CN101857887A - 一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明在水相或有机/水双相反应体系中，利用重组菌无细胞提取物催化不同底物芳基酮，获得光学纯芳基醇，产物光学纯度为90％～100％e.e.，产率为50％～90％。通过添加10～20g/L辅助底物，初始辅酶0.005～0.2mM NADP⁺，实现反应必需辅酶NADPH的再生循环，辅酶总转换数为936～3604。反应时间由全细胞催化体系的12～48h缩短至2～12h。与常规纯酶或全细胞催化方式不同，该无细胞系统不需额外添加辅酶再生所需的耦联酶，同时缩短反应时间，而且该系统还适用于其他的醇脱氢酶和羰基还原酶，是一种具有广泛适用性的经济、方便、有效的生物催化系统。

Description

一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法

技术领域

一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。

背景技术

芳基醇的化学结构为：

(R₁＝H，Cl，CH₃，OCH₃；R₂＝H，Br，OH)

光学纯芳基醇是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，开展光学纯芳基醇不对称转化制备方法的研究极有意义。

手性化合物在人们生活中具有重要作用，由于两个对映体在药理、毒理及功能作用等各方面均有所不同，因此，制备光学纯的手性模块化合物在医药、农业、材料以及环保等领域都具有重要的意义。

目前，国际上制备光学纯手性化合物的常见方法主要包括：化学拆分法，色谱拆分法，液体膜拆分法或手性固体膜拆分的膜拆分法，和生物法。利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点。合成光学活性物质的生物转化反应大致可分为两类：一类是把外消旋体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从外消旋或前手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。

90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由L-氨基酸构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。酶促拆分消旋体是比较理想的选择。利用完整细胞对外消旋化合物进行转化，可以获得光学纯对映体，在非水相及有机一水双相反应体系中，也可酶促转化制备光学纯化合物。

微生物细胞所产生的氧化还原酶具有立体选择性高和反应条件温和等特点，在制备手性醇、氨基酸和类固醇等方面显示出极大的优势，广泛应用于医药、农药、食品、精细化工等领域。目前，利用氧化还原酶催化不对称转化通常以细胞形式或纯酶形式进行。然而，无论采用何种生物催化剂形式，以氧化还原酶在进行生物催化时，都需要辅酶NAD(P)H作为电子传递体参与反应，在合成产物的同时会消耗掉一定量的辅酶。由于辅酶价格昂贵，从经济角度考虑在催化反应过程中添加大量辅酶是不现实的，因此应设法建立辅酶再生体系，对辅酶进行再生并循环使用。氧化还原酶的辅酶再生通常采用两种方式：一种是以醇类或糖类化合物为辅助底物的底物耦联再生，但维持辅酶循环所需的醇类化合物可能会对催化用酶本身产生变性失活作用；另一种是构建酶耦联再生体系，在体系中添加可用于辅酶循环的再生酶，如葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、氢化酶等，但这些酶的添加无疑增加了反应的复杂性和经济成本。此外，以细胞形式进行反应时，细胞膜会对底物和产物进出细胞形成阻碍，进而影响反应的效率。因此，很有必要建立一种方便、有效、经济的生物催化系统以促进和改善其催化转化效果。

目前生物法不对称转化制备光学纯芳基醇的方法主要是利用含有氧化还原酶的细胞如酿酒酵母或重组大肠杆菌，或氧化还原酶纯酶如微生物产生的羰基还原酶或醇脱氢酶。但是，尚没有利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的报道。构建重组菌株的基因scr1来自于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011，该基因编码羰基还原酶SCR1，催化不对称还原2-羟基苯乙酮为(S)-1-苯基-1，2-乙二醇的反应。

发明内容

(1)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法。本发明目的不仅仅在于建立一种不对称转化制备光学纯芳基醇的无细胞催化体系，并将该无细胞体系应用于不对称还原制备光学纯芳基醇的反应中，以提高不对称转化制备光学纯芳基醇产物的生产效率，而且利用该重组菌无细胞提取物，仅通过添加葡萄糖等辅助底物而无需额外添加辅酶再生所需的耦联酶，即可实现生物催化氧化还原必需辅酶的有效再生，从而建立一种具有广泛适用性的经济、方便、有效的生物催化系统。

(2)技术方案

本发明首先从表达羰基还原酶的重组大肠杆菌出发制备重组菌无细胞提取物，该无细胞体系仅通过添加辅助底物和初始量辅酶NADP⁺即可实现辅酶NADPH的再生循环。在此基础上，对该无细胞体系催化不对称还原制备光学纯芳基醇的反应条件进行优化，并考察该反应体系对于制备不同芳基醇的底物专一性和转化效果。

设计该转化方法的途径如图1所示。

利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法，以重组菌无细胞提取物为催化剂，并在该无细胞体系中添加辅助底物和初始辅酶NADP⁺实现辅酶NADPH的再生循环，同时催化芳基酮不对称转化反应制备光学纯芳基醇；

所用的辅助底物选用葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、乙醇、或果糖，浓度为10～20g/L；辅酶NADPH初始添加量为0.005～0.2mM。

所用的底物芳基酮选用2-羟基苯乙酮、间氯-2-羟基苯乙酮、对氯-2-羟基苯乙酮、对甲基-2-羟基苯乙酮、对甲氧基-2-羟基苯乙酮、间氯-2-溴苯乙酮、对氯-2-溴苯乙酮、对甲基-2-溴苯乙酮、对甲氧基-2-溴苯乙酮、苯乙酮、邻氯苯乙酮、间氯苯乙酮、对氯苯乙酮、对甲基苯乙酮、或对甲氧基苯乙酮，浓度为10～80mM。

(1)重组菌的构建

提取基因组的菌种为近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011；

近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011；培养基(m/V，即g/100mL双蒸水)：葡萄糖4％，酵母膏0.5％，(NH₄)₂HPO₄ 1.3％，KH₂PO₄ 0.7％，ZnSO₄7H₂O 0.03％，NaCl 0.01％，pH7.0。

将近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011菌种接种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于30℃、150rpm振荡培养48h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System(VIOGENE公司)提取基因组。

以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组DNA作为PCR扩增反应模板，利用含有NdeI限制性酶切位点的引物1和含有XhoI限制性酶切位点的引物2通过PCR反应扩增scr1基因片断；

引物1：5′-CCCGCCCGCATATGAGTAAAGACGAAACAATTTC-3′，

引物2：5′-GCCCGCTCGAGTGGGACAGTATAACCACCATC-3′，

PCR反应体系：ddH₂O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，1μL5 0pmol/μL引物1，1μL 50pmol/μL引物2，基因组DNA 5μL，5U/μLTaq DNA polymerase 0.5μL；

PCR反应过程为：94℃预变性5min；94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；

PCR产物利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。

利用限制性内切酶NdeI和XhoI对扩增得到的scr1基因与载体pET21c进行双酶切处理，处理后DNA片断插入载体pET21c的NdeI和XhoI位点获得带有目的基因片断的重组质粒pETSCR1，重组质粒pETSCR1转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株E.coli BL21(DE3)(pETSCR1)；

应用的典型例子为表达羰基还原酶基因的重组大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)(pETSCR1)，羰基还原酶基因scr1来自于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)，该基因编码羰基还原酶SCR1，催化不对称还原2-羟基苯乙酮为(S)-1-苯基-1，2-乙二醇的反应。基因scr1见序列表SEQ ID NO：1。

PCR产物利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。

将目的基因PCR产物DNA片段和质粒pET-21c进行酶切。反应体系组成：10×H Buffer 4μL，DNA 10μL，NdeI 2μL，XhoI 2μL，dd H₂O将体系补足40μL，振荡使液体充分混匀，37℃水浴3h，在管中加入4μL的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。

将目的基因DNA片段与质粒pET-21c连接，反应体系组成如下：质粒pET-21c 0.8μL，外源基因4.2μL，Ligation Solution 5μL，ddH₂O将体系补足10μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接16h。

连接反应产物转化大肠杆菌，在100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90秒。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入700μL LB液体培养基，37℃、100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清600μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养。

培养后的单菌落经测序鉴定获得含有羰基还原酶基因scr1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)(pETSCR1)。

(2)重组菌无细胞提取物的制备

LB培养基，以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0，氨苄青霉素0.05，固体培养基添加琼脂粉15；

挑取重组菌单菌落接种于3mL含50μg/rnL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养至控制OD₆₀₀约为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.1～1mmol/L，在培养温度17～30℃下诱导培养12～15h；

培养后的重组大肠杆菌细胞10,000rpm离心10min并用生理盐水洗涤三次后收集细胞；菌体重新悬浮于pH 6.5、0.1M磷酸钾缓冲液中配置成含有湿细胞浓度为100g/L的菌悬液，菌悬液经超声破碎后离心，所得上清液总可溶蛋白浓度5～20g/L作为无细胞提取物用于不对称转化反应；

(3)重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇

(a)水相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应

2mL反应体系组成：1mL pH 6.5、0.1M磷酸钾缓冲液，1mL无细胞提取物，提取物的总可溶蛋白5～20mg/mL，10～20mg/mL辅助底物，10～80mM底物芳基酮，0.005～0.2mM NADP⁺；反应混合物于20℃振荡反应2～12h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；

或(b)有机/水双相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应

2mL反应体系组成：0.6mL pH 6.5、0.1M磷酸钾缓冲液，0.4mL有机溶剂，1mL无细胞提取物，提取物的总可溶蛋白5～20mg/mL，10～20mg/mL辅助底物，10～80mM底物芳基酮，0.005～0.2mM NADP⁺；反应混合物于20℃振荡反应2～12h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；

反应有机相所用有机溶剂为乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、辛醇、二甲苯、或异丙醚。

产物通过手性固定相高效液相色谱(Agilent HP1100)或手性气相色谱(Agilent 7890A)进行分析。手性液相色谱柱为Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)或Chiralcel OD-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)，流动相为正己烷/异丙醇(90/10～98/2)，流速0.4～0.8mL/min，检测波长为215nm。手性气相色谱柱为CP-Chirasil-Dex CB chiral capillary column(25m×0.25mm；Varian，USA)。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。

产物对映过量值的计算：对映过量值(e.e.％)＝[(C_S-C_R)/(C_S+C_R)]×100％

产物产率的计算：产率(％)＝C_S/C₀×100％

式中C_S为反应后(S)-对映体的浓度，C_R为反应后(R)-对映体的浓度，C₀为反应前底物的浓度。

2-羟基苯乙酮、间氯-2-羟基苯乙酮、对氯-2-羟基苯乙酮、对甲基-2-羟基苯乙酮、对甲氧基-2-羟基苯乙酮、间氯-2-溴苯乙酮、对氯-2-溴苯乙酮、对甲基-2-溴苯乙酮、对甲氧基-2-溴苯乙酮、苯乙酮、邻氯苯乙酮、间氯苯乙酮、对氯苯乙酮、对甲基苯乙酮、或对甲氧基苯乙酮，经转化后得到对应的产物为(S)-1-苯基-1，2-乙二醇、(S)-间氯-1-苯基-1，2-乙二醇、(S)-对氯-1-苯基-1，2-乙二醇、(S)-对甲基-1-苯基-1，2-乙二醇、(S)-对甲氧基-1-苯基-1，2-乙二醇、(S)-间氯-2-溴苯乙醇、(S)-对氯-2-溴苯乙醇、(S)-对甲基-2-溴苯乙醇、(S)-对甲氧基-2-溴苯乙醇、(S)-1-苯乙醇、(S)-邻氯-1-苯乙醇、(S)-间氯-1-苯乙醇、(S)-对氯-1-苯乙醇、(S)-对甲基-1-苯乙醇、或(S)-对甲氧基-1-苯乙醇，光学纯度为90～100％e.e.，产率为50～95％。

与纯酶反应体系相比，该无细胞提取物催化体系不需额外添加辅酶再生所需的耦联酶，通过在反应体系中添加10～20g/L辅助底物，初始辅酶0.005～0.2mM NADP⁺，实现反应必须辅酶NADPH的再生循环，辅酶总转换数为936～3604，大大简化了反应系统的复杂性；与细胞反应体系相比，该无细胞提取物催化体系解除了细胞膜对底物/产物进出细胞的阻碍，大大缩短了反应时间，反应时间由全细胞催化体系的12～48h缩短至2～12h，提高了不对称转化效果。此外，该无细胞系统还可适用于其他催化不对称转化的醇脱氢酶和羰基还原酶，具有较为广泛应用价值。

(3)有益效果

本发明与通常采用的纯酶或全细胞催化方式不同，是一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法。利用该无细胞系统催化反应，无需在反应体系中额外添加辅酶再生所需的耦联酶，同时提高了酶与底物直接作用的效率，缩短反应时间，从而获得较好的转化效果。

在水相或有机/水双相的不对称转化反应体系中，利用重组菌无细胞提取物催化不同底物芳基酮，均可获得光学纯的反应产物芳基醇对映体，产物光学纯度为90％～100％e.e.，产率为50％～90％。通过在反应体系中添加10～20g/L辅助底物，初始辅酶0.005～0.2mM NADP⁺，实现反应必需辅酶NADPH的再生循环，辅酶总转换数为936～3604。反应时间由全细胞催化体系的12～48h缩短至2～12h。

该无细胞系统不仅提供了一种新的生物催化不对称转化的反应方式，既实现了生物催化氧化还原必需的辅酶再生，又提高了生物转化的整体效果，而且该系统还可适用于其他催化不对称转化的醇脱氢酶和羰基还原酶，是一种具有广泛适用性的经济、方便、有效的生物催化系统，具有较为广泛应用价值。

生物材料样品保藏

近平滑假丝酵母，保藏日期2003年3月1日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，菌株编号：M203011。该菌株已在中国专利CN 1212403C公告。

附图说明

图1本发明转化方法的途径示意图。

具体实施方式

实施例1

重组菌无细胞提取物的制备：LB培养基组成为胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(50μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。挑取阳性重组菌单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养过夜。取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度0.1mmol/L，在培养温度17℃下诱导培养12h。培养后的重组大肠杆菌细胞10,000rpm离心10min并用生理盐水洗涤三次后收集。菌体重新悬浮于磷酸钾缓冲液(pH 6.5、0.1M)中配置成含有湿细胞浓度为100g/L的菌悬液，菌悬液经超声破碎后离心，所得上清液(总可溶蛋白浓度10g/L)作为无细胞提取物用于不对称转化反应。

实施例2

重组菌无细胞提取物的制备：LB培养基组成为胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(50μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。挑取阳性重组菌单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养过夜。取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度1mmol/L，在培养温度30℃下诱导培养15h。培养后的重组大肠杆菌细胞10,000rpm离心10min并用生理盐水洗涤三次后收集。菌体重新悬浮于磷酸钾缓冲液(pH 6.5、0.1M)中配置成含有湿细胞浓度为100g/L的菌悬液，菌悬液经超声破碎后离心，所得上清液(总可溶蛋白浓度5g/L)作为无细胞提取物用于不对称转化反应。

实施例3

重组菌无细胞提取物的制备：LB培养基组成为胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(50μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。挑取阳性重组菌单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养过夜。取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度0.5mmol/L，在培养温度17℃下诱导培养15h。培养后的重组大肠杆菌细胞10,000rpm离心10min并用生理盐水洗涤三次后收集。菌体重新悬浮于磷酸钾缓冲液(pH 6.5、0.1M)中配置成含有湿细胞浓度为100g/L的菌悬液，菌悬液经超声破碎后离心，所得上清液(总可溶蛋白浓度20g/L)作为无细胞提取物用于不对称转化反应。

实施例4

水相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应：2mL反应体系组成为1mL磷酸钾缓冲液(pH6.5、0.1M)，1mL无细胞提取物(总可溶蛋白15mg/mL)，10g/L葡萄糖，40mM 2-羟基苯乙酮，0.02mM NADP⁺。反应混合物于20℃振荡反应6h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，产物(S)-1-苯基-1，2-乙二醇的光学纯度99％e.e.，产率93％。

实施例5

水相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应：2mL反应体系组成为1mL磷酸钾缓冲液(pH6.5、0.1M)，1mL无细胞提取物(总可溶蛋白15mg/mL)，10g/L海藻糖，10mM 2-羟基苯乙酮，0.02mM NADP⁺。反应混合物于20℃振荡反应2h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，产物(S)-1-苯基-1，2-乙二醇的光学纯度99％e.e.，产率95％。

实施例6

有机/水双相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应：2mL反应体系组成为0.6mL磷酸钾缓冲液(pH 6.5、0.1M)，0.4mL月桂酸乙酯，1mL无细胞提取物(总可溶蛋白20mg/mL)，10g/L葡萄糖，80mM 2-羟基苯乙酮，0.02mM NADP⁺。反应混合物于20℃振荡反应12h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，产物(S)-1-苯基-1，2-乙二醇的光学纯度99％e.e.，产率90％。

实施例7

有机/水双相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应：2mL反应体系组成为0.6mL磷酸钾缓冲液(pH 6.5、0.1M)，0.4mL辛烷，1mL无细胞提取物(总可溶蛋白15mg/mL)，10g/L葡萄糖，40mM 2-羟基苯乙酮，0.02mMNADP⁺。反应混合物于20℃振荡反应6h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，产物(S)-1-苯基-1，2-乙二醇的光学纯度99％e.e.，产率50％。

实施例8

有机/水双相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应：2mL反应体系组成为0.6mL磷酸钾缓冲液(pH 6.5、0.1M)，0.4mL月桂酸乙酯，1mL无细胞提取物(总可溶蛋白5～20mg/mL)，10g/L葡萄糖，25mM对氯-2-羟基苯乙酮，0.02mM NADP⁺。反应混合物于20℃振荡反应6h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，产物(S)-对氯-1-苯基-1，2-乙二醇的光学纯度99％e.e.，产率71％。

实施例9

有机/水双相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应：2mL反应体系组成为0.6mL磷酸钾缓冲液(pH 6.5、0.1M)，0.4mL月桂酸乙酯，1mL无细胞提取物(总可溶蛋白5～20mg/mL)，10g/L葡萄糖，25mM对氯-2-溴苯乙酮，0.02mM NADP⁺。反应混合物于20℃振荡反应6h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，产物(S)-对氯-2-溴苯乙醇的光学纯度99％e.e.，产率51％。

序列表

<210>SEQ ID NO：1

<211>846

<212>DNA

<213>近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011

 

<400>1

atgagtaaag acgaaacaat ttcttactgt aatgaccaat tgggcccatt gccaaccaca    60

gctccaaaag tatctgataa cgttactgac cttttctcct tcaaaggtaa agttgtgtca    120

gtaaccgggt cctccggagg tattggttgg gctgttgctg agggcttcgc tcaagctggt    180

gcagatgtag ccatttggta tcattctcac aatgctgatg aaaaggccaa atatctccaa    240

gaaaaatacg gagtcaagtc aattgcttat ggatgtaaca ttggtgttgc tgaggaagtc    300

caaaaaacag ttgatcaaat tgaatctgat ttcggtaaga ttgacgtttt cgttgccaac    360

gctggtattc catggacgga tggaccagaa attgatgttc aagatttaag caaatggacc    420

aagattatcg acactgattt gaacagtgta tattactgtg ctcatgccat tggtcctatt    480

ttcagaaaac aaggtaaagg ctcattggtt attactgcat ccatgtcggc tacaattgtc    540

aatgttccgc aattgcaagc agcttataat gttgccaaag ctggggttaa gcacttgtca    600

aagtcgttgg cggttgaatg ggctcctttt gccagagtca acagtgtctc accaggttat    660

atttcaacaa atttgacaac ctttgccaac cctgatttgc aaaagaaatg ggtgcaattg    720

actccattgg gtagagaagg gcatccaaag gaattggttg gtgcttactt atacttggct    780

tccgatgctg ctactttcac aactggttgt gatttagctg ttgatggtgg ttatactgtc    840

ccatag                                                               846

Claims (1)

1.一种利用重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇的方法，其特征在于

以重组菌无细胞提取物为催化剂，并在该无细胞体系中添加辅助底物和初始辅酶NADP⁺实现辅酶NADPH的再生循环，同时催化芳基酮不对称转化反应制备光学纯芳基醇；

所用的辅助底物选用葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、乙醇、或果糖，浓度为10～20g/L；辅酶NADPH初始添加量为0.005～0.2mM；

所用的底物芳基酮选用2-羟基苯乙酮、间氯-2-羟基苯乙酮、对氯-2-羟基苯乙酮、对甲基-2-羟基苯乙酮、对甲氧基-2-羟基苯乙酮、间氯-2-溴苯乙酮、对氯-2-溴苯乙酮、对甲基-2-溴苯乙酮、对甲氧基-2-溴苯乙酮、苯乙酮、邻氯苯乙酮、间氯苯乙酮、对氯苯乙酮、对甲基苯乙酮、或对甲氧基苯乙酮，浓度为10～80mM；

(1)重组菌的构建

提取基因组的菌种为近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011；

以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组DNA作为PCR扩增反应模板，利用含有NdeI限制性酶切位点的引物1和含有XhoI限制性酶切位点的引物2通过PCR反应扩增scr1基因片断；

引物1：5′-CCCGCCCGCATATGAGTAAAGACGAAACAATTTC-3′，

引物2：5′-GCCCGCTCGAGTGGGACAGTATAACCACCATC-3′，

PCR反应体系：ddH₂O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，1μL 50pmol/μL引物1，1μL 50pmol/μL引物2，基因组DNA 5μL，5U/μLTaq DNA polymerase 0.5μL；

PCR反应过程为：94℃预变性5min；94℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；

利用限制性内切酶NdeI和XhoI对扩增得到的scr1基因与载体pET21c进行双酶切处理，处理后DNA片断插入载体pET21c的NdeI和XhoI位点获得带有目的基因片断的重组质粒pETSCR1，重组质粒pETSCR1转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株E.coli BL21(DE3)(pETSCR1)；

(2)重组菌无细胞提取物的制备

LB培养基，以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0，氨苄青霉素0.05，固体培养基添加琼脂粉15；

挑取重组菌单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养至控制OD₆₀₀为0.6；向培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.1～1mmol/L，在培养温度17～30℃下诱导培养12～15h；

培养后的重组大肠杆菌细胞10,000rpm离心10min，并用生理盐水洗涤三次后收集细胞；菌体重新悬浮于pH 6.5、0.1M磷酸钾缓冲液中配置成含有湿细胞浓度为100g/L的菌悬液，菌悬液经超声破碎后离心，所得上清液总可溶蛋白浓度5～20g/L作为无细胞提取物用于不对称转化反应；

(3)重组菌无细胞提取物催化不对称转化制备光学纯芳基醇

(a)水相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应

2mL反应体系组成：1mL pH 6.5、0.1M磷酸钾缓冲液，1mL无细胞提取物，提取物的总可溶蛋白5～20mg/mL，10～20mg/mL辅助底物，10～80mM底物芳基酮，0.005～0.2mM NADP⁺；反应混合物于20℃振荡反应2～12h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；

或(b)有机/水双相反应体系中无细胞提取物催化不对称还原反应

2mL反应体系组成：0.6mL pH 6.5、0.1M磷酸钾缓冲液，0.4mL有机溶剂，1mL无细胞提取物，提取物的总可溶蛋白5～20mg/mL，10～20mg/mL辅助底物，10～80mM底物芳基酮，0.005～0.2mM NADP⁺；反应混合物于20℃振荡反应2～12h，反应后混合物用10mL乙酸乙酯萃取，有机相用于产物分析；

反应有机相所用有机溶剂为乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、辛醇、二甲苯、或异丙醚。

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