CN115814857B - 一种基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶及其制备方法和应用。本发明以Nitrophorin 2为蛋白质骨架，通过基因工程技术获得了57位突变为半胱氨酸，进一步被5‑溴酰基菲咯啉共价取代，再与CuII结合，从而在Nitrophorin 2中引入了非天然辅因子邻菲咯啉铜(II)，构建了一种新型的人工金属酶。本发明所述的人工金属酶具有铜离子催化中心，可在水相中催化Friedel‑Craft烷基化反应、不对称Diels‑Alder反应发生，且具有一定的催化活性和立体选择性。本发明构建了的新型铜离子人工金属酶，与野生型相比，改变了其催化活性中心，扩大了其在催化领域的应用。
Description
技术领域
本发明属于涉及蛋白质与生物技术领域，具体涉及一种基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶及其制备方法和应用。
背景技术
酶是一种具有反应高效性、高立体选择性的生物催化剂，是由20种天然氨基酸以及天然辅因子组成，这限制了酶的结构、催化性能和其他功能空间。为此，通过改变氨基酸序列对天然酶进行改造，或者在蛋白质中引入非天然结构元件(非天然氨基酸或非天然辅因子)，获得具有特定功能的人工酶，弥补天然酶的不足，开发新的功能，对扩大酶在催化领域的应用范围至关重要。其中，非天然结构元件的引入可以在蛋白质特定位点掺入具有反应特异性的官能团(如卤素原子、叠氮基团、炔基等)，或者引入具有荧光基团、模拟翻译后修饰的氨基酸等，这些都为人工酶的研究提供了新的思路。目前，一般可以通过基因密码子扩展技术引入非天然氨基酸，或通过非共价、共价作用在蛋白骨架中引入非天然金属辅因子。
Nitrophorin2(NP2)是一种唾液蛋白，存在于昆虫Rhodniusprolixus中，它可以结合一氧化氮和组胺，并在Rhodniusprolixus吸血过程中起到抗凝剂的作用。NP2的晶体结构显示蛋白具有一个由8个β折叠形成的疏水空腔，其中包含一个与第57位组氨酸配位的铁血红素辅基。而NP2的疏水空腔是一个重要的催化活性口袋，反应底物可在口袋中发生特定的催化反应，是值得研究的蛋白骨架(John F.Andersen,William R.Montfort,Journal ofBiological Chemistry,2000,275(39):30496-305103)。
1，10-菲咯啉(1,10-Phenanthroline,phen)是配位化学中一种经典的双齿配体，它能与多种过渡金属(如CuII、ZnII等)结合，形成的金属络合物具有特殊性质，如具有强烈的荧光、诱导DNA切割、促进酯和酰胺的水解等等。1，10-菲咯啉配位体系在有机、无机、超分子化学等领域都有广泛应用，此外，其还以非天然辅因子被引入蛋白质中进行催化化学研究。
不对称Friedel-Crafts反应和不对称Diels-Alder反应是在有机合成中是一种重要的碳-碳键形成反应。不对称Friedel-Crafts反应是重要的C-H活化反应，其在化学合成领域中占据重要作用，如天然产物合成和药物中间体合成中。不对称Diels-Alder反应是单烯烃和共轭二烯烃发生分子间[4+2]环加成，从而得到含有多个手性中心的六元环产物。此两类不对称反应已有广泛的研究，大多数反应仍在有机溶剂中进行。而水具有廉价、安全且对环境友好的特点，在某些条件下，也可成为催化反应的溶剂，更符合绿色化学的要求。
发明内容
为解决相关问题，本发明的首要目的在于提供一种基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶及其制备方法。该方法在Nitrophorin 2蛋白支架上引入非天然金属辅因子，从而构建一种新型含铜人工金属酶，用于催化Friedel-Craft烷基化反应和不对称Diels-Alder反应。该方法扩大了Nitrophorin 2蛋白的应用范围。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶。
本发明的再一目的在于提供上述基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶的制备方法，将Nitrophorin2突变体蛋白NP2(H57C)与5-溴酰基菲咯啉混合，反应，得中间产物NP2(H57C)-Phen；再将NP2(H57C)-Phen与铜离子溶液混合，孵育，即获得所述基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶；其中：所述NP2(H57C)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述NP2(H57C)与5-溴酰基菲咯啉的摩尔比为1：(8～12)；进一步优选为1：9。
优选的，所述NP2(H57C)先溶于二甲基亚砜(DMSO)并用磷酸盐缓冲液稀释中，再进行使用。
优选的，所述反应的条件为：3～5℃避光搅拌反应60～80小时；进一步优选为4℃避光搅拌反应72小时。
优选的，所述NP2(H57C)-Phen与铜离子的摩尔比为1:(0.9～1.1)；进一步优选为1:1。
优选的，所述孵育的条件为：3～5℃孵育30～60min；进一步优选为4℃孵育30min。
优选的，所述NP2(H57C)通过如下方法制备得到：将含有所述NP2(H57C)的编码基因的重组质粒转化到大肠杆菌中，培养并进行诱导表达，菌体经过破碎、洗涤、溶解、重折叠、纯化获得目标蛋白NP2(H57C)。
更优选的，所述培养并进行诱导表达的条件为：先在37℃，110rpm条件下振荡培养至OD600为0.6～0.8后，再加入最终浓度为1mM的IPTG，在37℃，110rpm条件下振荡；培养4h后，8000g离心10min，用0.9％NaCl溶液分散收集菌体，9000g离心10min。
更优选的，所述重折叠采用的重折叠缓冲液配方为：0.4M Arg-HCl，0.2M Tris，0.1M(NH4)2SO4，2mM EDTA，1mM GSH，0.2mM GSSG，pH 8.0。
更优选的，所述纯化采用的缓冲液配方为：100mM NaH2PO4，100mM NaCl，pH 6.5。
一种基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶，通过上述制备方法得到。
上述基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶催化不对称Friedel-Crafts反应和Diels-Alder反应的应用。
优选的，所述不对称Friedel-Crafts或Diels-Alder反应在水相中进行。
优选的，所述的催化不对称Friedel-Crafts反应为：将上述人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物在2～6℃下搅拌5～15分钟，再加入吲哚类化合物，继续在该温度下反应48～96小时，得到Friedel-Crafts烷基化产物；进一步优选为将上述人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物在4℃下搅拌10分钟，再加入吲哚类化合物，继续在该温度下反应72小时，得到Friedel-Crafts烷基化产物。
更优选的，人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物、吲哚类化合物的摩尔比为(0.05～0.2)：1：(1～2)；进一步优选为0.1：1：1。
优选的，所述的催化不对称Diels-Alder反应为：将人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物在2～6℃下搅拌5～15分钟，再加入共轭二烯类化合物，继续在该温度下反应48～96小时，得到Diels-Alder烷基化产物；进一步优选为将人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物在4℃下搅拌10分钟，再加入共轭二烯类化合物，继续在该温度下反应72小时，得到Diels-Alder烷基化产物。
更优选的，人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物、共轭二烯类化合物的摩尔比为(0.05～0.2)：1：(50～100)；进一步优选为0.1：1：100。
更优选的，上述氮杂查尔酮类化合物为吡啶烯酮类化合物；进一步优选为(E)-3-苯基-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮，其化学结构式如下：
更优选的，上述共轭二烯类化合物为环戊二烯。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明以Nitrophorin 2为蛋白质分子设计骨架，将蛋白质中第57位组氨酸突变为半胱氨酸，与5-溴酰基菲咯啉发生特异性共价结合，引入一个双齿配体，再结合CuII，从而从而在Nitrophorin 2中引入了非天然辅因子邻菲咯啉铜(II)(phen-CuII)，构建了一种新型的人工金属酶NP2(H57C)-Phen-CuII。此种新型的人工金属酶具有CuII活性中心，可用于催化水相中的不对称Friedel-Crafts反应和Diels-Alder反应，具有一定的转化率和对映体选择性。另外，水作为反应介质符合绿色化学的理念。
本发明构建的基于Nitrophorin 2蛋白支架的新型铜离子人工金属酶，与野生型相比，改变了其催化活性中心，扩大了其在催化领域的应用。同时，对该蛋白骨架有了更深的认识，为之后构建其他基于Nitrophorin 2蛋白支架的人工酶奠定了基础。
附图说明
图1为Nitrophorin 2铜离子人工金属酶NP2(H57C)-phen-CuII的结构示意图。
图2为Nitrophorin 2突变体NP2(H57C)纯化过程的凝胶电泳(SDS-PAGE)图，每个通道的样品情况如下：①诱导前的细胞破碎上清；②诱导前的细胞破碎沉淀；③诱导后的细胞破碎上清；④诱导后的细胞破碎沉淀(未纯化)；⑤SEC纯化后的NP2(H57C)；⑥SEC纯化后的NP2(H57C)-phen。
图3为Nitrophorin 2突变体NP2(H57C)与5-溴酰基菲咯啉反应前后的SEC纯化图以及LC-ESI-MS的表征图。
图4为NP2(H57C)-phen酶切的LC-ESI-MS图。
图5为NP2(H57C)-phen与CuII反应前后的EPR表征图。
具体实施方式
本发明公开了一种新型的人工金属酶并阐述其制备方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现目的。本发明的方法及产品已经通过较佳的实施例进行了具体描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部地实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为市售商品，均可通过商业渠道购买获得。
下述实施例中使用的5-溴酰基菲咯啉(2-bromo-N-(1,10-phenanthrolin-5-yl)acetamide，phen-Br)，其结构式如下所示，参考文献“Bos J,Fusetti F,Driessen AJ,RoelfesG,Angew Chem Int Ed Engl.2012,51(30):7472-5.”记载的方法制备得到：
下述实施例中的野生型Nitrophorin 2质粒为南京金斯瑞生物科技公司产品(载体质粒为pET-17b(+)，限制性内切酶为点位Ndel和EcoRI)。
下述实施例中的LB培养基按照如下方法配制：称量10g胰蛋白胨、10gNaCl、5g酵母提取物溶解于1L水中，充分溶解后120℃高压灭菌30min，灭菌后的混合液冷却至室温。
下述实施例中定点突变所用的引物是由北京擎科生物技术公司所合成，定点突变试剂盒从上海生工购买，突变质粒的基因测序委托上海生工。
下列实施例中所用到的试剂名称及缩写：
IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
GdmCl：盐酸胍
Tris：三羟甲基氨基甲烷
Arg-HCl：精氨酸盐酸盐
EDTA：乙二胺四乙酸
GSH：还原型谷胱甘肽
GSSG：氧化型谷胱甘肽
DMSO：二甲基亚砜
MOPS：3-(N-吗啡啉)丙磺酸。
实施例1：Nitrophorin 2突变体NP2(H57C)的生物表达
基于基因工程和蛋白质工程，利用定点突变技术，将野生型Nitrophorin 2蛋白氨基酸序列中第57位组氨酸突变为半胱氨酸，并成功克隆到pET-17b(+)载体Ndel和EcoRI两个酶切位点之间，获得Nitrophorin 2突变体NP2(H57C)质粒。经基因测序确认后，将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达。将转化得到的单克隆菌株接种在50ml LB培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，在37℃，130rpm条件下振荡培养过夜。第二天，将20mL过夜菌液转接到1L新鲜LB培养基中(盛在3L的摇瓶中，氨苄青霉素浓度为100μg/mL)进行大规模培养并进行诱导表达。具体步骤如下：先在37℃，110rpm条件下振荡培养至OD600为0.6～0.8后，再加入最终浓度为1mM的IPTG，在37℃，110rpm条件下振荡。培养4h后，8000g离心10min，用0.9％NaCl溶液分散收集菌体，9000g离心10min，保存于-25℃冰箱待用。
Nitrophorin 2突变体NP2(H57C)的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：
点突变所用引物序列：
F：5'-CGTGAAAGAAGCGCTGTACTGCTATAACGCGAACAAGAAAAC-3'
R：5'-GTTTTCTTGTTCGCGTTATAGCAGTACAGCGCTTCTTTCACG-3'。
实施例2：Nitrophorin 2突变体NP2(H57C)的纯化
5g菌体分散于30ml0.9％NaCl溶液中，超声破碎后，15000g离心15min收获破碎沉淀。用洗液洗涤破碎沉淀，目的是为了除去部分杂蛋白、DNA等其他杂质。洗涤结束后，加入5mL溶解液(6M GdmCl，150mM NaCl，30mM Tris，pH 8.0)在室温下搅拌溶解2h。蛋白溶解液经15000g离心30min两次后，将获得的上清液在4℃下缓慢滴入重折叠缓冲液(0.4M Arg-HCl，0.2M Tris，0.1M(NH4)2SO4，2mM EDTA，1mM GSH，0.2mM GSSG，pH 8.0)中，上清液全部滴入折叠液后，将折叠液继续的4℃下搅拌，期间检测蛋白的重折叠情况。重折叠结束后，折叠液经离心和0.22μm滤膜过滤后，在AKTA蛋白纯化系统(AKTA Purifier 10，GE)上经过排阻色谱柱(SEC)纯化，收集已折叠的蛋白溶液(缓冲溶液为100mM NaH2PO4,100mM NaCl，pH6.5)，纯化样品用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺溶液凝胶电泳(SDS-PAGE)测试纯度。结果如图2所示。
实施例3：Nitrophorin 2突变体NP2(H57C)与5-溴酰基菲咯啉(2-bromo-N-(1,10-phenanthrolin-5-yl)acetamide，phen-Br)反应
取5-溴酰基菲咯啉固体溶于少量DMSO中，再加入适量的磷酸缓冲液稀释，将其加入实施例2所获得的折叠好的蛋白溶液中，蛋白与5-溴酰基菲咯啉最终摩尔比为1：9，将混合液在4℃冰箱中避光搅拌反应。反应72h后，将反应混合液浓缩，离心，上清液经0.22μm滤膜过滤后，在AKTA蛋白纯化系统(AKTA Purifier 10,GE)上经过排阻色谱柱(SEC)纯化，获得反应后的蛋白。液相色谱-电喷雾电离质谱测试NP2(H57C)反应前后的分子量。结果如图3所示。
实施例4：引入邻菲咯啉(phen)的Nitrophorin 2突变体NP2(H57C)-phen的胰蛋白酶酶切
为验证实施例3中NP2确实在57位半胱氨酸上引入邻菲咯啉配体，使用胰蛋白酶对其进行酶切实验。胰蛋白酶是一种蛋白水解酶，它可以切割赖氨酸(K)和精氨酸(R)残基的C端肽键。取0.1mgNP2(H57C)-phen溶解于80μL 10mM NH4HCO3溶液(pH 8.0)中，再加入20μL胰蛋白酶溶液(0.5mg/mL)，反应混合液在37℃下振荡4h。反应结束后，立即进行液相色谱-电喷雾电离质谱(liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry,LC-ESI-MS)测试，寻找EALYC(phen)YNANK的切割片段。结果如图4所示，目标片段理论分子量为1422.53Da，实测值为1422.97Da，证实NP2确实在57位半胱氨酸上引入邻菲咯啉配体。
胰蛋白酶对NP2(H57C)-phen酶切情况如下面氨基酸序列所示(“/”为酶切位点)：
(M)DCSTNISPK/QGLDK/AKYFSGK/WYVTHFLDK/DPQVTDQYCSSFTPR/ESDGTVK/EALYCYNANK/K/TSFYNIGEGK/LESSGLQYTAK/YK/TVDK/K/K/AVLK/EADEK/NSYTLTVLEADDSSALVHICLR/EGSK/DLGDLYTVLTHQK/DAEPSAK/VK/SAVTQAGLQLSQFVGTK/DLGCQYDDQFTSL。
实施例5：引入邻菲咯啉(phen)的Nitrophorin 2突变体NP2(H57C)-phen与CuII结合
用5,5-二巯基双-2-硝基苯甲酸(DTNB)法确认5-溴酰基菲咯啉的反应效率，BCA法(以牛血清蛋白为蛋白质标准，使用从上海生工购入的BCA试剂盒)确定NP2(H57C)-phen浓度，以1：1的摩尔比加入硝酸铜溶液，4℃孵育1h，获得CuII活性中心的新型Nitrophorin 2铜离子人工金属酶NP2(H57C)-phen-CuII。将获得的人工金属酶溶于100mM MOPS(2％甘油溶液，pH 7.2)中，经电子顺磁共振(EPR)确认NP2(H57C)-phen是否与CuII配位。结果如图5所示，与NP2(H57C)-phen的EPR波谱图相比，NP2(H57C)-phen-CuII的EPR波谱图中出现CuII的特征信号，由此可知，NP2(H57C)-phen中的邻菲咯啉成功与CuII结合。
实施例6：人工金属酶NP2(H57C)-phen-CuII催化不对称Friedel-Crafts反应
实施例5中的NP2(H57C)-phen-CuII催化(E)-3-苯基-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮与2-甲基吲哚的不对称Friedel-Crafts烷基化反应生成3-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-3-苯基-1-(吡啶-2-基)丙-1-酮的用途，具体方法如下：
在4℃条件下，向110μM NP2(H57C)-phen溶液(缓冲系统为20mM MOPS，pH 6.5)中加入10μL10mM Cu(NO3)2溶液，孵育30min。然后将(E)-3-苯基-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮溶解到乙腈(100mM)中，取10μL加入到蛋白溶液中，最终浓度为1mM，4℃搅拌10min，再将溶解于乙腈的2-甲基吲哚(200mM)加入到反应体系中，最终浓度为1mM，4℃继续反应72h。
反应结束后，加入0.1mM 2-苯基喹啉作为内标，用1mL正己烷/异丙醇(9：1)溶液萃取，取上层有机相用无水硫酸钠除水，经0.22μm滤膜过滤后粗产品进行高效液相色谱(HPLC)分析。结果显示，(E)-3-苯基-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮的转化率为15.3％，3-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-3-苯基-1-(吡啶-2-基)丙-1-酮的对映选择性为23.2％。
实施例7：人工金属酶NP2(H57C)-phen-CuII催化不对称Diels-Alder反应
实施例5中的NP2(H57C)-phen-CuII催化(E)-3-苯基-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮与环戊二烯的不对称Diels-Alder反应生成(3-苯基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)(吡啶-2-基)甲酮的用途，具体方法如下：
在4℃条件下，向33μM NP2(H57C)-phen溶液(缓冲系统为20mM MOPS，100mM NaCl，pH 7.0)中加入3μL10mM Cu(NO3)2溶液，孵育30min，得到NP2(H57C)-phen-CuII溶液。然后将(E)-3-苯基-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮溶解到乙腈(100mM)中，取10μL加入到蛋白溶液中，最终浓度为1mM，4℃搅拌10min，再加入环戊二烯，最终浓度为100mM，4℃继续反应72h。
反应结束后，加入0.1mM 2-苯基喹啉作为内标，用1mL正己烷/异丙醇(9：1)溶液萃取，取上层有机相用无水硫酸钠除水，经0.22μm滤膜过滤后粗产品进行高效液相色谱(HPLC)分析。结果显示，(E)-3-苯基-1-(吡啶-2-基)丙-2-烯-1-酮的转化率为42.2％，(3-苯基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)(吡啶-2-基)甲酮的对映选择性(endo:exo)为74：26，其中endo型产物的对映选择性为1.97％，exo型产物的对映选择性为3％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶的制备方法，其特征在于：
将Nitrophorin2突变体蛋白NP2(H57C)与5-溴酰基菲咯啉混合，反应，得中间产物NP2(H57C)-Phen；再将NP2(H57C)-Phen与铜离子溶液混合，孵育，即获得所述基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶；其中：所述NP2(H57C)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述5-溴酰基菲咯啉的结构式如下所示：
。
2.根据权利要求1所述的基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶的制备方法，其特征在于：
所述NP2(H57C)与5-溴酰基菲咯啉的摩尔比为1：8～12；
所述反应的条件为：3～5℃避光搅拌反应60～80小时。
3.根据权利要求1所述的基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶的制备方法，其特征在于：
所述NP2(H57C)-Phen与铜离子的摩尔比为1：0.9～1.1；
所述孵育的条件为：3～5℃孵育30～60min。
4.根据权利要求1所述的基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶的制备方法，其特征在于：
所述NP2(H57C)与5-溴酰基菲咯啉的摩尔比为9:1；
所述NP2(H57C)先溶于二甲基亚砜中，再进行使用；
所述反应的条件为：4℃避光搅拌反应72小时；
所述NP2(H57C)-Phen与铜离子的摩尔比为1:1；
所述孵育的条件为：4℃孵育30min。
5.根据权利要求1～4任一项所述的基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶的制备方法，其特征在于：
所述NP2(H57C)通过如下方法制备得到：将含有所述NP2(H57C)的编码基因的重组质粒转化到大肠杆菌中，培养并进行诱导表达，菌体经过破碎、洗涤、溶解、重折叠、纯化获得目标蛋白NP2(H57C)。
6.根据权利要求5所述的基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶的制备方法，其特征在于：
所述培养并进行诱导表达为：先在37℃，110rpm条件下振荡培养至OD600为0.6～0.8后，再加入最终浓度为1mM的IPTG，在37℃，110rpm条件下振荡；培养4h后，8000g离心10min，用0.9% NaCl溶液分散收集菌体，9000g离心10min；
所述重折叠采用的重折叠缓冲液配方为：0.4M Arg-HCl，0.2M Tris，0.1M (NH4)2SO4，2mM EDTA，1mM GSH，0.2mM GSSG，pH 8.0；
所述纯化采用的缓冲液配方为：100mM NaH2PO4，100mM NaCl，pH 6.5。
7.一种基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶，其特征在于：通过权利要求1-6任一项中所述的制备方法得到。
8.权利要求7中所述的基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶催化不对称Friedel-Crafts反应和/或Diels-Alder反应的应用。
9.根据权利要求8所述的基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶催化不对称Friedel-Crafts反应和/或Diels-Alder反应的应用，其特征在于：
所述的催化不对称Friedel-Crafts反应为：将所述的人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物在2～6℃下搅拌5～15分钟，再加入吲哚类化合物，继续在该温度下反应48～96小时，得到Friedel-Crafts烷基化产物；人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物、吲哚类化合物的摩尔比为0.05～0.2：1：1～2；
所述的催化不对称Diels-Alder反应为：将所述的人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物在2～6℃下搅拌5～15分钟，再加入共轭二烯类化合物，继续在该温度下反应48～96小时，得到Diels-Alder烷基化产物；人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物、共轭二烯类化合物的摩尔比为0.05～0.2：1：50～100。
10.根据权利要求9所述的基于Nitrophorin2蛋白支架的人工金属酶催化不对称Friedel-Crafts反应和/或Diels-Alder反应的应用，其特征在于：
所述不对称Friedel-Crafts或Diels-Alder反应在水相中进行；
所述的催化不对称Friedel-Crafts反应为：将所述的人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物在4℃下搅拌10分钟，再加入吲哚类化合物，继续在该温度下反应72小时，得到Friedel-Crafts烷基化产物；人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物、吲哚类化合物的摩尔比为0.1：1：2；
所述的催化不对称Diels-Alder反应为：将所述的人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物在4℃下搅拌10分钟，再加入共轭二烯类化合物，继续在该温度下反应72小时，得到Diels-Alder烷基化产物；人工金属酶、氮杂查尔酮类化合物、共轭二烯类化合物的摩尔比为0.1：1：100；
所述氮杂查尔酮类化合物为吡啶烯酮类化合物；
所述共轭二烯类化合物为环戊二烯。
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