포함하는 기질로서 미생물에 의해 물질대사될 수 있는 모든 탄소 공급원을 의미한다.

재조합 생물체의 제작:

탄소 기질을 1,3-프로판디올로 전환시키는 효소적 경로를 코딩할 필수적인 유전자를 갖는 재조합 생물체는 당분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 제작될 수 있다. 본 발명에서는 데히드라타제 효소를 코딩하는 유전자를 클렙시엘라와 같은 천연 숙주에서 분리하여 대장균 숙주 균주 DH5α, ECL707 및 AA200을 형질전환시키는 데 사용하였다.

박테리아 게놈으로부터 원하는 유전자를 얻는 방법은 평이하며 분자생물학 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 유전자 서열이 알려져 있는 경우에는 적당한 게놈 라이브러리를 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 만들 수 있으며, 원하는 유전자 서열에 상보적인 탐침자로 스크리닝할 수 있다. 일단 서열을 분리하면 DNA를 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (미국특허 제4,683,202호)과 같은 표준 프라이머 유도 증폭 방법을 사용하여 증폭시켜 적당한 벡터를 사용하여 형질전환시키기에 적합한 양의 DNA를 얻을 수 있다.

다르게는, 코스미드 라이브러리를 만들고 여기의 게놈 DNA의 큰 조각들 (35 내지 45 kb)을 벡터로 팩킹하여 적당한 숙주를 형질전환시키는 데 사용할 수 있다. 코스미드 벡터는 다량의 DNA를 수용할 수 있는 유일한 벡터이다. 통상적으로 코스미드 벡터는 외래 DNA의 팩킹과 뒤이은 환형화에 필요한 cos DNA 서열 복제본 하나 이상을 갖고 있다. cos 서열 이외에도 이러한 벡터는 ColE1과 같은 복제 개시점 및 암피실린 또는 네오마이신에 저항성을 띄는 유전자와 같은 약물 저항성 마커도 포함할 수 있다. 적당한 박테리아 숙주의 형질전환을 위해 코스미드 벡터를 사용하는 방법은 본원에 참고로 도입되어 있는 문헌 [Sambrook, J 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 잘 기재되어 있다.

코스미드를 클로닝하는 데 있어서 전형적으로는 적당한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 외래 DNA를 분리하고 코스미드 벡터의 cos 부위에 가깝게 결합시킨다. 이어서 선형 외래 DNA를 포함한 코스미드 벡터를 박테리오파아지 λ와 같은 DNA 팩킹 비히클과 반응시킨다. 팩킹 과정 중에 cos 위치를 자르고 외래 DNA를 박테리아의 바이러스 입자의 헤드 부분으로 팩킹한다. 그 다음 이러한 입자를 대장균과 같은 적당한 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 데 사용한다. 일단 세포로 주입되면, 외래 DNA는 cos 점착성 말단 (sticky end)의 영향으로 환형이 된다. 이러한 방식으로 외래 DNA의 큰 조각들이 재조합 숙주 세포에 도입되어 발현될 수 있다.

본 발명의 맥락에서 1,3-프로판디올로 글리세롤을 가공할 수 있는 유전자를 갖는 것으로 알려진 박테리아 속 (屬)으로부터 게놈 DNA의 큰 조각을 클로닝하는데 코스미드 벡터 및 코스미드 형질전환 방법을 사용했다. 구체적으로는, 폐렴간균에서 얻은 게놈 DNA를 당분야에 잘 알려진 방법으로 분리하고 제한효소 Sau3A로 소화시켜 코스미드 벡터 슈퍼코스 (Supercos) 1^TM 내로 삽입하고 기가팩 (Gigapack) II 팩킹 추출물을 사용하여 팩킹했다. 벡터를 제작한 후 대장균 XL1-블루 MR 세포를 코스미드 DNA로 형질전환시켰다. 글리세롤이 있는 상태에서 세포를 증식시키고 1,3-프로판디올 생성 여부에 대해 배지를 분석함으로써 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환할 수 있는 능력이 있는 지에 관해 형질전환체를 스크리닝했다.

1,3-프로판디올 양성 형질전환체 두 개를 분석해 냈고, 그 코스미드를 pKP1 및 pKP2로 이름붙였다. DNA 서열분석 (sequencing) 결과, C. 프로인디로부터 얻은 글리세롤 데히드라타제 유전자에 대한 광범위한 상동성이 드러났으며, 이는 이들 형질전환체가 글리세롤 데히드라타제 유전자를 코딩하는 DNA를 포함했다는 것을 증명한다. 다른 1,3-프로판디올 양성 형질전환체를 분석해 냈고, 이 코스미드를 pKP4 및 pKP5로 이름붙였다. DNA 서열분석을 통해 이들 코스미드가 디올 데히드라타제 유전자를 코딩하는 DNA를 보유함을 입증했다.

본 발명은 클렙시엘라 코스미드 내로부터 분리된 유전자를 사용하지만, 데히드라타제 유전자의 다른 공급원으로는 시트로박터, 클로스트리디아 및 살모넬라 등을 들 수 있으나 이들로 국한되는 것은 아니다.

1,3-프로판디올의 제조에 긍정적으로 영향을 줄 다른 유전자는 적당한 숙주에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 야생형 세포에서 일반적으로 발견되는 수준보 다 훨씬 높은 수준으로 글리세롤 분해 경로 및(또는) 다른 경로의 특정 효소를 과발현시키는 것이 매우 바람직할 수 있다. 이는 강력한 유도성 또는 구성적 (constitutive) 프로모터하에 이들 유전자를 배치하거나 멀티카피 플라스미드 내로 이들 효소를 코딩하는 유전자를 선택적으로 클로닝함으로써 수행할 수 있다. 원하는 단백질을 과발현시키는 방법은 통상적이고 분자생물학 분야에 잘 알려져 있으며, 그 예를 삼브룩 (Sambrook)의 앞의 책에서 발견할 수 있다. 더욱이, 당분야에의 숙련가들에게 알려진 방법에 의해 특정 유전자에 특이적 결실을 일으켜 1,3-프로판디올 제조에 긍정적인 영향을 줄 수 있을 것이다. 그러한 방법의 예는 문헌 [Methods in Enzymology, 제217권, R. Wu 편집자, Academic Press: 산디에고 (1993)]에서 찾을 수 있다.

돌연변이체:

예시된 세포이외에, 본 방법은 1,3-프로판디올의 제조를 개선할 의도로 특이적으로 설계된 하나의 또는 다수의 돌연변이를 가진 세포를 사용할 수 있을 것이다. 일반적으로 탄소 공급 원료를 비생산적 경로로 우회시키거나 또는 상당한 이화물질 억제를 보이는 세포는 돌연변이가 되어 이들 표현형 결함을 피할 수 있다. 예를 들면, 많은 야생형 세포는 배지 내의 포도당 및 부산물로부터 이화물질 억제를 받으며, 포도당 억제에 내성이 있어서 1,3-프로판디올을 생성할 수 있는, 이들 야생형 생물체의 돌연변이 균주가 특히 본 발명에 유용한 것으로 예상된다.

돌연변이체를 만드는 방법은 일반적이며, 당분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 야생형 세포는 방사선 또는 화학적 돌연변이 유발제와 같은 다양한 작용제에 노출된 후 원하는 표현형을 스크리닝할 수 있다. 방사선을 통해 돌연변이를 일으키는 경우에는 자외선 (UV) 또는 이온화 방사선을 사용할 수 있다. 유전적 돌연변이에 적당한 단파 UV 파장은 200 nm 내지 300 nm의 범위에 속하며, 254 nm가 바람직하다. 이러한 파장의 UV선은 원칙적으로 핵산 서열에서 구아닌 및 시토신을 아데닌 및 티민으로 변화시킨다. 모든 세포는 대부분의 UV 유도 돌연변이를 교정할 수 있는 DNA 수복 (repair) 메카니즘이 있기 때문에 카페인 및 다른 억제제와 같은 약물을 첨가하여 수복 과정을 억제하여 효과적인 돌연변이의 수를 최대화할 수 있다. 300 nm 내지 400 nm 범위의 빛을 사용하는 장파 UV 돌연변이도 가능하지만 DNA와 상호작용하는 소랄렌 (psoralen) 염료와 같은 다양한 활성제와 병용하지 않는다면 일반적으로 단파 UV광만큼 효과적이지 못하다.

화학적 작용제로 돌연변이를 유발하는 것도 효과적이며, 일반적으로 사용되는 물질로는, 프레임쉬프트 (frameshift) 돌연변이를 유발하는 것으로 유명한 아크리딘 염료와 같이 DNA 복제에 영향을 주는 약물뿐만 아니라 HNO₂ 및 NH₂OH와 같이 DNA 복제에 영향을 주지 않는 화학물질을 들 수 있다. 방사선 또는 화학적 약물을 사용해서 돌연변이를 일으키는 특정한 방법은 당분야에 잘 문서화되어 있다. 예를 들면 본원에 참고로 도입되어 있는 문헌 [Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 제2판 (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.] 또는 문헌 [Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227 (1992)]을 참조한다.

돌연변이가 발생한 후, 원하는 표현형을 가진 돌연변이체를 각종 방법으로 선택할 수 있다. 무작위 스크리닝 (random screening)은 돌연변이 세포를 원하는 생성물 또는 중간체를 생산할 수 능력에 따라 선택하는 가장 일반적인 방법이다. 다르게는, 단지 내성있는 콜로니만 성장할 수 있는 선택 배지에서 돌연변이된 집단을 증식시켜 돌연변이체를 선택적으로 분리할 수 있다. 돌연변이체 선택 방법은 고도로 발달했으며, 산업 미생물학 분야에 잘 알려져 있다. 문헌 브록 (Brock)의 앞의 책과 문헌 [DeMancilha 등, Food Chem., 14, 313, (1984)]을 참조한다.

1,3-프로판디올 제조 경로에서 돌연변이 및 형질전환

대표적인 효소 경로

포도당으로부터 1,3-프로판디올의 생산을 아래의 일련의 단계를 통해 수행할 수 있다. 이러한 일련의 단계는 당분야의 숙련가들에게 알려진 많은 경로들을 대표한다. 포도당은 해당과정의 효소에 의해 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP) 및 3-포스포글리세르알데히드 (3-PG)로 일련의 단계에서 전환된다. 그 다음 글리세롤은 DHAP에서 히드록시아세톤 (DHA)으로 가수분해되고 환원되어 형성되거나 또는 DHAP가 글리세롤 3-포스페이트 (G3P)로 환원된 후 가수분해되어 형성된다. 가수분해 단계는 재조합에 의해 숙주로 도입될 수 있는, 기질이나 활성이 특이적이지 않은 것으로 알려진 모든 세포내 포스파타아제에 의해 촉매될 수 있다. 환원 단계는 NAD+ (또는 NADP+) 결합 숙주 효소에 의해 촉매되거나 활성이 재조합에 의해 숙주로 도입될 수 있다. dha 레귤론이 반응식 3의 가역 반응을 촉매하는 글리세롤 탈수소효소 (E.C. 1.1.1.6)를 포함하고 있음은 주목할 만하다.

<반응식 1>

글리세롤 → 3-HP + H2O

<반응식 2>

3-HP + NADH + H⁺ → 1,3-프로판디올 + NAD⁺

<반응식 3>

글리세롤 + NAD⁺ → DHA + NADH + H⁺

글리세롤은 상기에 자세하게 기재한 바와 같이 중간체 3-히드록시-프로피온알데히드 (3-HP)를 통해 1,3-프로판디올로 전환된다. 중간체 3-HP는 재조합에 의해 숙주로 도입될 수 있거나 또는 숙주에 코딩되어 있을 수 있는 데히드라타제 효소에 의해 반응식 1에서처럼 글리세롤로부터 제조된다. 이 데히드라타제는 글리세롤 데히드라타제 (E.C. 4.2.1.30), 디올 데히드라타제 (E.C. 4.2.1.28) 또는 이 변형을 촉매할 수 있는 임의의 다른 효소일 수 있다. 디올 데히드라타제는 아니지만 글리세롤 데히드라타제는 dha 레귤론에 의해 코딩된다. 1,3-프로판디올은 NAD+- (또는 NADP+) 결합 숙주 효소에 의해 또는 재조합에 의해 숙주로 도입될 수 있는 활성에 의해 반응식 2에서처럼 3-HP로부터 제조된다. 1,3-프로판디올의 제조에서 이 마지막 반응은 1,3-프로판디올 탈수소효소 (E. C. 1.1.1.202) 또는 다른 알코올 탈수소효소에 의해 촉매될 수 있다.

탄소 순환에 영향을 주는 돌연변이 및 형질전환

1,3-프로판디올 제조 경로에 변이를 포함하는 각종 돌연변이 생물체가 본 발 명에 유용할 것이다. 예를 들면, 트리오즈포스페이트 이성질화효소 돌연변이 (tpi ^- )를 본 발명의 미생물에 도입하는 것은 예를 들면, 탄소 순환에 의해 기능을 향상시키는 돌연변이의 사용례이다. 돌연변이는 효소 활성을 손상시키거나 또는 개선시키기 위해 구조 유전자에 대해 유발되거나 또는 효소 활성의 발현 수준을 조정하기 위해 조절 유전자에 대해 유발될 수 있다.

다르게는, 형질전환 및 돌연변이가 합해져서 1,3-프로판디올 제조의 개선을 위해 특정 효소 활성을 조절할 수 있다. 따라서, 1,3-프로판디올의 제조 증가를 유발하는 완전한 세포 촉매의 변형도 본 발명의 범위내에 포함된다.

배지 및 탄소 기질

본 발명에서 발효 배지는 적당한 탄소 기질을 함유해야 한다. 적당한 기질에는 포도당 및 과당과 같은 단당류, 락토오즈 또는 수크로오즈와 같은 올리고당, 녹말 또는 셀룰로오즈와 같은 다당류, 또는 이들의 혼합물 및 치즈 유장 투과물, 콘스팁 (cornsteep)액, 당 사탕무 당밀, 및 맥아 (barley malt)와 같은 재생 공급원료로 만든 정제되지 않은 혼합물이 포함되지만 이들로 국한되는 것은 아니다. 또한 탄소 기질은 이산화탄소, 또는 메탄올과 같이 중요한 생화학적 중간체로 대사적 전환이 증명된 바 있는 1-탄소 기질일 수도 있다. 1-탄소원 (예를 들면, 메탄올, 포름알데히드 또는 포르메이트)로부터 글리세롤 제조는 메틸을 양분으로하는 (methylotrophic) 효모 [K. Yamada 등, Agric. Biol. Chem., 53(2) 541-543, (1989)] 및 박테리아 [Hunter 등, Biochemistry, 24, 4148-4155 (1985)]에서 보고 된 바 있었다. 이러한 생물체는 산화 상태가 메탄 내지 포르메이트 범위인 1-탄소 화합물을 동화시켜 글리세롤을 제조할 수 있다. 탄소 동화 경로는 리불로오즈 모노포스페이트, 세린 또는 크실룰로오즈-모노포스페이트를 통할 수 있다 [Gottschalk, Bacterial Metabolism, 제2판, Springer-Verlag: New York (1986)]. 리불로오즈 모노포스페이트 경로는 리불로오즈-5-포스페이트와 포르메이트를 축합시켜 6탄당인 과당을 형성하며, 결과적으로는 3탄당 생성물 글리세롤-3-포스페이트를 형성한다. 마찬가지로 세린 경로는 1탄소 화합물을 메틸렌테트라히드로폴레이트를 통해 해당 경로로 동화시킨다.

1탄당 및 2탄당 탄소 기질이외에도, 메탄을 양분으로하는 생명체는 또한 메틸아민, 글루코사민 및 대사 활성을 위한 각종 아미노산과 같은 많은 다른 탄소 함유 화합물을 이용하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 메탄을 양분으로 하는 효모는 메틸아민으로부터 탄소를 이용하여 트레할로오즈 또는 글리세롤을 형성한다 [Bellion 등, Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 제7판 (1993), 415-32. 편집자(들): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. 편찬자: Intercept, Andover, UK]. 이와 유사하게 여러 칸디다 (Candida) 종은 알라닌 또는 올레산을 물질대사할 것이다 [Sulter 등, Arch. Microbiol. (1990), 153(5), 485-9]. 따라서, 본 발명에 사용되는 탄소원은 광범위하게 다양한 탄소 함유 기질을 포괄할 수 있으며 생물체를 선택함으로써만 제한할 수 있을 것이다.

상기한 탄소 기질 전부와 이들의 혼합물이 본 발명에 적합하다고 예상될 지라도 바람직한 탄소 기질은 포도당, 과당, 수크로오즈 또는 메탄올이다.

적당한 탄소원 이외에, 발효 배지에는 당분야의 숙련자에게 알려진, 1,3-프로판디올 제조에 필요한 효소 경로의 촉진과 배양물의 증식에 적합한 적당한 무기물, 염, 보조인자, 완충제 및 다른 화합물이 포함되어야 한다. Co(II) 염 및(또는) 비타민 B12 또는 이들의 전구체에는 특별한 주의가 있어야 한다.

배양 조건:

전형적으로 세포는 적당한 배지에서 30 ℃에서 증식시킨다. 바람직한 본 발명에서 증식 배지는 루리아 버타니 (Luria Bertani) (LB)액, 사보우라우드 덱스트로오즈 (Sabouraud Dextrose) (SD)액 또는 이스트 (Yeast) 배지 (YM)액과 같은 시판되는 배지이다. 다른 한정 (defined) 배지 또는 합성 증식 배지도 또한 사용될 수 있으며 특정 미생물의 증식에 적합한 배지가 미생물 또는 발효과학 분야의 숙련자에 의해 알려져 있을 것이다. 직접 또는 간접적으로 이화물질 억제를 조절하는 것으로 알려진 약물, 예를 들면 시클릭 아데노신 2':3'-모노포스페이트를 사용하는 것이 반응 배지에 도입될 수도 있다. 이와 유사하게, 효소 활성을 조절하여 1,3-프로판디올 제조를 증진시키는 약물 (예를 들면, 메틸 비올로젠; methyl viologen)은 유전자 조작에 대한 대안으로서 또는 유전자 조작과 병용하여 사용될 수 있다.

발효에 적당한 pH 범위는 pH 5.0 내지 pH 9.0 사이이고 pH 6.0 내지 pH 8.0이 초기 조건으로서 바람직하다.

반응은 호기성 또는 혐기성 조건하에서 수행할 수 있으며, 혐기성 또는 미량 호기성 (microaerobic) 조건이 바람직하다.

배치식 및 연속식 발효:

본 발명은 배치식 발효 방법을 사용한다. 고전적인 배치 발효는 배지 조성물이 발효의 초기에 설치되고 발효 동안에 인위적으로 교체시키지 않는 닫힌 계이다. 따라서 발효의 초기에 배지를 원하는 생물체 또는 생물체(들)로 접종하고 발효를 일으키고 아무것도 계에 첨가하지 않는다. 그러나, 전형적으로 “배치” 발효는 탄소원의 첨가를 1회분으로 처리하는 것이고 pH 및 산소 농도와 같은 요소를 때때로 조절하여야 한다. 배치계에서 계의 대사산물 및 생물량 조성물은 발효가 정지되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 배치 배양물 내에서, 세포는 정적 잠복기 (static lag phase)에서 고증식 대수기 (log phase)로 조절되고 마지막으로 증식률이 감소하거나 정지한 정지기 (stationary phase)로 변화해 간다. 만약 처리를 하지 않으면, 정지기의 세포는 사실상 죽을 것이다. 대수기의 세포는 통상적으로 최종 생성물 또는 중간체의 대부분을 제조한다.

표준 배치계를 변형시킨 것이 페드-배치계 (Fed-Batch system)이다. 페드-배치 발효 공정도 또한 본 발명에 적합하며, 발효가 진행될 때 기질을 증가분으로 첨가하는 것을 제외하면 전형적인 배치계로 이루어진다. 페드-배치계는 이화물질 억제가 세포의 대사를 억제하기 용이한 경우에 유용하며, 배지에서 기질의 양을 한정하는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 페드-배치계에서 실질적인 기질 농도의 측정은 어렵기 때문에 pH, 용존 산소 및 CO₂와 같은 폐기 가스의 분압 등의 측정가능한 인자의 변화를 기준으로 평가한다. 배치 및 페드-배치 발효는 통상적이며 당분야에 잘 알려진 것으로서 사례를 브록 (Brock)의 앞의 책에서 찾을 수 있다.

본 발명을 배치식으로 수행한다고 할 지라도 연속 발효 방법으로 개조될 수 있을 것으로 예상된다. 연속 발효는 한정 (defined) 발효 배지를 바이오리액터에 연속적으로 첨가하고 동량의 조절 배지 (conditioned media)를 가공을 위해 동시에 제거하는 열린 계이다. 연속 발효는 통상적으로 세포가 주로 대수기 증식 상태에 있는 일정한 고밀도로 배양물을 유지한다.

연속 발효에서는 세포 증식 또는 최종 생성물 농도에 영향을 주는 인자 하나 또는 임의의 수를 조절할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 방법은 탄소원과 같은 제한적 영양물질 또는 질소 수준을 고정된 비율로 유지하고 모든 다른 변수의 조절이 가능하도록 하는 것이다. 다른 계에서는, 배지 탁도에 의해 특정된 세포 농도는 일정하게 유지되는 반면 증식에 영향을 주는 많은 인자는 연속적으로 변화될 수 있다. 연속계는 정지 상태 증식 조건을 유지하려하며 따라서 배지 회수에 기인한 세포 손실은 발효에서 세포 성장률에 대해 균형을 이뤄야 한다. 연속 발효 공정을 위한 영양물질 및 성장 인자를 조절하는 방법은 생성물 생성률을 최대화하는 기술과 마찬가지로 산업 미생물 분야에 잘 알려져 있으며, 여러가지 방법이 브록 (Brock)의 앞의 책에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명은 배치, 페드-배치 또는 연속 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 공지된 모든 발효 방법이 적합할 것이라는 것을 생각할 수 있다. 또한 세포는 완전한 세포 촉매로서 기판 상에 고정될 수 있고 1,3-프로판디올 제조를 위한 발효 조건에 처해질 수 있다.

1,3-프로판디올 확인 및 정제:

발효 배지로부터의 1,3-프로판디올 정제 방법은 당분야에 알려져 있다. 예를 들면, 프로판디올은 반응 혼합물을 유기 용매로 추출하고, 증류하고 컬럼 크로마토그래피 (미국특허 제5,356,812호)시켜 세포 배지로부터 얻을 수 있다. 이 방법을 위해 특히 양호한 유기 용매는 시클로헥산 (미국특허 제5,008,473호)이다.

1,3-프로판디올은 배지를 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분석하여 직접 확인할 수 있다. 본 발명에서 바람직한 방법은 이동상 0.01 N 황산을 사용하여 분석 이온 교환 컬럼 상에서 이소크래틱형 (isocratic fashion)으로 발효 배지가 분석되는 방법이다.

세포:

본 발명에서 적합한 세포는 데히드라타제 효소를 갖고 있는 세포로 이루어진다. 적합한 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있으며, 활성 데히드라타제 효소를 발현시킬 수 있는 이들의 능력에 의해서만 제한될 것이다. 특히 본 발명에서 유용한 세포는 대규모 발효 방식에 용이하게 적응할 수 있는 것이다. 그러한 생물체는 생물가공산업 분야에 잘 알려져 있으며 그 예는 문헌 [Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications, Murooka 등 편, Marcel Dekker, Inc., New York (1994)]에서 찾을 수 있으며, 발효성 박테리아 뿐만 아니라 효모 및 섬유상 곰팡이를 포괄한다. 전형적으로 효소는 각각 글리세롤이나 1,2-프로판디올에 대한 기질 특이성이 있는 글리세롤 데히드라타제 또는 디올 데히드라타제일 것이다. 데히드라타제 효소는 글리세롤을 히드록시프로피온알데히드 (3-HPA)로 전환시킬 수 있으며 이는 이어서 1,3-프로판디올로 전환된다. 이 경로를 갖는 세포에는 시트로박터, 엔테로박터, 클로스트리듐, 클렙시엘라, 살모넬라 및 유산균 속에 속하는 돌연변이된 또는 재조합 생물체가 포함될 수 있다. 발효를 통해 글리세롤을 제조하는, 당분야의 숙련자에 의해 공지된 미생물, 예를 들어 아스페르길러스, 사카로마이시즈, 지고사카로마이시즈, 피키아, 클루이베로마이시즈, 칸디다, 한세눌라, 두날리엘라, 데바리오마이시즈, 무코르, 토릴롭시스 및 메틸로박테리아는 재조합 데히드라타제 효소를 위한 숙주일 수 있다. 본 발명에서 숙주로서 적합한 다른 세포는 간균, 에쉐리히아, 슈도모나스 및 스트렙토마이시즈를 포함한다. 이론적으로 한정하려는 것은 아니지만, 상기한 군에 속하는, 본 발명에 적합한 생명체는 자연에 존재한다고 믿어진다.

본 출원인들의 실험적 연구를 기초로 하면 광범위하게 다양한 세포가 본 발명에 사용될 수 있다고 생각된다. 본 출원인들은 유전적 조성 및 표현형 조성에서 광범위하게 다양한 세포가 적당한 탄소 기질을 1,3-프로판디올로 생물전환시킬 수 있다는 것을 증명했다. 예시된 세포는 dha 유전자를 갖는 폐렴간균 돌연변이 균주, 글리세롤 또는 디올 데히드라타제를 코딩하는 유전자가 있는 클렙시엘라 게놈의 성분을 포함하는 대장균 균주 및 클렙시엘라 게놈의 성분으로 트랜스펙트되고 트리오즈포스페이트 이성질화 효소를 코딩하는 유전자에서 돌연변이를 갖는 대장균 (tpi ^-) 균주를 포함한다.

폐렴간균으로부터 얻은 dha 레귤론을 갖는 대장균 형질전환체가 포도당 및 크실로오스의 존재하에 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환할 수 있다고 하더라도 [Tong 등, Appl. Biochem. Biotech., 34, 149 (1992)] 포도당만 단독으로 존재하는 상태에서는 이들 생물체에 의해 제조된 아무런 1,3-프로판디올이 검출되지 않았다. 이런 개시 내용과 완전 반대로, 본 출원인들은 폐렴간균으로부터 얻은 dha 레귤론을 포함하는 독립적으로 분리된 두 개의 코스미드 중 하나를 포함하는 3 가지 대장균 균주는 외부에서 첨가된 글리세롤이 전혀 없는 상태에서도 포도당의 공급으로부터 1,3-프로판디올을 제조함을 발견했다. 폐렴간균 dha 레귤론을 포함하는 코스미드 벡터 pKP-1 또는 pKP-2를 갖는 대장균 균주 ECL707은 외부에서 첨가된 글리세롤이 없는 상태에서 포도당으로부터 1,3-프로판디올의 많지 않은, 그러나 검출가능한 정도의 제조를 보였다 (실시예 4). 코스미드 벡터 pKP-1 또는 pKP-2를 포함하며 다른 숙주 생물체로부터 제작된 재조합 대장균 균주인 DH5α는 적당한 조건하에서 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 제조하는 데 있어서 ECL707 재조합체보다 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다 (실시예 3). 실시예 4의 조건하에서 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 제조하는 데 가장 효과적인 균주는 코스미드 벡터 pKP-1 또는 pKP-2를 포함하는 재조합 대장균 균주 AA200이었다 (실시예 2). 대장균 균주 AA200은 결함있는 트리오즈포스페이트 이성질화효소 (tpi ^-)를 갖고 있다.

형질전환 반응으로부터 얻은 독립적인 분리물 (independent isolate) 풀로부터 추가 연구를 위해 선택된 AA200-pKP1 균주는 두 단계의 반응으로 포도당을 1,3-프로판디올로 전환했다. 첫 단계에서 AA200-pKP1-5 균주는 포도당 및 글리세롤이 없는 상태에서 높은 세포 밀도로 증식되었다. 두번째 단계에서는 포도당을 포함하 고 글리세롤은 포함하지 않는 배지에 현탁된 증식된 세포가 높은 전환율과 선택도로 포도당을 1,3-프로판디올로 전환시켰다 (실시예 5). 면역화학, 크로마토그래피 및 유전학적으로 다를 지라도 보조효소 B₁₂-의존적 효소들인 글리세롤 데히드라타제 (E.C. 4.2.1.30) 및 디올 데히드라타제 (E.C. 4.2.1.28)는 글리세롤이 3-히드록시프로피온알데히드로 전환되는 것을 촉매한다. 디올 데히드라타제는 아니지만 글리세롤 데히드라타제는 dha 레귤론으로 포위된다. 글리세롤 데히드라타제는 아니지만 디올 데히드라타제를 포함하는 폐렴간균 ATCC 8724는 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환한다 Forage 등, J. Bacteriol., 149, 413, (1982). 재조합 대장균 균주 ECL707 및 AA200은 디올 데히드라타제를 코딩하는 유전자를 포함한 코스미드 벡터 pKP4를 갖고 있기 때문에 포도당을 1,3-프로판디올로 전환했다 (실시예 2 및 실시예 4).

자연적으로 발생한 균주로부터 돌연변이를 일으켜 제조한 폐렴간균 ECL2106 Ruch 등, J. Bacteriol. 124, 348 (1975)는 dha 레귤론의 항속적 발현을 보인다 Ruch 등의 앞의 책; Johnson 등, J. Bacteriol. 164, 479 (1985). 동일한 표현형을 보이는, 폐렴간균 ATCC 25955로부터 유도된 균주는 유사하게 제조되었다 Forage 등, J. Bacteriol. 149, 413 (1982). 클렙시엘라 dha 구조 유전자의 발현은 부분적으로 억제제 (dha R의 생성물)에 의해 조절된다 Sprenger 등. J. Gen Microbiol. 135, 1255 (1989). 본 출원인들은 dha 구조 유전자에 대해 항속적 (constitutive) ECL2106는 외부에서 첨가된 글리세롤이 없는 상태에서 포도당의 공급으로부터 1,3- 프로판디올을 제조했다 (실시예 6). 이는 동일한 조건 하에서 검출가능한 수준의 1,3-프로판디올을 제조하지 않았던 야생형 폐렴간균 ATCC 25955와 상반된다 (실시예 6).

ECL2106에서 dha 구조 유전자의 발현은 추가로 이화물질 억제에 의해 조절된다 [Sprenger 등, J Gen Microbiol. 135, 1255 (1989)]. C. 프로인디로부터 얻은 1,3-프로판디올 산화환원효소 (dhaT) 및 K. 옥시토카 (oxytoca) ATCC 8724로부터 얻은 디올 데히드라타제에 대해 증명되었듯이 이화물질 억제는 필요한 구조 유전자를 다른 프로모터의 조절하에 배치함으로써 제거할 수 있다 [Daniel 등, J. Bacteriol. 177, 2151 (1995) 및 Tobimatsu 등, J. Biol. Chem. 270, 7142 (1995)]. ECL2106으로부터 이화물질 억제를 이런 식으로 제거함으로써 글리세롤의 외부 공급원이 없는 상태에서 포도당으로부터 1,3-프로판디올 제조를 개선한다. 또한 tpi ^- 돌연변이에 대해 예를 들어 설명한 바와 같이 적당한 탄소 순환에 의해 추가로 개선시킨다.

시트로박터 및 클렙시엘라 종의 dha 레귤론은 두드러지게 유사하게 때문에 당분야의 숙련자는 클렙시엘라 종에 있어서 외부의 글리세롤 공급원이 없는 상태에서 포도당으로부터 1,3-프로판디올 제조와 관련된 기재내용을 시트로박터 종에게도 마찬가지로 적용할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, C. 부틸리쿰 (butyricum)에 의해 글리세롤의 물질대사가 폐렴간균과 비교했을 때 [Zeng 등., Biotechnol. and Bioeng. 44, 902 (1994)] 교훈은 클로스트리디아 종에게도 마찬가지로 확대될 것이 다.

실시예

공통 방법

인산화, 결합 (ligation) 및 형질전환 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 하기의 실시예에서 사용하기 적합한 기술은 문헌 [Sambrook, J 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 잘 기재되어 있다.

박테리아 배양물의 유지 및 증식에 적합한 물질 및 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 하기의 실시예에 사용하기 적합한 기술은 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg 및 G. Briggs Phillips, 편), American Scociety for Microbiology, Washington, DC. (1994) 또는 Thomas D. Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 제2판 (1989) Sinauer Associates. Inc., 미국 매사추세츠주 선더랜드 소재]에서 발견할 수 있다. 박테리아 세포의 증식 및 유지에 사용되는 모든 시약과 물질은 별도의 지시가 없는한 알드리치 케미칼스 (Aldrich Chemicals) (미국 위스콘신주 밀워키 소재), DIFCO 연구소 (미국 미시간주 디트로이트 소재), GIBCO/BRL (미국 메릴랜드주 가이터스부르그 소재) 또는 시그마 케미칼 캄파니 (Sigma Chemical Company) (미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 얻은 것이다.

약자의 의미는 다음과 같다: “시 (hr)”는 시간을 의미하며, “분 (min)” 은 분을 의미하며, “초 (sec)”는 초를 의미하고, “일 (d)”은 일 (日)을 의미하며, “ml”은 밀리리터를 의미하고, “ℓ”는 리터를 의미하며, 50amp는 암피실린 50 ㎍/ml이고 LB-50amp는 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유한 루리아-버티니 브로쓰이다.

표 안에는 다음의 약자가 사용되었다. “Con”은 전환율이고, “Sel”은 탄소를 기준으로한 선택도이고 “nd”은 검출되지 않음을 의미한다.

효소 분석

기질로서 1,2-프로판디올을 사용하여 세포 유리 추출물중의 글리세롤 데히드라타제 활성을 결정했다. 메틸벤조-2-티아졸론 히드라존과 알데히드의 반응을 기준으로한 분석이 문헌 [Forage 및 Foster, Biochem. Biophys. Acta, 569, 249 (1979)]에 기재되어 있다. 때때로 1,3-프로판디올 탈수소효소로 명명되는 1,3-프로판디올 산화환원효소의 활성은 문헌 [Johnson 및 Lin, J. Bacteriol., 169, 2050 (1987)]에 기재되어 있는 바와 같이 1,3-프로판디올 및 NAD⁺를 기질로서 사용하는 판 겔에서 또는 용액에서 결정했다.

1,3-프로판디올의 분리 및 판별

글리세롤에서 1,3-프로판디올로의 전환은 HPLC로 관찰했다. 분석은 크로마토그래피 분야의 숙련자에게 유용한 물질 및 표준 기술을 사용하여 수행했다. 한가지 적합한 방법은 UV (210 nm) 및 RI 검출을 사용하는 Waters Maxima 820 HPLC 시스템을 사용했다. 샘플을 Shodex SH-1011P 예비컬럼 (6 mm x 50 mm)이 장착되고 온도가 50 ℃로 조절되며, 이동상을 0.5 ml/분의 유속으로 0.01 N H2SO4를 사용하는 Shodex SH-1011 컬럼 (8 mm x 300 mm, 미국 매사추세츠주 밀포드에 소재한 워터스 (Waters) 판매)으로 주입했다. 정량 분석이 필요한 경우 샘플은 외부 표준으로서 트리메틸아세트산의 공지된 양을 써서 제조했다. 전형적으로 글리세롤 (RI 검출), 1,3-프로판디올 (RI 검출) 및 트리메틸아세트산 (UV 및 RI 검출)의 체류 시간 (retention time)은 각각 20.67 분, 26.08 분 및 35.03 분이었다.

1,3-프로판디올 제조는 GC/MS로 확인했다. GC/MS 분야의 숙련자에게 유용한 재료 및 표준 기술을 사용하여 분석했다. 한 적당한 방법은 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) 5971 시리즈 질량 선택 검출기 (EI) 및 HP-INNOWax 컬럼 (길이 30 m, 내경 0.25 mm, 필름 두께 0.25 μ)이 짝을 이루는 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) 5890 시리즈 II 기체 크로마토그래피를 사용했다. 생성된 1,3-프로판디올의 체류 시간 및 질량 스펙트럼을 확실한 1,3-프로판디올 (m/e: 57,58)의 그것과 비교했다.

GC/MS의 다른 방법은 샘플의 기원과 관계되어 있다. 샘플 (예를 들면, 배양 상층물)의 1.0 ml에 진한 (70 % v/v) 과염소산 30 ㎕을 첨가했다. 혼합한 후, 샘플을 냉각하고 동결건조했다. 이 동결건조된 물질에 1 : 1의 비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 : 피리딘 (300 ㎕) 혼합물을 첨가하고 격렬하게 혼합하고 1 시간 동안 65 ℃에 놓아두었다. 샘플을 원심분리하여 불용성 물질을 제거했다. 생성된 액체는 두 개의 상으로 나뉘고 이들 중 상층물을 분석에 사용했다. 샘플을 DB-5 컬럼 (48 m, 내경 0.25 mm, 필름 두께 0.25 ㎛; J&W Scientific 제공) 상에서 크로마토그래피를 실시하고 배양 상층물로부터 얻은 1,3-프로판디올 유도체 의 체류 시간 및 질량 스펙트럼을 확실한 표준으로부터 얻은 것과 비교했다. TMS-유도된 1,3-프로판디올의 질량 스펙트럼은 205, 177, 130 및 115 AMU의 특징적 이온을 포함한다.

폐렴간균 코스미드 라이브러리 제작

폐렴간균 (ATCC 25955)는 37 ℃에서 8 시간 동안 폭기시키면서 100 ml LB 배지에서 증식시켰다. 박테리아 (튜브당 25 ml)를 실온에서 듀폰 소르발 (DuPont Sorvall) GLC 2.B 원심분리기에서 15 분 동안 3,000 rpm으로 원심분리시켰다. 박테리아는 펠렛화되었다. 상층물을 가만히 따랐다. 박테리아 세포 펠렛을 -20 ℃에서 냉동시켰다. 하기에 약술한 바와 같이 DNA 절단을 피하기 위해 특별히 주의를 기울여 염색체 DNA를 분리했다 (즉, 볼텍싱 (vortexing)은 피함). 하나의 튜브의 박테리아를 50 mM 트리스-10 mM EDTA 2.5 ml에 재현탁시키고 리소짐 (1 mg/ml) 500 ㎕를 첨가했다. 펠렛을 온화하게 재현탁시키고 현탁액을 15 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 나트륨 도데실 술페이트를 첨가하여 최종 농도가 0.5 %가 되게했다. 이를 통해 용액을 맑게했다. 프로티나제 K (50 ㎍/ml)를 첨가하고 현탁액을 55 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 튜브를 꺼내어 얼음 중탕으로 옮기고 염화나트륨을 최종 농도가 0.4 M이 되도록 첨가했다. 이 액체에 2배 부피의 에탄올을 첨가했다. 유리 튜브를 경계면까지 삽입하고 DNA를 부드럽게 감았다. DNA를 70 % 에탄올이 들어있는 튜브에 담갔다. 진공 건조한 후, DNA를 물 500 ㎕로 재현탁시키고 DNA 농도를 분광법으로 결정했다. 희석시킨 DNA 일부를 0.5 % 아가로오즈 겔에 흐르도록 하여 DNA의 손상되지 않은 성질을 결정했다.

염색체 DNA를 삼브룩 (Sambrook) 등의 앞의 책에 약술되어 있는 바와 같이 Sau3A로 부분적으로 소화시켰다. DNA (2 ㎍)를 총부피 200 ㎕로 실온에서 2 유닛의 Sau3A (Promega 제품, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 소화시켰다. 0, 5, 10 및 20 분에, 샘플 (50 ㎕)을 꺼내어 EDTA 5 μmol이 들어있는 튜브로 옮겼다. 이들 튜브를 10 분 동안 70 ℃에서 인큐베이션시켰다. 일부 (2 ㎕)를 덜어 0.5 % 아가로오즈 겔 전기영동 상에서 분석하여 소화 정도를 확인하고 나머지 샘플 (48 ㎕)을 -20 ℃에서 보관했다. 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고 UV하에서 비춰보아 염색체 DNA의 부분 소화를 확인했다. 시간이 지남에 따라 염색체 DNA의 크기 감소가 관찰되었으며, 이는 염색체 DNA 크기 감소가 Sau3A의 작용에 기인한 것임을 증명한다. 표준 프로토콜 방법 (삼브룩 등의 앞의 책)으로 나머지 샘플에서 DNA를 추출했다.

슈퍼코스 (Supercos) 코스미드 벡터 키트 및 스트라타진 (Stratagene)사 (미국 캘리포니아주 라졸라 소재)에서 시판하는 시약을 사용하는 기가팩 (Gigapack) II 팩킹 추출물을 사용하여 폐렴간균으로부터 부분적으로 소화된 DNA의 코스미드 라이브러리를 제조했다. 제조자가 제공하는 지시를 따랐다. 팩킹된 폐렴간균은 대장균 XL1-Blue MR을 트랜스펙션시켜 결정한 결과 4 x 104 내지 1.0 x 105의 파아지 적정 농도를 포함했다.

코스미드 DNA를 대장균 형질전환체 6 개로부터 분리한 결과 큰 DNA 삽입체 (25 내지 30 kb)를 포함하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 1

1,3-프로판디올 발현을 위한 코스미드 DNA를 이용한 대장균 숙주 세포의 형질전환 및 클로닝

배지

합성 S12 배지를 사용하여 1,3-프로판디올을 제조하는 능력이 있는 박테리아 형질전환체를 스크리닝했다. S12 배지에는 10 mM 황산암모늄, 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.0), 2 mM MgCl₂, 0.7 mM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 1 μM FeCl ₃, 1 μM ZnCl, 1.7 μM CuSO₄, 2.5 μM CoCl₂, 2.4 μM Na₂MoO₄ 및 2 μM 티아민 히드로클로라이드가 포함되어 있다.

증식 및 발효에 사용되는 배지 A는 10 mM 황산암모늄; 50 mM MOPS/KOH 완충액, pH 7.5; 5 mM 인산칼륨 완충액, pH 7.5; 2 mM MgCl₂; 0.7 mM CaCl₂; 50 μM MnCl₂; 1 μM FeCl₃; 1 μM ZnCl; 1.72 μM CuSO₄; 2.53 μM CoCl₂; 2.42 μM Na₂MoO₄; 2 μM 티아민 히드로클로라이드; 0.01 % 효모 추출물; 0.01 % 카사미노산; 0.8 ㎍/ml 비타민 B₁₂; 및 50amp를 포함한다. 필요한 경우 0.2 % 글리세롤 또는 0.2 % 글리세롤 + 0.2 % D-포도당으로 배지 A를 보강했다.

세포:

K. 에로겐 (aerogene) 또는 에로박터 에로겐으로 문헌에 알려진 폐렴간균 ECL2106 [Ruch 등, J. Bacteriol., 124, 348 (1975)]을 E. C. C. Lin (미국 매사추세츠주 캠브리지 하버드 의대)로부터 얻어서 실험실 배양으로 유지했다.

폐렴간균 ATCC 25955는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (미국 메릴랜드주 록빌 소재)으로부터 구입했다.

대장균 DH5α를 Gibco/BRL로부터 구입하고 폐렴간균 ATCC 25955로부터 분리한, 글리세롤 또는 디올 데히드라타제 효소를 코딩하는 유전자를 함유한 코스미드 DNA로 형질전환시켰다. 글리세롤 데히드라타제 유전자를 함유한 코스미드는 pKP1 및 pKP2로 판명되었고 디올 데히드라타제 효소 유전자를 포함하는 코스미드는 pKP4로 판명되었다. 형질전환된 DH5α 세포는 DH5α-pKP1, DH5α-pKP2 및 DH5α-pKP4로 밝혀졌다.

대장균 ECL707 Sprenger 등, J. Gen. Microbiol., 135, 1255 (1989)은 E. C. C. Lin (미국 매사추세츠주 캠브리지 하버드 의대)로부터 얻고 폐렴간균에서 얻은 코스미드 DNA로 유사하게 형질전환시켰다. 이들 형질전환체는 글리세롤 데히드라타제 유전자를 갖는 ECL707-pKP1 및 ECL707-pKP2와 디올 데히드라타제 유전자를 갖는 ECL707-pKP4로 판명되었다.

tpi 유전자에 돌연변이가 있는 대장균 AA200 Anderson 등, J. Gen Microbiol., 62, 329 (1970)을 대장균 제네틱 스톡 센터 (E. coli Genetic Stock Center, 미국 코네티컷주 뉴헤이븐 예일대학 소재)로부터 구입해서 클렙시엘라 코스미드 DNA로 형질전환시켜 글리세롤 데히드라타제 유전자를 갖는 재조합 유기체 AA200-pKP1 및 AA200-pKP2와 디올 데히드라타제 유전자를 갖는 재조합 유기체 AA200-pKP4를 얻었다.

DH5α:

폐렴간균 DNA로 트랜스펙션된 대장균 XL1-Blue MR 콜로니 약 1,000 개를 포함한 형질전환 플레이트 6 개를 5 ml의 LB 배지로 세척하여 원심분리했다. 박테리아가 펠렛화되었고 이를 5 ml LB 배지 + 글리세롤로 재현탁시켰다. 일부 (50 ㎕)를 0.2 % 글리세롤 + 400 ng/ml 비타민 B₁₂ + 0.001 % 효모 추출물 + 50 amp가 포함된 S12 합성 배지가 들어있는 15 ml 튜브로 접종했다. 튜브를 꼭대기까지 배지로 채우고 파라필름으로 씌우고 30 ℃에서 인큐베이션시켰다. 약간의 탁도가 48 시간 후에 관찰되었다. 생성물 분포를 알아보기 위해 78 시 및 132 시에 상기한 바와 같이 분석된 일부는 1,3-프로판디올에 대해 양성이었고 132 시에서는 1,3-프로판디올의 증가된 양이 함유되어 있었다.

1,3-프로판디올 제조에 대해 양성 반응을 보인 박테리아를 연속적으로 희석하여 LB-50amp 플레이트에 깔아 하나의 콜로니를 분리했다. 48개의 단일 콜로니를 분리하고 1,3-프로판디올의 제조에 대해 다시 검사했다. 코스미드 DNA를 6 개의 독립 클론으로부터 분리하고 이것으로 대장균 균주 DH5α를 형질전환시켰다. 형질전환체를 1,3-프로판디올 제조에 대해 다시 검사했다. 두 개의 형질전환체를 추가로 골라내고 DH5α-pKP1 및 DH5α-pKP2로 지정했다.

pIBI31 (IBI Biosystem, 미국 코네티컷주 뉴헤이븐 소재)로 서브클로닝된, pKP1으로부터 12.1 kb EcoRI-SalI 단편을 서열분석했고 pHK28-26 (서열 1)로 명명했다. 서열분석으로 글리세롤 데히드라타제 및 조절에 필요한 유전자를 코딩하는 dha 오페론의 적합한 전사해독프레임 (open reading frame)의 위치를 밝혔다. 서 열 1을 참조하면, 디히드록시아세톤 키나아제를 코딩하는 dhaK를 위한 전사해독프레임의 단편은 염기 1 내지 399에서 밝견되었고 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 dhaD를 위한 전사해독프레임은 염기 983 내지 2107에서 발견되었고, 리프레서 (repressor)를 코딩하는 dhaR를 위한 전사해독프레임은 염기 2209 내지 4134에서 발견되었고, 1,3-프로판디올 산화환원효소를 코딩하는 dhaT를 위한 전사해독프레임은 염기 5017 내지 6180에서 발견되었고, α-서브유닛 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 dhaB1를 위한 전사해독프레임은 염기 7044 내지 8711에서 발견되었고, β-서브유닛 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 dhaB2를 위한 전사해독프레임은 8724 내지 9308에서 발견되었고 γ-서브유닛 글리세롤 데히드라타제를 코딩하는 dhaB3를 위한 전사해독프레임은 염기 9311 내지 9736에서 발견되었고, 미지의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 dhaBX를 위한 전사해독프레임은 염기 9749 내지 11572에서 발견되었다.

폐렴간균으로부터 얻은 팩킹된 코스미드 DNA로 트랜스펙션된 대장균 XL1-Blue MR의 단일 콜로니로 200 ㎕의 S15 배지 [10 mM 황산암모늄, 50 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0), 50 mM MOPS/KOH 완충액 (pH 7.0), 2 mM MgCl₂, 0.7 mM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 1 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl, 1.72 μM CuSO₄, 2.53 μM CoCl ₂, 2.42 μM Na₂MoO₄ 및 2 μM 티아민 히드로클로라이드] + 0.2 % 글리세롤 + 400 ng/ml 비타민 B₁₂ + 0.001 % 효모 추출물 + 50 ㎍/ml 암피실린이 들어있는 마이크로타이터 (microtiter) 웰을 접종하였다. 마이크로타이터 웰 이외에 LB-50 amp를 함유한 마 스터 플레이트도 접종했다. 96 시간 후, 100 ㎕을 뽑아내어 0.2 μ 나일론 막 필터를 포함하는 라이닌 마이크로퓨즈 (Rainin microfuge) 튜브에서 원심분리했다. 박테리아를 남겨두고 여액을 HPLC로 분석했다. 약 240 콜로니를 스크리닝한 후 1,3-프로판디올 제조를 보이는 양성 클론을 판별했다. 3 개의 양성 클론이 판별되었고 이들 중 2 개는 LB-50amp에서 증식시키고 다른 하나는 그렇지 않았다. LB-50amp에서 증식시키고 1,3-프로판디올의 제조가 입증된 두 개의 양성 클론 중 하나로부터 분리한 하나의 콜로니를 pKP4로 지정했다. 코스미드 DNA를 pKP4 갖는 대장균 균주로부터 분리하고 대장균 균주 DH5α를 형질전환시켰다. DH5α-pKP4로 지정된 독립 형질전환체는 1,3-프로판디올을 제조하는 것으로 증명되었다.

ECL707:

대장균 균주 ECL707을 pKP1, pKP2, pKP4에 상응하는 코스미드 폐렴간균 DNA 및 슈퍼코스 벡터 단독으로 형질전환하고, 이를 ECL707-pKP1, ECL707-pKP2, ECL707-pKP4 및 ECL707-sc로 각각 명명했다. ECL707은 ATP-의존적 글리세롤 키나아제, NAD⁺-결합된 글리세롤 탈수소효소 및 포스포에놀피루베이트 의존적 포스포트랜스퍼라제계의 디히드록시아세톤을 위한 효소 II를 각각 코딩하는 glpK, gld, 및 ptsD에 결함이 있다.

LB-50amp 플레이트에서 분리된, 각 코스미드로 형질전환된 20개의 단독 콜로니 및 슈퍼코스 벡터만으로 (음성 대조구) 형질전환된 5 개의 콜로니를 마스터 LB-50amp 플레이트로 옮겼다. 이들을 데히드라타제 활성을 갖는 지를 알아보기 위해 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환시키는 이들의 능력에 대해서 시험했다. 형질전환체를 멸균 이쑤시개로 0.2 % 글리세롤 또는 0.2 % 글리세롤 + 0.2 % D-포도당이 보강된 배지 A 200 ㎕가 들어있는 마이크로타이터 플레이트로 옮겼다. 30 ℃에서 48 시간 동안 인큐베이션한 후, 마이크로타이터 플레이트 웰의 내용물을 0.45 μ 나일론 필터를 통해 여과하고 HPLC로 크로마토그래피를 실시했다. 이 시험의 결과를 표 1에 나타냈다.

형질전환된 ECL707에 의한 글리세롤에서 1,3-프로판디올로의 전환율: 양성 분리체의 수/시험한 분리체의 수

형질전환체	글리세롤	글리세롤 + 포도당
ECL707-pKP1	19/20	19/20
ECL707-pKP2	18/20	20/20
ECL707-pKP4	0/20	20/20
ECL707-sc	0/5	0/5

AA200:

대장균 균주 AA200를 pKP1, pKP2, pKP4에 상응하는 코스미드 폐렴간균 DNA 및 슈퍼코스 벡터 단독으로 형질전환하고, 이들을 각각 AA200-pKP1, AA200-pKP2, AA200-pKP4 및 AA200-sc로 각각 명명했다. 균주 AA200은 트리오즈포스페이트 이성질화효소에 결함이 있다 (trp-).

각 코스미드로 형질전환된 20 개의 단독 콜로니와 빈 벡터 (데히드라타제 효소를 코딩하는 유전자가 결여된 벡터)로 형질전환된 5 개의 콜로니를 분리하고 대장균 균주 ECL707에 대해 상기한 바와 같이 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하는 능력이 있는지에 관해 시험했다. 시험 결과를 표 2에 나타내었다.

형질전환된 AA200에 의한 글리세롤에서 1,3-프로판디올로의 전환율: 양성 분리체의 수/시험한 분리체의 수

형질전환체	글리세롤	글리세롤 + 포도당
AA200-pKP1	17/20	17/20
AA200-pKP2	17/20	17/20
AA200-pKP4	2/20	16/20
AA200-sc	0/5	0/5

실시예 2

데히드라타제 활성을 갖는 폐렴간균 DNA로 형질전환된 대장균 균주 AA200에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환

0.5 내지 1.0 mM의 시클릭 아데노신 2':3'-모노포스페이트 (cAMP)를 더하거나 뺀 10 ㎍/ml 카나마이신 및 0.2 % D 포도당으로 보강한 실시예 1에서 정의한 바와 같은 배지 (배지 A 약 14 ml)로 가득 채운 시럽 유리병을 폐렴간균 dha 레귤론 코스미드 pKP1 또는 pKP2, 폐렴간균 pdu 오페론 pKP4을 포함하거나 또는 슈퍼코스 벡터만을 포함하는 대장균 균주 AA200의 선택된 단독 콜로니 분리체를 써서 접종시켰다. 글리세롤과 접촉을 피하기 위해, 동일한 배지의 액체 배양물로부터 또는 LB-50amp의 아가 플레이트로부터 접종을 수행했다. 반응을 250 rpm으로 진탕시키면서 30 ℃에서 약 72 시간 동안 인큐베이션시켰다. 600 nm에서 흡광도 변화를 통해 증식을 측정했으며, 초기 OD₆₀₀은 0.020 AU였다. 포도당 소모량과 생성물 분포를 HPLC를 통해 측정했다. 단독 콜로니 분리체를 숫자로 접미사 (-“X”)를 매겨, 예를 들면 AA200-pKP1-x와 같이 나타냈다. 누적된 결과를 표 3과 4에 나타내었다.

대장균 균주 AA200에 의한 0.2 % D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환: cAMP 부재

형질전환체	OD₆₀₀	[1,3-프로판디올] (mM)	농도 (%)	선택도 (%)
AA200-pKP1-3	0.056	0.05	17	1
AA200-pKP1-5	0.115	nd	0
AA200-pKP1-5	0.007	nd	0
AA200-pKP1-5	0.076	0.2	14	5
AA200-pKP1-20	0.116	nd	27	0
AA200-pKP1-20	0.205	0.3	17	8
AA200-pKP2-10	0.098	0.2	13	7
AA200-pKP2-14	0.117	0.5	17	14
AA200-pKP2-14	0.129	0.2	19	5
AA200-pKP2-20	0.094	nd	11	0
AA200-pKP4-4	0.198	0.1	28	2
AA200-pKP4-19	0.197	0.2	34	3
AA200-pKP4-20	0.206	0.1	38	1
AA200-sc-1	0.097	nd	22	0
AA200-sc-1	0.176	nd	46	0

대장균 균주 AA200에 의한 0.2 % D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환: cAMP 사용

형질전환체	OD₆₀₀	[1,3-프로판디올] (mM)	농도 (%)	선택도 (%)
AA200-pKP1-3	0.102	0.5	19	12
AA200-pKP1-5	0.088	1.5	21	37
AA200-pKP1-5	0.236	1.4	24	28
AA200-pKP1-5	0.071	0.8	15	23
AA200-pKP1-20	0.153	nd	40	0
AA200-pKP1-20	0.185	0.9	27	16
AA200-pKP2-10	0.098	0.2	13	7
AA200-pKP2-14	0.213	2.0	26	27
AA200-pKP2-14	0.155	0.6	25	12
AA200-pKP2-20	0.198	1.2	40	14
AA200-pKP4-4	0.218	0.1	31	2
AA200-pKP4-19	0.223	0.2	37	3
AA200-pKP4-20	0.221	0.2	35	3
AA200-sc-1	0.111	nd	23	0
AA200-sc-1	0.199	nd	49	0
AA200-sc-1	0.122	nd	25	0
^a1,3-프로판디올 판별은 상기의 공통 방법에 기재된 GC/MS로 증명했음.

실시예 3

데히드라타제 활성을 갖는 폐렴간균 DNA로 형질전환된 대장균 균주 DH5α에 의한 D-포도당의 1,3-프로판디올로의 전환

폐렴간균 dha 레귤론 코스미드 pKP1 또는 pKP2를 갖고 있는 대장균 균주 DH5α를 실시예 2에 기재한 바와 같이 D-포도당을 1,3-프로판디올로 전환할 수 있는 능력이 있는지에 관해 시험했다. 결과를 표 5에 나타냈다.

대장균 균주 DH5α에 의한 0.2 % D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환: cAMP 첨가 (+) 및 부재 (-)

형질전환체	OD₆₀₀	[1,3-프로판디올] (mM)	농도 (%)	(%)
DH5α-pKP1 (-)	0.630	0.5	100	2
DH5α-pKP1 (+)	0.774	0.6	100	3
DH5α-pKP2 (-)	0.584	0.6	100	3
DH5α-pKP2 (+)	0.699	0.7	100	3

실시예 4

데히드라타제 활성을 갖는 폐렴간균 DNA로 형질전환된 대장균 균주 ECL707에 의한 D-포도당의 1,3-프로판디올로의 전환

폐렴간균 dha 레귤론 코스미드 pKP1 또는 pKP2, 폐렴간균 pdu 오페론 pKP4 또는 슈퍼코스 벡터만을 포함하는 대장균 균주 ECL707을 실시예 2에 기재한 바와 같이 D-포도당을 1,3-프로판디올로 전환할 수 있는 능력이 있는 지에 관해 시험했다. 각각의 경우에서 전환률을 정량했다. 결과를 표 6에 나타냈다.

대장균 균주 ECL707에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환: cAMP 첨가 및 부재

형질전환체	OD₆₀₀	[1,3-프로판디올] (mM)	OD₆₀₀	[1,3-프로판디올] (mM)
형질전환체	cAMP 부재		cAMP 첨가
ECL707-pKP1-1	0.607	0.1	0.475	0.1
ECL707-pKP1-3	0.619	0.1	0.422	0.1
ECL707-pKP1-7	0.582	0.2	0.522	0.2
ECL707-pKP1-10	0.593	0.1	0.408	0.1
ECL707-pKP1-18	0.584	0.1	0.433	0.1
ECL707-pKP2-4	0.588	0.1	0.408	0.1
ECL707-pKP2-5	0.630	0.1	0.516	0.2
ECL707-pKP2-8	0.542	0.1	0.486	0.1
ECL707-pKP2-15	0.589	0.1	0.485	0.1
ECL707-pKP2-19	0.577	0.1	0.504	0.1
ECL707-pKP4-8	0.499	nd	0.361	< 0.1
ECL707-pKP4-9	0.544	nd	0.354	nd
ECL707-pKP4-10	0.515	nd	0.265	< 0.1
ECL707-pKP4-14	0.512	nd	0.318	< 0.1
ECL707-pKP4-17	0.545	nd	0.388	< 0.1
ECL707-sc-1	0.592	nd	0.385	nd

실시예 5

대장균 AA200-pKP1-5에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 2 단계 전환

LB-amp 배지 50 ml가 들어있는 배플 플라스크 (250 ml)를 AA200-pKP1-5의 단독 콜로니로 접종했다. 세포를 진탕시키면서 (250 rpm) 30 또는 37 ℃에서 밤새 두 배로 증식시켰다.

증식된 배양물을 (10 분, 10,000 rpm, 4 ℃) 스핀하고 미량 금속 A : (0.08 μM CoCl₂, 0.06 μM CuCl₂, 7 μM FeSO₄, 2 μM H₃BO₄, 0.2 μM MnCl₂, 0.1 μM Na₂MoO₄, 0.08 μM NiCl₂, 0.3 μM ZnSO₄ 및 0.03 mM 티아민) 또는 미량 금속 B :(0.7 mM CaCl₂, 2.53 μM CoCl₂, 1.72 μM CuSO₄, 1.0 μM FeCl₃, 2 mM MgCl₂, 0.05 mM MnCl₂, 2.42 μM Na₂MoO₄, 1.0 μM ZnCl₂ 및 0.03 mM 티아민)를 함유하는, 포도당이 없는 생산 배지 (10 mM (NH₄)₂SO₄; 5 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.5); 50 mM MOPS (pH 7.5); 0.01 % 효모 추출물; 0.01 % 카사미노산; 0.8 ㎍/ml 비타민 B₁₂; 및 50 ㎍/ml 암피실린)에 재현탁시켰다. 세포를 2회 스핀하고 D-포도당이 들어있는 50 ml의 새로운 생산 배지에 재현탁시키고 60 ml 시럽병에 넣고 마개로 막고 부틸 고무 격벽으로 봉합했다. 병을 진탕시키고 (250 rpm) 샘플을 격벽을 뚫고 주사기로 꺼내어 0.2 μ 필터를 통해 여과시킨 후 분석했다. 결과를 표 7 및 표 8에 나타내었다. 잔류 포도당을 효소적 분석 (Biochemistry Analyzer, Yellow Springs Instruments Co., Inc)으로 측정하고 1,3-프로판디올은 HPLC로 분석했다.

대장균 균주 AA200-pKP1-5에 의한 0.2 % D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환: 증식 반응을 2회 수행했음^a

실험	시간 (일)	[포도당] (mM)	[1,3-프로판디올] (mM)	농도 (%)	선택도 (%)
# 1	1	0.1	2.3	99	10
# 1	4	0.1	2.3	99	10
# 2	1	2.8	2.3	75	14
# 2	4	0.1	2.4	99	11
^a미량 금속 A를 함유한 반응 혼합물을 37 ℃에서 인큐베이션시켰다.

대장균 균주 AA200-pKP1-5에 의한 1 % D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환^a

시간 (일)	[포도당] (mM)	[1,3-프로판디올] (mM)	농도 (%)	선택도(%)
0	53	0	0	0
1	39	5.6	26	20
2	35	8.3	34	23
3	33	8.4	38	21^b
^a미량 금속 A를 함유한 반응 혼합물을 37 ℃에서 인큐베이션시켰다.
^b반응 마지막에 1,3-프로판디올의 존재는 GC/MS 및¹³C-NMR (300 MHz로 확인했다.

실시예 6

폐렴간균 ATCC 25955가 아니라 폐렴간균 ECL2106에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환

배지로 가득 (약 14 ml) 채운 시럽 유리병을 폐렴간균 ECL2106 또는 폐렴간균 ATCC 25955를 함유한 LB 아가 플레이트로부터 살짝 접종시켰다. 50 mM 포도당, 3 mM (NH₄)₂SO₄, 0.9 mM CaCl₂, 4 μM CoCl₂, 0.06 μM CuCl₂, 7 μM FeSO₄, 2 μM H₃BO₄, 0.8 mM MgSO₄, 0.2 μM MnCl₂, 0.1 μM Na₂MoO ₄, 0.08 μM NiCl₂, 0.3 μM ZnSO₄, 0.1 mg/ml DL-시스테인, 10 μM 에틸렌디아민테트라아세트산, 0.8 ㎍/ml 비타민 B12, 표 9에 지시한 바와 같은 인산칼륨 및 pH 7.5인 50 mM HEPES 또는 50 mM MOPS 완충액이 배지에 함유되었다. 반응은 250 rpm으로 진탕시키면서 30 ℃에서 47 시간 동안 반응을 수행했다. 그 밖에는 실시예 2에 기재되어 있는 바와 같이 수행했다. 결과를 표 9에 나타냈다.

균주	완충액	Pi (mM)	[포도당] (mM)	[1,3-프로판디올] (mM)
2106	MOPS	5.0	11.4	0.2
2106	MOPS	2.5	13.9	0.2
2106	MOPS	1.3	14.8	0.1
2106	MOPS	0.6	15.8	0.1
2106	HEPES	5.0	21.1	0.1
2106	HEPES	2.5	23.4	0.1
2106	HEPES	1.3	26.4	0.1
2106	HEPES	0.6	27.5	0.1
25955	MOPS	5.0	4.4	nd
25955	MOPS	2.5	5.4	nd
25955	MOPS	1.3	2.8	nd
25955	MOPS	0.6	7.8	nd
25955	HEPES	5.0	7.0	nd
25955	HEPES	2.5	13.5	nd
25955	HEPES	1.3	10.2	nd
25955	HEPES	0.6	17.8	nd

실시예 7

재조합 피키아 파스토리스에 의한 1,3-프로판디올 제조

일반 목적 발현 플라스미드 제작

pHIL-D4 (Philips Petroleum 제품, 미국 오클라호마주 버틀러스빌 소재)에서 0.9 kb EcoR1/Xba1 단편을 pAO815 (Invitrogen 제품, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)의 0.9 kb EcoR1/ Xba1 단편으로 대치하여 5'AOX1, P. 파스토리스 메탄올 유도 알코올 산화효소 I (AOX1) 프로모터; AOX1 말단, P. 파스토리스 AOX I 전사 종결 부위; HIS4, P. 파스토리스 히스티디놀 탈수소효소를 코딩하며 선별을 위한 his4 숙주 유전자; kan, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 트랜스포존 Tn903으로부터 유도된 서열로서, 매우 다양한 숙주에서 카나마이신, 네오마이신 및 G418 내성을 지니며 카세트 복제수의 지시자로 유용; 3'AOX1, 위치 지정 벡터 통합을 위해 5'AOX1과 병용되는, AOX1의 하류에 위치한 P. 파스토리스 서열; ori, 대장균에서 플라스미드 조작을 허용하는 DNA 복제의 pBR322 개시점; 및 amp, 암피실린에 대한 내성을 제공하는 pBR322로부터 얻은 β-락타마제 유전자를 포함한 pHIL-D4B2 플라스미드를 생성했다. pHIL-D4B2의 추가의 특징은 다중 발현 카세트 (5'AOX1-유전자-AOX1말단)가 BgI2/Xba1 단편 상의 카세트를 BamH1/Xba1 위치로 서브클로닝함으로써 하나의 플라스미드 상으로 용이하게 배치될 수 있다는 것이다.

dhaB1 및 dhaB2 의 동시발현을 위한 플라스미드 제작

dhaB1 및 dhaB2를 위한 전사해독프레임을 5'-말단에 EcoR1 위치를 도입한 프라이머 (dhaB1 및 dhaB2 각각에 대해 서열 2와 서열 3 및 서열 4와 서열 5)를 사용하는 PCR을 통해 코스미드 pKP1으로부터 증폭시켰다 [10 mM 트리스 pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.0001 % 겔라틴, 200 μM dATP, 200 μM dCTP, 200 μM dGTP, 200 μM dTTP, 1 μM 각 프라이머, 1-10 ng 표적 DNA, 25 유닛/ml 암플리탁 (Amplitaq)(등록상표) DNA 중합효소 (Perkin Elmer Cetus, 미국 코네틱컷주 노르웍 소재)]. PCR 변수를 94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1 분, 35 사이클이었다. 생성물을 pHIL-D4B2의 EcoR1 위치로 서브클로닝하여 각각 dhaB1 및 dhaB2를 갖는 발현 플라스미드 pMP19 및 pMP20를 제작했다.

pMP19로부터 Bgl2/Xba1 단편 상의 dhaB1 발현 카세트를 pMP20의 BamH1/Xba1 위치로 서브클로닝하여 pMP21을 생성했다. 플라스미드 pMP21은 dhaB2 및 dhaB1 모두의 발현 카세트 및 HIS4 선택 마커를 포함한다.

dhaB3 및 dhaT 의 동시발현을 위한 플라스미드 제작

5' 말단에 EcoR1 위치를 도입한 프라이머 (dhaT 및 dhaB3에 대해 각각 서열 6과 서열 7 및 서열 8과 서열 9)를 사용하여 dhaT 및 dhaB3를 위한 전자해독프레임을 코스미드 pKP1으로부터 PCR을 통해 증폭시켰다. 생성물을 pHIL-D4B2의 EcoR1 위치로 서브클로닝하여 dhaT 및 dhaB3를 각각 갖는 발현 플라스미드 pMP17 및 pMP18를 제작한다.

pMP17으로부터 Bgl2/Xba1 단편 상의 dhaT 발현 카세트를 pM18의 BamH1/Xba1 위치로 서브클로닝하여 dhaT 및 dhaB3 모두를 위한 발현 카세트를 갖는 pMP22를 제작했다.

SUC2를 함유한 4.1 kb EcoR1 단편을 pRK20 (Phillips Petroleum 제품, 미국 오클라호마주 버틀러스빌 소재)으로부터 제거하여 pMP2를 얻었다. SUC2는 피키아에서 제2 선택 마커로 사용될 수 있는 전화효소 (invertase)를 코딩한다. lacZ를 포함하는 4.0 kb Hind3 단편을 pMP2에서 제거하여 pMP3를 만들었다. pHIL-D4에서 얻은 AOX1 말단을 포함하는 0.4 kb Hind3 단편을 pMP3의 Hind3 위치로 서브클로닝하여 pMP10을 제작했다.

pMP10에서 2.0 kb Bgl2/Xba1 단편을 pMP22에서 얻은 dhaB3 및 dhaT 발현 카세트를 포함하는 5.0 kb Bgl2/Xba1 단편으로 대체하여 pMP23을 제작했다. pRK20에서 얻은 SUC2를 포함하는 5.4 kb Pst1/Bgl2 단편을 pSP73 (Promega 제품, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 Pst1/Bgl2 위치로 서브클로닝하여 pMP11a를 만들어냈다. 플라스미드 pMP11a를 EcoR1으로 자르고 T4 DNA 중합효소로 채우고 재결합시켜 pMP11b를 제작했다. pMP10 내의 1.1 kb Pst/Bgl2 단편을 pMP11b에서 얻은 SUC2를 포함하는 5.4 kb Bgl2/Pst1 단편으로 대체하여 pMP12를 제작했다.

pMP23 내의 1.0 kb Sca1/Bgl2 단편을 pMP12로부터 얻은 SUC2를 포함하는 5.2 kb Sca1/Bgl2 단편으로 대체하여 pMP24를 생성시켰다. 플라스미드 pMP24는 dhaT 및 dhaB3를 위한 발현 카세트 및 SUC2 선택 마커를 포함한다.

dhaB1 / dhaB2 발현 플라스미드 pMP21를 사용하는 P. 파스토리스의 형질전환

P. 파스토리스 균주 GTS115 (his4) (Pillips Petroleum 제품, 미국 오클라호마주 버틀러스빌 소재)를 문헌 [Cregg 등, Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)]에 기재되어 있는 스페로플라스트 형질전환 방법을 사용하여 Bgl2-선형화 플라스미드 pMP21 1 내지 2 ㎍으로 형질전환시켰다. 30 ℃에서 3 내지 4일 동안 히스티딘 없는 플레이트에서 세포를 재생시켰다. 모든 형질전환체는 염색체로 플라스미드 DNA의 통합 후에 발생한다. 형질전환체는 YPD (1 % 박토 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 포도당) 마스터 플레이트로 패칭 (patching)을 했다.

dhaB1 및 dhaB2 를 위한 P. 파스토리스 형질전환체 스크니링

염색체 DNA를 상기한 바와 같이 his ⁺ 형질전환체로부터 정제하고 dhaB1 및 dhaB2에 특이적인 프라이머로 PCR 분석을 실시했다. 2000 ㎍/ml까지 G418 (시그마 제품, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)의 수준을 증가시켜 보강한 YPD 배지에서 증식시켜 높은 복제수 균주를 dhaB1 및 dhaB2 모두를 포함하는 형질전환체로부터 선택했다. G418의 고수준에 대한 내성이 의미하는 바는 발현 카세트의 중복에 대한 상당한 가능성이다.

dhaB3 / dhaT 발현 플라스미드 pMP24를 사용하는 P. 파스토리스의 제2 형질전환

상기한 바와 같이 높은 수준의 G418 내성이 있는 형질전환체를 스페로플라스트 형질전환 방법을 사용하여 플라스미드 pMP24로 재형질전환시켰다. 세포를 우선 30 ℃에서 2일 동안 비선택적 플레이트 상에서 재생시킨 후, 재생된 세포를 포함하는 상층 아가를 플레이트로부터 긁어내어 물 20 ml 내에서 광범위하게 볼텍싱했다. 4겹의 무명을 통과시킨 후, 세포를 원심분리하여 펠렛화하고 10 ml의 물로 재현탁시켰다. 일부 200 ㎕를 수크로오즈 플레이트 상에 플레이팅하고 30 ℃에서 2일동안 인큐베이션시켰다. 모든 형질전환체는 플라스미드 DNA의 염색체로의 통합 후에 발생한다. 형질전환체는 작은 콜로니를 배경으로하는 큰 콜로니로서 나타나기 때문에 분리할 필요가 있다. Msu 배지 (1 ℓ당 13.4 g의 효모 질소 염기 w/o 아미노산, 10 g의 수크로오즈, 0.4 g의 바이오틴) 중의 30 ℃에서 24 시간 동안 진탕시키면서 증식시킨 후, 형질전환체를 Msu 플레이트 (Msu 배지 + 15 g/ℓ 아가로오즈)에 스트레킹 (streaking)하고, 30 ℃에서 2일 동안 증식시켰다. 큰 분리된 콜로니를 YPD 마스터 플레이트로 패칭했다.

dhaB1, dhaB2. dhaB3 및 dhaT 를 위한 P. 파스토리스 이중 형질전환체의 스크니링 및 이들의 상응하는 효소 활성

염색체 DNA를 상기한 suc+ 이중 형질전환체로부터 정제하고 dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaT에 특이적 프라이머로 PCR 분석을 실시했다. 이렇게 하여 전부 4 개의 전사해독프레임의 존재를 확인했다.

활성 글리세롤 데히드라타제 (dhaB) 및 1,3-프로판디올 산화환원효소 (dhaT)의 존재가 생체외 효소적 분석을 사용하여 증명되었다. 또한 웨스턴 블럿 (western blot) 분석을 통해 전부 4 개의 전사해독프레임으로부터 단백질 발현을 확인했다. 이들 단백질 특성 분석용 세포 유리 추출물을 하기와 같이 제조했다. dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaT를 포함하는 이중 형질전환체를 30 ℃, MGY (1 ℓ당, 효모 질소 염기 (아미노산 제외) 13.4 g, 0.4 mg의 바이오틴, 10 ml의 글리세롤) 중에서 진탕시키면서 호기성 상태로 2일 동안 증식시켰다. 세포를 원심분리하여 펠렛화하고 MM (1 ℓ당, 효모 질소 염기 (아미노산 제외) 13.4 g, 0.4 mg 바이오틴, 5 ml의 메탄올)에서 재현탁시키고 상기와 같이 인큐베이션시켰다. 약 24 시간 후에, 세포를 회수했고 완충액 (0.1 M 트리센/KOH 완충액, pH 8.2, 50 mM KCl 및 2 % 1,2-프로판디올)에서 재현탁시키고 (유리알의 존재하에 볼텍싱하면서 유리봉을 사용하여) 기계적으로 분쇄시킨 후 원심분리했다.

전부 4 개의 전사해독프레임 (dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaT)의 존재 및 이들의 상응하는 활성에 양성을 보이는 한 균주를 MsP42.81로 지정하고 추가 연구를 위해 선별했다.

재조합 피키아 파스토리스를 사용하는 1,3-프로판디올의 생체내 제조

P. 파스토리스 MSP42.81 (ATCC 74363)을 8.5 g/ℓ KH₂PO₄, 2.1 g/ℓ (NH₄)₂SO₄, 10 g/ℓ 글리세롤, 2.3 g/ℓ MgSO₄7H₂O, 0.18 g/ℓ CaSO₄2H₂O 및 0.29 ml/ℓ PTMI를 함유하는 1.5 ℓ 최소 배지를 사용한 BiostatB 발효기 (B Braun Biotech, Inc. 제품)에서 증식시켰다. PTMI는 24 mM CuSO₄, 4.8 mM KI, 18 mM MnSO₄, 0.8 mM Na₂MoO₄, 0.3 mM H₃BO₃, 2.1 mM CoCl ₂, 70 mM ZnSO₄, 26 mM H₂SO₄, 234 mM FeSO₄ 및 0.8 mM 바이오틴을 함유하는 무기물 스톡 용액 (stock solution)이다. 발효기는 30 ℃에서 2 M NH₄OH를 첨가하여 pH 5.0으로 조절하고 교반 조절을 통해 용존 산소압을 30 %로 조절했다. 30 ℃에서 YM 브로쓰에서 증식된 P. 파스토리스 MSP42.81의 배양물을 접종에 사용했다; 배양물 20 ml를 사용하여 발효기를 접종했다.

글리세롤이 고갈되었다고 생각될 때 (접종 후 24 시간) 메탄올 공급액을 첨가하여 AOX 프로모터의 유도를 개시했다. 공급액은 메탄올 1 ℓ, PTMI 5 ml 및 물 중의 0.2 g/ℓ로 제조된 바이오틴 스톡 용액 5 ml를 함유했다. 메탄올 용액을 수동으로 첨가하여 HPLC 분석으로 측정된 평균 농도를 0.5 %로 유지했다. 세포 40 ml (OD₆₀₀ = 20 AU)를 유도 후 15 시간 이후에 반응기에서 꺼냈다.

50 ml의 세포 현탁액을 펠렛화하고 12.5 ml의 질소 살포 염기 배지 (6.7 g/ℓ 효모 질소 염기, 3.0 g/ℓ 효모 추출물, 1.0 g/ℓ K₂HPO₄, 1.0 g/ℓ KH₂PO ₄, 3.0 g (NH₄)₂SO₄, pH 7.2로 적정 및 멸균 필터)에 재현탁시켰다. 질소 살포수에서 2 mg/ml인 스톡 용액으로 제조된 보조효소 B₁₂를 세포 현탁액에 첨가하여 최종 농도를 20 ㎍/ml가 되었다. 3 개의 배지 스톡 용액을 1 % 포도당, 0.5 % 포도당 및 0.5 % 글리세롤 및 1.0 % 글리세롤 (w/v)을 함유한 염기 배지로 제조했다. 클로로퀸의 스톡 용액 (1.06 g/50 ml, pH 7.2)도 제조했다.

최종 농도가 표 10에 주어져 있는 바와 같은 배지 스톡 용액 2 ml 및 클로로 퀸과 물의 1 ml 혼합물을 10 ml 크림프 봉합된 시럽병에 넣고 질소와 함께 살포한 후 보조효소 B₁₂ 혼합물과 함께 세포 1 ml를 첨가했다. 시럽병을 진탕시키면서 30 ℃에서 인큐베이션시켰다. 세포 첨가 직후 얻은 샘플 및 24 시간 인큐베이션 후 얻은 샘플을 HPLC로 분석했다. 결과를 표 10에 나타냈다.

반응	배지^a	클로로퀸 (mM)	1,3-프로판디올 (mM)
1	glu^b	0	0.04
2	glu	2.5	0.2
3	glu	5.0	0.1
4	glu	10.0	0.1
5	glu^b/gly	0	0.2
6	glu/gly	2.5	0.4
7	glu/gly	5.0	0.4
8	glu/gly	10.0	1.2^c
9	gly	0	0.2
10	gly	2.5	0.3
11	gly	5.0	0.3
12	gly	10.0	1.4^c
a 별도의 표시가 없으면 10 % 이하의 각 기질이 24 시간 동안 사용되었다.
b 아무런 포도당이 24 시간 후에 남아있지 않았다.
c 1,3-프로판디올의 존재를 공통 방법에서 기재한 것처럼 GC/MS로 확인했다.

실시예 8

D-포도당으로부터 1,3-프로판디올 제조를 위한 피키아 파스토리스 이중 형질전환체 사용

P. 파스토리스 MSP42.81을 8.5 g/ℓ KH₂PO₄, 2.1 g/ℓ (NH₄)₂SO ₄, 10 g/ℓ 포도당, 2.3 g/ℓ MgSO₄7H₂O, 0.18 g/ℓ CaSO₄2H₂O 및 0.29 ml/ℓ PTMI를 함유하는 1.5 ℓ 최소 배지를 사용한 BiostatB 발효기 (B Braun Biotech, Inc. 제품)에서 증식시 켰다. 그 밖에 발효 및 유도 조건은 실시예 7에 기재한 바와 동일하다. 세포 40 ml를 유도 15 시간 후 반응기에서 꺼냈다.

개질된 염기 배지 (6.7 g/ℓ 효모 질소 염기, 1.0 g/ℓ KH₂PO₄, 1 g/ℓ K₂HPO₄, 3 g/ℓ (NH₄)₂SO₄, pH 7.2로 적정 및 멸균 필터)를 사용하는 것만 제외하면 세포 현탁액을 실시예 7에 기재한 바와 같이 조작했다. 3 개의 배지 스톡 용액을 이 개질된 염기 배지에서 마찬가지로 재조했다. 모든 다른 용액은 동일했다. 반응 혼합물을 상기한 바와 같이 제조했고 진탕시키면서 30 ℃에서 인큐베이션시켰다. 세포 첨가 직후 얻은 샘플 및 75 시간 인큐베이션 후 얻은 샘플을 HPLC로 분석했다. 포도당을 탄소원으로 함유하고 5 mM의 클로로퀸을 함유한 반응에서, 0.17 mM 1,3-프로판디올을 제조했다.

실시예 9

사카로마이시즈 세레비지아에서 dhaB 및 dhaT 의 발현 및 형질전환을 위한 플라스미드 제작

일반 목적 발현 플라스미드 제작

2 가지 유형의 발현 플라스미드를 만들었으며, 이들은 재조합에 의해 염색체 내로 통합될 수 있으며 복제성 에피솜 성분로 존재할 수도 있다. 일반 발현 플라스미드의 각 유형마다 효모 프로모터가 존재하며, 이 프로모터와 효모 전사 종결 암호(terminator)와의 사이에는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제의 인식 위치가 존재하는 DNA 단편이 있다. 또한, 각 유형의 일반 발현 플라스미드마다 암피실린 함유 배지에서의 대장균 선별을 위한 β-락타마제 유전자, 대장균에서 플라스미드 유지를 위한 복제 개시점, 및 에피솜 성분을 위한 2 μ 복제 개시점 또는 유도된 DNA가 염색체로 재조합 및 통합되기 위한 S. 세레비지아 염색체에서 발견되는 것과 상동성인 서열도 포함한다. 효모의 경우에 사용되며 발현 플라스미드에 존재하는 선택성 영양 마커는, 이미다졸글리세롤포스페이트 데히드라타제를 코딩하는 HIS3 유전자, 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라아제를 코딩하는 URA3 유전자, N-(5'-포스포리보실)-안트라닐레이트 이성질화효소를 코딩하는 TRP1 유전자 및 β-이소프로필말레이트 탈수소효소를 코딩하는 LEU2 중 하나였다. 사용된 효모 프로모터는 ADH1 또는 GAL1이었고, 사용된 전사 종결 암호는 ADH1, CYC1 또는 AOX1이었고 후자는 피키아 파스토리스에서 얻은 것이었다.

플라스미드 pGADGH (Clontech 제품, 미국 캘리포니아 팔로알토 소재)를 HindIII로 소화시키고 단일 가닥 말단을 HindIII-XmnI 및 EcoRI-XmnI 아탑터 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 버버리 소재)로 결합시켜 EcoRI 말단으로 전환시켰다. 올바른 EcoR1 말단이 있는 플라스미드의 선별은 플라스미드 pUC4K (Pharmacia Biotech 제품, 스웨텐 웁살라 소재)로부터 얻은 EcoRI 단편의 카나마이신 내성 유전자로 결합 (ligation)시켜서 대장균 균주 DH5α를 형질전환시킨 후 25 ㎍/ml 카나마이신을 함유한 LB 플레이트 상에서 선별함으로써 수행했다. 수득한 플라스미드 (pGAD/KAN2)를 SnaB1 및 EcoR1으로 소화하고 ADH1 프로모터가 있는 1.8 kb 단편을 분리했다. 플라스미드 pGBT9 (Clontech 제품, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 SnaBI 및 EcoRI으로 소화시키고 1.5 kb ADH1/GAL4 단편을 SnaBI 및 EcoRI으로 소화된 pGAD/KAN2로부터 분리한 1.8 kb ADH1 프로모터 단편으로 대체했다. 수득된 벡터 (pMCK11)는 ADH1 프로모터와 종결 암호 및 TRP1 마커가 있는 효모의 증식 플라스미드 (replicating plasmid)이다.

플라스미드 pGADGH를 SnaBI 및 HindIII로 소화시키고 ADH1 프로모터가 포함된 1.8 kb 단편을 분리했다. 이 단편을 SmaI 및 HindIII로 미리 소화된 벡터 pRS405 (Stratagene 제품, 미국 캘리포니아 라졸라 소재)로 결합시켰다. 플라스미드-코딩된 lacZ 알파 펩티드를 삽입에 의해 불활성화시키고 ADH1 프로모터 단편의 존재를 통해 양성 클론을 판별했다. 생성된 플라스미드 (pMCK4)는 ADH1 프로모터 및 LEU2 마커를 포함했다.

ADH1 종결 암호가 들어있는 pGBT9로부터 얻은 약 0.2 kb NaeI-EcoRI 단편을 pRS403 (Stratagene 제품, 미국 캘리포니아 라졸라 소재)로 잘린 EcoRI-HincII에 결합시켜 약 4.8 kb 플라스미드 pRVN5를 제작했다. ADH1 프로모터가 들어 있는 pGAD/KAN2로부터 얻은 약 2.0 kb SnaBI-EcoRI 단편을 SmaI-EcoRI에 의해 잘린 pRVN5와 결합시켜 ADH1 프로모터 및 종결 암호와 이들 사이에 유일한 EcoRI 클로닝 위치를 포함하는 약 6.8 kb 플라스미드 pRVN6을 얻었다.

추가로 XmnI 위치가 들어있는 pGADGH로부터 얻은 0.4 kb HindIII 단편을 결실시키고 벡터를 재결합시켜 7.0 kb 벡터 pGAD-D3를 얻었다. 벡터 pGAD-D3을 XmnI으로 소화시키고 ADH1 프로모터 및 종결 암호와 사이에 낀 HindIII 클로닝 위치가 들어있는 약 2.4 kb 단편을 정제했다. pRS404 벡터 (Stratagene 제품, 미국 캘리포니아 라졸라 소재)를 PvuII로 자르고 TRP1으로 더 큰 3.8 kb 단편을 정제하고 pGAD-D3로부터 얻은 XmnI 프로모터 및 종결 암호 단편에 결합시켜 플라스미드 pRVN11을 얻었다.

5' 말단에서 EcoR1 위치를 도입한 프라이머 (각각 dhaT, dhaB3 및 dhaB1을 위한 서열 6과 서열 7, 서열 8과 서열 9 및 서열 2와 서열 3)를 사용하는 PCR을 통해 dhaT, dhaB3 및 dhaB1을 위한 전사해독프레임을 pHK28-26 (서열 1)으로부터 증폭시켰다 [10 mM 트리스 (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.0001 % 겔라틴, 200 μM dATP, 200 μM dCTP, 200 μM dGTP, 200 μM dTTP, 1 μM 각 프라이머, 1-10 ng 표적 DNA, 25 유닛/ml 암플리탁 (등록상표) DNA 중합효소 (Perkin Elmer Cetus 제품, 미국 코네티컷주 노르웍 소재)]. PCR 변수는 94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분, 35 사이클이었다. 생성물을 pHIL-D4 (Phillips Petroleum 제품, 미국 오클라호마 버틀러스빌 소재)의 EcoR1 위치로 서브클로닝하여 dhaT, dhaB3 및 dhaB1이 각각 들어있는 플라스미드 pMP13, pMP14 및 pMP15을 제작했다.

dhaT 발현을 위한 플라스미드 제작

증식 플라스미드 pGAD/KAN2를 EcoRI으로 잘라 카나마이신 내성 단편을 제거하고 인산기를 제거하고 pMP13으로부터 얻은 dhaT EcoRI 단편에 결합시켰다. 생긴 플라스미드 (pMCK13)는 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치된 dhaT를 가지며, LEU2 마커를 포함했다.

플라스미드 pRNV6을 EcoRI으로 자르고 pMP13으로부터 얻은 dhaT EcoRI 단편에 결합시켰다. 생긴 플라스미드 (pRVN6T)에서 dhaT는 ADH1 프로모터로부터 전사 되기 위해 올바르게 배치되었고 플라스미드에는 HIS3 마커가 포함되었다.

dhaB1 의 발현을 위한 플라스미드 제작

증식 플라스미드 pGADGH를 HindIII로 자르고 탈인산화하고 pMP15에서 얻은 dhaB1 HindIII 단편을 결합시켰다. 생긴 플라스미드 (pMCK10)에서 dhaB1은 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치되었고 플라스미드에는 LEU2 마커가 포함되었다.

dhaB2 의 발현을 위한 플라스미드 제작

증식 플라스미드 pMCK11을 EcoRI으로 자르고 탈인산화하고 pMP20으로부터 얻은 dhaB2 EcoRI 단편에 결합시켰다. 얻은 플라스미드 (pMCK17)에서 dhaB2는 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치되었고 플라스미드에는 TRP1 마커가 포함되었다.

플라스미드 pRS403을 SmaI으로 자르고 pMCK17로부터 얻은 SnaBI/NaeI dhaB2 단편에 결합시켰다. 얻은 플라스미드 (pMCK21)에는 dhaB2가 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치되었고 플라스미드에는 HIS3 마커가 포함되었다.

dhaB3 의 발현을 위한 플라스미드 제작

증식 플라스미드 pYES2 (Invitrogen 제품, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 EcoRI으로 자르고 탈인산화하고 pMP14로부터 얻은 dhaB3 EcoRI 단편에 결합시켰다. 얻은 플라스미드 (pMCK1)에서 dhaB3는 GAL1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치되었고 플라스미드에는 URA3 마커가 포함되었다.

증식 플라스미드 pGAD/KAN2를 EcoRI으로 자르고 탈인산화하고 pMP14로부터 얻은 dhaB3 EcoRI 단편에 결합시켰다. 얻은 플라스미드 (pMCK15)에서 dhaB3는 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치되었고 플라스미드에는 LEU2 마커가 포함되었다.

플라스미드 pRS404를 Pst 및 HincII로 자르고 pMCK15로부터 얻은 PstI/EcoRV dhaB3 단편에 결합시켰다. 얻은 플라스미드 (pMCK20)에는 dhaB3가 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치되었고 플라스미드에는 TRP1 마커가 포함되었다.

dha 발현 플라스미드를 이용한 S. 세레비지아 형질전환

S. 세레비지아 균주 YPH499 (ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-del63 his3-del200 leu2-del1) (Stratagene 제품, 미국 캘리포니아 라졸라 소재)를 스트라타진 (Stratagene)사가 공개한 LiCl/폴리에틸렌 글리콜 프로토콜 (카탈로그 #217406)을 사용하여 플라스미드 DNA 1 내지 2 ㎍으로 형질전환시켰다. 다르게는, 냉동된-EZ 효모 형질전환 키트 (카탈로그 #T2001) (Zymo Research 제품, 미국 캘리포니아 오렌지 소재)를 사용하여 형질전환시켰다. 콜로니를 보강 최소 배지 (SMM- 0.67 % 효모 질소 염기 (아미노산 제외), 2 % 포도당)에서 3 내지 4 일간 29 ℃에서, 아데닌 술페이트 (20 mg/ℓ), 우라실 (20 mg/ℓ), L-트립토판 (20 mg/ℓ), L-히스티딘 (20 mg/ℓ), L-루이신 (30 mg/ℓ), L-리신 (30 mg/ℓ) 가운데 하나 이상을 첨가하여 증식시켰다. 콜로니를 선택 플레이트에 스트레킹하고 액체 배지를 접종하는 데 사용했다. 사용된 벡터에 따라 플라스미드 DNA를 통합시킨 후 또는 에피솜의 복제로부터 콜로니가 발생했다. 한 유형의 플라스미드를 이용한 형질전환 이외에, 둘 이상의 플라스미드를 이용한 동시 형질전환도 수행했다.

형질전환된 S. 세레비지아에서 dhaB 활성의 발현

플라스미드 pMCK1, pMCK10 및 pMCK17로 형질전환된 균주 YPH499를 아미노산을 제외한 효모 질소 염기 0.67 %, 갈락토오즈 2 %, 라피노오즈 2 %, 아데닌 술페이트 20 mg/ℓ, L-리신 30 mg/ℓ 및 히스티딘 20 mg/ℓ가 들어있는 보강된 최소 배지에서 증식시켰다. 세포를 균질화하고 추출물을 dhaB 활성에 대해 분석했다. 1 mg당 0.021 유닛의 고유 활성도 (specific acitivity)를 얻었다.

실시예 10

S. 세레비지아의 형질전환을 위한 다른 증식 및 통합 플라스미드의 제작

pGAD/KAN2로부터 얻은 SnaBI/EcoRI ADH1 프로모터 단편을 분리하고 이 단편을 HincII 및 EcoRI으로 미리 소화된 벡터 pRS406 (Stratagene 제품, 미국 캘리포니아 라졸라 소재)로 결합시킴으로써 일반 목적 발현 플라스미드를 제작했다. 플라스미드-코딩된 lacZ 알파 펩티드를 삽입에 의해 불활성화시키고 ADH1 프로모터 단편의 존재를 통해 양성 클론을 판별했다. 생성된 플라스미드 (pMCK3)를 EcoRI 및 SmaI으로 자르고 플라스미드 pGBT9로부터 분리된 0.2 kb ADH1 종결 암호 단편에 결합시킨다. 생성된 플라스미드 (pMCK5)는 ADH1 프로모터 및 종결 암호 및 URA3 마커를 포함했다.

dhaT 발현을 위한 플라스미드 제작

벡터 pMCK5를 EcoRI으로 잘라 인산기를 제거했다. dhaT 유전자를 플라스미드 pMP13으로부터 EcoRI 단편으로서 잘라내고 이를 상기 pMCK5에 결합시켰다. 생 긴 플라스미드 (pMCK7)는 ADH1 프로모터로부터 전사되기에 올바르게 배치된 dhaT를 가지며, URA3 마커를 포함했다.

통합 벡터 pRS404를 KpnI 및 SacI으로 자랐다. 프로모터 및 종결 암호와 측면에 접하는 dhaT 유전자를 pMCK7으로부터 KpnI/SacI 단편으로서 잘라내고 pRS404에 결합시켰다. 생긴 플라스미드에서 dhaT는 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치되었고 플라스미드에는 TRP1 마커가 포함되었다.

dhaB1 의 발현을 위한 플라스미드 제작

벡터 pMCK5를 EcoRI으로 자르고 탈인산화시켰다. dhaB1 유전자를 플라스미드 pMP15으로부터 EcoRI 단편으로서 잘라내고 이를 pMCK5에 결합시켰다. 생긴 플라스미드 (pMCK8)는 ADH1 프로모터로부터 전사되기에 올바르게 배치된 dhaB1을 가지며, URA3 마커를 포함했다.

통합 벡터 pPS403을 ClaI 및 AatII로 소화시켰다. 플라스미드 pMCK8로부터 얻은 ClaI/AatII 단편으로서 플랭킹 프로모터 및 종결 암호가 있는 dhaB1 유전자를 잘라내고 이를 pRS403에 결합시켰다. 생긴 플라스미드는 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치된 dhaB1을 가지며, HIS3 마커를 포함했다.

증식 플라스미드 pYES2를 HindIII 및 SnaBI으로 자르고 SnaBI 및 HindIII로 잘린 pGADGH로부터 얻은 ADH1 프로모터 단편과 결합시켜 GAL1 프로모터 성분을 대체했다. pMP19로부터 얻은 dhaB1 HindIII 및 XbaI 단편을 pYES2의 변형된 ADHI 프로모터에 그 위치에 결합된다. 생긴 플라스미드는 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치된 dhaB1을 가지며, URA3 마커를 포함했다.

벡터 pMCK4를 HindIII로 자르고 탈인산화시켰다. dhaB1 유전자를 플라스미드 pMP15으로부터 HindIII 단편으로서 잘라내고 이를 pMCK4에 결합시켰다. 생긴 플라스미드는 ADH1 프로모터로부터 전사되기에 올바르게 배치된 dhaB1을 가지며, LEU2 마커를 포함했다.

dhaB2 의 발현을 위한 플라스미드 제작

벡터 pPS404, pRS405 및 pRS406을 SmaI으로 소화시켰다. 프로모터 및 종결 암호와 측면에 접하는 dhaB2 유전자를 플라스미드 pMCK17로부터 SnaBI/NaeI 단편으로서 잘라내고 이를 각 통합 벡터에 결합시켰다. 생긴 플라스미드는 ADH1 프로모터로부터 전사되기 위해 올바르게 배치된 dhaB2을 가지며, LEU2, TRP1 또는 URA3 마커를 포함했다.

실시예 11

dha 형질전환에 대한 S. 세레비지아 스크리닝 및 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환

dha 유전자에 대한 S. 세레비지아 스크리닝

실시예 9 및 10에 기재된 바와 같이 제작된 Ura⁺, His⁺, Trp⁺ 또는 Leu ⁺ 형질전환체로부터 얻은 염색체 DNA를 피키아 파스토리스에 대해 기재된 바와 같은 각각의 유전자에 특이적인 프라이머 (서열 2 내지 9)를 사용하는 PCR로 분석했다.

dha 유전자로 형질전환된 S. 세레비지아에 의한 D-포도당으로부터 1,3-프로판디올의 제조

실시예 9 및 10에 기재된 바와 같이 제작된, dhaT, dhaB1, dhaB2 및 dhaB3를 갖는 형질전환체를 아데닌 술페이트 20 mg/ℓ, L-리신 30 mg/ℓ, 비타민 B12 1 mg/ℓ로 보강된 SMM에서 29 ℃에서 진탕시키면서 호기성 또는 혐기성으로 증식시킨다. 정지기에 도달할 때까지 계속 증식시키고 1,3-프로판디올의 존재를 HPLC로 확인한다. 형질전환체 S. 세레비지아 pMCK1/10/17(HM)#A를 기탁했으며 ATCC 74370으로 지정했다.

실시예 12

수소 대기하에서 클로스트리듐 파스토리아눔 ( Clostridium pasteurianum ) ATCC 6013에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올의 제조

클로스트리듐 파스토리아눔을 위한 공통 증식 조건

클로스트리듐 파스토리아눔 ATCC 6013을 다른 지시가 없으면 배지 10 ml가 들어있는 60 ml 크림프로 밀봉된 시럽병에서 증식시켰다. 배지가 들어있는 크림프로 밀봉된 병을 질소를 살포하여 멸균한 다음 접종했다. pH 7.2로 조절되고, KH₂PO₄ 1.4 g/ℓ, NaH₂PO₄ 0.69 g/ℓ, NH₄Cl 1.8 내지 2.5 g/ℓ, KCl 0.50 g/ℓ, MgSO₄·7H2O 0.50 g/ℓ, CaCl₂ 0.025 g/ℓ, NaCl 1.0 g/ℓ, 효모 추출물 2.0 g/ℓ, 시스테인·HCl 0.50 g/ℓ, 중탄산나트륨 2.5 g/ℓ, p-아미노 벤조산 0.0080 g/ℓ, 바이오틴 0.000040 g/ℓ, 나트륨 시트레이트·2H2O 0.10 g/ℓ, FeSO₄·7H₂O 0.050 g/ℓ, CoCl₂·6H₂O 0.010 g/ℓ, MnCl₂·4H₂O 0.0010 g/ℓ, ZnCl ₂ 0.0005 g/ℓ, Na₂MoO₄·2H₂O 0.0025 g/ℓ, NiCl₂·6H₂O 0.010 g/ℓ 및 CuSO₄·5H₂O 0.0050 g/ℓ가 포함된 기본 배지 (배지 A)에 하기에 지시된 바와 같이 탄소 성분을 첨가했다. 인큐베이션은 모두 250 rpm으로 진탕시키면서 30 ℃에서 수행했다.

5 % 포도당이 보강된 배지 A의 10 ml 배치를 대략 15 % (v/v) 글리세롤을 포함하는 클로스트리듐 파스토리아눔의 냉동 혼합물 1 ml로 접종하는 것을 한번더 반복했다. 96 시간 후에, 증식 중인 세포 현탁액 0.5 ml를 새로운 배지 10 ml로 옮겨 계속 증식시켰다. 24 시간 후에 새롭게 접종된 병에서 대기압을 수소 기체로 30 psi로 하고 96 시간 동안 추가로 계속 인큐베이션시켰다. 수상을 초기와 마지막 96 시간의 끝에서 샘플로 취하여 상기 ‘공통 방법’란에 기재된 바와 같이 HPLC로 분석했다. 결과를 표 11에 나타냈다.

수소 대기하에서 클로스트리듐 파스토리아눔 ATCC 6013에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환

시간 (시)	실험	포도당 (mM)	글리세롤 (mM)	1,3-프로판디올 (mM)^a
0	A	114	nd	2.7
96	A	47	nd	3.4
0	B	119	0.1	2.0
96	B	59	0.1	3.5
a 1,3-프로판디올의 존재는 공통 방법에서 기재된 바와 같이 GC/MS로 확인했다.

실시예 13

메틸 비올로겐이 있는 상태에서 클로스트리듐 파스토리아눔 ATCC 6013에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올의 제조

실험 1. 모든 세포를 실시예 12의 프로토콜에 따라 증식시켰다. 5 % 포도 당으로 보강된 배지 A 1회분 (실시예 12에 기재됨) 10 ml를 대략 15 % (v/v) 글리세롤이 함유된 클로스트티디움 파스토리아눔 ATCC 6013 냉동 스톡 용액 1 ml로 접종하는 것을 한번더 반복했다. 96 시간 후, 증식 중인 세포 현탁액 0.5 ml를 새로운 배지 10 ml에 옮기고 계속 증식시켰다. 24 시간 후, 메틸 비올로겐 (1,1'-디메틸-4,4'-비피리미디늄 디클로라이드)을 새로 접종된 유리병으로 최종 농도가 1 mM가 되도록 첨가하고 추가로 96 시간 동안 계속 인큐베이션시켰다. 수상을 초기와 마지막 96 시간의 끝에서 샘플로 취하여 상기 ‘공통 방법’란에 기재된 바와 같이 HPLC로 분석했다. 결과를 표 12에 나타냈다.

메틸 비올로겐이 있는 상태에서 클로스트리듐 파스토리아눔 ATCC 6013에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환

시간 (시)	실험	포도당 (mM)	글리세롤 (mM)	1,3-프로판디올 (mM)^a
0	A	113	0.3	2.4
96	A	28	1.8	3.4
0	B	87	0.3	2.1
96	B	40	3.2	4.4
a 1,3-프로판디올의 존재는 공통 방법에서 기재된 바와 같이 GC/MS로 확인했다.

실험 2. 1 % (v/v) 글리세롤 + 1 % (w/v) 포도당으로 보강된 배지 A를 대략 15 % (v/v) 글리세롤이 포함된 클로스트리듐 파스토리아눔 ATCC 6013의 냉동 스톡 용액으로 20 ml 배지당 0.2 ml 냉동 스톡 용액의 비율로 접종했다. 48 시간 후, 세포 현탁액 10 ml를 새로운 배지 90 ml로 첨가하고 24 시간 동안 계속 증식시켰다. 10 ml의 세포 현탁액을 얼음 위에서 냉각시키고 혐기성 조건하에서 원심분리하여 세포를 모았다. 세포를 혐기성 완충액 [미리 N₂로 가스 처리하고 N₂하에서 오 토클레이브를 실시한 50 mM 인산 완충액 (pH 7.2) + 0.5 g/ℓ 시스테인·HCl]로 3회 세척하고 부피 8 ml인 혐기성 완충액에 재현탁시켰다. 동일한 반복 실험에서, 이들 세포 현탁액 1 ml를 써서 1 % 포도당과 0 mM, 1 mM, 5 mM 또는 10 mM 메틸 비올로겐으로 보강된 배지 A 10 ml를 접종하고 240 시간 동안 인큐베이션시켰다. 수상을 초기와 마지막 240 시간의 끝에서 샘플로 취하여 상기 ‘공통 방법’란에 기재된 바와 같이 HPLC로 분석했다. 결과를 표 13에 나타냈다.

메틸 비올로겐 (MV)이 있는 상태에서 클로스트리듐 파스토리아눔 ATCC 6013에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환

MV(mM)	시간 (시)	복제	포도당 (mM)	글리세롤 (mM)	1,3-프로판디올 (mM)^a
0	0	A	38	nd	nd
0	240	A^b	40	nd	nd
0	0	B	nd	nd	nd
0	240	B^b	nd	nd	nd
1	0	A	40	nd	nd
1	240	A^b	nd	4	1
1	0	B	45	nd	nd
1	240	B^b	nd	5	2
5	0	A	37	nd	nd
5	240	A	nd	4	2
5	0	B	38	nd	nd
5	240	B	nd	3	1
10	0	A	40	nd	nd
10	240	A	nd	2	5
10	0	B	43	nd	nd
10	240	B	nd	3	1
a 1,3-프로판디올의 존재는 공통 방법에서 기재된 바와 같이 GC/MS로 확인했다.
b 120 시까지, 포도당이 고갈되었고 추가의 포도당을 최종 농도 1 %가 되도록 첨가했다.

실험 3. 클로스트리듐 파스토라니눔 ATCC 6013을 처음에 티오글리콜레이트 배지 (Difco (등록상표))에 두었다가 뒤이은 모든 연구를 위해 0.4 % 포도당으로 보강된 배지 A로 옮겼다. 나중 배지를 통해 몇회 옮긴 후, 상기한 배지 10 ml에서 보존 배양물의 일부 1 ml를 밤새 증식시켜 접종물을 제조했다. 메틸 비올리겐이 표 14에 지시한 농도로 새로운 배지병에 들어있는 일련의 시럽병을 하룻밤 배양물 1 ml로 접종하고 표 14에 지시한 시간 동안 다시 인큐베이션시켰다. 병을 포도당 이용률을 측정하기 위해 주기적으로 샘플로 취하고 1,3-프로판디올 및 포도당의 존재를 상기 ‘공통 방법’란에서 기재된 바대로 HPLC를 이용해 분석했다. 분석 결과를 표 14에 요약했다.

클로스트리듐 파스토리아눔 ATCC 6013에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환

병	MV(mM)	시간 (시)	포도당 (mM)	1,3-프로판디올 (mM)^a
1	0	0	22.5	0
1	0	5	0	0
2	0.1	0	26.5	0
2	0.1	5	0	0
3	1.0	0	25.3	0
3	1.0	5	10.0	2.4
3	1.0	9	0	2.4
a 1,3-프로판디올의 존재는 공통 방법에서 기재된 바와 같이 GC/MS로 확인했다.

실시예 14

간균, 스트렙토마이시즈 및 슈도모나스 종의 형질전환에서 사용하기 위한 일반 목적 발현 플라스미드의 제작

발현 벡터 pTacIQ

대장균 발현 벡터인 pTacIQ는 pBR322 [Sutcliffe 등, Cold Spring Harb, Symp. Quant. Biol. 43, 77 (1979)]의 EcoRI으로 삽입된 tac 프로모터 [Amann 등, Gene 25, 167 (1983)] 및 lacIq 유전자 [Farabaugh, Nature 274, 5673 (1978)]를 포함한다. 다중 클로닝 위치 및 종결 암호 서열 (서열 10)로 EcoRI에서 SphI까지의 pBR322 서열을 대체한다.

글리세롤 데히드라타제 유전자 ( dhaB1, 2, 3 )의 서브클로닝

5' 말단에 EcoRI 위치와 3' 말단에 XbaI 위치가 도입된 프라이머 (서열 41 및 42)를 사용하는 PCR을 통해 dhaB3 유전자의 전사해독프레임을 pHK28-26으로부터 증폭시켰다. 생성물을 pLitmus29 (New England Biolab, Inc. 제품, 미국 매사추세츠주 버버리 소재) 내로 서브클로닝하여 dhaB3를 함유한 pDHAB3를 제작했다.

pHK28-26으로부터 얻은 dhaB 오페론의 4 개 유전자의 전체 코딩 부위를 포함하는 부위를 제한 효소 KpnI 및 EcoRI을 사용하여 pBluescriptII KS+ (Stratagene 제품, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)로 클로닝하여 플라스미드 pM7을 생성했다.

dhaB (1, 2, 3, 4)가 들어있는 플라스미드 pM7을 ApaI 및 XbaI을 사용하여 소화시켜 dhaBX 유전자를 제거했다. 얻은 5.9 kb 단편을 정제하고 pDHAB3 (dhaB3 유전자 포함)로부터 얻은 325-bp ApaI-XbaI 단편과 결합시켜 dhaB (1, 2, 3)을 포함하는 pM11을 만들었다.

5' 말단에 HindIII 위치 및 공통 (consensus) RBS 리보솜 결합 위치와 3' 말단에 XbaI 위치를 도입한 프라이머 (서열 11 및 서열 12)를 사용하는 PCR을 통해 dhaB1 유전자를 위한 전사해독프레임을 pHK28-26로부터 증폭시켰다. 생성물을 pLitmus28 (New England Biolab, Inc. 제품) 내로 서브클로닝하여 dhaB1이 들어있는 플라스미드 pDT1을 생성했다.

dhaB1 유전자, dhaB2 유전자 및 dhaB3 유전자 일부를 포함하는 pM11로부터 NotI-XbaI 단편을 pDT1로 삽입하여 dhaB 발현 플라스미드, pDT2를 제조했다. pDT2로부터 얻은 dhaB (1, 2, 3) 유전자가 포함된 HindIII-XbaI 단편을 pTacIQ로 삽입하여 pDT3를 만들었다.

1,3-프로판디올 탈수소효소 유전자 ( dhaT )의 서브클로닝

완전한 1,3-프로판디올 탈수소효소 (dhaT) 유전자를 포함하는 pHK28-26의 KpnI-SacI 단편을 pBluescriptII KS+로 서브클로닝하여 플라스미드 pAH1를 만들었다. 5' 말단에 XbaI 위치와 3' 말단에 BamHI 위치를 도입한 합성 프라이머 (서열 13 및 서열 14)를 사용하여 주형 (template) DNA인 pAH1으로부터 PCR로 dhaT 유전자를 증폭시켰다. 생성물을 SrfI 위치에서 pCR-Script (Stratagene 제품)으로 서브클로닝하여 dhaT를 포함하는 플라스미드 pAH4 및 pAH5를 제작했다. 플라스미드 pAH4는 pCR-Script 에서 lac 프로모터로부터 발현되기 위한 정확한 위치에서 dhaT 유전자를 포함하며, pAH5는 dhaT 유전자를 반대 방향으로 포함한다. pAH4로부터 얻은 dhaT 유전자를 포함하는 XbaI-BamHI 단편을 pTacIQ에 삽입하여 플라스미드 pAH8을 얻었다. RBS를 포함하는 pAH8로부터 얻은 HindIII-BamHI 단편을 pBluescriptII KS+로 삽입하여 pAH11을 만들었다. RBS, dhaT 유전자 및 종결 암호가 포함된 pAH8로부터 얻는 HindIII-SalI 단편을 pBluescriptII SK+로 삽입하여 pAH12를 만들었다.

dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT 를 위한 발현 카세트의 제작

dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT를 위한 발현 카세트는 상기한 개별 dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT 서브클론으로부터 표준 분자생물학 방법을 사용하여 조립했다. RBS, dhaT 유전자 및 종결 암호가 들어있는 pAH8로부터 얻은 SpeI-KpnI 단편을 pDT3의 XbaI-KpnI 위치로 삽입하여 pAH23을 만들었다. pAH23의 dhaB3 및 dhaT 유전자 사이의 SmaI-EcoRI 단편을 제거하여 pAH26을 만들었다. pDT2에서 얻은 EcoRI 위치를 포함하는 SpeI-NotI 단편을 사용하여 pAH26의 SpeI-NotI 단편을 대체하고 pAH27를 생성했다.

dhaT 및 dhaB (1, 2, 3)을 위한 발효 카세트의 제작

dhaT 및 dhaB (1, 2, 3)을 위한 발현 카세트를 표준 분자생물학 방법을 사용하여 상기한 개별 dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT 서브클론으로부터 조립했다. pDT3로부터 얻은 dhaB (1, 2, 3)이 포함된 SpeI-SacI 단편을 SpeI-SacI 위치에 pAH11로 삽입하여 pAH24를 제작했다.

실시예 15

재조합 스트렙토마이시즈 리비단스에 의한 1,3-프로판디올의 제조

포도당 이성질화효소 프로모터의 서브클로닝

벡터 pCOs121 (서열 15) 또는 pCO121low (서열 16)로부터 포도당 이성질화 효소 프로모터의 두 개의 유형을 5' 말단에 SpeI 및 EcoRI 위치 및 3' 말단에 HindIII 위치를 도입한 프라이머 (서열 17 및 18)를 사용하는 PCR로 증폭시켰다. 생성물을 pLitmus29 (New England Biolabs, Inc. 제품, 미국 매사추세츠주 버버리 소재)로 서브클로닝하여 플라스미드 pDT7 및 pDT8을 제작했다.

dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT 를 위한 발현 카세트 제작

제한효소 HindIII 및 SalI을 사용하여 pAH27 (실시예 14)에서 얻은 dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT를 위한 4.1 kb 발현 카세트를 pDT7 또는 pDT8로 삽입함으로써 각각 pDT11 및 pDT12를 만들었다.

스트렙토마이시즈에서 dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT 의 동시 발현을 위한 플라스미드의 제작

dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT를 위한 4.3 kb 발현 카세트를 EcoRI 및 SalI를 사용하여 소화시켜 pDT11 또는 pDT12로부터 제거했다. 벡터 pIJ488-101을 제한 효소 EcoRI 및 XbaI를 사용하여 잘랐다. 발현 카세트와 벡터를 Sal-Xba 링커 (서열 19 및 20)을 따라 결합시켜 각각 pDT13 및 pDT14를 제조했다.

pIJ488-101은 스트렙토마이시즈 리비단스로부터 얻은 pIJ101 [Kendall 및 Cohen, J. Bacteriol. 170, 4634 (1988)] 및 대장균에서 얻은 pUC18 [Norrander 등, Gene, 26, 101 (1983)]로부터의 복제 개시점을 포함한다. 서열의 출처는 다음과 같다: 염기 1 내지 2086은 pIJ101 (1-2086)에서, 염기 7688 내지 8437은 pIJ101 (8080-8830)으로부터 얻은 것이다. 염기 2087 내지 3368은 S. 아주로이스 (azureus)에서 얻은 티오스트렙톤 내성 유전자로부터 얻은 것이다 [Thompson 등, Gene, 20, 51 (1982)]. 염기 3369 내지 7687은 KpnI 위치에 삽입된 S. 에리트로이스 (erythreus)로부터 얻는 에리트로마이신 내성 유전자가 들어있는 pUC18에서 얻은 것이다.

dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT 을 이용한 스트렙토마이시즈 리비단스의 형질전환

플라스미드 pDT13 또는 pDT14를 표준 프로토플라스트 형질전환 기술 [Hopwood 등, Genetic Manipulation of Streptomyces, The John Innes Foundation (1985)]을 사용하여 스트렙토마이시즈 리비단스 TK23으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 30 ℃에서 인큐베이션된 50 ㎍/ml 티오스트렙톤 함유 플레이트에서 선별했다. 형질전환체로부터의 배종 (spore)을 새로운 플레이트로 옮겨 순수한 배양물을 얻었다.

글리세롤 데히드라타제 활성의 검출

스트렙토마이시즈 형질전환체를 1 % 포도당, 2 % 글리세롤, 1 mg/ℓ 비타민 B12, 50 ㎍/ml 티오스트렙톤이 더 첨가된 TSB (트립톤 소이 배양액, Difco 제품, 미국 미시간주 디트로이트 소재) 25 ml에서 3 일 동안 30 ℃에서 증식시켰다. 원심분리하여 세포를 회수하고 100 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) 1 ml에서 재현탁시켰다. 세포를 프렌치 프레스 (French Press) (20,000 psi)를 사용하여 깨고 세포 추출물을 상기 ‘공통 방법’란에 기재한 바와 같이 글리세롤 데히드라타제에 대해 분석했다. pDT13 (클론 #8) 또는 pDT14 (클론 #2)로 형질전환된 S. 리비단스 TK23로부터의 세포 추출물은 고유 활성도가 0.1 U/mg인 글리세롤 데히드라타제를 함유하고 있었다.

재조합 스트렙토마이시즈 리비단스에서 1,3-프로판디올의 제조

TSA 플레이트로부터 접종된 S. 리비단스 TK23/pDT14 (클론 #2) (ATCC 98052. S. 리비단스 균주 SL 14.2로도 밝혀짐)를 250 ml 플라스크 내의 1 % 포도당, 2 % 글리세롤, 1 mg/ℓ 비타민 B12, 50 ㎍/ml 티오스트렙톤이 첨가된 TSB (트립톤-소이 배양액, Difco 제품, 미국 미시간주 디트로이트 소재) 25 ml에서 증식시켰다. 진탕 플라스크를 30 ℃에서 3 일 동안 격렬하게 진탕시키면서 인큐베이션한 후, 1,3- 프로판디올 3 mg/ℓ가 상기 ‘공통 방법’란에 기재된 GC/MS 분석 (TMS 도함수)으로 상층물에서 검출되었다.

실시예 16

재조합 스트렙토마이시즈 리비단스를 사용하는 D-포도당으로부터 1,3-프로판디올의 제조

pDT13 또는 pDT14를 포함하는 스트렙토마이시즈 리비단스 TK23에 의한 1,3-프로판디올 제조를 증명하기 위해 진탕-플라스크 배양물 (삼각 플라스크, 전체 부피 중 액체 부피 1/10)에서 호기성으로 30 ℃에서 증식시켰다.

2일 된 TSA-플레이트 (트립티카제 콩 아가, BBL #11043)으로부터 접종하여 영양 배지 (rich media) 진탕-플라스크에서 배양을 시작했다. 영양 배지는 TSB (트리티카제 소이 배양액; BBL #11768), 액체 배양액 (Liquid Broth) (1 ℓ당 트립톤 16 g, 효모 추출물 10 g 및 NaCl 5 g 함유), 배지 B (1 ℓ당 포도당 10.0 g, NTA를 시트르산으로 대체한 개질된 발치스 미량원소 용액 (Modified Balch's Trace-Element Solution) 2 ml, Na₂CO₃ 2.0 g, K₂HPO₄ 4.0 g, 비타민 B₁₂ 1 mg으로 보강된 TSB, 최종 pH 7.2) 또는 배지 C (최종 pH 6.4인 배지 B) 중 하나이다. 개질된 발치스 미량원소 용액의 조성은 문헌 [P. Gerhardt 등, 편, Methods for General and Molecular Bacteriology, 158쪽, American Society for Microbiology, Washington D.C. (1994)]에서 발견할 수 있다. 1/30 (v/v) 접종물을 사용하여 2일 된 액체 TSB 배양액으로부터 접종함으로써 최소 배지 진탕-플라스크 내에서 배양을 시작했다. 최소 배지는 MM322 (1 ℓ당 포도당 12.0 g, K₂HPO₄ 11.3 g, (NH₄)₂SO₄ 1.0 g, Difco 효모 추출물 0.2 g, NaCl 0.1 g, 비타민 B₁₂ 2 mg 및 상기한 개질된 발치스 미량원소 용액 10 ml을 함유, pH 6.7 (HCl)), 배지 D (2 g/ℓ Na₂CO₃로 보강된 MM322 배지, 최종 pH 7.2) 또는 배지 E (배지 D, 최종 pH 6.4) 중 하나이다. 배지 B 및 C 및 최소 배지를 필터 멸균하고 다른 배지를 오토클레이브를 실시했다.

진탕-플라스크를 30 ℃에서 2 일 동안 격렬하게 진탕시키면서 인큐베이션한 후, 상층물의 HPLC 분석하기 위해 이들로부터 샘플을 취했다. 포도당을 첨가하고 배양물을 호기성 조건하에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후 배양물을 25 ml 부피의 유리 튜브로 옮겼다 (거의 꽉 찰 정도로 채움). 이어서 이들 튜브를 호기성 조건하의 30 ℃에서 인큐베이션시킨다. 2 내지 5일 동안 인큐베이션시킨 후, 상층물 중의 1,3-프로판디올을 상기 ‘공통 방법’란에 기재된 바와 같이 HPLC로 검출했다.

실시예 17

바실러스에서 dhaB (1-3) 및 dhaT 의 과발현을 위한 플라스미드와 일반 목적 플라스미드의 제작 및 재조합 리케니포르미스균 및 고초균에 의한 1,3-프로판디올의 제조

일반 목적 발현 플라스미드 제작

증식하는 높은 복제수 셔틀 벡터 pVS02를 사용하여 dhaB(1-3) 및 dhaT를 바실러스에서 동시발현시켰다. pVS02는 고초균 apr 프로모터와 융합된, 렌투스균 (Bacillus lentus)에서 얻은 알칼리성 세린 프로티아제를 보유하는 EcoRI/BamH1 단편을 pBS19 내로 클로닝함으로써 제작했다. pBS19는 EcoRI/BamHI 단편이 pUC19에서 얻은 EcoRI/HindIII 폴리링커 (Boehringer Mannheim 제품)에 의해 대체된 pBS42 Band 및 Henner, DNA 3, 17 (1984)의 유도체이다. 서열분석 및 PCR 반응을 촉진하기 위해 45 bp 합성 링커 (서열 21)를 프로티아제 유전자의 말단과 전사 종결 암호 사이에 PCR에 의해 도입했다.

증식하는 낮은 복제수 서틀 벡터 pSS15-B를 사용하여 바실러스에서 dha(1-3) 및 dhaT를 동시발현시켰다. 플라스미드 pHP13 Haima 등, Mol. Gen. Genet. 209, 335 (1987)를 HindIII/SalI (폴리링커에 존재하는 위치)로 자르고 T4 DNA 중합효소로 말단을 채우고 재결합시켜 pSS13를 얻어 플라스미드 pSS15-B를 제작했다. pVS02로부터 얻은 2 kb EcoRI/BamHI 단편을 플라스미드 pSS13의 EcoRI/BamHI 위치로 삽입하여 pSS15-B를 만들었다.

dhaB (1-3) 및 dhaT 카세트의 과발현을 위한 플라스미드

dhaT의 5' 말단에 바실러스 공통 리보솜 결합 위치를 만들기 위해, 합성 프라이머 (서열 22 및 서열 23)을 어닐링 (annealing)함으로써 얻은 EcoRI/Xba 링커를 pAH23의 EcoRI/XbaI 위치로 삽입하여 pM17을 제작했다. 합성 프라이머 (서열 24와 서열 25)를 사용하여 HindIII/BglII 링커를 플라스미드 pM17의 HindII/bglII 위치에 첨가함으로써 dhaB1의 5' 말단에서 SalI 위치를 삽입하여 pM20을 제작했다. 플라스미드 pM20으로부터 0.3 kb MluI/KpnI 단편을 플라스미드 pAH4로부터 얻은 0.3 kb MluI/KpnI으로 대체함으로써 HindIII 위치를 삽입하여 pM21을 제작했다.

SalI-XbaI 링커 (서열 26 및 27)를 제한 효소 SalI-XbaI로 자른 pAH5에 삽입하여 pDT15를 제작했다. 이 링커는 XbaI 위치를 파괴하며, 해독프레임을 변화시켜 dhaT 유전자가 pSS15-B 및 pVS2의 프로티아제 코딩 서열의 전사해독프레임으로 융합된다. pDT15로부터 취한 1 kb SalI-MluI 단편을 pAH24에 삽입하여 기존의 SalI-MluI 단편을 대체함으로써 pDT17을 제작했다.

SalI-XbaI 링커 (서열 28 및 29)를 제한 효소 SalI-XbaI로 자른 pAH5에 삽입하여 pDT16을 제작했다. 이 링커는 XbaI 위치를 파괴하며, 해독프레임을 변화시켜 dhaT 유전자가 pUSH1 Schon 및 Schuman, Gene 147, 91 (1994)의 폴리-His 코딩 서열의 전사해독프레임으로 융합된다. pDT16로부터 취한 1 kb SalI-MluI 단편을 pAH24에 삽입하여 기존의 SalI-MluI 단편을 대체함으로써 pDT18을 제작했다.

(dhaB(1-3)이 포함된) 플라스미드 pDT4는 pDT2로부터 얻은 2.7 kb EcoRI/XbaI 단편을 EcoRI/XbaI로 잘린 pUC18 (Boehringer Mannheim 제품)로 도입하여 제작했다.

바실러스에서 dhaT 및 dhaB (1-3)의 과발현을 위한 플라스미드

pDT17을 SacI으로 자르고 말단을 T4 DNA 중합효소로 채우고 DNA를 SalI으로 잘라 dhaT 및 dhaB를 포함하는 단편을 떼어냈다. 그 다음 단편을 HindIII (T4 DNA 중합효소를 이용해 말단을 블런트 말단 (blunt)화함) 및 SalI으로 잘린 pSS15-B에 결합시켜 pM27을 제작했다.

lac 기재 유도계를 사용하는 바실러스에서 dhaB (1-3)의 과발현을 위한 플라스미드

플라스미드 pDT4에서 얻은 dhaB (1-3)를 포함하는 2.7 kb BglII/HindIII 단 편을 pUSH1의 폴리링커에 HindIII/BamHI 위치로 클로닝하여 pM26을 제작했다. dhaB1 유전자를 pUSH1의 폴리-His 코딩 서열의 전사해독프레임으로 융합시켰다.

플라스미드를 이용한 바실러스의 형질전환

플라스미드 pM26 및 pM27로 자연적 형질전환 (natural transformation) [McCuen 및 Thome, J. Bacteriol. 107, 636-645 (1971)]에 의해 리케니포르미스균 BG307을 형질전환하고 각각 10 ㎍/ml 카나마이신 및 30 ㎍/ml 클로람페니콜 상에서 선별했다. 표준 프로토플라스트 형질전환 기술 [Pragai 등, Microbiology, 140, 305 (1994)]를 사용하여 동일한 플라스미드로 리케니포르미스균 균주 BG188을 형질전환시키고 상기와 같이 선별했다. 고초균 균주 BG2864를 플라스미드 pM27로 자연적 형질전환에 의해 형질전환시켰다. 플라스미드를 포함하는 형질전환체를 10 ㎍/ml 클로람페니콜을 함유한 LA 플레이트 상에서 선별했다.

플라스미드 pM26으로 고초균 균주 1E62 [Saito 등, Mol. Gen. Genet., 170, 117 (1979)]로 형질전환하고 플라스미드를 갖는 형질전환체를 10 ㎍/ml 에리트로마이신 및 20 ㎍/ml 카나마이신을 함유한 LA 플레이트 상에서 선별했다.

모든 형질전환체를 30 ℃에서 증식시켰다.

글리세롤 데히드라타제 활성의 검출

pM26 (클론 #8)로 형질전환된 리케니포르미스균 BG188을 30 ℃, 1 % 포도당 및 10 ㎍/ml 카나마이신이 첨가된 LB (Difco 제품) 25 ml에서 밤새 증식시켰다. 세포를 원심분리하여 회수하고 1 ml의 0.1 mM 트리신 (tricine)/KOH 완충액 (pH 8.2), 50 mM KCl, 1 mM 디티오트레이톨 및 200 μM 페닐메틸술포닐 플루오라이드에 재현탁시켰다. 세포를 프렌치 프레스 (20,000 psi)에서 깨서 세포 추출물을 얻고 글리세롤 데히드라타제 분석을 상기 ‘공통 방법’란에 기재되어 있는 바와 같이 수행했다. 0.036 U/mg의 고유 활성도를 얻었다. 1,3-프로판디올 탈수소효소의 고유 활성도를 상기 ‘공통 방법’란에서 기재한 대로 측정한 결과 0.2 U/mg였다.

재조합 바실러스에서 1,3-프로판디올의 제조

pM26 (클론 #8)로 형질전환된 리케니포르미스균 균주 BG188 (ATCC 98051)를 30 ℃, 1 % 포도당 및 10 ㎍/ml 카나마이신이 첨가된 LB (Difco 제품) 25 ml가 들어있는 진탕-플라스크에서 격렬하게 진탕시키면서 밤새 증식시킨 후, 1 ml를 사용하여 250 ml 플라스크 내의 1 % 포도당, 1 % 글리세롤, 0.33 ㎍/ml 비타민 B12 및 10 ㎍/ml 카나마이신이 첨가된 LB 25 ml를 접종시켰다. 진탕-플라스크를 격렬하게 진탕시키면서 30 ℃에서 인큐베이션시키고 증식 9 시간 후, 300 ㎕ 1,3-프로판디올을 상기‘공통 방법’란에 기재된 바와 같이 GC/MS (TMS 도함수)로 검출했다.

pM27 (클론 #1)로 형질전환된 고초균 균주 BG2864 (ATCC 98050)를 250 ml 플라스크 내의 1 % 포도당, 1 % 글리세롤, 0.33 ㎍/ml 비타민 B12 및 10 ㎍/ml 클로람페니콜이 들어있는 진탕-플라스크에서 증식시켰다. 진탕-플라스크를 격렬하게 진탕시키면서 30 ℃에서 인큐베이션시키고 증식 43 시간 후, 1,3-프로판디올을 검출했다.

재조합 바실러스에 의한 3-히드록시프로피온알데히드의 제조

바실러스 발효는 전체 부피가 15.5 ℓ인 Biolafitte 발효기에서 처음에는 부피 7 ℓ로 작동하고 작동 도중에 9.5 ℓ로 증가시키면서 수행했다. 0.8 bar의 배 압과 임펠러 속도 650 rpm로, 7 ℓ/분의 속도로 공기를 폭기시키면서 호기성 조건을 유지했다 [호기성 조건은 용존 산소 백분율 (%)로 정의 (주변 압력에서 정의된 100 % DO)되며, 장착된 DO-탐침자로 측정하며 최소치인 35 % DO까지를 호기성으로 간주함]. 10 % H2SO4 또는 28 % NH4OH를 자동 첨가하여 pH를 6.7로 유지했다. 온도는 30 ℃로 유지했다.

하기의 화합물을 탱크로 1 회분을 넣고 121 ℃에서 30 분 동안 멸균했다 (단위 : g/ℓ) : NaH₂PO₄·1H₂O 6 g/ℓ, K₂HPO₄ 10 g/ℓ, NaCl 1.5 g/ℓ, (NH₄)₂SO₄ 10 g/ℓ, FeCl₃ 0.2 g/ℓ, 트립톤 1.5 g/ℓ, 효모 추출물 6 g/ℓ, 발치스 미량원소 용액 10 ml [P. Gerhardt 등 편, Methods for General and Molecular Bacteriology, 158쪽, American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)] 및 2 MAZU DF204 (주문된 거품억제제). 멸균 후에, 50 % 포도당 공급액 350 g을 카나마이신 및 클로람페니콜 (둘다 최종 농도 10 mg/ℓ 이하로)과 함께 첨가했다.

LBG 1 % (= 트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 5 g, 포도당 10 g)에서 증식된 24 시간된 리케니포르미스균 BG188/pM26 (클론 #8) 진탕 플라스크의 0.6 ℓ를 사용하여 발효기를 접종했다. 이어서 배양물을 증식하고 포도당을 소모했다: 6.60 이상의 pH 상승은 포도당 공급을 촉발한다 (50 % 포도당, 오토클레이브됨, 0.7 g/분의 속도). 45 시간 후, 영양분의 첨가했다 (발치스 미량원소 용액 50 ml, K2HPO4 14 g, 효모 추출물 14 g, 비타민 용액 14 ml, pH 6.60, 필터 멸균). 70 시간 후, 비타민 B12를 최종 농도 10 mg/ℓ 이하로 첨가했다. %DO를 처음 92 시간 동안은 호기성 수준으로 유지했다. 포도당은 작동하는 동안 (약간) 과량으로 존재하도록 했다 (처음 92 시간) 호기성 시기에서는 0.2 내지 12 g/ℓ; (92 내지 164 시간) O2 제한 시기에는 0.2 내지 36 g/ℓ. 87 시에 취한 샘플에서 3-히드록시프로피온알데히드 존재가 추측되었으며, 상층 샘플을 환원제인 나트륨보로히드리드로 처리한 후 1,3-프로판디올의 검출로 확인되었다.

실시예 18

바실러스에서 dhaT 및 dhaB (1-3) 카세트의 과발현을 위한 다른 플라스미드

바실러스에서 dhaT 및 dhaB (1-3) 카세트의 과발현을 위한 플라스미드

플라스미드 pM21에서 얻은, dhaB(1-3) 및 dhaT가 들어있는 SalI/HindIII 단편을 5 kb Sal/HindIII pVS02 벡터와 결합시켜 pM22를 제작했다. pM22는 높은 복제수 벡터에 apr 프로모터하에서 dhaB 및 dhaT를 갖고 있었다.

플라스미드 pM21에서 얻은 SalI/HindIII 단편을 pSS15-B로부터 얻은 5.8 kb Sal/HindIII 단편과 결합시켜 pM23을 제작했다. pM23은 낮은 복제수 벡터에 apr 프로모터하에서 dhaB 및 dhaT를 갖고 있었다.

pDT17을 SacI로 자르고 말단을 T4 DNA 중합효소로 채우고 DNA를 SalI으로 잘라 dhaT 및 dhaB를 포함하는 단편을 떼어냈다. 이어서 이 단편을 HindIII (말단을 T4 DNA 중합효소를 이용하여 블런트 말단화함) 및 SalI으로 잘린 pVS02에 결합시켜 pM25를 제작했다.

lac-기재 유도계를 이용하는 바실러스에서 dhaT 및 dhaB (1-3) 카세트의 과발현을 위한 플라스미드

pDT18을 SacI로 자르고 말단을 T4 DNA 중합효소로 채우고 DNA를 SalI으로 잘라, 바실러스 공통 리보솜 결합 위치를 갖는 두 유전자인 dhaT 및 dhaB를 포함하는 단편을 떼어냈다. 이어서 이 단편을 HindIII (말단을 T4 DNA 중합효소를 이용하여 블런트 말단화함) 및 SalI으로 잘린 pUSH1 (Schon 및 Schuman의 앞의 책)에 결합시켜 pM24를 제작했다.

실시예 19

재조합 바실러스에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올로의 전환

바실러스를 위한 증식 조건

리케니포르미스균 및 고초균에 의한 1,3-프로판디올 제조를 증명하는 증식을 (상기한 바와 같이) 30 ℃ 또는 35 ℃에서 진탕-플라스크 배양 (삼각 플라스크) 및 15.5 ℓ (총부피) Biolafitte 발효기 (작동 부피 7 내지 10 ℓ) 내에서 수행했다.

LBG (1 ℓ당 트립톤 16 g, 포도당 10 g, 효모 추출물 10 g 및 NaCl 5 g 함유)를 하루가 지난 TSA-플레이트 (트립티카제 소이 아가, BBL #11043)로부터 접종함으로써 배양을 시작했다 이어서 이들 진탕-플라스크를 사용하여 D-포도당에서 1,3-프로판디올의 전환이 정확히 증명되는 발효기 또는 진탕-플라스크를 접종시켰다.

진탕-플라스크에서의 배치 배양

영양 배지는 TSB (트리티카제 소이 배양액; BBL #11768), LBG, 배지 B (1 ℓ당 포도당 10.0 g, NTA를 시트르산으로 대체한 개질된 발치스 미량원소 용액 2 ml, Na₂CO₃ 2.0 g, K₂HPO₄ 4.0 g, 비타민 B₁₂ 1 mg으로 보강된 TSB, 최종 pH 7.2) 또는 배지 C (pH 6.4인 배지 B) 중 하나이다. 개질된 발치스 미량원소 용액의 조성은 문헌 [P. Gerhardt 등, 편, Methods for General and Molecular Bacteriology, 158쪽, American Society for Microbiology, Washington D.C. (1994)]에서 발견할 수 있다. 최소 배지는 MM322 (1 ℓ당 포도당 12.0 g, K₂HPO₄ 11.3 g, (NH₄) ₂SO₄ 1.0 g, Difco 효모 추출물 0.2 g, NaCl 0.1 g, 비타민 B₁₂ 2 mg 및 상기한 개질된 발치스 미량원소 용액 10 ml을 함유, 최종 pH 6.7 (HCl)), 배지 D (2 g/ℓ Na₂CO₃로 보강된 MM322 배지, 최종 pH 7.2) 또는 배지 E (배지 D, 최종 pH 6.4) 중 하나이다. 배지 B 및 C 및 최소 배지를 필터 멸균하고 다른 배지를 오토클레이브를 실시했다.

진탕-플라스크를 30 ℃에서 1 일 동안 격렬하게 진탕시키면서 인큐베이션한 후, 상층물의 HPLC 분석을 위해 이들로부터 샘플을 취했다. 포도당을 첨가하고 배양물을 호기성 조건하에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후 배양물을 25 ml 부피의 유리 튜브로 옮겼다 (거의 꽉 찰 정도로 채움). 이어서 이들 튜브를 혐기성 조건하의 30 ℃에서 인큐베이션시킨다. 1 내지 5일 동안 인큐베이션시킨 후, 상층물 중의 1,3-프로판디올을 상기 ‘공통 방법’란에 기재된 바와 같이 HPLC로 검출했다.

발효기에서 배치 및 페드배치 배양

진탕-플라스크 (LBG-배지)로부터 얻는 총 부피 배양물 600 ml를 사용하여 6.4 ℓ의 배지를 1회분 넣고 최소 배지의 경우 30 분, 영양 배지의 경우 45 분 동 안 오토클레이브한 발효기를 접종시켰다. 발효기에서 전형적인 최소 배지는 배지 D이며, 전형적인 ‘영양 (rich)’ 배지는 1 ℓ당 50 g의 효모 추출물이 첨가된 배지 D이다. 발효기를 오토클레이브한 후 주사기 및 발효기 내벽에 있는 격막 방출구를 사용하여 필터 멸균된 첨가물 (비타민 B₁₂ 또는 영양요구균을 위한 보충물)을 첨가했다.

배압 (BP, 0.1 내지 0.5 bar), 폭기 (1 분당 1 ℓ의 공기, 0.4 내지 1 vvm), 교반 (rpm, 200 내지 600), 온도 (T, 30 내지 37 ℃), 용존 산소 (%DO) 및 pH (NH4OH 및 H2SO4 또는 H3PO4 첨가에 의한 5.8 내지 7.2)를 관찰하고 지시한 바와 같이 원하는 값으로 조절했다.

접종 후, 세포를 처음 14 시간 동안 배치식으로 증식시킨 후 포도당 공급을 시작했다. 혐기성 증식/제조 동안에 %DO는 rpm 및 BP의 감소에 의해, 추가적으로 공기를 N2로 대체함으로써 0 %까지 지시한 바대로 되도록 한다.

발효기 및 진탕-플라스크의 상층물에서 샘플을 채취하여 OD550 기록 (증식) 및 효소적 포도당 분석을 수행했고 상층물은 또한 상기 공통 방법란에 약술된 표준 순서에 따른 HPLC 분석에도 사용된다; 1,3-프로판디올은 이 상층물에 존재한다.

실시예 20

dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT 를 사용한 슈도모나스의 형질전환 및 1,3-프로판디올 제조의 증명

슈도모나스에서 dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT 의 동시 발현을 위한 플라스미드의 제작

pAH27로부터 얻는 dhaB (1, 2, 3) 및 dhaT를 위한 4.1 kb 발현 카세트를 제한 효소 EcoRI 및 SalI을 사용하여 벡터 pMMB66EH [Fueste 등, Gene, 48, 119 (1986)] 및 pMMB207 [Morales 등, Gene, 97, 39 (1991)]에 삽입하여 각각 pDT10 및 pDT9를 제작했다.

pDT9 발현 플라스미드를 사용한 P. 아에루기노사 PAO 2845의 형질전환

P. 아에루기노사 PAO 2845 세포를 형질전환시키기 위해 L-브로쓰에서 200 rpm에서 진탕시키면서 37 ℃에서 밤새 증식시켜 준비했다. 이 배양물을 써서 1 : 25로 새로운 미리 가온 및 폭기된 새 L-브로쓰 25 ml를 접종했다. 새로운 배양물을 2 내지 3 시간 동안 초기 대수기까지는 37 ℃, 200 rpm에서 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리하여 모으고 5 % 디메틸술폭시드가 함유된 10 ml의 얼음 냉각 0.15 M MgCl₂로 2회 세척하고 디메틸술폭시드 용액 2 ml에 재현탁시켰다. 세포 현탁액 (0.2 ml)를 100 내지 200 ng pDT9 DNA와 합하고 60 분 동안 얼음 위에 두었다. 반응 혼합물을 2 분 동안 37 ℃에서 열충격을 주고 옮겨서 5 분 동안 얼음에 두었다. L-브로쓰 (0.5 ml)를 첨가하고 세포를 20 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 단독 콜로니를 37.5 ㎍/ml 클로람페니콜이 보강된 영양분 아가 플레이트로부터 얻었다.

P. 아에루기노사 PAO1으로 pDT10의 접합 (conjugal) 이식

플라스미드 pDT10을 문헌 [Figurski 및 Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 76, 1648 (1979)]의 방법에 의해 PAO1으로 이식시켰다. pDT10로 대장균 AC80 [Chakrarty 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 3109 (1978)]을 형질전환시켜 공여자 균주를 만들었다. 헬퍼 균주 (helper strain)를 pRK2013 (Figurski 및 Helinski의 앞의 책)을 함유한 대장균 HB101이었다. 수여자 균주는 슈도모나스 아에루기노사 PAO1 [Royle 등, J. Bacteriol., 145, 145 (1981)]이었다. 각 균주의 배양물 (5 ml)을 37 ℃, LB에서 밤새 증식시켰다. 세포를 0.9 % NaCl로 세척하고 200 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 세포를 서로 혼합하고 LA 플레이트 (Luria Agar, Difco)로 펴발랐다. 플레이트를 6 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 플레이트에서 제거하고 250 ㎍/ml 카르벤실린이 함유된 PIA (Difco) 플레이트로 옮기고 밤새 증식시켰다. 단독 콜로니를 동일한 배지로 분리했다.

글리세롤 데히드라타제 및 1,3-프로판디올 탈수소효소 활성의 검출

슈도모나스 아에루기노사 PAO1/pDT10을 250 ㎍/ml 카르벤실린 및 0.1 mM의 IPTG가 함유된 2XYT (16 g/ℓ 효모 추출물, 16 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ NaCl) 25 ml로 증식했다. 세포를 원심분리하여 회수하고 100 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) 1 ml에 재현탁시켰다. 세포를 프렌치 프레스로 15,000 psi에서 깼다. 이어서 조추출물을 글리세롤 데히드라타제 및 1,3-프로판디올 탈수소효소 활성에 대해 표준 분석을 사용하여 분석했다. 단백질을 바이오래드 (Bio-Rad) (Bradford) 단백질 분석에 의해 결정했다. 글리세롤 데히드라타제에 대한 고유 활성도는 5 U/mg였다. 1,3-프로판디올 탈수소효소의 고유 활성도는 20 U/mg였다. 유사하게 제조된, pDT9로 형질전환된 P. 아에루기노사 PAO 2845로부터 얻는 조추출물에는 0.05 U/mg 글리세롤 데히드라타제 활성이 포함되었다.

pDT9 플라스미드를 갖는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 1,3-프로판디올의 제조

pDT9 플라스미드를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 PAO 2845 (ATCC 55760)를 37 ℃에서, 25 ㎍/ml 클로람페니콜이 보강된 2XYT 배지에서 200 rpm으로 진탕하면서 증식시켰다. 밤새 증식한 후, 세포 현탁액 일부를 증식 배지 (3 부 2XYT 배지 + 1 부 HEPES0.1 배지, 0.25 % (w/v) 포도당, 0.2 % (w/v) KNO3, 25 ㎍/ml 클로람페니콜, 50 mg/㎍ 효모 추출물 및 80 mg/ℓ 영양분 브로쓰로 보강됨)로 옮겨 OD₆₆₀ nm가 0.5 내지 0.8 AU인 세포 현탁액을 얻었다. HEPES0.1 배지에는 하기의 성분이 포함된다: NH₄Cl 9.52 mM; MgCl₂·6H₂O 0.523 mM; K₂SO₄, 0.276 mM; HEPES (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N-[2-에탄술폰산]) 40 mM; 트리신 (N-트리스(히드록시메틸)메틸 글리신) 4 mM; FeSO₄·7H₂O 0.010 mM; K₂HPO₄ 0.132 mM; 및 하기의 성분의 최종 농도를 g/ℓ 단위로 제공하는 미량 무기물: 나트륨 시트레이트·6H₂O 0.001 g/ℓ; FeSO4?7H4O 0.0005 g/ℓ; CoCl2?6H2O 0.0001 g/ℓ; MnCl2?4H2O 0.00001 g/ℓ; ZnCl2 0.000005 g/ℓ; Na2MoO4?2H2O 0.000025 g/ℓ; NiCl2?6H2O 0.0001 g/ℓ; CuSO2?2H2O 0.00005 g/ℓ. 250 rpm에서 진탕시키면서 30 ℃에서 1 시간 증식한 후, 0.5 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드)를 증식 배지에 첨가하고 세포를 계속 증식시켰다. 대략 5 시간의 추가 증식 후에, 세포를 원심분리하여 상온에서 회수했다. 세포를 생성물 배지: 0.25 % (w/v) 포도당, 0.2 % (w/v) KNO3, 25 ㎍/ml 클로람페니콜, 50 mg/ℓ 효모 추출물 및 80 mg/ℓ 영양분 브로쓰로 보강된 HEPES0.1 배지로 3회 세척했다. 2벌로, 세척된 세포를 본래의 회수된 부피로, 0.2 % (v/v) 글리세롤이 함유된 생성물 배지 중에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 250 rpm에서 진탕시키면서 30 ℃의 질소 대기하에서 인큐베이션시켰다. 대략 1 시간 후 5 ㎍/ml 보조효소 B12 (5,6-디메틸-벤즈이미다졸일코바마이드 5-데옥시아데노신)을 세포 현탁액에 첨가하고 250 rpm으로 진탕시키면서 30 ℃에서 계속 인큐베이션시켰다. 세포 현탁액 샘플을 생성물 분석을 위해 주기적으로 모았다. 모으자마자 세포를 원심분리해서 샘플로부터 제거하고 수성 상층물을 분석할 때까지 - 20 ℃에서 냉동 보관했다.

확실한 표준을 기준으로한 보정을 통한 HPLC 분석한 결과 이들 세포 현탁액은 1,3-프로판디올을 제조했다는 것을 보여주었다. 결과를 표 15에 나타냈다. 생성물의 판별은 상기 공통 방법란 기재된 바와 같이 GC/MS 분석으로 확인했다.

pDT9 플라스미드를 포함하는 슈도모나스 아에루기노사에 의한 1,3-프로판디올의 제조

샘플	시간 (시)	1,3-프로판디올 (mM)
A	0	0
A	24	5.1
B	0	0
B	24	5.6

실시예 21

슈도모나스 아에루기노사를 사용하는 D-포도당으로부터 1,3-프로판디올의 제조

공통 증식 조건

PGSC Pseudomonas Genetic Stock Center, 미국 노쓰 캐롤라이나주 그린빌 East Carolina School of Medicine 소재)에서 얻은 슈도모나스 아에루기노사 PAO 2845를 기본 배지, HEPES0.1 배지에서 증식시켰다. HEPES0.1 배지의 성분은 하기와 같다: NH₄Cl 9.52 mM; MgCl₂·6H₂O 0.523 mM; K₂SO₄, 0.276 mM; HEPES (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N-[2-에탄술폰산]) 40 mM; 트리신 (N-트리스(히드록시메틸)메틸 글리신) 4 mM; FeSO₄·7H₂O 0.010 mM; K₂HPO₄ 0.132 mM; 및 하기의 성분의 최종 농도를 g/ℓ 단위로 제공하는 미량 무기물: 나트륨 시트레이트·6H₂O 0.001 g/ℓ; FeSO₄·7H₄O 0.0005 g/ℓ; CoCl₂·6H₂O 0.0001 g/ℓ; MnCl₂·4H ₂O 0.00001 g/ℓ; ZnCl₂ 0.000005 g/ℓ; Na₂MoO₄·2H₂O 0.000025 g/ℓ; NiCl₂·6H₂O 0.0001 g/ℓ; CuSO₂·2H₂O 0.00005 g/ℓ. HEPES0.1을 모든 실험에 사용했다: 보충물이 있는 경우는 별도로 기록된다.

유전자 중단 (gene interruption)에 의한 P. 아에루기노사 PAO 2845의 글리세롤 음성 돌연변이 제작

P. 아에루기노사 PAO 2845를 37 ℃에서 200 rpm으로 진탕시키면서 Nutrient Broth (Difco 제품, 미국 미시간주 디트로이트 소재)에서 밤새 증식시킨다. 세포를 원심분리하여 회수하고 표준 알칼리 용균 순서 (Sambrook, 1989)를 사용하여 세포로부터 DNA를 추출했다. glpR (글리세롤 이화작용 조절 단백질 유전자, Genbank ACCESSION #M60805)를 위한 전사해독프레임을 P. 아에루기노사 PAO 2845로부터 5' 말단에 EcoR1 위치를 도입한 프라이머 JJ-gplR-5' 및 JJ-glpR-3' (각각 서열 30 및 31)를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 그 다음, 이 DNA 단편을 플라스미드 pARO180 Parke, Gene 93, 135, (1990)내의 유일한 EcoRI 제한 위치에 결합시켜 플라스미드 pJJ10을 만들어낸다. pJJ10 결합 혼합물로부터 얻은 DNA로 형질전환된 대장균을 50 ㎍/ml 암피실린 및 0.08 mg/ml Xgal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토시드)가 포함된 Nutrient Agar (Difco 제품, 미국 미시간주 디트로이트 소재)에 펴발랐다. glpR 삽입의 높은 가능성을 나타내는 백색 콜로니를 따서 50 ㎍/ml 암피실린이 보강된 LB 배지로 옮겼다. 37 ℃에서 200 rpm으로 진탕시키면서 밤새 증식시킨 후 회수한 세포로부터 pJJ10 DNA를 얻는다.

pUC4K로부터 카나마이신 카세트 부위 (Pharmacia Cat. No. 27-4958-01)를 증폭시키고 제한 효소 Sty1 (Promega 제품, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 맞게 단편 말단을 변형시키는 데 적합하게 설계된 프라이머 (서열 32 및 33)를 사용하여 PCR을 통해 카나마이신 카세트 부위를 증폭시켜 4 kb 단편 pUC4k-sty1을 얻는다. pUC4k-sty1 DNA 단편을 플라스미드 pJJ10의 glpR 유전자 내의 Sty1 위치로 서브클로닝하여 플라스미드 pJJ11를 제작한다. pJJ11 결합 혼합물로부터 얻은 DNA로 형질전환된 대장균을 25 ㎍/ml 카나마이신 및 50 ㎍/ml 암피실린이 보강된 LB 아가 상에 펴발랐다. 25 ㎍/ml 카나마이신 및 50 ㎍/ml 암피실린이 보강된 LB 배지 중의 37 ℃에서 밤새 증식시킨 후, 5 내지 20개의 분리된 콜로니로부터 얻은 DNA를 개별적으로 모았다. 원하는 플라스미드 DNA의 존재는 겔 전기영동법으로 확인한다.

P. 아에루기노사 PAO 2845를 표준 프로토콜을 따라 pJJ11 DNA로 형질전환시킨다. 간단하게, P. 아에루기노사 세포를 L-브로쓰에서 200 rpm으로 진탕시키면서 37 ℃에서 밤새 증식시켜 형질전환을 위해 준비한다. 이 밤새 증식된 배양물로 25 ml의 새로운 미리 가온 및 폭기된 L-브로쓰를 1 : 25로 접종한다. 새로운 배양물은 37 ℃에서 200 rpm으로 2 내지 3 시간 (초기 대수기까지) 동안 인큐베이션시킨다. 세포를 원심분리하고 상층물을 가만히 따라낸다. 모아진 세포를 5 % 디메틸술폭시드가 함유된 얼음 냉각 멸균 0.15 M MgCl₂ 10 ml에 재현탁시키고 5 내지 10 분 동안 얼음에 둔다. 세포를 원심분리하고 상층물로부터 분리하고 5 % 디메틸술폭시드가 함유된 얼음 냉각 멸균 0.15 M MgCl₂ 10 ml에 재현탁시키고 5 내지 10 분 동안 얼음에 둔다. 상층물로부터 최종 원심분리 및 분리 후에 세포를 5 % 디메틸술폭시드가 함유된 얼음 냉각 멸균 0.15 M MgCl₂ 2 ml에 재현탁시킨다. 냉각된 세포 농축액의 일부 0.2 ml를 100 내지 200 ng의 pJJ11 DNA와 미리 냉각된 1.5 ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브에서 합하고 혼합물을 60 분 동안 얼음에 둔다. 그 다음 튜브를 신속하게 37 ℃ 물 중탕으로 옮겨 2 분간 두고 즉시 얼음으로 옮겨 5 분간 둔다. 대략 L-브로쓰 0.5 ml를 첨가하여 세포를 0.3 내지 1 시간 동안 37 ℃에서 부드럽게 진탕시키면서 인큐베이션시킨다. 인큐베이션된 세포를 회수한 후 세포 현탁액 일부 10 ㎕ 및 50 ㎕를 50 ㎍/ml 카나마이신으로 보강된 영양분 아가 플레이트 상에 펴바른다. 선택 배지 상에 나타난 콜로니를 1 % 숙신산 또는 1 % 글리세롤로 보강된 HEPES0.1 배지가 들어있는 아가 플레이트에서 증식시켜 스크리닝한다. 글리세롤에서 증식하지 못하지만 숙신산에서는 증식할 수 있는 클론을 다음에 사용하기 위해 15 % 글리세롤에 냉동시켜 보관한다.

pDT9를 이용한 gplR-P. 아에루기노사 PAO 2845로의 형질전환

상기한 방법으로 형질전환될 P. 아에루기노사를 제조한다. 냉각 세포 농축액의 일부 0.2 ml를 100 내지 200 ng의 pDT9 DNA와 미리 냉각된 1.5 ml 폴리프로필렌 원심분리 튜브에서 합하고 혼합물을 60 분 동안 얼음에 둔다. 튜브를 신속하게 37 ℃ 물 중탕으로 옮겨 2 분간 두고 즉시 얼음으로 옮겨 5 분간 둔다. 대략 L-브로쓰 0.5 ml를 첨가하여 세포를 0.3 내지 1 시간 동안 37 ℃에서 부드럽게 진탕시키면서 인큐베이션시킨다. 인큐베이션된 세포를 회수한 후 세포 현탁액 일부 10 ㎕ 및 50 ㎕를 37.5 ㎍/ml 클로람페니콜이 보강된 영양분 아가 플레이트 상에 펴바른다.

pDT9의 존재 여부에 대해 glpR --P. 아에루기노사 PAO 2845 형질전환체 스크리닝

상기의 형질전환체를 37.5 ㎍/ml 클로람페니콜이 보강된 영양분 아가 플레이트 상에 플레이팅하고 37 ℃에서 밤새 증식시킨다. 이들 선택 플레이트 상에 나타난 콜로니로부터 대략 20개를 따내어 37.5 ㎍/ml 클로람페니콜이 보강된 Nutrient Broth (Difco 제품, 미국 미시간주 디트로이트 소재) 10 ml로 옮겨 37 ℃에서 200 rpm으로 진탕시키면서 밤새 증식시킨다. 선택된 형질전환체에서 pDT9 플라스미드의 존재를 확인하기 위해 플라스미드를 추출하고 정제하고 EcoRI (Promega 제품, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)으로 자른다. 선형 DNA의 분자량을 겔 전기영동법으로 분석한다. 추가로, dhaT, dhaB1, dhaB2 및 dhaB3과 공통되는 서열이 있는 프라이머쌍 (각각 서열 34과 35, 36과 37, 8과 9, 4와 5)을 사용하여 PCR 증폭을 수행한 후 겔 전기영동법을 이용하여 단편 분자량을 결정하여 원하는 유전자의 존재를 확인한다.

pDT9로 형질전환된 glpR --P. 아에루기노사 PAO 2845의 대사적 스크리닝

추가로 특성화하기 위해 상기의 양성 형질전환체로부터 1 내지 20개의 클론을 선택한다. 세포를 37.5 ㎍/ℓ 클로람페니콜이 보강된 Nutrient Broth에서 호기성으로 30 ℃에서 250 rpm으로 진탕시키면서 밤새 증식시킨다. 세포를 1.5 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드)가 포함된 동일 배지로 1 : 8 희석액으로 옮겨 4 내지 6 시간 동안 증식시킨다. 그 다음, 세포를 원심분리하여 회수하고 10 g/ℓ 글리세롤, 0.03 g/ℓ 쇠고기 추출물, 0.05 g/ℓ 펩톤, 0.05 g/ℓ 효모 추출물 (모두 Difco 제품, 미국 미시간주 디트로이트 소재) 및 0.2 % KNO3로 보강된 HEPES0.1 배지로 1 회 세척한다. 이어서 공기 공간이 없이 본래 부피의 1/5의 세포를 작은 유리병에 재현탁시키고 100 rpm으로 진탕시키면서 30 ℃에서 18 내지 72 시간 동안 인큐베이션시킨다. 세포를 원심분리하여 제거하고 상층물을 HPLC로 분석하여 1,3-프로판디올이 존재하는지를 확인한다. 추가로, 1,3-프로판디올의 화학적 동일성을 기체 크로마토그래피-질량 분광법으로 확인한다.

pDT9로 형질전환된 glpR --P. 아에루기노사 PAO 2845 (ATCC 55760)에 의한 D-포도당에서 1,3-프로판디올의 제조

상기 스트리닝 순서로부터, 1,3-프로판디올의 최대량을 글리세롤로부터 제조하는 1 내지 5개의 클론을 250 rpm으로 진탕시키면서 30 ℃에서 37.5 ㎍/ℓ 클로람페니콜이 보강된 Nutrient Broth에서 호기성으로 증식시킨다. 세포를 1.5 mM IPTG가 포함된 동일 배지로 1 : 8 희석액으로 옮겨 4 내지 6 시간 동안 증식시키고 세 포를 원심분리하여 회수하고 10 g/ℓ 포도당, 0.03 g/ℓ 쇠고기 추출물, 0.05 g/ℓ 펩톤, 0.05 g/ℓ 효모 추출물 및 0.2 % KNO₃로 보강된 HEPES0.1 배지로 1 회 세척한다. 이어서 세포를 본래 부피의 1/5의, 공기층이 없는 작은 유리병에 재현탁시키고 100 rpm으로 진탕시키면서 30 ℃에서 약 36 시간 동안 인큐베이션시킨다. 세포를 원심분리하여 제거하고 상층물을 HPLC로 분석하여 1,3-프로판디올이 존재하는지를 확인한다. 추가로, 1,3-프로판디올의 화학적 동일성을 기체 크로마토그래피-질량 분광법으로 확인한다.

실시예 22

아스페르길러스 니거에서 dhaB1 , dhaB2 , dhaB3 및 dhaT 의 발현을 위한 발현 카세트의 제작

일반 발현 카세트 (pAEX)

아스페르길러스 니거 gla A 프로모터 및 종결 암호의 적절한 조절을 위한 충분한 부분을 포함하는, 플라스미드 pGPTpyrG Berka 등, "The development of gene expression systems for filamentous fungi", Biotechnol. Adv., 7:127-154 (1989)로부터 얻은 1.4 kb SpeI-EcoRV 단편을 pLITMUS39 (New England Biolabs 제품, 미국 매사추세츠주 버버리 소재)의 폴리링커의 Spe1 및 EcoRV 위치로 결합시켰다.

A. 니거를 위한 개별 클론 발현 카세트

개별적인 폐렴간균 dhaB 서브유닛 및 dhaT를 위한 전사해독프레임 (ORF's)을 클로닝하고 별도로 일반 발현 벡터 (pAEX)로 동일한 클로닝 기술을 사용하여 결합 시켰다.

각각의 개별 dhaB ORF 및 dhaT ORF의 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍을 전체 유전자 오페론의 공지된 서열을 기준으로 각 ORF를 위한 5' 및 3' 말단 서열에 맞도록 설계했다 (dhaB1, dhaB2, dhaB3, dhaX 및 dhaT에 대해 각각 서열 38과 12, 39와 40, 41과 42, 45와 46, 43과 44). 각 ORF의 5' 말단을 위한 프라이머들은 매칭 서열 이외에도 EcoRI 제한 위치를 포함하고 서열의 5' 최고 말단에 Bgl II 제한 위치 뿐만 아니라 다음으로 각 ORF의 첫 ATG의 상류에 5개의 염기 서열 CAGCA를 포함하도록 고안되었다. 각 ORF의 3' 말단에 조화를 이루도록 고안된 프라이머는 클론의 3' 최고 말단에서 번역 중지코돈의 하류에 XbaI 제한 위치를 포함한다.

dhaB 및 dhaT ORF's를 위한 개별 클론 단편을 상기 프라이머를 사용하여 폐렴간균 dha 오페론을 포함하는 플라스미드 pHK26-28로부터 PCR로 증폭시켰다. 개별 ORF 클론 단편을 이들의 각각의 분자량 (dhaB1=1540 bp; dhaB2=607 bp; dhaB3=448 bp; dhaBX = 1846 bp; dhaT=1187 bp)을 기준으로 분리했다. PCR 프라이머에 설계된 유일한 EcoRI 및 XbaI 제한 위치를 사용하여 개별 dhaB 및 dhaT ORF 단편을 pLITMUS29 (New England Biolabs 제품)의 폴리링커에서 EcoRI 및 XbaI 제한 위치로 결합시켰다. pLITMUS29에서 dhaB2 및 dhaB3 클론을 서열분석을 통해 정확한지를 확인했다. pLITMUS29에서 dhaB1 클론의 코딩 부위로부터 얻은 유일한 1363 bp NcoI-EcoRV 제한 단편을 제거하고 pHK26-28로부터 얻은 상응하는 제한 단편으로 대체한다. pLITMUS29에서 dhaT 클론의 코딩 부위로부터 유일한 783 bp TthlllI-MluI 제한 단편을 pHK26-28로부터 얻은 상응하는 제한 단편으로 대체했다. pLITMUS29에서 dhaBX 클론의 코딩 부위로부터 얻은 유일한 1626 bp EcoRV 제한 단편을 pM7 (폐렴간균 dhaB 오페론 함유)로부터 얻은 상응하는 제한 단편으로 대체했다. dhB1, dhaBX 및 dhaT 클론의 5' 및 3' 말단 서열 약 250 bp에는 치환된 단편으로부터의 일부 서열이 포함되며 서열 분석으로 정확한지를 확인했다.

pLITMUS29에서 dhaB1, dhaB2, dhaB3, dhaBX 및 dhaT 클론의 ORF's를 포함하는 유일한 Bgl II- XbaI 제한 단편을 일반 발현 벡터 pAEX에서 Bgl II- XbaI 제한 위치로 결합시키고 A. 니거 gla A 프로모터 및 종결 암호의 조절하에 있는 각 클론의 발현을 확인했다. 각각의 얻은 벡터를 각각 ORF 즉, pAEX:dhaB1, pAEX:dhaB2, pAEX:dhaB3, pAEX:dhaBX 및 pAEX:dhaT로 명명했다.

A. 니거를 위한 이중 발현 카세트 벡터

dhaB1 발현 카세트 (A. 니거 gla A 프로모터, dhaB1 ORF 및 종결 암호로 구성됨)를 포함하는 유일한 SnaB1-Stu1 제한 단편을 벡터 pAEX:dhaB1으로부터 단하고 pAEX:dhaB2 벡터의 유일한 SnaB1 제한 위치로 결합시켰다. A. 니둘란스 (Aspergillus nidulans) pyrG 영양요구균 선택 마커를 포함하는, pBH2 Ward 등, Exp. Myc., 13, 289 (1989)로부터 얻은 약 2.2 kb Sca1-Sma1 제한 단편을 dhaB1 및 dhaB2 발현 카세트가 포함된 벡터에서 유일한 Stu1 제한 위치로 결합시켰다. 이 벡터를 pAEX:B1+B2로 명명했다.

dhaB3 및 dhaT를 위한 전체 발현 카세트가 포함된 유일한 Spe1-HindIII 제한 단편을 각각 pAEX:dhaB3 및 pAEX:dhaT 벡터로부터 분리했다. 두 발현 카세트 단편을 벡터 pUC18 내의 유일한 HindIII 제한 위치에서 동시에 탠덤 형식으로 (in tandum) 결합시켰다. 벡터를 pAEX:B3+T로 명명했다.

형질전환, 형질전환체의 분리, 발현 카세트의 통합 확인, 및 아스페르길러스에서 dhaB 및 dhaT 유전자의 발현

문헌 [Campbell 등, "Improved transformation efficiency of A. niger using homologous niaD gene for nitrate reductase", Curr. Genet., 16:53-56 (1989)]의 방법을 사용하여 아스페르길러스 니거 균주 FS1 (pyrG^-)을 두 개의 발현 벡터 pAEX:B1+B2 및 pAEX:B3+T로 동시 형질전환시켰다. 형질전환체를 우리딘이 없는 선택 배지에서 성장하는 이들의 능력으로 선별했다. 형질전환체의 게놈 DNA를 HindIII 및 Spe1으로 잘라 예견된 분자량의 단편을 분리하고 온전한 발현 카세트의 통합 (integration)을 증명했다. 각 발현 카세트의 검출은 별도로 개별 유전자들로 탐침하여 서던 (Southern) 분석했다. dhaB2 단백질의 존재를 항-dhaB 항체를 사용하여 웨스턴 분석으로 검출했다.

각 ORF의 발현을 통합된 pAEX:B1+B2 및 pAEX:B3+T 벡터를 갖는 형질전환체를 종균 배양으로서 10 % CSL 배지 {곡물즙 알코올 (고체 50 %) 10 % (w/v); NaH₂PO₄·H₂O 1.0 g/ℓ; MgSO₄ 0.50 g/ℓ; 말토오즈 100.0 g/ℓ; 포도당 10.0 g/ℓ; 및 Mazu 거품억제제 0.003 % (v/v)}에서 증식시킨 후 1/10 부피의 종균 배양액을 MBM 탄소 배지 (NaH₂PO₄ 0.70 g/ℓ; K₂HPO₄ 0.70 g/ℓ; KH ₂PO₄ 0.70 g/ℓ; MgSO₄·7H₂O 1.40 g/ℓ; (NH₄)₂SO₄ 10.5 g/ℓ; CaCl ₂·2H₂O 0.70 g/ℓ;NH₄NO₃ 3.50 g/ ℓ; 나트륨 시트레이트 14 g/ℓ; FeCl₂·4H₂O 1.0 mg/ℓ;ZnCl₂ 5.87 mg/ℓ; CuCl₂·2H₂O 0.42 mg/ℓ; MnCl₂·4H₂O 0.21 mg/ℓ; Na₂B₄O₇·10H₂O 0.07 mg/ℓ; 엽산 0.174 mg/ℓ; 피리독신HCl 6.12 mg/ℓ; 리보플라빈 1.83 mg/ℓ; 판토텐산 23.60 mg/ℓ; 니코틴산 26.66 mg/ℓ; 바이오틴 0.49 mg/ℓ; 티아민HCl 1.39 mg/ℓ; 말토오즈 120.0 g/ℓ; 카르베니실린 0.035 mg/ℓ; 스트렙토마이신 0.035 mg/ℓ; 트윈 (tween) 80 0.07 %; 및 glaA 프로모터 유도를 위한 Mazu 거품억제제 0.14 % (v/v)}로 종균 배양액 1/10 부피를 옮겨 시험했다. mRNA를 형질전환체 배양액에서 분리하고 (Fast Track 2 Kit, Invitrogen Corp. 제품) 노던 (Northern) 분석을 화학발광 (Genius (등록상표) System, Boehringer-Mannheim 제품)과 함께 수행하여 각 유전자의 전사된 전달 암호를 검출했다. 진탕 플라스크 배양에서 dhaB1, dhaB2, dhaB3 및 dhaT 유전자의 대등한 전사를 각 dhaB 및 dhaT ORF의 유전자 단편으로 탐침하여 노던 혼성으로 증명했다.

모든 형질전환된 유전자를 전사하는 것으로 보이는 분리된 콜로니를 추가로 pAEX:dhaBX로 형질전환시켰다. 이들 분리체를 pAEX:dhaBX 및 pAA10 (pUC18에 아스페르길러스 니둘란스 amdS 선택 마커가 포함된 3.2 kb Acc1-Asp718 제한 단편)으로 동시 형질전환시켰다. 이 새롭게 형질전환된 배양균을 유일한 탄소원으로 아세트아미드가 포함된 배지에서 선별했다. 아세트아미드를 유일한 탄소원으로 이용할 수 있는 형질전환체는 프라이머 KpdhaBX-5' 및 KpdhaBX-3' (서열 45 및 46)를 사용하는 게놈 DNA로부터 dhaBX ORF의 PCR 증폭에 의해 통합된 dhaBX ORF를 갖는 것으 로 드러났다.

A. 니거 균주 FS1에 의한 글리세롤의 제조

아스페르길러스 니거 균주 FS1을 종균 배양물로서 10 % CSL 배지에서 증식하고 MBM 탄소 배지 + 12 % 말토오즈에 1 : 10 희석액으로 옮겼다. 배양물 상층부에 아스페르길러스에 의해 제조된 글리세롤이 6 g/ℓ이 함유되어 있음이 증명되었다. 글리세롤 분석은 HPLC로 수행했다.

재조합 A. 니거에 의한 1,3-프로판디올의 제조

처음에는 부피 8 ℓ로 작동하고 작동 도중에 11 ℓ로 증가하는, 전체 부피가 15.5 ℓ인 Biolafitte 발효기에서 아스페르길러스 발효를 수행했다. 1.1 bar의 배압과 임펠러 속도 700 내지 800 rpm의 속도로, 10 ℓ/분의 속도로 공기를 폭기시키면서 호기성 조건을 유지했다 [호기성 조건은 용존 산소 백분율 (%)로 정의 (주변 압력에서 정의된 100 % DO)되며, 장착된 DO-탐침자로 측정하며 최소치인 35 % DO까지를 호기성으로 간주함]. 10 % H₃PO₄ 또는 28 % NH₄OH를 자동 첨가하여 pH를 5.60으로 유지했다. 온도는 32 ℃로 유지했다.

하기의 화합물을 탱크로 1 회분을 넣고 121 ℃에서 30 분 동안 멸균했다 (단위 : g/ℓ) : NaH₂PO₄·1H₂O 2 g/ℓ, (NH₄)₂SO ₄ 17 g/ℓ, MgSO₄ 1 g/ℓ, 트윈 80 2 g/ℓ, Promosoy-100 (단백질 70 %의 콩 농축액) 45 g/ℓ, 콘스팁액 (고체 50 %) 6 g/ℓ, 말토오즈 10 g/ℓ 및 Mazu DF204 (주문된 거품제거제) 2 g/ℓ). 멸균 후에 50 % Maltrin 150 공급 50 g을 카르베니실린 및 스트렙토마이신 (둘다 최종 농도가 10 mg/ℓ 이하)과 함께 첨가했다.

두 개의 발현 벡터 pAEX:B1+B2 및 pAEX:B3+T로 형질전환되고 10 % CSL이 함유된 진탕 플라스크에서 배양한지 45 시간이 된 아스페르길러스 니거 균주 (균주 TGR40) 1 ℓ를 사용하여 발효기를 접종시켰다. 그 다음 배양물을 배치식으로 완전히 호기성으로 28 시간 동안 증식시킨 뒤 먹이 공급 (50 % Maltrin 150 용액, 가열 멸균)을 0.8 내지 1.0 g/분의 속도로 시작했다. 그 다음, 추가의 20 시간 동안 배양하는 동안 %DO는 세포의 O2 요구로 인해 실질적으로 0으로 떨어졌다 (나머지 가동 중에는 배양물이 0 내지 5 %로 남아있었음). 이후 (접종한지 48 시간 후) 최종 글리세롤 농도가 163 g/ℓ 이하로 글리세롤을 8 시간 주기로 공급했다. 말트린 (maltrin) 공급을 접종한지 97 시간 후에 멈추고 배압 및 폭기를 각각 0.2 bar 및 4 ℓ/분 (0.5 vvm)으로 낮추고 보조효소 B₁₂를 최종 농도가 10 mg/ℓ가 되도록 첨가했다. 배양한지 122 시간이 되었을 때, 브로쓰를 회수하고 원심분리하고 에탄올을 0.2 ℓ를 상층물 1 ℓ에 첨가했다.

세포 유리 발효 브로쓰 1 ℓ를 진공 증류하고 약 60 ml의 탁한 슬러리를 얻었다. 슬러리를 원심분리하고 약 40 ml의 상층물을 모았다. 이어서 이 액체를 40 ml의 에탄올로 처리하여 잔류 고체를 침전시키고 원심분리하여 이를 제거했다. 가만히 따른 액체의 소량의 샘플을 HPLC로 분석한 결과 1,3-프로판디올이 발견되었고 프로판디올의 동일성을 GC/MS로 확인했다.

본 출원인들은 dhaB (1-3), dhaBX 및 dhaT를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 재조합 아스페르길러스 니거 균주 TGR40-13 (ATCC 74369)를 기탁했다.

실시예 23

재조합 A. 니거를 사용하는 말토오즈에서 1,3-프로판디올의 제조

처음에는 부피 8 ℓ로 작동하고 작동 도중에 11 ℓ로 증가하는, 전체 부피가 15.5 ℓ인 Biolafitte 발효기에서 아스페르길러스 발효를 수행했다. 1.1 bar의 배압과 700 내지 800 rpm의 임펠러 속도, 10 ℓ/분의 속도의 공기의 폭기로 호기성 조건을 유지했다 [호기성 조건은 용존 산소 백분율 (%)로 정의 (주변 압력에서 정의된 100 % DO)되며, 장착된 DO-탐침자로 측정하며 최소치인 35 % DO까지를 호기성으로 간주함]. 10 % H₃PO₄ 또는 28 % NH₄OH를 자동 첨가하여 pH를 5.60으로 유지했다. 온도는 32 ℃로 유지했다.

하기의 화합물을 탱크로 1 회분을 넣고 121 ℃에서 30 분 동안 멸균했다 (단위 : g/ℓ) : NaH₂PO₄·1H₂O 2 g/ℓ, (NH₄)₂SO ₄ 17 g/ℓ, MgSO₄ 1 g/ℓ, 트윈 80 2 g/ℓ, Promosoy-100 (단백질 70 %의 콩 농축액) 45 g/ℓ, 콘스팁액 (고체 50 %), 말토오즈 10 g/ℓ 및 Mazu DF204 (주문된 거품제거제) 2 g/ℓ. 멸균 후에 50 % Maltrin 150 먹이공급 50 g을 카르베니실린 및 스트렙토마이신 (둘다 최종 농도가 10 mg/ℓ 이하)과 함께 첨가했다.

dhaB1, dhaB2, dhaB3, dhaB4 및 dhaT 유전자로 형질전환되고 10 % CSL (실시예 22에서 정의됨)이 함유된 진탕 플라스크에서 증식시킨 지 40 내지 48 시간이 된 아스페르길러스 니거 균주 1 ℓ를 사용하여 발효기를 접종시켰다. 그 다음 배양물 을 30 내지 35 시간 동안 증식시킨 뒤 먹이공급 (50 % Maltrin 150 용액, 가열 멸균)을 1 g/분의 속도로 시작했다. 그 다음, 추가의 5 시간 동안 O2가 제한된 조건에서 배양했다 (%DO는 0, 완전 폭기하에서). 이후 말트린 (maltrin) 공급을 중지하고 상층물에서 측정된 포도당이 실제로 0일 때 rpm을 150으로 BP를 0.2로 낮추고 폭기를 멈췄다. 발효기를 혐기성 기체 혼합물 (5 % H₂, 5 % CO₂, 90 % N₂)을 30 분 동안 7 ℓ/분의 속도로 플러싱했다. 그 다음 기체 흡입구 및 방출구를 닫고 BP를 0.4 bar로 유지하고 보조 효소 B₁₂를 5 mg/ℓ의 최종 농도로 첨가했다. 처음부터 끝까지 브로쓰 샘플을 원심분리하고 상층물을 HPLC 및 GC 분석을 위해 준비했다 : 1,3-프로판디올이 상층물에서 검출되었다.

실시예 24

락토바실러스 로이테리 ( Lactobacillus reuteri ) (ATCC 23272)에 의해 글리세롤 이외의 기질로부터 1,3-프로판디올의 제조

락토바실러스 로이테리 (ATCC 23272)를 MRS (Difco 제품, 미국 미시간주 디트로이트 소재) 플레이트에서 유지했다. 이 플레이트로부터 얻은 콜로니를 사용하여 250 ml 삼각 플라스크 중의 25 mM NaHCO₃가 보강된 Lactobacillus MRS 브로쓰 (Difco #0881-17) 70 ml를 접종했다. 플라스크를 32 ℃의 혐기성 대기 (5 내지 7 % H2, 2 내지 8 % CO2, 85 내지 93 % N2) 중에서 인큐베이션시켰다. Lactobacillus MRS 브로쓰의 HPLC 분석은 글리세롤의 체류 시간을 갖는 성분을 드러냈다. Lactobacillus MRS 브로쓰를 알칼리 비등으로 처리하고 HPLC 및 효소적 분석으로 글리세롤에 대해 분석했다. 대부분 글리세롤 0.25 g/ℓ가 초기 배지에서 검출될 수 있었으며, 이 글리세롤 모두가 1,3-프로판디올로 전환된다면 0.21 g/ℓ의 프로판디올이 글리세롤로부터 생성되는 것으로 말할 수 있다.

인큐베이션 10 일 후, 락토바실러스 로이테리 배양 플라스크로부터 얻은 샘플를 취하여 HPLC 및 GC-MS 분석을 실시하고 초기 배지 샘플과 비교했다. 배지에 있는 글리세롤을 보정한 결과, 1.35 g/ℓ의 1.3-프로판디올이 글리세롤 이외의 기질로부터 락토바실러스 로이테리로부터 제조되었다.

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인:

(A) 성명: 이. 아이. 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니

(B) 거리: 마킷트 스트리트 1007

(C) 도시: 윌밍톤

(D) 주: 델라웨어주

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 19898

(G) 전화번호: 302-892-8112

(H) 팩스: 302-773-0164

(i) 출원인:

(A) 성명: 제넨커 인터내셔널, 인크.

(B) 거리: 사우쓰 윈톤 로드 1870 캠브리지 플레이스 4

(C) 도시: 로체스터

(D) 주: 뉴욕주

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 14618

(G) 전화번호:

(H) 팩스:

(ii) 발명의 명칭: 단일 미생물에 의한 발효가능한 탄소원의 1,3-프로판디올로의 생물전환

(iii) 서열수: 46

(iv) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 3.5 인치 플로피 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: 마이크로소프트 윈도 3.1

(D) 소프트웨어: 마이크로소프트 워드 6.0

(v) 본 출원 정보:

(A) 출원번호:

(B) 출원일:

(C) 분류:

(vi) 우선권 정보:

(A) 출원번호: 08/440,293

(B) 출원일: 1995년 5월 12일

(vii) 대리인 정보:

(A) 성명: 린다 액사머씨 플로이드 (LINDA AXAMETHY FLOYD)

(B) 등록번호: 33,692

(C) 참조/관리번호: CR-9715-B

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 12145 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 1a>

<서열 1b>

<서열 1c>

<서열 1d>

<서열 1e>

<서열 1f>

<서열 1g>

<서열 1h>

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 2>

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 29 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 3>

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 30 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 4>

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 25 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 5>

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 6>

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 7>

(2) 서열 8에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 8>

(2) 서열 9에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 9>

(2) 서열 10에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 94 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 10>

(2) 서열 11에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 33 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 11>

(2) 서열 12에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 26 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 12>

(2) 서열 13에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 42 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 13>

(2) 서열 14에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 36 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 14>

(2) 서열 15에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 181 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 15>

(2) 서열 16에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 149 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 16>

(2) 서열 17에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 33 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 17>

(2) 서열 18에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 33 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 18>

(2) 서열 19에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 16 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 19>

(2) 서열 20에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 16 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 20>

(2) 서열 21에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 45 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 21>

(2) 서열 22에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 14 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 22>

(2) 서열 23에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 14 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 23>

(2) 서열 24에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 19 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 24>

(2) 서열 25에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 19 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 25>

(2) 서열 26에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 13 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 26>

(2) 서열 27에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 13 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 27>

(2) 서열 28에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 18 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 28>

(2) 서열 29에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 18 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 29>

(2) 서열 30에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 23 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 30>

(2) 서열 31에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 22 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 31>

(2) 서열 32에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 31 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 32>

(2) 서열 33에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 32 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 33>

(2) 서열 34에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 23 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 34>

(2) 서열 35에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 35>

(2) 서열 36에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 36>

(2) 서열 37에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 37>

(2) 서열 38에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 35 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 38>

(2) 서열 39에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 34 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 39>

(2) 서열 40에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 40>

(2) 서열 41에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 37 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 41>

(2) 서열 42에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 27 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 42>

(2) 서열 43에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 38 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 43>

(2) 서열 44에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 24 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 44>

(2) 서열 45에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 35 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 45>

(2) 서열 46에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 26 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자 형태: DNA (게놈)

(xi) 서열 설명:

<서열 46>

본 발명은 또한 상기 방법의 생성물을 포함한다.

본 발명은 또한 폐렴간균으로부터 분리된 약 35 kb의 DNA 단편을 포함하는 코스미드 (cosmid)를 포함하며, 여기서 상기 단편은 도 1의 컬럼 1 및 2와 같이 제한효소에 의해 소화되며, 활성 글리세롤 데히드라타제 효소를 코딩한다. 이 코스미드는 미생물로 옮겨지면, 탄소 기질 특히 포도당을 1,3-프로판디올로 대사되도록 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

아스페르길러스 (Aspergillus), 사카로마이시즈 (Saccharomyces), 지고사카로마이시즈 (Zygosaccharomyces), 피치아 (Pichia), 클루이베로마이시즈 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 한세눌라 (Hancenula), 데바리오마이시즈 (Debaryomyces), 무코르 (Mucor), 토룰롭시스 (Torulopsis), 메틸로박터 (Methylobacter), 살모넬라 (Salmonella), 간균 (Bacillus), 스트렙토마이시즈 (Streptomyces) 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 (屬)에 속하는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된, dhaB1, dhaB2 및 dhaB3 및 dhaT 각각을 코딩하는, 서열 1의 염기번호 7044-8711, 8724-9308, 9311-9736 및 5017-6180 중 하나 이상을 가지는 유전자가 하나 이상 있으며 데히드라타제 효소(EC 4.2.1.-)를 발현할 수 있는 단일 미생물을 적당한 조건하에서 글리세롤과 접촉시키는 것을 포함하는 1,3-프로판디올의 제조를 위한 생물전환 방법.
dhaB1, dhaB2 및 dhaB3 및 dhaT 각각을 코딩하는, 서열 1의 염기번호 7044-8711, 8724-9308, 9311-9736 및 5017-6180을 가지는 DNA 단편을 포함하며 데히드라타제(EC 4.2.1.-)를 발현시키는 재조합 진핵 미생물.
제2항에 있어서, 효모 및 섬유상 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 진핵 미생물.