CN107267476B - 一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用 - Google Patents

一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用。本发明提供了一种蛋白质，是在现有蛋白质的基础上进行定点突变得到的，命名为D‑LDH*蛋白，是由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。编码所述D‑LDH*蛋白的基因(命名为D‑ldh*基因)也属于本发明的保护范围。含有所述D‑ldh*基因的重组微生物也属于本发明的保护范围。所述重组微生物具体可通过如下方法制备得到：将所述重组质粒甲导入出发菌，得到重组菌甲；所述出发菌为蓝藻。本发明提供的重组菌采用蓝藻为出发微生物，生产光学纯D‑乳酸。

Description

一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用。
背景技术
全球面临的能源问题、环境问题向人们提出了发展可再生清洁能源化学品的要求。乳酸是生产聚乳酸的单体。聚乳酸是理想的绿色高分子材料，可完全生物降解，具有良好的机械性能、物理特性、生物相容性及防腐、耐菌性等优点，是其它生物降解材料所无法比拟的。聚乳酸是传统塑料制品的理想替代品，可应用于各行各业，如生产生物可降解塑料及人工合成生物组织等。全球每年对塑料的需求量是200亿公斤，而聚乳酸的产量只有450万公斤。由此可见全球对生产聚乳酸的原料乳酸的需求。
乳酸又称2-羟基丙酸。因分子中有一个不对称碳原子，而具有旋光性。因此乳酸有L-乳酸和D-乳酸两种旋光异构体。不同光学性质的乳酸用途不同。聚乳酸的性能与D-乳酸的含量相关，因此D-乳酸是生产优质聚乳酸所必须的。由此可见生产光学纯D-乳酸的重要性及必要性。
乳酸的生产方法有发酵法、化学合成法和酶转化法。发酵法主要是以粮食为原料，由乳酸菌对粮食淀粉发酵生产乳酸。化学发和酶法是以能源化学品为原料，具有污染环境的弊端。上述方法主要用于生产L-乳酸或消旋乳酸LD-乳酸，而对光学纯D-乳酸的生产是随着聚乳酸的广泛应用而兴起的。为减缓能源短缺及避免污染环境，近年来科研人员尝试通过代谢工程改造细菌用发酵法生产光学纯乳酸。
乳酸脱氢酶是生物合成乳酸的关键酶，通过把丙酮酸还原来合成乳酸。乳酸脱氢酶(L-LDH)根据其辅因子偏好性分为NADH依赖型和NADPH依赖型，而天然的乳酸脱氢酶多为NADH依赖型。通常异养菌中辅因子以NADH为主，而光合自养菌(如蓝藻)中辅因子以NADPH为主，因子乳酸脱氢酶的辅因子选择性限制了生物合成乳酸的宿主选择范围。此外，乳酸脱氢酶根据其催化的产物不同分为L-乳酸脱氢酶(L-LDH)和D-乳酸脱氢酶(D-LDH)两种，天然的乳酸脱氢酶多是L型的。因此，为了满足生物合成光学纯D-乳酸的需求，对现有D-乳酸脱氢酶进行改造是非常必要的，提高D-乳酸脱氢酶活性，同时拓宽其辅因子选择性，使其可以同时高效利用NADH和NADPH两种辅因子，不仅可以提高催化效率，还可以避免生物合成乳酸的宿主只能选择以NADH为主的异养菌的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用。
本发明提供了一种蛋白质，是在现有蛋白质的基础上进行定点突变得到的，命名为D-LDH*蛋白，是如下(a1)至(a6)中的任一种：
(a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乳酸脱氢酶活性的由序列3衍生的蛋白质；
(a3)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列3衍生的蛋白质；
(a4)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a5)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乳酸脱氢酶活性的由序列7衍生的蛋白质；
(a6)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列7衍生的蛋白质。
编码所述D-LDH*蛋白的基因(命名为D-ldh*基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下(b1)至(b10)中的任一种：
(b1)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码乳酸脱氢酶的DNA分子；
(b3)与(b1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码乳酸脱氢酶的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b1)限定的DNA序列杂交且编码D-乳酸脱氢酶的DNA分子；
(b5)与(b1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码D-乳酸脱氢酶的DNA分子；
(b6)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子；
(b7)在严格条件下与(b6)限定的DNA序列杂交且编码乳酸脱氢酶的DNA分子；
(b8)与(b6)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码乳酸脱氢酶的DNA分子；
(b9)在严格条件下与(b6)限定的DNA序列杂交且编码D-乳酸脱氢酶的DNA分子；
(b10)与(b6)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码D-乳酸脱氢酶的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有所述D-ldh*基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为：将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pBR322载体的多克隆位点(例如HindIII酶切位点和BamHI酶切位点之间)得到重组质粒甲。
所述重组表达载体具体可为：将序列表的序列4自5’末端第4至999位核苷酸所示的双链DNA分子插入pEASY-blunt E2载体得到的重组质粒丙。
所述重组微生物具体可通过如下方法制备得到：将所述重组质粒甲导入出发菌，得到重组菌甲；所述出发菌为如下(c1)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c7)或(c8)：(c1)光合微生物；(c2)藻类微生物；(c3)蓝藻门微生物；(c4)色球藻科微生物；(c5)聚球藻属微生物；(c6)蓝藻；(c7)淡水蓝藻聚球藻；(c8)淡水蓝藻聚球藻2973。
所述重组微生物具体可通过如下方法制备得到：将所述重组质粒丙导入大肠杆菌，得到重组菌丙。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21。
本发明还保护以上任一所述所述重组微生物在制备所述D-LDH*蛋白中的应用。
本发明还保护如下(d1)、(d2)或(d3)在制备乳酸中的应用：(d1)所述D-LDH*蛋白；(d2)所述D-ldh*基因；(d3)以上任一所述重组微生物。所述乳酸具体可为D-乳酸。
本发明还保护一种制备乳酸的方法，包括如下步骤：将所述重组菌甲进行光照培养。
所述光照培养的培养基为以无机碳为唯一碳源的液体培养基。所述光照培养的培养基具体可为BG11培养基。
所述光照培养的温度为38-41℃，具体可为40℃。所述光照培养的光照强度为200μmol/m2/s-500μmol/m2/s，具体可为200μmol/m2/s。所述光照培养可为振荡培养。所述振荡培养的振荡频率为100rpm-150rpm，具体可为100rpm。所述光照培养的时间为5天-8天，具体可为6天。
所述光照培养的初始时刻，培养体系的OD730nm＝2。
所述方法还包括如下步骤：完成所述光照培养后，离心收集上清液。乳酸存在于所述上清液中。所述离心的条件具体可为14000rpm、2min。
所述乳酸具体可为D-乳酸。
本发明还保护所述D-LDH*蛋白作为D-乳酸脱氢酶的应用。所述应用中，所述D-LDH*蛋白利用NADH和/或NADPH为辅因子。
本发明提供的乳酸脱氢酶是在现有乳酸脱氢酶的基础上进行点突变得到的(通过定点突变进行了三个氨基酸残基的改变，D176S、I177R和F178T)，可以同时高效利用NADH和NADPH为辅因子，而且伴随有酶活性的大幅提高。
蓝藻为光合自养菌，可以利用太阳能将CO2直接转化为有机物，可以在海水和污水中生长，其细胞倍增时间可与异氧微生物酵母相比。本发明提供的重组菌采用蓝藻为出发微生物，生产光学纯D-乳酸。
附图说明
图1为实施例2中采用液相色谱检测乳酸的含量的结果。
图2为实施例2中采用液相色谱检测乳酸的光学纯度(手性分析)的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置十次重复实验，结果取平均值。
淡水蓝藻聚球藻2973属于色球藻科、聚球藻属；参考文献：Synechococcuselongatus UTEX 2973,afast growing cyanobacterial chassis forbiosynthesisusing light and CO2.Scientific Reports,2015,5:8132|DOI:10.1038/srep08132，公众可从UTEX Culture Collection of Algae,University of Texas at Austin,205W.24thStreet-BIO#218,Austin,TX 78712获得。实施例中的淡水蓝藻聚球藻2973即为参考文献中的Synechococcus elongatus UTEX 2973。
pBR322载体：NEB，北京百灵克公司，产物目录号N3033s。pEASY-blunt E2：Transgen公司，产物目录号CE211-01。大肠杆菌BL21：Transgen公司，产物目录号CE211-01。D-乳酸：Wako、日本和光公司,产品目录号CDH5485。L-乳酸：Wako、日本和光公司,产品目录号CDH5484。
BG-11培养基的组成见表1。Trace metal mix A5的组成见表2。
表1 BG-11培养基的组成
组分 组分在培养基中的含量
NaNO<sub>3</sub> 1.5g/L
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.04g/L
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.075g/L
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 0.036g/L
柠檬酸 0.006g/L
柠檬酸铁铵 0.006g/L
EDTA-Na<sub>2</sub> 0.001g/L
Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 0.02g/L
Trace metal mix A5 1.0ml/L
琼脂 10.0g/L
蒸馏水 补足1L
pH 8.0
表2 Trace metal mix A5的组成
德式乳酸菌(Lactobacillusdelbrueckii)11842的NADH依赖型D-乳酸脱氢酶如序列表的序列1所示(用D-LDH表示)，其编码基因如序列表的序列2所示(用D-ldh表示)。
本发明提供的可以同时高效利用NADH和NADPH为辅因子的D-乳酸脱氢酶如序列表的序列3所示(用D-LDH*表示)，其编码基因如序列表的序列4所示(用D-ldh*表示)。
与序列2相比，序列4的差异在于：将序列2中第526-534位核苷酸由“GATATTTTT”突变为了“AGTCGGACC”。
与序列1相比，序列3的差异在于：将序列1中第176-178位氨基酸残基由“DIF”突变为了“SRT”。
实施例1、制备重组菌
1、将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pBR322载体的HindIII和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒甲。
2、将步骤1得到的重组质粒甲导入淡水蓝藻聚球藻2973，得到重组菌甲。
3、将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pBR322载体的HindIII和BamHI酶切位点之间，得到重组质粒乙。
4、将步骤3得到的重组质粒乙导入淡水蓝藻聚球藻2973，得到重组菌乙。
实施例2、利用重组菌制备D-乳酸
分别采用实施例1制备的重组菌甲或重组菌乙进行如下步骤：
1、将重组菌接种至BG11培养基(初始时刻，培养体系的OD730nm≈2)，然后40℃、100rpm光照培养(光照强度为200μmol/m2/s)6天。
2、完成步骤1后，取整个培养体系，14000rpm离心2min，分别收集上清液和菌体沉淀。
3、取步骤2得到的菌体沉淀，60℃烘干至恒重，称重，得到菌体干重。
4、取步骤2得到的上清液，采用液相色谱检测乳酸的含量。
色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRad Aminex HPX-87 H有机酸柱(300*7.8mm)；柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H2SO4水溶液，流速0.5ml/min。标准品为D-乳酸。上述色谱条件下，不能区分L-乳酸和D-乳酸，因此虽然采用D-乳酸作为标准品，但检测结果反应的是包括L-乳酸和D-乳酸在内的乳酸含量。
标准品的出峰时间为15分钟。标准曲线方程为：y＝86400x+4000(R2＝0.9995)(x为标准品乳酸的含量，单位为g/L；y为峰面积S)。
重组菌甲步骤2得到的上清液的色谱图见图1，在15分钟处显示出峰，说明其中含有乳酸。将峰面积带入标准曲线方程，计算得到乳酸含量。重组菌甲步骤2得到的上清液中的乳酸浓度为2g/L，乳酸产量与细胞干重的质量比为50％。重组菌乙步骤2得到的上清液中的乳酸浓度为0.6g/L，乳酸产量与细胞干重的质量比为10％。
5、取步骤2得到的上清液，采用液相色谱检测乳酸的光学纯度(手性分析)。
色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，紫外检测器；MCI GEL CRSLOW手性柱(4.6*50mm)；柱温25℃；上样量10μl；流动相为2mM H2SO4水溶液，流速0.5ml/min。标准品为D-乳酸和L-乳酸。上述色谱条件下，能区分L-乳酸和D-乳酸。
D-乳酸标准品的出峰时间为9分钟。L-乳酸标准品的出峰时间为11分钟。
重组菌甲步骤2得到的上清液的结果见图2，在9分钟处显示出峰，在11分钟处没有显示出峰，说明上清液中只含有D-乳酸、不含有L-乳酸。
实施例3、制备重组菌和融合蛋白
一、制备重组菌
1、将序列表的序列4自5’末端第4至999位核苷酸所示的双链DNA分子插入pEASY-blunt E2载体，得到重组质粒丙。序列表的序列4所示的双链DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸形成序列表的序列8所示的融合基因，表达序列表的序列7所示的融合蛋白(命名为融合蛋白丙，融合蛋白丙中含有去除第一位氨基酸残基后的D-LDH*和His标签)。
2、将步骤1得到的重组质粒丙导入大肠杆菌BL21，得到重组菌丙。
3、将序列表的序列2第4至999位所示的双链DNA分子插入pEASY-blunt E2载体，得到重组质粒丁。序列表的序列2所示的双链DNA分子与载体骨架上的部分核苷酸形成序列表的序列6所示的融合基因，表达序列表的序列5所示的融合蛋白(命名为融合蛋白丁，融合蛋白丙中含有去除第一位氨基酸残基后的D-LDH和His标签)。
4、将步骤3得到的重组质粒丁导入大肠杆菌BL21，得到重组菌丁。
二、制备重组蛋白
分别采用重组菌丙或重组菌丁进行如下步骤：
1、将重组菌接种至LB液体培养基，37℃、180rpm振荡培养至OD600nm＝0.7。
2、完成步骤1后，取培养体系，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为500μM，然后30℃、180rpm振荡培养7小时。
3、完成步骤2后，4℃、6000rpm离心5分钟，收集菌体沉淀。
4、取步骤3得到的菌体沉淀，先用蒸馏水洗涤1次，再用Binding Bufer洗涤2次。
5、完成步骤4后，取菌体沉淀，用Binding Bufer重悬，然后进行超声破碎(变幅杆6mm,功率40％，总时间40分钟，超声4秒停4秒，0℃)，然后4℃、15000rpm离心30分钟，收集上清液。
6、取步骤5得到的上清液，用孔径为0.22微米的滤膜过滤，收集滤液。
7、将步骤6得到的滤液上样于镍柱；然后用10mL Binding Bufer洗涤；然后用3mLelution Buffer洗脱，收集洗脱过程中第1.5至2.5毫升过柱后溶液，即为目标蛋白溶液。
镍柱、Binding Bufer、elution Buffer均为GE Healthcare公司的HisGraviTrapTM系列的Ni SephraseTM 6Fast Flow试剂盒(产品号是11-0033-99)内的组件。
重组菌丙进行上述步骤，得到的目标蛋白溶液命名为融合蛋白丙溶液。
重组菌丙进行上述步骤，得到的目标蛋白溶液命名为融合蛋白丁溶液。
实施例4、融合蛋白的酶学特性表征
一、酶活测定
反应体系(200μL，pH6.5)：含150mM磷酸二氢钠、300μM辅因子、2.5mM MgCl2、40ng融合蛋白(融合蛋白为融合蛋白丙或融合蛋白丁，加入形式为实施例3制备的融合蛋白丙溶液或融合蛋白丁溶液)、30mM丙酮酸钠，余量为水。辅因子为NADH或NADPH。
30℃孵育2分钟。
检测孵育前和孵育2分钟后的OD340nm值。
以NADH为辅因子的标准曲线：y＝3.8291x+0.034(R2＝0.9981)；y:孵育前的吸光度(A340nm)值-孵育2分钟后的吸光度(A340nm)值；x:NADH浓度(mM)。
以NADPH为辅因子的标准曲线：y＝3.8618x+0.0366(R2＝0.992)；y:孵育前的吸光度(A340nm)值-孵育2分钟后的吸光度(A340nm)值；x:NADPH浓度(mM)。
融合蛋白丙：以NADPH为辅因子的酶活为2894±47μmol/min/mg；以NADH为辅因子的酶活为1565±61μmol/min/mg。
融合蛋白丁：以NADPH为辅因子的酶活为52±3μmol/min/mg；以NADH为辅因子的酶活为1284±37μmol/min/mg。
二、酶动力学参数分析
反应体系(200μL)：溶剂为PBS缓冲液(pH6.5、100mM)，含不同浓度的辅因子、2.5mMMgCl2、100ng融合蛋白(融合蛋白为融合蛋白丙或融合蛋白丁，加入形式为实施例3制备的融合蛋白丙溶液或融合蛋白丁溶液)、20mM丙酮酸钠。辅因子为NADH或NADPH。
30℃孵育。检测OD340nm值。
用Michaelis-Menten方程计算动力学参数。
融合蛋白丙：以NADPH为辅因子时Kcat为8850/s，Km为0.266mM；以NADH为辅因子时Kcat为8630/s，Km为1.05mM。
融合蛋白丁：以NADPH为辅因子时Kcat为833/s，Km为4.16mM；以NADH为辅因子时Kcat为8008/s，Km为1.47mM。

Claims (17)

1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a4)：
(a1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a4)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)或(b6)：
(b1)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；
(b6)编码区如序列表中序列8所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pBR322载体的多克隆位点得到重组质粒。
6.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是通过如下方法制备得到的：将权利要求5所述重组表达载体导入出发菌；所述出发菌为光合微生物。
7.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是通过如下方法制备得到的：将权利要求5所述重组表达载体导入出发菌；所述出发菌为藻类微生物。
8.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是通过如下方法制备得到的：将权利要求5所述重组表达载体导入出发菌；所述出发菌为蓝藻门微生物。
9.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是通过如下方法制备得到的：将权利要求5所述重组表达载体导入出发菌；所述出发菌为色球藻科微生物。
10.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是通过如下方法制备得到的：将权利要求5所述重组表达载体导入出发菌；所述出发菌为聚球藻属微生物。
11.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是通过如下方法制备得到的：将权利要求5所述重组表达载体导入出发菌；所述出发菌为蓝藻。
12.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是通过如下方法制备得到的：将权利要求5所述重组表达载体导入出发菌；所述出发菌为淡水蓝藻聚球藻。
13.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物是通过如下方法制备得到的：将权利要求5所述重组表达载体导入出发菌；所述出发菌为淡水蓝藻聚球藻2973。
14.权利要求6至13中任一所述重组微生物在制备权利要求1所述蛋白质中的应用。
15.如下(d1)、(d2)或(d3)在制备乳酸中的应用：
(d1)权利要求1所述蛋白质；
(d2)权利要求2或3所述基因；
(d3)权利要求6至13中任一所述重组微生物。
16.一种制备乳酸的方法，包括如下步骤：将权利要求6至13中任一所述重组微生物进行光照培养。
17.权利要求1所述蛋白质作为D-乳酸脱氢酶的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108034644B (zh) * 2018-01-15 2020-03-06 江南大学 一种催化效率提高的l-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法
CN113736814A (zh) * 2021-09-29 2021-12-03 上海交通大学 生产聚乳酸的基因工程菌株及生产聚乳酸的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302503A (zh) * 2007-05-08 2008-11-12 上海医药工业研究院 突变的植物乳杆菌d-乳酸脱氢酶及其基因、重组酶和应用
CN102517303A (zh) * 2011-11-24 2012-06-27 中国科学院微生物研究所 一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用
CN102766608A (zh) * 2012-06-20 2012-11-07 中国科学院微生物研究所 菊糖芽孢乳杆菌的d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用
CN103562381A (zh) * 2011-03-29 2014-02-05 雀巢产品技术援助有限公司 缺失d-乳酸产生并且具有改进的贮藏期限的约氏乳杆菌菌株cncm i-1225的衍生物
CN104395456A (zh) * 2012-04-24 2015-03-04 Cj第一制糖株式会社 生产d-乳酸的新型菌株及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140045235A1 (en) * 2012-08-12 2014-02-13 Wisconsin Alumi Research Foundation Construction of a lactobacillus casei ethanologen
US9506915B2 (en) * 2012-11-15 2016-11-29 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methods and kits for isolation and analysis of a chromatin region

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302503A (zh) * 2007-05-08 2008-11-12 上海医药工业研究院 突变的植物乳杆菌d-乳酸脱氢酶及其基因、重组酶和应用
CN103562381A (zh) * 2011-03-29 2014-02-05 雀巢产品技术援助有限公司 缺失d-乳酸产生并且具有改进的贮藏期限的约氏乳杆菌菌株cncm i-1225的衍生物
CN102517303A (zh) * 2011-11-24 2012-06-27 中国科学院微生物研究所 一种产乳酸的重组蓝藻及其制备方法与应用
CN104395456A (zh) * 2012-04-24 2015-03-04 Cj第一制糖株式会社 生产d-乳酸的新型菌株及其用途
CN102766608A (zh) * 2012-06-20 2012-11-07 中国科学院微生物研究所 菊糖芽孢乳杆菌的d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Roles of Hs205, His296, His303 and Asp259 in catalysis by NAD(+)-specific D-lactate dehydrogenase;Kochhar, S等;《EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY》;20000331;第267卷(第6期);第1633-1639页，参见全文 *
片球菌属乳酸菌乳酸脱氢酶生物合成苯乳酸的研究;郁书怀;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20140228;参见全文 *
登录号：AKA09353D-lactate dehydrogenase;Li,C等;《GenBank》;20150829;参见序列信息 *

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