CN101333554B - 一种酶法拆分外消旋乳酸生产d-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，包括(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液的制备，(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活，(3)对外消旋乳酸拆分，(4)转化液预处理，(5)D-乳酸和丙酮酸的分离，(6)D-乳酸和丙酮酸的精制等步骤。本发明具有培养基简单、生长周期短，成本低，后续分离提取费用低廉，可耐底物浓度高，产物D-乳酸对映体过量值高等特点，为价格低的外消旋乳酸的开发应用和D-乳酸的高效生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种D-乳酸的制备方法，尤其涉及一种利用微生物产生的NAD(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖性L-乳酸脱氢酶拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法。
背景技术
乳酸在化工、制药等工业及科学研究中有着广泛的用途。乳酸分为L-乳酸，D-乳酸以及外消旋乳酸(DL-乳酸)。由乳酸单体聚合合成生物可降解性高聚物聚乳酸是当今生态塑料研究的热点《Appl.Microbiol.Biotechnol.2007，74，524-534.Fermentative production of lactic acid from biomass：an overview on processdevelopments and future perspectives.》。由于L-聚乳酸与D-聚乳酸掺合可以大大改善聚乳酸的耐热性问题，使得D-乳酸生产的研究受到广泛的关注《Macromol.Biosci.2005，5，569-597.Poly(lactide)stereocomplexes：formation，structure，properties，degradation，and applications.》。
D-乳酸的生产主要依靠发酵法进行，乳酸菌在该领域得到广泛应用，然而乳酸菌对培养基成分的要求比较苛刻。基因工程手段同样应用于该领域的研究，基因工程菌的乳酸产量及生产效率均低于乳酸菌。高效D-乳酸生产菌株的难于获得，制约了D-乳酸的发酵法生产《Appl.Microbiol.Biotechnol.2008，78，449-454.Production ofD-lactic acid by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation.》。
生物催化法同样有报道应用于D-乳酸的生产。粟武，魏东芝等在《Tetrahedron：Asymmetry 2004，15，1275-1277.Enantioselective oxidation of racemic1，2-propanediol to D-(-)-lactic acid by Gluconobacter oxydans.》一文中，以氧化葡萄糖酸杆菌为催化剂，立体选择性催化外消旋2，3-丙二醇，得到对映体过量值大于99％的D-乳酸，底物转化率48％(接近理论转化率)。在底物外消旋2，3-丙二醇高于20克/升的条件下需要通过调节pH等手段保证产物D-乳酸的高对映体过量值。KenjiSoda等在《J Mol.Catal.B-Enzym.2001，11，149-153.One-pot chemo-enzymaticenantiomerization of racemates.》一文中，报道了酶法-化学法相耦联，以DL-乳酸为底物，L-乳酸氧化酶作为催化剂，硼氢化钠为还原剂，催化DL-乳酸生成D-乳酸的工艺。上述反应所用底物DL-乳酸的浓度仅为5毫摩尔/升，并且过程产生副产物过氧化氢。
由于乳酸的工业化应用对乳酸光学纯度的要求，外消旋乳酸的应用受到很大限制，因此造成外消旋乳酸的价格远低于L-乳酸，D-乳酸的价格。如果立体选择性催化外消旋乳酸中的L-乳酸生成丙酮酸，针对性保留D-乳酸，即可以通过催化过程以外消旋乳酸为底物生成D-乳酸以及另外一种重要的化工中间体-丙酮酸，这在技术上是可行的，生产上是极为经济的。
经检索利用微生物的NAD非依赖性乳酸脱氢酶(iLDH)拆分外消旋乳酸制备D-乳酸的方法目前还未见报道。
发明内容
针对外消旋乳酸应用的限制以及现有D-乳酸生产方法的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用含有NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶的生物催化剂拆分外消旋乳酸制备D-乳酸的方法。该方法具有底物利用率高(同时生产两种工业合成中间体)、产物纯度高、后提取简便等特点。
本发明的技术方案是基于申请人的前期研究，见《Appl.Microbiol.Biotechnol.2007，77，91-98.Membrane-bound L-and D-lactate dehydrogenase activities ofa newly isolated pseudomonas stutzeri strain.》一文，申请人报道了施氏假单胞菌SDM中含有D型和L型两种NAD非依赖性乳酸脱氢酶，能分别立体选择性催化L-乳酸、D-乳酸生成丙酮酸，其中NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶具有较高的温度稳定性。本发明在这一基础上，通过培养施氏假单胞菌得到的生物催化剂——NAD非依赖性乳酸脱氢酶，以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活，再立体选择性催化外消旋乳酸生成D-乳酸和丙酮酸，反应式如下：
本发明的酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，步骤如下：
(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液的制备：选取施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)SDM CCTCC No.M206010(申请人已于2006年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC))，常规培养并发酵至NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活达到200～250单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2～4次，再将菌体重悬于pH7.2～7.5、67±3毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中，并使菌体浓度达到5～60克干细胞/升，得到含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液；或者用超声波破碎完整细胞得含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液；
(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液置于45～65℃水浴中处理5～60分钟，得到仅含有NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；
(3)对外消旋乳酸拆分：将步骤(2)中制得的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度为100～700毫摩尔/升，生物催化剂浓度为1～15克干细胞/升；然后在25～40℃，pH值6.0～8.0条件下，160～200转/分钟振荡10～20小时，进行生物催化剂对外消旋乳酸的拆分，最终得到含有D-乳酸和丙酮酸的转化液；
(4)转化液预处理：将步骤(3)反应后的转化液以5,000～10,000转/分转速，离心5～10分钟，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；
(5)D-乳酸和丙酮酸的分离：弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IRA 45装柱，处理为氯型，将步骤(4)的上清液以0.5～3倍柱体积/小时的流速上样1～3倍柱体积；去离子水以0.5～3倍柱体积/小时的流速淋洗1～3倍柱体积，收集得到含D-乳酸的洗脱液；然后0.5～2.5摩尔/升盐酸以0.5～3倍柱体积/小时的流速逆流洗脱1～3倍柱体积，收集得到含丙酮酸的洗脱液；
(6)D-乳酸和丙酮酸的精制：将步骤(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脱液分别在真空度0.075～0.095兆帕，温度45～70℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-乳酸和丙酮酸产品。
利用高效液相(HPLC)测定D-乳酸和丙酮酸成品的含量及D-乳酸的对映体过量值，D-乳酸和丙酮酸的成品的含量测定采用Agilent1100色谱系统，色谱柱为反向C18柱(150×4.6毫米，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，美国Agilent公司)，分析条件为以1毫摩尔/升硫酸∶甲醇(体积比为96∶4)为流动相，柱温25℃，流速为1毫升/分钟，进样量5微升，紫外检测器波长为254纳米。D-乳酸对映体过量值测定采用Agilent1100色谱系统，色谱柱为手性柱(50×4.6毫米，MCIGEL CRS10W，日本三菱化学)，以2毫摩尔/升硫酸铜水溶液作为流动相，柱温25℃，流速为0.5毫升/分钟，进样量5微升，紫外检测器波长为254纳米。待测样品用两倍体积的高氯酸(5％)酸化，4℃静置2小时后，12000转/分钟离心15分钟，离心上清用0.45微米的水相滤膜过滤，然后HPLC分析样品。
上述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法中：
步骤(1)所述菌体的浓度优选为35～60克干细胞/升。
步骤(2)所述完整细胞悬液或者粗酶液热处理温度优选为50～60℃。
步骤(2)所述完整细胞悬液或者粗酶液热处理时间优选为5～30分钟。
步骤(3)所述DL-乳酸钠的浓度优选为300～600毫摩尔/升。
步骤(3)所述生物催化剂浓度优选为6～12克干细胞/升。
步骤(3)所述温度优选为30～37℃，所述pH值优选为6.5～7.5，所述振荡转速优选为180转/分钟。
步骤(4)所述离心转速优选为8,000～10,000转/分，离心时间优选为7～10分钟。
步骤(5)所述上样流速优选为1～2倍柱体积/小时，上样体积优选为1.5～2.5倍柱体积，去离子水淋洗流速优选为1～2倍柱体积/小时，去离子水淋洗体积优选为1.5～2.5倍柱体积，盐酸浓度优选为1～2摩尔/升，盐酸逆流洗脱流速优选为1～2倍柱体积/小时，盐酸逆流洗脱体积优选为1.5～2.5倍柱体积。
步骤(6)所述真空度优选为0.08～0.09兆帕，温度优选为55～65℃。
在上述方法中，酶活的单位(U)定义为：37℃，每分钟催化底物乳酸转化生成1微摩尔丙酮酸的酶量为一个酶活单位(U)。
本发明是一种利用热变性使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活，获得仅NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶有活力的生物催化剂，使外消旋乳酸中的L-乳酸被选择性的转化为丙酮酸，从而制备D-乳酸的方法。
本发明具有以下特点：
(1)菌株要求的培养基简单、生长周期短，成本低。
(2)能拆分价格低的外消旋乳酸，生产D-乳酸，底物成本低。
(3)可作用的底物浓度高。
(4)拆分所得另外一种产物丙酮酸同样具很高经济价值。
(5)底物转化率高，产物稳定。
(6)生物催化剂可以用过滤法或离心法去除，后续分离提取费用低廉。
(7)两种产物可以简单分离，高纯度产物容易得到。
(8)产物D-乳酸对映体过量值高(高于99.5％)。
具体实施方式
实施例1：利用P.stutzeri SDM粗酶液拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法
(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液的制备：选用施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)SDM CCTCC No.M206010菌株(该菌株申请人已于2006年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心)接种于含有1.5％的琼脂糖并加有0.5％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养20小时。将上述培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升含有0.5％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上180转/分钟振荡培养10小时，制得种子；
以5％(体积比)接种量，接种子于150毫升含有1％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养至NAD非依赖性乳酸脱氢酶酶活达到250单位/升时，终止发酵培养；
发酵液5,000转/分条件下离心10分钟，收集菌体，并用生理盐水洗涤3次；再将菌体重悬于pH7.4、67毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中，并使菌体的浓度达到45克干细胞/升，用超声波破碎菌体细胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分钟，得含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液；
(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液置于55℃水浴中处理10分钟，得到仅含NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；
(3)对外消旋乳酸拆分：将步骤(2)中制得的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度为500毫摩尔/升，生物催化剂浓度为9克干细胞/升；然后在30℃，pH7.0条件下，180转/分钟振荡10小时，实现生物催化剂对外消旋乳酸的拆分，最终得到含有D-乳酸和丙酮酸的转化液；
(4)转化液预处理：将步骤(3)反应后的转化液以8,000转/分转速，离心10分钟，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；
(5)D-乳酸和丙酮酸的分离：弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IRA 45装柱，处理为氯型，将步骤(4)的上清液以1.5倍柱体积/小时的流速上样2倍柱体积，去离子水以1.5倍柱体积/小时的流速淋洗2倍柱体积，收集得到含D-乳酸的洗脱液；然后1.5摩尔/升盐酸以1.5倍柱体积/小时的流速逆流洗脱2倍柱体积，收集得到含丙酮酸的洗脱液；
(6)D-乳酸和丙酮酸的精制：将步骤(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脱液分别在真空度0.085兆帕，温度60℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-乳酸和丙酮酸产品。高效液相检测得到的D-乳酸浓度为90.3％(质量体积比)，对映体过量值为99.8％，丙酮酸浓度为89.8％(质量体积比)。
实施例2：利用P.stutzeri SDM粗酶液拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法
(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液的制备：选用施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)SDM CCTCC No.M206010菌株接种于含有1.5％的琼脂糖并加有0.5％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养20小时。将上述培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升含有0.5％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上180转/分钟振荡培养10小时，制得种子；
以5％(体积比)接种量，接种子于150毫升含有1％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养至NAD非依赖性乳酸脱氢酶酶活达到220单位/升时，终止发酵培养；
发酵液5,000转/分条件下离心10分钟，收集菌体，并用生理盐水洗涤2次；再将菌体重悬于pH7.2、64毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中，并使菌体的浓度达到5克干细胞/升，用超声波破碎菌体细胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分钟，得含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液；
(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液置于45℃水浴中处理60分钟，得到仅含NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；
(3)对外消旋乳酸拆分：将步骤(2)中制得的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度为100毫摩尔/升，生物催化剂浓度为1克干细胞/升；然后在25℃，pH6.0条件下，160转/分钟振荡15小时，实现生物催化剂对外消旋乳酸的拆分，最终得到含有D-乳酸和丙酮酸的转化液；
(4)转化液预处理：将步骤(3)反应后的转化液以10,000转/分转速，离心5分钟，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；
(5)D-乳酸和丙酮酸的分离：弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IRA 45装柱，处理为氯型，将步骤(4)的上清液以3倍柱体积/小时的流速上样1倍柱体积，去离子水以3倍柱体积/小时的流速淋洗1倍柱体积，收集得到含D-乳酸的洗脱液；然后0.5摩尔/升盐酸以3倍柱体积/小时的流速逆流洗脱1倍柱体积，收集得到含丙酮酸的洗脱液；
(6)D-乳酸和丙酮酸的精制：将步骤(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脱液分别在真空度0.075兆帕，温度70℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-乳酸和丙酮酸产品。高效液相检测得到的D-乳酸浓度为89.5％(质量体积比)，对映体过量值为99.6％，丙酮酸浓度为89.4％(质量体积比)。
实施例3：利用P.stutzeri SDM粗酶液拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法
(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液的制备：选用施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)SDM CCTCC No.M206010菌株接种于含有1.5％的琼脂糖并加有0.5％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养20小时。将上述培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升含有0.5％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上180转/分钟振荡培养10小时，制得种子；
以5％(体积比)接种量，接种子于150毫升含有1％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养至NAD非依赖性乳酸脱氢酶酶活达到200单位/升时，终止发酵培养；
发酵液5,000转/分条件下离心10分钟，收集菌体，并用生理盐水洗涤4次；再将菌体重悬于pH7.5、70毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中，并使菌体的浓度达到60克干细胞/升，用超声波破碎菌体细胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分钟，得含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液；
(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液置于65℃水浴中处理5分钟，得到仅含NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；
(3)对外消旋乳酸拆分：将步骤(2)中制得的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度为700毫摩尔/升，生物催化剂浓度为15克干细胞/升；然后在40℃，pH8.0条件下，200转/分钟振荡20小时，实现生物催化剂对外消旋乳酸的拆分，最终得到含有D-乳酸和丙酮酸的转化液；
(4)转化液预处理：将步骤(3)反应后的转化液以5,000转/分转速，离心10分钟，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；
(5)D-乳酸和丙酮酸的分离：弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IRA 45装柱，处理为氯型，将步骤(4)的上清液以0.5倍柱体积/小时的流速上样3倍柱体积，去离子水以0.5倍柱体积/小时的流速淋洗3倍柱体积，收集得到含D-乳酸的洗脱液；然后2.5摩尔/升盐酸以0.5倍柱体积/小时的流速逆流洗脱3倍柱体积，收集得到含丙酮酸的洗脱液；
(6)D-乳酸和丙酮酸的精制：将步骤(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脱液分别在真空度0.095兆帕，温度45℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-乳酸和丙酮酸产品。高效液相检测得到的D-乳酸浓度为88.7％(质量体积比)，对映体过量值为99.7％，丙酮酸浓度为89.7％(质量体积比)。
实施例4：利用P.stutzeri SDM完整细胞悬液拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法
(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液的制备：选用施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)SDM CCTCC No.M206010菌株接种于含有1.5％的琼脂糖并加有0.5％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养20小时。将上述培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升含有0.5％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上180转/分钟振荡培养10小时，制得种子；
以5％(体积比)接种量，接种子于150毫升含有1％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养至NAD非依赖性乳酸脱氢酶酶活达到250单位/升时，终止发酵培养；
发酵液5,000转/分条件下离心10分钟，收集菌体，并用生理盐水洗涤3次；再将菌体重悬于pH7.4、67毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中，并使菌体的浓度达到45克干细胞/升，得到含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液；
(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液置于65℃水浴中处理5分钟，得到仅含NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；
(3)对外消旋乳酸拆分：将步骤(2)中制得的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度为700毫摩尔/升，生物催化剂浓度为15克干细胞/升；然后在40℃，pH8.0条件下，200转/分钟振荡20小时，实现生物催化剂对外消旋乳酸的拆分，最终得到含有D-乳酸和丙酮酸的转化液；
(4)转化液预处理：将步骤(3)反应后的转化液以5,000转/分转速，离心10分钟，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；
(5)D-乳酸和丙酮酸的分离：弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IRA 45装柱，处理为氯型，将步骤(4)的上清液以0.5倍柱体积/小时的流速上样3倍柱体积，去离子水以0.5倍柱体积/小时的流速淋洗3倍柱体积，收集得到含D-乳酸的洗脱液；然后2.5摩尔/升盐酸以0.5倍柱体积/小时的流速逆流洗脱3倍柱体积，收集得到含丙酮酸的洗脱液；
(6)D-乳酸和丙酮酸的精制：将步骤(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脱液分别在真空度0.095兆帕，温度45℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-乳酸和丙酮酸产品。高效液相检测得到的D-乳酸浓度为88.7％(质量体积比)，对映体过量值为99.7％，丙酮酸浓度为89.7％(质量体积比)。
实施例5：利用P.stutzeri SDM完整细胞悬液拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法
(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液的制备：选用施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)SDM CCTCC No.M206010菌株接种于含有1.5％的琼脂糖并加有0.5％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养20小时。将上述培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升含有0.5％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上180转/分钟振荡培养10小时，制得种子；
以5％(体积比)接种量，接种子于150毫升含有1％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养至NAD非依赖性乳酸脱氢酶酶活达到200单位/升时，终止发酵培养；
发酵液5,000转/分条件下离心10分钟，收集菌体，并用生理盐水洗涤3次；再将菌体重悬于pH7.5、70毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中，并使菌体的浓度达到60克干细胞/升，得到含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液；
(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液置于55℃水浴中处理10分钟，得到仅含NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；
(3)对外消旋乳酸拆分：将步骤(2)中制得的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度为500毫摩尔/升，生物催化剂浓度为9克干细胞/升；然后在30℃，pH7.0条件下，180转/分钟振荡10小时，实现生物催化剂对外消旋乳酸的拆分，最终得到含有D-乳酸和丙酮酸的转化液；
(4)转化液预处理：将步骤(3)反应后的转化液以8,000转/分转速，离心10分钟，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；
(5)D-乳酸和丙酮酸的分离：弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IRA 45装柱，处理为氯型，将步骤(4)的上清液以1.5倍柱体积/小时的流速上样2倍柱体积，去离子水以1.5倍柱体积/小时的流速淋洗2倍柱体积，收集得到含D-乳酸的洗脱液；然后1.5摩尔/升盐酸以1.5倍柱体积/小时的流速逆流洗脱2倍柱体积，收集得到含丙酮酸的洗脱液；
(6)D-乳酸和丙酮酸的精制：将步骤(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脱液分别在真空度0.085兆帕，温度60℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-乳酸和丙酮酸产品。高效液相检测得到的D-乳酸浓度为89.9％(质量体积比)，对映体过量值为99.7％，丙酮酸浓度为89.6％(质量体积比)。
实施例6：利用P.stutzeri SDM完整细胞悬液拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法
(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液的制备：选用施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)SDM CCTCC No.M206010菌株接种于含有1.5％的琼脂糖并加有0.5％DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，30℃培养20小时。将上述培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于50毫升含有0.5％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上180转/分钟振荡培养10小时，制得种子；
以5％(体积比)接种量，接种子于150毫升含有1％DL-乳酸钠的液体基本培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养至NAD非依赖性乳酸脱氢酶酶活达到220单位/升时，终止发酵培养；
发酵液5,000转/分条件下离心10分钟，收集菌体，并用生理盐水洗涤2次；再将菌体重悬于pH7.2、64毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中，并使菌体的浓度达到5克干细胞/升，得到含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液；
(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液置于45℃水浴中处理60分钟，得到仅含NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；
(3)对外消旋乳酸拆分：将步骤(2)中制得的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度为100毫摩尔/升，生物催化剂浓度为1克干细胞/升；然后在25℃，pH6.0条件下，160转/分钟振荡15小时，实现生物催化剂对外消旋乳酸的拆分，最终得到含有D-乳酸和丙酮酸的转化液；
(4)转化液预处理：将步骤(3)反应后的转化液以10,000转/分转速，离心5分钟，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；
(5)D-乳酸和丙酮酸的分离：弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IRA 45装柱，处理为氯型，将步骤(4)的上清液以3倍柱体积/小时的流速上样1倍柱体积，去离子水以3倍柱体积/小时的流速淋洗1倍柱体积，收集得到含D-乳酸的洗脱液；然后0.5摩尔/升盐酸以3倍柱体积/小时的流速逆流洗脱1倍柱体积，收集得到含丙酮酸的洗脱液；
(6)D-乳酸和丙酮酸的精制：将步骤(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脱液分别在真空度0.075兆帕，温度70℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-乳酸和丙酮酸产品。高效液相检测得到的D-乳酸浓度为89.6％(质量体积比)，对映体过量值为99.7％，丙酮酸浓度为89.2％(质量体积比)。
上述实施例中，固体斜面基本培养基配方(克/升)如下：
KH2PO4 1，K2HPO4·3H2O 0.8，NH4Cl 1，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.05，金属离子混合液1.2毫升/升。调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟，琼脂粉15。
液体基本培养基配方(克/升)如下：
KH2PO4 1，K2HPO4·3H2O 0.8，NH4Cl 1，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.05，金属离子混合液1.2毫升/升。调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟。
金属离子混合液的配方如下(克/升)：
Na2EDTA，50；ZnSO4·7H2O，20；MnCl2·4H2O，5；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1，；FeSO4·7H2O，5；CuSO4·5H2O，1.5；CoCl2·H2O，1.6；CaCl2·2H2O，5.5。
上述实施例中，高效液相(HPLC)测定D-乳酸和丙酮酸成品的含量及D-乳酸的对映体过量值的实施条件是：
D-乳酸和丙酮酸的成品的含量测定采用Agilent1100色谱系统，色谱柱为反向C18柱(150×4.6毫米，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，美国Agilent公司)，分析条件为以1毫摩尔/升硫酸∶甲醇(体积比为96∶4)为流动相，柱温25℃，流速为1毫升/分钟，进样量5微升，紫外检测器波长为254纳米。
D-乳酸对映体过量值测定采用Agilent1100色谱系统，色谱柱为手性柱(50×4.6毫米，MCIGEL CRS10W，日本三菱化学)，以2毫摩尔/升硫酸铜水溶液作为流动相，柱温25℃，流速为0.5毫升/分钟，进样量5微升，紫外检测器波长为254纳米。待测样品用两倍体积的高氯酸(5％)酸化，4℃静置2小时后，12000转/分钟离心15分钟，离心上清用0.45微米的水相滤膜过滤，然后HPLC分析样品。
Claims (10)
1.一种酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，步骤如下：
(1)含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液的制备：选取施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)SDM CCTCC No.M206010，常规培养并发酵至NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活达到200～250单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2～4次，再将菌体重悬于pH7.2～7.5、67±3毫摩尔/升的磷酸钾缓冲液中，并使菌体浓度达到5～60克干细胞/升，得到含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液；或者用超声波破碎完整细胞得含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的粗酶液；
(2)以热变性的方法使NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶失活：取步骤(1)制得的含NAD非依赖性乳酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液置于45～65℃水浴中处理5～60分钟，得到仅含有NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶活力的生物催化剂，4℃储存，备用；
(3)对外消旋乳酸拆分：将步骤(2)中制得的生物催化剂与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的浓度为100～700毫摩尔/升，生物催化剂浓度为1～15克干细胞/升；然后在25～40℃，pH值6.0～8.0条件下，160～200转/分钟振荡10～20小时，进行生物催化剂对外消旋乳酸的拆分，最终得到含有D-乳酸和丙酮酸的转化液；
(4)转化液预处理：将步骤(3)反应后的转化液以5,000～10,000转/分钟的转速，离心5～10分钟，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；
(5)D-乳酸和丙酮酸的分离：弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IRA 45装柱，处理为氯型，将步骤(4)的上清液以0.5～3倍柱体积/小时的流速上样1～3倍柱体积；去离子水以0.5～3倍柱体积/小时的流速淋洗1～3倍柱体积，收集得到含D-乳酸的洗脱液；然后0.5～2.5摩尔/升盐酸以0.5～3倍柱体积/小时的流速逆流洗脱1～3倍柱体积，收集得到含丙酮酸的洗脱液；
(6)D-乳酸和丙酮酸的精制：将步骤(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脱液分别在真空度0.075～0.095兆帕，温度45～70℃的条件下减压蒸馏浓缩得到D-乳酸和丙酮酸产品。
2.如权利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，其特征在于，步骤(1)所述菌体的浓度为35～60克干细胞/升。
3.如权利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述完整细胞悬液或者粗酶液热处理温度为50～60℃。
4.如权利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述完整细胞悬液或者粗酶液热处理时间为5～30分钟。
5.如权利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述DL-乳酸钠的浓度为300～600毫摩尔/升。
6.如权利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述生物催化剂浓度为6～12克干细胞/升。
7.如权利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述温度为30～37℃，所述pH为6.5～7.5，所述振荡转速为180转/分钟。
8.如权利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，其特征在于，步骤(4)所述离心转速为8,000～10,000转/分，离心时间为7～10分钟。
9.如权利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，其特征在于，步骤(5)所述上样流速为1～2倍柱体积/小时，上样体积为1.5～2.5倍柱体积，去离子水淋洗流速为1～2倍柱体积/小时，去离子水淋洗体积为1.5～2.5倍柱体积，盐酸浓度为1～2摩尔/升，盐酸逆流洗脱流速为1～2倍柱体积/小时，盐酸逆流洗脱体积为1.5～2.5倍柱体积。
10.如权利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生产D-乳酸的方法，其特征在于，步骤(6)所述真空度为0.08～0.09兆帕，温度为55～65℃。
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