CN102559570B - 一种表达定向进化l-乳酸脱氢酶的工程菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌，是一种能够外源表达定向进化的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌；其是以商业大肠杆菌C43(DE3)为基础，通过转入含有突变NAD(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖性L-乳酸脱氢酶基因的表达载体pETDuet-1-mlldD，使其能够高表达相应的突变蛋白，具有S-扁桃酸降解活性。本发明还公开了所述工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用，是以所构建工程菌完整细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分，同时生产手性纯R-扁桃酸以及苯乙酮酸，具有底物利用率高、产物浓度高、光学纯度高以及后提取简便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种大肠杆菌工程菌及应用，尤其涉及一种能够外源表达定向进化的NAD(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌，以及所述工程菌在拆分外消旋扁桃酸，共生产R-扁桃酸和苯乙酮酸中的应用。
背景技术
R-扁桃酸及其衍生物是重要的精细化工及多种药物合成的中间体。高纯度手性R-扁桃酸可以用来合成半合成青霉素，头孢菌素，抗癌抗菌素以及抗肥胖药物《Preparation of(R)-(-)-mandelic acid and its derivatives from racemates by enantioselective degradation with anewly isolated bacterial strain Alcaligenes sp.ECU0401.Bioprocess.Biosyst.Eng.2008，31：445-451.》。R-扁桃酸还可以作为醇类的旋光拆分试剂使用《Production of R-(-)-mandelicacid from mandelonitrile by Alcaligenes faecalis ATCC 8750.Appl.Environ.Microbiol.1991，57：3028-3032》。苯乙酮酸是合成某些农药(如除草剂苯嗪草酮)和医药产品(如胃长宁)的重要中间体《化工中间体苯乙酮酸的合成初探，上海化工，2000，2，22-23》。
文献报道生物催化法生产R-扁桃酸的途径有三种，一是通过腈水解酶立体选择性的催化外消旋扁桃腈水解《Enantioselective biocatalytic hydrolysis of(R，S)-mandelonitrile forproduction of(R)-(2)-mandelic acid by a newly isolated mutant strain.J Ind MicrobiolBiotechnol.2010，38：337-345》；二是利用脂肪酶立体选择性的水解外消旋扁桃酸酯《Enzyme-catalysed optical resolution of mandelic acid via -methyl mandelate innon-aqueous media.Biochemical.Engineering.Journal.2004，19：101-107》或进行外消旋扁桃酸的酯化《Biocatalytic enantioconvergent separation of racemic mandelic acid.Separationand Purification Technology.2007，53：178-182》。三是利用微生物的氧化还原酶催化生成R-扁桃酸《Preparation of(R)-(-)-mandelic acid and its derivatives from racemates byenantioselective degradation with a newly isolated bacterial strain Alcaligenes sp.ECU0401.Bioprocess.Biosyst.Eng.2008，31：445-451.》。该类方法可使用外消旋扁桃酸，外消旋苯基-1，2-乙二醇或苯乙酮酸为底物，操作简易，不需添加共底物。其中外消旋扁桃酸来源广泛，价格低廉，使用其作为底物生产高光学纯的的R-扁桃酸具有较好的可行性。
施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri SDM，CCTCC No.M206010)含有NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶(L-iLDH)和NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶(D-iLDH)，通过针对性的保留施氏假单胞菌中L-iLDH，去除D-iLDH，可以实现外消旋乳酸及外消旋α-羟基丁酸的拆分《Enantioselective oxidation of racemic lactic acid to D-lactic acid and pyruvic acid byPseudomonas stutzeri SDM.Bioresour.Technol.2009，100：1878-188》《Kinetic resolution of2-hydroxybutanoate racemic mixtures by NAD-independent L-lactate dehydrogenase.Bioresour.Technol.2011，102：4595-4599》。但是其中L-iLDH具有较窄的底物谱，仅对于L-乳酸及L-2-羟基丁酸具有较高的活性，而对于含苯环或长链的2-羟酸无活性或仅具有微弱活性，限制了其在生物催化中的应用。
R-扁桃酸与L-乳酸具有类似的结构，利用蛋白质定点突变技术，改变L-iLDH的底物特异性，可以提高其催化S-扁桃酸的活性，通过在不含扁桃酸降解活性的大肠杆菌中外源 表达该突变蛋白制备全细胞催化剂，可以实现以外消旋扁桃酸为底物进行手性拆分，生成两种重要的中间体R-扁桃酸和苯乙酮酸。
经检索，利用外源表达突变L-iLDH的工程菌株完整细胞催化剂生产R-扁桃酸以及苯乙酮酸的方法未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够外源表达定向进化L-乳酸脱氢酶的大肠杆菌工程菌及其应用：该工程菌制备的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分，同时生产手性纯R-扁桃酸以及苯乙酮酸。
本发明所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌，其特征在于：所述工程菌是一种能够外源表达定向进化的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌，由如下方法构建获得：
(1)设计并合成PCR引物，自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri SDM)CCTCC No.M206010菌株的基因组中扩增L-iLDH的基因lldD(Genbank序列号GU373722)；其中所述引物是：
上游引物lldU：AAGCTTATGATCATTTCCGCCTCTACC，
下游引物lldD：CTCGAGTCAGACGTCAGCAGACGTTG；
(2)选取L-iLDH蛋白质序列中的108位的缬氨酸作为目标位点，设计并合成含有突变位点的PCR引物，通过PCR反应，将lldD基因第323的胸腺嘧啶核苷酸(T)改变为胞嘧啶核苷酸(C)，即相应于将蛋白质序列108位的缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)，得到突变L-iLDH基因mlldD；其中所述引物是：
上游引物lmU：TTCACCCTTTCCACCGCGTCGGTCT，
下游引物lmD：GGGAATCCCTTTCTTGTCTGCCGC；
使用DNA连接酶进行PCR反应产物的自连接，将直线型的产物重新连接为环状，完成蛋白质编码基因的定点突变；
(3)以含有T7启动子和氨苄青霉素抗性的大肠杆菌宿主适用表达载体pETDuet-1出发，将突变L-iLDH基因mlldD序列通过T4 DNA连接酶连接至表达载体，构建表达载体pETDuet-1-mlldD；
(4)使用化学转化的方法将表达载体pETDuet-1-mlldD转化至大肠杆菌C43(DE3)所制备的感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的固体LB培养基上，筛选得到含有连接突变L-iLDH基因表达载体的转化子，即得到表达突变蛋白的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌。
上述步骤中大肠杆菌感受态细胞的制备方法可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中大肠杆菌感受态制备方法。
上述步骤中的LB培养基配方为：每升蒸馏水中含有5克酵母粉，10克蛋白胨，10克氯化钠，调节pH值为7.5，121℃湿热灭菌20分钟。固体LB培养基配方为在上述配方中加入15克琼脂粉。
本发明所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用。
其中：所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分，同时生产手性纯R-扁桃酸以及苯乙酮酸。
进一步的，所述工程菌的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分的方法是：
(1)制备表达定向进化L-乳酸脱氢酶工程菌的完整细胞催化剂：
平板培养：将构建的高表达突变L-iLDH的大肠杆菌工程菌划线接种于固体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃进行培养12小时，挑取单菌落；
种子培养：将挑取的单菌落接种至5毫升液体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃培养8～10小时；
诱导培养：将工程菌种子以体积比1％的接种量接种至LB培养基中，37℃培养；OD620nm达到0.5～0.7时，加入终浓度为0.8～1.2毫摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，开始诱导突变蛋白进行表达；继续在30～37℃诱导蛋白表达6～10小时后，终止培养；分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，得到作为催化剂的表达定向进化L-乳酸脱氢酶工程菌的完整细胞悬液；
(2)将上述催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入20～25毫摩尔/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为20～40克/升；催化剂完整细胞浓度为80～120克湿细胞/升，在30～42℃，pH 6.5～7.5条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、催化剂与氧气充分混合，并以120转/分钟～180转/分钟振荡培养36～48小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。
上述步骤(2)优选的实施方式是：将上述催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入25毫摩尔/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为40克/升；催化剂完整细胞浓度为100克湿细胞/升，在37～42℃，pH 7.0条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、催化剂与氧气充分混合，并以150转/分钟振荡培养40～45小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。
利用高效液相色谱(HPLC)测定转化液中R-扁桃酸的含量及R-扁桃酸的对映体过量值：
样品处理：待测样品用两倍体积的高氯酸(5％)酸化，4℃静置2小时后，12000转/分钟离心15分钟，离心上清用0.22微米的水相滤膜过滤，然后HPLC分析样品；
R-扁桃酸及苯乙酮酸的含量测定采用Agilent1100色谱系统，色谱柱为离子交换柱(300×7.8毫米，Aminex HPX-87H column，美国Bio-Rad公司)，分析条件为以10毫摩尔/升硫酸为流动相，柱温55℃，流速为0.4毫升/分钟，进样量5微升，采用示差折光检测器(RID)进行检测；
R-扁桃酸对映体过量值测定采用Agilent1100色谱系统，色谱柱为手性柱(150×4.6毫米，DAICEL CHIRALCEL OJ-RH，日本Daicel公司)，以纯水(含0.1％醋酸)∶乙腈(体积比为90∶10)作为流动相，柱温15℃，流速为0.4毫升/分钟，进样量1微升，采用二极管阵列检测器(DAD)进行检测，波长设定为205纳米。
其中：上述对映体过量率的计算公式为：
本发明所述的表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌是一种以商业大肠杆菌菌株为基础，通过转入含有突变NAD(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖性L-乳酸脱氢酶的基因的表达载体，使其能够高表达相应的突变蛋白，具有S-扁桃酸降解活性的工程大肠杆菌。该菌株除含有大肠杆菌的各项基本生理生化特征，另含有氨苄青霉素抗性，并通过异丙基硫代 半乳糖苷(IPTG)的特异性诱导，可以启动上述突变蛋白的大量表达，从而含有S-扁桃酸降解活性。
本发明利用定点突变技术进行NAD-非依赖型L-乳酸脱氢酶的定向进化，使其催化S-扁桃酸的活力大为提高，使用不含扁桃酸降解活性的大肠杆菌构建了表达该突变蛋白的基因工程菌株，并利用该菌株制备生物催化剂，催化外消旋扁桃酸中的S-扁桃酸被选择性的转化为苯乙酮酸，从而实现制备R-扁桃酸及苯乙酮酸。
本发明拓展了L-iLDH在生物催化拆分2-羟酸中的应用，技术手段先进，效果明显，具有以下特点：
(1)菌株稳定性高，要求的培养基简单、生长周期短，成本低。
(2)外源表达突变L-iLDH的大肠杆菌完整细胞仅含有S-扁桃酸脱氢酶活力，无需预处理即可作用于外消旋扁桃酸的拆分。
(3)能拆分价格低的外消旋扁桃酸，生产R-扁桃酸，底物成本低。
(4)可作用的底物浓度高。
(5)拆分所得另外一种产物苯乙酮酸同样具很高经济价值。
(6)生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，后续分离提取费用低廉。
(7)产物R-扁桃酸对映体过量值高(可高于99.5％)。
附图说明
图1RS-扁桃酸钠标准品的HPLC离子交换色谱柱检测结果。图中峰1为磷酸盐，峰2为RS-扁桃酸钠。
图2苯乙酮酸钠标准品的HPLC离子交换色谱柱检测结果。图中峰1为磷酸盐，峰2为苯乙酮酸钠。
图3RS-扁桃酸钠标准品的HPLC手性色谱柱检测结果。图中峰1为S-扁桃酸钠，峰2为R-扁桃酸钠。
图4最终转化液的HPLC离子交换色谱柱检测结果。图中峰1为苯乙酮酸钠，峰2为剩余扁桃酸钠。
图5最终转化液的HPLC手性色谱柱检测结果。图中峰1为苯乙酮酸钠，峰2为R-扁桃酸钠。
具体实施方式
实施例1：表达定向进化L-乳酸脱氢酶工程菌的构建
(1)采用常规的方法制备施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri SDM，CCTCC No.M206010)的基因组DNA，该过程可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法。使用PCR反应，自施氏假单胞菌SDM的基因组中扩增L-iLDH的编码基因。
PCR反应程序为：
a.95℃预变性10分钟
b.95℃变性30秒
c.60℃退火30秒
d.72℃延伸1分钟
重复过程b-d 30个循环
e.补充延伸10分钟
所用引物为：
上游引物lldU：AAGCTTATGATCATTTCCGCCTCTACC，含HindIII酶切位点
下游引物lldD：CTCGAGTCAGACGTCAGCAGACGTTG，含XhoI酶切位点
在PCR扩增得到的DNA产物中加入游离的核苷酸，进行末端加A反应。将得到的DNA产物连接至经预处理的pMD-18T载体。将连接液转化大肠杆菌Match T1感受态细胞，涂布带有氯霉素抗性LB平板。得到的转化子进行质粒提取、酶切及序列测定验证，保存正确转化子，得到克隆载体pMD-18T-lldD。
(2)分析L-扁桃酸脱氢酶中影响底物特异性的氨基酸位点，选取L-iLDH的第108位缬氨酸作为目标位点，进行PCR反应，所用引物为：
上游引物lmU：TTCACCCTTTCCACCGCGTCGGTCT
下游引物lmD：GGGAATCCCTTTCTTGTCTGCCGC
PCR反应程序为：
e.95℃预变性10分钟
f.95℃变性30秒
g.68℃退火30秒
h.72℃延伸3分钟
重复过程b-d 30个循环
e.补充延伸10分钟
通过该PCR反应，将lldD基因第323的胸腺嘧啶核苷酸(T)改变为胞嘧啶核苷酸(C)，得到突变L-iLDH基因，称为mlldD，相应于将蛋白质序列108位的缬氨酸突变为丙氨酸，突变蛋白称为V108AL-iLDH。
将PCR产物加入TaKaRa Mutant Best试剂盒中的连接酶(Ligase)，进行自连接，反应条件为16℃静置1小时，重新获得环状连接有mlldD的pMD-18T载体。
(3)将连接在pMD-18T克隆载体上的mlldD基因，经限制性内切酶XhoI和HindIII处理回收后，与经相同限制性内切酶处理的载体pETDuet-1相连，使用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。
(4)将(3)中的连接液转化大肠杆菌Mach T1的感受态细胞，涂布带有氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜。
(5)挑取(4)中平板上所生长的转化子单菌落至LB培养基中培养，然后提取质粒，利用XhoI和HindIII双酶切验证其正确性，同时进行DNA测序以保证其准确性。最后保存正确转化子，得到载体pETDuet-1-mlldD。
(6)将(3)中构建的载体pETDuet-1-mlldD转化至大肠杆菌C43(DE3)感受态细胞，涂布带有氨苄青霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜。
(7)挑取(4)中平板上所生长的转化子单菌落至LB培养基中培养10小时，提取质粒，利用XhoI和HindIII双酶切验证其正确性，同时进行DNA测序以保证其准确性。最后保存正确转化子，得到表达V108AL-iLDH的大肠杆菌工程菌，即烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌。
经测定V108AL-iLDH比L-iLDH对于S-扁桃酸钠的最大反应速度(Vmax)由45.9U/mg提高至539.8U/mg。
上述步骤中大肠杆菌Mach T1购自北京全式金生物技术有限公司，大肠杆菌C43(DE3) 购自LUCIGEN公司，pMD-18T克隆载体购自TaKaRa公司，pETDuet-1表达载体购自Novagen公司，TaKaRa Mutant Best试剂盒购自TaKaRa公司。
其中上述大肠杆菌感受态细胞的制备方法可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中大肠杆菌感受态制备方法。
其中上述L-iLDH酶活单位U定义为：37℃，每分钟催化底物S-扁桃酸钠转化生成1微摩尔苯乙酮酸钠所需的酶量；L-iLDH酶活的测定方法为：在37℃，1毫升的反应体系中，含有1毫克/毫升的L-iLDH蛋白质，0.05毫摩尔/升的电子受体2，6-二氯吲哚酚钠(DCIP)，以及若干浓度的底物S-扁桃酸钠。通过分光光度计测定在600nm处光吸收的变化速率，换算为DCIP被还原的速率，进一步换算为底物S-扁桃酸钠转化为苯乙酮酸钠的速率。分光光度计使用瑞典Amersham Ultrospec 2100 Pro紫外可见分光光度计。
上述所构建的工程大肠杆菌以商业大肠杆菌C43(DE3)为基础，通过转入含有突变NAD(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖性L-乳酸脱氢酶的基因的表达载体pETDuet-1-mlldD，使其能够高表达相应的突变蛋白，具有S-扁桃酸降解活性。该菌株除含有大肠杆菌的各项基本生理生化特征，另含有氨苄青霉素抗性，并通过异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的特异性诱导，可以启动突变蛋白(蛋白质序列108位的缬氨酸突变为丙氨酸)的大量表达。
实施例2：高表达突变L-iLDH工程大肠杆菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用
(1)表达突变L-iLDH的大肠杆菌完整细胞的制备：
平板培养：将含有pETDuet-1-mlldD载体的大肠杆菌C43(DE3)菌株划线接种于固体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃进行培养12小时，挑取单菌落；
种子培养：将挑取的单菌落接种至5毫升液体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃培养10小时；
高表达突变L-iLDH全细胞催化剂的制备：将种子以1％的接种量转接至1升LB培养基(至于5升容量的三角瓶中)，37℃进行培养，至OD620nm达到0.6时，加入终浓度为1毫摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，开始诱导突变蛋白进行表达。在30℃诱导6小时后，终止培养；分离并收集菌体，用pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含突变L-iLDH的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)拆分外消旋扁桃酸：将步骤(1)中生物催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入20毫摩尔/升的EDTA，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为20克/升；生物催化剂完整细胞浓度为120克湿细胞/升，在30℃，pH 7.0条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，以160转/分钟振荡36小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。
使用HPLC进行检测，苯乙酮酸的浓度为8.6克/升，R-扁桃酸钠的浓度为10克/升，对映体过量率为78.6％。
实施例3：高表达突变L-iLDH工程大肠杆菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用
(1)表达突变L-iLDH的大肠杆菌完整细胞的制备：
平板培养：将含有pETDuet-1-mlldD载体的大肠杆菌C43(DE3)菌株划线接种于固体 LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃进行培养12小时，挑取单菌落；
种子培养：将挑取的单菌落接种至5毫升液体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃培养8小时；
高表达突变L-iLDH全细胞催化剂的制备：将种子以1％的接种量转接至1升LB培养基(至于5升容量的三角瓶中)，37℃进行培养，至OD620nm达到0.5时，加入终浓度为1.2毫摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，开始诱导突变蛋白进行表达。在30℃诱导10小时后，终止培养；分离并收集菌体，用pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含突变L-iLDH的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)拆分外消旋扁桃酸：将步骤(1)中生物催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入25毫摩尔/升的EDTA，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为20克/升；生物催化剂完整细胞浓度为80克湿细胞/升，在37℃，pH 6.5条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，以150转/分钟振荡40小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。
使用HPLC进行检测，苯乙酮酸的浓度为8.7克/升，R-扁桃酸钠的浓度为10克/升，对映体过量率为80.2％。
实施例4：高表达突变L-iLDH工程大肠杆菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用
(1)表达突变L-iLDH的大肠杆菌完整细胞的制备：
平板培养：平板培养：将含有pETDuet-1-mlldD载体的大肠杆菌C43(DE3)菌株划线接种于固体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃进行培养12小时，挑取单菌落；
种子培养：将挑取的单菌落接种至5毫升液体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃培养10小时；
高表达突变L-iLDH全细胞催化剂的制备：将种子以1％的接种量转接至1升LB培养基(至于5升容量的三角瓶中)，37℃进行培养，至OD620nm达到0.7时，加入终浓度为0.8毫摩尔的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，开始诱导突变蛋白进行表达。继续在37℃培养6小时后，终止培养；分离并收集菌体，用pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含突变L-iLDH的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)拆分外消旋扁桃酸：将步骤(1)中生物催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入25毫摩尔/升的EDTA，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为30克/升；生物催化剂完整细胞浓度为100克湿细胞/升，在37℃，pH 7.5条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，以150转/分钟振荡48小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。
使用HPLC进行检测，R-扁桃酸钠的浓度为15克/升，苯乙酮酸的浓度为14.5克/升，对映体过量率为96.7％。
实施例5：高表达突变L-iLDH工程大肠杆菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用
(1)表达突变L-iLDH的大肠杆菌完整细胞的制备：
平板培养：平板培养：将含有pETDuet-1-mlldD载体的大肠杆菌C43(DE3)菌株划线 接种于固体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃进行培养12小时，挑取单菌落；
种子培养：将挑取的单菌落接种至5毫升液体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃培养10小时；
高表达突变L-iLDH全细胞催化剂的制备：将种子以1％的接种量转接至1升LB培养基(至于5升容量的三角瓶中)，37℃进行培养，至OD620nm达到0.6时，加入终浓度为1毫摩尔/升异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，开始诱导突变蛋白进行表达。继续在37℃培养6小时后，终止培养；分离并收集菌体，用pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含突变L-iLDH的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)拆分外消旋扁桃酸：将步骤(1)中生物催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入25毫摩尔/升的EDTA，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为30克/升；生物催化剂完整细胞浓度为100克湿细胞/升，在42℃，pH 7.0条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，以120转/分钟振荡48小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。
经检测，R-扁桃酸钠的浓度为15克/升，苯乙酮酸的浓度为14.7克/升，对映体过量率为99.6％。
实施例6：高表达突变L-iLDH工程大肠杆菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用
(1)表达突变L-iLDH的大肠杆菌完整细胞的制备：
平板培养：平板培养：将含有pETDuet-1-mlldD载体的大肠杆菌C43(DE3)菌株划线接种于固体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃进行培养12小时，挑取单菌落；
种子培养：将挑取的单菌落接种至5毫升液体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37℃培养10小时；
高表达突变L-iLDH全细胞催化剂的制备：将种子以1％的接种量转接至1升LB培养基(至于5升容量的三角瓶中)，37℃进行培养，至OD620nm达到0.6时，加入终浓度为1毫摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，开始诱导突变蛋白进行表达。继续在37℃培养6小时后，终止培养；分离并收集菌体，用pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含突变L-iLDH的完整细胞悬液，4℃储存备用；
(2)拆分外消旋扁桃酸：将步骤(1)中生物催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入25毫摩尔/升的EDTA，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为40克/升；生物催化剂完整细胞浓度为100克湿细胞/升，在37℃，pH 7.0条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，以150转/分钟振荡42小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。
使用HPLC进行检测，R-扁桃酸钠的浓度为20克/升，苯乙酮酸的浓度为19.7克/升，对映体过量率为99.6％。
Claims (5)
1.一种表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌，其特征在于：所述工程菌是一种能够外源表达定向进化的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸（NAD）非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌，由如下方法构建获得：
（1）设计并合成PCR引物，自施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）CCTCC No.M206010菌株的基因组中扩增L-iLDH的基因lldD；其中所述引物是：
上游引物lldU：AAGCTTATGATCATTTCCGCCTCTACC，
下游引物lldD：CTCGAGTCAGACGTCAGCAGACGTTG；
（2）选取L-iLDH基因lldD中的108位的缬氨酸作为目标位点，设计并合成含有突变位点的PCR引物，通过PCR反应，将lldD基因第323的胸腺嘧啶核苷酸（T）改变为胞嘧啶核苷酸（C），即相应于将蛋白质序列108位的缬氨酸（Val）突变为丙氨酸（Ala），得到突变L-iLDH基因mlldD；其中所述引物是：
上游引物lmU：TTCACCCTTTCCACCGCGTCGGTCT，
下游引物lmD：GGGAATCCCTTTCTTGTCTGCCGC；
（3）以含有T7启动子和氨苄青霉素抗性的大肠杆菌宿主适用表达载体pETDuet-1出发，将突变L-iLDH基因mlldD序列通过T4DNA连接酶连接至表达载体，构建表达载体pETDuet-1-mlldD；
（4）使用化学转化的方法将表达载体pETDuet-1-mlldD转化至大肠杆菌C43（DE3）所制备的感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的固体LB培养基上，筛选得到含有连接突变L-iLDH基因表达载体的转化子，即得到表达突变蛋白的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸（NAD）非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌。
2.权利要求1所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分，同时生产手性纯R-扁桃酸以及苯乙酮酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述工程菌的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分的方法是：
（1）制备表达定向进化L-乳酸脱氢酶工程菌的完整细胞催化剂：将工程菌种子以体积比1%的接种量接种至LB培养基中，37℃培养；OD620nm达到0.5～0.7时，加入终浓度为0.8～1.2毫摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），开始诱导突变蛋白进行表达；继续在30～37℃诱导蛋白表达6～10小时后，终止培养；分离并收集菌体，用pH7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，得到作为催化剂的表达定向进化L-乳酸脱氢酶工程菌的完整细胞悬液；
（2）将上述催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入20～25毫摩尔/升的乙二胺四乙酸（EDTA），使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为20～40克/升；催化剂完整细胞浓度为80～120克湿细胞/升，在30～42℃，pH6.5～7.5条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、催 化剂与氧气充分混合，并以120转～180转/分钟振荡培养36～48小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤（2）所述方法是将上述催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入25毫摩尔/升的乙二胺四乙酸（EDTA），使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为40克/升；催化剂完整细胞浓度为100克湿细胞/升，在37～42℃，pH7.0条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、催化剂与氧气充分混合，并以150转/分钟振荡培养40～45小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。
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