CN104797713A - 1,4-丁二醇的制造方法及微生物 - Google Patents
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Abstract
一种1,4-丁二醇的制造方法,其使用微生物及/或其培养物,并利用依次经由3-羟丁酰CoA、巴豆酰CoA、及4-羟丁酰CoA的酵素反应系来制造1,4-丁二醇,所述1,4-丁二醇的制造方法的特征在于,所述3-羟丁酰CoA是光学活性体,所述微生物包括:(1)对烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因;(2)乙烯乙酰CoAΔ-异构酶进行编码的遗传基因;(3)4-羟丁酰CoA脱水酶进行编码的遗传基因;及(4)对基质特异性具有与所述3-羟丁酰CoA相反的光学选择性的酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因。
Description
技术领域
本发明涉及一种1,4-丁二醇(butanediol)的制造方法及微生物。
背景技术
近年,从化石资源的枯渴和地球温暖化的应对等角度来看,以可再生资源为原料的化合物制造工艺备受瞩目。特别是以生物量(biomass)为原料并采用生物化学工艺来制造各种聚合物原料化合物和化学品原料化合物的所谓的“生物精练(biorefinery)”更受到了广泛的关注。
作为一种可向生物量进行原料转换的化合物,可列举出1,4-丁二醇。1,4-丁二醇作为精密有机化学品的合成原料、涤纶(polyester)、及工程塑料(engineering plastic)的单体(monomer)单位等得到了广泛的应用,其市场规模也非常大。为此,急需一种可采用以生物量等可再生资源为原料的生物化学工艺来高效制造1,4-丁二醇的方法。
作为采用生物化学工艺来制造1,4-丁二醇的制造方法,例如,可列举出如下专利文献1、2、及非专利文献1中所记载的方法。
[专利文献1]日本专利第4380704号说明书
[专利文献2]国际公开第2008/115840号公报
[非专利文献1]Harry Yim et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli for directproduction of 1,4-butanediol,Nature Chemical Biology,7,445-452(2011).
发明内容
[发明要解决的课题]
然而,就上述专利文献1、2、及非专利文献1中所记载的方法而言,其工艺较为复杂。
针对上述课题,本发明提供一种可选择性并可经济性地获得1,4-丁二醇的1,4-丁二醇的制造方法。
[用于解决课题的手段]
本发明包括如下:
[1]一种1,4-丁二醇的制造方法,其使用微生物及/或其培养物,并利用依次经由3-羟丁酰(hydroxybutyryl)CoA、巴豆酰(crotonyl)CoA、及4-羟丁酰CoA的酵素反应系(reaction system)来制造1,4-丁二醇,所述1,4-丁二醇的制造方法的特征在于,
所述3-羟丁酰CoA是光学活性体(optically active substance),
所述微生物包括:
(1)对烯酰(enoyl)CoA水合酶(hydratase)进行编码(code)的遗传基因(gene);
(2)乙烯乙酰(vinyl acetyl)CoAΔ-异构酶(delta isomerase)进行编码的遗传基因;
(3)对4-羟丁酰CoA脱水酶(dehydratase)进行编码的遗传基因;及
(4)对基质特异性具有与所述3-羟丁酰CoA相反的光学选择性的酰基(acyl)CoA还原酵素进行编码的遗传基因。
[2]上述[1]记载的1,4-丁二醇的制造方法,其中,所述微生物还包括:对提供具有光学活性的3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素(reductase(还原酶))进行编码的遗传基因。
[3]上述[2]记载的1,4-丁二醇的制造方法,其中,所述乙酰乙酰CoA还原酵素是:乙酰乙酰CoA还原酵素(EC编号:1.1.1.36)、3-羟丁酰CoA脱氢酶(dehydrogenase)(EC编号:1.1.1.35)、或3-羟酰(hydroxy acyl)CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.157)。
[4]上述[2]记载的1,4-丁二醇的制造方法,其中,对所述乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下述(a)~(c)的任一个所记载的遗传基因,即:
(a)具有序列编号(sequence number)3的盐基序列的遗传基因;
(b)具有盐基序列的遗传基因,该盐基序列是序列编号3的盐基序列中1个或多个盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列,并且,该盐基序列相对于序列编号3的盐基序列具有90%以上的同一性;及
(c)在渐快(stringendo)条件下具有序列编号3的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗传基因进行杂交(hybridize)的遗传基因。
[5]上述[1]记载的1,4-丁二醇的制造方法,其中,对所述酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下述(a)~(c)的任一个所记载的遗传基因,即:
(a)具有序列编号7的盐基序列的遗传基因;
(b)具有盐基序列的遗传基因,该盐基序列是序列编号7的盐基序列中1个或多个盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列,并且,该盐基序列相对于序列编号7的盐基序列具有90%以上的同一性;及
(c)在渐快条件下对具有序列编号7的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗传基因进行杂交的遗传基因。
[6]一种微生物,其特征在于,包括:
(1)对烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因;
(2)对乙烯乙酰CoAΔ-异构酶进行编码的遗传基因;
(3)对4-羟丁酰CoA脱水酶进行编码的遗传基因;
(4)对相对于3-羟丁酰CoA的基质特异性为光学选择性的酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因;及
(5)对相对于3-羟丁酰CoA的基质特异性具有与所述酰基CoA还原酵素相反的光学选择性的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因。
[7]上述[6]记载的微生物,其中,所述乙酰乙酰CoA还原酵素是:乙酰乙酰CoA还原酵素(EC编号:1.1.1.36)、3-羟丁酰CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.35)、或3-羟酰CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.157)。
[8]上述[7]记载的微生物,其中,对所述乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下述(a)~(c)的任一个所记载的遗传基因,即:
(a)具有序列编号3的盐基序列的遗传基因;
(b)具有盐基序列的遗传基因,该盐基序列是序列编号3的盐基序列中1个或多个盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列,并且,该盐基序列相对于序列编号3的盐基序列具有90%以上的同一性;及
(c)在渐快条件下对具有序列编号3的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗传基因进行杂交的遗传基因。
[9]上述[6]记载的微生物,其中,对所述酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下述(a)~(c)的任一个所记载的遗传基因,即:
(a)具有序列编号7的盐基序列的遗传基因;
(b)具有盐基序列的遗传基因,该盐基序列是序列编号7的盐基序列中1个或多个盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列,并且,该盐基序列相对于序列编号7的盐基序列具有90%以上的同一性;及
(c)在渐快条件下对具有序列编号7的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗传基因进行杂交的遗传基因。
[10]上述[6]记载的微生物,其中,所述微生物是是大肠杆菌、酵母、棒状(coryneform)细菌、及梭菌属(clostridium)细菌。
[发明的效果]
能够提供一种可选择性并经济性地制造1,4-丁二醇的制造方法。
附图说明
[图1]本实施方式的1,4-丁二醇的制造方法的酵素系的一例。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。这里需要说明的是,在本说明书中,「CoA」是指「辅酶(coenzyme)A」的意思。另外,如果没有特别的说明,「%」是「质量%」的意思。「ppm」则是表示质量基准的意思。
本实施方式使用微生物,并利用依次经由3-羟丁酰CoA、巴豆酰CoA、及4-羟丁酰CoA来制造1,4-丁二醇的酵素反应系。这里,本发明的特征之一是一种可选择性并可高生产性地制造1,4-丁二醇的微生物或其培养物的使用方法。
本发明人对解决上述课题的技术手段进行了潜心研究和锐意探索,并发现了一种可制造1,4-丁二醇的制造方法,其使用微生物并通过酵素反应系,以3-羟丁酰CoA为基质(也可为中间体、前驱体等。),并依次经由巴豆酰CoA和4-羟丁酰CoA来制造1,4-丁二醇,其中,通过对从微生物的3-羟丁酰CoA生成3-羟基丁醇(butanol)的酵素反应路径进行抑制,可对从3-羟丁酰CoA向1,3-丁二醇的生成进行抑制,这样,就可提高1,4丁二醇的生成效率。
另外,本发明人还发现了,作为用于对从微生物的3-羟丁酰CoA生成3-羟基丁醇的酵素反应路径进行抑制的一个方法,使用相对于光学活性的3-羟丁酰CoA具有与其相反的光学选择性的酰基CoA还原酵素很有效。即,选择3-羟丁酰CoA的S体或R体的任一个,并使用相对于与其相反的手征(chiral)的选择性为较高的酰基CoA还原酵素很有效。
以下对本实施方式中所使用的微生物的特征、微生物的制作方法、微生物的使用方法(即,1,4-丁二醇的制造方法)、及所制造的1,4-丁二醇的获取方法等进行说明。
(宿主微生物)
本实施方式中所使用的宿主微生物是可导入后述各种遗传基因的宿主微生物,并且,只要是可使用遗传基因改造(转基因)技术的宿主微生物即可,对其并无特别限制。
具体而言,是一种可向以3-羟丁酰CoA为基质,依次经过巴豆酰CoA和4-羟丁酰CoA在后述适当的培养条件下可生产1,4-丁二醇,并具有可对从3-羟基丁基(butyl)CoA生成3-羟基丁醇的酵素反应路径进行抑制的功能的微生物进行形质转换的宿主微生物。
作为可在本实施方式中进行使用的宿主微生物的具体例子,从工业实用性的观点来看,可列举出大肠杆菌、酵母、棒状细菌、及梭菌属细菌。作为酵母,可列举出酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、及马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)等。作为棒状细菌,可列举出谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、有效棒杆菌(corynebacterium efficiens)、双歧短杆菌(brevibacterium divaricatum)、解糖短杆菌(brevibacterium saccharolyticum)、brevibacterium immariophilum、乳糖发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)、玫瑰色短杆菌(brevibacterium roseum)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、硫殖短杆菌(brevibacterium thiogenitalis)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumacetoglutamicum)、corynebacterium callunae、百合棒杆菌(corynebacterium lilium)、corynebacterium mellassecola,嗜氨小杆菌(microbacterium ammoniaphilum)等。作为梭菌属细菌,可列举出克氏梭菌(clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)、氨基丁酸梭菌(clostridium aminobutyricum)、拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)、clostridium saccharoperbutylacetonicum等。其中,尽管常用的为大肠杆菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、及谷氨酸棒杆菌,但是,从容易地进行形质转换的角度来看,优选使用大肠杆菌。
另外,就本实施方式中的形质转换微生物而言,其也可以以微生物培养菌体本身或其培养物的各种形态来进行使用。具体而言,本实施方式中的微生物的培养物包括:基于微生物培养菌体的培养基·缓冲液等媒质(medium)的悬浊物、来自微生物培养菌体的无细胞提取液、及再对该无细胞提取液中的可对该反应进行催化的成分进行浓缩·精制·提取所获得的物质等的处理物。本实施方式中的微生物的培养物还包括使所述微生物的处理物固定化至难溶性担体(载体)后的物质。作为这样的固定化载体,可列举出聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚(poly)-N-乙烯基甲酰胺(vinylformamide)、聚丙烯胺(polyallylamine)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、甲基纤维素(methyl cellulose)、葡甘露聚糖(glucomannan)、藻酸盐(alginate)、及卡拉胶(carrageenan)等,还有它们的共聚、架桥化物等、以及形成包合了上述微生物菌体或其处理物的水难溶性固体成分的化合物等。另外,可以单独使用上述的1种物质,也可以使用上述的2种以上的物质。再有,在活性炭、多孔质陶瓷、玻璃纤维、多孔质聚合物成形体、及硝化纤维(nitrocellulose)膜等这些预先做为固形物而形成的物体上使微生物或其提取液·提取成分进行了保持的物质也可作为微生物的培养物来使用。
(形质转换微生物)
本实施方式中所使用的形质转换微生物除了宿主微生物本来所具有的酵素系之外,至少还具有以3-羟丁酰CoA为基质,依次经由巴豆酰CoA和4-羟丁酰CoA可生成4-丁二醇的酵素反应系的各酵素系,并且,还具有可对从3-羟丁酰CoA生成3-羟基丁醇的酵素反应路径进行抑制的功能。另外,就本实施方式中的形质转换微生物而言,作为用于对从3-羟丁酰CoA生成3-羟基丁醇的酵素反应路径进行抑制的一个方法为,对3-羟丁酰CoA的S体、R体进行选择,并具有相对于与其相反的手征具有较高选择性的酰基CoA还原酵素。优选为,不具有相对于该S体或R体本身具有较高选择性的酰基CoA还原酵素。
以下针对对各酵素系进行编码的遗传基因进行说明。
[对烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因]
就本实施方式中所使用的对烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因而言,只要是可对以3-羟丁酰CoA为基质藉由脱水来生成巴豆酰CoA的反应进行催化的酵素进行编码的遗传基因即可,对其并无特别限制。
作为在本实施方式中所使用的可对从(S)-3-羟丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的酵素进行编码的遗传基因的具体例子而言,尽管对其并无特别限制,但可列举出:对烯酰CoA水合酶(EC编号:4.2.1.17)进行编码的遗传基因或其同源染色体(homologue)等。关于上述酵素,具体可参考“Moskowitz,G.J.and Merrick,J.M.Metabolism of poly-β-hydroxybutyrate.II.Enzymatic synthesis of D-(–)-β-hydroxybutyrylcoenzyme A by an enoyl hydrase from Rhodospirillum rubrum.Biochemistry 8(1969)2748-2755.”之非专利文献等。
另外,作为在本实施方式中所使用的可对从(R)-3-羟丁酰CoA生成巴豆酰CoA的反应进行催化的酵素进行编码的遗传基因的具体例子,尽管对其并无特别限制,但是可列举出:对烯酰CoA水合酶(EC编号:4.2.1.55(3-羟丁酰CoA脱水酶)或EC编号:4.2.1.119)进行编码的遗传基因或其同源染色体等。有关上述酵素,具体可参考“Fukui,T.,Shiomi,N.and Doi,Y.Expression and characterization of(R)-specific enoylcoenzyme A hydratase involved in polyhydroxyalkanoate biosynthesis by Aeromonascaviae.J.Bacteriol.180(1998)667-673.”或“Metabolism of poly-beta-hydroxybutyrate.II.Enzymatic synthesis of D-(-)-beta hydroxybutyryl coenzyme A by an enoyl hydrase fromRhodospirillum rubrum.,Moskowitz GJ,Merrick JM.Journal Biochemistry.,82748-2755(1969).”等非专利文献等。
[对乙烯乙酰CoAΔ-异构酶进行编码的遗传基因]
在本实施方式中,就对乙烯乙酰CoAΔ-异构酶进行编码的遗传基因而言,只要是可对通过对巴豆酰CoA的石蜡(olefin)进行重排(rearrangement)而生成乙烯乙酰CoA的反应进行催化的酵素进行编码的遗传基因即可,对其并无特别限制。
作为对上述反应进行催化的酵素的具体例子,尽管对其并无特别限制,但是可列举出:乙烯乙酰CoAΔ-异构酶(EC编号:5.3.3.3)或其同源染色体等。有关上述酵素,具体可参考例如“Fermentation of 4-aminobutyrate by Clostridium aminobutyricum:cloning of two genes involved in the formation and dehydration of 4-hydroxybutyryl-CoA,Archives of Microbiology,174(3)189-199(2000).”等非专利文献等。
[对4-羟丁酰CoA脱水酶进行编码的遗传基因]
在本实施方式中,就对4-羟丁酰CoA脱水酶进行编码的遗传基因而言,只要是可对通过对乙烯乙酰CoA进行水和而生成4-羟丁酰CoA的反应进行催化的酵素进行编码的遗传基因即可,对其并无特别限制。
作为对上述反应进行催化的酵素的具体例子,尽管对其并无特别限制,但可列举出:4-羟丁酰CoA脱水酶(EC编号:4.2.1.120)或其同源染色体等。有关上述酵素,具体可参考例如“Fermentation of 4-aminobutyrate by Clostridium aminobutyricum:cloning of two genes involved in the formation and dehydration of 4-hydroxybutyryl-CoA,Archives of Microbiology,174(3)189-199(2000).”等非专利文献等。这里需要说明的是,该非专利文献中记载的是涉及4-羟丁酰CoA脱水酶和上述乙烯乙酰CoAΔ-异构酶(EC编号:5.3.3.3)的复合酵素及对其进行编码的遗传基因的例子。但是,只要能够适当地提供各酵素的功能,也可以个别地使用对各酵素进行编码的遗传基因,还可以使用对酵素蛋白质或催化亚基(subunit)进行编码的遗传基因。
[对酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因]
在本实施方式中,就对酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因而言,其为可对通过对4-羟丁酰CoA进行还原而生成4-羟基丁醛(hydroxybutanal)的反应进行催化的酵素进行编码的遗传基因。另外,就本实施方式中的对酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因而言,在生成3-羟丁酰CoA的上游步骤中制造了(R)-3-羟丁酰CoA的情况下,使用可选择(S)-3-羟丁酰CoA的酰基CoA还原酵素。另外,在生成3-羟丁酰CoA的上游步骤中制造了(S)-3-羟丁酰CoA的情况下,则使用可选择(R)-3-羟丁酰CoA的酰基CoA还原酵素。
作为对上述反应进行催化的酵素的具体例子,可列举出:醛(aldehyde)脱氢酶(酰化(acylation))(EC编号:1.2.1.10)或其同源染色体。
这里需要说明的是,就所获得的4-羟基丁醇而言,尽管通过后述宿主通常所具有的乙醇(alcohol)还原酵素其可被导向1,4-丁二醇,但是,藉由追加发现对乙醇还原酵素进行编码的遗传基因,也可制造1,4-丁二醇。
(形质转换微生物的制作方法)
就遗传基因至宿主微生物的导入而言,其可通过使用各种周知方法、例如、基于制限酵素(restriction enzyme)/连接(ligation)的方法、In-Fusion克隆(cloning)方法等的适当的组合,使上述遗传基因或其一部分与适当的带菌媒介(vector)进行连结,并将所获得的重组带菌媒介(vector)导入宿主中,以可发现目的遗传基因的方式来进行。或者,也可藉由采用同源重组(homologous recombination)而在基因组上的任意位置插入目的遗传基因或其一部分的方式来进行。这里,「一部分」是指被导入宿主中时能够发现各遗传基因所编码的蛋白质的各遗传基因的一部分。本发明中,遗传基因包括DNA和RNA,优选为DNA。
作为连结所述遗传基因的带菌媒介(vector),只要是宿主可进行复制的,对其并无特别限制,例如可列举出:大肠杆菌中导入外来遗传基因时所使用的质粒(plasmid)、噬菌体(phage)、及黏粒(cosmid)等。作为质粒,例如可列举出:pHSG398、pUC18、pBR322、pSC101、pUC19、pUC118、pUC119、pACYC117、pBluescript II SK(+)、pET17b、pETDuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1、及pCOLADuet-1等,而作为噬菌体,例如可列举出:λgt10、Charon 4A、EMBL-、M13mp18、及M13mp19等。这些中的几个都是市场上销售的商品即市贩品(kit),可参照其说明书进行使用,或者也可对其进行适当的改变后再进行使用。
在上述带菌媒介(vector)中,为了可确实地发现所插入的遗传基因,在该遗传基因的上游还可以连接适当的“发现启动子”(promoter)。就所使用的发现启动子而言,对其并无特别限制,可由所属技术领域的技术人员根据宿主的情况对其进行适当的选择。例如,可使用在大肠杆菌中发现外来遗传基因时所使用的T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、λ-PL启动子、或参与源自大肠杆菌的硝酸呼吸的硝酸还原遗传基因narGHJI操纵子(operon)的Nar启动子区域、作为大肠杆菌的硝酸还原酵素遗传基因的Frd遗传基因的启动子区域等。
另外,根据情况,对宿主微生物的本来的遗传基因进行破坏,以使该遗传基因不会被发现这样的方法也是较佳的。作为对遗传基因进行破坏的方法,可使用对大肠杆菌的遗传基因进行破坏时所使用的公知的方法。具体而言,可使用:在目标遗传基因的任意位置使用可引起同源重组的带菌媒介(vector)(打靶(targeting)带菌媒介(vector))对该遗传基因进行破坏的方法(基因(gene)打靶(targeting)法)、在目标遗传基因的任意位置插入捕获(trap)用带菌媒介(vector)(不带有启动子的报告(reporter)遗传基因)对该遗传基因进行破坏以使其功能丧失的方法(遗传基因捕获法)、及对它们进行组合的方法等该技术领域制作敲除(knockout)细胞等时所使用的方法。
就可引起同源置换的位置或插入捕获用带菌媒介(vector)位置而言,只要是可生成使想要破坏的目标遗传基因不会被发现的变异的位置,对其并无特别限制,但是,优选为转录调节区域。
再有,作为将所述带菌媒介(vector)导入宿主的导入方法,尽管对其并无特别限制,但是例如可列举出:向大肠杆菌进行带菌媒介(vector)导入时通常所用的使用钙离子(calcium ion)的方法、原生质体(protoplast)法、及电穿孔法等。
就通过同源重组在基因组(genome)上的任意位置插入目的遗传基因的方法而言,可采用如下方式,即:在与基因组上的序列相同的序列处与启动子一起插入目的遗传基因,并将该核酸断片(片段)通过电穿孔导入细胞内,以引起同源重组。在向基因组进行导入时,如果使用将目的遗传基因和耐药性遗传基因(drug resistance gene)进行了连结的核酸断片,则可容易地对发生同源重组的株进行选拔。另外,也可采用如下方式,即:在基因组上藉由上述方法通过同源重组插入将耐药性遗传基因与在特定条件下可致死的遗传基因进行了连结的遗传基因,然后,采用对耐药性遗传基因和在特定的条件下可致死的遗传基因进行置换的方式,将目的遗传基因藉由同源重组进行导入。
再有,就导入目的遗传基因的重组微生物的选择方法而言,对其并无特别限制,但是优选为,可容易地仅对导入目的遗传基因的重组微生物进行选择的方法。
(用于制造1,4-丁二醇的微生物的使用方法、培养条件、及所获得的1,4-丁二醇的获得方法)
[1,4-丁二醇的生成系]
图1中示出了本实施方式的1,4-丁二醇的制造方法的酵素系的一例。在本实施方式中,1,4-丁二醇可通过使用藉由形质转换等在微生物体内发现上述一系列遗传基因的培养物而获得。这里需要说明的是,遗传基因通过个别地或作为一系列的簇(cluster)插入任意的带菌媒介(vector),以对宿主微生物进行形质转换。另外,通过将所获得的形质转换体在适当的碳源(carbon source)、例如以葡萄糖为碳源的培养基中进行培养,可发现各遗传基因。如果是可在宿主中构成并发现的遗传基因,则可通过在培养基中对形质转换体进行培养,来发现遗传基因。另一方面,如果各遗传基因是在带菌媒介(vector)上所配置的调控子(regulator)的控制下而构成的,则可通过添加诱导基质,以移行至诱导环境的方式,来发现各用于编码的遗传基因。这里需要说明的是,本实施方式中的培养是指包括所有的通常的微生物培养的培养条件的意思,另外,培养步骤是指对微生物在用于制造1,4-丁二醇的充分的时间和条件下进行培养的意思。
通常,藉由本实施方式的遗传基因所编码的一般的酵素的组合所生成的丁二醇为1,3-丁二醇和1,4-丁二醇的并产(joint production)混合物。即,在前驱体(或中间体)3-羟丁酰CoA的存在下,烯酰CoA水合酶和4-羟丁酰CoA脱水酶发生作用后,藉由它们的作用,会很快形成3-羟丁酰CoA和4-羟丁酰CoA的平衡状态。在此平衡状态下,如果使酰基CoA还原酵素发生作用,则通过向以这两个酰基CoA体为基质的CoA依存乙醛(aldehyde)进行还原的还原反应,可平衡比依存地生成3-羟基丁醛和4-羟基丁醛。这些乙醛体可通过源自宿主的乙醇还原酵素等被引导为1,3-丁二醇和1,4-丁二醇。
在本实施方式中,在3-羟丁酰CoA的生成步骤中制造了(R)-3-羟丁酰CoA的情况下,使用可选择(S)-3-羟丁酰CoA的酰基CoA还原酵素。另一方面,在3-羟丁酰CoA的生成步骤制造了(S)-3-羟丁酰CoA的情况下,则使用可选择(R)-3-羟丁酰CoA的酰基CoA还原酵素。据此,作为中间体的3-羟丁酰CoA藉由还原酵素被导引至1,3-丁二醇的副反应可被降低,进而可提高1,4-丁二醇的生产性。
在本发明中,就「可选择(R)(至(S))-3-羟丁酰CoA的酰基CoA还原酵素」而言,只要是具有针对4-羟丁酰CoA的反应性、并且、具有针对(R)(至(S))-3-羟丁酰CoA的反应性的酰基CoA还原酵素即可,对其并无特别限制。优选为,具有相对于分别对应的逆相的光学异构体(optical isomer)的反应性为0.02倍以上、最好为0.2倍以上的反应性的酰基CoA还原酵素。
这里需要说明的是,就酵素的基质特异性而言,其可通过如下方法、即、通过与发色色素DTNB(5、5’-二硫双(dithiobis)(2-硝基(nitro)安息香酸))的偶联(coupling),使藉由使用了各基质的还原反应在一定时间内所生成游离的CoA呈色(呈现颜色),并对其吸亮度进行测定的方法等进行确认。另外,还可采用常用的对随着还原反应的进行而逐渐生成的CoA进行定量的方法。再有,藉由采用高速液体层析(chromatography)(HPLC)或气体(gas)层析(GC)等的信息对在部分或全部地实施本实施方式的过程中所生成的1,3-丁二醇和1,4-丁二醇的生成量的比率或3-羟基丁醛和4-羟基丁醛的生成量的比率进行把握,也可相对地对承担该还原步骤的酵素是否为预期的可选择4-羟丁酰CoA的酰基CoA还原酵素进行评价。
[3-羟丁酰CoA的供给]
对本实施方式的1,4-丁二醇的制造方法中的3-羟丁酰CoA的供给方法并无特别限制,可使用已知的各种方法。
作为一例,首先,在藉由醣酵解(glycolysis)等已知的反应路径所获得的乙酰(acetyl)CoA的供给下,从2分子的乙酰CoA使1分子的CoA脱离,并通过使用了对用于赋予乙酰乙酰CoA的、β-酮硫解酶(ketothiolase)(EC编号:2.3.1.9)进行编码的遗传基因或其同源染色体(homologue)的酵素反应,可进行乙酰乙酰CoA的供给。另外,以乙酰CoA和丙二酰(malonyl)CoA为基质,并使用对不可逆地生成乙酰乙酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA合成酵素(EC编号:2.3.1.194)进行编码的遗传基因或其同源染色体,也可进行乙酰乙酰CoA的供给。有关乙酰乙酰CoA合成酵素,具体可参考例如“Unprecedented acetoacetyl-coenzyme A synthesizing enzyme of thethiolase superfamily involved in the mevalonate pathway.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.107,11265-11270(2010).”等非专利文献等。接下来,通过对所获得的乙酰乙酰CoA进行还原,并藉由使用了对用于赋予3-羟丁酰CoA的反应进行催化的乙酰乙酰CoA还原酶(EC编号:1.1.1.36)、3-羟丁酰CoA脱氢酶(dehydrogenase)(EC编号:1.1.1.35)、3-羟基(hydroxyl)酰基CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.157)、或它们的同源染色体的酵素反应,可获得3-羟丁酰CoA。这里需要说明的是,在使用了乙酰乙酰CoA还原酶(EC编号:1.1.1.36)的情况下,可获得(R)-3-羟丁酰CoA,而在使用了3-羟丁酰CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.35)或3-羟基酰基CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.157)的情况下,可获得(S)-3-羟丁酰CoA。
另外,作为其他例子,作为向3-羟基丁烷(butane)酸直接转移CoA的酵素,熟知的有丙酸(propionic acid)CoA转移酵素(EC编号:2.8.3.1)。在发现了对丙酸CoA转移酵素进行编码的遗传基因或其同源染色体的情况下,并且,在进行作为CoA转移反应的供体(donor)的乙酰CoA的供给的情况下,通过向包括微生物或该微生物的培养物进行(S)(至(R))-3-羟基丁烷酸的供给,可生成与供给的3-羟基丁烷酸的手性(chirality)相对应的(S)(至(R))-3-羟丁酰CoA。
本实施方式中的同源染色体包括直系同源(ortholog)和旁系同源(paralog)。直系同源是指从基于具有共同祖先的遗传基因藉由物种分化所生成的物种间所对应的遗传基因及其藉由该遗传基因所获得的酵素组。旁系同源是指从相同物种内不是藉由物种分化而是藉由遗传基因重复所生成的物种间所对应的遗传基因及其藉由该遗传基因所获得的酵素。同源染色体是指与直系同源和旁系同源无关地从序列中具有同一性的遗传基因及其藉由该遗传基因所获得的酵素。
具体而言,上述遗传基因的同源染色体(遗传基因)是指具备与该遗传基因具有90%以上的同一性、优选为、具有95%以上的同一性的碱基序列的遗传基因,较好的是指与该遗传基因完全相同或其盐基的1个或数个发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的遗传基因。
另外,同源染色体遗传基因还包括在渐快条件下使对象遗传基因和具有互补碱基序列的遗传基因进行杂交的遗传基因。具体而言,使用对公共数据库进行检索的同族关系(homology)检索程序(例如,BLAST、FASTA等)、或者、根据使用了由认定(identification)遗传基因的至少一部分所组成的探针(prob)(由该遗传基因的碱基序列组成的DNA和由互补碱基序列组成的DNA)的渐快条件下的杂交或聚合酶(polymerase)连锁反应(PCR)等常用的方法,可获得遗传基因或藉由该其遗传基因的形质转换所得到的酵素。另外,所属技术领域的技术人员还可以通过对碱基序列进行置换等,自己来进行设计。这里需要说明的是,作为这里所说的渐快条件,例如可列举出“Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION(JosephSambrook,David W.Russell.,Cold Spring Harbor Laboratory Press)”之非专利文献中所记载的杂交条件。具体而言,杂交条件是指在包括6×SSC(1×SSC的组成:0.15M的氯化钠,0.015M的柠檬酸钠;pH:7.0)、0.5%的SDS、5×邓哈特(Denhardt’s)溶液、及100mg/mL的鲱鱼(herring)精子DNA的溶液中与探针一起进行65℃下8~16个小时的恒温保持的杂交条件。
[培养方法]
就本发明的反应而言,最简便的可通过如下方式来实现,即:例如,对形质转换体采用LB培养基等荣养培养基,在15℃~40℃、最好为18℃~37℃的温度下,进行24个小时左右的培养,之后,移殖至以通常的碳源、例如以0.01~50%、最好为0.1~30%的葡萄糖为碳源的培养基,继续在同样的温度下,进行1~200个下时左右的培养,在该过程中,培养液中会蓄积1,4-丁二醇。另外,也可以根据菌的增殖·反应的进行所导致的碳源的消耗,连续或者间歇地添加碳源,此时,反应液中的碳源浓度并不限于上述数值。
作为用于对微生物进行培养的培养基碳源,可单独或组合使用葡萄糖、蔗糖、果糖等的糖类、甘油(glycerol)等的多元醇(polyol)、乙醇(ethanol)、醋酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、安息香酸、脂肪酸等的有机物或者它们的碱性金属盐、n-石蜡等的脂肪族碳化氢类、芳香族碳化氢类、及例如蛋白胨、肉精汁(extract)、鱼精汁、大豆粉、麸等的天然有机物,其浓度通常为0.01%~30%,最好为0.1%~20%左右。
作为用于对微生物进行培养的培养基氮源,可单独或组合使用例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠、硝酸钾等的无机氮化合物、尿素、尿酸等的含氮有机物、及蛋白胨、肉精汁、鱼精汁、大豆粉等的天然有机物,浓度通常为0.01%~20%,最好为0.1%~10%左右。
再有,为了对菌的生育和酵素活性进行改善,根据需要,还可以添加磷酸2氢钾等的磷酸盐、硫酸镁、硫酸亚铁、醋酸钙、氯化锰、硫酸铜、硫酸亚铅、硫酸钴、硫酸镍等的金属盐。添加浓度因培养条件而异,一般来说,就磷酸盐而言,其为0.01%~5%,就镁盐而言,其为10ppm~1%,而就其他化合物而言,其为0.1ppm~1,000ppm左右。另外,为了对菌的生育和酵素活性进行改善,还可以根据所选择的培养基,做为维生素类、氨基酸、核酸等的供给源来添加1ppm~100ppm左右的例如酵母精汁、酪蛋白氨基酸(casamino acid)、及酵母核酸。
培养基的pH优选为调整至4.5~9,最好为调整至5~8。另外,如果采用远心分离和膜过滤等方法从培养液中分取(分离并提取)藉由上述培养基而预先培养的微生物菌体,并在包括反应原料的水、生理食盐水、或者pH被调整为与培养基的pH相同的磷酸、醋酸、硼酸,三(羟基甲基)氨基甲烷等及它们的盐所组成的缓冲液等中进行再次悬浊和反应,则可有效地减少反应液中的夹杂物,并可容易地进行之后的生成物的分取。就反应中的pH而言,在使用具有足够浓度的缓冲液的情况下一般都可被维持,但是,在随着反应的进行上述pH发生了逸脱的情况下,最好使用氢氧化钠和氨等进行适当的调整,以保持具有同样的pH。
在1,4-丁二醇于反应液中进行蓄积从而导致反应速度降低了的情况下,优选采用根据生成物的浓度向反应液中连续追加水、生理食盐水、反应缓冲液等以进行稀释的方法。另外,通过在反应速度降低了的时点对菌进行分取,并将上清(supernatant)作为生产物溶液进行回收,之后再把分取的菌再次放回包含反应原料的溶液或者悬浊液中,也可使反应速度恢复。另外,该操作可以通过远心分离器或分离膜等连续或分批地进行。
就反应液中所生成的1,4-丁二醇的分离、回收及精制而言,其可在1,4-丁二醇的生成量到达了实质的量的时点,并在藉由远心分离从反应液中除去了菌体之后或在原反应液中采用一般的有机化合物的分离、回收及精制的手段来进行。例如,针对从培养液中除去了菌体等的过滤液,可采用适当的有机溶媒等进行提取。最后,通过对该提取物本身进行蒸馏(distillation)、再采用适当的溶媒进行再提取、或者、使用硅胶等的层析进行精制或对其进行多段蒸馏等,就可获得高纯度的1,4-丁二醇。
(实施例及比较例)
接下来,通过对实施例进行说明,以对本发明进行更详细的说明。
表1中总结性地示出了想定的反应步骤、对各反应步骤进行催化的酵素、及对该酵素进行编码而使用的遗传基因的序列编号。这里需要说明的是,遗传基因的序列编号与序列表中的序列编号相对应。
[表1]
[比较例1]
在序列编号1所示的遗传基因序列的上下游,并在发现带菌媒介(vector)pET17b(Novagen公司制)的多克隆位点中,分别包括NdeI位点的上游侧CAT和下游侧ATG的上游侧和下游侧的15个盐基对长度所对应的序列被分别付加至5’末端侧和3’末端侧,据此,获得了平滑末端断片(片段),并且,该平滑末端断片是由常用方法调制的。然后,使用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara Bio公司制)将该断片和对pET17b(Novagen公司制)进行了NdeI处理了的断片进行连接(ligation),据此,获得了质粒pETBD1。
采用与pETBD1同样的方法,获得了对序列编号2所示的遗传基因序列以pET17b的NdeI位点为靶(target)进行了插入的、包括序列2的质粒pETBD2。
藉由“制限酵素处理”,对pETBD1的序列1的终止密码子(codon)下游的、源自pET17b多克隆位点的EcoRI位点进行切断,据此,调制了pETBD1的开环断片。接下来,藉由PCR,调制了在包括pETBD2的序列2的区域和上游的源自pET17b的T7启动子的区域的上下游附加了与包括所述pETBD1的EcoRI位点的上游侧15个bp的长度和下游侧15个bp的长度相对应的序列的断片。然后,使用In-Fusion HDCloning Kit对所获得的2个断片进行连接(ligation),据此,获得了包括序列1和2的质粒pETBD1-2。
接下来,同样地再以pETBD1-2的序列2的下流的序列为靶,依次追加序列编号4、6、7,获得了质粒pETBD1-2-4-6-7。这里需要说明的是,在进行序列的追加时,就被插入侧质粒的开环而言,在带菌媒介(vector)上存在不切断插入完序列的适当的制限酵素位点的情况下,由该制限酵素进行切断,而在不存在那样的位点的情况下,则由从目的插入部位开始的反向PCR来进行。据此,获得了对大肠杆菌JM109(DE3)株进行了形质转换的、大肠杆菌pETBD1-2-4-6-7/JM109(DE3)。
[实施例1]
藉由与比较例1同样的方法,获得了采用对与该步骤进行催化的酵素相对应的酵素进行编码的序列编号3和5的遗传基因,对质粒pETBD1-2-4-6-7上的序列2和4的遗传基因进行了置换的、并通过对质粒pETBD1-3-5-6-7进行调制而发生了形质转换的、大肠杆菌pETBD1-3-5-6-7/JM109(DE3)。
分别采用5mL的包括100mg/L的氨苄西林(ampicillin)的LB培养基,在37℃的温度下,对比较例和实施例中所获得的形质转换体进行了12个小时的有氧(aerobic)培养。然后,将0.1mL的培养液移植至5mL的包括1%的葡萄糖、100mg/L的氨苄西林、及0.2mM的IPTG的LB培养基,在30℃的温度下进行了48个小时的有氧培养。接下来,将培养液上清提供至高速液体层析(HPLC:柱(column)、Shodex SH-1011(昭和电工制);柱温度:60℃;溶离液:25mM硫酸水溶液;流速:0.6mL/min;检测:差动式折射计)以进行测试。构成所用的形质转换体的质粒的遗传基因和培养液中所生成的1,4-丁二醇量之间的关系示于表2中。
[表2]
从表2可知,实施例1中的1,4-丁二醇的生成率(1,4-丁二醇的生产量/1,3-丁二醇的生产量)与比较例1时相比,大约为1.5倍。
在实施例和比较例中,反应路径上经由的3-羟丁酰CoA的手征(chirality)分别为(S)体、(R)体,其他都是共同的。另外,一系列的反应都是可逆反应,并且整体上是细胞内的单纯的化学平衡,所以,在两个路径上也同样地形成了包括3-羟丁酰CoA的在物理化学上相等价的一系列的酰基CoA中间体群的细胞内平衡。所以,可以认为,细胞外所获得的1,3-丁二醇和1,4-丁二醇的比率之差是与作为除去CoA并将其导出至细胞外的步骤的酰基CoA还原酵素的催化反应的针对各CoA中间体的选择性相依存。
即,通过以经由相对于酰基CoA还原酵素的手征选择性具有适当手征(chirality)的3-羟丁酰CoA中间体的方式来构成反应路径,更具体地,通过经由具有难以被酰基CoA还原酵素进行变换·排出的手征(chirality)的3-羟丁酰CoA的方式来针对对反应路径及其反应进行催化的酵素及其酵素进行编码的遗传基因进行选择,可提供一种具有更高的生产性的1,4-丁二醇的制造方法。
另外,通过预先对要经由的3-羟丁酰CoA的手征(chirality)进行设定,并使用具有适当手征(chirality)的酰基CoA还原酵素,更具体地,通过使用对难以变换·排出所设定的手征(chirality)的3-羟丁酰CoA的酰基CoA还原酵素及其酵素进行编码的遗传基因,可提供一种具有更高的生产性的1,4-丁二醇的制造方法。
本申请主张基于2012年11月27日向日本国专利厅申请的“特愿2012-258516号”的优先权,并将“特愿2012-258516号”的全部内容援用于本申请。
Claims (10)
1.一种1,4-丁二醇的制造方法,其使用微生物及/或其培养物,并利用依次经由3-羟丁酰CoA、巴豆酰CoA、及4-羟丁酰CoA的酵素反应系来制造1,4-丁二醇,所述1,4-丁二醇的制造方法的特征在于,
所述3-羟丁酰CoA是光学活性体,
所述微生物包括:
(1)对烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因;
(2)乙烯乙酰CoAΔ-异构酶进行编码的遗传基因;
(3)4-羟丁酰CoA脱水酶进行编码的遗传基因;及
(4)对基质特异性具有与所述3-羟丁酰CoA相反的光学选择性的酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因。
2.如权利要求1所述的1,4-丁二醇的制造方法,其中,
所述微生物还包括:对提供光学活性的3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因。
3.如权利要求2所述的1,4-丁二醇的制造方法,其中,
所述乙酰乙酰CoA还原酵素是:乙酰乙酰CoA还原酵素(EC编号:1.1.1.36)、3-羟丁酰CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.35)、或3-羟酰CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.157)。
4.如权利要求2所述的1,4-丁二醇的制造方法,其中,
对所述乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下述(a)~(c)的任一个所记载的遗传基因,即:
(a)具有序列编号3的盐基序列的遗传基因;
(b)具有盐基序列的遗传基因,该盐基序列是序列编号3的盐基序列中1个或多个盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列,并且,该盐基序列相对于序列编号3的盐基序列具有90%以上的同一性;及
(c)在渐快条件下具有序列编号3的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗传基因进行杂交的遗传基因。
5.如权利要求1所述的1,4-丁二醇的制造方法,其中,
对所述酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下述(a)~(c)的任一个所记载的遗传基因,即:
(a)具有序列编号7的盐基序列的遗传基因;
(b)具有盐基序列的遗传基因,该盐基序列是序列编号7的盐基序列中1个或多个盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列,并且,该盐基序列相对于序列编号7的盐基序列具有90%以上的同一性;及
(c)在渐快条件下对具有序列编号7的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗传基因进行杂交的遗传基因。
6.一种微生物,其特征在于,包括:
(1)对烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因;
(2)对乙烯乙酰CoAΔ-异构酶进行编码的遗传基因;
(3)对4-羟丁酰CoA脱水酶进行编码的遗传基因;
(4)对相对于3-羟丁酰CoA的基质特异性为光学选择性的酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因;及
(5)对相对于3-羟丁酰CoA的基质特异性具有与所述酰基CoA还原酵素相反的光学选择性的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因。
7.如权利要求6所述的微生物,其中,
所述乙酰乙酰CoA还原酵素是:乙酰乙酰CoA还原酵素(EC编号:1.1.1.36)、3-羟丁酰CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.35)、或3-羟酰CoA脱氢酶(EC编号:1.1.1.157)。
8.如权利要求7所述的微生物,其中,
对所述乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下述(a)~(c)的任一个所记载的遗传基因,即:
(a)具有序列编号3的盐基序列的遗传基因;
(b)具有盐基序列的遗传基因,该盐基序列是序列编号3的盐基序列中1个或多个盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列,并且,该盐基序列相对于序列编号3的盐基序列具有90%以上的同一性;及
(c)在渐快条件下对具有序列编号3的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗传基因进行杂交的遗传基因。
9.如权利要求6所述的微生物,其中,
对所述酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因是下述(a)~(c)的任一个所记载的遗传基因,即:
(a)具有序列编号7的盐基序列的遗传基因;
(b)具有盐基序列的遗传基因,该盐基序列是序列编号7的盐基序列中1个或多个盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列,并且,该盐基序列相对于序列编号7的盐基序列具有90%以上的同一性;及
(c)在渐快条件下对具有序列编号7的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列的遗传基因进行杂交的遗传基因。
10.如权利要求6所述的微生物,其中,
所述微生物是是大肠杆菌、酵母、棒状细菌、及梭菌属细菌。
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