JP6243851B2 - 1,4−ブタンジオールの製造方法及び微生物 - Google Patents
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Description
[1]微生物及び/又はその培養物を用いて、3−ヒドロキシブチリルCoA、クロトニルCoA、4−ヒドロキシブチリルCoAを順次経由する酵素反応系を利用して1,4−ブタンジオールを製造する方法であって、
前記3−ヒドロキシブチリルCoAが光学活性体であり、
前記微生物は、下記(1)〜(5)の遺伝子を含み、
(1)(S)−3−ヒドロキシブチリルCoAからクロトニルCoAを生成する反応を触媒するエノイルCoAヒドラターゼをコードする遺伝子
(2)ビニルアセチルCoAデルタイソメラーゼをコードする遺伝子
(3)4−ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする遺伝子
(4)基質特異性が、前記3−ヒドロキシブチリルCoAとは逆の光学選択性を有するアシルCoA還元酵素をコードする遺伝子
(5)光学活性な3−ヒドロキシブチリルCoAを与えるアセトアセチルCoAレダクターゼをコードする遺伝子
前記アセトアセチルCoAレダクターゼをコードする遺伝子は、
(a)配列番号3の塩基配列を有する遺伝子
(b)配列番号3の塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号3の塩基配列に対して90%以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
のいずれかであり、
前記アシルCoA還元酵素をコードする遺伝子は、
(a)配列番号7の塩基配列を有する遺伝子
(b)配列番号7の塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号7の塩基配列に対して90%以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
のいずれかである、1,4−ブタンジオールの製造方法。
(1)(S)−3−ヒドロキシブチリルCoAからクロトニルCoAを生成する反応を触媒するエノイルCoAヒドラターゼをコードする遺伝子
(2)ビニルアセチルCoAデルタイソメラーゼをコードする遺伝子
(3)4−ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする遺伝子
(4)3−ヒドロキシブチリルCoAに対する基質特異性が光学選択的であるアシルCoA還元酵素をコードする遺伝子
(5)3−ヒドロキシブチリルCoAに対する基質特異性が前記アシルCoA還元酵素とは逆の光学選択性を有するアセトアセチルCoAレダクターゼをコードする遺伝子
前記アセトアセチルCoAレダクターゼをコードする遺伝子は、
(a)配列番号3の塩基配列を有する遺伝子
(b)配列番号3の塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号3の塩基配列に対して90%以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
のいずれかであり、
前記アシルCoA還元酵素をコードする遺伝子は、
(a)配列番号7の塩基配列を有する遺伝子
(b)配列番号7の塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号7の塩基配列に対して90%以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
のいずれかである、微生物。
本実施形態で使用される宿主微生物は、後述する種々の遺伝子を導入することができる宿主微生物であり、遺伝子組み換え技術を適用することができる宿主微生物であれば、特に限定されない。
本実施形態で使用される形質転換微生物は、宿主微生物が本来有する酵素系の他に、更に少なくとも、3−ヒドロキシブチリルCoAを基質として、クロトニルCoA、4−ヒドロキシブチリルCoAを順次経由して、1,4−ブタンジオールを生産することができる酵素反応系の各々の酵素系を有し、かつ3−ヒドロキシブチリルCoAから3−ヒドロキシブタナールを生成する酵素反応経路を抑制する機能を有する。また、本実施形態における形質転換微生物は、3−ヒドロキシブチリルCoAから3−ヒドロキシブタナールを生成する酵素反応経路を抑制するための1つの方法として、3−ヒドロキシブチリルCoAのS体、R体を選択し、それとは逆のキラルに対して高い選択性を有するアシルCoA還元酵素を有する。好ましくは、当該S体又はR体そのものに対して高い選択性を有するアシルCoA還元酵素を有しない。
本実施形態で使用されるエノイルCoAヒドラターゼをコードする遺伝子は、3−ヒドロキシブチリルCoAを基質として脱水し、クロトニルCoAを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。
本実施形態において、ビニルアセチルCoAデルタイソメラーゼをコードする遺伝子は、クロトニルCoAのオレフィンを転位してビニルアセチルCoAを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。
本実施形態において、4−ヒドロキシブチリルCoAデヒトラターゼをコードする遺伝子は、ビニルアセチルCoAを水和して4−ヒドロキシブチリルCoAを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。
本実施形態において、アシルCoA還元酵素をコードする遺伝子は、4−ヒドロキシブチリルCoAを還元して4−ヒドロキシブタナールを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子である。また、本実施形態におけるアシルCoA還元酵素をコードする遺伝子は、3−ヒドロキシブチリルCoAを生成する上流工程において(R)−3−ヒドロキシブチリルCoAを製造した場合、(S)−3−ヒドロキシブチリルCoA選択的アシルCoA還元酵素を使用する。また、3−ヒドロキシブチリルCoAを生成する上流工程において(S)−3−ヒドロキシブチリルCoAを製造した場合、(R)−3−ヒドロキシブチリルCoA選択的アシルCoA還元酵素を使用する。
宿主微生物への遺伝子の導入は種々の知られた方法、例えば制限酵素/ライゲーションに基づく方法、In−Fusionクローニング方法などを適宜組み合わせて用いることで上記遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結し、得られた組換えベクターを目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより可能である。又は相同組換えによってゲノム上の任意の位置に目的の遺伝子又はその一部を挿入することにより可能である。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタンパク質を発現することができる各遺伝子の一部分を指す。本発明において遺伝子には、DNA及びRNAが包含され、好ましくはDNAである。
[1,4−ブタンジオールの生成系]
図1に、本実施形態の1,4−ブタンジオールの製造方法の酵素系の一例を示す。本実施形態において、1,4−ブタンジオールは、前述した一連の遺伝子を形質転換などにより微生物体内で発現さえた培養物を用いて得ることができる。なお、遺伝子は、個別に又は一連のクラスターとして、任意のベクターに挿入して宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体を、適当な炭素源、例えばグルコースを炭素源として培地中で培養することで、各遺伝子を発現させる。宿主で構成発現し得る遺伝子の場合には、培地中で形質転換体を培養することで、遺伝子が発現する。一方、各遺伝子をベクター上に配されたレギュレーターの制御下で構成した場合には、誘導基質を添加し、誘導的環境へ移行することにより、各々のコードする遺伝子が発現する。なお、本実施形態における培養とは、通常の微生物培養の培養条件を全て含み、また、培養するステップとは、微生物が1,4−ブタンジオールを製造するための十分な時間及び条件で培養することを意味する。
本実施形態の1,4−ブタンジオールの製造方法における、3−ヒドロキシブチリルCoAの供給方法には特に制限はなく、既知の様々な方法が用いられる。
本発明の反応は、もっとも簡便には、例えば形質転換体をLB培地などの栄養培地で15℃〜40℃、望ましくは18℃〜37℃の温度で24時間程度培養したのち、通常の炭素源、例えば0.01〜50%、望ましくは0.1〜30%のグルコースを炭素源とする培地に移殖し、引き続き同様の温度で1時間〜200時間程度培養し、その過程で培養液中に1,4−ブタンジオールを蓄積させることにより達せられる。また菌の増殖・反応の進行による炭素源の消費に応じて、連続的あるいは間欠的に炭素源を添加してもよく、この場合の炭素源の反応液中濃度は前記の限りではない。
次に、実施例を説明することにより、本発明をより詳細に説明する。
配列番号1で示される遺伝子配列の上下流に、発現ベクターpET17b(ノバジェン社製)のマルチクローニングサイト中、NdeIサイトの上流側CAT、下流側ATGをそれぞれ含む上流側、下流側15塩基対分に対応する配列をそれぞれ5'末端側、3'末端側に付加した平滑末端断片を常法により調製した。この断片と、pET17b(ノバジェン社製)をNdeI処理した断片とをIn−Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)によりライゲーションし、プラスミドpETBD1を得た。
比較例1と同様の方法により、プラスミドpETBD1−2−4−6−7上の配列2および4の遺伝子を、当該工程を触媒する酵素に対応する酵素をコードする配列番号3および5の遺伝子で置換した、プラスミドpETBD1−3−5−6−7を調製し、これにより形質転換した、大腸菌pETBD1−3−5−6−7/JM109(DE3)を得た。
Claims (5)
- 微生物及び/又はその培養物を用いて、3−ヒドロキシブチリルCoA、クロトニルCoA、4−ヒドロキシブチリルCoAを順次経由する酵素反応系を利用して1,4−ブタンジオールを製造する方法であって、
前記3−ヒドロキシブチリルCoAが光学活性体であり、
前記微生物は、下記(1)〜(5)の遺伝子を含み、
(1)(S)−3−ヒドロキシブチリルCoAからクロトニルCoAを生成する反応を触媒するエノイルCoAヒドラターゼをコードする遺伝子
(2)ビニルアセチルCoAデルタイソメラーゼをコードする遺伝子
(3)4−ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする遺伝子
(4)基質特異性が、前記3−ヒドロキシブチリルCoAとは逆の光学選択性を有するアシルCoA還元酵素をコードする遺伝子
(5)光学活性な3−ヒドロキシブチリルCoAを与えるアセトアセチルCoAレダクターゼをコードする遺伝子
前記アセトアセチルCoAレダクターゼをコードする遺伝子は、
(a)配列番号3の塩基配列を有する遺伝子
(b)配列番号3の塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号3の塩基配列に対して90%以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
のいずれかであり、
前記アシルCoA還元酵素をコードする遺伝子は、
(a)配列番号7の塩基配列を有する遺伝子
(b)配列番号7の塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号7の塩基配列に対して90%以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
のいずれかである、1,4−ブタンジオールの製造方法。 - 前記アセトアセチルCoAレダクターゼが、アセトアセチルCoAレダクターゼ(EC番号:1.1.1.36)、3−ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼ(EC番号:1.1.1.35)又は3−ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ(EC番号:1.1.1.157)である、請求項1に記載の1,4−ブタンジオールの製造方法。
- 下記(1)〜(5)の遺伝子を含み、1,4−ブタンジオールを製造し得る微生物であって、
(1)(S)−3−ヒドロキシブチリルCoAからクロトニルCoAを生成する反応を触媒するエノイルCoAヒドラターゼをコードする遺伝子
(2)ビニルアセチルCoAデルタイソメラーゼをコードする遺伝子
(3)4−ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする遺伝子
(4)3−ヒドロキシブチリルCoAに対する基質特異性が光学選択的であるアシルCoA還元酵素をコードする遺伝子
(5)3−ヒドロキシブチリルCoAに対する基質特異性が前記アシルCoA還元酵素とは逆の光学選択性を有するアセトアセチルCoAレダクターゼをコードする遺伝子
前記アセトアセチルCoAレダクターゼをコードする遺伝子は、
(a)配列番号3の塩基配列を有する遺伝子
(b)配列番号3の塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号3の塩基配列に対して90%以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
のいずれかであり、
前記アシルCoA還元酵素をコードする遺伝子は、
(a)配列番号7の塩基配列を有する遺伝子
(b)配列番号7の塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号7の塩基配列に対して90%以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
のいずれかである、微生物。 - 前記アセトアセチルCoAレダクターゼが、アセトアセチルCoAレダクターゼ(EC番号:1.1.1.36)、3−ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼ(EC番号:1.1.1.35)又は3−ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ(EC番号:1.1.1.157)である、請求項3に記載の微生物。
- 大腸菌、酵母、コリネ型細菌、クロストリジウム属細菌である、請求項3に記載の微生物。
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