MX2012003025A

MX2012003025A - Microorganismos y metodos para la co-produccion de isopropanol con alcoholes, dioles y acidos primarios.

Info

Publication number: MX2012003025A
Application number: MX2012003025A
Authority: MX
Inventors: Priti Pharkya; Anthony P Burgard; Robin E Osterhout; Mark J Burk; Sunjun
Original assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2009-09-09
Filing date: 2010-09-09
Publication date: 2012-06-27
Also published as: JP2013504326A; EP2475775A4; EP2475775A1; CN107586753A; SG179048A1; CN102625845A; KR20120068021A; ZA201301486B; CA2773694A1; WO2011031897A1; US8715971B2; EP2933338A3; BR112012005296A2; US20140377820A1; US20110201068A1; EP2933338A2; ZA201201468B

Abstract

La invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene trayectorias n-propanol e isopropanol, 1,4-butandiol (14-BDO) y las trayectorias isopropanol, 1,3 butandiol-(13-BDO) y las trayectorias isopropanol o ácido metacrílico (MAA) y la trayectoria isopropanol. El organismo microbiano contiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica un enzima en cada uno de los n-propanol, 14-BDO, 13-BDO o MAA respectivos y las trayectorias isopropanol. La invención proporciona adicionalmente un método para la co-producción de n-propanol e isopropanol, l4-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol. El método puede incluir un cultivo de n-propanol e isopropanol, una co-producción del organismo microbiano, donde el organismo microbiano expresa por lo menos un ácido nucleico que codifica una exógeno n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o una enzima de trayectoria MAA en una cantidad suficiente para producir cada uno de los productos respectivos, bajo condiciones y durante un período suficiente de tiempo para producir cada uno de los productos respectivos.

Description

MICROORGANISMOS Y MÉTODOS PARA LA CO-PRODUCCIÓN DE ISOPROPANOL CON ALCOHOLES, DIOLES Y ÁCIDOS PRIMARIOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a los procesos biosintéticos , y más específicamente a los organismos que tienen n-propanol e isopropanol, 1 , -butandiol e isopropanol, 1 , 3-butandiol e isopropanol o metilacrílico y la capacidad biosintética de isopropanol.

El isopropanol (IPA) es un líquido incoloro, inflamable que se mezcla completamente con la mayoría de los solventes, incluyendo agua. El mayor uso de IPA es como un solvente, incluyendo su uso bien conocido todavía pequeño como "alcohol de frotamiento", que es una mezcla de IPA y agua. Como un solvente, IPA se encuentra en muchos productos de uso diario tales como pinturas, barnices, solventes, tintas, adhesivos, productos de limpieza de uso general, desinfectantes, cosméticos, artículos de tocador, descongelantes, y productos farmacéuticos. También se utiliza IPA de grado bajo en aceites de motor. El segundo uso más grande es como un intermediario químico para la producción de isopropilaminas , isopropiléteres , e isopropilésteres . El isopropanol potencialmente puede deshidratarse para formar propileno, un precursor de polímero con un mercado anual de más de 2 millones de toneladas métricas.

La capacidad de producción mundial actual de isopropanol (IPA) es de aproximadamente 6 mil millones de libras/año, con aproximadamente el 74% de la capacidad global de IPA se concentra en los Estados Unidos, Europa y Japón. El isopropanol se fabrica por dos rutas de petroquimicos . El proceso predominante implica la hidratación de propileno, ya sea con o sin catálisis de ácido sulfúrico. En segundo lugar, el IPA se produce a través de la hidrogenación de acetona, que es un subproducto formado en la producción de óxido de fenol y propileno. El alto precio del propileno actualmente est conduciendo a altos costos y márgenes bajos a través de la industria química que motiva la necesidad de una variedad más amplia de materias primas de bajo costo.

Puede utilizarse potencialmente n-propanol como un sustituto de gasolina. Actualmente se utiliza como un solvente de múltiples usos en la industria farmacéutica, para los revestimientos de superficie y en las formulaciones de tinta. Se utiliza como un bloque de construcción para las resinas y ésteres, aminas y haluros de propilo. También se utiliza para aplicaciones de contacto de empanado y alimentos. La producción mundial de n-propanol en 2005 fue de más de 140,000 toneladas métricas.

Se fabrica n-propanol mediante la hidrogenación catalítica de propionaldehído .

El propionaldehído es en sí mismo producido mediante el proceso oxo, por hidroformilación de etileno usando monóxido de carbono e hidrógeno en la presencia de un catalizador tal como cobalto octacarbonilo o un complejo de rodio. Se forma naturalmente en pequeñas cantidades en muchos procesos de fermentación. Por ejemplo, la producción microbiana de cantidades muy pequeñas de n-propanol se ha detectado a partir de ciertas especies de Clostridium a través de catabolismo de treonina y de levadura en la fermentación de cerveza. Se ha informado que no existe microorganismo para producir 1-propanol a partir de azúcares en cantidades significativas.

El 1 , 4-butandiol (14-BDO) es un intermediario de polímero y solvente industrial con un mercado mundial de aproximadamente 3 mil millones de libras/año. El BDO se produce actualmente a partir de precursores petroquímicos , principalmente acetileno, anhídrido maleico y óxido de propileno. Por ejemplo, el acetileno se hace reaccionar con 2 moléculas de formaldehído en la reacción de síntesis de Reppe (Kroschwitz y Grant , Encyclopedia of Chem. Tech., John Wiley and Sons, Inc., Nueva York (1999)), seguido por hidrogenación catalítica para formar 1 , -butandiol . Puede además transformarse corriente abajo, 14-BDO; por ejemplo, por oxidación a la gamma-butirolactona, que puede convertirse después en pirrolidona y N-metil-pirrolidona, o hidrogenólisis a tetrahidrofurano . Estos compuestos han tenido varios usos como intermediarios de polímero, solventes y aditivos, y tienen un mercado combinado de casi 2 mil millones de libras/año. Comúnmente se utiliza 1 , 3 -Butanodiol (13-BDO) es un carbono de cuatro diol como un solvente orgánico para los agentes saborizantes para alimentos. También se utiliza como un co-monómero para resinas de poliuretano y poliéster y es ampliamente empleado como un agente hipoglicémico . Ópticamente activo 13-BDO es un material de partida útil para la síntesis de compuestos biológicamente activos y los cristales líquidos. Un uso comercial sustancial de 1 , 3-butandiol es la deshidratación posterior para dar 1 , 3 -butadieno, (Ichikawa, J. Mol. Catalysis. 256:106-112 (2006)), unos 25 mil millones de libras/año se utilizó en la petroquímica para la fabricación de cauchos sintéticos (por ejemplo, neumáticos), látex y resinas. El 13-BDO se produce tradicionalmente a partir del acetileno a través de su hidratación. El acetaldehído resultante luego se convierte en 3-hidroxibutiraldehido el cual se reduce posteriormente para formar 1,3-BDO. En años más recientes, el acetileno ha sido remplazado por etileno como una fuente de acetaldehído.

El ácido metilacrílico (MAA) es un precursor clave de metilmetaacrilato (MMA) , un intermediario químico con una demanda global en exceso de 4.5 mil millones de libras por año, gran parte del cual se convierte en poliacrilatos . El proceso convencional para la síntesis de metilmetaacrilato (es decir, la ruta de cianohidrina acetona) implica la conversión del cianuro de hidrógeno (HCN) y acetona a cianohidrina acetona a la que luego se somete a hidrólisis de ácido asistida y esterificación con metanol para dar MAA. Las dificultades en el manejo de HCN potencialmente mortal, junto con los altos costos de la eliminación de subproductos (1.2 toneladas de bisulfato de amonio se forman por tonelada de MAA) han generado una gran cantidad de investigaciones destinadas a procesos más limpios y más económicos. Como material de partida, MAA puede convertirse fácilmente en MAA a través de esterificación con metanol. Se ha informado que no existen microorganismos para producir MAA a partir de azúcares en cantidades significativas.

· Se describen en la presente organismos microbianos y métodos para efectivamente co-producir cantidades comerciales de n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol e incluyen ventajas relacionadas.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona organismos microbianos de origen no natural, que tienen una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol. En un aspecto, las modalidades descritas en la presente se relacionan a un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, donde la trayectoria n-propanol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol expresada en una cantidad suficiente para producir n-propanol y donde la trayectoria isopropanol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica un enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol . En un aspecto, la trayectoria n-propanol incluye una propionaldehído deshidrogenasa, una propanol deshidrogenasa , una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil-CoA hidrolasa, una propionil-CoA transferasa, una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionato reductasa o un fosfato propionilreductasa y la trayectoria isopropanol incluye una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenasa.

En otra modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol e isopropanol, donde la trayectoria n-propanol incluye un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol y donde la trayectoria isopropanol incluye un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol. En un aspecto, el primer conjunto codifica enzimas de trayectoria n-propanol, incluyendo una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa. En otro aspecto, el segundo conjunto codifica enzimas de trayectoria isopropanol incluyendo una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En otro aspecto, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol y un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol, donde el primer conjunto codifica una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; un malato deshidrogenasa; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA descarboxilasa, y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa y una propionil fosfato reductasa, o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y el segundo conjunto codifica una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa activadora de enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En otro aspecto, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol y un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol, donde el primer conjunto codifica una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una desaminasa treonina, y una 2-oxobutanoato descarboxilasa y una propanol deshidrogenasa, o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA : fosfato propanoiltransíerasa, una fosfato propionilreductasa y una propanol deshidrogenasa; o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o un 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y el segundo conjunto codifica una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa enzima y formiato deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En otro aspecto, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol y un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol, donde el primer conjunto codifica una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa ; o una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA carboxilasa; una malonil-CoA reductasa; una malonato semialdehído reductasa; propionil-CoA sintasa; y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa y el segundo conjunto codifica una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En otro aspecto, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol y un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol, donde el primer conjunto codifica una lactato deshidrogenasa; una lactato-CoA transferasa, una lactil-CoA deshidratasa; acriloil CoA reductasa; y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; fosfato propanoiltransíerasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa y el segundo conjunto codifica una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato formiato liasa, un formiato piruvato liasa que activa enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa,- y una isopropanol deshidrogenasa.

En otra modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol, la trayectoria n-propanol que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol se expresa en una cantidad suficiente para producir n-propanol. En un aspecto la trayectoria n-propanol incluye una propionaldeh do deshidrogenasa, una propanol deshidrogenasa, una propionil-CoA: fosfato propanoiltransíerasa, una propionil-CoA hidrolasa, una propionil-CoA transferasa, una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionato reductasa o una propionil fosfato reductasa.

En otra modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol, la trayectoria n-propanol incluye un conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una propionaldehido deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa.

En aún otros aspectos, las modalidades descritas en la presente se refieren a un método para producir n-propanol e isopropanol que incluye cultivar los organismos microbianos de origen no natural antes mencionados. En aún otro aspecto, las modalidades descritas en la presente se refieren a un método para producir n-propanol que incluye cultivar los organismos microbianos de origen no natural antes mencionados .

En una modalidad, la invención proporciona organismos microbianos de origen no natural, que tienen una trayectoria isopropanol y una trayectoria de 1 , 4-butandiol (14-BDO), una trayectoria de 1 , 3 -butandiol (13-BDO) o una trayectoria del ácido metilacrílico (MAA) . En un aspecto, las modalidades descritas en la presente se relacionan a un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1,4-butandiol y una trayectoria isopropanol, donde la trayectoria de 1 , -butandiol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 1 , 4-butandiol se expresa en una cantidad suficiente para producir 1,4-butandiol y donde la trayectoria isopropanol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol. En un aspecto, las modalidades descritas en la presente se relacionan a un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria 1 , 3-butandiol y un isopropanol, donde la trayectoria 1 , 3-butandiol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 1, 3-butandiol se expresa en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol y donde la trayectoria isopropanol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol . En un aspecto, las modalidades descritas en la presente se relacionan a un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene un ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, donde la trayectorias del ácido metilacrílico incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de la trayectoria del ácido metilacrílico expresada en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico y donde la trayectoria isopropanol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol.

En una modalidad, la trayectoria isopropanol comprende una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la trayectoria 14-BDO comprende una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, una 4-hidroxibutirato reductasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa , 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa, o una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) .

En una modalidad, la trayectoria 13-BDO comprende una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa, una crotonasas, una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa, o una 3-hidroxibutirato reductasa .

En una modalidad, la trayectoria de MAA comprende una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa, una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa, una metacrilil-CoA hidrolasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, una 3-hidroxibutirato deshidratasa, una metilmalonil-CoA mutasa, una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA hidrolasa, una metilmalonato reductasa, una metilmalonil-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenase, una metilmalonil-CoA reductasa (que forma alcohol) o una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria 14-BDO y un isopropanol, donde la trayectoria 14-BDO incluye un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO y donde la trayectoria isopropanol incluye un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria 13-BDO y un isopropanol, donde la trayectoria 13-BDO incluye un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de la trayectoria 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO y donde la trayectoria isopropanol incluye un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que incluye un organismo microbiano que tiene un ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, donde la trayectorias del ácido metilacrílico incluye un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de la trayectorias del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico y donde la trayectoria isopropanol incluye un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol.

Se entiende que las trayectorias de ácido metilacrílico que pasan a través de un intermediario 3-hidroxiisobutirato se pueden aplicar para la producción de 3-hidroxiisobutirato en oposición con la producción de ácido metilacrílico si la enzima corriente abajo, es decir, una deshidratasa, se omite (véanse las figuras 7 y 8) . En este caso, el organismo de origen no natural producirá 3-hidroxiisobutirato en lugar de ácido metilacrí lico . El organismo de origen no natural alternativamente podría producir una mezcla de ácido 3 -hidroxiisobutirato y metilacrí lico . Los rendimientos máximos molares de ATP y el producto serán sin cambio independientemente de sí el ácido metilacrí lico o 3 -hidroxiisobutirato se produce.

Se entiende además que, si se desea, el ácido 3-hidroxiisobutírico expresado por un organismo microbiano de la invención puede convertirse químicamente al ácido metilacrílico . Por ejemplo, ácido 3-hidroxiisobutírico, o ácido ß-hidroxiisobutírico, puede deshidratarse para formar ácido metilacrílico tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estadounidense No. 7,186,856.

En aún otros aspectos, las modalidades descritas en la presente se refieren a un método para producir 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o AA e isopropanol que incluye cultivar los antes mencionados organismos microbianos de origen no natural.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una trayectoria ejemplar para la co-producción de n-propanol e isopropanol a partir de glucosa. Abreviaciones: GLC - glucosa, PEP fosfoenolpiruvato, PYR - piruvato, FOR - formiato, ACCOA -acetil-CoA, AACOA - acetoacetil-CoA, ACAC - acetoacetato, AC-acetona, PPOH-2 - isopropanol, OAA - oxaloacetato, MAL -malato, FUM - fumarato, SUCC - succinato, SUCCOA - succinil -CoA, MMCOA - metilmalonil-CoA, PPCOA - propionil-CoA, PPA -propionato, PPAL - propionaldehído, PPPi - propionil fosfato, PPOH-1 - n-propanol .

La figura 2 muestra una trayectoria ejemplar para la co-producción de n-propanol e isopropanol a partir de glucosa. Abreviaciones: GLc - glucosa, PEP fosfoenolpiruvato, PYR - piruvato, FOR - formiato, ACCOA -acetil-CoA, AACOA - acetoacetil-CoA, ACAC - acetoacetato, AC - acetona, PPOH-2 - isopropanol, OAA - oxaloacetato, THR -treonina, 2-OBUT - 2-oxobutanoato, PPCOA - propionil-CoA, PPA - propionato, PPAL - propionaldehído, PPPi - propionil fosfato, PPOH-1 - n-propanol.

La Figura 3 muestra una trayectoria ejemplar para la co-producción de n-propanol e isopropanol a partir de glucosa. Abreviaciones: Glc - glucosa, PEP fosfoenolpiruvato, PYR - piruvato, FOR - formiato, ACCOA -acetil-CoA, AACOA - acetoacetil-CoA, ACAC - acetoacetato, AC - acetona, PPOH-2 - isopropanol, MALCOA - malonil-CoA, MALAL - malonato semialdehído, 3HP-3 -hidroxipropionato, PPCOA -propionil-CoA, PPA - propionato, PPAL - propionaldehído, PPPi - propionil fosfato, PPOH-1 - n-propanol.

La figura 4 muestra una trayectoria ejemplar para la co-producción de n-propanol e isopropanol a partir de glucosa. Abreviaciones: Glc - glucosa, PEP fosfoenolpiruvato, PYR - piruvato, FOR - formiato, ACCOA -acetil-CoA, AACOA - acetoacetil-CoA, ACAC - acetoacetato, AC acetona, PPOH-2 - isopropanol, LAC-D-lactato, LACCOA-lactoil-CoA, ACRYLCOA - acriloil-CoA, PPCOA - propionil-CoA, PPA - propionato, PPAL - propionaldehído , PPPi - propionil fosfato, PPOH-1 - n-propanol.

La Figura 5 muestra una trayectoria ejemplar para la coproducción de 1,4-BDO e isopropanol a partir de glucosa. Abreviaciones: Glc - glucosa, PEP - fosfoenolpiruvato, PYR -piruvato, FOR - formiato, ACCOA - acetil-CoA, AACOA -acetoacetil-CoA, ACAC-acetoacetato, AC - acetona, PPOH-2 -isopropanol, OAA - oxaloacetato, MAL - malato, FUM fumarato, SUCC - succinato, SUCCOA - succinil-CoA, SUCSAL -semialdehído succinico, 4-HB-4-hidroxibutirato, 4-HBCOA - 4-hidroxibutiril-CoA, 4-HBALD - 4- hidroxibutiraldehído, 14-BDO - 1, 4-butandiol, 4-HBP - 4-hidroxibutiril-fosfato .

La figura 6 muestra una trayectoria ejemplar para la coproducción de 1,3-BDO e isopropanol a partir de glucosa. Abreviaciones: Glc - glucosa, PEP - fosfoenolpiruvato , PYR -piruvato, FOR-formiato, ACCOA - acetil-CoA, AACOA acetoacetil-CoA, ACAC-acetoacetato, AC-acetona, PPOH-2 isopropanol, OAA - oxaloacetato, MAL - malato, FUM fumarato, SUCC - succinato, SUCCOA - succinil-CoA, SUCSAL -semialdehído succínico, 3-HB - 3-hidroxibutirato, 4-HB - 4-hidroxibutirato, 4-HBCOA - 4-hidroxibutiril-CoA, CRTCOA-crotonil-CoA, 3-HBCOA - 3 -hidroxibutiril-CoA, 3-HBALD - 3-hidroxibutiraldehído, 13-BDO - 1 , 3-butandiol .

La figura 7 muestra una trayectoria ejemplar para la coproducción de ácido metacrílico e isopropanol a partir de glucosa. Abreviaciones: Glc - glucosa, PEP fosfoenolpiruvato, PYR - piruvato, FOR - formiato, ACCOA -acetil-CoA, AACOA - acetoacetil-CoA, ACAC-acetoacetato, AC-acetona, PPOH-2 - isopropanol, OAA - oxaloacetato , ACOA -metiacrilil-CoA, MAL - malato, FUM - fumarato, SUCC succinato, SUCCOA - succinil-CoA, SUCSAL - semialdehído succínico, 4-HB - 4-hidroxibutirato, 4-HBCOA - 4-hidroxibutiril-CoA, 3-HIBCOA - 3-hidroxiisobutiril-CoA, 3-HIB - 3-hidroxibutirato, MAA - ácido metacrílico.

La figura 8 muestra una trayectoria ejemplar para la coproducción de ácido metacrílico e isopropanol a partir de glucosa. Abreviaciones: Glc - glucosa, PEP fosfoenolpiruvato, PYR - piruvato, FOR - formiato, ACCOA -acetil-CoA, AACOA - acetoacetil-CoA, ACAC-acetoacetato, AC-acetona, PPOH-2 - isopropanol, OAA - oxaloacetato, MAL -malato, FUM - fumarato, SUCC - succinato, SUCCOA - succinil-CoA, MM - metilmalonato, MMCOA-metilmalonil-CoA, MMSA metilmalonato semialdehído, 3-HIB - 3-hidroxiisobutirato, MAA - ácido metacrílico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la presente invención proporcionan organismos microbianos de origen no naturales que tienen trayectorias anaerobicas de redox equilibradas para la co-producción de n-propanol e isopropanol a partir de moléculas 3 fosfoenolpiruvato (PEP) como se ejemplifica en las Figuras 1-4. Algunas ventajas de esta estrategia de co-producción incluyen: (1) la co-producción proporciona el rendimiento máximo teórico de n-propanol e isopropanol en 1.33 /moles total/mol de glucosa; y (2) la trayectoria para la co-producción es completamente redox equilibrada y tiene un rendimiento neto positivo de ATP. Esto facilita una producción completamente anaeróbica de alcoholes C3 en oposición a los cultivos de organismos microbianos que tienen solo la trayectoria isopropanol, que requiere la aireación para la regeneración de NAD.

Las modalidades de la presente invención también proporcionan organismos microbianos de origen no natural que pueden co-producir n-propanol e isopropanol a partir de recursos renovables, como se muestra en las Figuras 1-4. Específicamente, los organismos incluyen todas las enzimas utilizadas en la co-producción de n-propanol e isopropanol a partir de acetil-CoA y propionil-CoA. El formiato puede convertirse en dióxido de carbono por una formiato deshidrogenasa que proporciona una reducción adicional equivalente que puede utilizarse para la síntesis de n-propanol e isopropanol . Además, reducir equivalentes pueden obtenerse de otros pasos de la trayectoria, tales como, la trayectoria de glicolisis durante la conversión de glucosa a fosfenolpiruvato , piruvato deshidrogenasa o piruvato ferredoxin oxidorreductasa durante la conversión de piruvato a acetil-CoA, o 2-oxobutanoato deshidrogenasa durante la conversión de 2-oxobutanoato a propionil-CoA.

Las modalidades de la presente invención también proporcionan organismos microbianos de origen no natural que pueden producir n-propanol a través de propionil-CoA. Esta conversión se lleva a cabo por dos enzimas diferentes: una deshidrogenasa aldehido y alcohol o en una etapa por un aldehido bifuncional /alcohol deshidrogenasa.

Alternativamente, el propionil-CoA puede convertirse en propionil fosfato y luego se transforma en propionaldehído por un acil fosfato reductasa.

Alternativamente, el propionil-CoA puede convertirse en propionato luego en propionil fosfato mediante una propionil-CoA hidrolasa, transferasa, o sintetasa y una propionato dinasa, respectivamente. Alternativamente, el propionato puede convertirse en propionaldehído por una propionato reductasa. Las trayectorias para la producción de propionil-CoA se ejemplifican en las Figuras 1-4. En una modalidad, la trayectoria para la producción de propionil-CoA procede a través de oxaloacetato como se ejemplifica en la Figura 1. El oxaloacetato se convierte en propionil-CoA por medio del ciclo TCA reductivo, una metilmutasa, una descarboxilasa, y una descarboxilasa . Una epimerasa puede requerirse para convertir el estereoisómero (R) de metilmalonil-CoA a la configuración (S) . En otra modalidad, la trayectoria para la producción de propionil-CoA procede a través de treonina como se ejemplifica en la Figura 2. El oxaloacetato se convierte en treonina por la trayectoria de treonina nativa diseñada para altos rendimientos. A continuación se desamina para formar 2-oxobutanoato y posteriormente se convierte en propionil-CoA. En una alternativa, 2-oxobutanoato se convierte en propionaldehído por una descarboxilasa, que después se reduce a n-propanol por una propanol deshidrogenasa . En otra modalidad, la trayectoria para la producción de propionil-CoA procede a través de malonil-CoA como se ejemplifica en la Figura 3. El acetil-CoA es carboxilado para formar malonil-CoA. Este se reduce entonces a malonato semialdehído, y se transforma posteriormente en 3 -hidroxipropionato (3HP). El 3HP se convierte en propionil-CoA a través de propionil-CoA sintasa. En otra modalidad, la trayectoria para la producción de propionil-CoA procede a través de lactato como se ejemplifica en la Figura 4. El piruvato se reduce para formar lactato que se activa entonces para formar lactoil-CoA. El lactoil-CoA se deshidrata para formar acriloil-CoA y luego se reduce para generar propionil-CoA.

Las modalidades de la presente invención también proporcionan organismos microbianos de origen no natural que pueden producir isopropanol a través de acetil-CoA. La producción de isopropanol se logra a través de la conversión de acetil-CoA por una acetoacetil-CoA tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa como se ejemplifica en las Figuras 1 - 4. En una modalidad, la trayectoria para la producción de acetil-CoA de glucosa procede a través de fosfoenolpiruvato (PEP) . La glucosa se convierte en PEP por la trayectoria de glicolisis nativa del organismo microbiano. PEP se convierte en piruvato por el piruvato cinasa y luego a acetil-CoA por el piruvato deshidrogenasa o piruvato ferredoxin oxidorreductasa . Alternativamente, el piruvato se convierte en acetil-CoA y formiato por formiato piruvato liasa. El formiato luego se convierte en dióxido de carbono e hidrógeno por una formiato deshidrogenasa .

Las modalidades de la presente invención proporcionan métodos alternativos para la coproducción de isopropanol con los compuestos 14-BDO, 13 BDO y MAA. La producción de isopropanol procede a través de acetil-CoA como se describe en lo anterior. Solo esta ruta no es redox equilibrado y por lo tanto requiere de aireación para lograr altos rendimientos de isopropanol. Las modalidades descritas en la presente utilizan esta ruta y se combinan con trayectorias para la síntesis de los co-productos 1,4-butandiol (14-BDO), 1 , 3-butandiol (13 -BDO) y ácido metacrílico (MAA) . Las rutas de coproducción son redox equilibrado bajo condiciones anaeróbicas en oposición al requerimiento de oxígeno si el isopropanol se produce exclusivamente a través de acetona. La coproducción también proporciona ventajas relacionadas, tales como, la facilidad de separación de isopropanol a partir de otros productos de fermentación debido a que su punto bajo de ebullición (82°C) con relación al 14-BDO (230°C), 13-BDO (203°C) y MAA (163°C) y la coproducción utilizando cualquiera de los organismos microbianos descritos en la presente se establece que el rendimiento máximo teórico del carbono se otorga a partir de glucosa.

Las modalidades de la presente invención proporcionan organismos microbianos de origen no natural que pueden producir 14-BDO a través de succinil-CoA o en algunos aspectos a través de succinato. Para la producción de 14-BDO, succinil-CoA se convierte en semialdehído succínico por una succinil-CoA reductasa. Alternativamente, el succinato puede convertirse en semialdehído succínico por una succinato reductasa. A continuación, el semialdehído succínico se reduce a 4-hidroxibutirato por 4-hidroxibutirato deshidrogenasa . La activación de 4-HB en su acil-CoA se cataliza por una COA transferasa o sintetasa. Alternativamente, 4-HB puede convertirse en 4-hidroxibutiril-fosfato y se transforma posteriormente en 4-HB-CoA por una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa . El 4-HB-CoA se convierte a continuación en 14-BDO por ya sea un aldehido bifuncional de CoA-dependiente/alcohol deshidrogenasa, o por dos enzimas separadas con aldehido y la actividad de alcohol deshidrogenasa. Sin embargo, otra alternativa que desvía el 4-HB-CoA intermediario es la reducción directa de 4-HB a 4-hidroxibutirilaldehido por un ácido carboxílico reductasa. Se reduce posteriormente 4-Hidroxibutirilaldehido a 14-BDO por un alcohol deshidrogenasa. Sin embargo, otra ruta que desvía 4-HB-CoA implica la reducción de 4-hidroxibutiril-fosfato a 4-hidroxibutiraldehído por un fosfato reductasa.

Las modalidades de la presente invención proporcionan organismos microbianos de origen no natural que pueden producir 13-BDO a través de succinil-CoA o en algunos aspectos a través de succinato. La producción de 13-BDO también procede a través de 4-hidroxibutiril-CoA, formada como se describe en lo anterior. En esta ruta, se deshidrata 4-hidroxibutiril-CoA y se isomeriza para formar crotonil-CoA. Las reacciones de deshidratación y vinilisomerisacion se catalizan por una enzima bifuncional, 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa. La crotonil-CoA luego se hidrata a 3-hidroxibutiril-CoA. La eliminación de la porción de CoA y rendimientos de reducción concurrentes 3-hidroxibutiraldehído . Alternativamente, 3 -hidroxibutiril-CoA se convierte en 3-hidroxibutirato por una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa, hidrolasa, o sintetasa y después se reduce por una 3-hidroxibutirato reductasa para dar 3-hidroxibutiraldehído . Finalmente la reducción del aldehido por 3 -hidroxibutiraldehído .reductasa produce 13BD0.

Las modalidades de la presente invención proporcionan organismos microbianos de origen no natural que pueden producir MAA a través de dos rutas alternativas. La primera ruta procede a través de 4-hidroxibutiril-CoA, formada como se describe en lo anterior. Se convierte 4-hidroxibutiril-CoA en 3-hidroxiisobutiril-CoA por una metil mutasa . La porción de CoA de 3-hidroxiisobutiril-CoA se elimina a continuación por una CoA transferasa, hidrolasa, o sintetasa. Finalmente, la deshidratación del grupo 3-hidroxi produce MAA. Alternativamente, 3-hidroxiisobutiril-CoA se convierte en metilacrilil-CoA por un 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa y luego la porción de CoA se removió por una CoA transferasa, hidrolasa, o sintetasa para producir MAA. En la ruta de producción de MAA alternativa, el succinil-CoA se convierte en metilmalonil-CoA por metilmalonil-CoA mutasa. Una epimerasa puede requerirse para convertir el estereoisómero (R) de metilmalonil-CoA a la configuración (S) . Un aldehido deshidrogenasa de CoA-dependiente entonces se convierte en metilmalonil-CoA a metilmalonato semialdeh do . Alternativamente, la porción CoA de (R)-metilmalonil-CoA o (S) -metilmalonil-CoA se remueve mediante un CoA transferasa, hidrolasa, o sintetasa para formar metilmalonato, el cual luego se convierte al semialdehido por una reductasa. La reducción del aldehido a 3-hidroxiisobutirato, seguido por deshidratación, produce MAA. Al ernativamente, el metilmalonil-CoA se convierte en 3-hidroxiisobutirato por una CoA reductasa que forma alcohol.

Las modalidades de la presente invención proporcionan organismos microbianos de origen no natural que tienen trayectorias para la producción de succinil-CoA como se ejemplifica en las Figuras 5-8. En una modalidad, la trayectoria para la producción de succinil-CoA procede a través de oxaloacetato. El oxaloacetato se convierte en succinil-CoA por un medio del ciclo de TCA reductivo, incluyendo una malato deshidrogenasa, una fumerasa, una fumarato reducatasa y una succinil-CoA transferasa o alternativamente una succinil-CoA sintetasa.

La Ingeniería de estas trayectorias en un microorganismo que implica la clonación de un conjunto apropiado de los genes que codifican un conjunto de enzimas en un huésped de producción descrito en la presente, la optimización de las condiciones de fermentación, y ensayo de formación del producto seguido de la fermentación. Para diseñar un huésped de producción para la producción de n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol, una o más secuencias de ADN exógeno pueden expresarse en un microorganismo. Además, el microorganismo puede tener genes endógenos funcionalmente interrumpidos, eliminados o sobreexpresados . Las modificaciones metabólicas descritas en la presente permiten la producción de n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol utilizando materias primas renovables.

En algunas modalidades, la invención proporciona organismos microbianos de origen no natural, que incluyen al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol se expresa en una cantidad suficiente para producir n-propanol .

En otra modalidad, la invención proporciona organismos microbianos de origen no natural, que incluyen al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol.

En aún otras modalidades, la invención proporciona métodos para la co-producción de n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol. Tales métodos implican el cultivo de los organismos microbianos descritos en la presente.

Como se utiliza en la presente, el término "de origen no natural" cuando se utiliza en referencia a un organismo microbiano o microorganismo de la invención se pretende para significar que el organismo microbiano tiene al menos una alteración genética no se encuentra normalmente en una cepa de origen natural de las especies de referencia, incluyendo cepas de tipo silvestre de la especie de referencia. Las alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, la introducción de modificaciones expresables ácidos nucleicos que codifican polipéptidos metabólicos, otras adiciones de ácido nucleico, supresión de ácidos nucleicos y/o otra interrupción funcional del material genético del organismo microbiano. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, las regiones de codificación y fragmentos funcionales de los mismos, para heterólogos, homólogos o ambos polipéptidos heterólogos y homólogos de las especies mencionadas. Las modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes en las cuales las modificaciones alteran la expresión de un gen o operón. Ejemplos de polipéptidos metabólicos incluyen enzimas o proteínas dentro de una n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o trayectorias biosinteticas MAA.

Una modificación metabólica se refiere a una reacción bioquímica que se altera desde su estado de origen natural. Por lo tanto, los microorganismos de origen no natural pueden tener modificaciones genéticas a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos metabólicos o, fragmentos funcionales de los mismos. Ejemplos de modificaciones metabolicas se describen en la presente.

Como se utiliza en la presente, el término "aislado" cuando se utiliza en referencia a un organismo microbiano se pretende que signifique un organismo que está sustancialmente libre de al menos un componente como el organismo microbiano de referencia se encuentra en la naturaleza. El término incluye un organismo microbiano que se remueve de algunos o todos los componentes que se encuentran en su entorno natural. El término incluye también un organismo microbiano que se remueve de algunos o todos los componentes como el organismo microbiano se encuentran en entornos de origen no natural. Por lo tanto, un organismo microbiano aislado está parcial o completamente separado de otras sustancias como se encuentra en la naturaleza o como se cultiva, almacenada o subsiste en entornos de origen no natural. Ejemplos específicos de los organismos microbianos aislados incluyen microbios parcialmente puros, microbios sustancialmente puros y microbios cultivados en un medio que es de origen no natural .

Tal como se utiliza en la presente, los términos "microbiano", "organismo microbiano" o "microorganismo" se pretende que signifique cualquier organismo que existe como una célula microscópica que se incluye dentro de los dominios de arquea, bacterias o eukarya. Por lo tanto, el término se pretende abarcar las células procariotas o eucariotas u organismos que tienen un tamaño microscópico e incluye bacterias, arquea y bacterias de todas las especies, así como los microorganismos eucarióticos tales como levaduras y hongos. El término también incluye cultivos de células de cualquier especie que puedan cultivarse para la producción de un bioquímico.

Como se utiliza en la presente, "n-propanol" se pretende para significar un alcohol primario con la fórmula molecular de C3H80 y una masa molecular de 60.1 g/mol. N-propanol se conoce también en la técnica como 1-propanol, alcohol 1-propílico, alcohol n-propílico, propan-l-ol, o propanol simplemente. N-propanol es un isómero de isopropanol .

Como se utiliza en la presente, "isopropanol" se pretende para significar un alcohol secundario, con la fórmula molecular de C3H80 y una masa molecular de 60.1 g/mol, en donde el carbono de alcohol se une a dos carbonos adicionales. Este anexo a veces se muestra como (CH3)2CHOH. El isopropanol es también conocido en la técnica como propan-2-ol , 2-propanol o la abreviación PIA. El isopropanol es un isómero de n-propanol .

Como se utiliza en la presente, el término "1,4-butandiol" se pretende para significar un derivado de alcohol del alcano butano, que lleva dos grupos hidroxilo que tienen la fórmula química C4H1002 y una masa molecular de 90.12 g/mol . El compuesto químico 1 , 4-butandiol también es conocido en la técnica como 1,4-BDO y es un intermediario o precursor químico para una familia de compuestos referidos comúnmente como la familia de compuestos de BDO.

Tal como se utiliza en la presente, el término " 1 , 3 -butandiol " se pretende para significar uno de los cuatro isómeros estables de butandiol que tienen la fórmula química C4H10O2 y una masa molecular de 90.12 g/mol. El compuesto químico 1 , 3-butandiol se conoce en la técnica como 13-BDO o ß-butanglicol y es también un intermediario o precursor químico de una familia de compuestos conocidos comúnmente como la familia de compuestos de BDO.

Como se utiliza en la presente, "ácido metilacrílico" , que tiene la fórmula química CH2=C (CH3 ) C02 (también conocido como ácido metacrílico y el nombre de IUPAC ácido 2-metil-2-propenoico) , es la forma ácida de metilacrilato, y se entiende que el ácido metilacrílico y metilacrilato se pueden utilizar de manera intercambiable para referirse al compuesto en cualquiera de sus formas neutras o ionizadas, incluyendo cualesquiera formas de sal de los mismos. Se entiende por aquellos expertos que la forma especifica dependerá del pH. De manera similar, ácido 3-hidroxiisobutirato y 3-hidroxiisobutírico se puede utilizar de manera intercambiable para referirse al compuesto en cualquiera de sus formas neutras o ionizadas, incluyendo cualesquiera formas de sal de los mismos.

Como se utiliza en la presente, el término "CoA" o "coenzima A" se pretende para significar un cofactor orgánico o grupo prostético (porción sin proteica de una enzima) , cuya presencia es necesaria para la actividad de muchas enzimas (la apoenzima) para formar un sistema de enzima activo. Las funciones de coenzima A en ciertas enzimas de condensación, actúan en un grupo acetilo u otro acilo y en síntesis de ácidos grasos y oxidación, oxidación de piruvato y en otra acetilación .

Como se utiliza en la presente, el término "sustancialmente anaeróbico" cuando se utiliza en referencia a un cultivo o condición de crecimiento se pretende para significar que la cantidad de oxigeno es menor que aproximadamente 10% de saturación de oxígeno disuelto en un medio líquido. El término también se pretende para incluir cámaras selladas de un medio líquido o sólido mantenido con una atmósfera de menos de aproximadamente 1% de oxígeno.

"Exógena" como se utiliza en la presente se pretende significar que la molécula de referencia o la actividad de referencia se introducen en el organismo microbiano huésped. La molécula puede introducirse, por ejemplo, mediante la introducción de un codificador de ácido nucleico en el material genético huésped tal como mediante la integración en un cromosoma huésped o como material genético no cromosomático tal como un plásmido. Por lo tanto, el término tal como se utiliza en referencia a la expresión de un codificador de ácido nucleico se refiere a la introducción del codificador de ácido nucleico en una forma expresable en el organismo microbiano. Cuando se utiliza en referencia a una actividad biosintética, el término se refiere a una actividad que se introduce en el organismo de referencia huésped. La fuente puede ser, por ejemplo, un homólogo o heterólogo que codifica un ácido nucleico que expresa la actividad referenciada siguiendo la introducción en el organismo microbiano huésped. Por lo tanto, el término "endógeno" se refiere a una molécula de referencia o actividad que está presente en el huésped. Asimismo, el término cuando se utiliza en referencia a la expresión de un codificador de ácido nucleico se refiere a la expresión de un codificador de ácido nucleico contenido dentro del organismo microbiano. El término "heterólogo" se refiere a una molécula o actividad derivada de una fuente distinta de la especie de referencia, mientras que "homólogo" se refiere a una molécula o derivado de la actividad del organismo microbiano huésped. Por consiguiente, la expresión exógena de un codificador de ácido nucleico de la invención puede utilizar cualquiera o ambos de un heterólogo u homólogo que codifica ácido nucleico .

Los organismos microbianos de origen no natural de la invención pueden contener alteraciones genéticas estables, que se refieren a los microorganismos que pueden cultivarse durante más de cinco generaciones sin pérdida de la alteración. En general, las alteraciones genéticas estables incluyen modificaciones que persisten en más de 10 generaciones, particularmente modificaciones estables persistirán m s de aproximadamente 25 generaciones, y más particularmente, las modificaciones genéticas estables serán mayores que 50 generaciones, incluso indefinidamente.

Los expertos en la técnica entenderán que las alteraciones genéticas, incluyendo las modificaciones metabolicas ejemplificadas en la presente, se describen con referencia a un organismo huésped adecuado tal como E. coli y sus reacciones metabolicas correspondientes o un organismo de fuente adecuada para el material genético deseado tales como los genes para una trayectoria metabólica deseada. Sin embargo, dada la secuenciación completa del genoma de una amplia variedad de organismos y el alto nivel del experto en el área de la genómica, los expertos en la técnica serán fácilmente capaces de aplicar las enseñanzas y orientaciones proporcionadas en la presente para esencialmente todos los otros organismos. Por ejemplo, las alteraciones metabólicas de E. coli ejemplificadas en la presente pueden aplicarse fácilmente a otras especies mediante la incorporación de la misma o análogos que codifican ácido nucleico a partir de especies distintas de las especies mencionadas. Tales alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, alteraciones genéticas de especies homologas, en general, y en particular, ortólogos, parálogos o desplazamientos de genes no ortólogos.

Un ortólogo es un gen o genes que están relacionados por descendencia vertical y son responsables de manera sustancial para las mismas o idénticas funciones en diferentes organismos. Por ejemplo, un ratón epóxido , hidrolasa e epóxido hidrolasa humano puede considerarse ortólogo para la función biológica de la hidrólisis de los epóxidos . Los genes se relacionan por descenso vertical cuando, por ejemplo, comparten similitud de secuencia de la cantidad suficiente para indicar que son homólogos, o se relacionan por la evolución de un antecesor común. Los genes también se pueden considerar ortólogos si comparten la estructura tridimensional, pero no necesariamente similitud de secuencia, de una cantidad suficiente para indicar que han evolucionado a partir de un antecesor común en la medida en que la similitud de secuencia primaria no es identificable .

Los genes que son ortólogos pueden codificar proteínas con similitud de secuencia de aproximadamente 25% a 100% de identidad de secuencia de aminoácidos. Los genes que codifican proteínas comparten una similitud de aminoácidos menos que el 25% también se puede considerar que han surgido por descenso vertical si su estructura tridimensional también muestra similitudes. Los miembros de la familia de la serina proteasa de la familia de enzimas, incluyendo activador plasminógeno tisular y elastasa, se consideran que han surgido por descenso vertical de un antecesor común.

Los ortólogos incluyen genes o sus productos de genes codificados a través de, por ejemplo, la evolución, han divergido en la estructura o actividad global. Por ejemplo, cuando una especie codifica un producto génico exhibiendo dos v funciones y donde dichas funciones han sido separadas en genes distintos en una segunda especie, los tres genes y sus productos correspondientes se consideran ortólogos. Para la producción de un producto bioquímico, los expertos en la técnica entenderán que el gen ortólogo alberga la actividad metabólica que se introduce o interrumpe debe elegirse para la construcción del microorganismo de origen no natural. Un ejemplo de ortólogos que exhiben las actividades separables es donde distintas actividades se han separado en distintos productos de genes entre dos o más especies o dentro de una sola especie. Un ejemplo especifico es la separación de la proteolisis elastasa y la proteolisis del plasminogeno, dos tipos de actividad de serina proteasa, en moléculas distintas como el activador del plasminogeno y la elastasa. Un segundo ejemplo es la separación de micoplasma 5 ' -3 ' exonucleasa y actividad III de Drosófila del ADN polimerasa. El ADN polimerasa de la primera especie se puede considerar un ortólogo a cualquiera o ambos de la exonucleasa o la polimerasa de la segunda especie, y viceversa.

En contraste, los parálogos son homólogos relacionados por, por ejemplo, la duplicación seguida por divergencia evolutiva y tienen funciones similares o comunes, pero no idénticas . Los parálogos pueden originarse o derivarse de, por ejemplo, la misma especie o de una especie diferente. Por ejemplo, epóxido hidrolasa microsomal (epóxido hidrolasa I) y epóxido hidrolasa soluble (epóxido hidrolasa II) pueden considerarse parálogos debido a que representan dos enzimas diferentes, co-evolucionadas a partir de un antecesor común, que cataliza distintas reacciones y tienen distintas funciones en las mismas especies. Los parálogos son proteínas de la misma especie con similitud de secuencia significante entre sí lo que sugiere que son homologas o relacionadas a través de co-evolución de un ancestro común. Los grupos de familias de proteínas parálogas incluyen homólogos Hipa, genes luciferasa, peptidasas, y otros.

Un desplazamiento del gen no ortólogo es un gen no ortólogo de una especie que puede sustituirse para una función de los genes referenciados en una especie diferente. La sustitución incluye, por ejemplo, ser capaz de realizar sustancialmente la misma o una función similar en la especie de origen en comparación con la función de referencia en las diferentes especies. Aunque en general, un desplazamiento de gen no ortólogo será identificado como estructuralmente relacionado con un gen que codifica la conocida función de referencia, menos estructuralmente relacionado, pero genes funcionalmente similares y sus correspondientes productos génicos no obstante todavía caerá dentro del significado del término tal como se utiliza en la presente. Similitud funcional requiere, por ejemplo, al menos alguna similitud estructural en el sitio activo o región de unión de un producto génico no ortólogo en comparación con un gen que codifica la función que desea sustituirse. Por lo tanto, un gen no ortólogo incluye, por ejemplo, un parálogo o un gen no relacionado.

Por lo tanto, en la identificación y la construcción de organismos microbianos de origen no natural de la invención que tiene n-propanol e isopropanol, 14 BDO e isopropanol, 13 -BDO e isopropanol o AA y capacidad de isopropanol biosintética, aquellos con experiencia en la técnica entenderán con la aplicación la enseñanza y la orientación proporcionada en la presente para una especie particular que la identificación de modificaciones metabólicas pueden incluir la identificación y la inclusión o la inactivación de ortólogos. En la medida en que desplazamientos de genes parálogos y/o no ortólogos se presentan en el microorganismo de referencia que codifica una enzima que cataliza una reacción metabólica similar o sustancialmente similar, aquellos expertos en la técnica también pueden utilizar estos genes evolutivamente relacionados .

Los desplazamientos de gen ortólogos, parálogos y no ortólogo pueden determinarse por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la inspección de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos para dos polipéptidos revelará identidad de secuencia y similitudes entre las secuencias comparadas. Sobre la base de estas similitudes, un experto en la técnica puede determinar sí la similitud es suficientemente alta para indicar que las proteínas se relacionan a través de la evolución de un antecesor común. Algoritmos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, tal como Align, BLAST, Clustal W y otros comparan y determinan una similitud o identidad de secuencias al natural, y también determinan la presencia o la importancia de huecos en la secuencia que puede asignarse un peso o puntuación. Tales algoritmos también son conocidos en la técnica y son igualmente aplicables para la determinación de similitud o identidad de secuencia de nucleótido. Parámetros para similitud suficiente para determinar la relación se calculan sobre la base de métodos bien conocidos al calcular similitud estadística, o la posibilidad de encontrar una coincidencia similar en un polipéptido aleatorio, y la importancia de la coincidencia determinada. Una comparación por computadora de dos o más secuencias pueden, si se desea, también optimizarse visualmente por aquellos expertos en la técnica. Se pueden esperar productos o proteínas de genes relacionados que tengan una alta similitud, por ejemplo, 25% a 100% de identidad de secuencia. Las proteínas que no están relacionadas pueden tener una identidad que es esencialmente la misma como sería de esperar que se produzca por casualidad, si una base de datos de tamaño suficiente es escaneada (aproximadamente 5%) . Las secuencias entre 5% y 24% pueden o no pueden representar homología suficiente para concluir que las secuencias comparadas están relacionadas. Análisis estadístico adicional para determinar la importancia de estas coincidencias, dado el tamaño del conjunto de datos puede llevarse a cabo para determinar la relevancia de estas secuencias.

Ejemplos de parámetros para determinar la relación de dos o más secuencias utilizando el algoritmo BLAST, por ejemplo, puede ser como se establece a continuación. En pocas palabras, la secuencia de alineaciones de amino ácido se puede realizar utilizando BLASTP versión 2.0.8 ( 05-Ene-1999 ) y los siguientes parámetros: Matriz: 0 BLOSUM62; espacio abierto: 11, extensión de espacio: 1; x_dropoff: 50; esperar: 10.0; tamaño de la palabra: 3; filtro: encendido. Alineamientos de secuencias de ácidos nucleicos se pueden realizar utilizando BLASTN versión 2.0.6 ( 16-septiembre-1998 ) y los siguientes parámetros: coincidencia: 1; falta de coincidencia: -2; espacio abierto: 5; espacio de extensión: 2; x_dropoff: 50; esperar: 10.0; tamaño de la palabra: 11; filtro: apagado. Aquellos con experiencia en la técnica conocerán qué modificaciones pueden hacerse a los parámetros anteriores para ya sea aumentar o disminuir la severidad de la comparación, por ejemplo, y determinar la relación de dos o más secuencias.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol expresada en una cantidad suficiente para producir n-propanol, la trayectoria n-propanol incluye una propionaldehído deshidrogenasa , una propanol deshidrogenasa, una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil-CoA hidrolasa, una propionil-CoA transferasa, una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionato reductasa o una propionil fosfato reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol incluye una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenasa .

En un aspecto adicional de la modalidad anterior, el organismo microbiano tiene una trayectoria de acetil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria acetil -CoA expresada en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, la trayectoria de acetil-CoA que incluye una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidorreductasa, una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa enzima, o una formiato deshidrogenasa.

En otra modalidad, el organismo microbiano tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica un enzima de trayectoria de propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria de propionil-CoA que incluye una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA mutasa, una metilmalonil-CoA epimerasa o una metilmalonil-CoA descarboxilasa. En un aspecto adicional, la trayectoria de propionil-CoA incluye una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

En otra modalidad adicional, el organismo microbiano tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria de propionil-CoA incluye una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una treonina desaminasa, o un 2-oxobutanoato deshidrogenasa . En un aspecto adicional, la trayectoria n-propanol incluye 2-oxobutanoato descarboxilasa.

En otra modalidad adicional, el organismo microbiano tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria de propionil-CoA incluye una acetil-CoA carboxilasa, una malonil-CoA reductasa, una malonato semialdehido reductasa o propionil-CoA sintasa.

En otra modalidad adicional, el organismo microbiano tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica un enzima de trayectoria de propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria de propionil-CoA incluyendo una lactato deshidrogenasa, una lactato-CoA transferasa, una lactil-CoA deshidratasa o acriloil CoA reductasa.

En aún otra modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol tiene un primer conjunto de ácidos nucleico exógenos que codifican las enzimas de trayectoria n-propanol expresada en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol que tiene un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresa en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En un aspecto adicional de la modalidad anterior, el organismo microbiano tiene una trayectoria de acetil-CoA que tiene un tercer juego de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de acetil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica una piruvato cinasa, y una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa enzima y formiato de una deshidrogenasa.

En otra modalidad adicional, el organismo microbiano tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene un tercer conjunto de de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; un malato deshidrogenasa; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; una metilmalonil-CoA mutasa, y una metilmalonil-CoA descarboxilasa . En un aspecto adicional, el tercer conjunto de los ácidos nucleicos exógenos además codifica para una metilmalonil-CoA epimerasa, un piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

En otra modalidad adicional, el organismo microbiano tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una treonina desaminasa; y una 2-oxobutanoato deshidrogenasa . En un aspecto adicional, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifican una metilmalonil-CoA descarboxilasa o una piruvato carboxilasa. En aún otro aspecto, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifica una 2-oxobutanoato descarboxilasa .

En otra modalidad adicional, el organismo microbiano tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica una acetil-CoA carboxilasa, una malonil-CoA reductasa, una malonato semialdehído reductasa y propionil-CoA sintasa.

En otra modalidad adicional, el organismo microbiano tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una lactato deshidrogenasa; una lactato-CoA transferasa; una lactil-CoA deshidratasa, y acriloil CoA reductasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una malato deshidrogenasa; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA descarboxilasa , y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa y una propionil fosfato reductasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una enzima que activa piruvato-formiato liasa y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa , y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una treonina desaminasa, y una 2-oxobutanoato descarboxilasa y una propanol deshidrogenasa; o un 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o un 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa, o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa. En un aspecto adicional, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifica una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransíerasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol expresada en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA carboxilasa; una malonil-CoA reductasa; una malonato semialdehido reductasa; una propionil-CoA sintasa; y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransíerasa, una propionil fosfato reductasa y propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que incluye un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una lactato deshidrogenasa; una lactato-CoA transferasa; una lactil-CoA deshidratasa; acriloil CoA reductasa, y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil CoA- hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol, la trayectoria n-propanol comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol expresada en una cantidad suficiente para producir n-propanol, la trayectoria n-propanol incluyendo una propionaldehído deshidrogenasa, una propanol deshidrogenasa, una propionil-CoA: fosfato propanoil ransíerasa, una propionil-CoA hidrolasa, una propionil-CoA transferasa, una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionato reductasa, o una propionil fosfato reductasa.

En otra modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol, la trayectoria n-propanol que comprende un conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa , o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa , una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa.

En un aspecto adicional de la modalidad anterior, el organismo microbiano de origen no natural tiene una trayectoria n-propanol también tiene una trayectoria propionil-CoA que incluye ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA como se ejemplifica en la presente. Por ejemplo, en algunos aspectos, los ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa, un PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA mutasa o una metilmalonil-coA descarboxilasa . En otro aspecto, los ácidos nucleicos exógenos además codifican una metilmalonil-CoA epimerasa. Adicionalmente, en aún otro aspecto de la modalidad anterior, el organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol puede tener una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, en donde el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una malato deshidrogenasa; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA epimerasa, una metilmalonil-CoA descarboxilasa; una propionaldehido deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 14-BDO expresada en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , una hidroxibutiraldehído 4-reductasa, una 4-hidroxibutirato reductasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una hidroxibutiril-fosfato 4-reductasa o una hidroxibutiril-CoA 4-reductasa (que forma alcohol) , la trayectoria isopropanol que incluye por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresado en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol que incluye una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 13-BDO expresada en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa, una crotonasas, una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa, o una 3-hidroxibutirato reductasa, o una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , la trayectoria isopropanol que incluye por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol incluyendo una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria MAA que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria MAA expresada en una cantidad suficiente para producir MAA, la trayectoria de MAA incluye una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa, una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa, una metacrilil-CoA hidrolasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, una 3 -hidroxibutirato deshidratasa, una metilmalonil-CoA mutasa, una metilmalonil-CoA epimerasa, una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA hidrolasa, una metilmalonato reductasa, un reductasa metilmalonil-CoA (que forma aldehido) , una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, una metilmalonil-CoA reductasa (que forma alcohol) o una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, la trayectoria isopropanol que incluye por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una suficiente cantidad para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol incluyendo una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenasa.

En un aspecto adicional de las modalidades anteriores, el organismo microbiano tiene una trayectoria acetil -CoA que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de acetil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, la trayectoria de acetil-CoA incluyendo una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa , un piruvato ferredoxin oxidorreductasa , una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima, o una formiato deshidrogenasa.

En otro aspecto de las modalidades anteriores, el organismo microbiano tiene una trayectoria succinil-CoA que tiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria succinil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir succinil-CoA, la trayectoria de succinil-CoA que incluye una PEP carboxicinasa , una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa. En un aspecto adicional, la trayectoria de succinil-CoA incluye una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato reductasa, y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa, y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa ; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa,- una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato reductasa, y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 4-hidroxibutiraldehido reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa, y una 4-hidroxibutiraldehido reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; y una 4-hidroxibutiril CoA reductasa (que forma alcohol) , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 3-hidroxibutiraldehido reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenase .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa ; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3 -hidroxibutirato reductasa, y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDQ y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; un 4-hidroxibutirato cinasa; un fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; un 4-hidroxibutirato cinasa; un fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3-hidroxibutirato reductasa, y una 3 -hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa , y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; un fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa, y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa, y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratase; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3 -hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3-hidroxibutirato reductasa, y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; un fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratase,· una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3-hidroxibutirato reductasa, y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una crotonasa, y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa, y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3 -hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa; y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, y una 3 -hidroxiisobutirato deshidratasa , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; un fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa; y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad invención proporciona organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de ??? expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3 -hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3 -hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa; y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3 -hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; un fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa; y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa,- una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA reductasa (que forma aldehido) ; una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA epimerasa; una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa, o una metilmalonil-CoA hidrolasa; una metilmalonato reductasa; una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa , y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa o una metilmalonil-CoA hidrolasa; una metilmalonato reductasa; una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA epimerasa; una metilmalonil-CoA reductasa (que forma alcohol), y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En un aspecto adicional de las modalidades anteriores, el organismo microbiano tiene una trayectoria de acetil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de acetil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, y una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductas , o una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa.

En otra modalidad adicional, el organismo microbiano tiene una trayectoria de succinil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas succinil-CoA trayectoria expresadas en una cantidad suficiente para producir succinil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa, un PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa y una succinil-CoA sintetasa. En un aspecto adicional, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifica una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una piruvato carboxilasa, una metilmalonil-CoA carboxi transferasa, una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, una 4-hidroxibutirato reductasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa, una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) y una 4-hidroxibutirilaldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidorreductasa, una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima, una formiato deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO que incluye un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil CoA sintetasa, una piruvato carboxilasa, una metilmalonil-CoA carboxitransferasa, una succinil CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratase, una crotonasa, una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa, una 3-hidroxibutirato reductasa, y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa , una piruvato ferredoxin oxidorreductasa, una piruvato- formiato liasa, una piruvato- formiato liasa que activa la enzima, una formiato deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil CoA transferasa, una succinil CoA sintetasa, una piruvato carboxilasa, una metilmalonil-CoA carboxitransferasa , una succinil CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4- hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa,. 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa, metacrilil-CoA transferasa, metacrilil-CoA sintetasa, metacrilil-CoA hidrolasa y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidorreductasa, , una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima, una formiato deshidrogenase, una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y un isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil CoA transferasa, una succinil CoA sintetasa, una piruvato carboxilasa, una metilmalonil-CoA carboxitransferasa, una succinil CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, una 3 -hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa, metacrilil-CoA transferasa, metacrilil-CoA sintetasa, metacrilil-CoA hidrolasa y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidoreductasa, una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima, una formiato deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa, un acetoacetil-CoA transferasa, un acetoacetil-CoA hidrolasa, un acetoacetil-CoA sintetasa, un acetoacetato descarboxilasa, y un isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural, que incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA que incluye un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectorias de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una piruvato carboxilasa, una metilmalonil-CoA carboxitransferasa, una metilmalonil-CoA mutasa, una metilmalonil-CoA epimerasa, una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA hidrolasa, una metilmalonato reductasa, una metilmalonil-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, una metilmalonil-CoA reductasa (que forma alcohol) y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidorreductasa, una piruvato-formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa la enzima, una formiato deshidrogenasa, un acetil-CoA acetil tiolasa, un acetoacetil-CoA transferasa, un acetoacetil-CoA hidrolasa, un acetoacetil-CoA sintetasa, un acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En un aspecto adicional de cada una de las modalidades anteriores, el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.

En un aspecto adicional de cada una de las modalidades anteriores, el organismo microbiano de origen no natural se encuentra en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico .

En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol e isopropanol, en donde el organismo microbiano de origen no natural comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o prote na que convierte un sustrato a un producto seleccionado del grupo que consiste de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato , oxaloacetato a malato, malato a fumarato, fumarato a succinato, succinato a succinil-CoA, succinil-CoA a (R)-metilmalonil-CoA, (R) -metilmalonil-CoA a ( S ) -metilmalonil-CoA, ( S ) -metilmalonil-CoA a propionil-CoA, propionil-CoA a propionaldehído, propionaldehido a n-propanol, propionil-CoA a propionil fosfato, propionil-CoA a propionato, propionato a propionil fosfato, propionato a propionaldehido, propionil fosfato a propionaldehído, fosfoenolpiruvato a piruvato, piruvato a oxaloacetato, piruvato a acetil-CoA, piruvato a acetil-CoA y formiato, formiato a C02, sustratos de 2 acetil-CoA a 1 producto de acetoacetil-CoA, acetoacetil-CoA a acetoacetato, acetoacetato a acetona, acetona a isopropanol. Alguien con experiencia en la técnica entenderá que éstos son solamente ejemplares y que cualquiera de los pares de productos de sustrato descritos en la presente son adecuados para producir un producto deseado y para el cual una actividad apropiada se encuentra disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinado por alguien con experiencia en la técnica basado en las enseñanzas en la presente. De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que contiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, en donde la enzima o proteína convierte los sustratos y los productos de una trayectoria n-propanol e isopropanol, tal como se muestra en la Figura 1.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol e isopropanol, en donde el organismo microbiano de origen no natural comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto seleccionado del grupo que consiste de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, oxaloacetato a treonina, treonina a 2-oxobutanoato, 2-oxobutanoato de propionil-CoA, propionil-CoA a propionaldehído , propionaldehído a n-propanol, 2-oxobutanoato a propionaldehído, propionil-CoA a propionil fosfato, propionil-CoA a propionato, propionato a propionil fosfato, propionato a propionaldehído, propionil fosfato a propionaldehído, fosfoenolpiruvato a piruvato, piruvato a oxaloacetato, piruvato a acetil-CoA, piruvato a acetil-CoA y formiato, formiato a C02, sustratos de 2 acetil-CoA a 1 producto de acetoacetil-CoA, acetoacetil-CoA a acetoacetato, acetoacetato a acetona, acetona a isopropanol. Alguien con experiencia en la técnica entenderá que éstos son solamente ejemplares y que cualquiera de los pares de productos de sustrato descritos en la presente son adecuados para producir un producto deseado y para el cual una actividad apropiada se encuentra disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinada por alguien con experiencia en la técnica basado en las enseñanzas en la presente. De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que contiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, en donde la enzima o proteína convierte los sustratos y los productos de una trayectoria n-propanol e isopropanol, tal como se muestra en la Figura 2.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol e isopropanol, en donde el organismo microbiano de origen no natural comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto seleccionado del grupo que consiste de fosfoenolpiruvato a piruvato, piruvato a acetil-CoA, piruvato a acetil-CoA y formiato, formiato a C02, acetil-CoA a malonil-CoA, malonil-CoA a malonato semialdehído, malonato semialdehído a 3-hidroxipropionato, 3-hidroxipropionato a propionil-CoA, propionil-CoA a propionaldehído , propionaldehído a n-propanol, propionil-CoA a propionil fosfato, propionil-CoA a propionato, propionato a propionil fosfato, propionato a propionaldehído , propionil fosfato a propionaldehído, 2 sustratos de acetil-CoA a 1 producto de acetoacetil CoA, acetoacetil-CoA a acetoacetato , acetoacetato a acetona, acetona a isopropanol . Alguien con experiencia en la técnica entenderá que éstos son solamente ejemplares y que cualquiera de los pares de productos de sustrato descritos en la presente son adecuados para producir un producto deseado y para el cual una actividad apropiada se encuentra disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinada por alguien con experiencia en la técnica basado en las enseñanzas en la presente. De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que contiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, en donde la enzima o proteína convierte los sustratos y los productos de una trayectoria n-propanol e isopropanol, tal como se muestra en la Figura 3.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol e isopropanol, en donde el organismo microbiano de origen no natural comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto seleccionado del grupo que consiste de piruvato a D-lactato, D-lactato a lactoil-CoA, lactoil-CoA a acriloil-CoA, acriloil-CoA a propionil-CoA, propionil-CoA a propionaldehído, propionaldehído a n-propanol, propionil-CoA a propionil fosfato, propionil-CoA a propionato, propionato a propionil fosfato, propionato a propionaldehído, propionil fosfato a propionaldehído, piruvato a acetil-CoA, piruvato a acetil-CoA y formiato, formiato a C02, 2 sustratos de acetil-CoA a 1 producto de acetoacetil CoA, acetoacetil-CoA a acetoacetato , acetoacetato a acetona, acetona a isopropanol . Alguien con experiencia en la técnica entenderá que éstos son solamente ejemplares y que cualquiera de los pares de productos de sustrato descritos en la presente son adecuados para producir un producto deseado y para el cual una actividad apropiada se encuentra disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinada por alguien con experiencia en la técnica basado en las enseñanzas en la presente. De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que contiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, en donde la enzima o proteína convierte los sustratos y los productos de una trayectoria n-propanol e isopropanol, tal como aquella mostrada en la Figura 4.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol, en donde el organismo microbiano de origen no natural comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto seleccionado del grupo que consiste de propionil-CoA a propionaldehído, propionaldehído a n-propanol, propionil-CoA a propionil fosfato, propionil-CoA a propionato, propionato a propionil fosfato, propionato a propionaldehído, y propionil fosfato a propionaldehído. Alguien con experiencia en la técnica entenderá que éstos son solamente ejemplares y que cualquiera de los pares de productos de sustrato descritos en la presente son adecuados para producir un producto deseado y para el cual una actividad apropiada se encuentra disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinada por alguien con experiencia en la técnica basado en las enseñanzas en la presente. De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que contiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, en donde la enzima o proteína convierte los sustratos y los productos de una trayectoria n-propanol e isopropanol, tal como aquella mostrada en las Figuras 1-4.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria de 14-BDO y una de isopropanol, en donde el organismo microbiano de origen no natural comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto seleccionado del grupo que consiste de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, oxaloacetato a malato, malato a fumarato, fumarato a succinato, succinato a succinil-CoA, succinil-CoA a semialdehído succínico, semialdehído succínico a 4-hidroxibutirato , 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutiril-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA a 4-hidroxibutiraldehído, 4-hidroxibutiraldehído a 14-BDO, succinato a semialdehído succínico, 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutiraldehído, 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutiril-fosfato, 4-hidroxibutiril-fosfato a 4-hidroxibutiril-CoA, 4-hidroxibutiril-fosfato a 4 hidroxibutiraldehído, 4-hidroxibutiril-CoA a 14-BDO, propionil-CoA a propionil fosfato, propionil fosfato a propionaldehído, fosfoenolpiruvato a piruvato, piruvato a oxaloacetato, piruvato a acetil-CoA, piruvato a acetil-CoA y formiato, formiato a C02, 2 sustratos de acetil-CoA a 1 producto de acetoacetil CoA, acetoacetil-CoA a acetoacetato, acetoacetato a acetona, acetona a isopropanol. Alguien con experiencia en la técnica entenderá que éstos son solamente ejemplares y que cualquiera de los pares de productos de sustrato descritos en la presente son adecuados para producir un producto deseado y para el cual una actividad apropiada se encuentra disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinada por alguien con experiencia en la técnica basado en las enseñanzas en la presente. De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que contiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, en donde la enzima o proteína convierte los sustratos y los productos de una trayectoria n-propanol e isopropanol, tal como aquella mostrada en la Figura 5.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una 13-BDO y una trayectoria isopropanol, en donde el organismo microbiano de origen no natural comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto seleccionado del grupo que consiste de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato , oxaloacetato a malato, malato a fumarato, fumarato a succinato, succinato a succinil-CoA, succinil-CoA a semialdehído succínico, semialdehído succínico a 4-hidroxibutirato , 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutiril-CoA, succinato a semialdehído succínico, 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutiril-fosfato, 4-hidroxibutiril-fosfato a 4-hidroxibutiril-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA, crotonil-CoA a 3 -hidroxibutiril-CoA, 3-hidroxibutiril-CoA a 3 hidroxibutiraldehído, 3-hidroxibutiril-CoA a 3-hidroxibutirato , 3 -hidroxibutirato a 3 hidroxibutiraldehído, 3 hidroxibutiraldehído a 13-BDO, 3 -hidroxibutiril-CoA a 13-BDO, propionil-CoA a propionil fosfato, propionil fosfato a propionaldehído, fosfoenolpiruvato a piruvato, piruvato a oxaloacetato, piruvato a acetil-CoA, piruvato a acetil-CoA y formiato, formiato a C02, 2 sustratos de acetil-CoA a 1 producto de acetoacetil CoA, acetoacetil-CoA a acetoacetato, acetoacetato a acetona, acetona a isopropanol. Alguien con experiencia en la técnica entenderá que éstos son solamente ejemplares y que cualquiera de los pares de productos de sustrato descritos en la presente son adecuados para producir un producto deseado y para el cual una actividad apropiada se encuentra disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinada por alguien con experiencia en la técnica basado en las enseñanzas en la presente. De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que contiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, en donde la enzima o proteína convierte los sustratos y los productos de una trayectoria n-propanol e isopropanol, tal como aquella mostrada en la Figura 6.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria de AA e isopropanol, en donde el organismo microbiano de origen no natural comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína que convierte un sustrato a un producto seleccionado del grupo que consiste de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato, oxaloacetato a malato, malato a fumarato, fumarato a succinato, succinato a succinil-CoA, succinil-CoA a semialdeh do succínico, semialdehido succínico a 4-hidroxibutirato, 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutiril-CoA, succinato a semialdehido succínico, 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutiril-fosfato, 4-hidroxibutiril-fosfato a 4-hidroxibutiril-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA a 3-hidroxiisobutiril-CoA, 3-hidroxiisobutiril-CoA a 3-hidroxiisobutirato, 3-hidroxiisobutiril-CoA a metiacrilil-CoA, metiacrilil-CoA a MAA, 3-hidroxiisobutirato a MAA, succinil-CoA a (R) -metilmalonil-CoA, (R) -metilmalonil-CoA a (S) -metilmalonil-CoA, (S) -metilmalonil-CoA a metilmalonato semialdehido, (S) -metilmalonil-CoA a 3-hidroxiisobutirato, metilmalonato semialdehido a 3-hidroxiisobutirato, propionil-CoA a propionil fosfato, propionil fosfato a propionaldehído, fosfoenolpiruvato a piruvato, piruvato a oxaloacetato, piruvato a acetil-CoA, piruvato a acetil-CoA y formiato, formiato a C02, 2 sustratos de acetil-CoA a 1 producto de acetoacetil CoA, acetoacetil-CoA a acetoacetato, acetoacetato a acetona, acetona a isopropanol. Alguien con experiencia en la técnica entenderá que éstos son solamente ejemplares y que cualquiera de los pares de productos de sustrato descritos en la presente son adecuados para producir un producto deseado y para el cual una actividad apropiada se encuentra disponible para la conversión del sustrato al producto puede ser fácilmente determinada por alguien con experiencia en la técnica basado en las enseñanzas en la presente. De este modo, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que contiene por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima o proteína, en donde la enzima o proteína convierte los sustratos y los productos de una trayectoria n-propanol e isopropanol, tal como aquella mostrada en la Figura 7 y 8.

Aunque generalmente se describe en la presente como un organismo microbiano que contiene una trayectoria n-propanol y una isopropanol, una de 14-BDO y una de isopropanol, una 13-BDO y una de isopropanol o MAA y una de isopropanol, se entenderá que la invención adicionalmente proporciona un organismo microbiano de origen no natural que comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol, una de isopropanol, una de 14-BDO, una de 13-BDO y/o una MAA expresada en una cantidad suficiente para producir un intermediario de una trayectoria n-propanol, una de isopropanol, una de 14-BDO, una de 13-BDO y/o de MAA. Por ejemplo, como se describe en la presente, una trayectoria n-propanol, una de isopropanol, una de 14-BDO, una de 13-BDO y/o de MAA se ejemplifica en las Figuras 1-8. Por consiguiente, una adición a un organismo microbiano que contiene una trayectoria n-propanol e isopropanol, una de 14-BDO 14 e isopropanol , una 13-BDO 13 e isopropanol o una MAA y una de isopropanol que produce n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol, la invención adicionalmente proporciona un organismo microbiano de origen no natural que comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol, una de isopropanol, una de 14-BDO, una de 13-BDO. y/o de MAA, en donde el organismo microbiano produce un intermediario de trayectoria n-propanol, un isopropanol, uno de 14-BDO, uno de 13-BDO y/o de MAA, por ejemplo, acetona, metilmalonil-CoA, propionil fosfato, 2-oxobutanoato, 3-hidroxipropionato, lactoil-CoA, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxibutiril-fosfato, crotonil-CoA, succinil-CoA, semialdehído succínico o 3-hidroxiisobutiril-CoA.

Se entenderá que cualquiera de las trayectorias descritas en la presente, como se describe en los Ejemplos y ejemplificadas en las Figuras, incluyendo las trayectorias de las Figuras 1-8, pueden utilizarse para generar un organismo microbiano de origen no natural que produce cualquier trayectoria intermedia o producto como se desee. Como se describe en la presente, tal organismo microbiano que produce un intermediario puede utilizarse en combinación con otro organismo microbiano que expresa enzimas de trayectoria corriente abajo para producir un producto deseado. Sin embargo, se entenderá que un organismo de origen no natural que produce un intermediario n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o MAA puede utilizarse para producir el intermediario como un producto deseado.

La invención se describe en la presente con referencia general a la reacción metabólica, reactante o producto de la misma, o con referencia específica a uno o más ácidos nucleicos o genes que codifican una enzima asociada con o que cataliza, o una proteína asociada con, la reacción metabólica, reactante o producto de referencia. A menos que se establezca expresamente de otra forma en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que la referencia a una reacción también constituye la referencia a los reactantes y productos de la reacción. De manera similar, a menos que se establezca expresamente de otra forma en la presente, la referencia al reactante o producto también hace referencia a la reacción, y la referencia a cualquiera de estos constituyentes metabólicos también hace referencia al gen o genes que codifican las enzimas que catalizan o proteínas implicadas en la reacción, reactante o producto de referencia. Del mismo modo, dados los campos bien conocidos de bioquímica metabólica, enzimología y genómica, la referencia en la presente a un gen o ácido nucleico que codifica también constituye una referencia a la enzima codificada correspondiente y la reacción se cataliza o una proteína asociada con la reacción, así como los reactantes y productos de la reacción.

Los organismos microbianos de origen no natural de la invención pueden producirse mediante introducir ácidos nucleicos expresables que codifican una o más de las enzimas o proteínas que participan en una o más de las trayectorias biosintéticas de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. Dependiendo del organismo microbiano huésped elegido para la biosíntesis, los ácidos nucleicos para algunos o todos de una trayectoria biosintética particular de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA pueden expresarse. Por ejemplo, si un huésped elegido es deficiente en una o más enzimas o proteínas para una trayectoria biosintética deseada, entonces los ácidos nucleicos expresables para la o las enzimas deficientes o la o las proteínas se introducen en el huésped para expresión exógena subsiguiente. Alternativamente, si el huésped elegido muestra expresión endógena de algunos genes de trayectoria, pero es deficiente en otros, entonces el ácido nucleico que codifica se necesita para la o las enzimas o la o las proteínas deficientes para lograr la biosíntesis de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. De este modo, un organismo microbiano de origen no natural de la invención puede producirse al introducir actividades de enzimas o proteínas exógenas para obtener una trayectoria biosintética deseada, o una trayectoria biosintética deseada puede obtenerse al introducir una o más actividades de proteína o enzima exógenas que, junto con una o más enzimas o proteínas endógenas, produce un producto deseado, tal como n-propanol, isopropanol, 14BD0, 13BD0 y/o MAA.

Dependiendo de los constituyentes de trayectoria biosintética de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA de un organismo microbiano huésped seleccionado, el organismo microbiano de origen no natural de la invención incluirá por lo menos un ácido nucleico que codifica la trayectoria n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA expresados exógenamente y hasta todos los ácidos nucleicos que codifican para una o más trayectorias biosintéticas de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. Por ejemplo, la biosíntesis de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA puede establecerse en un huésped deficiente en una enzima o proteína de trayectoria a través de expresión exógena del ácido nucleico de codificación correspondiente. En un huésped deficiente en todas las enzimas o proteínas de una trayectoria n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA, la expresión exógena de todas las enzimas o proteínas en la trayectoria pueden incluirse, aunque se entiende que todas las enzimas o proteínas de una trayectoria pueden expresarse incluso si el huésped contiene por lo menos una de las enzimas o proteínas de trayectoria. Por ejemplo, la expresión exógena de todas las enzimas o proteínas en una trayectoria para la producción de n-propanol e isopropanol pueden incluirse, tal como una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una malato deshidrogenasa; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA epimerasa; una metilmalonil-CoA descarboxilasa; y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa y una propionil fosfato reductasa, una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato- formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa, como se ejemplifica en la Figura 1.

Dadas las enseñanzas y guía proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que el número de ácidos nucleicos que codifica para introducir en una forma expresable serán, por lo menos, paralelos a la deficiencia de trayectoria n-propanol, isopropanol, 14 BDO, 13-BDO y/o MAA del organismo microbiano huésped seleccionado. Por lo tanto, un organismo microbiano de origen no natural de la invención puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o veintiuno, hasta que todos los ácidos nucleicos que codifican las enzimas o proteínas que constituyen una trayectoria biosintética de un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o una MAA descrito en la presente. En algunas modalidades, los organismos microbianos de origen no natural también incluyen otras modificaciones genéticas que facilitan u optimizan la biosíntesis de n-propanol , isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA o que confieren otras funciones útiles en el organismo microbiano huésped. Una de tales funcionalidades adicionales puede incluir, por ejemplo, aumento de la síntesis de uno o más de los precursores de trayectoria n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA tal como fosfoenolpiruvato o piruvato.

Generalmente, un organismo microbiano huésped se selecciona de tal manera que se produce el precursor de una trayectoria de un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o un MAA, ya sea como una molécula producida naturalmente o como un producto diseñado que ya se ha proporciona la producción de novo de un precursor deseado o la producción incrementada de un precursor producido naturalmente por el organismo microbiano huésped. Por ejemplo, el fosfoenolpiruvato y piruvato se producen naturalmente en un organismo huésped tal como E. coli. Un organismo huésped puede diseñarse para incrementar la producción de un precursor, como se describe en la presente. Además, un organismo microbiano que se ha diseñado para producir un precursor deseado puede utilizarse como un organismo huésped y además diseñarse para expresar las enzimas o proteínas de una trayectoria de un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o un MAA.

En algunas modalidades, un organismo microbiano de origen no natural de la invención se genera a partir de un huésped que contiene la capacidad enzimática para sintetizar n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. En esta modalidad específica, puede ser útil incrementar la síntesis o acumulación de un producto de trayectoria de un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o un MAA, por ejemplo, accionando la reacción de trayectoria n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA hacia la producción de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. La síntesis o acumulación incrementada puede lograrse mediante por ejemplo, sobreexpresion de ácidos nucleicos que codifican una o más de las enzimas o proteínas de trayectoria n-propanol y/o isopropanol descritas en lo anterior. La sobreexpresion de la enzima o enzimas y/o proteína o proteínas de la trayectoria n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA puede presentarse, por ejemplo, a través de la expresión exógena del gen o genes endógenos, o a través de la expresión exógena del gen o genes heterólogos. Por lo tanto, los organismos de origen natural pueden ser fácilmente generado para ser organismos microbianos de origen no natural de la invención, por ejemplo, produciendo n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA, a través de la sobreexpresion de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o veintiuno, es decir, hasta todos los ácidos nucleicos que codifican las enzimas o proteínas de trayectoria biosintética de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. Además, un organismo de origen no natural puede generarse mediante mutagénesis de un gen endógeno que resulta en un incremento de la actividad de una enzima en la trayectoria biosintética de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/O MAA.

En modalidades particularmente útiles, se emplea la expresión exógena de los ácidos nucleicos que codifican. La expresión exógena confiere la capacidad para adaptar a la medida la expresión y/o elementos regulatorios al huésped y aplicación para lograr un nivel de expresión deseado que se controla por el usuario. Sin embargo, la expresión endógena también puede utilizarse en otras modalidades, tal como al remover un efector regulatorio negativo o inducción del promotor de genes cuando se une a un promotor inducible u otro elemento regulatorio. De este modo, un gen endógeno que tiene una promotor inducible de origen natural puede ser sobre-regulado al proporcionar el agente de inducción apropiado o la región regulatoria de un gen endógeno puede ser diseñada para incorporar un elemento regulatorio inducible, permitiendo así la regulación de la expresión incrementada de un gen endógeno en un tiempo deseado. Similarmente, un promotor inducible puede incluirse como un elemento regulatorio para un gen exógeno introducido en un organismo microbiano de origen no natural .

Se entenderá que, en los métodos de la invención, cualquiera de uno o más ácidos nucleicos exógenos pueden introducirse en un organismo microbiano para producir un organismo microbiano de origen no natural de la invención. Los ácidos nucleicos pueden introducirse para conferir, por ejemplo, una trayectoria biosintetica de un N-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol en el organismo microbiano. Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican pueden introducirse para producir un organismo microbiano intermediario que tiene una capacidad biosintética para catalizar algunas de las reacciones requeridas para conferir la capacidad biosintética de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. Por ejemplo, un organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria biosintética de un n-propanol y un isopropanol, un 14-BDO y un isopropanol, un 13-BDO y un isopropanol o un MAA y un isopropanol puede comprender por lo menos dos ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas deseadas o proteínas, tales como la combinación de propionaldehído deshidrogenasa e isopropanol deshidrogenasa , o alternativamente propionil-CoA sintasa y acetil-CoA acetil tiolasa, o alternativamente lactato de deshidrogenasa y acetil-CoA tiolasa, o alternativamente una succinil-CoA reductasa y 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), o alternativamente crotonasa y acetoacetato descarboxilasa, o alternativamente 4-hidroxibutirato cinasa y fosfotrans-4-hidroxibutirilasa o alternativamente metilmalonil-CoA reductasa (que forma alcohol) y piruvato cinasa y similares. De este modo, se entenderá que cualquier combinación de dos o más enzimas o proteínas de una trayectoria biosintética pueden incluirse en un organismo microbiano de origen no natural de la invención. Similarmente, se entenderá que cualquier combinación de tres o más enzimas o proteínas de una trayectoria biosintética puede incluirse en un organismo microbiano de origen no natural de la invención, por ejemplo, PEP carboxicinasa, acetil-CoA acetil tiolasa y propanol deshidrogenasa, o alternativamente piruvato cinasa, acetoacetato descarboxilasa y 2-oxobutanoato deshidrogenasa, o alternativamente propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, propionil fosfato reductasa e isopropanol deshidrogenasa, o alternativamente, lactato-CoA transferasa y lactil-CoA deshidratasa y piruvato-formiato liasa, o, alternativamente, succinil-CoA deshidrogenasa, 4-hidroxibutirato reductasa y 4-hidroxibutiraldehido reductasa, o alternativamente crotonasa, PEP carboxilasa y acetoacetato descarboxilasa, o alternativamente, 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, fumarasa e isopropanol deshidrogenasa, o alternativamente acetil-CoA acetil tiolasa, acetoacetato descarboxilasa, metilmalonil-CoA reductasa (que forma alcohol) y así sucesivamente, como se desee, con la condición de que la combinación de enzimas y/o proteínas de la trayectoria biosintética deseada resulta en la producción del producto deseado correspondiente. Similarmente , cualquier combinación de cuatro o más enzimas o proteínas de una trayectoria biosintética como se describe aquí, por ejemplo, piruvato carboxilasa, malato deshidrogenasa, metilmalonil-CoA epimerasa y acetoacetil-CoA hidrolasa, o, alternativamente, acetil-CoA acetil tiolasa, isopropanol deshidrogenasa, propionaldehído deshidrogenasa y propanol deshidrogenasa, o, alternativamente, acetil-CoA carboxilasa, malonil-CoA reductasa, malonato semialdehído y acetoacetato descarboxilasa, o alternativamente, acriloil CoA reductasa, acetoacetil-CoA transferasa, acetoacetato descarboxilasa, e isopropanol deshidrogenasa, o, alternativamente, succinil-CoA deshidrogenasa, 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, e isopropanol deshidrogenasa, o alternativamente succinato reductasa, 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, 3-hidroxiisobutirato deshidratase y piruvato ferredoxin oxidoreductasa o, al ernativamente, acetil-CoA acetil tiolasa, acetoacetil-CoA transferasa, metilmalonil-CoA mutasa e hidroxiisobutirato deshidratasa , pueden incluirse en un organismo microbiano de origen no natural de la invención, como se desea, con la condición de que la combinación de enzimas y/o proteínas de la trayectoria biosintética deseada resulta en la producción del producto deseado correspondiente .

Se entenderá que más de un ácido nucleico exogeno se incluye en un organismo microbiano que los más de un ácido nucleico exogeno se refiere al ácido nucleico que codifica de referencia o la actividad biosintética, como se discute en lo anterior. Se entenderá además, como se describe en la presente, que más de uno de los ácidos nucleicos exógenos puede introducirse en los organismos microbianos huésped en moléculas de ácidos nucleicos separadas, en moléculas de ácido nucleico policistrónicas , o una combinación de las mismas, y aún considerarse más de un ácido nucleico exogeno. Por ejemplo, como se discute en la presente un organismo microbiano puede diseñarse para expresar dos o más ácidos nucleicos exogenos que codifican una enzima o proteína de trayectoria deseada. En el caso en donde dos ácidos nucleicos exogenos que codifican una actividad deseada se introducen en un organismo microbiano huésped, se entenderá que los dos ácidos nucleicos exogenos pueden introducirse como un ácido nucleico sencillo, por ejemplo, en un plásmido sencillo, en plásmidos separados, pueden integrarse en el cromosoma del huésped en un solo sitio o múltiples sitios, y todavía considerarse como dos ácidos nucleicos exogenos . Similarmente, se entenderá que más de dos ácidos nucleicos exogenos pueden introducirse en un organismo huésped en cualquier combinación deseada, por ejemplo, en un plásmido simple, en plásmidos separados, pueden integrarse en el cromosoma huésped en un solo sitio o múltiples sitios, y aún considerarse como dos o más ácidos nucleicos exogenos, por ejemplo tres ácidos nucleicos exogenos. De este modo, el número de ácidos nucleicos exogenos de referencia o las actividades biosintéticas se refieren al número de ácidos nucleicos que codifican o el número de actividades biosintéticas, no el número de ácidos nucleicos separados introducidos en el organismo huésped.

Además a la biosíntesis n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA como se describe en la presente, los organismos microbianos de origen no natural y los métodos de la invención también pueden utilizarse en diversas combinaciones entre sí y con otros organismos microbianos y métodos bien conocidos en la técnica para lograr producto de biosíntesis mediante otras rutas. Por ejemplo, una alternativa para producir n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA diferentes que no sea el uso de los productores de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA es a través de la adición de otros organismos microbianos capaces de convertir un intermediario de trayectoria de un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o una MAA a n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. Uno de tales procedimientos incluye, por ejemplo, la fermentación de un organismo microbiano que produce un intermediario de trayectoria de un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o un MAA. El intermediario de trayectoria n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol puede entonces utilizarse como un sustrato para un segundo organismo microbiano que convierte el intermediario de trayectoria n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA a n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. El intermediario de trayectoria n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA puede agregarse directamente a otro cultivo del segundo organismo o el cultivo original de los productores intermediarios de trayectoria n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA puede agotarse de estos organismos microbianos mediante, por ejemplo, separación celular, y después la adición subsiguiente del segundo organismo al caldo de fermentación puede utilizarse para producir el producto final sin etapas de purificación intermedias .

En otras modalidades, el organismo microbiano de origen no natural y los métodos de la invención pueden integrarse en una amplia variedad de subtrayectorias para lograr la biosíntesis de, por ejemplo, n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol. En estas modalidades, las trayectorias biosintéticas para un producto deseado de la invención pueden segregase en organismos microbianos diferentes, y los organismos microbianos diferentes puede ser co-cultivados para producir el producto final. En tal esquema biosintético, el producto de un organismo microbiano es el sustrato para un segundo organismo microbiano hasta que se sintetiza el producto final. Por ejemplo, la biosíntesis de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA pueden lograrse mediante la construcción de un organismo microbiano que contiene trayectorias biosintéticas para la conversión de un intermediario de trayectoria a otro intermediario de trayectoria o el producto. Alternativamente, el n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA pueden ser biosintéticamente producidos a partir de organismos microbianos a través de co-cultivo o co- fermentación utilizando dos organismos en el mismo recipiente, donde el primer organismo microbiano produce un intermediario propionil-CoA, succinil-CoA y/o un acetil-CoA y el segundo organismo microbiano convierte el o los intermediarios a n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA.

Dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que una amplia variedad de combinaciones y permutaciones existen para los organismos microbianos de origen no natural y los métodos de la invención junto con otros organismos microbianos, con el co-cultivo de otros organismos microbianos de origen no natural que tienen subtrayectorias y co-combinaciones de otros procedimiento químicos y/o bioquímicos bien conocidos en la técnica para producir n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA.

Las fuentes de los ácidos nucleicos que codifican para una enzima o proteína de trayectoria de un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o un MAA pueden incluir, por ejemplo, cualquier especie en donde el producto genético codificado es capaz de catalizar la reacción de referencia. Tales especies incluyen tanto organismos procarióticos como eucarióticos , que incluyen, pero no limitado a, bacterias, que incluyen arquea y eubacterias, y eucariotas, que incluyen levadura, planta, insectos, animal y mamífero, incluyendo humano. Especies ejemplares para tales fuentes incluyen, por ejemplo, Escherichia coli, Acetobacter pasteurians, Acidanus brierleyi, Acinetobacter baylyi, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter sp. Strain Mi, Actinobacillus succinogenes, Anaerobiospirilu succiniciproducens, Anaerostipes caccae DSM 14662, Arabidopsis thaliana, Bacillus cereus ATCC 14579, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168, Eos taurus, Bradyrhizobium japonicum USDA110, Caenorhabditis elegans, Ca pylobacter jejuni, Chlamydomonas reinhardtii , Chloroflexus aurantiacus, Clostridium acetobutylicum, Clostridiu acetobutylicum ATCC 824, Clostridium beijerinckii , Clostridium botulinum C str. Eklund, kluyveri , Clostridium kluyveri DSM 555, Clostridium novyi-NT, Clostridium propionicum, Clostridium saccharobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Corynebacteriu glutamicum, Desulfovibrio africanus, Erythrobacter sp . NAPl , Escherichia coli K12, Escherichia coli K12 str. MG1655, Escherichia coli 0157.-H7, Geobacillus thermoglucosidasius M10EXG, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Homo sapiens, Klebsiella pneumonía MGH78578, Kluyveromyces lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum WCFS1, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Mannheimia succiniciproducens, marine gamma proteobacteria HTCC2080, Mesorhizobium loti, Metallosphaera sedula, Methylobacterium extorquens, Moorella thermoacetica, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, Oryctolagus cuniculus, Plasmodiu ovale, Porphyromonas gingivalis, Propionibacterium acnés, Propionibacterium fredenreichii sp . shermanii , Propionibacterium freudenreichii , Propionigeniu modestum, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa PA01, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas putida E23, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas sp, Pseudomonas stutzeri , Ralstonia eutropha, Ralstonia eutropha H16, Rattus norvegicus, Rhodobacter spaeroides, Rhodoferax ferrireducens DSM 15236, Rhodospirillum rubrum, Roseiflexus castenholzii , Saccharomyces cerevisiae, Sal onella entérica, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Simmondsia chinensis, Streptococcus mutans, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii , Syntrophobacter fumaroxidans, Thermococcus litoralis, Thermotoga maritime, Thermus thermophilus, Trichomonas vaginalis G3 , Trypanosoma brucei, Veillonella párvula, Yersinia frederiksenii , Zy omonas mobilis, Bacillus egaterium, butirato que produce bacterium L2-50, Clostridium aminobutyricum, Geobacillus thermoglucosidasius, Mycobacterium bovis BCG, Nocardia farcinica IFM 10152, Nocardia iowensis (sp NRRL 5646), Penicillium chrysogenum, Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, Pseudomonas mendocina, Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350, así como también otras especies ejemplares descritas en la presente se encuentran disponibles como organismos fuente para genes correspondientes. Sin embargo, con la secuencia de genoma completa, ahora disponible para más de 550 especies (con más de la mitad de estas disponibles en bases de datos públicos, como la NCBI) , incluyendo 395 genomas de microorganismos y una variedad de genomas de levaduras, hongos, plantas, y mamíferos, la identificación de los genes que codifican la actividad biosintética del n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA requisito para uno o más genes en especies relacionadas o distantes, incluyendo por ejemplo, desplazamientos genéticos homólogos, ortólogos, parálogos y no ortólogos de genes conocidos, y el intercambio de alteraciones genéticas entre organismos es de rutina y bien conocida en la técnica. Por consiguiente, las alteraciones metabólicas que permiten la biosíntesis de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA se describen en la presente con referencia a un organismo particular, tal como E. coli pueden aplicarse fácilmente a otros microorganismos, incluyendo organismos procarióticos y eucarióticos semejantes. Dadas las enseñanzas y las guías proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica sabrán que una alteración metabolica ejemplificada en un organismo puede igualmente aplicarse a otros organismos.

En algunos casos, tales como cuando una trayectoria biosintética n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA alternativa existe en una especie no relacionada, la biosíntesis de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA puede conferirse en las especies huéspedes, mediante, por ejemplo, expresión exógena de un parálogo o parálogos a partir de una especie no relacionada que cataliza una reacción metabólica similar, incluso no idéntica para reemplazar la reacción de referencia.

Debido a que ciertas diferencias entre redes metabolicas existen entre diferentes organismos, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que el uso del gen actual entre diferentes organismos puede diferir. Sin embargo, dadas las enseñanzas y guías proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica también entenderán que las enseñanzas y métodos de la invención pueden aplicarse a todos los organismos microbianos utilizando las alteraciones metabolicas semejantes a aquellas ejemplificadas en la presente para construir un organismo microbiano en una especie de interés que sintetizará n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA.

Los organismos microbianos huéspedes pueden seleccionarse de, y los organismos microbianos de origen no natural, generados en, por ejemplo, bacteria, levadura, hongo o cualquiera de una variedad de otros microorganismos aplicables a procesos de fermentación. Las bacterias ejemplares incluyen especies seleccionadas de Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillu succiniciproducens , Actinobacillus succinogenes , Mannheimia succiniciproducens , Rhizobiwn etli, Bacillus subtilis , Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans , Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantar m, Streptomyces coelicolor, Clostridiu acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida. Ejemplos de levaduras u hongos incluyen especies seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus , Aspergillus terreus, Aspergillus niger K Pichia pastoris . E. col i es un organismo huésped particularmente útil puesto que es un organismo microbiano bien caracterizado adecuado para ingeniería genética. Otros organismos huésped particularmente útiles incluyen levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae . Otros organismos huéspedes particularmente útiles incluyen organismos microbianos con cantidades suficientes que se producen naturalmente de propionil-CoA y/o acetil-CoA para la co-producción de n-propanol e isopropanol. Ejemplos de tales organismos incluyen, pero no se limitan a, Clostrium propionicu , Escherichia col i y Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii.

Los métodos para construir y probar los niveles de expresión de un huésped de producción de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA de origen no natural pueden realizarse, por ejemplo, mediante métodos recombinantes y de detección bien conocidos en la técnica. Tales métodos pueden encontrarse descritos en, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); y Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999) .

Las secuencias de ácidos nucleicos exógenos implicadas en una trayectoria para la producción de n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol pueden introducirse de forma estable o transitoriamente en una célula huésped que utiliza técnicas bien conocidas en el arte, incluyendo, pero sin limitarse a, conjugación, electroporación, transformación química, transducción, transfección y transformación con ultrasonido. Para la expresión de exógenos en E. coli u otras células procariotas, algunas secuencias de ácido nucleico en los genes o los ADNc de ácidos nucleicos eucarióticos pueden codificar las señales de selección tal como N-terminal mitocondrial u otra señal de selección, que puede eliminarse antes de la transformación en células huésped procarioticas, si se desea. Por ejemplo, la eliminación de una secuencia líder mitocondrial conduce a la expresión incrementada en E. coli (Hoffmeister et al., J". Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)) . Para la expresión exógena en levadura exógeno u otras células eucariotas, los genes pueden expresarse en el citosol sin la adición de una secuencia líder, o pueden seleccionarse para mitocondria u otros organelos, o dirigirse para la secreción, mediante la adición de una secuencia de selección adecuada tal como una selección mitocondrial o la secreción de señal adecuada para las células huésped. De este modo, se entenderá que las modificaciones apropiadas para una secuencia de ácido nucleico para eliminar o incluir una secuencia de selección pueden incorporarse en una secuencia de ácido nucleico exógeno para impartir las propiedades deseables. Además, los genes pueden someterse a optimización de codón con técnicas bien conocidas en el arte para lograr la expresión optimizada de las proteínas.

Un vector o vectores de expresión pueden construirse para incluir una o más trayectorias biosintéticas de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA que codifican los ácidos nucleicos como se ejemplifican en la presente operablemente unidos a una secuencia de control de expresión funcional en el organismo huésped. Los vectores de expresión aplicables para su uso en los organismos huésped microbianos de la invención incluyen, por ejemplo, plásmidos, vectores de fago, vectores virales, episomas y cromosomas artificiales, que incluyen vectores y secuencias de selección o marcadores operables para la integración estable en un cromosoma del huésped. Adicionalmente, los vectores de expresión pueden incluir uno o más genes marcadores seleccionables y secuencias apropiadas de control de expresión. Los genes marcadores seleccionables también pueden incluirse, por ejemplo, proporcionar resistencia a los antibióticos o toxinas, complementan las deficiencias auxotróficos , o suministrar nutrientes críticos no en el medio de cultivo. Las secuencias de control de expresión pueden incluir promotores constitutivos e inducibles, mejoradores de transcripción, terminadores de transcripción, y similares que son bien conocidos en la técnica. Cuando dos o más ácidos nucleicos que codifican exógeno que van a coexpresarse, ambos ácidos nucleicos pueden insertarse, por ejemplo, en un vector de expresión simple o en un vector de expresión por separado. Para la expresión del vector simple, los ácidos nucleicos que codifican pueden ser operativamente enlazados a una secuencia de control de expresión común o enlazada a una secuencia de control diferente, tal como un promotor inducible y un promotor constitutivo. La transformación de las secuencias de ácido nucleico exógeno implicas en una trayectoria metabólica o sintética pueden confirmarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen por ejemplo, análisis de ácido nucleico, tal como transferencias Northern o amplificación de reacción de cadena de polimerasa (PCR) de ARNm, o inmunotransferencia para expresión de productos génicos, u otros métodos analíticos adecuados para probar la expresión de una secuencia de ácido nucleico introducida o su producto de gen correspondiente. Se entenderá que aquellos con experiencia en la técnica que el ácido nucleico exógeno se expresada en una cantidad suficiente para producir el producto deseado, y se entiende además que los niveles de expresión pueden optimizarse para obtener la expresión suficiente que utiliza métodos bien conocidos en la técnica y como se describe en la presente.

La evolución directa es un procedimiento poderoso que involucra la introducción de mutaciones dirigidas a un gen especifico para mejorar y/o alterar las propiedades de una enzima. Las enzimas mejoradas y/o alteradas pueden identificarse a través del desarrollo e implementación de los ensayos seleccionados de rendimiento de alta sensibilidad que permiten la selección automatizada de muchas variantes de enzima (por ejemplo, >104) . Las rondas iterativas de mutagénesis y selección típicamente se realizan para proporcionar una enzima con propiedades optimizadas. Los algoritmos computacionales que pueden ayudar a identificar áreas del gen durante la mutagénesis también se han desarrollado y pueden reducir significativamente el número de variantes de enzima que necesitan generarse y seleccionarse.

Numerosas tecnologías evolucionadas dirigidas se han desarrollado (para revisiones, véase Hibbert y otros, Ing. Biomol 22:11-19 (2005), Huisman y Lalonde, in Biocatálisis en la industria farmacéutica y biotecnológica pgs.717-742 (2007), Patel (ed) , CRC Press, Otten y Quax. Biomol.Eng 22:1-9 (2005).; y Sen et al, Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223 (2007)) para ser efectiva en crear variantes de diversas bibliotecas y estos métodos se han aplicado de manera exitosa a la mejora de un amplio margen de propiedades a través de muchas clases de enzimas .

Características de la enzima que se han mejorado y/o alterado por tecnologías de la evolución directa incluyen, por ejemplo, selectividad/especificidad -para la conversión de sustratos no naturales; estabilidad de temperatura -durante el procesamiento robusto de alta temperatura; estabilidad de pH -durante el bioprocesamiento bajo condiciones de pH bajo o elevado; tolerancia del sustrato o el producto -de modo que los títulos de producto alto puedan lograrse; uniendo (Km) -amplificar la unión del sustrato para incluir sustratos no naturales, inhibición (Kj.) -para eliminar la inhibición por productos, sustratos, o intermediarios clave; actividad (kcat) -incrementa los índices de reacción enzimática para lograr el flujo deseado; niveles de expresión - incrementa la producción de proteínas y flujo de trayectoria general; estabilidad de oxígeno -durante la operación de enzimas sensibles al aire bajo condiciones aeróbicas; y actividad anaeróbica -durante la operación de una enzima aeróbica, en ausencia de oxígeno.

Los siguientes métodos ejemplares se han desarrollado para la mutagénesis y diversificación de genes para dirigir propiedades deseadas de las enzimas específicas. Cualquiera de estas puede utilizarse para alterar/optimizar la actividad de una enzima descarboxilasa .

EpPCR (Pritchard et al., J Theor.Biol 234:497-509 (2005)) introduce mutaciones puntos aleatorios al reducir la fidelidad de la ADN polimerasa en las reacciones de PCR por la adición de iones Mn2+, al desviar concentraciones de clNTP , o por otra variaciones de condición. El proceso de clonación de cinco etapas para confinar la mutagénesis al gen objetivo de interés involucra: 1) amplificación por PCR propenso a errores del gen de interés, 2) digestión con enzimas de restricción; 3) purificación de gel del fragmento de ADN deseado; 4) ligación un vector, 5) transformación de los variantes de genes en un huésped adecuado y selección de la biblioteca para el rendimiento mejorado. Este método puede generar mutaciones múltiples en un gen único de manera simultánea, lo cual puede ser útil. Un número alto de mutantes puede generarse por EpPCR, de modo que un ensayo de selección de rendimiento alto o un método de selección (especialmente utilizando robótica) es útil para identificar aquellos con características deseables.

La Amplificación Círculo Rodante propenso a error (epRCA) (Fujii et al, Nucleic Acids Res 32:el45 (2004), y Fujii et al, Nat.Protoc 1:2493-2497 (2006)) tiene muchos de estos mismos elementos como epPCR excepto un plásmido circular entero se utiliza como la plantilla y los 6 miembros aleatorios con enlaces de tiofosfato resistentes a la exonucleasa a los 2 últimos nucleótidos se utilizan para amplificar el plásmido seguido por la transformación en células en que el plásmido se vuelve a circular nuevamente a repeticiones en tándem. Ajustar la concentración de Mn2+ puede variar en alguna parte del índice de la mutación. Esta técnica utiliza un método de etapa única propenso a error simple para crear por completo una copia del plásmido con 3-4 mutaciones /kpb. No se requieren cebadores específicos o digestión con enzima de restricción. De manera adicional, este método típicamente se encuentra disponible como un juego.

El ADN o Barajado de Familia (Stemmer, Proc Nati Acad Sci U.S. A 91: 10,747-10,751 (1994); y Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)) típicamente involucra la digestión de dos o más genes variantes con nucleasas, tales como Dnasa I o EndoV para generar un grupo de fragmentos aleatorios que pueden ensamblarse nuevamente por ciclos de recocido y extensión en la presencia de la ADN polimerasa para crear una biblioteca de genes quiméricos. Los fragmentos se ceban entre sí y se presenta la recombinación cuando una copia ceba a otra copia (modificador de plantilla) . Este método puede utilizarse con secuencias de > ADN lkpb. Además de las recombinaciones mutacionales creadas por reensamble de fragmentos, este método introduce mutaciones de punto en las etapas de extensión en un índice similar al PCR propensa a error. El método puede utilizarse para eliminar mutaciones deletérea, al azar y neutral que pueden conferir antigenicidad.

La extensión vacilante (StEP) (Zhao et al., Nat.Biotechnol 16:258-261 (1998)) implica el cebado de plantilla seguido por los ciclos repetidos de 2 etapas de PCR con desnaturalización y una duración muy corta de recocido/extensión (tan corto como 5 segundos) . Los fragmentos de crecimiento se recosen en plantillas diferentes y se extienden más, lo cual se repite hasta realizar secuencias de longitud completa. El cambio de plantilla significa que la mayoría de los fragmentos resultantes tienen padres múltiples. Las combinaciones polimerasas de baja fidelidad (Taq y Mutazyme) reducen las desviaciones propensas a errores, debido al espectro mutacional opuesto.

En la Recombinación por Cebado al Azar (RPR) los cebadores de secuencia aleatoria se utilizan para generar diversos fragmentos de ADN cortos complementarios a los diferentes segmentos de la plantilla. (Shao et al., Nucleic Acids Res. 26:681-683 (1998)). La incorporación y cebado erróneos de base mediante epPCR proporciona las mutaciones puntuales. Los fragmentos de ADN cortos se ceban entre sí basándose en la homología y se recombinan y se ensamblan nuevamente por completo en la longitud por termociclación repetida. La eliminación de plantillas antes de esta etapa asegura recombinantes parentales bajos. Este método, como la mayoría de los otros, puede realizarse sobre iteraciones múltiples para involucrar propiedades distintas. Esta tecnología impide la desviación de secuencia, es independiente de la longitud genética, y requiere muy poco ADN parental para la aplicación.

En Recombinación Heterodúplex el ADN plásmido linearizado se utiliza para formar los heterodúplex que se reparan por la reparación de errores de recocido. (Volkov et al, Nucleic Acids Res 27: el8 (1999), y Volkov y otros, Methods Enzymol 328:456-463 (2000)). La etapa de reparación de errores de recocido es en cierta manera mutagénico . Los heterodúplex se transforman de manera más eficiente que los homodúplex lineales. Este método es adecuado para los genes grandes y todos los operones .

La Quimeragénesis Aleatoria en Plantillas de Transitorias (RACHITT) (Coco et al., Nat . Biotechnol 19:354-359 (2001)) emplea la fragmentación aDnsa I y fraccionamiento de tamaño del ADN de cadena simple. Los fragmentos homólogos se hibridizan en la ausencia de polimerasa a un andamiaje del ADN de cadena simple complementaria. Cualquiera de los extremos de fragmentos sin hibridizar de solapamiento se ajusta por una exonucleasa. Los espacios entre los fragmentos se llenan, y después se ligan para proporcionar un grupo de diversas hebras de larga duración hibridizadas al andamiaje (que contiene U para impedir la amplificación) . El andamiaje entonces se destruye y se reemplaza por una nueva hebra complementaria a la hebra diversa por amplificación de PCR. El método involucra una hebra (andamiaje) que es proveniente únicamente de un padre, mientras que los fragmentos de cebado derivan de otros genes; el andamiaje parental se selecciona nuevamente. Por lo tanto, no se presenta el recocido con los fragmentos parentales . Los fragmentos de solapamiento se ajustan con una exonucleasa. De otro modo, de manera conceptual esto es similar al barajado de ADN y StEP. Por lo tanto, no deben existir hermanos, pocos inactivos, no parentales sin barajar. La ventaja de esta técnica es que pocos o ninguno de los genes parentales se crean y pueden resultar mucho más cruzamientos en relación al barajado de ADN estándar.

La Extensión Recombinada en Plantillas Truncadas (RETT) conlleva al cambio de plantilla de las hebras crecimiento de manera unidireccional a partir de cebadores en la presencia de fragmentos de ADN de cadena simple unidireccionales utilizadas como un grupo de plantillas. (Lee et al, J.Molec . Catalysis 26: 119-129 (2003)) . No se utilizan endonucleasas de ADN. El ADN de cadena simple unidireccional se hace por polimerasa de ADN con cebadores aleatorios o eliminación de serie con exonucleasa. El ADN de cadena simple unidireccional son únicamente plantillas y no cebadores. El cebado aleatorio y exonucleasa no presentan desviación de secuencia del mismo modo que la división enzimática del barajado de ADN/RACHITT. La RETT puede ser más fácil de optimizar que la StEP ya que esta utiliza normalmente en condiciones de PCR en lugar de extensiones muy cortas. La recombinación se presenta como un componente de las etapas de PCR--sin barajado directo. Este método también puede ser más aleatorio que el StEP debido a la ausencia de pausas.

En el Barajado Genético Oligonucleótido Degenerado (DOGS) los cebadores degenerados se utilizan para controlar la recombinación entre las moléculas; (Bergquist y Gibbs, Methods Mol.Biol 352: 191-204 (2007); Bergquist et al, Biomol.Eng 22:63-72 (2005); Gibbs et al, Gene 271:13-20 (2001)) este puede utilizarse para controlar la tendencia de los otros métodos tales como el barajado de ADN para regenerar genes parentales . Este método puede combinarse con la mutagénesis aleatoria (epPCR) de segmentos genéticos seleccionados. Este puede ser un buen método para bloquear la reformación de secuencias parentales . No son necesarias las endonucleasas. Al ajustar las concentraciones de entrada de los segmentos realizados, una puede desviarse hacia una estructura base deseada. Este método permite que el barajado de ADN a partir de padres no relacionados, sin enzimas de restricción digiera y permita una elección de métodos de mutagénesis aleatorio.

El Truncamiento Gradual para la Creación de Enzimas Híbridas (ITCHY), crea una biblioteca combinatoria con eliminaciones de par de una base 1 de un gen o fragmento de gen de interés. (Ostermeier et al., Proc Nati Acad Sci U.S. A. 96:3562-3567 (1999); y Ostermeier et al., Nat . Biotechnol 17: 1205-1209 (1999)) Los truncamientos se presentan en la dirección opuesta en piezas de 2 genes diferentes. Estos se ligan juntos y las fusiones se clonan. Esta técnica no requiere homología entre los 2 genes parentales . Cuando ITCHY se combina con el barajado de ADN, el sistema se denomina SCRATCHY (véase a continuación) . Una ventaja principal de ambos es que no necesitan la homología entre genes parentales, por ejemplo, fusiones funcionales entre E. coli y un gen humano creados mediante ITCHY. Cuando se realizan las bibliotecas ITCHY, se capturan todos los cruzamientos posibles.

El truncamiento Tio-gradual para la creación de enzimas híbridas (THIO-ITCHY) es similar a ITCHY, excepto que los dNTP de fosfotioato se utilizan para generar truncamientos. (Lutz et al, Nucleic Acids Res 29: E16 (2001)) En relación con ITCHY, THIO-ITCHY puede ser más fácil optimizar, proporcionar más la reproducibilidad y ajustabilidad.

El SCRATCHY combina dos métodos para la recombinación de genes, ITCHY y barajado de ADN. (Lutz et al., Proc Nati Acad Sci U.S. A. 98: 11248-11253 (2001)) SCRATCHY combina las mejores características de ITCHY y barajado de ADN. Primero, el ITCHY se utiliza para crear un conjunto comprensivo de fusiones entre fragmentos de genes y una manera independiente homológica de ADN. Esta familia artificial después se somete a una etapa de barajado de ADN para incrementar el número de cruzamiento. Las predicciones computacionales pueden utilizarse para la optimización. La SCRATCHY es más eficaz que el barajado de ADN cuando la identidad de secuencia se encuentra por debajo de 80%.

En la Mutagénesis de Desviación Aleatoria (RNDM) las mutaciones hechas mediante epPCR seguida por tamizado/selección para aquella actividad útil de retención (Bergquist et al., Bio ol.Eng 22:63-72 (2005)). Entonces, éstas se utilizan en el DOGS para generar recombinantes con fusiones entre mutantes activos múltiples o entre mutantes activos y otros padres deseables. Diseñada para promover el aislamiento de mutaciones neutrales; su propósito es tamizar durante la actividad catalítica retenida o incluso si esta actividad es mayor o menor que en el gen original . La RNDM es útil en los ensayos de alta producción cuando el tamizado es capaz de detectar la actividad antes del antecedente. La RNDM se ha utilizado como un extremo frontal de DOGS en diversidad de generación. Esta técnica impone un requerimiento durante la actividad antes del barajado u otras etapas de secuencia; las bibliotecas de desviación neutral se indican para dar como resultado en mejoras mayores/más rápidas en la actividad a partir de bibliotecas menores. Aunque se publique utilizando epPCR, éste puede aplicarse a otros métodos de mutagénesis de mayor escala.

La Mutagénesis de Saturación de Secuencia (SeSaM) es un método de mutagénesis aleatorio que: 1) genera grupos de fragmentos aleatorios de ancho aleatorio utilizando una » incorporación aleatoria de un nucleótidos fosfotioato y división; este grupo se utiliza como una plantilla para 2) extenderse en la presencia de bases "universales" tales como inosina, 3) réplica de un complemento que contiene inosina que proporciona una incorporación de base aleatoria y, por consiguiente, mutagénesis. (Wong et al., Biotechnol J 3:74-82 (2008); Wong et al., Nucleic Acids Res 32:e26 (2004); y Wong et al., Anal . Biochem. 341: 187-189 (2005)). Utilizando esta técnica puede ser posible generar una biblioteca mayor de mutantes dentro de 2-3 días utilizando métodos simples. Esta técnica no es dirigida en comparación a la desviación mutacional de polimerasas de ADN. Las diferencias en este procedimiento hacen de esta técnica complementaria (o una alternativa) para epPCR.

En el Barajado Sintético, los oligonucleótidos de solapamiento se diseñan para codificar "toda la diversidad genética en objetivos" y permite una diversidad muy alta para la progenie barajada. (Ness et al., Nat . Biotechnol 20: 1251-1255 (2002)). En esta técnica, uno puede diseñar los fragmentos para ser barajados. Esto ayuda en la incrementación de diversidad resultante de la progenie. Uno puede diseñar las desviaciones de secuencia/codón para hacer que las secuencias relacionadas más alejadas se recombinen en índices que se aproximen aquellos observados con secuencias relacionadas más cercanas. De manera adicional, la técnica no requiere posea físicamente los genes de la plantilla.

El Intercambio Nucleótidos y Tecnología División NexT aprovecha una combinación de incorporación dUTP seguido por el tratamiento con uracilo ADN glicosilasa y después piperidina para realizar un criterio de valoración de la fragmentación de ADN (Muller et al., Nucleic Acíds Res 33:ell7 (2005)). El gen vuelve a ensamblarse utilizando la extensión de cebador de PCR interno con polimerasa de corrección de prueba. Los tamaños para barajar pueden controlarse de manera directa utilizando proporciones variadas de dUPT: : dTTP . Este es una reacción de criterios de valoración utilizando métodos simples para la incorporación y de división de uracilo. Otros análogos nucleótidos, tales como 8-oxo-guanina, puede utilizarse con este método. De manera adicional, la técnica funciona bien con fragmentos muy pequeños (86 pb) y tiene un índice muy bajo de error. La división química de ADN utilizada en esta técnica resulta en muy pocos clones sin barajar.

En la Recombinación de Proteína Independiente de Secuencia de Homología (SHIPREC) un ligador se utiliza para facilitar la fusión entre dos genes lejanos/no relacionados. El tratamiento de nucleasa se utiliza para generar un margen de quimeras entre dos genes. Estas fusiones resultan en bibliotecas de híbridos de cruzamiento simple. (Sieber et al., Nat.Biotechnol 19:456-460 (2001)) Esto produce un tipo limitado de barajado y un proceso separado se requiere durante la mutagénesis. Además, ya no es necesario la homología esta técnica puede crear una biblioteca de quimeras con fracciones diferentes de cada una de dos genera parentales no relacionados. La SHIPREC se probó con un dominio de heme-unión de una bacteria CP450 fusionada a las regiones N-terminales de un mamífero CP450; esto produjo actividad mamífera en más de una enzima soluble.

En la Gene Site Saturation Mutagénesis™ (GSSM™) los materiales de inicio son un plásmido de ADN de doblo cadena súper helicoidal que contiene un inserto y dos cebadores los cuales se degeneran en el sitio deseado de mutaciones. ((Kretz et al., Methods Enzymol . 388:3-11 (2004)) Los cebadores que portan la mutación de interés, recosen la misma secuencia en hebras opuestas de ADN. La mutación típicamente se encuentra en el centro del cebado y rodea en cada lado por ~20 nucleótidos de la secuencia correcta. La secuencia en el cebado es o N K (codificado) y M N (no codificado) (N = todos los 4, K = G, T, M = A, C) . Después de la extensión, Dpnl se utiliza para digerir ADN metilado de adenina para eliminar la plantilla de tipo silvestre. Esta técnica explora todas las sustituciones de aminoácidos posibles en un lugar proporcionado (es decir, un codón) . La técnica facilita la generación de todos los reemplazamientos posibles en un solo sitio sin codones de terminación y resulta equivalente para una representación casi equivalente de la mayoría de los alelos posibles. Esta técnica no requiere un conocimiento previo de la estructura, mecanismo, o dominio de la enzima objetivo. Si es seguido por el barajado o reensamble genético, esta tecnología crea una biblioteca diversa de recombinantes que contiene todas las combinaciones posibles de mutaciones en un sólo sitio. La utilidad de esta combinación de tecnología se ha demostrado durante la evolución exitosa de más de 50 enzimas diferentes, y también por más de una propiedad en una enzima proporcionada.

La Mutagénesis Cásete Combinatoria (CCM) involucra el uso de casetes oligonucleotidos cortos para reemplazar las regiones limitadas con un número mayor de alteraciones de secuencias de aminoácidos posibles. (Reidhaar-Olson et al. Methods Enzymol. 208:564-586 (1991); y Reidhaar-Olson et al. Science 241:53-57 (1988)) Las sustituciones simultaneas en dos o tres sitios son posibles utilizando esta técnica. De manera adicional, el método de prueba una multiplicidad mayor de cambios de secuencia posibles en un margen limitado de sitios. Esta técnica se ha utilizado para explorar el contenido de información del dominio de unión al ADN de la represora lambda.

La Mutagénesis de Cásete Múltiple Combinatoria (CMCM) es similar esencialmente a la CCM, excepto que esta se emplea como parte de un programa mayor: 1) Uso de epPCR en un índice de mutación elevado para 2) los puntos críticos ID y regiones críticas y después 3) la extensión por CCM para cubrir una región definida del espacio de secuencias de proteínas. (Reetz, M. T., S. Wilensek, D. Zha, and K. E. Jaeger, 2001, Directed Evolution of an Enantioselective Enzyme through Combinatorial Multiple-Cassette Mutagénesis. Angew. Chem. Int .Ed Engl. 40:3589-3591.) Como con la CCM, este método puede probar prácticamente todas las alteraciones posibles sobre una región objetivo. Si se utiliza junto con los métodos para crear mutaciones aleatorias y genes barajados, proporciona un medio excelente de generar proteínas diversas y barajadas. Este proceso fue exitoso en incrementar, por 51-pliegues, la enantioselectividad de una enzima .

En la técnica Cepas Mutadoras los plásmidos mutadores ts condicionales permiten incrementar de 20 a 4000-X en una frecuencia de mutación aleatoria y natural durante la acumulación de selección y bloqueo de mutaciones perjudiciales cuando no se requiere la selección. (Selifonova et al., Appl Environ Microbiol 67:3645-3649 (2001)) Esta tecnología se basa en el gen mutD5 derivado del plásmido, el cual codifica una subunidad mutante de ADN III polimerasa. Esta subunidad se une a un endógeno ADN polimerasa III y comprende la capacidad de errores de la polimerasa III en cualquier cepa que albergue al plásmido. Se presenta un amplio espectro de sustitución de base y mutaciones cambio de fase. Para tener un uso efectivo, el plásmido mutador debe eliminarse una vez que el fenotipo deseado se logra; este se logra a través de un origen de sensible de temperatura de réplica, el cual permite al plásmido curarse a 41° C. debe observarse que las cepas mutadoras se han explorado durante bastante tiempo (por ejemplo, véase al Low et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680 (1996)). En esta técnica se observan índices muy elevados de mutación espontánea. La propiedad condicional minimiza las mutaciones de antecedentes no deseadas. Esta tecnología puede combinarse con una evolución adaptable para mejorar los índices de mutagénesis y lograr de manera más rápida los fenotipos deseados.

"La Mutagénesis de Revisión (MLP) es un método de mutagénesis muítidimensional que evalúa y optimiza las mutaciones combinatorias de aminoácidos seleccionados". (Rajpal et al., Proc Nati Acad Sci U.S. A. 102:8466-8471 (2005)) En lugar de saturar cada sitio con todos los cambios de ácido amino posibles, un conjunto de nueve se eligen para cubrir la margen del grupo-R aminoácidos químicos . Pocos cambios por sitio permiten que sitios múltiples se sometan a este tipo de mutagénesis. Un aumento de >800 dobles incrementa en la afinidad de unión para un anticuerpo de nanomolar bajo a picomolar se ha logrado a través de este método. Este es un proceso racional para minimizar el número de combinaciones aleatorias y pueden incrementar la capacidad para encontrar rasgos mejorados al disminuir en gran medida los números de clones para tamizarse. Esto se ha aplicado en la ingeniería de anticuerpos, específicamente para incrementar la afinidad de unión y/o reducir la disociación. La técnica puede combinarse con el tamizado o selección.

El reensamble de genes es un método de barajado de ADN que puede aplicarse a genes, múltiples en una sola vez o para crear una biblioteca mayor de quimeras (mutaciones múltiples) de un solo gen. (Tunable GeneReassembly™ (TGR™) Tecnología proporcionada por Verenium Corporation) Típicamente esta tecnología se utiliza en combinación con la selección de ultra-alta-producción para averiguar el espacio de secuencia representado por mejoras deseadas. Esta técnica permite la recombinación de genes múltiples independientes de homología. El número exacto y posición de eventos de cruzamiento pueden predeterminarse utilizando fragmentos diseñados mediante el análisis bioinformático . Esta tecnología conduce a un nivel muy alto de diversidad reformación genética prácticamente no parental y un nivel bajo de genes inactivos. Combinada con GSSM™, un margen mayor de mutaciones puede probarse para la actividad mejorada. El método permite el "mezclado" y "ajuste fino" de barajado de ADN, por ejemplo, puede optimizarse el uso de codón.

La Automatización de Diseño de Proteína In Silico (PDA) es un algoritmo de optimización que ancla la estructura principal de proteína estructuralmente definida que posee un doblez particular, y busca espacio de secuencia para sustituciones de aminoácidos que estabilizan el doblez energiza completamente la proteína. (Hayes et al., Proc Nací Acad Sci U.S. A. 99: 15926-15931 (2002)) Esta tecnología utiliza in silico estructura basada en predicciones de entropía para buscar la tolerancia estructural hacia las variaciones de proteína de aminoácidos. Los mecanismos estadísticos se aplican para calcular las interacciones acopladas a cada posición. La tolerancia estructural hacia la sustitución de aminoácidos es una medida de acoplamiento. Finalmente, esta tecnología se diseña para producir modificaciones deseadas de propiedades de proteínas mientras se mantiene la integridad de características estructurales. El método computacional evalúa y permite la filtración de un número muy amplio de variantes de secuencia posibles ( 1050) . Esta elección de variantes de secuencias para probar se relaciona con las predicciones basadas en la mayoría de termodinámicas favorables. En apariencia, únicamente la estabilidad o propiedades que se enlazan a la estabilidad pueden ser dirigidas de manera eficiente con esta tecnología. El método ha sido utilizado de manera exitosa en algunas proteínas terapéuticas, especialmente en las inmunoglobulinas de ingeniería. En las predicciones in silico impiden probar de manera extraordinaria los números grandes de variantes potenciales. Las predicciones basadas en tres estructuras dimensionales existentes tienen mayor probabilidad de tener éxito que las predicciones basadas en las estructuras hipotéticas. Esta tecnología puede predecir fácilmente y permitir la selección objetivo de mutaciones simultáneas múltiples, algo que no es posible con tecnología puramente experimental, debido a los incrementos exponenciales en números .

Mutagénesis de Saturación Iterativa (ISM) involucra): 1) utiliza reconocimiento de estructura/ función para elegir un sitio probable para el mejoramiento de enzima, 2) mutagénesis de saturación en un lugar elegido utilizando Stratagene QuikChange (u otro medio adecuado), 3) tamizar/seleccionar para propiedades deseadas y 4) con el clon o clones mejorados, comenzar en otro sitio y continuar la repetición. (Reetz et al., Nat.Protoc. 2:891-903 (2007); y Reetz et al., Angew. Chem.Int.Ed Engl . 45:7745-7751 (2006)). Ésta es una metodología probada, la cual asegura que todos los reemplazos posibles en una posición proporcionada se realizan por tamizado/selección.

Cualquiera de los métodos antes mencionados para la mutagénesis puede utilizarse solo o en cualquier combinación. De manera adicional, cualquiera o una combinación de los métodos de evolución dirigidos pueden utilizarse junto con las técnicas de evolución de adaptación.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir n-propanol e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol expresada en una cantidad suficiente para producir n-propanol, la trayectoria n-propanol incluye una propionaldehído deshidrogenasa, una propanol deshidrogenasa, una propionil-CoA: fosfato propanoiltransíerasa, una propionil-CoA hidrolasa, una propionil-CoA transferasa, una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionato reductasa o una propionil fosfato reductasa, esta trayectoria isopropanol comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol que incluye una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenasa .

En un aspecto adicional de la modalidad anterior, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de acetil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de acetil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, la trayectoria de acetil-CoA que incluye una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidoreductasa, una piruvato- formiato liasa que activa la enzima, o una formiato deshidrogenasa.

En una modalidad adicional, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria de propionil-CoA incluye una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA mutasa, una metilmalonil-CoA epimerasa o una metilmalonil-CoA descarboxilasa. En un aspecto adicional, la trayectoria de propionil-CoA carboxilasa incluye una piruvato carbolxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

En otra modalidad adicional, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria de propionil-CoA incluye una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una treonina desaminasa, o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa . En un aspecto adicional, la trayectoria n-propanol incluye 2-oxobutanoato descarboxilasa.

En otra modalidad adicional, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria de propionil-CoA incluye una acetil-CoA carboxilasa, una malonil-CoA reductasa, una malonato semialdehido reductasa o propionil-CoA sintasa.

En otra modalidad adicional, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria de propionil-CoA incluye una lactato deshidrogenasa, una lactato-CoA transferasa, una lactil-CoA deshidratasa o acriloil-CoA reductasa.

En aún otra modalidad, la invención proporciona un método para producir n-propanol e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que tiene un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol que tiene un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En un aspecto adicional de la modalidad anterior, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de acetil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de acetil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa; y una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidoreductasa, o una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa .

En otra modalidad adicional, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una malato deshidrogenasa; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; una metilmalonil-CoA mutasa, y una metilmalonil-CoA descarboxilasa. En un aspecto adicional, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos además codifica una metilmalonil-CoA epimerasa o una piruvato carboxilasa.

En otra modalidad adicional, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, tal tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una treonina desaminasa, y una 2-oxobutanoato deshidrogenasa. En un aspecto adicional, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos además codifica una metilmalonil-CoA descarboxilasa o una piruvato carboxilasa. En aún otro aspecto, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos además codifica una 2-oxobutanoato descarboxilasa.

En otra modalidad adicional, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA carboxilasa, una malonil-CoA reductasa, una malonato semialdehído reductasa y una propionil-CoA sintasa.

En otra modalidad adicional, el método incluye un organismo microbiano que tiene una trayectoria de propionil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una lactato deshidrogenase; una lactato-CoA transíerasa; una lactil-CoA deshidratasa; y acriloil-CoA reductasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir n-propanol e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una malato deshidrogenasa; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA descarboxilasa ; y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa y una propionil fosfato reductasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidoreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa ; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir n-propanol e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una treonina desaminasa; y una 2-oxobutanoato descarboxilasa y una propanol deshidrogenasa; o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa, o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidoreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato- formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa. En un aspecto adicional, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifica una piruvato carboxilasa o un metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir n-propanol e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidoreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA carboxilasa; una malonil-CoA reductasa; una malonato semialdehído reductasa; propionil-CoA sintasa, y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa , una propionil fosfato reductasa y propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir n-propanol e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una lactato deshidrogenasa; una lactato-CoA transferasa; una lactil-CoA deshidratasa ; acriloil-CoA reductasa, y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidoreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir n-propanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol, la trayectoria n-propanol comprende por lo menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol expresada en una cantidad suficiente para producir n-propanol, la trayectoria n-propanol incluye una propionaldehído deshidrogenasa, una propanol deshidrogenasa, una propionil CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil-CoA hidrolasa, una propionil-CoA transferasa, una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionato reductasa, o una propionil fosfato reductasa.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir n-propanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol, la trayectoria n-propanol comprende un conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican que codifican las enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa, o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa.

En un aspecto adicional de la modalidad anterior, el método para producir un propanol incluye cultivar el organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol que también tiene una trayectoria de propionil-CoA incluyendo ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA como se ejemplifica en la presente. Por ejemplo, en algunos aspectos los ácidos nucleicos exógenos codifican una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA mutasa, o una metilmalonil-CoA descarboxilasa . En otro aspecto, los ácidos nucleicos exógenos además codifican una metilmalonil-CoA epimerasa. De manera adicional, en aún otro aspecto de la modalidad anterior, el método para producir un propanol incluye cultivar el organismo microbiano de origen no natural que tiene una trayectoria n-propanol que tiene un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, en donde el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos codifican una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una malato deshidrogenasa; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA epimerasa; una metilmalonil-CoA descarboxilasa; una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 14-BDO expresado en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, la trayectoria de 14-BDO incluye una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, un-4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, una 4-hidroxibutirato reductasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa , una 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa o una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), la trayectoria isopropanol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresado en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol incluye una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenas .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 13-BDO expresada en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, la trayectoria de 13-BDO incluye una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa, una crotonasa, una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 3-hidroxibutiraldehido reductasa, una 3 -hidroxibutiril -CoA transferasa, una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa, o una 3 -hidroxibutirato reductasa, o una 3 -hidroxibutiril -CoA reductasa (que forma alcohol), la trayectoria isopropanol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol incluye una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de MAA expresada en una cantidad suficiente para producir MAA, la trayectoria de MAA incluye una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa, una 3 -hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa, una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa, una metacrilil-CoA hidrolasa, una 3-hidroxiisobutiril transferasa-CoA, una 3- hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, una 3-hidroxibutirato deshidratasa, una metilmalonil-CoA mutasa, una metilmalonil-CoA epimerasa, una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA hidrolasa, un metilmalonato reductasa, una metilmalonil-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, una metilmalonil-CoA reductasa (que forma alcohol) o una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, la trayectoria isopropanol incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una suficiente cantidad para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol incluye una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa o una isopropanol deshidrogenasa.

En un aspecto adicional de las modalidades anteriores, el organismo microbiano tiene una trayectoria de acetil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de acetil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, la trayectoria de acetil-CoA incluye una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidoreductasa, una piruvato- formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima, o una formiato deshidrogenasa .

En un aspecto adicional de las modalidades anteriores, el organismo microbiano tiene una trayectoria de succinil-CoA que tiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de succinil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir succinil-CoA, la trayectoria de succinil-CoA incluye una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa. En un aspecto adicional, la trayectoria de succinil-CoA incluye una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) ; y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetilo tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato reductasa, y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) ; y una 4-hidroxibutiraldehido reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa, y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetilo tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa,- una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenase; 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; , una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato reductasa, y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa ; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa ; una 4-hidroxibutirato cinasa; una 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa; y un 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa ; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codi-fican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o 0una 4- . ¿> c hidroxibutiril-CoA sintetasa; y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenase .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa ; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4- hidroxibutiril-CoA deshidratasa, una crotonasa, una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una una 3 -hidroxibutirato reductasa; y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa ; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) ; y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3-hidroxibutirato reductasa; y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa ; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa, y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una suficiente cantidad para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural , incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) ; y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad invención proporciona método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural , incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa, una crotonasa, una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3-hidroxibutirato reductasa, y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenase,- una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa ; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa; una 3 -hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3-hidroxibutirato reductasa; y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una crotonasa, y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa ; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratase; una crotonasa; y una 3 -hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa; y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa; y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa; y una 3 -hidroxiisobutirato deshidratasa , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3 -hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa ; y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa; y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa ; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3 -hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa; y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa ; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa; y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA reductasa (que forma aldehido) ; una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa; y una 3 -hidroxiisobutirato deshidratasa , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA epimerasa; una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa, o una metilmalonil-CoA hidrolasa; una metilmalonato reductasa; una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa; y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa o una metilmalonil-CoA hidrolasa; una metilmalonato reductasa; una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa ; y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA reductasa (que forma alcohol), y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican las enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifican una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

En un aspecto adicional de las modalidades anteriores, el organismo microbiano tiene una trayectoria de acetil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de acetil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, y una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidoreductasa ; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato- formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa.

En otra modalidad adicional, el organismo microbiano tiene una trayectoria de succinil-CoA que tiene un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de succinil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir succinil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa y una succinil-CoA sintetasa. En un aspecto adicional, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifican una metilmalonil-CoA epimerasa, una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 14-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural, incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 14-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 14-BDO incluyendo un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de 14-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 14-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa , una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una piruvato carboxilasa, una metilmalonil-CoA carboxitransferasa, una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una-4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, una 4-hidroxibutirato reductasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, un 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa, una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidoreductasa, una piruvato- formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima, un formiato deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y un isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir 13-BDO e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 13-BDO y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 13-BDO incluyendo una primera conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria de 13-BDO expresadas en una cantidad suficiente para producir 13-BDO, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una piruvato carboxilasa, una metilmalonil-CoA carboxitransferasa , una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa , una crotonasa, una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) ; una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 3 -hidroxibutiril-CoA hidrolasa, una 3-hidroxibutirato reductasa, y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidoreductasa, una piruvato-formiato liasa, una piruvato- formiato liasa que activa la enzima, una formiato deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural incluyendo un organismo microbiano que tiene una trayectoria de MAA y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA incluyendo una primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican las enzimas de trayectoria de MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA( el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una piruvato carboxilasa, una metilmalonil-CoA carboxitransferasa, una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA-hidrolasa, 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa, metacrilil-CoA-transferasa, metacrilil-CoA sintetasa, metacrilil-CoA hidrolasa y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifican una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidoreductasa, una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima, una formiato deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

En una modalidad, la invención proporciona un método para producir MAA e isopropanol que incluye cultivar un organismo microbiano de origen no natural que incluye un organismo microbiano que tiene MAA trayectoria y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de MAA que incluye un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos codificando enzimas de trayectoria MAA expresadas en una cantidad suficiente para producir MAA, como el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos codificando una carboxicinasa PEP, una carboxilasa PEP, una malato de deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una piruvato carboxilasa, una metilmalonil-CoA carboxitransferasa, una metilmalonil-CoA mutasa, una metilmalonil-CoA epimerasa, una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA hidrolasa, una metilmalonato reductasa, una metilmalonil-CoA reductasa (formando aldehido), una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, una metilmalonil-CoA reductasa (formando alcohol) y una 3 -hidroxiisobutirato deshidratasa, y la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos codificando enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos codificando una piruvato quinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidorreductasa , una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa la enzima, una formiato deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa , y una isopropanol deshidrogenasa.

En un aspecto adicional de cada una de las modalidades anteriores, las condiciones incluyen condiciones de cultivo sustancialmente anaeróbico.

Una purificación adecuada y/o ensayos para probar la producción de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA puede realizarse utilizando métodos bien conocidos. Las replicas adecuadas tales como cultivos por triplicado pueden cultivarse para cada cepa de ingeniería para ser probada. Por ejemplo, puede monitorearse la formación de producto y subproducto en el huésped de producción de ingeniería. El producto final e intermediarios, y otros compuestos orgánicos, pueden analizarse por métodos tales como HPLC (Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento) , GC-MS (Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas) y LC-MS (Cromatografía liquida-Espectrometría de Masas) u otros métodos analíticos adecuados utilizados en procedimientos de rutina bien conocidos en la técnica. La liberación del producto en el caldo de fermentación también puede probarse con el sobrenadante del cultivo. Los subproductos y glucosa residual puede cuantificarse al utilizar la HPLC, por ejemplo, un detector de índice de refractivo para glucosa y alcoholes, y un detector de UV para ácidos orgánicos (Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)), u otros ensayos adecuados y métodos de detección bien conocidos en la técnica. Las actividades de la enzima o la proteína individual a partir de las secuencias de ADN exógenas también pueden ensayarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Diversos alcoholes pueden cuantificarse por cromatografía de gas al utilizar un detector de ionización de flama como se describe en Atsumi et al. Metab Eng (2007) y Hanai et al. Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007).

El n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA pueden separarse de otros componentes en el cultivo utilizando una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos de separación incluyen, por ejemplo, procedimientos de extracción, así como métodos que incluyen extracción líquido- líquido continua, pervaporación, filtración de membrana, separación de membrana, osmosis inversa, electrodiálisis , destilación, cristalización, centrifugación, filtración de extracción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de adsorción, y ultrafiltración . Todos los métodos anteriores son bien conocidos en la técnica.

Cualquiera de los organismos microbianos de origen no natural descritos en la presente puede cultivarse para producir y/o segregar los productos biosintéticos de la invención. Por ejemplo, los productores de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA pueden cultivarse para la producción biosintetica de n-propanol, isopropanol, 14-BDO-, 13-BDO y/O MAA.

Para la producción de n-propanol, isopropanol, 14- BDO, 13-BDO y/o MAA, las cepas recombinantes se cultivan en un medio con una fuente de carbono y otros nutrientes esenciales. Se desea altamente mantener condiciones anaeróbicas en el fermentador para reducir los costos del proceso general. Tales condiciones se pueden obtener, por ejemplo, primero rosear el medio con nitrógeno y después sellar los matraces con un tapón septum. Para las cepas en crecimiento no se observa anaeróbicamente, las condiciones microaeróbicas pueden aplicarse al perforar el tapón septum con un pequeño orificio para la ventilación limitada. En condiciones anaeróbicas ejemplares pueden describirse previamente y son bien conocidos en la técnica. Las condiciones aeróbicas y anaeróbicas ejemplares se describen, por ejemplo, en la Publicación Estadounidense 2009/0047719, presentada el 10 de agosto 2007. Las fermentaciones pueden realizarse en una manera de lote, lote alimentado o continua, como se describe en la presente.

Si se desea, el pH del medio puede mantenerse en un pH deseado, en particular pH neutral, tal como un pH de alrededor de 7 por adición de una base, tal como NaOH u otras bases, o ácido, como sea necesario para mantener el medio de cultivo en un pH deseable. El índice de crecimiento puede determinarse al medir la densidad óptica utilizando un espectrofotómetro (600 nm) , y el índice de absorción de glucosa al monitorear la disminución de la fuente de carbono con el tiempo.

El medio de crecimiento puede incluir, por ejemplo, cualquier fuente de carbohidrato que pueda suministrar una fuente de carbono al microorganismo de origen no natural . Tales fuentes incluyen, por ejemplo, azúcares tal como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, fructosa, sacarosa y almidón. Otras fuentes de carbohidrato incluyen, por ejemplo, materias primas renovables y la biomasa. Tipos ejemplares de biomasas que pueden utilizarse como materias primas en los métodos de la invención incluyen biomasa celulósica, la biomasa hemicelulósica y materias primas de lignina o porciones de las materias primas. Tales materias primas de biomasa contienen, por ejemplo, sustratos de carbohidrato útiles como fuentes de carbono tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, fructosa y almidón. Dadas las enseñanzas y orientaciones proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que las materias primas renovables y la biomasa, distintos de aquellos ejemplificados en lo anterior también pueden utilizarse para cultivar los organismos microbianos de la invención para la producción de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA.

Además las materias primas renovables tales como las ejemplificadas en lo anterior, el n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA y organismos microbianos de isopropanol de la invención también pueden modificarse para el crecimiento en gas de síntesis como su fuente de carbono. En esta modalidad específica, una o más proteínas o enzimas se expresan en los organismos que producen n-propanol, isopropanol, 14-BDO-, 13-BDO y/o MAA para proporcionar una trayectoria metabólica durante la utilización de gas de síntesis u otra fuente de carbono gaseoso.

El gas sintético, también conocido como gas de síntesis o gas productor, es el principal producto de la gasificación de carbón y de materiales carbonosos tales como materiales de biomasa, que incluyen cultivos agrícolas y residuos. El gas de síntesis es una mezcla principalmente de H2 y CO y puede obtenerse de la gasificación de cualquier materia prima orgánica, que incluye pero no se limita a carbón, aceite de carbón, gas natural, biomasa y desperdicios de materia orgánica. La gasificación generalmente se realiza de acuerdo con una alta relación de combustible a oxígeno. Aunque en gran parte de H2 y CO, el gas de síntesis también puede incluir C02 y otros gases en pequeñas cantidades. De este modo, el gas sintético proporciona una fuente de costo efectiva de carbono gaseoso tal como CO y, adicionalmente C02.

La trayectoria de ood-Ljungdahl cataliza la conversión de CO y H2 para acetil-CoA y otros productos tales como el acetato. Los organismos capaces de utilizar CO y el gas de síntesis generalmente también tienen la capacidad de utilizar mezclas de C02 y C02/H2 a través del mismo conjunto básico de enzimas y transformaciones abarcadas por la trayectoria de Wood-L ungdahl. La conversión H2-dependiente de C02 a acetato por microorganismos se reconoció mucho antes de que se revelara que CO también puede utilizarse por los mismos organismos y que las mismas trayectorias se involucraron. Se han demostrado diversos acetogenos crecer en la presencia de C02 y producir compuestos tales como acetato, siempre y cuando el hidrógeno se encuentre presente para suministrar a los equivalentes de reducción necesaria (véase, por ejemplo, Drake, Acetogenesis , pp 3-60 Chapman y Hall, Nueva York, (1994)) . Esto se puede resumir por la siguiente ecuación: 2 C02 + 4 H2 + n ADP + n Pi ? CH3COOH + 2 H20 + n ATP De hecho, los microorganismos de origen no natural que poseen la trayectoria de Wood-Ljungdahl pueden utilizar las mezclas de C02 y H2, así como la producción de acetil-CoA y otros productos deseados .

La trayectoria de Wood-Ljungdahl es bien conocida en la técnica y consiste de 12 reacciones las cuales pueden separarse en dos ramas: (1) rama de metilo y (2) rama carbonilo. La rama de metilo convierte al gas de síntesis a metil-tetrahidrofolato (metil-THF) , mientras que la rama de carbonilo convierte el metil-THF a acetil-CoA. Las reacciones en la rama de metilo se catalizan en orden por las siguientes enzimas o proteínas: ferredoxin oxidorreductasa, formiato deshidrogenasa, formiltetrahidrofolato sintetasa, meteniltetrahidrofolato ciclodehidratasa, metilentetrahidrofolato deshidrogenasa y metilentetrahidrofolato reductasa. Las reacciones en la rama de carbonilo se catalizan en orden por las siguientes enzimas o proteínas: metiltetrahidrofolato : proteína corrinoide metiltransferasa (por ejemplo, ACSE) , proteína con hierro-azufre corrinoide, proteína de ensamble de níquel-proteína (por ejemplo, ACSF) , ferredoxin, acetil-CoA sintasa, monóxido de carbono deshidrogenasa y proteína de ensamble de níquel-proteína (por ejemplo, COOC) . Siguiendo las enseñanzas y la orientación proporcionada en la presente para introducir un número suficiente de ácidos nucleicos codificados para generar un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o una trayectoria de MAA, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que el mismo diseño de ingeniería también puede realizarse con respecto a introducir al menos ácidos nucleicos que codifican las enzimas o proteínas de Wood-Ljungdahl ausentes en el organismo huésped. Por lo tanto, la introducción de uno o más ácidos nucleicos codificados en los organismos microbianos de la invención tales como el organismo modificado contiene la trayectoria completa de Wood-Ljungdahl transferirá la capacidad de utilización de gas de síntesis.

Adicionalmente, el ciclo de ácido tricarboxílico (inverso) reductivo y/o hidrogenasa las actividades también pueden utilizarse para la conversión de CO, C02 y/o H2 para el acetil-CoA y otros productos tales como acetato. Los organismos capaces de fijar carbono mediante la trayectoria de TCA reductiva pueden utilizar uno o más de las siguientes enzimas: ATP citrato-liasa, citrato liasa, aconitasa, isocitrato deshidrogenasa, alfa-cetoglutarato : ferredoxin oxidorreductasa, succinil-CoA sintetasa, succinil-CoA-transferasa, fumarato reductasa, fumarasa, malato deshidrogenasa, NAD (P) H: ferredoxin oxidorreductasa, monóxido de carbono deshidrogenasa, e hidrogenasa. Específicamente, los equivalentes de reducción extraídos de CO y/o H2 por monóxido de carbono deshidrogenasa e hidrogenasa se utilizan para fijar C02 mediante el ciclo TCA reductivo en acetil-CoA o acetato. El acetato puede convertirse en acetil-CoA por enzimas tales como acetil-CoA transferasa, acetato quinasa/fosfotransacetilasa, y acetil-CoA sintetasa. Acetil-CoA puede convertirse en un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o precursores de MAA, gliceraldehído-3-fosfato, fosfoenolpiruvato, y piruvato, por piruvato: ferredoxin oxidorreductasa y las enzimas de gluconeogénesis . Siguiendo con las enseñanzas y orientación proporcionada en la presente para introducir un número suficiente de ácidos nucleicos codificados para generar un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o una trayectoria de MAA, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que el mismo diseño de ingeniería también puede realizarse con respecto a introducir al menos los ácidos nucleicos codificando las enzimas o proteínas de trayectoria TCA reductiva ausentes en el organismo huésped. Por lo tanto, la introducción de uno o más ácidos nucleicos codificados en los organismos microbianos de la invención de modo que el organismo modificado contenga la trayectoria TCA reductiva completa transferirá la capacidad de utilización de gas de síntesis.

Por consiguiente, dado las enseñanzas y orientación proporcionada en la presente, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que pueden producirse un organismo microbiano de origen no natural que segrega los compuestos biosintetizados de la invención cuando crecen en una fuente de carbono tal como un carbohidrato. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, n-propanol, isopropanol, 14-BD0-, 13-BDO y/o MAA y cualquiera de los metabolismos intermediarios en el n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o trayectoria MAA. Todo esto se requiere para diseñar en una o más de las actividades de enzima o proteína requerida para lograr la biosíntesis del compuesto o intermediario deseado, incluyendo, por ejemplo, inclusión de algunos o todos de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o trayectorias biosintéticas de MAA . Por consiguiente, la invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que produce y/o segrega n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA cuando crece en un carbohidrato u otra fuente de carbono y produce y/o segrega cualquiera de los metabolismos intermediarios mostrados en el n-propanol, isopropanol, 14-BDO , 13-BDO y/o trayectoria MAA cuando crece en un carbohidrato u otra fuente de carbono. El n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol y que producen organismos microbianos de la invención pueden iniciar la síntesis a partir de un intermediario, por ejemplo, succinil-CoA, propionil-CoA y/o acetil-CoA.

Los organismos microbianos de origen no natural de la invención se construyen utilizando métodos bien conocidos en la técnica como se ejemplifican en la presente para expresar de manera exógena al menos un ácido nucleico que codifica un n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o una enzima o proteína de trayectoria MAA en cantidades suficientes para producir n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. Se entiende que los organismos microbianos de la invención se cultivan bajo condiciones suficientes para producir n-propanol, isopropanol, 14-BDO-, 13-BDO y/o MAA. Siguiendo con las enseñanzas y la orientación proporcionada en la presente, los organismos microbianos de origen no natural de la invención puede lograr la biosíntesis de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA resultando en concentraciones intracelulares está entre alrededor de 0.1-200 mM o más. Generalmente, la concentración intracelular de n-propanol, isopropanol, 14-BDO-, 13-BDO y/o MAA y está entre alrededor 3-150 mm, particularmente entre alrededor 5-125 mM y de manera más particular entre alrededor de 8-100 mM, incluyendo alrededor 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM, o más. Las concentraciones intracelulares entre y encima de cada uno de estos intervalos ejemplares también pueden lograrse a partir de organismos microbianos de origen no natural de la invención .

En algunas modalidades, las condiciones de cultivo incluyen crecimiento anaerobio o sustancialmente anaeróbica o condiciones de mantenimiento. En las condiciones anaeróbicas ejemplares se han descrito en lo anterior y son bien conocidas en la técnica. Las condiciones anaeróbicas ejemplares para los procesos de fermentación se describen en la presente y se describen, por ejemplo, en la Publicación Estadounidense 2009/0047719, presentada el 10 de agosto de 2007. Cualquiera de estas condiciones pueden emplearse con los organismos microbianos de origen no natural así como otras condiciones anaeróbicas bien conocidas en la técnica. Bajo tales condiciones anaerobias, los productores de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA pueden sintetizar n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA en concentraciones intracelulares de 5-10 mM o más, así como todas las otras concentraciones ejemplificadas en la presente. Se entiende que, aunque la descripción anterior se refiera a las concentraciones intracelulares, organismos microbianos que producen n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA pueden producir n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO-y/o MAA intracelularmente y/o segregar el producto en el medio de cultivo.

Las condiciones de cultivo pueden incluir, por ejemplo, procedimientos de cultivo líquido, así como fermentación y otros procedimientos de cultivo de gran escala. Como se describe en la presente, producciones particularmente útiles de los productos biosintéticos de la invención pueden obtenerse bajo condiciones de cultivo anaeróbicas o sustancialmente anaeróbicas.

Como se describe en la presente, una condición de crecimiento ejemplar para lograr la biosíntesis del n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol incluyen cultivo anaerobio o condiciones de fermentación. En ciertas modalidades, los organismos microbianos de origen no natural de la invención pueden sostenerse, cultivarse o fermentarse bajo condiciones anaerobias o sustancialmente anaeróbicas. En resumen, las condiciones anaeróbicas se refieren a un ambiente desprovisto de oxígeno. Las condiciones sustancialmente anaeróbicas incluyen, por ejemplo, un cultivo, fermentación por lote o fermentación continua de modo que la concentración de oxígeno disuelto en el medio permanece entre 0 y 10% de saturación. Las condiciones sustancialmente anaerobias también incluyen células en cultivo o en reposo en medio líquido o sobre agar sólido dentro de una cámara sellada mantenida con una atmósfera de menos del 1% de oxígeno. El porcentaje de oxígeno puede mantenerse, por ejemplo, al rosear el cultivo con una mezcla de N2/C02 u otro, gas adecuado sin oxígeno o gases .

Las condiciones de cultivo descritas en la presente pueden aumentar y constantemente crecer para la fabricación de n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol. Los procedimientos de crecimiento ejemplar incluyen, por ejemplo, fermentación por lote alimentado y separación de lote; fermentación por lote alimentado y separación continua, o fermentación continua y separación continua. Todos estos procesos son bien conocidos en la técnica. Para los procedimientos de fermentación particularmente son útiles para la producción biosintética de las cantidades comerciales de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA. Generalmente, y como con los procedimientos de cultivo no continuos, la producción continua y/o casi continua de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA incluirá cultivar un n-propanol de origen no natural e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol produciendo un organismo de la invención con nutrientes suficientes y un medio para sostener y/o casi sostener el crecimiento en una fase exponencial. El cultivo continuo bajo tales condiciones puede incluir, por ejemplo, el crecimiento durante 1 día, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días o más. Adicionalmente, el cultivo continuo puede incluir períodos de tiempo más largo de 1 semana, 2, 3, 4 ó 5 más o semanas y hasta varios meses. Alternativamente, los organismos de -la invención pueden cultivarse durante horas, si es adecuado para una aplicación particular. Se entenderá que las condiciones de cultivo continuas y/o casi continuas también pueden incluir todos los intervalos entre estos períodos ejemplares. Además se entiende que el tiempo de cultivar del organismo microbiano de la invención es durante un período de tiempo suficiente para producir una cantidad suficiente de producto para un propósito deseado.

Los procedimientos de fermentación son bien conocidos en la técnica. En resumen, la fermentación para la producción biosintética de n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol puede utilizarse en, por ejemplo, fermentación por lote alimentado y separación por lote; fermentación por lote alimentado y separación continua, o fermentación continua y la separación continua. Ejemplos procedimientos de lote y fermentación continua son bien conocidos en la técnica.

Además de los procedimientos anteriores que utilizan la fermentación de los productores de n-propanol, isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA de la invención para la producción continua de cantidades sustanciales de n-propanol e isopropanol, 14-BDO-e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol, los productores de n-propanol , isopropanol, 14-BDO, 13-BDO y/o MAA, por ejemplo, también pueden someterse de manera simultánea a procedimientos de síntesis química para convertir el producto en otros compuestos o las producto puede separarse del cultivo de fermentación y someterse secuencialmente a una conversión química para convertir el producto en otros compuestos, si se desea .

Además de las condiciones de cultivo y fermentación descritas en la presente, la condición de crecimiento para lograr la biosíntesis de n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol puede incluir la adición de un osmoprotector para las condiciones de cultivo. En ciertas modalidades, los organismos microbianos de origen no natural de la invención pueden sostenerse, cultivarse o fermentarse como se describe en la presente en presencia de un osmoprotector. En resumen, un osmoprotector significa un compuesto que actúa como un osmolito y ayuda al organismo microbiano con la tensión osmótica de supervivencia descrita en la presente. Los osmoprotectores incluyen, pero no se limitan a, betaínas, aminoácidos, y el azúcar trehalosa. Los ejemplos no limitados de tales son glicina betaína, praliná betaína, dimetiltetin, dimetilsulfonioproprionato, 3-dimetilsulfonio-2-metilproprionato, ácido pipecólico, dimetilsulfonioacetato , colina, L-carnitina y ectoína. En un aspecto, el osmoprotector es la glicina betaína. Se entiende por uno con experiencia en la técnica que la cantidad y tipo de osmoprotector adecuado para proteger un organismo microbiano descrito en la presente de una tensión osmótica dependerán del organismo microbiano utilizado. La cantidad de osmoprotector en las condiciones de cultivo, por ejemplo, puede ser no más de alrededor de 0.1 mM, no más de alrededor de 0.5 mM, no más de alrededor de 1.0 M, no más de alrededor de 1.5 mM, no más de alrededor de 2.0 mm, sin más de alrededor de 2.5 mM, no más de alrededor de 3.0 mM, no más de alrededor de 5.0 mM, no más de alrededor de 7.0 mM, no más de alrededor de 10 mM, no más de alrededor de 50 mM, no más de alrededor de 100 mM o no más de alrededor de 500 mM.

Para generar mejores productores, el moldeo metabólico puede utilizarse para optimizar las condiciones de crecimiento. El moldeo también puede utilizarse para diseñar los bloqueos de genes que adicionalmente optimizan la utilización de la trayectoria (véase, por ejemplo, las publicaciones de patente Estadounidense US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 y US 2004 0009466 /, y la Patente Estadounidense No. 7.127.379). Los análisis de moldeo permiten predicciones confiables de los efectos en el crecimiento celular para desplazar el metabolismo hacia una producción más eficiente de n-propanol, isopropanol, 14-BD0-, 13-BDO y/O MAA.

Un método computacional para identificar y diseñar alteraciones metabólicas que favorecen la bios ntesis de un producto deseado es el esquema computacional OptKnock (Burgard et al., . Biotechnol . Bioeng. 84:647-657 (2003)) . OptKnock es programa de moldeo y simulación metabólico que sugiere la eliminación genética o estrategias de interrupción que resultan en microorganismos genéticamente estables el cual produce en exceso el producto objetivo. Específicamente, el marco examina la red metabolica y/o bioquímica completa de un microorganismo para sugerir las manipulaciones genéticas que fuerzan a la bioquímica deseada según un subproducto obligatorio de crecimiento celular. Al acoplar la producción de bioquímica con el crecimiento celular a través de las eliminaciones genéticas colocadas estratégicamente u otras interrupciones genéticas funcionales, las presiones de selección de crecimiento impuestas en las cepas de ingeniería después de períodos prolongados de tiempo en un biorreactor que conduce mejoras en el rendimiento como un resultado de la producción bioquímica de crecimiento acoplado obligatorio. Por último, cuando las eliminaciones genéticas se construyen, existe una posibilidad insignificante de las cepas de volver a su estado silvestre ya que los genes seleccionados por OptKnock se eliminaran por completo del genoma. Por lo tanto, esta metodología computacional puede utilizarse para identificar las trayectorias alternativas que conducen a la biosíntesis de un producto deseado o utilizarse con relación a los organismos microbianos de origen no natural para una optimización adicional de la biosíntesis de un producto deseado .

En resumen, OptKnock es un término utilizado en la presente para hacer referencia a un sistema y método computacional para el metabolismo celular de moldeo. El programa OptKnock se refiere a un marco de modelos y métodos que incorporan limitaciones particulares en los modelos de análisis de balance de flujo (FBA) . Estas limitaciones incluyen, por ejemplo, información cinética cualitativa, información regularmente cualitativa, y/o información experimental de micromatriz de ADN. OptKnock también evalúa soluciones a diversos problemas metabólicos, por ejemplo, al ajustar los límites de flujo derivados a través de modelos de balance de flujo y, explorar subsiguientemente los límites de rendimiento de las redes metabólicas en presencia de las adiciones o eliminaciones genéticas. El esquema computacional OptKnock permite la construcción de formulaciones modelo que permiten una búsqueda efectiva de los límites de rendimiento de las redes metabólicas y proporciona métodos para resolver los problemas de programación lineales enteros mezclados resultantes. Los métodos de moldeo y simulación metabólicos referidos en la presente como OptKnock se describen en, por ejemplo, la publicación Estadounidense 2002/0168654, presentada el 10 de enero de 2002, en la Patente internacional No. PCT/US02/00660 , presentada el 10 de enero de 2002, y la publicación Estadounidense 2009/0047719, presentada el 10 de agosto de 2007.

Otro método computacional para identificar y diseñar alteraciones metabólicas que favorecen la producción biosintética de un producto es un sistema de moldeo y simulación metabólicos denominado SimPheny®. Este sistema y método computacional se describe en, por ejemplo, la publicación Estadounidense 2003/0233218, presentada el 14 de junio de 2002, y en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US03/18838, presentada el 13 de junio de 2003. SimPheny® es un sistema computacional que puede utilizarse para producir un modelo de red in silico y para simular el flujo de masa, energía o carga a través de las reacciones químicas de un sistema biológico para definir un espacio de la solución que contiene todas y cada una de las funcionalidades posibles de las reacciones químicas en el sistema, determinando así un margen de actividades permitidas para el sistema biológico. Este proceso se denomina como un modelo basado en limitaciones ya que el espacio de solución se define por los límites tal como la estequiometría conocida de las reacciones incluidas, así como la reacción termodinámica y límites de capacidad asociados con los flujos máximos a través de las reacciones. El espacio definido por estas limitaciones puede ser interrogante para determinar las capacidades fenotípicas y comportamiento del sistema biológico, o de sus componentes bioquímicos.

Estos procedimientos computacionales son consistentes con las realidades biológicas ya que los sistemas biológicos son flexibles y pueden alcanzar el mismo resultado en muchas formas diferentes. Los sistemas biológicos se diseñan a través de mecanismos evolutivos que se han restringido por los límites fundamentales que todos los sistemas existentes deben enfrentar. Por consiguiente, la estrategia de moldeo basada en limitaciones abarca estas realidades generales. Además, la capacidad de imponer de manera continua más restricciones en un modelo de red mediante el ajuste de los resultados limitantes en una reducción en el tamaño del espacio de solución, mejorando así la precisión con la que puede proveerse el rendimiento o fenotipo fisiológico.

Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en la presente, aquellos con experiencia en la técnica serán capaces de aplicar diversos esquemas computacionales de moldeo y simulación metabólicos para diseñar e implementar la biosíntesis de un compuesto deseado en organismos microbianos huésped. Tales métodos de moldeo y simulación metabólicos incluyen, por ejemplo, los sistemas computacionales e emplificados en lo anterior como SimPheny® y OptKnock. Para ilustración de la invención, algunos métodos se describen en la presente con referencia al esquema computacional OptKnock para el moldeo y la simulación. Aquellos con experiencia en la técnica sabrán cómo aplicar la identificación, diseño e implementación de las alteraciones metabólicas utilizando OptKnock para cualquiera de los otros esquemas computacionales de moldeo y simulación metabólicos y métodos bien conocidos en la técnica.

Los métodos descritos en lo anterior proporcionarán un conjunto de reacciones metabólicas para interrumpir. La eliminación de cada reacción dentro del conjunto o modificación metabólica puede resultar en un producto deseado como un producto obligatorio durante la fase de crecimiento del organismo. Dado a que las reacciones son conocidas, una solución para problema OptKnock de dos niveles también proporcionará el gen o genes asociados codificando una o más enzimas que catalizan cada reacción dentro del conjunto de reacciones. La identificación de un conjunto de reacciones y sus genes correspondientes codifican las enzimas que participan en cada reacción es generalmente un proceso automatizado, logrado a través de la correlación de las reacciones con una base de datos de reacción que tiene una relación entre las enzimas y genes codificados.

Una vez identificado, el conjunto de reacciones que serán interrumpidas para lograr la producción de un producto deseado se implementan en la célula u organismo objetivo por la interrupción funcional de al menos un gen que codifica cada reacción metabólica dentro del conjunto. Un significado particularmente útil para lograr la interrupción funcional del conjunto de reacción es por la eliminación de cada gen codificado. Sin embargo, en algunos casos, puede ser benéfico interrumpir la reacción por otras aberraciones genéticas que incluyen, por ejemplo, mutación, eliminación de regiones reguladoras, tales como sitios de unión cis o promotores para factores reguladores, o por truncamiento de la secuencia de codificación en cualquier número de ubicaciones. Estas últimas aberraciones, que resultan en menos de la eliminación total del conjunto de genes que puede ser útil, por ejemplo, cuando las evaluaciones rápidas del acoplamiento de un producto son deseables o cuando la reversión genética es menos probable que suceda.

Para identificar las soluciones productivas adicionales para el problema OptKnock de dos niveles descrito en lo anterior el cual conduce a conjuntos adicionales de reacciones para interrumpir, o modificaciones metabólicas que pueden resultar en la biosíntesis, incluyendo biosíntesis de crecimiento acoplado de un producto deseado, un método de optimización, cortes enteros denominados, pueden implementarse . Este método procede al resolver de manera iterativa el problema OptKnock ejemplificado en lo anterior con la incorporación de una restricción adicional denominada como un corte entero en cada iteración. Las restricciones de corte entero en todos los equivalentes el procedimiento de solución al elegir el mismo conjunto exacto de reacciones identificadas en cualquier iteración previa que acople de manera obligatoria la biosíntesis de productos para el crecimiento. Por ejemplo, si una modificación metabólica de crecimiento acoplada previamente identificada especifica las reacciones 1, 2, y 3 durante la interrupción, entonces, la siguiente restricción impide que las mismas reacciones se consideren de manera simultánea en las soluciones subsiguientes. El método de corte entero es bien conocido en la técnica y puede encontrarse descrito en, por ejemplo, Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17:791-797 (2001). Como con todos los métodos descritos en la presente con referencia a su uso en combinación con el esquema computacional OptKnock para el moldeo y simulación metabólicos, el método de corte entero para reducir la redundancia en el análisis computacional iterativo también puede aplicarse con otros esquemas computacionales bien conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, SimPheny®.

Los métodos ejemplificados en la presente permiten la construcción de células y organismos que producen biosintéticamente un producto deseado, incluyendo el acoplamiento obligatorio de producción de un producto bioquímico objetivo para el crecimiento de la célula u organismo diseñado para hospedar las alteraciones genéticas identificadas. Por lo tanto, los métodos computacionales descritos en la presente permiten la identificación e implementación de modificaciones metabolicas que se identifican por un método in silico seleccionado de OptKnock o SimPheny®. El conjunto de modificaciones metabolicas puede incluir, por ejemplo, adición de una o más enzimas de trayectoria biosintéticas y/o interrupción funcional de una o más reacciones metabolicas que incluyen, por ejemplo, la interrupción por eliminación genética.

Como se discute en lo anterior, la metodología OptKnock se desarrolló en la premisa que las redes microbianas mutantes pueden involucrarse con respecto a sus fenotipos de crecimiento máximo computacionalmente previsto cuando se somete a períodos prolongados de selección de crecimiento. En otras palabras, el procedimiento aprovecha una capacidad del organismo para auto optimizar bajo presiones selectivas. El esquema OptKnock se permite para la enumeración exhaustiva de combinaciones de eliminación genética que forza a un acoplamiento entre la producción bioquímica y crecimiento celular basándose en la estequiometría de red. La identificación de bloqueos genéticos/reacción requiere la solución de un problema de optimización de dos niveles que elige el conjunto de reacciones activas de modo que una solución de crecimiento óptimo para la red resultante produce en exceso la bioquímica de interés (Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003) ) .

Un modelo estequiométrico in silico de E. coli metabolismo puede emplearse para identificar los genes esenciales para las trayectorias metabólicas como se ejemplifican en lo anterior y describe en, por ejemplo, las publicaciones de Patente Estadounidense US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 y US 2004/0009466, y en la Patente Estadounidense No. 7.127.379. Como se describe en la presente, el esquema matemático OptKnock puede aplicarse para precisar las eliminaciones genéticas que conducen a la producción de crecimiento acoplado de un producto deseado. Además, la solución del problema OptKnock de dos niveles proporciona únicamente un conjunto de eliminaciones. Para enumerar todas las soluciones significantes, es decir, todos los conjuntos de bloqueos que dirigen a la formación de producción de crecimiento acoplado, una técnica de optimización, denominada cortes enteros, puede implementarse . Esto conlleva a resolver de manera iterativa el problema OptKnock con la incorporación de una limitación adicional denominada como un corte entero en cada iteración, como se discute en lo anterior.

Se entiende que las modificaciones que no afecten sustancialmente a la actividad de las diversas modalidades de esta invención también se proporcionan dentro de la definición de la invención proporcionada en la presente. Por consiguiente, los siguientes ejemplos se pretenden para ilustrar aunque no limitan la presente invención.

EJEMPLO I Trayectorias para la co-producción de n-propanol e isopropanol a partir de glucosa Este ejemplo describe las trayectorias ejemplares para la co-producción de n-propanol e isopropanol.

Las trayectorias novedosas para co-producir n-propanol e isopropanol y productos relacionados se describen en la presente. Esta invención proporciona cuatro métodos alternativos o alternos para la co-producción de n-propanol e isopropanol. La producción de isopropanol en E. coli se ha descrito anteriormente (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)). En resumen, acetil-CoA se convierte en acetoacetil CoA, transformado en acetoacetato , descarboxilado para formar acetona y después se reduce para formar isopropanol (Figuras 1-4). Los organismos microbianos y métodos descritos en la presente combinan esta ruta conocida con cuatro trayectorias novedosas para sintetizar n-propanol. Esta co-producción proporcionará rutas balanceadas completamente redox para la producción de los alcoholes C3 , es decir, n-propanol e isopropanol, permitiendo la producción anaeróbica a diferencia de los requerimientos de oxigeno si el isopropanol se produce individualmente mediante acetona como se describe por Hanai et al. supra. Una ventaja para la co-producción de n-propanol e isopropanol utilizando cualquiera de las trayectorias descritas en la presente es que la traducción teórica máxima de los alcoholes C3 se proporciona : 1 glucosa -> 1.33 C3H80 + 2C02 + 0.67 H20 Además, todas estas trayectorias tienen una producción positiva neta de ATP.

Producción de isopropanol utilizando acetil-CoA La producción de isopropanol se celebra mediante la conversión de acetil-CoA por una acetoacetil-CoA tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa, una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa como se ejemplifica en las Figuras 1-4. La producción isopropanol se ha descrito para la siguiente expresión E. coli recombinante de los dos genes heterólogos de C. acetobutilicum (THL y ADC codificando acetoacetil-CoA tiolasa y acetoacetato descarboxilasa, respectivamente) y una de C. beijerinckii (ADH codificando un alcohol secundario deshidrogenasa) , junto con la expresión incrementada de los genes atoA y atoD nativos que codifican la actividad acetoacetil-CoA: acetato: CoA transferasa (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007)). La conversión de acetoacetil-CoA a acetoacetato puede catalizarse de manera alternativa por una enzima con actividades de acetoacetil-CoA hidrolasa o acetoacetil-CoA sintetasa.

Acetoacetil-CoA tiolasa La acetoacetil-CoA tiolasa (también conocida como acetil-CoA acetiltransferasa) convierte dos moléculas de acetil-CoA a una molécula de cada una de acetoacetil-CoA y CoA. Las enzimas de acetoacetil-CoA tiolasa ejemplares incluyen los productos genéticos de atoB de E. coli (Martin et al., Nat.Biotechnol 21:796-802 (2003)), thlA y atoB de C. acetobutylicum (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007); Winzer et al., J. Mol .Microbiol Biotechnol 2:531-541 (2000), y ERGIO de S. cerevisiae Hiser et al., J.Biol. C em. 269:31383-31389 (1994)). Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1.

Acetoacetil-CoA transferasa La acetoacetil-CoA transferasa cataliza la conversión de acetoacetil-CoA a acetoacetato mientras transfiere la porción CoA a una molécula aceptora CoA. Diversas Transferasas tienen una amplia especificidad y por lo tanto pueden utilizar aceptores CoA tan diversos como acetato, succinato, propionato, butirato, 2-metilacetoacetato, 3-cetohexanoato, 3-cetopentanoato, valerato, crotonato, 3-mercaptopropionato, propionato, vinilacetato, butirato, entre otros.

La acetoacetil-CoA: acetato: CoA transferasa convierte la acetoacetil-CoA y acetato a acetoacetato y acetil-CoA. Las enzimas ejemplares incluyen los productos genéticos de atoAD de E. coli (Hanai et al, Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007), ctfAB de C. acetobutilicum (Jojima et al, Appl Microbiol Biotechnol 77:.. 1219-1224 (2008), y ctfAB de Clostridium saccharoperbutylacetonicu (Kosaka et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)) se muestran en la siguiente Tabla 2. Una succinil-CoA: 3-cetoácido CoA transferasa (SCOT) también puede catalizar la conversión de la 3-cetoacil-CoA, acetoacetil-CoA, en el 3-cetoácido, acetoacetato . La diferencia de acetoacetil-CoA: acetato: CoA transferasa, SCOT se emplea succinato como una CoA aceptadora en lugar del acetato. La succinil-CoA: 3: cetoácido-CoA transferasas ejemplares se encuentran presentes en Helicobacter pylori (Corthesy-Theulaz et al, J Biol Chem. 272:25659-25667 (1997)), Bacillus subtilis (Stols et al., Protein Expr Purif 53:396-403 (2007)), y el Homo sapiens (Fukao et al, Genomics 68:144-151 (2000); Tanaka et al, Mol Hum Reprod 8: 16-23 (2002)). Incluso, otra transferasa capaz de esta conversión es butiril-CoA: acetoacetato CoA-transferasa. Enzimas ejemplares se pueden encontrar en Fusobacteriu nucleatum (Barker et al, J Bacteriol L52 (1) : 201-1 (1982)), Clos ridium SB4 (Barker et & L, J Biol Chem. 253 (4): 1219-1225 (1978)), y Clostridium acetobutilicum (Wiesenborn et al., Appl Environ Microbiol 55 (2):323-9 (1989)). Aunque las secuencias genéticas específicas no se proporcionaron para la butiril-CoA: acetoacetato CoA-transferasa en estas referencias, los genes FN0272 y FN0273 se han anotado como una butirato-acetoacetato CoA-transferasa (al Kapatral et, J Bact 184(7) 2005-2018 (2002)). Los homólogos tales como Fusobacteriu nucleatum FN1857 y FN1856 probablemente también tienen la actividad acetoacetil-CoA transferasa. FN1857 y FN1856 se localizan adyacentes a muchos otros genes involucrados en la fermentación por lisina y son por lo tanto muy probables a codificar un acetoacetato : butirato CoA transíerasa (Kreimeyer , et al, J Biol Che . 282 (10) 7191-7197 (2007) ) . Candidatos adicionales de Gingivalis Porphyrmonas y Thermoanaerobacter tengcongensis pueden identificarse en una manera similar (Kreimeyer, et al., J. Biol. Chem. 282 (10) 7191-7197 (2007) ) . Estos genes y proteínas se identifican en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2 Acetoacetil-CoA sintetasa Una CoA sintetasa también puede catalizar la reducción de una porción de CoA a partir del acetoacetil-CoA. Una enzima candidata, ADP formando acetil-CoA sintetasa (ACD, CE 6.2.1.13), acopla la conversión de acil-CoA ésteres a sus ácidos correspondientes con la síntesis concurrente de ATP. Diversas enzimas con amplias especificidades de sustrato se han descrito en la literatura. ACD I de Archaeo globus fulgidus, codificado por AF1211, se mostró para operar en una variedad de sustratos de cadena lineal y ramificada que incluye acetil-CoA, propionil-CoA, butiril-CoA, acetato, propionato, butirato, isobutiriato, isovalerato, succinato, fumarato, fenilacetato, indoleacetato (Musfeldt et al., J Bacteriol 184:636-644 (2002)). La enzima de Haloarcula marismortui (anotada como una succinil-CoA sintetasa) acepta propionato, butirato, y ácidos de cadena ramificada (isovalerato e isobutirato) como sustratos,. y mostrados para operar en las direcciones de avance y retroceso (Brasen et al., Arch Microbiol 182:277-287 (2004)). El ACD codificado por PAE3250 de crenarchaeon hipertermofílico Pyrobaculum aerophilum mostró el margen de sustrato más amplio de todos los ACDs caracterizados, que reaccionan con acetil-CoA, isobutiril-CoA (sustrato preferido) y fenilacetil-CoA (Brasen et al . , supra) . Las enzimas de A. fulgidus, H. marismortui and P. aerophilum se han clonado todas, funcionalmente expresado, y caracterizado en E. coli (Musfeldt et al., supra; Brasen et al., supra). Estos genes /proteínas se identifican en la siguiente Tabla 3.

Tabla 3.

Otro candidato CoA sintetasa es succinil-CoA sintetasa. Los genes de sucCD de E. coli a partir de una succinil-CoA sintetasa compleja la cual cataliza naturalmente la formación de succinil-CoA a partir de succinato, con la composición concaminante de un ATP, una reacción que es reversible in vivo (Buck et al., Biochem. 24:6245-6252 (1985)). Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 4.

Tabla 4.

CoA-ligasas ejemplares adicionales incluye la dicarboxilato-CoA ligasa de rata para la cual la secuencia aún no se encuentra caracterizada (Vamecq et al., Biochemical Journal 230:683-693 (1985)), cualquiera de las dos fenilacetato-CoA ligasas caracterizadas a partir de P. chrysogenum (Lamas-Maceiras et al., Biochern. J. 395: 147-155 (2005); Wang et al., Biochern Biophy Res Commun 360 (2 ): 453-458 (2007)), la fenilacetato-CoA ligasa a partir de Pseudomonas putida (Martinez-Bianco et al., J. Biol . Che . 265:7084-7090 (1990) ) , y la 6-carboxihexanoato-CoA ligasa a partir Bacilis subtilis (Boweret al., J. Bacteriol. 178 (14 ): 4122-4130 (1996)). Las enzimas candidatas adicionales son acetoacetil-CoA sintetasas a partir de Mus musculus (Hasegawa et al., Biochim Biophys Acta 1779:414-419 (2008)) y el Homo sapiens (Ohgami et al., Biochern Pharmacol 65:989-994 (2003)), las cuales catalizan naturalmente el ATP, de conversión dependiente del acetoacetato en acetoacetil-CoA. Estos genes /proteínas se identifican en la siguiente Tabla 5.

Tabla 5.

Acetoacetil-CoA hidrolasa La acetoacetil-CoA también puede convertirse en acetoacetato por una CoA hidrolasa. Los candidatos de enzima acetoacetil-CoA hidrolasa incluyen acil-CoA-hidrolasa, 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, acetil-CoA-hidrolasa, y ácido dicarboxílico tioesterasa. Una acil-CoA hidrolasa de cadena corta en las mitocondrias de hígado de rata se encontró para aceptar acetoacetil-CoA como un sustrato, sin embargo, el gen asociado con esta enzima no se ha identificado a la fecha (Svensson et al. Eur. J. Biochem. , 239:526-531 (1996) ) .

La 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa cataliza de manera eficiente la conversión de 3-hidroxiisobutiril-CoA a 3-hidroxiisobutirato durante la degradación de la valina (Shimomura et al., J.Biol Chem. 269: 14248-14253 (1994) ) . Los genes que codifican esta enzima incluyen hibch de Rattus norvegicus (Shimomura et al., supra; Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240 (2000) ) y Homo sapiens (Shimomura et al., supra) . La enzima H. sapiens también acepta la 3-hidroxibutiril-CoA y 3-hidroxipropionil-CoA como sustratos (Shimomura et al., supra) . Los genes candidatos por homología de secuencia incluyen hibch de Saccharomyces cerevisiae y BC_2292 de Bacillus cereus . Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 6 .

Tabla 6 .

Diversas acetil-CoA hidrolasas eucariotas (EC 3.1.2.1) tienen especificidad de sustrato amplia y por lo tanto representan enzimas candidatas adecuadas. Por ejemplo, la enzima del cerebro de la Rattus norvegicus (Robinson et al., Res. Com un. 71:959-965 (1976)) puede reaccionar con el butiril-CoA, hexanoil-CoA y malonil-CoA. Aunque su secuencia no se ha reportado, la enzima de la mitocondria de la hoja de guisante también tiene una especificidad de sustrato amplia, con actividad demostrada en acetil-CoA, propionil-CoA, butiril-CoA, palmitoil-CoA, oleoil-CoA, succinil-CoA, y crotonil-CoA (Zeiher et al., Plant. Physiol. 94.-20-27 (1990)). La acetil-CoA-hidrolasa, ACHI, a partir de S. cerevisiae representa otro candidato de la hidrolasa (Buu et al., J. Biol. Chem. 278: 17203-17209 (2003)). Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 7.

Tabla 7.

Otra hidrolasa candidata es el ácido dicarboxílico tioesterasa humano, acot8, la cual muestra actividad en glutaril-CoA, adipil-CoA, suberil-CoA, sebacil-CoA, y dodecanedioil-CoA (Westin et al., J Biol. Chem. 280:38125-38132 (2005)) y el homólogo más cercano de E. coli, tesB, el cual también puede hidrolizar un margen amplio de CoA tioésteres (Naggert et al . , J Biol. Chem. 266: 11044-11050 (1991) ) . Una enzima similar también se ha caracterizado en el hígado de rata (Deana et al., Biochem. Int. 26:767-773 (1992) ). Otras E. coli tioéster hidrolasas potenciales incluyen los productos genéticos de tesA (Bonner et al., Chem. 247:3123-3133 (1972)), ybgC (Kuznetsova et al., FEMS Microbiol Rev 29:263-279 (2005); y (Zhuang et al., FEBS Lett . 516:161-163 (2002)), paal (Song et al., J Biol. Chem. 281:11028-11038 (2006)), y ybdB (Leduc et al., J Bacteriol . 189:7112-7126 (2007)). Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 8.

Tabla 8 .

Incluso otra hidrolasa candidata es la glutaconato CoA- transferasa de Acidaminococcus fermentans . Esta enzima se transformó por mutagenesis de sitio dirigido en una acil-CoA hidrolasa con actividad en glutaril-CoA, acetil-CoA y 3-butenoil-CoA (Mack et al., FEBS . Lett. 405:209-212 (1997)). Esto sugiere que las enzimas que codifican succinil-CoA: 3-cetoácido-CoA transferasas y acetoacetil CoA-acetil-CoA: transferasas pueden servir también como candidatas para esta etapa de reacción, aunque podrían requerir ciertas mutaciones para cambiar su función. Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 9.

Tabla 9.

Acetoacetato descarboxilasa La acetoacetato descarboxilasa convierte el acetoacetato en dióxido de carbono y acetona. Enzimas de acetoacetato descarboxilasa ejemplares se codifican por los productos genéticos de adc de C. acetobutylicum (Petersen y Bennett, Appl Environ. Microbiol 56:3491-3498 (1990) ) y adc de Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Kosaka et al., Biosci . Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007) ) . Esta enzima a partir de C beijerinkii puede inferirse de la similaridad de secuencia. Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 10.

Tabla 10.

Isopropanol deshidrogenasa La etapa final en la trayectoria de síntesis de isopropanol involucra la reducción de acetona a isopropanol .

Enzimas alcohol deshidrogenasa ejemplares capaces de esta transformación incluyen adh a partir del C. beijerinckii (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007) ; Jojima et al., Appl Microbiol Biotechnol 77: 1219-1224 (2008) ) y adh a partir de Thermoanaerobacter brockii (Hanai et al., Appl Environ Microbiol 73:7814-7818 (2007) ; Peretz et al, Anaerobe 3:259-270 (1997) ) . Las enzimas caracterizadas adicionales incluyen alcohol deshidrogenasas a partir de Ralstonia eutropha (anteriormente Alcaligenes eutrophus) (Steinbuchel y Schlegel et al., Eur. J. Biochem_. 141 : 555 - 564 ( 1984 ) ) y especies Phytomonas (Uttaro y Opperdoes et al., Mol.Biochem.Parasitol. 85 : 213 - 219 ( 1997 ) ) . Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 11 .

Tabla 11.

Producción de n-propanol utilizando propionil-CoA Las trayectorias descritas en la presente para la producción de n-propanol utilizan la reducción de la propionil-CoA en propionaldehído por una aldehido deshidrogenasa de CoA-dependiente que después se reduce más para formar n-propanol (Figuras 1 - 4 ) . Esta conversión se lleva a cabo por dos enzimas diferentes: una aldehido y alcohol deshidrogenasa o en una etapa por un aldehido/alcohol deshidrogenasa bifuncional. De manera alternativa, el propionil CoA puede convertirse en propionil fosfato y después transformarse en propionaldehído por una acil fosfato reductasa .

Propionaldehído deshidrogenasa y propanol deshidrogenasa La conversión de propionil-CoA a propanol se cataliza ya sea por una enzima bifuncional que tiene la aldehido deshidrogenasa de CoA-dependiente y las actividades de la alcohol deshidrogenasa o por dos enzimas diferentes con las actividades de la aldehido y alcohol deshidrogenasa.

Las dos etapas de oxidorreductasas ejemplares que convierten una acil-CoA a alcohol incluyen aquellas que transforman sustratos tales como acetil-CoA a etanol (por ejemplo, adhE a partir de E. coli) (Kessler, FEBS. Lett. 281:59-63 (1991) ) y butiril-CoA a butanol (por ejemplo adhE2 a partir de C. acetobutilicum) . (Fontaine et al., J. Bacteriol. 184:821-830 (2002) ) . Además para reducir la acetil-CoA a etanol, la enzima codificada por adhE en Leuconostoc mesenteroides se ha mostrado para oxidizar el compuesto de cadena ramificada isobutiraldehído a isobutiril-CoA (Kazahaya, Microbiol .18 : 43-55 (1972) ; y Koo et al, Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005) ) . Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 12.

Tabla 12.

Otra enzima ejemplar puede convertir la malonil-CoA a 3-HP. Una enzima de NADPH-dependiente con esta actividad se ha caracterizado en Chloroflexus aurantiacus donde esta participa en el ciclo de 3-hidroxipropionato (Hugler, . Bacteriol. 184:2404-2410 (2002);. y Strauss, Eur. J. Bioche . 215:633-643 (1993)). Esta enzima, con una masa de 300 kDa, es altamente específica de sustrato y muestra una pequeña similitud de secuencia para otras oxidorreductasas conocidas (Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)). Ningunas enzimas en otros organismos se han mostrado para catalizar esta reacción específica; sin embargo existe evidencia bioinformática que otros organismos pueden tener trayectorias similares (Klatt, Environ. Microbiol. 9:2067-2078 (2007)). Las candidatas de la enzima en otros organismos, que incluyen Roseiflexus castenholzii , Erythrobacter sp. NAPl y marine gamma proteobacterium HTCC2080 pueden inferirse por similitud de secuencias. Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 13.

Tabla 13.

Las moléculas de acil-CoA de cadena más larga pueden reducirse por enzimas tales como la jojoba (Simmondsia chinensis) FAR la cual codifica una acil-CoA reductasa grasa que forma alcohol. Su sobreexpresión en E. coli da como resultado en la actividad FAR y la. acumulación de alcohol graso (Metz, Plant Physiology 122 :635-644 (2000) . Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 14.

Tabla 14.

Diversas acil-CoA deshidrogenasas son capaces de reducir un acil-CoA a su aldehido correspondiente. Genes ejemplares que codifican tales enzimas incluyen el Acinetobacter calcoaceticus acrl que codifica una acil-CoA reductasa grasa, (Reiser, Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (1997) ) la acil-CoA reductasa grasa de Acinetobacter sp. Mi, (Ishige et al., Appl . Environ. Microbiol. 68: 1192-1195 (2002) ) y una succinato semialdehído deshidrogenasa de CoA-dependiente y NADP codificado por el gen sucD en Clostridium kluyveri (Sohling, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996) ) . El SucD de P. gingivalis es otra succinato semialdehído deshidrogenasa (Takahashi, J. Bacteriol 182:4704-4710 (2000) ) . La enzima que acila acetaldehído deshidrogenasa en Pseudomonas sp, codificada por bphG, es incluso otra candidata como se ha demostrado para oxidar y acilar acetaldehído, propionaldehído , butiraldehído , isobutiraldehído y formaldehído (Powlowski, J. Bacteriol. 175:377-385 (1993) ) . Además de la reducción de acetil-CoA a etanol, la enzima codificada por adhE en Leuconostoc esenteroides ha mostrado oxidar el compuesto de cadena ramificada de isobutiraldehído a isobutiril-CoA (Kazahaya, J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972) ; y Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505- 510 (2005) ) . Estos genes/proteínas se identifican en la siguiente Tabla 15.

Tabla 15.

Un tipo de enzima adicional que convierte una acil- CoA a su aldehido correspondiente es malonil-CoA reductasa la cual transforma la malonil-CoA a semialdehído malónico. La malonil-CoA reductasa es una enzima clave en fijación de carbón autotrófica mediante el ciclo de 3 hidroxipropionato en una bacteria arquea termoacidofílica (Berg, Science 318: 1782-1786 (2007) , y Thauer, Science 318 : 1732-1733 (2007) ) . La enzima utiliza NADPH como un cofactor y se ha caracterizado en Metallosphaera y Sulfolobus spp. (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006) ; y Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002) ) . La enzima se codifica por Msed_0709 en Metallosphaera sedula (Alber et al . , J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); y Berg, Science 318:1782-1786 (2007)). Un gen que codifica una malonil-CoA reductasa a partir de Sulfolobus tokodaii se clono y expreso de manera heteróloga en E. coli (Alber et al., J. Bacteriol 188:8551-8559 (2006). Esta enzima también ha mostrado catalizar la conversión de metilmalonil-CoA a su aldehido correspondiente (WO2007141208 (2007)). Aunque la funcionalidad aldehido deshidrogenasa de estas enzimas es similar a la deshidrogenasa bifuncional de Chloroflexus aurantiacus, existe una pequeña similitud de secuencia. Ambas enzimas candidatas de malonil-CoA reductasa tienen similitud de secuencia elevada al aspartato-semialdehido deshidrogenasa, una enzima que cataliza la reducción y desfosforilación concurrente de aspartil-4-fosfato a aspartato-semialdehído . Los candidatos genéticos adicionales pueden encontrarse por homología de secuencia para las proteínas en otros organismos que incluyen Sulfolobus sol fataricus y Sulfolobus acidocaldarius y se han enlistado a continuación. Incluso otro candidato para la CoA que asila aldehido deshidrogenasa es el gen ald a partir de Clostridium beijerinckii (Toth, Appl . Envíron. Microbiol. 65:4973-4980 (1999). Esta enzima se ha reforzado para reducir acetil-CoA y butiril-CoA a sus aldehidos correspondientes. Este gen es muy similar al eutE que codifica la acetaldehído deshidrogenasa de Salmonella typhimurium y E. coli (Toth, Appl. Environ. Microbiol. 65 : 4973 - 4980 ( 1999 ) . Estos genes /proteínas se identifican a continuación en la Tabla 16 .

Tabla 16 .

Los genes ejemplares que codifican las enzimas que catalizan la conversión de un aldehido a alcohol (es decir, alcohol deshidrogenasa o de manera equivalente aldehido reductasa) incluye arlA que codifica un alcohol deshidrogenasa de cadena media para C2-C14, (Tani, Appl. Environ. Microbiol. 66:5231-5235 (2000)) ADH2 a partir de Saccharomyces cerevisiae, (Atsumi, Nature 451:86-89 (2008)) yqhD a partir de E. coli que tiene preferencia a moléculas mayores que C3 , (Sulzenbacher et al, Journal of Molecular Biology 342.: 489-502 (2004)) y bdh I y bdh II a partir de C. acetobutyticum que convierte al butiraldehído en butanol (Walter, Journal of Bacteriology 174: 7149-7158 ( 1992 ) ) . El producto genético de yqhD cataliza la reducción de acetaldehído, malondialdehído, propionaldehído, butiraldehído, y acroleína usando NADPH como el cofactor (Pérez, J. Biol . Chem. 283:7346-7353 (2008)). ADHl a partir de Zymomonas mobilis ha demostrado tener actividad en un número de aldehidos que incluyen formaldehído, acetaldeh do, propionaldehído, butiraldehído, y acroleina (Kinoshita, Appl . Microbiol. Biotechnol. 22:249-254 (1985)). Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 17.

Tabla 17.

Las enzimas que muestran actividad de 3-hidroxibutiraldehído reductasa (EC 1.1.1.61) también cae dentro de esta categoría. Tales enzimas se han caracterizado en Ralstonia eutropha, (Bravo J. Forensic Sci. 49:379-387 (2004)) Clostridium kluyveri (Wolff, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)) y Arabidopsis thaliana (Breitkreuz et al. J. Biol. Chem. 278:41552-41556 (2003)). Incluso otro candidato genético alcohol deshidrogenasa adhl a partir de Geobacillus thermoglucosidasius (Jeon et al. J. Biotechnal 135:127-133 (2008)). Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 18.

Tabla 18.

Otra enzima ejemplar es 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa la cual cataliza la oxidación reversible de 3-hidroxiisobutirato a metilmalonato semialdehído . Esta enzima participa en la degradación de valina, leucina e isoleucina y se ha identificado en bacterias, eucariota, y mamíferos. Esta enzima codificada por P84067 a partir de Ther us thermophilus HB8 se ha caracterizado de manera estructural (Lokanath et al., J". Mol Biol . 352:905-917 (2005) ) . La reversibilidad de la 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa en el cuerpo humano se demostró utilizando un sustrato isotópicamente marcado ( anning, Biochem J 231:481-484 (1985) ) . Los genes adicionales que codifican esta enzima incluyen 3hidh en el Homo sapiens (Hawes et al, Methods Enzymol. 324:218-228 (2000) ) y Oryctolagus cuniculus , (Hawes et al, Methods Enzymol 324:218-228 (2000) ; y Chowdhury, Biosci Biotechnol Biochem 60:2043-2047 (1996) ) (mmsb en Pseudomonas aeruginosa, y dhat en Pseudomonas pu ida (Aberhart, J Chem. Soc . 6:1404-1406 (1979) ; Chowdhury, Biosci. Biotechnol Biochem. 60:2043-2047 (1996) y Chowdhury, Biosci. Biotechnol Biochem. 67:438-441 (2003) ) . Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla Tabla 19.

Propionil-Co A: fosfato propanoiltrans erasa La conversión de propanoil-CoA a propanoil fosfato puede catalizarse por una fosfato transferasa. Entre las fosfato acetiltransferasas (EC 2.3.1.8) , diversas enzimas incluyen aquellos de Bacillus subtilis , (Rado, Biochem Biophys Acta 321:114-125 (1973) ) Clostridium kluyveri, (Stadtman, Methods Enzymol 1:596-599 (1955) ) y Thermotoga marítima (Bock, J. Bacteriol 181:1861-1867 (1999) ) han mostrado tener actividad en propionil-CoA. Por lo tanto, los genes codificados por estas fosfato acetiltransferasas , así como el gen Escherichia coli pta se utilizará para catalizar esta etapa. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 20.

Tabla 20.

Propionil fosfato reductasa La conversión de propanoil fosfato a propionaldehído se cataliza por la propionil fosfato reductasa. Aunque no se ha demostrado la conversión directa aún, transformaciones similares se documentaron incluyendo gliceraldehido- 3-fosfato deshidrogenasa y aspartato-semialdehído deshidrogenasa. Los siguientes genes que codifican gliceraldehído- 3-fosfato deshidrogenasa y aspartato-semialdehído deshidrogenasa se considerarán para catalizar esta etapa. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 21 .

Tabla 21 .

Propionil-Co A hidrolasa La propionil-CoA puede convertirse a propionato por una CoA hidrolasa, sintetasa o transferasa. La hidrólisis de la propionil-CoA a propionato se produce en las trayectorias de degradación de ácidos orgánicos que continúan a través del 2-oxobutanoato intermedio. Esta reacción se cataliza por las enzimas acil-CoA hidrolasa (EC 3 . 1 . 2 . 18 ) . La propionil-CoA es el sustrato preferido de la acil-CoA hidrolasa de cadena corta encontrada en la mitocondria del hígado de rata (Alexson et al., Biochim Biophys . Acta., 1105 (l):13-9 (1989)). Esta enzima se ha caracterizado, aunque la secuencia que codifica el gen aún no se identifica (Garras et al., Biochim. Biophys . Acta., 1255:154-160 (1995)). Otra enzima que muestra la actividad CoA hidrolasa en propionil-CoA se encuentra en la mitocondria de la hoja de guisante. Aunque su secuencia no se ha reportado, esta enzima tiene una especificidad de sustrato amplio, con actividad demostrada en la acetil-CoA, propionil-CoA, butiril-CoA, palmitoil-CoA, oleoil CoA, succinil-CoA, y crotonil-CoA (Zeiher et al., Plant. Physiol. 94:20-27 (1990)). Las candidatas adicionales de propionil-CoA hidrolasa incluyen 3-hidroxiisobutiril-CoA-hidrolasa, acetil-CoA hidrolasa, y ácido dicarboxílico tioesterasa .

La 3 -hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa cataliza de manera eficientemente la conversión de 3-hidroxiisobutiril-CoA a 3-hidroxiisobutirato durante la degradación de valina (Shimomura et al., J. Chem. Biol . 269: 14248-14253 (1994)). Los genes que codifican esta enzima incluyen hibch de Rattus norvegicus (Shimomura et al., supra; Shimomura et al, Methods Enzymol 324:229-240 (2000)) y Homo sapiens (Shimomura et al, supra) . La enzima H. sapiens también acepta 3-hidroxibutiril-CoA y 3-hidroxipropionil-CoA como sustratos (Shimomura et al, supra) . Los genes candidatos por homología de secuencia incluyen hibch de Saccharomyces cerevisiae y BC_2292 de Bacillus cereus . Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 22.

Tabla 22.

Diversas acetil-CoA hidrolasas eucarióticas (EC 3.1.2.1) tienen especificidad de sustrato amplia y representan por lo tanto enzimas candidatas adecuadas. Por ejemplo, la enzima a partir del cerebro de Rattus norvegicus (Robinson et al., Res. Commun. 71:959-965 (1976) ) puede reaccionar con butiril-CoA, hexanoil-CoA y malonil-CoA. La acetil-CoA hidrolasa, ACHI, a partir de S. cerevisiae representa otra hidrolasa candidata (Buu et al., J. Biol. Chem. 278:17203-17209 (2003) ) . Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 23.

Tabla 23.

Otra hidrolasa candidato es ácido dicarboxilico tioesterasa en el cuerpo humano, acotS, la cual muestra actividad en glutaril-CoA, adipil-CoA, suberil-CoA, sebacil-CoA, y dodecandioil-CoA (Westin et al., J Biol . Che . 280:38125-8132 (2005)) y el homólogo más cercano de E. coli, tesB, el cual también hidroliza un margen amplio de tioésteres de CoA Naggert et al . , J Biol. Chem. 266:11044-11050 (1991)). Una enzima similar también se ha caracterizado en el hígado de rata (Deana et al., Bioche . Int. 26:767-773 (1992)). Otras tioésteres hidrolasas potenciales de E. coli incluyen los productos genéticos de tesA (Bonner et al., Chem. 247:3123-3133 (1972)), ybgC (Kuznetsova et al, FEMS Microbiol Rev 29:263-279 (2005); y (Zhuang et al., FEBS Lett. 516:161-163 (2002)), paal (Song et al., J Biol. Chem. 281:11028-11038 (2006)), y ybdB (Leduc et al., J. Bacteriol . 189:7112-7126 (2007)). Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 24.

Tabla 24.

Incluso, otra hidrolasa candidata es la glutaconato CoA-transferasa a partir de Acidaminococcus fermentarte . Esta enzima se transformó por mutagénesis de sitio dirigida a una acil-CoA hidrolasa con actividad en glutaril-CoA, acetil-CoA y 3-butenoil-CoA (Mack et al., FEBS. Lett. 405 : 209 - 212 ( 1997 ) ) . Esto sugiere que las enzimas que codifican succinil-CoA: 3-cetoácido-CoA transferasas y acetoacetil CoA: acetil-CoA transíerasas también pueden servir como candidatas para esta etapa de reacción, aunque podrían requerir ciertas mutaciones para cambiar su función. Estos genes /proteínas se identifican a continuación en la Tabla 25 .

Tabla 25.

Propionil-CoA sintetasa Una CoA sintetasa también pueden catalizar la eliminación de una porción de CoA a partir de propionil-CoA. Una enzima candidata, acetil-CoA sintetasa que forma ADP (ACD, EC 6.2.1.13), acopla la conversión de ésteres de acil-CoA a sus ácidos correspondientes con la síntesis concurrente del ATP. Diversas enzimas con amplias especificidades de sustrato se han descrito en la literatura. El ACD I a partir de Archaeoglobus fulgidus , codificado por AF1211, se mostró operar en una variedad de sustratos de cadena lineal y ramificada que incluyen acetil-CoA, propionil-CoA, butiril-CoA, acetato, propionato, butirato, isobutiriato , isovalerato, succinato, fumarato, fenilacetato, indolacetato (Musfeldt et al., J. Bacteriol 184:636-644 ( 2002 ) ) . La enzima a partir de Haloarcula marismortui (anotada como una succinil-CoA sintetasa) acepta propionato, butirato, y ácidos de cadena ramificada (isovalerato e isobutirato) como sustratos, y se mostró operar en las direcciones hacia adelante y hacia atrás (Brasen et al., Arch. Mícrobiol 182:277-287 (2004)). La ACD codificada por PAE3250 de la crenarqueota hipertermofílica Pyrobaculum aerophilum mostró el margen de sustrato más amplio de todas las ACD caracterizadas, reaccionando con acetil-CoA, isobutiril-CoA (sustrato preferido) y fenilacetil-CoA (Brasen et al., supra) . Las enzimas a partir de A. fulgidus, H. marismortui y P. aerophilum todas se han clonado, expresado de manera funcional, y caracterizado en E. coli (Musfeldt et al, supra; Brasen et al, supra). Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 26.

Tabla 26.

Otra candidata de CoA sintetasa es succinil-CoA sintetasa. Los genes de sucCD de E. coli forman una succinil-CoA sintetasa compleja la cual cataliza de manera natural la formación de succinil-CoA a partir del succinato con el consumo concaminante de un ATP, una reacción que es reversible in vivo (Buck et al., Biochem 24:6245-6252 (1985)). Estos genes /proteínas se identifican a continuación en la Tabla 27.

Tabla 27.

Las CoA-ligasas ejemplares adicionales incluyen dicarboxilato-CoA ligasa de rata para la cual la secuencia aún no se caracteriza (Vamecq et al., Biochemical Journal 230:683-693 (1985)), cualquiera de las dos fenilacetato-CoA ligasas caracterizadas a partir de P. chrysogenum (Lamas-Maceiras et al., Biochem J. 395:147-155 (2005); Wang et al, Biochem Biophy Res Com un 360 (2 ): 453-458 (2007)), la fenilacetato-CoA ligasa a partir de Pseudomonas putida (Martínez-Bianco et al., J. Biol . Chem. 265:7084-7090 (1990)), y la 6-carboxihexanoato-CoA ligasa a partir de Bacilis subtilis (Boweret al., J. Bacteriol . 178 (14): 4122-4130 (1996) ) . Las enzimas candidatas adicionales son las acetoacetil-CoA sintetasas a partir de Mus musculus (Hasegawa et al, Biochem Biophys Acta 1779 : 414 - 419 ( 2008 ) ) y Homo sapiens (Ohgami et al, Biochem Pharmacol 65 : 989 - 994 ( 2003 ) ) la cual cataliza de manera natural la conversión dependiente de ATP de acetoacetato en acetoacetil-CoA. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 28 .

Tabla 28.

Propionil-CoA transferasa La propionil-CoA transferasa cataliza la conversión de propionil-CoA a propionato mientras transfiere la porción de CoA a una molécula aceptora de CoA. Muchas transferasas tienen amplia especificidad y pueden por lo tanto utilizar aceptores de CoA tan diversos como acetato, succinato, propionato, butirato, 2-metilacetoacetato, 3-cetohexanoato, 3-cetopentanoato, valerato, crotonato, 3-mercaptopropionato, propionato, vinilacetato, butirato, entre otros.

Diversos genes han identificado que tienen actividad de propionil-CoA transferasa. La enzima a partir de Roseburia sp . A2-183 mostró tener butiril-CoA: acetato : CoA transferasa y actividad propionil-CoA: acetato : CoA transferasa (Charrier et al, Microbiology 152, 179-185 (2006)). Homólogos cercanos pueden encontrarse en, por ejemplo, Roseburia intestinalis Ll-82, Roseburia inulinivorans DSM 16841, Eubacterium rectale ATCC 33656. Otra enzima con actividad propionil-CoA transferasa pueden encontrarse en Clostridium propionicum (Selmer et al., Eur J Biochem 269, 372-380 (2002)). Esta enzima puede utilizar acetato, (R)-lactato, (S)-lactato, acrilato, y butirato como aceptora de CoA (Selmer et al, Eur J Biochem 269, 372-380 (2002); Schweiger y Buckel, FEBS Letters, 171(1) 79-84 (1984)). Homólogos cercanos pueden encontrarse en, por ejemplo, Clostridium novyi NT, Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, y Clostridium botulinum C str. Eklund. YgfH codifica una propionil CoA: succinato CoA transferasa en E. coli (Haller et al, Biochemistry, 39(16) 4622-4629). Homólogos cercanos pueden encontrarse en, por ejemplo, ATCC 29220 Citro£>acter youngae, Salmonella entérica subsp. arizonae serovar, y Yersinia intermedia ATCC 29909. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 29.

Tabla 29.

Una enzima candidata adicional es la enzima de dos unidades codificadas por peal y pcaJ en Pseudo onas , la cual ha mostrado tener actividad de 3-oxoadipil-CoA/succinato transferasa (Kaschabek et al., supra) . Enzimas similares basadas en homología existen en Acinetobacter sp . ADPl (Kowalchuk et al., Gene 146:23-30 (1994) ) y Streptomyces coelicolor. La succinil-CoA: 3 : oxoácido-CoA transferasas ejemplares se encuentran presentes en Helicobacter pylori (Corthesy-Theulaz et al, J. Biol. Chem. 272:25659-25667 (1997) ) y Bacillus subtilis (Stols et al, . Protein . Expr . Purif . 53:396-403 (2007)) . Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 30.

Tabla 30 Una CoA transferasa que puede utilizar acetato como la aceptora de CoA es acetoacetil-CoA transferasa, codificada por los genes E. coli atoA (subunidad alfa) y atoD (subunidad beta) (Vanderwinkel et al, Biochem. Biophys .Res Comun. 33:902-908 (1968) ; Korolev et al, Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr 58:2116-2121 (2002) ) . Esta enzima ha mostrado transferir la porción de CoA a acetato a partir de una variedad de acil-CoA sustratos ramificados y lineales, que incluyen isobutirato (Matthies et al, Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992) ) , valerato (Vanderwinkel et al., supra) y butanoato (Vanderwinkel et al., supra). Enzimas similares existen en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Duncan et al, Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002) ) , Clostridium acetobutylicum (Cary et al, Appl Environ Microbiol 56: 1576-1583 (1990) ) , y Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Kosaka et al., Biosci . Biotechnol Biochem. 71:58-68 (2007)). Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 31.

Tabla 31 Las enzimas anteriores también pueden mostrar las actividades deseadas en propionil-CoA. Las candidatas de transferasa ejemplares adicionales se catalizan por los productos genéticos de catl , cat2, y cat3 de Clostridium kluyveri los cuales han mostrado actividad succinil-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA, y butiril-CoA transferasa, respectivamente (Seedorf et al., supra; Sohling et al., Eur.J Biochem 212:121-127 (1993); Sohling et al, J Bacteriol. 178:871-880 (1996)). Actividades similares de CoA transferasa también se encuentran presentes en Trichomonas vaginalis (van Grinsven et al., J. Biol . Chem. 283:1411-1418 (2008)) y Trypanosoma brucei (Riviere et al., J" . Biol. Chem. 279:45337- 45346 (2004)) . Estos genes /proteínas se identifican a continuación en la Tabla 32.

Tabla 32.

La enzima glutaconato-CoA- ransferada (EC 2.8.3.12) de la bacteria anaeróbica Acidaminococcus fermentans reacciona con diácido glutaconil-CoA y 3 -butenoil-CoA (Mack et al., FEBS Lett. 405:209-212 (1997) ) . Los genes que codifican esta enzima son gctA y gctB. Esta enzima tiene una actividad reducida aunque detectable con otros CoA derivados que incluyen glutaril-CoA, 2-hidroxiglutaril-CoA, adipil-CoA y acrilil-CoA (Buckel et al, Eur.J.Biochem 118:315-321 (1981) ) . La enzima se ha clonado y expresado en E. coli (Mack et al., Eur.J.Biochem. 226:41-51 (1994) ) . Estos genes /proteínas se identifican a continuación en la Tabla 33.

Tabla 33.

Propionato cinasa El propionato se activa con propionil-fosfato por una enzima con actividad propionato cinasa. La butirato cinasa (EC 2.7.2.7) lleva a cabo la conversión reversible de butiril-fosfato a butirato durante la acidogénesis en C. acetobutylicum (Cary et al, Appl Environ. Microbiol 56:1576-1583 (1990)). Esta enzima se codifica por cualquiera de los dos productos genéticos buk (Huang et al., J. Mol. Microbiol Biotechnol 2,33-38 (2000)). Esta enzima se mostró al aceptar propionato, isobutanoato y valerato como sustratos alternativos (Hartmanis, J. Biol . Chem. , 262 (2):617-21 (1987)). Otras enzimas butirato cinasas se encuentran en C. jutyricujrj y C. tetanomorphum (Twarog et al, J" Bacteriol 86:112-117 (1963)). Estas enzimas también aceptan propionato, isobutanoato y valerato como sustratos secundarios. Enzimas relacionadas con isobutirato cinasa a partir de Thermotoga marítima también se ha expresado en E. coli y cristalizado (Diao et al, E. Biol. Crystallogr. 59:1100-1102 (2003); y Diao et al, J Bacteriol 191:2521-2529 (2009)). La aspartocinasa cataliza la fosforilación dependiente de ATP de aspartato y participa en la síntesis de varios aminoácidos. La enzima aspartocinasa III en E. coli, codificada por lysC, tiene un amplio margen de sustrato y los residuos catalíticos que involucrados en la especificidad de sustrato se han elucidado (Keng et al., Arch. Biochem. Biophys. 335:73-81 (1996)). Dos cinasas adicionales en E. coli también son buenas candidatas : acetato cinasa y la gamma-glutamil cinasa. La acetato cinasa de E. coli, codificada por ackA (Skarstedt et al, J. Biol. Chem. 251:6775-6783 (1976)), fosforiliza propionato además de acetato (Hesslinger et al, Mol Microbiol 27:477-492 (1998)). La gamma-glutamil-cinasa de E. coli, codificada por proB (Smith et al., J. Bacteriol . 157:545-551 (1984)), fos fori l i za el grupo gamma ácido carbónico de glutamato. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 34.

Tabla 34.

Propionato reductasa La reducción de propionato a semialdehído propiónico se cataliza por un ácido carboxílico reductasa. Las enzimas candidatas ejemplares para la enzima succinato reductasa y 4-hidroxibutirato reductasa, se describe a continuación, también pueden aplicarse en la presente.

EJEMPLO II Trayectoria para la Producción de la Acetil-CoA a partir de la glucosa Además del Ejemplo I, la trayectoria para la producción de acetil-CoA a partir de glucosa procede mediante fosfoenolpiruvato (PEP) (Figuras 1-4) . La glucosa se convierte en PEP por la trayectoria de glicolisis nativa del organismo microbiano. La PEP se convierte en piruvato por piruvato cinasa y después a acetil-CoA por piruvato deshidrogenasa o piruvato ferredoxin oxidoreductasa . Alternativamente, el piruvato se convierte a acetil-CoA y formiato por piruvato-formiato liasa. El formiato después se convierte a dióxido de carbono por una formiato deshidrogenasa que también produce NADH. La acetil-CoA producida por estas trayectorias después se utiliza para la producción de isopropanol como se describe en el Ejemplo I o utilizados para la producción de n-propanol e isopropanol como se describe en el Ejemplo V a continuación (Figura 3).

Piruvato Deshidrogenasa La piruvato deshidrogenasa compleja, que cataliza la conversión de piruvato a acetil-CoA, se ha estudiado de manera extensiva. La S. cerevisiae compleja consiste de un núcleo E2 (LATI) que une El (PDAl, PDBl) , E3 (LPD1) , y compuestos de proteína X ( PDX1 ) (Pronk, Yeast 12:1607-1633 (1996)). En la enzima de E. coli, los residuos específicos en el componente El son responsables de la especificidad del sustrato (Bisswanger, J. Biol Chem. 256-815-822 (1981); Bremer, Eur. J Biochem. 8:535-540 (1969) y Gong et al., J. Biol Chem. 275-13645-13653 (2000)). Los esfuerzos de ingeniería han mejorado la actividad de enzima PDH de E. coli bajo condiciones anaeróbicas (Kim, j. Bacteriol 190; 3851-3858 (2008); Kim, Appl . Environ. Microbiol . 73-1766-1771 (2007) y Zhou, Biotechnol . Lett . 30:335-342 (2008)). En contraste a la PDH de E. coli, la B. subtilis compleja se activa y requiere para el crecimiento bajo condiciones anaeróbicas (Nakano, J. Bacteriol 179:6749-6755 (1997)). La PDH de Klebsiella pneumoniae, caracterizado durante el crecimiento en glicerol, también se activa bajo condiciones anaeróbicas (Menzel, J. Biotechnol, 56:135-142 (1997)). Estructuras de cristal del complejo de enzima de riñon de bovino (Zhou, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 98:14802-14807 (2001)) y el dominio catalítico E2 de Azotobacter vinelandii están disponibles (Mattevi et al, Science 255:1544-1550 (1992)). Algunos complejos de enzimas PDH de mamífero pueden reaccionar en sustancias alternas tales como 2-oxobutanoato (Paxton, J. Bacteriol. 179:5684-5692 (1997)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 35.

Tabla 35.

Piruvato Ferrodoxin Oxidorreductasa El piruvato ferrodoxin oxidorreductasa (PFOR) cataliza la oxidación del piruvato para formar acetil-CoA. La PFOR de Desulfovibrio africanus se ha clonado y expresado en E. coli resultando en una enzima recombinante activa que fue estable durante varios días en presencia de oxigeno (Pieulle, J Bacteriol 179:5684-5692 (1997)). La estabilidad de oxígeno es relativamente no común en PFORs y se cree que se confiere por una extensión de 60 residuos en la cadena de polipéptido de la enzima D. africanus . La PFOR M. thermoacetica también es bien caracterizada (Menon, Biochemistry 36:8484-8494 (1997)) y aún se muestra que tiene alta actividad en la dirección de la síntesis de piruvato durante el crecimiento autotrófico (Furdui, J. Biol. Chem. 275:28494-28499 (2000)). Además, E. coli posee una estructura de lectura abierta no caracterizada, ydbK, que codifica una proteína que es 51% idéntica a la PFOR M. thermoacetica . La evidencia para la actividad piruvato oxidorreductasa en E. coli se ha descrito (Blaschkowski, Eur. J Biochem. 123:563-569 (1982)). Las diversas enzimas PFOR adicionales se describen en la siguiente revisión (Ragsdale, Chem. Rev. 103:2333-2346 (2003)). Finalmente, flavodoxin reductasas (por ejemplo, fqrB de Helicobacter pylori o Campylobacter jejuni) (St Maurice et al., J. Bacteriol. 189:4764-4773 (2007)) o proteínas tipo Rnf (Seedorf et al., Proc. Nati. Acad Sci U.S. A. 105:2128-2133 (2008), y Herrmann, J. Bacteriol 190:784-791 (2008)) proporciona un medio para generar NADH o NADPH a partir de la ferredoxina reducida generada por PFOR. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 36.

Tabla 36.

Piruvato Formiato Liasa La piruvato formiato liasa es una enzima que cataliza la conversión de piruvato y CoA en acetil-CoA y formiato. La piruvato formiato liasa es una enzima común en organismos procarióticos que se utilizan para ayudar a modular el balance de redox anaeróbico. Las enzimas ejemplares pueden encontrarse en Escherichia coli (Knappe, FEMS. Microbiol Rev. 6:383-398 (1990) ) , Lactococcus lactis (Melchiorsen, Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344(2002) ) , y Streptococcus mutans . (Takahashi-Abbe, Oral. Microbiol Iwmunol. 18:293-297 (2003) ) . Una piruvato formiato liasa mitocondrial también se ha identificado en eucariota, Chlamydomonas reinhardcii. (Hemschemeier , Eukaryoc Cell 7:518-526 (2008) ; y Atteia, J. Biol . Chem. 281:9909-9918 (2008)) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 37.

Tabla 37.

Formiato hidrógeno Liasa Una enzima formiato hidrógeno liasa puede emplearse para convertir el formiato a dióxido de carbono e hidrógeno. Una enzima formiato hidrógeno liasa ejemplar puede encontrarse en Escherichia coli. La formiato hidrógeno liasa E. coli consiste de hidrogenasa 3 y formiato deshidrogenasa-H (Maeda, Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890 (2007) ) . Se activa por el producto genético de fhlA (Maeda, Appl Microbiol Biotechnol 77 :879-890 (2007) ) . La adición de los elementos traza, selenio, níquel y molibdeno, en un caldo de fermentación se ha mostrado para mejorar la actividad formiato hidrógeno liasa (Soini, Microb. Cell Fact. 07:26 (2008) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 38.

Tabla 38 .

Una enzima formiato hidrógeno liasa también existe en la arquea hipertermofílica, Thermococcus litoralis (Takacs et al., BMC. Microbiol 8 : 88 ( 2008 ) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 39 .

Tabla 39 Los sistemas de formiato hidrógeno liasa adicionales se han encontrado en Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Rhodospirillum rubrum, Methanobacterium formicicum (Vardar-Schara, Microbial Biotechnology 1 : 107-125 (2008)) Formiato deshidrogenasa La actividad de formiato deshidrogenasa está presente tanto en E. coli y Saccharo yces cerevisiae entre otros organismos. S. cerevisiae que contiene dos formiatos deshidrogenasas, FDH1 y FDH2, que catalizan la oxidación de formiato a C02. (Overkamp et al., Yeast 19:509-520 (2002)). En Moorella thermoacetica , los loci, Moth_2312 y Moth_2313, está actualmente un gen que es responsable de codificar la subunidad alfa de formiato deshidrogenasa mientras la beta subunidad se codifica por Moth_2314 (Pierce et al, Environ. Microbiol (2008); Andreesen, J. Bacteriol 116:867-873 (1973); Li, J. Bacteriol 92:405-412 (1966) y Yamamoto, J. Biol . Chem. 258: 1826-1832 (1983)). Otro conjunto de genes que codifican la actividad formiato deshidrogenasa se codifica por Sfum_2703 a través de Sfum_2706 en Syntrophobacter fumaroxidans (Reda, Proc Nati Acad Sci U.S. A. 105:10654-10658 (2008); y de Bok et al., Sur. J. Biochem 270:2476-2485 (2003)). Similar a sus contrapartes M. thermoacetica, Sfum_2705 y Sfum_2706 actualmente son un gen. E. coli que contiene formiato deshidrogenasas múltiples. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 40.

Tabla 40 .

EJEMPLO III Las Trayectorias para la Producción de Propionil-CoA de la Glucosa que Utiliza el Ciclo TCA Reductxvo Además de los Ejemplos I y II, la trayectoria para la producción de propionil-CoA procede mediante oxaloacetato (Figura 1 ) . PEP se convierte en oxaloacetato ya sea mediante PEP carboxicinasa o PEP carboxilasa. Alternativamente, PEP se convierte primero en piruvato por piruvato cinasa y luego a oxaloacetato por metilmalonil-CoA carboxitransferasa o piruvato carboxilasa. El oxaloacetato se convierte a propionil-CoA por medio del ciclo TCA reductivo, una metilmutasa, una descarboxilasa, una epimerasa y una descarboxilasa .

PEP Carboxicinasa Aunque la conversión neta de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato es redox-neutral , el mecanismo de la conversión es importante en los energéticos totales de la trayectoria de co-producción. La enzima más deseable para la conversión de PEP a oxaloacetato es PEP carboxicinasa que simultáneamente forma un ATP mientras carboxila PEP. En más organismos, sin embargo, PEP carboxicinasa sirve como una función gluconeogénica y convierte oxaloacetato a PEP en el gasto de una ATP. S. cerevísiae es un organismo cuya carboxicinasa PEP nativa, PCKl , sirve como un rol gluconeogénico (Valdes-Hevia , FEBS Lett. 258:313-316. (1989)). E. coli es otro organismo, como el rol de PEP carboxicinasa en la producción de oxaloacetato se cree ser menor cuando se compara a PEP carboxilasa, que no forma ATP, posiblemente debido a la Km más elevada para bicarbonato de PEP carboxicinasa (Kim, Appl Environ Microbiol 70:1238-1241 (2004)). Sin embargo, la actividad de la PEP carboxicinasa nativa de E. coli de PEP hacia oxaloacetato se ha demostrado recientemente en ppc mutantes de E. coli K-12 (Kwon, Journal of Microbiology and Biotechnology 16: 1448-1452 (2006)). Estas cepas no mostraron defectos de crecimiento y tuvieron producción de succinato incrementado en concentraciones NaHCCh elevada. En algunos organismos, la bacteria particularmente de la panza, PEP carboxicinasa es bastante eficiente en la producción de oxaloacetato de PEP y generar ATP . Ejemplos de genes PEP carboxicinasa que se han clonado en E. coli incluyen aquellos de Mannheimia succiniciproducens (Lee, Biotechnol . Bioprocesos Eng. 7:95-99 (2002) ) , Anaerobiospirillum succiniciproducens (Laivenieks, Appl Environ. Microbiol 63:2273-2280 (1997) ) , y Actinobacillus succinogenes (Kim, Appl Environ Microbiol 70: 1238-1241 (2004) ) . Los experimentos internos también se han encontrado que la enzima PEP carboxicinasa codificada por Haemophilus influenza es altamente eficiente en la formación de oxaloacetato de la PEP. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 41.

Tabla 41.

Estas secuencias y secuencias para las enzimas subsecuentes listadas en este reporte pueden utilizarse para identificar proteínas homologas en GenBank u otras bases de datos a través de las búsquedas de similitud de secuencia (por ejemplo, BLASTp) . Las proteínas homologas resultantes y sus secuencias de gen correspondientes proporcionan secuencias de DNA adicionales para la transformación en el organismo huésped de selección.

PEP Carboxilasa PEP carboxilasa representa una enzima alternativa para la formación de oxaloacetato de PEP. Ya que la enzima no genera ATP en descarboxilación de oxaloacetato, su utilización disminuye el rendimiento ATP máximo de la trayectoria de producción y representa una alternativa menos favorable para convertir oxaloacetato a PEP. Sin embargo, los alcoholes C3 teóricos máximos de 1.33 mol/mol permanecerán sin cambios si la PEP carboxilasa se utiliza para convertir PEP a oxaloacetato. S. cerevisiae, no codifica naturalmente una PEP carboxilasa, aunque organismos ejemplares que poseen genes que codifican PEP carboxilasa incluyen E. coli (Kai, Arch Biochem. Biophys 414:170-179 (2003) ) , Methylobacterium extorquens AM1 (Arps, J. Bacteriol . 175:3776-3783 (1993) ) , y Corynebacterium glutamicum (Eikmanns, Mol. Gen. Genet . 218:330-339 (1989)) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 42.

Tabla 42.

Piruvato Cinasa y Metilmalonil-CoA Carboxiltransferasa Una ruta energéticamente eficiente adicional a oxaloacetato de PEP requiere dos actividades enzimáticas : piruvato cinasa y metilmalonil-CoA carboxitransferasa . Piruvato cinasa cataliza la conversión de generación ATP de PEP a piruvato y se codifica por la PYKl (Burke, J. Biol . Chem. 258:2193-2201 (1983)) y PYK2 (Boles et al., J. Bacteriol 179:2987-2993 (1997)) genes en S. cerevisiae. En E. coli, esta actividad se cataliza por el producto genético de pykF y pykA. Metilmalonil-CoA carboxitransferasa cataliza la conversión de piruvato a oxaloacetato. Considerablemente, esta reacción también simultáneamente cataliza la conversión de (S) -metilmalonil-CoA a propionil-CoA (véase figuras 1 y 2) . Una metilmalonil-CoA carboxitransferasa ejemplar que se comprende de subunidades 1.3S, 5S, 12S pueden encontrarse en Propionibacterium freudenreichii (Thornton et al., J. Bacteriol 175:5301-5308 (1993)). Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 43.

Tabla 43 Piruvato Cinasa y Piruvato Carboxilasa Una combinación de enzimas puede convertir PEP a oxaloacetato con una estequiometría idéntica a aquella de PEP carboxilasa. Estas enzimas se codifican por piruvato cinasa, PYKl (Burke, J. Biol . Chem. 258:2193-2201 (1983) ) o PYK2 (Boles et al., J. Bacteriol, 179:2987-2993 (1997) ) y piruvato carboxilasa, PYCl (Walker, Biochem Biophys . Res. Comun 176:1210-1217 (1991) ) o PYC2 (Walker, Biochem. Biophys. Res. Conmun 176:1210-1217 (1991) ) . Los genes /proteínas más recientes se identifican en lo siguiente en la Tabla 44.

Tabla 44.

Malato Deshidrogenasa, Fumarasa, Fumarato Reductasa Oxaloacetato puede convertirse a succinato por malato deshidrogenasa, fumarasa y fumarato reductasa cuando el ciclo TCA se opera en el ciclo reductivo S. cerevisiae que posee tres copias de malato deshidrogenasa, MDH1 (McAlister- Henn, J. Bacteriol 169:5157-5166 (1987) ) MDH2 (Minard, Mol.

Cell. Biol. 11:370-380 (1991) ; y Gibson, J. Biol. Chem. 278:25628-25636 (2003) ) , y MDH3 (Steffan, J. Biol. Chem. 267:24708-24715 (1992) ) , que localiza el mitocondrión, citosol y peroxisomas, respectivamente. S. cerevisiae contiene una copia de un gen que codifica fumarasa, FUM1, cuyo producto se localiza tanto en citosol y mitrocondrion (Sass, J. Biol. Chem. 278:45109-45116 (2003)). Fumarato reductasa se codifica por dos enzimas solubles, FRDS1 (Enomoto, DNA Res. 3:263-267 ( 1996 ) ) y FRDS2 (Muratsubaki , Arch Biochem Biophys 352:175-181 (1998)), que se localiza en citosol y promitocondrion, respectivamente, y se requiere para el crecimiento anaeróbico de la glucosa (Arikawa, Microbiol Lett 165:111-116 (1998)). E. coli se conoce que tiene un malato deshidrogenasa activo. Esto tiene tres fumarasas codificadas por fumA, B y C, cada una de las cuales es activa bajo diferentes condiciones de la capacidad de oxígeno. El fumarato reductasa en E. coli se compone de cuatro subunidades . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 45.

Tabla 45.

Succinil-CoA Transferasa Succinil-CoA transferasa cataliza la conversión de succinil-CoA a succinato mientras transfiere la porción CoA a una molécula aceptora CoA. Muchas transferasas tienen especificidad amplia y estas pueden utilizar aceptores CoA tan diversos como acetato, succinato, propionado, butirato, 2-metilacetoacetato, 3-cetohexanoato , 3-cetopentanoato, valerato, crotonato, 3-mercaptopropionato, propionato, vinilacetato, butirato, entre otros.

La conversión de succinato a succinil-CoA es idealmente llevada por una transferasa que no requiere que el consumo directo de un ATP o GTP. Este tipo de reacción es común en un número de organismos. Quizás la enzima candidata superior para esta etapa de reacción es succinil-CoA: 3-cetoácido-CoA transferasa. Esta enzima convierte el succinato a succinil-CoA, mientras convierte una 3-cetoacil-CoA a un 3-cetoácido. Las transferasas succinil-CoA: 3 : cetoácido-CoA ejemplares están presentes en Helicobacter pylori (Corthesy-Theulaz et al, J. Biol . Chem. 272 : 25659-25667 (1997)), Bacillus subtilis (Stols et al, Protein. Expr. Purif. 53:396-403 (2007)), y Homo sapiens (Fukao et al, Genómics, 68:144-151 (2000); y Tanaka, Mol. Hum. Reprod. 8:16-23 (2002)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 46.

Tabla 46.

La conversión de succinato a succinil-CoA también puede catalizarse mediante succinil-CoA : acetil-CoA transferasa. El producto genético catl de Clostridium kluyveri se ha mostrado para exhibir actividad succinil-Coa : acetil-CoA transferasa (Sohling, J Bacteriol 178:871-880 (1996) ) . Además, la actividad está presente en Trichomonas vaginalis (van Grinsven et al., J. Biol . Chem. 283:1411-1418 (2008) ) y Trypanosoma brucei (Riviere et al., J. Biol. Chem. 279:45337-45346 (2004) ) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 47.

Tabla 47.

Aún otro posible aceptor CoA es bencilsuccinato . Las funciones Succinil-CoA: (R) Bencilsuccinato CoA-transferasa como parte de una trayectoria de degradación anaerobia para tolueno en organismos tales como Thauera aromática (Leutwein and Heider, J. Bact 183 (14) 4288-4295 (2001) ) . Los homólogos pueden encontrarse en Azoarcus sp. T, Aromatoleum aromaticum EbNl y Geobacter metallireducens GS-15. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 48.

Tabla 48.

Finalmente, ygf codifica una propionil CoA: succinato CoA transferasa en E. coli (Haller et al., Biochemistry, 39(16) 4622-4629. ) . Los homólogos cercanos pueden encontrarse en, por ejemplo, Citrobacter youngae ATCC 29220, Salmonella entérica subsp. arizonae serovar, y Yersinia intermedia ATCC 29909. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 49.

Tabla 49.

Succinil-CoA Sintetasa El producto de los genes LSCl y LSC2 de S. cerevisiae y los genes sucC y sucD de E. coli, naturalmente del complejo succinil-CoA sintetasa que cataliza la formación de succinil-CoA a partir de succinato con el consumo concomitante de un ATP, una reacción que es reversible in vivo (Przybyla-Zawilask et al, Eur. J. Biochem 258 (2 ) : 736-743 (1998) y Buck et al., J. Gen. Microbiol 132 ( 6 ) : 1753-1762 (1986) ) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 50.

Tabla 50.

Metilmalonil-CoA mutasa Succinil-CoA puede convertirse en (R) -metilmalonil CoA por metilmalonil-CoA mutasa (MCM) . En E. coli, la mutasa dependiente de adenosilcobalamina reversible participa en trayectorias de tres etapas que conducen a la conversión de succinato a propionato (Haller, Biochemis ry 39:4622-9 (2000) ) . MCM está codificado por los genes scpA en Escherichia coli (Haller Biochemistry 39:4622-4.629 (2000) , and Bobik, Anal Bioanal Chem 375:344-349 (2003) ) y mutA en Homo sapiens (Padovani, Biochemistry 45:9300-9306 (2006) ) . En diversos otros organismos MCM contiene alfa y beta subunidades y se codifica por dos genes. Los candidatos de gen ejemplar codifican proteínas de dos subunidades que son Propionibacterium fredenreichii sp. shermani mutA y mutB (Korotkova, J Biol Chem. 279:13652-13658 (2004) ) y Methylobacterium extorquens mcmAy y mcmB (Korotkova, j Biol Chem 279:13652-13658 (2004) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 51.

Tabla 51.

Candidatos de enzima adicional identificados basados en homología elevada en el producto genético spcA E. coli se identifica en lo siguiente en la Tabla 52.

Tabla 52.

Hay además evidencia existente de que los genes adyacentes a los genes catalíticos metilmalonil-CoA mutasa también se requieren para actividad máxima. Por ejemplo, se ha demostrado que el gen M. extorquens meaB forma un complejo con metilmalonil-CoA mutasa, se estimulan en actividad mutasa in vitro, y se protegen posiblemente de inactivación irreversible (Korotkova, J Biol Chem 279 : 13652-13658 (2004)). El producto genético M. extorguens meaB es altamente similar al producto del gen de E. coli argK (BLAST : 45% de identidad, valor e: 4e-67) que es adyacente a scpA en el cromosoma. Ninguna secuencia para un homólogo de meaB en P. freudenreichii se cataloga en GenBank. Sin embargo, el producto de gen KPA171202 Propionibacterium acnés, YP_055310.1, es 51% idéntica a la proteína M. extorguens meaB y su gen también es adyacente al gen metilmalonil-CoA mutasa en el cromosoma. Estos genes /proteínas se identifican a continuación en la Tabla 53.

Tabla 53.

Metilmalonil-CoA epimerasa La metilmalonil-CoA epimerasa (MMCE) es la enzima que interconvierte (R) -metilmalonil-CoA y (S) -metilmalonil-CoA. MMCE es una enzima esencial en la disolución de ácidos grasos numerados de manera impar y de los aminoácidos valina, isoleucina, y metionina. La metilmalonil-CoA epimerasa se encuentra presente en organismos tales como Bacillus subtilis (YqjC) (Haller, Bioche istry. 39:4622-4629 (2000)), Homo sapiens (YqjC) (Fuller, Biochem. J 213:643-650 (1983)), Rattus norvegicus (Mcee) (Bobik, j Biol Chem. 276 : 37194-3719'8 (2001)), Propionibacterium shermanii (AF454511) (Haller, Biochemistry 39:4622-9 (2000); McCarthy, Structure 9:637-46 (2001) y (Fuller, Biochem. J 7213:643-650 (1983)) y Caenorhabditis elegans ( mce) (Kuhnl et al., FEBS J 7272: 1465-1477 (2005)). El candidato de gen adicional, AE016877 de Bacillus cereus, tiene homología de secuencia alta en las otras enzimas caracterizadas. La actividad de MMCE se requiere si la metilmalonil-CoA descarboxilasa empleada o metilmalonil-CoA carboxitransferasa requiere el (S) estereoisómero de metilmalonil-CoA. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 54.

Tabla 54.

Metilmalonil-CoA descarboxilasa La metilmalonil-CoA descarboxilasa, es una enzima independiente de bioestaño que cataliza la conversión de metilmalonil-CoA a propionil-CoA en E. coli (Benning, Biochemistry. 39:4630-4639 (2000) ; y Haller, Biochemistry. 39:4622-4629 (2000) ) . La especificidad estéreo de la enzima de E. coli no se reportó, pero en la enzima en Propionigenium modestum (Bott et al., Eur. J. Biochem. 250:590-599 (1997) ) y Veillonella párvula (Huder, 7. Biol. Che . 268:24564-24571 (1993) ) cataliza la descarboxilación del ( S ) -estereoisómero de metilmalonil-CoA (Hoffmann, FEBS. Lett. 220: 121-125 (1987) Las enzimas de P. modestum y V. párvula se componen de subunidades múltiples que no solamente descarboxilar (S)-metilmalonil-CoA, sino también crear una bomba que transporta iones de sodio a través de la membrana celular como un medio de generar energía. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 55.

Tabla 55 .

Ejemplo IV Trayectorias para la Producción de la Propionil-CoA a partir de Glucosa mediante Treonina Además de los ejemplos I y II, la trayectoria para producción de propionil-CoA mediante treonina se ejemplifica en la Figura 2. PEP se convierte en oxaloacetato ya sea mediante PEP carboxiquinasa o PEP carboxilasa como se describe en el Ejemplo III. Alternativamente, PEP se convierte primero a piruvato mediante piruvato cinasa y luego a oxaloacetato mediante metilmalonil-CoA carboxitransferasa o piruvato carboxilasa como se describe en el Ejemplo III. El oxaloacetato se convierte en treonina mediante la trayectoria de treonina nativa diseñada para producciones elevadas . Entonces se desamina para formar 2-oxobutanoato y subsecuentemente convertir en propionil-CoA. En una alternativa, 2-oxobutanoato se convierte en propionaldehído mediante una descarboxilasa, que se reduce entonces a n-propanol mediante una propanol deshidrogenasa .

Treonina Desaminasa La conversión de treonina a 2-oxobutanoato (o 2-cetobutirato) pueden lograrse por una treonina desaminasa. Se codificada mediante uno o más genes seleccionados de ilvA (Calhoun et al., J. Biol . Chem. 248 (10) : 3511-6, (1973) ) y tdcB (Umbarger et al., J. Bacteriol . 73 ( 1 ) : 105-12 , (1957) ; Datta et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 84(2) : 393-7(1987) ) . Rhodospirillu rubrum representa un organismo ejemplar adicional que contiene treonina desaminasa (Feldberg et al., Eur. J. Biochem. 21(3) : 438-46 (1971) ; .S. Patent 5,958,745) . Los detalles para enzimas ejemplares para llevar a cabo esta transformación se muestran en lo siguiente. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 56.

Tabla 56. 2-Oxobutanoato deshidrogenasa 2-oxobutanoato ( 2-cetobutirato) puede convertirse a propionil-CoA mediante un piruvato-formiato liasa y una enzima que activa piruvato-formiato liasa. El piruvato- formiato liasa es codificada mediante el gen seleccionado a partir de pflB y tdcE, mientras que la enzima que activa piruvato-formiato liasa se codifica mediante un gen pflA. Los detalles para estos genes ejemplares para llevar a cabo esta transformación están listados.

Alternativamente, 2-oxobutanoato puede convertirse en propionil-CoA por medio de piruvato deshidrogenasa, piruvato ferredoxin oxidorreductasa (PFOR), o cualquier otra enzima con funcionalidad 2-cetoácido deshidrogenasa. Tales enzimas son capaces de convertir piruvato a acetil-CoA. Las enzimas piruvato deshidrogenasa ejemplares se encuentran presentes en E. coli (Bisswanger, H., J. Biol . Chem. 256:815-822 (1981); Bremer, J., Eur. J. Biochem. 8:535-540 (1969); Gong et al, J. Biol. Chem. 275: 13645-13653 (2000)), B. subtilis (Nakano et al., J. Bacteriol. 179 : 67.49-6755 (1997)), K. pneumonía (Menzel et al., J. Biotechnol . 56: 135-142 (1997)), R. norvegicus (Paxton et al., Biochem. J. 234:295-303 (1986)), por ejemplo. La información genética ejemplar se proporciona en lo siguiente. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 57.

Tabla 57.

Las enzimas PFOR ejemplares incluyen, por ejemplo, la enzima de Desulfovibrio africanus que se han clonado y se expresan en E. coli, resultando en una enzima recombinante activa que fue estable durante varios días en la presencia de oxígeno (Pieulle et al., J. Bacteriol. 179:5684-5692 (1997) ) . La estabilidad de oxígeno es relativamente poco común en PFORs y se reporta para ser conferida mediante una extensión de 60 residuos en la cadena de polipéptidos de la enzima D. africanus . El PFOR de M. cermoacética también se caracteriza (Menon et al. Biochemistry 36:8484-8494 (1997) ) y se mostró que tiene alta actividad en la dirección de síntesis de piruvato durante el crecimiento autotrofico (Furdui et al. J.

Biol. Chem. 275:28494-28499 (2000) ) . Además, E. coli posee un marco de lectura abierta no caracterizada, ydbK, que codifica una proteína que es 51% idéntica a la PFOR de M. thermoacetica . La evidencia para actividad piruvato oxidorreductasa en E. coli ha descrito (Blaschkowski et al., Eur. J. Biochem. 123 :563-569 (1982) ) . Las secuencias de proteínas de esta enzima PFOR ejemplar puede identificarse mediante el siguiente acceso de GenBank y/o números de GI como se muestra en lo siguiente. Diversas enzimas PFOR adicionales se han descrito (Ragsdale, Chem. Rev. 103 :2333-2346 (2003) ) . Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 58.

Tabla 58.

Trayectorias adicionales para producir propionil-CoA se describen en la Patente Estadounidense 5, 958,745 que se incorpora para referencia en la presente en su totalidad. Una de tales trayectorias implica convertir 2-cetobutirato a propionato mediante piruvato oxidasa, y convertir propionato a propionil-CoA mediante un acil-CoA sintetasa. 2-Oxobutanoato Descarboxilasa Un cetoácido descarboxilasa puede catalizar la conversión de 2-oxobutanoato a propionaldehído . Diversas 2-cetoácido descarboxilasas se han identificado. Los candidatos de enzimas para esta etapa son piruvato descarboxilasa (CE 4.1.1.1), benzoilformato descarboxilasa (4.1.1.7), alfa-cetoglutarato descarboxilasa (CE 4.1.1.71), alfa-ceto-ácido descarboxilasa de cadena ramificada (4.1.1.72), y descarboxilasa indolpiruvato (CE 4.1.1.74). Estas clases de descarboxilasas son NADH independientes, se utilizan tiamina difosfato como un cofactor, y la interacción del sustrato con el cofactor de enlace de enzima es de a través de ser la etapa que limita el índice para la activación de enzimas (Hubner, Eur. J Biochem. 92:175-181 (1978)). La piruvato descarboxilasa y benzoilformato descarboxilasa tienen márgenes de sustrato amplios para diversos cetoácidos y se han caracterizado en detalle estructural. Pocos alfa-cetoglutarato y alfa-cetoácido descarboxilasas de cadena ramificada se han caracterizado experimentalmente ; sin embargo, estas enzimas también parecen descarboxilar una variedad de sustratos de ceto-ácidos.

La piruvato descarboxilasa (PDC), también denominado ceto-ácido descarboxilasa, es una enzima clave en la fermentación alcohólica, catalizando la descarboxilación de piruvato a acetaldehído . La enzima de Saccharomyces cerevisiae tiene un margen de sustrato amplio para 2-cetoácidos alifáticos que incluyen 2-cetobutirato, 2-cetovalerato , 3 -hidroxipiruvato y 2-fenilpiruvato (22) . El PDC de Zymomonas obilis, codificada mediante pdc, ha sido un sujeto de estudios de diseño directo que altera la afinidad para sustratos diferentes (Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005) ) . El PDC de Saccharomyces cerevisiae también ha sido extensivamente estudiado, diseñado para actividad alterada, y funcionalidad expresada en E. coli (Li, Biochemistry. 38: 10004-10012 (1999) ; ter Schure, Appl . Environ. Microbiol. 64:1303-1307 (1998) y illenberg-Jabs , Eur. J. Biochem. 268: 1698-1704 (2001) ) . La estructura de cristal de esta enzima se encuentra disponible (Killenberg-Jabs, Eur. J. Biochem. 268: 1698-1704 (2001) ) . Otros candidatos de PDC bien caracterizados incluyen las enzimas de Acetobacter pasteurians (Chandra, Arch. Microbiol. 176:443-451 (2001) ) y Kluyveromyces lactis (Krieger, Eur. J. Biochem. 269:3256-3263 (2002) ) . Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 59.

Tabla 59.

Similar a PDC, la benzoilformato descarboxilasa tiene un margen sustrato amplio y ha sido el objetivo de los estudios de diseño de enzimas. La enzima de Pseudomonas putida ha sido excesivamente estudiada y las estructuras de cristal de esta enzima se encuentran disponibles (Polovnikova et al, Biochemistry 42: 1820-1830 (2003); y Hasson et al., Biochemistry 37:9918-9930 (1998)). La mutagénesis dirigida de dos residuos en el sitio activo de la enzima Pseudomonas putida alteró la afinidad (Km) del sustrato de origen natural y de origen no natural (Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357 (2005)). Las propiedades de estas enzimas han sido modificadas mediante diseño directo (Lingen et al., Che biochem. 4:721-725 (2003); y Lingen, Protein Eng 15:585-593 (2002)). La enzima de Pseudomonas aeruginosa, codificada por MDLC, se ha caracterizado experimentalmente ( (Barrowman, FEMS Microbiology Letters 34:57-60 (1986)). Los candidatos de gen adicional de Pseudomonas stutzeri , Pseudomonas fluorescens y otros organismos pueden inferirse mediante homología de secuencia o identificados utilizando un sistema de sección del crecimiento desarrollado en Pseudomonas putida (Henning et al, Appl Environ. Microbiol . 72:7510-7517 (2006)). Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 60.

Tabla 60.

Una tercera enzima capaz de descarboxilar 2-oxoácidos es alfa-cetoglutarato descarboxilasa (KGD) . El margen de sustrato de esta clase de enzimas no se ha estudiado hasta la fecha. El KDC de Mycobacterium tuberculosis (Tian, Proc Nati Acad Sci U S. A 102: 10670-10675 (2005) ) se ha clonado y expresado funcionalmente en otros proyectos internos de Genomática. Sin embargo, no es un candidato ideal para diseñar cepa debido a que es grande (~130 kD) y rico en GC . La actividad de la enzima KDC ha sido detectada en diversas especies de Rhizobia como Bradyrhizobium japonicum y Mesorhizobium loti (Green, J Bacteriol. 182:2838-2844 (2000) ) . Aunque el o los genes que codifican KDC no han sido aislados en estos organismos, las secuencias de genoma se encuentran disponibles y diversos genes en cada genoma se anotan como KDC putativos . Un KDC de Euglena gracilis también se ha caracterizado, pero el gen asociado con esta actividad no se ha identificado a la fecha (Shigeoka, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28 (1991) ) . Los primeros veinte aminoácidos inician desde el N- terminal donde la secuencia MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV (Shigeoka, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28 (1991) ) . El gen pude ser identificado al probar los genes candidatos que contienen esta secuencia N-terminal para la actividad de KDC. Estos genes /proteínas se identifican a continuación en la Tabla 61.

Tabla 61.

Una cuarta enzima candidato para catalizar esta etapa es alfa-cetoácido descarboxilasa (BCKA) cadena ramificada. Esta clase de enzima se ha mostrado que actuar como una variedad de compuestos que varían en longitud de cadena de 3 a 6 carbonos (Oku, J Biol Chem. 263:18386-18396 (1988); y Smit et al., Appl Environ Microbiol 71:303-311 (2005)). La enzima en Lactococcus lactis se ha caracterizado en una variedad de sustratos lineales y ramificados, que incluyen 2-oxobutanoato, 2-oxohexanoato, 2-oxopentanoato, 3-metil-2-oxobutanoato, 4-metil-2-oxobutanoato e isocaproato (Smit et al., Appl Environ Microbiol 71 :303-311 (2005)). La enzima se ha caracterizado estructuralmente (Berthold et al., Acta Cryscallogr. D Biol Crystallogr. 63:1217-1224 (2007)). Las alineaciones de secuencia entre la enzima de Lactococcus lactis y la piruvato descarboxilasa de Zymo onas mobilis indica que los residuos de reconocimiento catalítico y del sustrato son casi idénticos (Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18 : 345- 357 ( 2005 ) ) , así esta enzima puede ser un candidato prometedor para diseño directo. La descarboxilacion de alfa-cetoglutarato por un BCKA se detectó en Bacillus subtilis , sin embargo, esta actividad fue baja ( 5% ) en relación con la actividad en otros sustratos de cadena ramificada ((Oku, J Biol Chem. 263 : 18386 - 18396 ( 1988 ) ) y el gen que codifica esta enzima no se ha identificado hasta la fecha. Los candidatos de gen BCKA adicionales pueden identificarse mediante homología a la secuencia de proteína de Lactococcus lactis. Muchas de las consultas de BLASTp de alta puntuación, para esta enzima se anotan como indolepiruvato descarboxilasas (CE 4 . 1 . 1 . 74 ) . las indolepiruvato descarboxilasa (IPDA) es una enzima que cataliza la descarboxilacion de indolpiruvato a indolacetaldehído en plantas y bacterias de plantas. Este gen/proteína se identifica a continuación en la Tabla 62 .

Tabla 62 .

Las enzimas alfa-cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada recombinante derivadas a partir de las subunidades El del conjunto de cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada mitocondrial de Homo sapiens y Bos taurus se han clonado y se expresan funcionalmente en E. coli (Wynn, J.

Biol. Chem. 267: 12400-12403 (1992) ; Davie, J. Biol . Chem. 267: 16601-16606 (1992) y Wynn et al . , J. Biol . Chem. 267: 1881-1887 (1992) ) . En estos estudios, el autor encontró que la co-expresión de chaperoninas GroEL y GroES mejoró la actividad específica de la descarboxilasa por 500 veces (Wynn, J. Biol. Chem. 267: 12400-12403 (1992) ) . Estas enzimas se encuentran compuestas de dos subunidades alfa y dos beta. Estos genes/proteínas se identifican a continuación en la Tabla 63.

Tabla 63 Ejemplo V Trayectorias para la Producción de la Propionil-CoA de la Glucosa mediante Malonil-CoA Además para los ejemplos I y II, la trayectoria para producción de propionil-CoA mediante malonil-CoA se ejemplifica en la Figura 3. Acetil CoA se carboxila para formar malonil-CoA. Esto se reduce entonces a malonato semialdehído, y subsecuentemente se transforma en 3-hidroxipropionato (3HP) . 3HP se convierte en propionil-CoA mediante propionil-CoA sintasa.

Acetil-CoA carboxilasa La multisubunidad del complejo acetil-CoA carboxilasa (CAC) , se conserva ampliamente entre bacterias, cataliza la formación dependiente de ATP de malonil-CoA dependiente de acetil-CoA y bicarbonato. Esta reacción sirve como la primera etapa perpetuada en la biosíntesis de ácido graso, y la enzima se ha enfocado en esfuerzos para desarrollar fármacos antibacterianos e inhibidores en E. coli (Freiberg et al., J. Biol . Chem. 279:26066-26073 (2004)), levadura (Zhang, Proc. Nati. Acad. U.S. A 101:5910-5915 (2004)), Bacillus subtllis (Freiberg et al., J. Biol. Chem. 279:26066-26073 (2004)) y otros organismos (Barber, Biochim. Biophys. Acta 1733:1-28 (2005)). En E. coli y muchas otras bacterias, ACC se encuentra compuesto de cuatro subunidades codificadas por accA, accB, accC y la accD (Choi, Rhee, J. Biol. Chem. 278:30806-30812 (2003)). La expresión de dos subunidades, accB y accC, se encuentra autorregulada por el producto genético de accB (James, J. Biol. Chem. 279:2520-2527 (2004)). En levadura, la enzima se codifica mediante dos genes, hfal y accl. El gen bpll gen, que codifica una ligasa biotina: apoproteína, se requiere para la función de la enzima .

Los miembros autotróficos del grupo taxonómico archael Sulfolobales exhiben altos niveles de actividad acetil-CoA carboxilasa en el contexto del ciclo 3-hidroxipropionato (Chuakrut, J. Bacteriol . 185:938-947 (2003), y Hugler, Eur . J. Biochem. 270:736-744 (2003)). En Metallosfaera Sedula, la holoenzima acil-CoA carboxilasa es un multímero compuesto de subunidades codificadas mediante tres genes: Msed_0148 (conexión de biotina/lipoilo) , Msed_0147 (biotin carboxilasa) , y Msed_1375 (carboxil transferasa) . La enzima se ha purificado y caracterizado y se encontró que es bifuncional, reacciona con acetil-CoA y propionil-CoA (Hugler, Eur. J. Biochem. 270:736-744 (2003)). Una eznima archael acetil-CoA carboxilasa bifuncional de Acidanus brierleyi , codificada por tres genes, se ha clonado en E. coli y se caracteriza (Chuakrut, J. Bacteriol. 185:938-947 (2003). Las secuencias de genes de acil-CoA carboxilasa de A. jrierleyi y regiones de flanqueo fueron sometidas al Banco de Datos de ADN de Japón (DDBJ) bajo el número de acceso ??088419. Aunque estas enzimas archael exhiben alta actividad se debe observar que la temperatura óptima es de 65°C (Chuakrut, J. Bacteriol. 185:938-947 (2003)). Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 64.

Tabla 64.

Malonil-CoA Reductasa y Malonato Semialdehído Reductasa La reducción de malonil-CoA a 3-HP puede lograrse mediante una malonil-CoA reductasa bifuncional con funcionalidad de aldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa . Una enzima NADPH-dependíente con esta actividad se ha caracterizado en Chloroflexus aurantiacus en donde ésta participa en el ciclo de 3-hidroxipropionato (Hugler, j. Bacceriol 184:2404-2410 (2002) y Strauss, Eur. J. Bioche 215:633-643 (1993) ) . Esta enzima, con una masa de 300 kDa, es un sustrato altamente especifico y muestra una pequeña similaridad de secuencia en otras oxidorreductasas conocidas (Hugler, J. Bacteriol . 184:2404-2410 (2002)). Ninguna de las enzimas en otros organismos se han mostrado que catalice esta reacción específica; sin embargo, existen evidencia bioinformática de que otros organismos pueden tener una trayectoria similar (Klatt, Environ. Microbiol. 9:2067-2078 (2007). Las enzimas candidatos en otros organismos, incluyen Roseiflexus castenholzii , Erythrobacter sp. NAPl y gamma proteobacterium HTCC2080 marino puede inferirse mediante similaridad de secuencias. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 65.

Tabla 65.

Alternativamente, la reducción de malonil-CoA a 3-HP puede catalizarse por dos enzimas separadas: un aldehido deshidrogenasa acilada con CoA y un alcohol deshidrogenasa primario. Ante esta ruta, malonil-CoA es primero reducido a malonato semialdehído (MSA) mediante malonato-semialdehído deshidrogenasa o malonil-CoA reductasa. MSA es subsecuentemente convertido a 3-HP mediante 3- HP-deshidrogenasa .

La malonil-CoA reductasa es una enzima clave en la fijación de carbono autotrófico por medio del ciclo de 3-hidroxipropionato en la bacteria archael termoacidofílica (Berg, Science. 318:1782-1786 (2007), y Thauer, Science. 318: 1732-1733 (2007)). La enzima utiliza NADPH como un cofactor y se ha caracterizado en Metallosphaera y Sulfolobus spp (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006), y Hugler, J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)). La enzima codificada por Msed_0709 en Metallosphaera sedula se conoce para convertir malonil-CoA a semialdehído malónico y operar en la dirección de interés (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006), y (Berg, Science. 318: 1782-1786 (2007)). Un gen que codifica una malonil-CoA reductasa de Sulfolobus tokodaii se clonado y se expreso heterólogamente en E. coli (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006). Aunque la funcionalidad de aldehido deshidrogenasa de estas enzimas es similar a la deshidrogenasa bifuncional de Chloroflexus aurantiacus , existe una pequeña similaridad de secuencia. Ambos candidatos de enzima malonil-CoA reductasa, tienen una similaridad de alta secuencia para aspartato-semialdehído deshidrogenasa, una enzima que cataliza la reducción y defosforilación simultánea de aspartil-4-fosfato a aspartato semialdehído. Los candidatos genéticos adicionales pueden encontrarse mediante la homología de secuencia en proteínas en otros organismos incluyendo Sulfolobus solfataricus y Sulfolobus acidocaldarius . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 66 .

Tabla 66 .

La conversión subsecuente de semialdehido malónico a 3-HP puede lograrse mediante una enzima con actividad 3-HP deshidrogenasa. Tres enzimas se conocen para catalizar esta conversión: 3 -hidroxipropionato deshidrogenasa dependiente de NADH, malonato semialdehído reductasa dependiente de NADPH , y 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasas dependiente de NADH. Una 3 -hidroxipropionato deshidrogenasa dependiente de NADH se piensa que participan en las trayectorias de bios ntesis de beta-alanina a partir del propionato en bacterias y plantas (Rathinasabapathi , Journal of Plant Pathology 159 : 67 1 - 674 ( 2 002 ) ; y Stadtman, A. J. Am. Chem. Soc . 77 : 5765 - 57 66 ( 1955 ) ) . Esta enzima no se ha asociado con un gen en ningún organismo hasta la fecha. El malonato semialdehído reductasa dependiente de NADPH cataliza la reacción inversa en la bacteria de fijación C02 autotrófica. Aunque la actividad enzimática se ha detectado en Metallosphaera sedula, la identidad del gen no se conoce (Alber et al., J. Bacteriol . 188 : 8551 - 8559 ( 2 006 ) ) .

Diversas enzimas 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa también se han mostrado para convertir semialdehído malónico a 3-HP. Tres genes candidatos exhiben esta actividad son mmsB de Pseudomonas aeruginosa PA01 (Gokam et al., Patente Estadounidense 7,393,676 (2008)). mmsB de Pseudomonas putida KT2440 (Liao, Publicación de Patente Estadounidense 2005-0221466 (2005) y mmsB de Pseudomonas putida E23 (Chowdhury, Biosci. Biotechnol . Biochem. 60:2043-2047 (1996)). La proteína a partir de Pseudomonas putida E23 se ha caracterizado y funcionalmente expresado en E. coli; sin embargo, esta actividad en 3-HP fue relativamente baja (Chowdhury, Biosci. Biotechnol. Biochem. 60:2043-2047 (1996)). Una enzima con actividad 3-hidroxibutirato deshidrogenasa en Alcaligenes faecalis M3A también se ha identificado (Liao, Publicación de Patente Estadounidense 2005-0221466 (2005), y Liao, Publicación de Patente, Estadounidense 2005-0221466 (2005)). Los genes adicionales candidatos de otros organismos incluyendo Rhodobacter spaeroides pueden inferirse mediante similaridad de secuencia. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 67.

Tabla 67.

Las enzimas que exhiben una actividad 4-hidroxibutirato (EC 1.1.1.61) pueden ser también capaces de convertir semialdehído malónico a 3-HP, cuando la transformación química es muy similar. Estas enzimas se han caracterizado en Ralstonia eutropha (Bravo, J. Forensic Sci. 49:379-387 (2004) ) , Clostridium kluyveri (Wolff, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995) ) y Arabidopsis thaliana (Breitkreuz et al., J. Biol . Chem. 278 :41552-41556 (2003) ) . La actividad de estas enzimas en semialdehído malónico no se han demostrado experimentalmente hasta la fecha. Sin embargo, puesto que estas enzimas se han estudiado en otros proyectos internos en Genomática podría probarse fácilmente para la actividad 3-HP deshidrogenasa . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 68.

Tabla 68.

Propionil-CoA Sintasa La conversión de 3-hidroxipropionato (3HP) a propionil-CoA se logra mediante una propionil-CoA sintasa. Esta etapa se conoce que se cataliza mediante una proteína de fusión simple de 201 KDa en Chloroflexus aurantiacus (Alber, J Biol. Chem. 277:12137-12143 (2002)). La proteína se comprende de una CoA ligasa, una enoil-CoA hidratasa y una enoil-CoA reductasa. La enzima se ha purificado 30 veces hasta casi homogeneidad y tiene una masa molecular nativa muy grande entre 500 y 800 kDa . En termoacidofílico Metallosphaera sedula (y miembros de la familia Sulfolobaceae) , esta función se cataliza mediante tres enzimas diferentes, una 3-hidroxipropionil-CoA sintetasa que activa 3HP a su CoA éster, una 3-hidroxipropionil-CoA deshidratasa que convierte 3-HP-CoA a acriloil-CoA seguido por la reducción del último para formar propionil-CoA. Una 3-HP-CoA sintetasa se ha reportado (Alber, J Bacteriol 190:1383-1389 (2008)). El gen que codifica la proteína se ha secuenciado y el gen que codifica la proteína homologa identificado en el genoma de Sulfolobus tokodaii; genes similares se encontraron en S. solfataricus y S. acidocaldarius . El gen fue heterólogamente expresado en Escherichia coli. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 69.

Tabla 69.

Recientemente, la 3-hidroxipropionil-CoA deshidratasa y acriloil-CoA reductasa se purificaron a partir de M. sedula (Teufel, J. Bacteriol . 191:4572-4581 (2009)), los genes que codifican se identifican a partir del genoma de M. sedula y otros miembros de Sulfolobales, y enzimas recombinantes se produjeron como una prueba de función. Se concluyó que el gen que codifica para 3-hidroxipropionil-CoA deshidratasa y acriloil-CoA reductasa no están agrupados en el genoma Metallosphaera o Sulfolobus. La comparación de los dominios respectivos de propionil-CoA sintasa en estos dos organismos ha revelado que la o las enzimas que catalizan la conversión de 3HP a propionil-CoA a evolucionado independientemente en estas dos clases. Los números de GI y/o de acceso de GenBank para 3-HP-CoA deshidratasa de M. sedula se identifican en lo siguiente en la Tabla 70.

Tabla 70.

Los IDs de GenBank para acriloil-CoA reductasas identifican en lo siguiente en la Tabla 71 .

Tabla 71 Otros genes candidatos que codifican estas enzimas pueden obtenerse mediante búsquedas de homología de secuencias .

EJEMPLO VI Trayectoria para la Producción de Propionil-CoA de Glucosa mediante Lactato Además de los ejemplos I e II, la trayectoria para la producción de propionil-CoA por medio de lactato se ejemplifica en la Figura 4 . Esta trayectoria presenta aún otra ruta equilibrada de redox para la formación de propionil-CoA. El piruvato se redujo para formar lactato que entonces se activa para formar lactoil-CoA. La lactoil-CoA se deshidrata para formar acriloil-CoA y después se reduce para generar propionil-CoA.

Lactato deshidrogenasa La conversión de piruvato a lactato se cataliza mediante el lactato deshidrogenasa (EC 1 . 1 . 1 . 27 ) . Muchos lactatos deshidrogenasas se han descrito en detalle (Garvie, Microbiol Rev 44:106-139 (1980) ) . La lactato deshidrogenasa fermentativa de Escherichia coli será el primer candidato para ser sobre-expresado para convertir piruvato a lactato (Bunch, Microbiology 143 (Pt 1) , 187-195 (1997) ) . Otra lactato deshidrogenasa candidatas se utilizan para esta etapa incluyendo aquellas con bajo Km para piruvato que favorece la formación de lactato, tal como lactato deshidrogenasa a partir de: Lactobacillus casei (Gordon, Eur. J Biochem. 67 :543-555 (1976) ) , Plasmodium falciparum (Bro n et al., Biochemistry 43 : 6219-6229 (2004) ) , y Thermotoga maritime (Auerbach et al., Structure. 6:769-781 (1998) ) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 72.

Tabla 72.

Lactato-CoA transferasa La activación de lactato a lactoil-CoA puede catalizarse mediante actividad lactato-CoA transferasa asociado con propionato CoA-transferasa (EC 2.8.3.1) . El Clostridium propionicum fermenta la alanina mediante la trayectoria no aleatoria con acriloil-CoA como intermediario característico. En esta trayectoria, el lactato se activa al lactoil-CoA mediante la enzima propionato: acetil-CoA CoA-transferasa (EC 2.8.3.1, o propionato de CoA-transferasa) utilizando propionil-CoA o acetil-CoA como un donador de coenzima A (Sch eiger, FEBS Lett. 171:79-84 (1984)). La enzima exhibió más bien especificidades de sustrato amplio para ácido monocarboxílico incluyendo acrilato, propionato y butirato mientras que los ácidos dicarboxílieos no se utilizaron. El gen que codifica para esta enzima se clonó (Selmer, Eur . J Biochem. 269:372-380 (2002)). Otro propionato CoA-transferasa pueden ser candidatos para esta etapa incluyen homólogos de propionato CoA-transferasa de Clostridium propionicum. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 73.

Tabla 73.

Lactoil-CoA deshidratasa La deshidratación de lactoil-CoA a acriloil-CoA se cataliza mediante lactoil-CoA deshidratasa (EC 4.2.1.54). Los fermentos de alanina de Clostridium propionicum ante la trayectoria no aleatoria con acriloil-CoA como intermediario característico (Schweiger, FEBS Lett. 171 : 79 - 84 ( 1984 ) ) . En esta trayectoria, la lactoil-CoA se deshidrata en acriloil-CoA mediante la lactoil-CoA deshidratasa (Hofmeister, Eur. J. Biochem. 206 : 547 - 552 ( 1992 ) ) . La clonación del propionato CoA-transferasa también identificó un segundo ORF (IcdB) que codifica probablemente una subunidad de la lactoil-CoA deshidratasa requerida en la trayectoria. El IcdB es similar a la subunidad 2-hidroxiglutaril-CoA deshidratasa ß. Los homólogos de IcdB se probarán para su actividad en esta etapa. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 74 .

Tabla 74 .

Acriloil-CoA reductasa La conversión de acriloil-CoA a propionil-CoA se cataliza mediante la acriloil-CoA reductasa. En Clostridium propionícum que fermenta alanina, la acriloil-CoA reductasa cataliza la formación dependiente de NADH irreversible de propionil-CoA a partir de acriloil-CoA. La enzima se ha purificado y el N-termino de las subunidades de la enzima se ha determinado (Hetzel et al., Eur. J Bioche . 270 : 902 - 910 ( 2003 ) ) . El N-termino de la subunidad propionil-CoA deshidrogenasa dimérica es similar a aquella de butiril-CoA deshidrogenasas de diversas Clostridia y anaerobias relacionadas (hasta 55% de identidad de secuencia) . El N-termino de la subunidad ß y ? comparte 40% y 35% de identidades de secuencia con aquellas de las subunidades A y B de la flavoproteína que transfiere el electrón (ETF) de Megasphaera elsdenii , respectivamente, y hasta 60 % con aquellos de ETFs putativos de otros anaerobios. Puesto que la secuencia de genoma completa de Clostridium propionicum no se encuentra disponible, el N-termino de la subunidad propionil-CoA deshidrogenasa "MDFKLTKTQVLQQWLFAEFAGIGIKPIAE" (SEQ ID NO.) se utilizó en la similaridad de búsqueda y resultó en los siguientes homólogos del propionil-CoA deshidrogenasa para su actividad en esta etapa. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 75 .

Tabla 75 .

Adicionalmente, un gen de propionil-CoA sintasa (pcs) tri- funcional se identificó a partir del eubacterium sin azufre verde fototrófico Chloroflexus aurantiacus (Alber, J. Biol. Chem. 277 : 12137-12143 (2002)). La propionil-CoA sintasa es una proteína de fusión natural de 201 kDa que consisten de una CoA ligasa, una enoil-CoA hidratasa, y una enoil-CoA reductasa. La enzima cataliza la conversión de 3-hidroxipropionato a 3-hidroxipropionil-CoA a acriloil-CoA después a propionil-CoA. Esta enzima puede utilizarse en toda o en parte a esta actividad de enoil-CoA reductasa. El gen/proteína se identifica en lo siguiente en la Tabla 76.

Tabla 76.

EJEMPLO VI Trayectorias para co-producción de 1, 4-butandiol (1,4-BDO) e Isopropanol a partir de glucosa Este ejemplo describe las trayectorias ejemplares para co-producción de 1 , 4-butandiol (1,4-BDO) e isopropanol.

Las trayectorias novedosas para co-producir 1,4-butandiol (1,4-BDO) e isopropanol y productos relacionados se describen en la presente. En la trayectoria de co-producción de 1 , 4-butandiol (1,4-BDO) e isopropanol de la Figura 5, los intermediarios del metabolismo central son primero canalizados en succinil-CoA. La formación de succinil-CoA, fosfoenolpiruvato (PEP) se convierte en oxaloacetato ya sea por medio PEP carboxicinasa o PEP carboxilasa. Alternativamente, PEP se convierte primero a piruvato mediante piruvato cinasa y después a oxaloacetato mediante metilmalonil-CoA carboxitransferasa o piruvato carboxilasa. El oxaloacetato entonces se convierte a succinil-CoA por medio del ciclo de TCA reductivo. El succinil-CoA entonces se convierte a semialdehído succínico mediante un aldehido deshidrogenasa dependiente de CoA. Alternativamente, el succinato puede convertirse a semialdehído succínico mediante una succinato reductasa. Después, el semialdehído succínico se reduce a 4-hidroxibutirato mediante 4-hidroxibutirato deshidrogenasa. La activación de 4-HB a su acil-CoA se cataliza mediante una CoA transferasa o sintetasa. Alternativamente, 4-HB puede convertirse en 4-hidroxibutiril-fosfato y subsecuentemente transformada en 4-HB-CoA mediante una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa . 4-HB-CoA se convierte entonces a 14-BDO mediante ya sea un aldehido/alcohol deshidrogenasa dependiente de CoA bifuncional, o mediante dos enzimas separadas con actividad aldehido y alcohol deshidrogenasa. Aún otra alternativa que desvíe el intermediario 4-HB-CoA es la reducción directa de 4-HB a 4-hidroxibutirilaldehído mediante un ácido carboxílico reductasa. 4-Hidroxibutirilaldehído se reduce subsecuentemente a 14-BDO mediante un alcohol deshidrogenasa. Aún otra ruta que desvía el CoA intermediario es la reducción de 4-hidroxibutiril-fosfato a 4-hidroxibutirialdehído mediante una fosfato reductasa. Las trayectorias para la producción de isopropanol procede como se ha descrito en los Ejemplos I e II.

La producción teórica máxima de un organismo que produce 14-BDO e isopropanol es de 0.77 moles de isopropanol y 0.46 moles de 14-BDO por molécula de glucosa consumida (0.26 g/g IPA y 0.23 g/g 14-BDO), para la siguiente ecuación: 13 Glucosa -> 10 IPA + 6 14-BDO + 24 C02 + 8 H20 EJEMPLO VIII Trayectorias para Co-producción de 1, 3-butandiol (1,3-BDO) e isopropanol a partir de glucosa Este ejemplo describe trayectorias ejemplares para la co-producción de 1 , 3-butandiol (13-BDO) e isopropanol.

Las trayectorias novedosas para co-producir 1,3-butandiol (13-BDO) e isopropanol y productos relacionados se describen en la presente. La ruta de co-producción para 1,3-butandiol (13-BDO) e isopropanol, mostradas en la Figura 6, también procede a través de 4-hidroxibutiril-CoA, formado como se describe en el Ejemplo VI. En esta ruta, 4-hidroxibutiril-CoA se deshidrata e isomeriza para formar crotonil-CoA. Las reacciones de deshidratación y vinilisomerización se catalizan por una enzima bifuncional, 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa . Crotonil-CoA entonces se hidrata a 3-hidroxibutiril-CoA. La remoción de la porción de CoA y la producción actual produce 3-hidroxibutiraldehído . Finalmente la reducción del aldehido por 3-hidroxibutiraldeh do reductasa produce 13-BDO.

Alternativamente, 3-hidroxibutiril-CoA puede convertirse a 13-BDO directamente por una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol). Otras diversas rutas alternativas son posibles en esta trayectoria. El succinato puede convertirse a semialdehído succínico mediante una reductasa de ácido carboxílico, desviando la formación de succinil-CoA . 4-HB puede ser fosforilado a 4-HB-fosfato por una cinasa, después subsecuentemente convertido a 4-HB-CoA. Finalmente 3-hidroxibutiril-CoA puede ser des-acilado por una CoA hidrolasa, transferasa o sintetasa, después subsecuentemente reducido a 3-hidroxibutiraldehido mediante una reductasa de ácido carboxílico.

Las trayectorias para la producción de isopropanol procede como se describe en lo anterior en los Ejemplos I y II .

La producción teórica máxima de 13-BDO e isopropanol mediante la trayectoria es de 0.77 moles de isopropanol y 0.46 moles de 13-BDO por mol de glucosa consumida (0.26 g/g IPA y 0.23 g/g 13-BDO), para la siguiente ecuación: 13 Glucosa -> 10 IPA + 6 13-BDO + 24 C02 + 8 H20 EJEMPLO IX Trayectorias para Co-producción de ácido metacrílico (MAA) e Isopropanol a partir de Glucosa Este ejemplo describe trayectorias ejemplares para co-producción de ácido metacrílico (MAA) e isopropanol.

Las trayectorias novedosas para co-producir ácido metacrílico (MAA) e isopropanol y productos relacionados se describen en la presente. Dos rutas de co-producción para ácido metacrílico (MAA) se muestran en las Figuras 7 y 8. La ruta mostrada en la Figura 7 procede a través de 4-hidroxibutiril-CoA, formado como se describe previamente, 4-hidroxibutiril-CoA se convierte a 3-hidroxiisobutiril-CoA mediante una metil mutasa. La porción de CoA de 3-Hidroxiisobutiril-CoA entonces se remueve mediante una CoA transferasa, hidrolasa, o sintetasa. Finalmente, la deshidratacion del grupo 3-hidroxi produce MAA. Varias de las etapas claves de esta ruta pueden desviarse mediante rutas alternas. El succinato, por ejemplo, puede convertirse directamente a semialdehído succínico mediante una succinato reductasa, desviando la formación de succinil-CoA. La conversión de 4-HB a 4-HB-CoA puede proceder a través del 4-hidroxibutirilfosfato intermedio, mediante las enzimas 4-hidroxibutirato cinasa y fosfotrans-4-hidroxibutirilasa . 3-HIBCOA pueden convertirse a MAA mediante el intermediario metacrilil-CoA. Las trayectorias para producción de isopropanol procede como se describe en lo anterior en los Ejemplos I y II.

En la ruta de co-producción de MAA alterna mostrada en la Figura 8, el succinil-CoA se forma a través del ciclo de TCA reductivo, convertido después a metilmalonil-CoA mediante metilmalonil-CoA mutasa. Una epimerasa puede requerirse para convertir la configuración de (R) estereoisómero de metilmalonil-CoA a la (S) . Un aldehido deshidrogenasa dependiente de CoA puede entonces convertir metilmalonil-CoA a metilmalonato semialdehído . La reducción del aldehido a 3-hidroxiisobutirato, seguido por deshidratación, produce MAA. Alternativamente, metilmalonil-CoA se convierte a 3-hidroxiisobutirato mediante un CoA reductasa que forma alcohol. En aún otra ruta alternativa, el metilmalonil-CoA se convierte a metilmalonato mediante una CoA hidrolasa, transferasa o sintetasa. El metilmalonato subsecuentemente se convierte a metilmalonato semialdehído mediante una reductasa de ácido carboxílico. El semialdehído de metilmalonato se convierte a MAA como se describe previamente. Las trayectorias para la producción de isopropanol procede como se describe en lo anterior en los Ejemplos I y II.

Ambas de las trayectorias de coproducción de MAA logran producir 0.67 moles cada una de isopropanol y MAA por mol de glucosa utilizada (0.22 g/g de isopropanol y 0.32 g/g de MAA) por la ecuación: 3 Glucosa -> 2 IPA + 2 MAA + 4 C02 + 4 H20 EJEMPLO X Sistema de Clasificación de Enzima para Producción de Isopronaol y 1, 4-Butandiol- (1, 4-BDO) , 1, 3-Butandiol (1,3-BDO) o ácido metacrílico (MAA) Este ejemplo describe el sistema de clasificación de enzimas para las trayectorias ejemplares descritas en los Ejemplos VII y IX para producción de 1 , 4-butandiol ( 1 , 4-BDO) , 1, 3-butandiol (1,3-BDO) o ácido metacrílico (MAA). Las enzimas ejemplares para producción de isopropanol de acetil-CoA se describen en el Ejemplo I y las enzimas ejemplares para producción de acetil-CoA a partir de glucosa se describen en el Ejemplo II.

PEP carboxicinasa Aunque la conversión neta de fosfoenolpiruvato a oxaloacetato es redox-neutral , el mecanismo de esta conversión es importante para los energéticos globales de la trayectoria de co-producción . La mayoría de enzima deseable para la conversión de PEP a oxaloacetato es PEP carboxicinasa que simultáneamente forma un ATP mientras se realiza la carboxilación de PEP. En la mayoría de los organismos, sin embargo, PEP carboxicinasa sirve una función gluconeogénica y convierte oxaloacetato a PEP a expensas de una ATP. S. cerevisiae es uno de tales organismos cuya PEP carboxicinasa nativa, PCK1 , sirve en un rol gluconeogénico ( aldes-Hevia et al., FEBS. Lett. 258:313-316 (1989)). E. coli es otro de tal organismo, como el papel de PEP carboxicinasa en producir oxaloacetato se cree que es menor cuando se compara con PEP carboxilasa, que no forma ATP, posiblemente debido a la Km superior para bicarbonato de PEP carboxicinasa (Kim et al., Appl Environ Microbiol 70:1238-1241 (2004)). Sin embargo, la actividad de la PEP carboxicinasa E. coli nativa a partir de PEP hacia oxaloacetato se ha demostrado recientemente en mutantes ppc de E. coli K-12 (Kwon et al, Journal of Microbiology and Biotechnology 16: 1448-1452 (2006)). Estas cepas exhibidas no desarrollan defectos y tuvieron producción de succinato incrementada en concentraciones elevadas de NaHCC»3. En algunos organismos, particularmente en bacterias de rumen, PEP carboxicinasa es muy eficiente en producir oxaloacetato a partir de PEP y generar ATP. Ejemplos de genes PEP carboxicinasa que se han clonado en E. coli incluyen aquellos de Mannheimia succiniciproducens (Lee et al., Gene. Biotechnol. Bioprocesos Eng. 7:95-99 (2002)), Anaerobiospirillum succiniciproducens (Laivenieks et al., Appl Environ Microbiol 63 : 2273 - 2280 ( 1997 ) ) , y Actinobacillus succinogenes (Kim et al., Appl Environ Microbiol 7 0 : 1238 - 1241 ( 2004 ) ) . Los experimentos internos también han encontrado que la enzima PEP carboxicinasa codificada por Haemophilus influenza es altamente eficiente en formar oxaloacetato de PEP. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 77 .

Tabla 77 Estas secuencias y secuencias para enzimas subsecuentes listadas en este reporte pueden utilizarse para identificar proteínas homologas en GenBank u otras bases de datos a través de búsqueda de similaridad de secuencias (por ejemplo, BLASTp) . La proteína homologas resultante y sus secuencias genéticas correspondientes proporcionan secuencias de ADN adicionales para transformación en los organismos huésped de elección.

PEP Carboxilasa PEP carboxilasa representa una enzima alternativa para la formación de oxaloacetato a partir de PEP. S. cerevisiae no codifica naturalmente una PEP carboxilasa, sino organismos ejemplares que poseen genes que codifican PEP carboxilasa incluyen E. coli (Kai et al, Arch. Bioche Biophys 414:170-179 (2003) ) , Methylohacterium extorquens AMl (Arps et al., J. Bacteriol 175:3776-3783 (1993) ) , y Corynebacteriu gluta icum (Eikmanns et al, Mol Gen. Genet 218:330-339 (1989) ) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 78.

Tabla 78.

Piruvato cinasa y metilmalonil-CoA carboxitransferasa Una ruta energéticamente eficiente adicional para oxaloacetato a partir de PEP requiere dos actividades enzimáticas : piruvato cinasa y metilmalonil-CoA carboxitransferasa . La piruvato cinasa cataliza la conversión que genera ATP de PEP a piruvato y se codifica mediante el PYK1 (Burke et al., J. Biol . Chem. 258:2193-2201 (1983) ) y PYK2 (Boles et al., J. Bacteriol. 179:2987-2993 (1997) ) genes en S. cerevisiae. En E. coli, esta actividad se cataliza mediante el producto genético de pykF y pykA. La metilmalonil-CoA carboxitransferasa cataliza la conversión de piruvato a oxaloacetato. De manera importante, esta reacción también cataliza simultáneamente la conversión de (S)-metilmalonil-CoA a propionil-CoA (véase las Figuras 1 y 2) . Una metilmalonil-CoA carboxitransferasa ejemplar la cual se comprende de subunidades 1.3S, 5S, y 12S pueden encontrarse en Propionibacteriumfreudenreichii (Thornton et al., J. Bacteriol . 175:5301-5308 (1993) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 79.

Tabla 79.

Piruvato cinasa y Piruvato Carboxilasa Una combinación de enzimas puede convertir PEP a oxaloacetato con una estequiometría idéntica a aquella de PEP carboxilasa. Estas enzimas se codifican mediante piruvato cinasa, PYKl (Burke et al., J. Biol . Chem. 258:2193-2201 (1983) ) o PYK2 (Boles et al., J. Bacteriol. 179 :2987-2993 (1997) ) , y piruvato carboxilasa, PYC1 (Walker et al, Biochem Biophys Res Cornnun 176:1210-1217 (1991) ) o PYC2 (224) . Algunos candidatos para la función piruvato carboxilasa se identifican en lo siguiente en la Tabla 80.

Tabla 80 .

Malato Deshidrogenasa, Fumarasa, Fumarato Reductasa El oxaloacetato puede convertirse a succinato mediante malato deshidrogenasa, fumarasa y fumarato reductasa cuando el ciclo de TCA se opera en el ciclo reductivo S. cerevisiae posee tres copias de malato deshidrogenasa, MDHl (McAlister-Henn et al., J. Bacteriol . 169:5157- 5166 (1987)), MDH2 (Gibson J. Biol . Chem. 278:25628-25636 (2003); y Minará et al, Mol Cell Biol. 11:370- 380 (1991)), y MDH3 (Steffan et al, J. Biol. Chem. 267:24708-24715 (1992)), que localiza a la mitocondria, citosol y peroxisoma, respectivamente. S. cerevisiae contiene una copia de un gen que codifica fumarasa, FUM1 , cuyo producto localiza a ambas del citosol y las mitrocondrias (Sass et al., J" . Biol. Chem. 278:45109-45116 (2003)). La fumarato reductasa se codifica mediante dos enzimas solubles, FRDS1 (Enomoto et al, DNA Res. 3:263-267 (1996)) y FRDS2 (Muratsubaki et al, Arch. Biochem Biophys 352:175-181 (1998)), que localiza al citosol y promitocondrias , respectivamente, y se requieren para crecimiento anaeróbico de glucosa (Arikawa et al, Microbiol Lett 165:111-116 (1998)). E. coli se conoce que tiene una malato deshidrogenasa activa. Tiene tres fumarasas codificadas por fumA, B y C, cada una de las cuales se activa bajo condiciones diferentes de disponibilidad de oxigeno. La fumarato reductasa en E. coli se compone de cuatro subunidades . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 81.

Tabla 81.

Succinil-CoA transferasa Succinil-CoA transferasa cataliza la conversión de succinil-CoA a succinato mientras que transfiere la porción de CoA a una molécula aceptora de CoA. Muchas transferasas tienen amplia especificidad y de este modo pueden utilizar aceptores de CoA tan diversos como acetato, succinato, propionato, butirato, 2-metilacetoacetato, 3-cetohexanoato, 3-cetopentanoato, valerato, crotonato, 3-mercaptopropionato , propionato, vinilacetato , butirato, entre otros.

La conversión de succinato a succinil-CoA es idealmente llevada por una transferasa que no requiere el consumo directo de un ATP o GTP. Este tipo de reacción es común en varios organismos. Quizá la enzima candidato superior para esta etapa de reacción es succinil-CoA: 3-cetoácido-CoA transferasa. Esta enzima convierte el succinato a succinil-CoA, mientras convierte un 3-cetoacil-CoA a un 3-cetoácido. El succinil-CoA ejemplar : 3 : cetoácido-CoA transferasa se encuentran presentes en Helicobacter pylori (Corthesy-Theulaz et al, J. Biol . Chem. 272 :25659-25667 (1997) ) , Bacillus subtilis (Stols et al, Protein Expr Purif 53 :396-403 (2007) ) , y Homo sapiens (Fukao et al, Genomics 68:144-151 (2000. ) , y Tanaka et al, Mol Hum Reprod 8:16-23 (2002) ) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 82.

Tabla 82.

La conversión de succinato a succinil-CoA también puede catalizarse mediante succinil-CoA: acetil-CoA transferasa. El producto genético de c tl de Clostridium kluyveri se ha demostrado que exhibe actividad succinil-CoA: acetil-CoA transferasa (Sohling et al, J Bacteriol 178:871-880 (1996)). Además, la actividad se encuentra presente en Trichomonas vaginalis (van Grinsven et al., J. Biol . Chem. 283:1411-1418 (2008)) y Trypanosoma brucei (Riviere et al., J. Biol. Chem. 279:45337-45346 (2004)). Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 83.

Tabla 83.

Aún otro aceptor de CoA posible es bencilsuccinato . Succinil-CoA: (R) -Bencilsuccinato de CoA-transíerasa funciona como parte de una trayectoria de degradación anaerobia para tolueno en organismos tales como Thauera aromática (Leutwein and Heider, J. Bact 183 (14) 4288-4295 (2001)). Los homólogos pueden encontrarse en Azoarcus s . T. Aromatoleum aromaticum EbNl y Geobacter metallireducens GS-15. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 84.

Tabla 84.

Finalmente, ygfH codifica una propionil CoA: succinato CoA transferasa en E. coli (Haller et al, Bioche istry, 39(16)4622-4629) . Homólogos cercanos pueden encontrarse en, por ejemplo, Citrobacter youngae ATCC 29220, Salmonella entérica subsp. arizonae serovar, y Yersinia intermedia ATCC 29909. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 85.

Tabla 85.

Succinil-CoA sintetasa El producto de los genes LSC1 y LSC2 de S. cerevisiae y los genes sucC y sucD de E. coli, naturalmente forman un complejo de succinil-CoA sintetasa que cataliza la formación de succinil-CoA a partir de succinato con el consumo concomitante de un ATP, una reacción que es reversible in vivo (Bravo et al., J". Forensic Sci. 49:379-387 (2004) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 86.

Tabla 86.

Piruvato-Formiato Liasa El piruvato-formiato liasa es una enzima que cataliza la conversión de piruvato y CoA en acetil-CoA y formiato. El piruvato-formiato liasa es una enzima común en organismos procarióticos que se utilizan para auxiliar en modular el balance redox anaeróbico. Enzimas ejemplares pueden encontrarse en Escherichia coli (Knappe et al., FEMS . Microbiol Rev. 6:383-398 (1990)), Lactococcus lactis (Melchiorsen et al., Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344 (2002)), y Streptococcus mutans (Takahashi-Abbe et al., Oral, Microbiol Immunol. 18:293-297 (2003)). Una mitocondria de piruvato- formiato liasa también se ha identificado en la eucariota, Chlamydomonas reinhardtii (Atteia et al, J. Biol .

Chem. 281:9909-9918 (2006) ; y Hemschemeier et al, Eukaryot cell 7:518-526 (2008) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 87.

Tabla 87.

Formiato Hidrógeno Liasa Una enzima formiato hidrógeno liasa puede emplearse para convertir formiato a dióxido de carbono e hidrógeno. Una enzima formiato hidrógeno liasa ejemplar puede encontrarse en Escherichia coli. El formiato hidrógeno liasa de E. coli consiste de hidrogenasa 3 y formiato deshidrogenasa-H (Maeda et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890 (2007) ) . Esta se activa por el producto genético de fhlA (Maeda et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890 (2007) ) . La adición de los elementos traza, selenio, níquel y molibdeno, para un caldo de fermentación se ha mostrado para mejorar la actividad de formiato hidrógeno liasa (Soini, et al., Microb. Cell Fact. 07:26 (2008) ) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 88.

Tabla 88.

Una enzima formiato hidrógeno liasa también existe en la arquea hipertermof ílica , Thermococcus litoralis (Takacs et al., icrobiol 8:88 2008) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 89.

Tabla 89 Los sistema de formiato hidrógeno liasa adicionales se han encontrado en Salmonella typhi uriu , Klebsiella pneumoniae, Rhodospirillum rubru , Methanobacterium formicicum (Vardar-Schara et al, Microbial Biotechnology 1:107-125) ) Formiato Deshidrogenasa La actividad de formiato deshidrogenasa se encuentra presente en ambos de E. coli y Saccharomyces cerevísiae entre otros organismos. S. cerevisiae contiene dos formiato deshidrogenasas, FDH1 y FDH2, que catalizan la oxidación de formiato a C02 (Overkamp et al., Yeast 19:509-520 (2002)). En Moorella thermoacetica, los lugares, Moth_2312 y Moth_2313, son actualmente un gen que es responsable de codificar la subunidad alfa de formiato deshidrogenasa, mientras que la subunidad beta se codifica por Moth_2314 (Andreesen et al., J. Bacteriol . 116:867-873 (1973); Li et al, J. Bacteriol. 92:405-412 (1966); Pierce et al, Environ. Microbiol (2008) y Yamamoto et al., J. Biol . Chem. 258: 1826-1832 (1983)). Otro conjunto de genes que codifican la actividad de formiato deshidrogenasa se codifican por Sfum_2703 hasta Sfum_2706 en Syntrophobacter fumaroxidans (de Bok, et al, Eur. J. Bioche 270:2476-2485 (2003); y Reda et al, Proc. Nati. Acad. Sci U.S. A 105: 10654-10658 (2008)). Similar a su contraparte M. thermoacetica, Sfum_2705 y Sfum_2706 son actualmente un gen. E. coli que contiene múltiples formiato deshidrogenasas. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 90.

Tabla 90.

Piruvato Deshidrogenasa El complejo de piruvato deshidrogenasa, que cataliza la conversión de piruvato a acetil-CoA, se ha estudiado extensivamente. El complejo S. cerevisiae consiste de un E2 (LATI) que enlaza El (PDAl, PDBl) , E3 (LPD1) , y compuestos de proteina X (PDX1) (Pronk et al, 12 :1607-1633 (1996) ) . En la enzima E. coli, los residuos específicos en el componente El son responsables de la especificidad de sustrato (Bisswanger J Biol Chem. 256:815-822 (1981) ; Bremer J BioChem 8:535-540 (1969) y Gong et al, J Biol Chem 275: 13645-13653 (2000) ) . Los esfuerzos de ingeniería han mejorado la actividad de enzima PDH de E. coli bajo condiciones anaerobias (Kim et al., Appl . Environ Microbiol 73 :1766-1771 (2007) , Kim et al, J. Bacteriol . 190:3851-3858 (2008) y Zhou et al., Biotechnol. Lett. 30:335-342 (2008)). En contraste con el PDH de E. coli, el complejo B. subtilis es activo y se requiere para el crecimiento bajo condiciones anaerobias (Wakano et al., J. Bacteriol. 179:6749-6755 (1997)). La PDH de Klebsiella pneumoniae, caracterizada durante el crecimiento de glicerol, también es activa bajo condiciones anaeróbicas (Menzel et al., J. Biotechnol 56:135-142 (1997)). Las estructuras de cristal del complejo de enzima de riñon bovino (Zhou et al., Proc. Nati. Acad. U.S. A. Un 98:14802-14807 (2001)) y el dominio catalítico E2 de Azotobacter vinelandii se encuentran disponibles (Mattevi et al. Science 255:1544-1550 (1992)). Algunos complejos de enzimas PDH de mamífero pueden reaccionar en sustratos alternos tales como 2-oxobutanoato (Paxton et al., BioChem. J. 234:295-303 (1986) ) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 1.

Tabla 91.

Piruvato Ferredoxin Oxidorreductasa La piruvato ferrodoxin oxidorreductasa (PFOR) cataliza la oxidación de piruvato para formar acetil-CoA. La PFOR de Desulfovibrio africanus se ha clonado y expresado en E. coli que resulta en una enzima recombinante activa que fue estable durante varios días en la presencia de oxígeno (Pieulle et al., J. Bacteriol. 179:5684-5692 (1997)). La estabilidad de oxígeno es relativamente poco común en PFORs y se cree que se confiere mediante 60 extensiones de residuos en la cadena de polipéptido de la enzima D. africanus. La PFOR M. thermoacetica también se encuentra bien caracterizada (Menon et al., BioChemistry 36:8484-8494 (1997)) y se muestra incluso para tener alta actividad en la dirección de síntesis de piruvato durante el crecimiento autotrófico (Furdui et al., J. Biol Chem. 275:28494-28499 (2000)). Además, E. coli posee un marco de lectura abierta poco caracterizado, ydbK, que codifica una proteína que es 51% idéntica a la PFOR M. thermoacetica . La evidencia de actividad oxidorreductasa piruvato en E. coli se ha descrito (Blaschkowski et al. J. BioChem. 123:563-569 (1982)). Diversas enzimas PFOR adicionales se describen en la siguiente revisión (Ragsdale, Chem. Rev. 103:2333-2346 (2003)). Finalmente, la flavodoxin reductasas (por ejemplo, fqrB de Helicobacter pylori o Campylobacter jejuni (St Maurice et al., J. Bacteriol . 189:4764-4773 (2007)) o proteínas tipo R F (Herrmann et al., J. Bacteriol. 190:784-791 (2008); y Seedorf et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A. 105:2128-2133 (2008)) proporciona un medio para generar NADH o NADPH a partir de ferredoxina reducida generada mediante PFOR. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 92.

Tabla 92.

Semialdehído deshidrogenasa succínico (CoA-dependiente) El semialdehído deshidrogenasa succínico (CoA-dependiente) , también se refiere como una succinil-CoA reductasa, es una Oxidorreductasa dependiente de CoA- y NAD (P)H que reduce succinil-CoA en su aldehido correspondiente. Enzimas ejemplares se codifican por el gen sucD en Clostridium kluyveri (Sohling et al , J" Bacterial 178:871-80 (1996); y Sohling et al, J Bacterial 178:871-880 (1996)) y el gen sucD de P. gingivalis (Takahashi et al., J. Bacteriol . 182:4704-4710 (2000)). Otras enzimas que catalizan reacciones similares son las acil-CoA reductasas grasas de Acínetobacter calcoaceticus (Reiser et al., Journal of Bacteriology 179:2969-2975 (2007)) y Acinetobacter sp. M-l (Ishige et al., Appl . Environ. Microbiol . 68:1192-1195 (2002)), y el acetaldehído deshidrogenasa acilante en Pseudomonas sp, que se ha demostrado para oxidizar y acilar acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído, isobutiraldehído y formaldehído (Powlowski et al., J. Bacteriol. 175:377-385 (1993) ) . Además de reducir acetil-CoA a etanol, la enzima codificada por adhE en Leuconostoc mesenteroides se ha mostrado para oxidar el compuesto de cadena ramificada isobutiraldehído en isobutiril-CoA (Koo et al., Biotechnol Lett. 27:505-510 (2005) ) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 93.

Tabla 93 4-hidroxibutirato deshidrogenasa 4-hidroxibutirato deshidrogenasa cataliza la reducción dependiente de NAD (P)H de semialdehído succínico a 4-HB. Las enzimas que inhiben esta actividad se encuentran en Ralstonia eutropha (Bravo et al., J. Forensic Sci . 49:379-387 (2004) ) , Clostridium kluyveri (wolff et al., Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995) ) y Arabidopsis thaliana (Breitkreuz et al., J. Biol. Chem. 278:41552-41556 (2003) ) . Aún otro gen es el alcohol deshidrogenasa adhl de Geobacillus thermoglucosidasius (Jeon et al, J Biotechnol 135:127-133 (2008)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 94.

Tabla 94. 4-Hidroxibutiril-CoA transferasa La conversión de 4-HB a 4-hidroxibutiril -CoA se cataliza por una enzima con actividad 4-hidroxibutiril-CoA transferasa. Las enzimas candidatas incluyen los productos de gen de catl , cat2, y cat3 de Clostridium kluyveri que se han mostrado para exhibir succinil-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA, y actividad butiril-CoA transferasa, respectivamente (Gerhardt et al., Arch. Microbiol 174:189-199 (2000); Arikawa et al, Microbiol Lett 165: 111-116 (1998) y Sohling et al., J. Bacteriol 178:871-880 (1996)). Las actividades de CoA transferasa similares también se encuentran presentes en Trichomonas vaginalis (van Grinsven et al., J. Biol . Chem. 283:1411-1418 (2008)) y Trypanosoma brucei (Riviere et al., J. Biol. Chem. 279:45337-45346 (2004)). En los genes atoA y atoD de E. coli codifican un acetoacetil-CoA transferasa con un margen de sustrato amplio (Sramek et al, Arch. BioChem Biophys 171:14-26 (1975) ) . Esta enzima se ha mostrado que transfiere una porción de CoA de acetil-CoA a una variedad de sustratos ramificados y lineales incluyendo isobutirato (Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992) ) , valerato (Vanderwinkel et al., BioChem Biophys Res. Commun. 33:902-908 (1968) ) y butanoato (Vanderwinkel et al., BioChem. Biophys. Res. Commun. 33:902-908 (1968) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 95.

Tabla 95. 4-Hidroxibutiril-CoA sintetasa La conversión de 4-HB a 4-hidroxibutiril-CoA también puede catalizarse mediante una ligasa tiol de ácido CoA, como se muestra en la sintetasa de CoA. Las enzimas que catalizan esta transformación exacta no se an caracterizado hasta la fecha; sin embargo, diversas enzimas con especificidad de sustrato amplio se han descrito en la literatura. Un candidato ejemplar es la enzima codificada por sucCD en E. coli, que, cataliza naturalmente la formación de succinil-CoA a partir de succinato con el consumo concomitante de un ATP, una reacción que es reversible in vivo (Buck et al., BioChemistry 24:6245-5252 (1985) ) . Los candidatos CoA-ligasa adicionales incluyen el fenilacetato-CoA ligasa que forman el ADP a partir de P. chrysogenum ( Lamas-Maceiras et al, BioChem J 395:147-155 (2006) ; y Wang et al, BioChem Biophys Res. Commun . 360:453-458 (2007) ) y la pimeloil-CoA ligasa de Pseudomonas mendocina. La enzima que forma AMP a partir de Pseudomonas mendocina, clonadas en E. coli, se mostraron para aceptar los sustratos alternos de hexandioato y nonanedioato (Binieda et al., BioChem. J 340 (Pt 3) :793-801 (1999) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 96. Los candidatos de enzima CoA sintetasa identificadas para acetoacetil-CoA sintetasa, succinil-CoA sintetasa, propionil-CoA sintetasa, 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa, 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, metilmalonil-CoA sintetasa y metacrilil-CoA sintetasa también se aplican aquí.

Tabla 96. 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) 4-hidroxibutiril-CoA reductasa cataliza la reducción dependiente de NAD (P)H de 4-hidroxibutiril-CoA a 4-hidroxibutiraldehido . Las enzimas que exhiben esta actividad incluyen enzimas semialdehido deshidrogenasa succinato codificadas por el gen sucD en Clostridium kluyverí (Sohling et al, J Bacteriol 178:871-80 (1996); y Sohling et al, J Bacteriol 178:871-880 (1996)) y sucD de P. gingivalis (Takahashi et al., J. Bacteriol. 182:4704-4710 (2000)). Las enzimas butiraldehído deshidrogenasa, se encuentran en organismos solventogénicos tales como Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Kosaka et al, Biosci Biotechnol BioChem 71:58-68 (2007)), se cataliza una reacción similar: conversión de butiril-CoA a butiraldehído. El acetaldehído deshidrogenasa que acetila la enzima en Pseudomonas sp, codificada por bphG, es aún otro candidato como se ha demostrado para oxidizar y acilar acetaldehído, propionaldehído , butiraldehído, isobutiraldehído y formaldehído (Powlowski et al., J". Bacteriol. 175:377-385 (1993)). Las enzimas acil-CoA reductasa grasas a partir de AciiietOjacter calcoaceticus (Reiser et al., Journal oí Bacteriology 179:2969-2975 (1997)) y Acinetobacter sp. M-l (Ishige, et al., Appl . Environ. Microbiol . 68:1192-1195 (2002)) catalizan reacciones similares. Además de reducir el acetil-CoA a etanol, la enzima codificada por adhE en Leuconostoc mesenteroides se ha mostrado que oxidiza el compuesto de cadena ramificada isobutiraldehído a isobutiril-CoA (Koo et al., Biotechnol Lett . 27:505-510 (2005)). Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 97.

Tabla 97. 4-hidroxibutiraldehído reductasa La conversión de 4-hidroxibutirilaldehido a 14-BDO se cataliza por un alcohol deshidrogenasa . Diversas deshidrogenasas nativas en E. coli tal como yqhD (Sulzenbacher et al., Journal of Molecular Biology 342:489-502 (2004)) exhiben una especificidad de sustrato amplio y son capaces de catalizar esta reacción. El producto gen de yqhD cataliza la reducción de acetaldehído, malondialdehído, propionaldehído, butiraldehído, y acroleína utilizando NADPH como el cofactor (Pérez et EL, J" Biol Chem. 283:7346-7353 (2008); y Pérez et al, J Biol. Chem. 283:7346-7353 (2008)).

Los candidatos de enzima adicionales que catalizan la conversión de un aldehido a alcohol incluyen alrA que codifica un alcohol deshidrogenasa de cadena media para C2-C14 (Tani et al., Appl . Environ. Microbiol . 66:5231-5235 (2000)), ADH2 de Saccharomyces cerevisiae (Atsumi et al., Nature 451:86-89 (2008)) y bdh I y II de C. acetobutilicum que convierte butiraldehído en butanol (Walter et al., Journal of Bacteriology 174:7149-7158 (1992)). El producto de gen adhA de Zymomonas mobilis ha demostrado tener actividad en varios de los aldehidos que incluyen formaldehído, acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído, y acroleína (Kinoshita et al., Appl Microbiol Biotechnol 22:249-254 (1985)). Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 98.

Tabla 98. 4-Hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) La conversión de 4-hidroxibutiril-CoA a 14-BDO también puede catalizarse mediante una oxidorreductasa bifuncional con capacidades de aldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa . Por ejemplo, el producto de gen de adheEa a partir de los Clostridium acetobutilicum convierte butiril-CoA a butanol (Fontaine et al., J. Bacteriol. 184:821-830 (2002)). Esta enzima también acepta 4-hidroxibutiril-CoA como un sustrato. Las enzimas reductasa que forman alcohol bifuncionales adicionales incluyen los productos de gen de adhE en Leuconostoc esenteroides (Kazahaya et al, J. Gen. Appl . Microbiol. 18:43-55 (1972); y Koo et al, Biotechnol Lett 27: 505-510 (2005)) y FAR de Simmondsia chinensis ( etz et al., Plant Physiology 122:635-644 (2000) ) . Otra enzima ejemplar en la malonil-CoA reductasa de NADPH dependiente en Chloroflexus aurantiacus codificada por mcr (Hugler et al., J Bacteriol 184:2404-2410 (2002); y Strauss et al, Eur. J. BioChem 215:633-643 (1993)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 99.

Tabla 99. 4-hidroxibutirato fosfotransferasa (también conocida como cinasa) La 4-hidroxibutirato fosfotransferasa, también conocida como 4-hidroxibutirato cinasa, transforma 4-HB a 4-hidroxibutiril fosfato con hidrólisis concurrente de un ATP. Las enzimas candidato para catalizar estas transformaciones incluyen butirato cinasa, aspartocinasa, acetato cinasa y gaMAA-glutamil cinasa, Butirato cinasa (EC 2.7.2.7) enzimas que llevan a cabo la conversión reversible de butiril-fosfato a butirato durante acidogénesis en C. acetobutilicu/n (Cary et al, Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990)). Esta enzima se codifica por cualquiera de los dos productos de gen buk (Huang et & 1., J. Mol. Microbiol Biotechnol 2:33-38(2000)). Otras enzimas butirato cinasa se encuentran en C. butyricum y C. tetanomorphu (TWARONG et al., J Bacteriol 86:112-117 (1963)). La enzima de isobutirato cinasa relacionada a partir de Thermotoga marítima también se ha expresado en E. coli y cristalizado (Diao et al, D. Biol . Crystallogr 59:1100-1102 (2003); y Diao et al, J Bacteriol 191:2521-2529 (2009)). Aspartocinasa cataliza la fosforilación dependiente de ATP de aspartato y participa en la síntesis de diversos aminoácidos. La enzima aspartocinasa III en E. coli, codificada por lysC, tiene un margen de sustrato amplio y los residuos catalíticos implicados en la especificidad del sustrato se han dilucidado (Keng et al., Arch. Biochem. Biophys. 335:73-81 (1996)). Dos cinasas adicionales en E. coli también son buenos candidatos: acetato cinasa y gaMAA-glutamil cinasa. Acetato cinasa de E. coli, codificada por ackA (Skarstedt et al., J. Biol. Chem. 251:6775-6783 (1976)), fosforilatos propionatos además de acetato (Hesslinger et al., Mol. Microbiol 27 : 477-492 (1998)) . La gaMAA-glutamil cinasa de E. coli, codificada por proB (Smith et al., J. Bacterial. 157:545-551 (1984)), fosforila el grupo de ácido carbónico gaMAA de gluta ato. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 100.

Tabla 100.

Fosfotrans-4-hidroxibutirilasa La fosfotrans-4-hidroxibutirilasa intercambia la porción fosfato de 4-hidroxibutiril-fosfato para una porción de CoA, formando 4-hidroxibutiril-CoA. Una enzima candidato para esta transformación es fosfotransbutirilasa (EC 2.3.1.19) una enzima que convierte reversiblemente butiril-CoA en butiril-fosfato . Esta enzima se codifica mediante los genes ptb encontrados en C. acetobutylicum (Walter et al, Gene 134:107-111 (1993), y Wiesenborn et al, Appl Environ. Microbiol 55:317-322 (1989)), bacteria L2-50 que produce butirato (Louis et al., J. Bacteriol . 186:2099-2106 (2004)) y Bacillus megaterium (Vázquez et al., Curr. Microbiol 42:345-349 (2001) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 101.

Tabla 101. 4-Hidroxibutiril-fosfato reductasa La reducción de 4-hidroxibutiril-fosfato a su aldehido correspondiente se cataliza mediante fosfato reductasa. Esta reacción no se cataliza por enzimas conocidas, sino una reacción similar se cataliza mediante aspartato semialdehído deshidrogenasa (ASD, EC 1.2.1.11) : la reducción NADPH dependiente de 4-aspartil fosfato a aspartato-4-semialdehído . ASD participa en la biosíntesis de aminoácido y, recientemente, se ha estudiado como un antimicrobiano objetivo (Hadfield et al, Biochemistry 40:14475-14483 (2001) ) . La estructura ASD de E. coli se ha resuelto (Hadfield et al., J. Mol. Biol . 289:991-1002 (1999) ) y la enzima se ha mostrado que acepta el sustrato alterno beta-3-metilaspartil fosfato (Shames et al., J Biol Che 259:15331-15339 (1984) ) . La enzima Haemophilus influenzae ha sido el objeto de los estudios de ingeniería de enzima para alterar las afinidades de enlace de sustrato en el sitio activo (Blanco et al, Acta Crystallogr D. Biol . Crystallogr 60:1388-1395 (2004) , y Blanco et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:1808-1815 (2004)) . Otros candidatos ASD se encuentran en Mycobacterium tuberculosis (Shafiani et al, J Appl Microbiol 98:832-838 (2005)) , Methanococcus jannaschii (Faehnle et al, J Mol Biol. 353:1055-1068 (2005)), y los microorganismos infecciosos Vibrio cholera y Helicobacter pylori (Moore et al, Protein Expr. Purif. 25:189-194 (2002)) . Una enzima candidato relacionada es acetilglutamilfosfato reductasa (EC 1.2.1.38), una enzima que reduce naturalmente acetilglutamilfosfato a acetilglutamato-5-semialdehído, que se encuentra en S. cerevisiae (Pauwels et al., Eur . J Bioche . 270:1014-1024 (2003)), B . subtilis (O'Reilly and Devine, Microbiology 140 (Pt 5) : 1023-1025 (1994)) y otros organismos. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 102.

Tabla 102 Otras enzimas fosfato reductasa ejemplares incluyen gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa que convierten gliceraldehído-3-fosfato en D-glicerato 1 , 3-bifosfato (por ejemplo, E. coli gapA (Branlant et al, Eur. J. Biochem, 150:61-66 (1985) ) ) , N-acetil-gamma-glutamil-fosfato reductasa que convierte N-acetil-L-glutamato-5-semialdehído en N-acetil-L-glutamil-5-fosfato (por ejemplo, E. coli argC (Parsot et al., Gene, 68:275-283 (1988) ) ) , y glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa que convierte L-glutamato-5-semialdehído en L-glutamil-5-fosfato (por ejemplo, E. coli proA (Smith et al., J. Bacteriol . , 157 :545-551 (1984) ) ) . Los genes que codifican las enzimas glutamato-5-semialdehído deshidrogenasa a partir de Sal onella typhimurium (Mahan et al., J. Bacteriol, 156:1249-1262 (1983) ) y Campylobacter jejuni (Louie et al., Mol Gen. Genet, 240:29-35 (1993) ) se clonaron y expresaron en E. coli. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 103.

Tabla 103.

Succinato-reductasa y 4-hidroxibutirato reductasa La reducción directa de succinato a semialdehído succínico o 4-HB a 4-hidroxibutiraldehído puede catalizarse por un ácido carbox lico reductasa. El ácido carboxílico reductasa de Nocardia iowensis, conocido equivalentemente como aril-aldeh do deshidrogenasa, cataliza el magnesio, el ATP y la reducción NADPH-dependiente de ácidos carboxilicos a sus aldehidos correspondientes (Venkitasubramanian et al., J Biol. Chem. 282:478-485 (2007)) y es capaz de catalizar la conversión de 4-hidroxibutirato a 4-hidroxibutanal . Esta enzima, codificada por car, se clonó y expresó funcionalmente en E. coli (Venkitasubramanian et al., J Biol. Chem. 282:478-485 (2007)). Expresión de la actividad mejorada del producto de gen npt de la enzima mediante modificación post-transcripcional . El gen ntp codifica una fosfopanteteína transferasa específica (PPTasa) que convierte la apo-enzima inactiva a la holo-enzima activa. El sustrato natural de esta enzima es ácido vinílico y la enzima exhibe amplia aceptación de sustratos aromáticos y alifáticos (Venkitasubramanian et al "Biocatalytic Reduction of Carboxylic Acids: Mechanism and Applications". Chapter 15 in Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industries, ed. R.N. Patel , CRC Press LLC, Boca Ratón, FL (2006)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 104.

Tabla 104.

Genes car y npt adicionales pueden identificarse con base en homología de secuencia. Se muestran ejemplos no limitantes de proteínas codificadas por estos genes en la Tabla 105.

Tabla 105.

Un candidato enzima adicional encontrado en Streptomyces griseus está codificado por los genes griC y griD. Esta enzima se cree que convierte ácido 3-amino-4-hidroxibenzoico a 3-amino-4-hidroxibenzaldehído como supresión de cualquier griC o griD conduce a la acumulación de ácido 3-acetilamino-4-hidroxibenzoico extracelular , un producto de desviación de ácido de metabolismo de 3-amino-4-hidroxibenzoico (Suzuki et al., J. Antibiot. 60 ( 6 ) : 380-387 (2007) ) . Co-expresión de griC y griD con SGR_665, una enzima similar en secuencia en la Nocardia iowensis npt, puede ser beneficiosa. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 106.

Tabla 106.

Una enzima con características similares, alfa-aminoadipato reductasa (AAR, EC 1.2.1.31), participa en las rutas de biosíntesis de lisina en algunas especies de hongos. Esta enzima reduce naturalmente alfa-aminoadipato a alfa-aminoadipato semialdehído . El grupo carboxilo se activa primero a través de la formación de ATP-dependiente de un adenilato que luego se reduce por NAD ( P) H para producir el aldehido y AMP. Similar a CAR, esta enzima utiliza magnesio y requiere la activación de una PPTasa. Los candidatos de enzima para AAR y su PPTasa correspondientes se encuentran en Saccharomyces cerevisiae (Morris et al., Gene 98:141-145 (1991)), Candida albicans (Guo et al., Mol. Genet. Genomics 269:271-279 (2003)), y Schizosaecharomyees po be (Ford et al, Curr Genet 28:131-137 (1995)). La AAR de S. pombe exhibió actividad significativa cuando se expreso en E. coli (Guo et al, Yeast 21:1279-1288 (2004)). La AAR de Penicilliu chrysogenum acepta S-carboximetil-L-cisteína como un sustrato alternativo, pero no reaccionó con adipato, L-glutamato o diaminopimelato (Hijarrubia et al., J. Biol . Chem. 278:8250-8256 (2003)). El gen que codifica la P. chrysogenum PPTasa no se ha identificado hasta la fecha y no se identificaron aciertos de alta confidencia mediante búsqueda de homología de comparación de secuencia. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 107.

Tabla 107. 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa La 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa cataliza la conversión reversible de 4-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA . Esta enzima posee una actividad vinilacetil-CoA ?-isomerasa intrínseca, cambiando el doble enlace de la posición 3,4 a la posición 2,3 (Scherf et al, Eur J BioChem 215:421-429 (1993); y Scherf et al., Arch. Microbiol 161 :239-245 (1994)). Se purificaron las enzimas 4-hidroxibutirul-CoA deshidratasa de C. aminojbutyricujtt y C. kluyveri , caracterizadas, y secuenciadas en el N-terminal (Scherf et al, Eur. J BioChem. 215:421-429 (1993), y Scherf et al, Arch. Microbiol 161:239-245 (1994)). La enzima C. kluyveri, codificada por abfD, se clonó, secuenció y expresó en E. coli (Gerhardt et al, Arch.

Microbiol 174 : 189 - 199 ( 2000 ) ) . El producto del gen abfD Porphyro onas gingivalis ATCC 33277 se relaciona estrechamente por homología de secuencia en los productos del gen Clostridial . Estos genes /proteínas se identificaron en lo siguiente en la Tabla 108 .

Tabla 108 .

Crotonasa La 3-hidroxibutiril-CoA deshidratasa (EC 4.2.1.55), también llamada crotonasa, es una enoil-CoA hidratasa que se deshidrata en forma reversible de 3-hidroxiisobutiril-CoA para formar crotonil-CoA. Las enzimas crotonasa son necesarias para la formación de n-butanol en algunos organismos, particularmente especias Clostridial, y también comprenden una etapa del ciclo 3-hidroxipropionato/4-hidroxibutirato en Arquea termoacidofí lica del género Sulfolobus , Acidianus , y Metallosphaera . Genes ejemplares que codifican enzimas crotonasa pueden encontrarse en C. acetobutilicum (Atsumi et al, Metab Eng. 10:305-311 (2008); y Boynton et al., J Bacteriol. 178:3015-3024 (1996)), C. kluyveri (Hillmer et al., FEBS Lett. 21:351-354 (1972)..), y Metallosphaera Sedula (Berg et al., Science 318:1782-1786 (2007)), aunque la secuencia del último gen no se conoce. La enoil-CoA hidratasa de Pseudomonas putida, codificada por ech, cataliza la conversión de crotonil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA (Roberts et al., Arch. Mícrobiol 117:99-108 (1978)). Candidatos enoil-CoA hidratasa adicionales son phaA y phaB, de P. putida, y paaA y paaB de P. fluorescens (Olivera et al., Proc . Nati. Acad. Sci . U.S. A. 95:6419-6424 (1998)). Por último, un número de genes Escherichia coli han sido mostrados para demostrar la funcionalidad enoil-CoA hidratasa incluyendo maoC (Park et al., J" . Bacteriol . 185:5391-5397 (2003)), paaF (Ismail et al., Eur. J BioChew. 270:3047-3054 (2003); Park et al., Appl . BioChem Biotechnol 113-116:335-346 (2004) y Park et al, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)) y paaG (Ismail et al., Eur. J BioChem 270:3047-3054 (2003); Park et al., Appl. BioChem Biotechnol 113-116:335-346 (2004) y Park et al., Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)). Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 109.

Tabla 109. 3-hidroxibutiril Co-A reductasa (formación de aldehido) La 3 -hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa cataliza la reducción NAD ( P) H dependiente de 3-hidroxibutiril-CoA a 3-hidroxibutiraldehído . No se ha identificado hasta la fecha una enzima que catalice esta transformación. Un Aldehido deshidrogenasa de CoA-acilación ejemplar es el gen ald de Clostridium beijerinckii (Toth et al., Appl Environ. Microbiol 65:4973-498? (1999) ) . Esta enzima se ha reportado que reduce acetil-CoA y butiril-CoA a sus aldehidos correspondientes. Otra enzima que convierte un acil-CoA a su aldehido correspondiente es malonil-CoA reductasa que transforma malonil-CoA a semialdehido malónico. Malonil-CoA reductasa es una enzima clave en la fijación autotrófica de carbono mediante el ciclo de 3-hidroxipropionato en bacteria termoacidofilica archael (Berg et al, Science. 318: 1782-1786 (2007) , y Thauer, Science 318:1732-1733 (2007) ) . La enzima utiliza NADPH como un cofactor y se ha caracterizado en Metallosphaera y Sulfolobus spp (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); y Hugler et al., J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002)). La enzima se codifica por Msed_0709 en Metallosphaera sedula (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006); Berg et al., Science 318:1782-1786 (2007)). un gen que codifica una malonil-CoA reductasa de Sulfolobus tokodaii se clonó y se expresó de forma heterologa en E. coli (Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559 (2006)). Esta enzima también ha mostrado · catalizar la conversión de metilmalonil-CoA a su aldehido correspondiente (WO/2007/141208) . Los candidatos de la enzima aldehido deshidrogenasa para convertir 4-hidroxibutiril-CoA a 4-hidroxibutiraldehído, descritos en lo anterior, también se aplican aquí. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 110.

Tabla 110. 3-Hidroxibutiraldehído reductasa Se requiere una enzima con actividad 3-hidroxibutiraldehído reductasa para convertir 3-hidroxibutiraldehído a 1 , 3-butandiol . Genes ejemplares que codifican enzimas que catalizan la conversión de un aldehido a alcohol (es decir, alcohol deshidrogenasa o equivalentemente aldehido reductasa) incluyen alrA que codifica un alcohol deshidrogenasa de cadena media para C2-C14 (Tani et al., Appl . Environ. Microbiol. 66:5231-5235 (2000)), ADH2 de Saccharomyces cerevisiae (Atsumi et al., Nature 451:86-89 (2008)), yqhD de E. coli que tiene preferencia por las moléculas más grandes que C(3) (Sulzenbacher et al., Journal oí Molecular Biology 342:489-502 (2004)), y bdh I y bdh II de C. acetobutylicum que convierte butiraldehído en butanol (Walter et al., Journal of Bacteriology 174:7149-7158 (1992)). El producto del gen de yqhD cataliza la reducción de acetaldehido , malondialdeh do , propionaldehído , butiraldehído, y acroleína usando NADPH como el cofactor (Pérez et al., J Biol Chem. 283:7346-7353 (2008); y Pérez et al., J Biol. Chem. 283:7346-7353 (2008)). El producto del gen aóhA de Zymomonas mobilis ha demostrado tener actividad en un número de aldehidos incluyendo formaldehído , acetaldehido, propionaldehído, butiraldehído, y acroleína (Kinoshita et al., Appl Microbiol Biotechnol 22:249-254 (1985)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 111.

Tabla 111.

Candidatos adicionales incluyen enzimas 4-hidroxibutirato deshidrogenasa y 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa . La enzimas 4-hidroxibutirato deshidrogenasa naturalmente convierten 4-hidroxibutiraldehído a 4-HB y se han caracterizado en Ralstonia eutropha (Bravo et al., J. Forensic Sci. 49:379-387 (2004)), Clostridium kluyveri (Wolff et al., Protein Expr . Purif. 6:206-212 (1995)) y Arabidopsis thaliana (Breitkreuz, et al., J. Biol . Chem. 278:41552-41556 (2003)). Candidatos de enzima 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa incluyen mmsB desde Pseudomonas aeruginosa PAOl (Gokam et al., patente de los Estados unidos 7393676 (2008)), nunsB de Pseudomonas putida KT2440 (118) y mmsB de Pseudomonas putida E23 (Chowdhury, et al., Biosci . Biotechnol. BioChem. 60:2043-2047 (1996)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 112.

Tabla 112. 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (formación de alcohol) Se requiere una oxidoreductasa bifuncional para la conversión directa de 3-hidroxibutiril-CoA a 1 , 3-butandiol . Enzimas ejemplares que convierten un acil-CoA a alcohol incluyen aquellos que transforman sustratos tales como acetil-CoA a etanol (por ejemplo, adhE de E. col i (Kessler et al., FEBS. Lett. 281:59-63 (1991))), butiril-CoA a butanol (por ejemplo adhE2 de C. acetobutllicu (Fontaine et al., J. Bacteriol. 184:821-830 (2002))) y 4-hidroxibutiril-CoA a 1,4-butandiol (véanse candidatos en la sección anterior) . La jojoba (Si ondsia chinensis) FAR codifica un acil-CoA reductasa grasa que forma alcohol. Este gen se clonó y sobreexpresó en E. coli, resultando en actividad FAR y la acumulación de alcohol graso (Metz et al., Plant Physiology 122:635-644 (2000)). Otra enzima ejemplar convierte malonil-CoA a 3-hidroxipropionato . Una enzima NADPH-dependiente, con esta actividad se ha caracterizado en Chloroflexus aurantiacus donde participa en el ciclo 3-hidroxipropionato (Hugler et al, J. Bacteriol 184:2404-2410 (2002); y Strauss et al., Eur. J. Biochem. 215:633-643 (1993) ) . Esta enzima, con una masa de 300 kDa, es altamente sustrato-específico y muestra poca similitud de secuencia a otras oxidoreductasas conocidas (Hugler et al., J. Bacteriol. 184:2404-2410 (2002) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 113.

Tabla 113. 3-hidroxibutiril-CoA transferasa La conversión de 3-hidroxibutiril-CoA a 3-hidroxi-butirato (3-HB) se cataliza por una CoA transferasa, hidrolasa, o sintetasa. Una enzima CoA transferasa que cataliza esta transformación específica no se ha identificado hasta la fecha. La enzima acil-CoA: acetato-CoA transferasa de E. coli, también conocida como acetato-CoA transferasa (EC 2.8.3.8) , ha mostrado transferir la porción CoA a acetato de una variedad de sustratos acil-CoA ramificados y lineales, incluyendo isobutirato (Matthies et al., Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992) ) , valerato (Vanderwinkel et al., BioChem. Biophys . Res Commun. 33:902-908 (1968) ) y butanoato (Vanderwinkel et al . , BioChem. Biophys. Res. Conmun. 33:902-908 (1968) ) . Esta enzima se codifica por atoA (subunidad alfa) y atoD (subunidad beta) en E. coli sp. K12 (Korolev et al., D Biol. Crystallogr. 58:2116-2121 (2002) ; y Vanderwinkel et al., BioChem Biophys. Res Conmun. 33:902-908 (1968) ) y actA y cg0592 en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Duncan et al., Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002)) . Existen enzimas similares en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Eikmanns et al., Mol. Gen. Gene . 218:330-339 (1989) ) , Clostridium acetobutilicum (Cary et al, Appl. Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990) ; y Wiesenborn et al, Appl. Environ. Microbiol 55:323-329 (1989) ) , y Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Kosaka et al., Biosci. Biotechnol BioChem. 71:58-68 (2007) ) . Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 114.

Tabla 114.

Los candidatos de gen CoA transferasa descritos para la propionil-CoA transferasa, metilmalonil-CoA transferasa, acetoacetil-CoA transferasa, metacrilil-CoA transferasa, 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, 4-hidroxibutiril-CoA transferasa y succinil-CoA transferasa también son aplicables aquí. 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa La 3-hidroxibutiril-CoA también puede convertirse a 3-HB por una CoA sintetasa (también conocida como ligasa o sintasa) . Un candidato ATP sintetasa es acetil-CoA sintetasa que forma ADP (ACD, EC 6.2.1.13), una enzima que acopla la conversión de ésteres acil-CoA a sus correspondientes ácidos con la síntesis concurrente de ATP. Aunque esta enzima no ha mostrado reaccionar con 3-hidroxibutiril-CoA como un sustrato, se han descrito varias enzimas con amplias especificidades de sustrato en la literatura. ACD I de Archaeoglobus fulgidus, codificada por AF1211, se mostró operar sobre una variedad de sustratos de cadena lineal y ramificada incluyendo isobutirato, isopentanoato, y fumarato (Musfeldt et al., J. Bacteriol . 184:636-644 (2002)). Un segundo ACD reversible en Archaeoglobus fulgidus , codificado por AF1983, también mostró tener un margen de sustrato amplio con alta actividad en compuestos cíclicos de fenilacetato e indolacetato (Musfeldt, et al., J". Bacteriol. 184:636-644 (2002) ) . La enzima de Haloarcula marismortui (anotado como una succinil-CoA sintetasa) acepta propionato, butirato, y ácidos de cadena ramificada (isovalerato e isobutirato) como sustratos, y se mostró que operan en las direcciones hacia adelante y hacia atrás (Brasen et al., Arch.. Microbiol 182:277-287 (2004)). El ACD codificado por PAE3250 de crenarchaeon hipertermof lilca Pyrobaculum aerophilum mostró el margen de sustrato más amplio de todos los ACDs caracterizados, reaccionando con acetil-CoA, isobutiril-CoA (sustrato preferido) y fenilacetilo CoA- (Brasen et al, Arch. Microbiol 182:277-287 (2004)). Sin embargo, la evolución o ingeniería dirigida puede ser necesaria para esta enzima para funcionar a la temperatura fisiológica del organismo huésped. Las enzimas de A. fulgidus , H. marismortui y P. aerophilum todos han sido clonados, expresados funcionalmente , y caracterizados en E. coli (Brasen et al, Arch. Microbiol 182:277-287 (2004); y Musfeldt et al, J. Bacteriol 184:636-644 (2002)). Un candidato adicional es la enzima codificada por sucCD en E. coli, que cataliza de forma natural la formación de succinil-CoA de succinato con el consumo concomitante de un ATP, una reacción que es reversible in vivo (Buck et al., Biochemistry 24:6245-6252 (1984)). Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 115.

Tabla 115.

Candidatos de genes CoA sintetasa descritos para propionil-CoA sintetasa, metílmalonil-CoA sintetasa, metacrilil-CoA sintetasa, acetoacetil-CoA sintetasa, 3 -hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa y succinil-CoA sintetasa también son aplicables aguí . 3-Hidroxibutiril-CoA hidrolasa Se requiere una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa para convertir 3-hidroxibutiril-CoA a 3-HB. La enzima 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa (EC 3.1.2.4) cataliza una transformación relacionada: la hidrólisis de 3 -hidroxiisobutiril-CoA. La 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa a partir de Homo sapiens también acepta 3-hidroxibutiril-CoA como un sustrato (Shimomura et al., Methods Enzymol . 324:229-240 (2000) ) . Esta enzima también se ha caracterizado en Rattus norvegicus (Shimomura et al . , J" Biol Chem. 269:14248-14253 (1994); y Shimomura et al, Methods Enzymol 324:229-240 (2000) ) . Los genes candidatos por homología de secuencia incluyen hibch de Saccharomyces cerevisiae y BC_2292 de Bacillus cereus . Estas proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 116. Candidatos de enzima CoA hidrolasa adicionales identificados para propionil-CoA-hidrolasa, metilmalonil-CoA hidrolasa, metacrilil-CoA hidrolasa, acetoacetil-CoA hidrolasa y 3-hidroxiisobutiril-CoA también son aplicables aquí. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 116.

Tabla 116. 3-hidroxibutirato reductasa La reducción de 3-hidroxibutirato a 3 -hidroxibutiraldehído se cataliza por un ácido carboxílico reductasa. Candidatos de enzima ejemplares para succinato reductasa y 4-hidroxibutirato reductasa también son aplicables aquí. 4-hidroxibutiril-CoA mutasa La conversión de 4HB-CoA a 3-hidroxiisobutiril-CoA se cataliza por una metilmutasa. Tal conversión aún no se ha demostrado experimentalmente . Sin embargo, dos metilmutasas (es decir, isobutiril-CoA mutasa y metilmalonil-CoA mutasa) que catalizan reacciones similares son candidatos prometedores dada la similitud estructural de sus sustratos correspondientes .

Metilmalonil-CoA mutasa (MCM) es una enzima dependiente de cobalamina que convierte naturalmente succinil-CoA a metilmalonil-CoA. En E. coli, la mutasa dependiente de adenosilcobalamina reversible participa en una ruta de tres etapas que conduce a la conversión de succinato a propionato (Haller et al., BioChemistry 39:4622-9 (2000)). MCM está codificado por los genes scpA en Escherichia coli (Bobik et al, Anal Bioanal Chem 375:344-349 (2003); y Haller et al., BioChemistry 39:4622-4629 (2000)) y mutA en Homo sapiens ( Padovani et al., BioChemistry 45:9300-9306 (2006)). En varios otros organismos MCM contiene subunidades alfa y beta y se codifica por dos genes. Candidatos de genes ejemplares que codifican la proteína de dos subunidades son Propionibacterium freudenreichii sp. shermanii mutA y mutB (Korotkova et al, J Biol Chem 279:13652-13658 (2004)) y Methylobacterium extorquens mcmA y mcmB (Korotkova et al . , J Biol Chem. 279:13652-13658 (2004)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 117.

Tabla 117.

Candidatos de enzima adicional identificados con base en elevada homología al producto del gen de E. coli spcA incluyen aquellos identificados en lo siguiente en la Tabla 118 .

Tabla 118 .

Existe evidencia adicional que los genes adyacentes a los genes catalíticos de metilmalonil-CoA mutasa también son necesarios para la actividad máxima. Por ejemplo, se ha demostrado que el gen de meaB de M. extorquens forma un complejo con metilmalonil-CoA mutasa, estimula in vitro la actividad mutasa, y posiblemente la protege de la inactivación irreversible (Korotkova et al . , J Biol . Chem. 279 : 13 652 - 13 . 658 ( 2004 ) ) . El producto del gen M. extorquens meaB es muy similar al producto del gen E. coli argK (BLASTp : 45% de identidad, e-valor: 4e-67) que está adyacente a scpA en el cromosoma. Ninguna secuencia para un homólogo de meanB en P. freudenreichii está catalogado en el GenBank. Sin embargo, la Propionibacterium acnés KPA171202 producto del gen en el locus PPA0597 es 51% idéntica a la proteína M. extorquens meaB y su gen también está adyacente al gen metilmalonil-CoA mutasa en el cromosoma. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla Tabla 119.

Alternativamente, isobutiril-CoA mutasa (ICM) podría catalizar la transformación propuesta. ICM es una metilmutasa dependiente de cobalamina de la familia MCM que reordena reversiblemente la estructura principal de carbono de butiril-CoA en isobutiril-CoA (Figura 7B de Ratnatilleke, J Biol Chem. 274:31679-31685 (1999)). Un estudio reciente de un ICM novedoso en Methylibíum petroleiphilum, junto con el trabajo previo, proporciona evidencia que cambiando un aminoácido sencillo cerca al sitio activo altera la especificidad de sustrato de la enzima (Ratnatilleke et al., J Biol Chem. Biol . 274:31679-31685 (1999); y Rohwerder et al , Appl Environ Microbiol 72:4128-4135 (2006)). Esto implica que si una enzima nativa es incapaz de catalizar la conversión de 4HB-CoA a 3HIB-CoA, la enzima podría experimentar ingeniería racional. Genes ICM ejemplares que codifican enzimas homodiméricas incluyen icmA en Streptomyces coelicolor A3 (2) y Mpe_B0541 en Methylibium petroleiphilum PMl (Ratnatilleke et al., J Biol Chem. 274:31679-31685 (1999); y Rohwerder et al., Appl Environ Microbiol 72:4128-4135 (2006)). Genes que codifican enzimas heterodiméricas incluyen icm e icmB en Streptomyces cinnamonensis (Ratnatilleke, et al., J Biol Chem. 274:31679-31685 (1999);. Vrijbloed et al., J Bacteriol . 181:5600-5605 (1999) y Zerbe-Burkhardt et al . , J Biol Chem. 273:6508-6517 (1998)). Las enzimas codificadas por genes icmA y icmB en Streptomyces avermitilis MA- 4680 muestran alta similitud de secuencia a ICM conocidas. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 120.

Tabla 120. 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa La siguiente etapa en esta ruta implica la conversión de 3 -hidroxiisobutiril-CoA en 3 -hidroxiisobutirato (3-HIB) por una Coa transferasa. Una enzima que cataliza esta transformación específica no se ha identificado hasta la fecha. La enzima acil-CoA: acetato-CoA transferasa de E. coli, también conocida como acetato-CoA transferasa (EC 2.8.3.8), ha mostrado transferir la porción CoA al acetato a partir de una variedad de sustratos de acil-CoA ramificados y lineales, incluyendo isobutirato (Matthies et al, Appl Environ Microbiol 58:1435-1439 (1992)), valerato (Vanderwinkel et al., BioChem Biophys Res Commun. 33:902-908 (1968)) y butanoato (Vanderwinkel et al., BioChem Biophys Res Commun. 33:902-908 (1968)). Esta enzima está codificada por atoA (subunidad alfa) y atoD (subunidad beta) en E. coli sp. K12 (Korolev et al . , D Biol . Crystallogr. 58:2116-2121 (2002); y Vanderwinkel et al, BioChem Biophys Res Commun 33:902-908 (1968)) y actA y cg0592 en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Duncan et al., Appl Environ Microbiol 68:5186-5190 (2002)). Existen enzimas similares en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Eikmanns et al., Mol. Gen. Genet. 218:330-339 (1989)), Clostridium acetobutilicum (Cary et al, Appl. Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990); y Wiesenborn et al, Appl. Environ. Microbiol 55:323-329 (1989)), y Clostridium saccharoperbutylacetonicum (Kosaka et al., Biosci. Biotechnol BioChem. 71 : 58 - 68 ( 2007 ) ) . Candidatos de enzimas 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, descritos anteriormente, también son aplicables aquí. Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla Tabla 121 . 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa 3-hidroxiisobutiril-CoA también puede convertirse a 3-HIB por una CoA sintetasa (también conocida como ligasa o sintasa) . Una ATP sintasa candidato es acetil-CoA sintetasa formadora de ADP (ACD, CE 6 . 2 . 1 . 13 ) , una enzima que acopla la conversión de ésteres acil-CoA a sus ácidos correspondientes con la síntesis concurrente de ATP. Aunque esta enzima no ha mostrado reaccionar con 3-hidroxiisobutiril-CoA como sustrato, varias enzimas con especificidades de sustrato amplias se han descrito en la literatura. ACD I a partir de Archaeoglobus fulgidus, codificada por AF1211, se mostró operar en una variedad de sustratos de cadena lineales y ramificada incluyendo isobutirato, isopentanoato, y fumarato (Musfeldt et al., J. Bacteriol. 184:636-644 (2002)). Un segundo ACD reversible en Archaeoglobus fulgidus, codificado por AF1983, mostró también tener un margen de sustrato amplio con alta actividad en compuestos cíclicos de fenilacetato e indoleacetato (Musfeldt, et al., J. Bacteriol. 184:636-644 (2002)). La enzima de Haloarcula marismortui (anotada como una succinil-CoA sintetasa) acepta propionato, butirato, y ácidos de cadena ramificada (isovalerato e isobutirato) como sustratos, y mostró operar en las direcciones hacia adelante y hacia atrás (Brasen et al., Arch. Microbiol 182:277-287 (2004)). La ACD codificada por PAE3250 a partir de crenarchaeon hipertermofílico Pyrobaculum aerophilum mostró el margen de sustrato más amplio de todas las ACD caracterizadas, reaccionando con acetil-CoA, isobutiril-CoA (sustrato preferido) y fenilacetil-CoA (Brasen et al, Arch. Microbiol 182:277-287 (2004)). Sin embargo, la evolución dirigida o ingeniería puede necesitarse para esta enzima para operar a la temperatura fisiológica del organismo huésped. Las enzimas de A. fulgidus, H. marismortui y P. aerophilum todas han sido clonadas, expresadas funcionalmente, y caracterizadas en E. coli (Brasen et al Arch. Microbiol 182:277-287 (2004); y Musfeldt et al., J. Bacteriol 184:636-644 (2002) ) .

Un candidato adicional es la enzima codificada por sucCD en E. coli, que, cataliza naturalmente la formación de succinil-CoA a partir de succinato con el consumo concomitante de una ATP, una reacción que es reversible in vivo (Buck et al., BioChemistry 24 : 6245 - 6252 ( 1984 ) ) . Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 122 .

Tabla 122 . 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa La enzima 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa convierte selectivamente el 3-hidroxiisobutiril-CoA a 3-HIB durante la degradación de valina (Shimomura et al . , J Biol Chem 269 : 14248 - 53 ( 1994 ) ) . Los genes que codifican esta enzima se describieron previamente. 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa y el gen propionil-CoA candidatos, descritos previamente, también son aplicables aquí. 3-hidroxiisobutirato deshidratasa La deshidratación de 3-hidroxiisobutirato a ácido metilacrílico se cataliza por una enzima con actividad 3-hidroxiisobutirato deshidratasa . No se ha identificado evidencia directa para esta transformación enzimática especifica. Sin embargo, la mayoría de deshidratasas catalizan la alfa, beta-eliminación de agua, que involucra la activación de la alfa-hidrógeno mediante un carbonilo aceptor de electrones, carboxilato, o grupo CoA-tiol éster y la eliminación del grupo hidroxilo de la posición beta (Buckel et al., J Bacterial 117: 1248-1260 (1974); y Martins, et al., Proc Nati Acad Sci U S A 101:15645-9 (2004)). Este es el tipo exacto de transformación propuesto para la etapa final en la ruta de ácido metilacrílico . La transformación propuesta es muy similar a la 2- (hidroximetil ) glutarato deshidratasa de Eubacterium barkeri (Figura 3A) . Esta enzima ha sido estudiada en el contexto de catabolismo de nicotinato y está codificada por hmd (Alhapel et al., Proc Nati Acad Sci U S A 103:12341-6 (2006)). Una enzima con funcionalidad similar en E. barkeri es dimetilmaleato hidratasa, una enzima reversible dependiente de Fe+2 y sensible a oxígeno en la familia aconitasa que hidrata dimetilmaleato para formar (2R,3S)-2,3-dimetilmalato . Esta enzima está codificada por dmdAB (Alhapel et al., Proc Nati Acad Sci U S A. 103:12341-6 (2006); y Kollmann-Koch et al., Hoppe Seylers Z. Physiol Chem. 365:847-857 (1984)). Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 123.

Tabla 123 .

Un candidato enzima adicional es 2-metilmalato deshidratasa , también llamado citramalato hidroliasa, una hidroliase reversible que cataliza la eliminación alfa, beta de agua a partir de citramalato para formar mesaconato. Esta enzima ha sido estudiada en Methanocaldococcus jannaschii en el contexto de la ruta de piruvato a 2-oxobutanoato, donde se ha demostrado tener una especificidad de sustrato amplia (Drevland et al . , J Bacteriol. 189 : 43 91 - 4400 ( 2007 ) ) . Esta actividad de enzima también se detectó en Clostridium tetanomorphum, Morganella morganii, Citrobacter amalonaticus donde se cree que participan en la degradación del glutamato (Kato et al., Arch. Microbiol 168 : 457 - 463 ( 1997 ) ) . La secuencia de la proteína M. jannaschii no conlleva una homología significativa con los genes de estos organismos. Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 124 .

Tabla 124 .

Enzimas de fumarato hidratasa, que catalizan naturalmente la deshidratación de malato a fumarato, representan un conjunto adicional de candidatos. Aunque la capacidad de fumarato hidratasa para reaccionar en 3-hidroxiisobutirato como un sustrato no ha sido descrita, una gran cantidad de información estructural está disponible para esta enzima y otros investigadores han diseñado exitosamente la enzima para alterar la actividad, inhibición y localización (Weaver, D Biol . Crystallogr. 61:1395-1401 (2005)). E. coli tiene tres fumarasas : FumA, FumB y FumC que se regulan por las condiciones de crecimiento. FumB es sensible al oxígeno y solamente activa bajo condiciones anaeróbicas. FumA está activa bajo condiciones microanaeróbicas , y FumC es la única enzima activa en crecimiento aeróbico (Guest et al . , J Gen Microbiol 131:2971-2984 (1985). Tseng et al., J Bacteriol 183:461-467 (2001) y Woods et al., Biochim Biophys Acta 954:14-26 (1988)). Candidatos de enzimas adicionales se encuentran en Campylobacter jejuni (Smith et al., Int.. J Biochem. Cell Biol. 31 :961-975 (1999)), Thermus ther ophilus (Mizobata et al, Arc . BioChem Biophys 355:49-55 (1998)) y Rattus norvegicus (Kobayashi et al., J Biochem 89:1923-1931 (1981)). La fumarasa MmcBC de Pelotomaculum thermopropionicum es otra clase de fumarasa con dos subunidades (Shimoyama et al., FEMS Microbiol Lett 270:207-213 (2007)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 125.

Tabla 125. 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa La deshidratación de 3 -hidroxiisobutiril-CoA por una CoA deshidratasa produce metacrilil-CoA. La enoil-CoA hidratasa (CE 4.2.1.17) cataliza la deshidratación de sustratos de 3-hidroxiacil-CoA (Agnihotri y Liu., J". Bacterial. 188:8551-8559 (2003) ; Conrad et al., J. Bacteriol 118:103-111 (1974) ; y Roberts et al., Arch. Microbiol 117:99-108 (1978) ) . La enoil-CoA hidratasa (ECH) se encuentra en hígado de bovino acepta una variedad de substratos incluyendo metacrilil-CoA, 2- y 3-metil-crotonoilo-CoA, acriloil-CoA y 1-carboxiciclohexenoil-CoA- (Agnihotri et al., Bioorg Med Chem. , 11 (1) : 9-20 (2003 ) ) . Una enzima de ECH de hígado bovino recombinante ha sido sobreexpresada en E. coli y se encontró tener propiedades catalíticas similares (Dakoji et al., J. A . Chem. Soc, 123:9749 (2001) ) . La enoil-CoA hidratasa de Pseudomonas putida, codificada por ech, cataliza la conversión de 3-hidroxibutiril-CoA a crotonoil-CoA (Roberts et al., Arch. Microbiol 117:99-108 (1978)). Candidatos de enoil-CoA hidratasa adicionales son phaA y phaB, de P. putida, y paaA y paaB de P. fluorescens (Olivera et al., Proc. Nati. Acad. Sci . U.S. A 95:6419-6424 (1998)). El producto del gen de pimF en Rhodopseudowonas palustris se pronostica que codifica una enoil-CoA hidratasa que participa en la degradación pimeloil-CoA (Harrison y Harwood, Microbiology 151:727-736 (2005)). Por último, un número de genes de Escherichia coli han mostrado demostrar la funcionalidad enoil-CoA hidratasa incluyendo maoC (Park y Lee, J. Bacteriol. 185:5391-5397 (2003)), paaF (Ismail et al., J Biochem. 270:3047-3054 (2003), Park y Lee, Appl . Biochem Biotechnol 113-116:335-346 '(2004); y Park y Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)) y paaG (Ismail et al., J" Biochem. 270:3047-3054 (2003); Park y Lee, Appl Biochem Biotechnol 113-116:335-346 (2004) y Park y Yup, Biotechnol Bioeng 86:681-686 (2004)). Estos genes/proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 126.

Tabla 126.

Otro candidato enzima ejemplar para catalizar esta reacción es crotonasa. Candidatos de gen para esta enzima se describieron anteriormente. Alternativamente, los productos de gen E. coli de fadA y fadB codifican un complejo multienzima implicado en la oxidación de ácido graso que exhibe actividad enoil-CoA hidratasa (Nakahigashi e Inokuchi, Nucleic Acids Res. 18:4937 (1990); Yang, J. Bacteriol . 173:7405-7406 (1991); y Yang et al, Biochemistry 30:6788-6795 (1991)). Al destruir un regulador negativo codificado por fadR puede utilizarse para activar el producto del gen fadB (Sato et al., J Biosci. Bioeng 103:38-44 (2007)). Los genes fadl y fadJ codifican funciones similares y se expresan naturalmente bajo condiciones anaeróbicas (Campbell et al., Mol. Microbiol 47:793-805 (2003)). Estos genes /proteínas se identifican en lo siguiente en la Tabla 127.

Tabla 127 .

Metacrilil-CoA hidrolasa La conversión de metacrilil-CoA a MAA se cataliza por una CoA transferasa, sintetasa, o hidrolasa. Los candidatos de gen CoA hidrolasa descritos para propionil-CoA hidrolasa, metílmalonil-CoA hidrolasa, acetoacetil-CoA hidrolasa, 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa y 3 -hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa también son aplicables aquí.

Metacrilil-CoA transferasa La conversión de metacrilil-CoA a MAA se cataliza por una CoA transferasa, sintetasa, o hidrolasa. Candidatos de gen CoA transferasa descritos para propionil-CoA transferasa, metilmalonil-CoA transferasa, acetoacetil-CoA transferasa, 3 -hidroxibutiril-CoA transferasa, 3 -hidroxiisobutiril-CoA transferasa, 4-hidroxibutiril-CoA transferasa y succinil-CoA transferasa son aplicables aquí.

Metacrilil-CoA sintetasa La conversión de metacrilil-CoA a MAA se cataliza por una CoA transferasa, sintetasa, o hidrolasa. Candidatos de genes CoA sintetasa descritos para propionil-CoA sintetasa, metilmalonil-CoA sintetasa, acetoacetil-CoA sintetasa, 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa, 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa y succinil-CoA sintetasa son aplicables aquí.

Metilmalonil-CoA hidrolasa Metilmalonil-CoA se convierte a metilmalonato mediante metilmalonil-CoA hidrolasa (CE 3.1.2.17). Esta enzima, aislada de hígado de Rattus norvegícus, está también activa en malonil-CoA y propionil-CoA como sustratos alternativos (Kovachy et al., J. Biol . Chem. , 258:11415-11421 (1983)). El gen asociado con esta enzima no se conoce. Otros candidatos de enzima CoA hidrolasa para propionil-CoA hidrolasa, metacrilil-CoA hidrolasa, acetoacetil-CoA hidrolasa, 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa y 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa descritos en secciones previas, son aplicables aquí.

Metilmalonil-CoA transferasa Alternativamente, metilmalonil-CoA se convierte a metilmalonato por una CoA transferasa. Candidatos de gen CoA transferasa descritos para propionil-CoA transferasa, metacrilil-CoA transferasa, acetoacetil-CoA transferasa, 3-hidroxibutiril-CoA transferasa, 3 -hidroxiisobutiril-CoA transferasa, 4-hidroxibutiril-CoA transferasa y succinil-CoA transferasa son también aplicables aquí Metilmalonil-CoA sintetasa Aún otra enzima que forma metilmalonato a partir de metilmalonil-CoA es metilmalonil-CoA sintetasa. Los candidatos de gen COA sintetasa descritos para propionil-CoA sintetasa, metacrilil-CoA sintetasa, acetoacetil-CoA sintetasa, 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa, 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa y succinil-CoA sintetasa son aplicables aquí.

Metilmalonato reductasa La reducción de metilmalonato a semialdehído metilmalonato se cataliza por un ácido carboxílico reductasa. Candidatos de enzima ejemplares para enzimas de succinato reductasa y 4-hidroxibutirato reductasa también son aplicables aquí.

A lo largo de esta solicitud varias publicaciones se han citado. Las descripciones de estas publicaciones en su totalidad, incluyendo GenBank y publicaciones número GI, se incorporan por la presente para referencia en esta solicitud para describir más plenamente el estado de la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque la invención se ha descrito con referencia a los ejemplos proporcionados en lo anterior, debe entenderse que varias modificaciones pueden hacerse sin apartarse del espíritu de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol expresada en una cantidad suficiente para producir n-propanol, la trayectoria n-propanol que comprende: una propanol deshidrogenasa, una propionaldehído deshidrogenasa, una propionil-CoA : fosfato propanoi1transferasa, una propionil-CoA hidrolasa, una propionil-CoA transferasa, una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionato reductasa o una propionil fosfato reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol que comprende : una isopropanol deshidrogenasa, un acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, o una acetoacetato descarboxilasa.

2. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 1, que comprende además una trayectoria acetil-CoA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria acetil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, la trayectoria acetil-CoA que comprende: una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidorreductasa , una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima, o una formiato deshidrogenasa.

3. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 1, que comprende además una trayectoria propionil-CoA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria propionil-CoA que comprende: una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa, una succinil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA mutasa, una metilmalonil-CoA epimerasa o una metilmalonil-CoA descarboxilasa .

4. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 3, en donde la trayectoria propionil-CoA comprende además una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

5. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 1, que comprende además una trayectoria propionil-CoA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria propionil-CoA que comprende: una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una treonin desaminasa, o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa .

6. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 5, en donde la trayectoria n-propanol comprende además 2-oxobutanoato descarboxilasa .

7. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 1, que comprende además una trayectoria de propionil-CoA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria propionil-CoA que comprende: una acetil-CoA carboxilasa, una malonil-CoA reductasa, una malonato semialdehído reductasa o propionil-CoA sintasa.

8. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 1, que comprende además una trayectoria propionil-CoA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria propionil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, la trayectoria propionil-CoA que comprende: una lactato deshidrogenasa, una lactato-CoA transferasa, una lactil-CoA deshidratasa o acriloil CoA reductasa .

9. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transíerasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; un acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

10. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 9, que comprende además una trayectoria acetil-CoA que comprende un tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria acetil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una piruvato cinasa, y una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa.

11. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 9, que comprende además una trayectoria propionil-CoA que comprende un tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una malato deshidrogenasa; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; una metilmalonil-CoA mutasa, y una metilmalonil-CoA descarboxilasa .

12. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 11, en donde el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifica una metilmalonil-CoA epimerasa, una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

13. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 9, que comprende además una trayectoria propionil-CoA que comprende un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, dicho tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que comprende: una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una treonina desaminasa, y una 2-oxobutanoato deshidrogenasa .

14. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 13, en donde el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifica una o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa o una piruvato carboxilasa.

15. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 13, en donde el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifica una 2-oxobutanoato descarboxilasa.

16. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 9, que comprende además una trayectoria propionil-CoA que comprende un tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA carboxilasa, una malonil-CoA reductasa, una malonato semialdehído reductasa; y propionil-CoA sintasa.

17. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 9, que comprende además una trayectoria propionil-CoA que comprende un tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria propionil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir propionil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una lactato deshidrogenasa ; una lactato-CoA transferasa; una lactil-CoA deshidratasa , y acriloil CoA reductasa.

18. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una malato deshidrogenasa ; una fumarasa; una fumarato reductasa; una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa; una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA descarboxilasa , y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa, o un propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa y una propionil-fosfato reductasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil-fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: un piruvato cinasa; un piruvato deshidrogenasa o un piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa la enzima y un formiato deshidrogenasa; un acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

19. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 18, en donde el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifica una metilmalonil-CoA epimerasa, una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

20. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una PEP carboxicinasa o una PEP carboxilasa; una treonina desaminasa; y una 2-oxobutanoato descarboxilasa y una propanol deshidrogenasa; o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionaldeh do deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa, o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil- fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa, una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil-fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una 2-oxobutanoato deshidrogenasa , una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

21. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 20, en donde el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos además codifica una metilmalonil-CoA descarboxilasa o una piruvato carboxilasa.

22. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria n-propanol expresas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una piruvato cinasa; una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa; o una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA carboxilasa; una malonil-CoA reductasa; una malonato semialdehído reductasa; propionil-CoA sintasa; y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoil transíerasa, una propionil fosfato reductasa y propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil -CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil -fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

23. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria n-propanol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una lactato deshidrogenasa; una lactato-CoA transferasa; una lactil-CoA deshidratasa; acriloil CoA reductasa, y una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa , una propionil-fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil- fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa, o una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa la enzima y un formiato deshidrogenasa; una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

24. El organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en donde el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterologo.

25. El organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en donde el organismo microbiano de origen no natural está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.

26. Un método para producir n-propanol e isopropanol, que comprende cultivar un organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 1-23, bajo condiciones y durante un período de tiempo suficiente para producir n-propanol e isopropanol.

27. El método de la reivindicación 26, en donde las condiciones comprenden condiciones de cultivo sustancialmente anaeróbicas .

28. El método de la reivindicación 26, en donde el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterologo.

29. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol, la trayectoria n-propanol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria n-propanol expresada en una cantidad suficiente para producir n-propanol, la trayectoria n-propanol que comprende : una propanol deshidrogenasa, una propionaldehído deshidrogenasa, un propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa una propionil-CoA hidrolasa, una propionil-CoA transferasa, una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionato reductasa, o una propionil-fosfato reductasa.

30. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria n-propanol, la trayectoria n-propanol que comprende un conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria n-propanol expresadas en una cantidad suficiente para producir n-propanol, el conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una propionaldehído deshidrogenasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA: fosfato propanoiltransferasa, una propionil-fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil-CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato cinasa, una propionil fosfato reductasa y una propanol deshidrogenasa; o una propionil -CoA hidrolasa o una propionil-CoA transferasa o una propionil-CoA sintetasa, una propionato reductasa y una propanol deshidrogenasa.

31. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 29 ó 30, en donde el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterologo.

32. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 29 ó 30, en donde el organismo microbiano de origen no natural está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.

33. Un método para producir n-propanol, que comprende cultivar un organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 29 ó 30 bajo condiciones y durante un período de tiempo suficiente para producir n-propanol .

34. El método de la reivindicación 33, en donde las condiciones comprenden condiciones de cultivo sustancialmente anaeróbicas .

35. El método de la reivindicación 33, en donde el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterologo.

36. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresada en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende : una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, una succinil- CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (formador de aldehido), 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa, una 4-hidroxibutirato reductasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, o una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (formador de alcohol); la trayectoria isopropanol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol que comprende : una isopropanol deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, o una acetoacetato descarboxilasa .

37. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3 -butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3 -butandiol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresada en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende : una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, una succinil- CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenase, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa, una crotonasa, una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa, una 3-hidroxibutirato reductasa, una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (formador de aldehido), o una 3 -hidroxibutiril-CoA reductasa (formador de alcohol ) ; la trayectoria isopropanol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol que comprende: una isopropanol deshidrogenasa, una acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, o una acetoacetato descarboxilasa.

38. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria del ácido metilacrílico expresada en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende: una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa, una succinil-CoA reductasa, una succinato reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa, una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa, una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa, una metacrilil-CoA hidrolasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa, una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, una metilmalonil-CoA mutasa, una metilmalonil-CoA epimerasa, una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa, una metilmalonil-CoA hidrolasa, una metilmalonato reductasa, una metilmalonil-CoA reductasa (formador de aldehido), una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, una metilmalonil-CoA reductasa (formador de alcohol) o una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa ; la trayectoria isopropanol que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria isopropanol expresada en una cantidad suficiente para producir isopropanol, la trayectoria isopropanol que comprende : una isopropanol deshidrogenasa, un acetil-CoA acetil tiolasa, una acetoacetil-CoA transferasa, una acetoacetil-CoA hidrolasa, una acetoacetil-CoA sintetasa, o una acetoacetato descarboxilasa .

39. El organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 36-38, que comprende además una trayectoria acetil-CoA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria acetil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, la trayectoria acetil-CoA que comprende: una piruvato cinasa, una piruvato deshidrogenasa, una piruvato ferredoxin oxidorreductasa , una piruvato formiato liasa, una piruvato formiato liasa que activa la enzima, o una formiato deshidrogenasa.

40. El organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 36-38, que comprende además una trayectoria succinil-CoA que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica una enzima de trayectoria succinil-CoA expresada en una cantidad suficiente para producir succinil-CoA, la trayectoria succinil-CoA que comprende: una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa, una fumarasa, una fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa o una succinil-CoA sintetasa.

41. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 40, en donde la trayectoria succinil-CoA comprende además una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa .

42. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica una enzima de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresada en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa ( formador de aldehido), y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o un acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

43. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato reductasa; y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

44. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) ; y una 4-hidroxibutiraldehido reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o un acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa ; y una isopropanol deshidrogenasa.

45. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa; y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o un acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

46. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

47. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa, y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir el isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o un acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

48. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

49. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato reductasa; y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa;- una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

50. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 4-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

51. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , -butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa ; una 4-hidroxibutirato cinasa, una 4-hidroxibutiril-fosfato reductasa; y una 4-hidroxibutiraldehido reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

52. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , -butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , -butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

53. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 4-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 4-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 4-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 4-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; y una 4-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

54. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinil-CoA reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa, una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (formación de aldehido); y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

55. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinil-CoA reductasa, una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa; una 3 -hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3 -hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3-hidroxibutirato reductasa, y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

56. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa ; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (formación de aldehido) ; y una 3 -hidroxibutiraldehido reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

57. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3 -butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3-hidroxibutirato reductasa, y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

58. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3 -butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1, 3-butandiol, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa ; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa; y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

59. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; y una 3 -hidroxibutiril-CoA reductasa (formación de alcohol), la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

60. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

61. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3 -butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3 -butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3 -butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa ; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3 -hidroxibutirato reductasa, y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

62. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3 -butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa ; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma aldehido) , y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa.

63. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa; una crotonasa; una 3-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 3-hidroxibutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxibutiril-CoA hidrolasa; una 3-hidroxibutirato reductasa; y una 3-hidroxibutiraldehído reductasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa; y una isopropanol deshidrogenasa .

64. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3-butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3-butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una crotonasa; y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol), la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

65. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria de 1 , 3 -butandiol y una trayectoria isopropanol, la trayectoria de 1 , 3 -butandiol que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria de 1 , 3-butandiol expresadas en una cantidad suficiente para producir 1 , 3-butandiol , el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA deshidratasa,- una crotonasa, y una 3-hidroxibutiril-CoA reductasa (que forma alcohol) , la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

66. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una transferasa 3-hidroxiisobutiril-CoA, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una hidrolasa 3-hidroxiisobutiril-CoA, y una 3 -hidroxiisobutirato deshidratasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

67. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa, y una metacrilil-CoA transferasa , una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

68. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrilico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrilico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrilico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una transferasa 3-hidroxiisobutiril-CoA, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o un 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa; y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

69. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinil-CoA reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa, una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa, y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

70. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacr lico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrilico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrilico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa; y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa , la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

71. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutiril-CoA transferasa o una 4-hidroxibutiril-CoA sintetasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa ; y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

72. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una succinato reductasa; una 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; una fosfotrans-4-hidroxibutirilasa; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA transferasa, una 3-hidroxiisobutiril-CoA sintetasa o una 3 -hidroxiisobutiril-CoA hidrolasa; y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

73. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de los ácidos nucleicos exogenos que codifica: una succinato reductasa; un 4-hidroxibutirato deshidrogenasa; una 4-hidroxibutirato cinasa; fosfotrans-4-hidroxibutirilasa ; una 4-hidroxibutiril-CoA mutasa; una 3-hidroxiisobutiril-CoA deshidratasa , y una metacrilil-CoA transferasa, una metacrilil-CoA sintetasa o una metacrilil-CoA hidrolasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o un acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

74. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de los ácidos nucleicos exogenos que codifica: una metilmalonil-CoA mutasa; un metilmalonil-CoA reductasa (que forma aldehido) ; una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o un acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

75. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de los ácidos nucleicos exogenos que codifica: una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA epimerasa; un metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa o una metilmalonil-CoA hidrolasa; una metilmalonato reductasa; una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o un acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa.

76. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrílico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrílico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrílico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico , el primer conjunto de los ácidos nucleicos exogenos que codifica: una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA transferasa, una metilmalonil-CoA sintetasa o una metilmalonil-CoA hidrolasa; una metilmalonato reductasa; una 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa, y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa , la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa , y una isopropanol deshidrogenasa.

77. Un organismo microbiano de origen no natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una trayectoria del ácido metilacrilico y una trayectoria isopropanol, la trayectoria del ácido metilacrilico que comprende un primer conjunto de ácidos nucleicos exogenos que codifica enzimas de la trayectoria del ácido metilacrilico expresadas en una cantidad suficiente para producir ácido metacrílico, el primer conjunto de los ácidos nucleicos exógenos que codifica: una metilmalonil-CoA mutasa; una metilmalonil-CoA reductasa (que forma alcohol), y una 3-hidroxiisobutirato deshidratasa, la trayectoria isopropanol que comprende un segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de trayectoria isopropanol expresadas en una cantidad suficiente para producir isopropanol, el segundo conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una acetil-CoA acetil tiolasa; una acetoacetil-CoA transferasa o una acetoacetil-CoA hidrolasa o una acetoacetil-CoA sintetasa; una acetoacetato descarboxilasa, y una isopropanol deshidrogenasa .

78. El organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 42-77, que comprende además una trayectoria de acetil-CoA que comprende un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica las enzimas de trayectoria acetil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir acetil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una piruvato cinasa, y una piruvato deshidrogenasa o una piruvato ferredoxin oxidorreductasa, o un piruvato-formiato liasa, una piruvato-formiato liasa que activa la enzima y una formiato deshidrogenasa.

79. El organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 42-77, que comprende además una trayectoria de succinil-CoA que comprende un tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica enzimas de la trayectoria succinil-CoA expresadas en una cantidad suficiente para producir succinil-CoA, el tercer conjunto de ácidos nucleicos exógenos que codifica: una PEP carboxicinasa, una PEP carboxilasa, una malato deshidrogenasa , una fumarasa, un fumarato reductasa, una succinil-CoA transferasa y una succinil-CoA sintetasa.

80. El organismo microbiano de origen no natural de la reivindicación 79, en donde el tercer conjunto de los ácidos nucleicos exógenos además codifica una piruvato carboxilasa o una metilmalonil-CoA carboxitransferasa.

81. El organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 36-38 ó 42-77, en donde el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.

82. El organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 36-38 ó 42-77, en donde el organismo microbiano de origen no natural está en un medio de cultivo sustancialmente anaeróbico.

83. Un método para producir 1 , 4-butandiol e isopropanol, que comprende cultivar un organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 36, o 42-53 bajo condiciones y durante un período suficiente de tiempo para producir 1 , 4-butandiol e isopropanol.

84. El método de la reivindicación 83, en donde las condiciones que comprenden las condiciones de cultivo sustancialmente anaeróbicas.

85. El método de la reivindicación 83, en donde el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.

86. Un método para producir 1 , 3-butandiol e isopropanol, que comprende cultivar un organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 37, o 54-65 bajo condiciones y durante un período suficiente de tiempo para producir 1, 3-butandiol e isopropanol.

87. El método de la reivindicación 86, en donde las condiciones que comprenden las condiciones de cultivo sustancialmente anaeróbicas.

88. El método de la reivindicación 86, en donde el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo.

89. Un método para producir ácido metacrílico e isopropanol, que comprende cultivar un organismo microbiano de origen no natural de cualquiera de las reivindicaciones 38, o 67-77 bajo condiciones y durante un período suficiente de tiempo para producir ácido metacrílico e isopropanol.

90. El método de la reivindicación 89, en donde las condiciones que comprenden las condiciones de cultivo sustancialmente anaeróbicas.

91. El método de la reivindicación 89, en donde el ácido nucleico exógeno es un ácido nucleico heterólogo. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un organismo microbiano de origen no natural que tiene trayectorias n-propanol e isopropanol, 1 , 4-butandiol (14-BDO) y las trayectorias isopropanol, 1,3 butandiol- ( 13-BDO) y las trayectorias isopropanol o ácido metacrílico (MAA.) y la trayectoria isopropanol . El organismo microbiano contiene al menos un ácido nucleico exógeno que codifica un enzima en cada uno de los n-propanol, 14-BDO, 13-BDO o MAA respectivos y las trayectorias isopropanol. La invención proporciona adicionalmente un método para la co-producción de n-propanol e isopropanol, 14-BDO e isopropanol, 13-BDO e isopropanol o MAA e isopropanol. El método puede incluir un cultivo de n-propanol e isopropanol, una co-producción del organismo microbiano, donde el organismo microbiano expresa por lo menos un ácido nucleico que codifica una exógeno n-propanol, un isopropanol, un 14-BDO, un 13-BDO y/o una enzima de trayectoria MAA en una cantidad suficiente para producir cada uno de los productos respectivos, bajo condiciones y durante un período suficiente de tiempo para producir cada uno de los productos respectivos.