CN114456275B

CN114456275B - 一种多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法

Info

Publication number: CN114456275B
Application number: CN202210102690.6A
Authority: CN
Inventors: 李佳斌; 彭帅; 路家琦; 许国强
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: CN114456275A

Abstract

本发明属于蛋白质合成技术领域，涉及一种多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法，包括以下步骤，在弱酸缓冲盐条件下，采用交联剂活化泛素突变体，得到活性中间体；所述泛素突变体的C端甘氨酸被半胱氨酸取代，所述交联剂能够与半胱氨酸特异性反应；加入组蛋白突变体，调节pH至偏中性，原位诱发所述活性中间体与所述组蛋白突变体交联，得到所述多位点单泛素修饰组蛋白；所述组蛋白突变体的修饰位点被半胱氨酸取代。本发明以重组蛋白为原料，经位点选择性的正交反应合成结构复杂的目的蛋白，具有操作简单、合成效率高、可大量制备等优点。

Description

一种多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法

技术领域

本发明属于蛋白质合成技术领域，涉及一种多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法，具体来说是一种双位点和三位点单泛素化组蛋白的合成方法。

背景技术

组蛋白是真核生物中一类高度保守的、富含碱性氨基酸的蛋白质，是染色体的基本结构蛋白，主要有H1、H2A、H2B、H3、H4五种类型，其后四种又被称为核心组蛋白。四种核心组蛋白各以两分子参与形成八聚体结构，大约147bp的DNA缠绕于八聚体核心的表面而形成核小体，构成染色体的基本重复结构单元。

组蛋白存在大量的翻译后修饰，如甲基化、乙酰化、磷酸化以及泛素化或类泛素化，这些修饰以顺序或组合的方式构成“组蛋白密码”，形成精密的表观遗传调控网络。其中，由76个氨基酸组成的泛素由于其空间位阻和广泛的互作界面近年来引起极大关注。组蛋白泛素化参与调控复制、转录、损伤修复等几乎所有DNA相关的细胞过程，其紊乱被发现与癌症等疾病密切相关。组蛋白泛素化功能的多样化来源于其位点特异性的识别作用，而多位点组合的泛素修饰信号则进一步提供更为复杂且精准的表观遗传调控方式。因此，阐明组蛋白泛素化的分子识别和催化机制不仅能帮助理解泛素化修饰参与的染色质结构及功能调控，而且能为相关靶点的活性分子发现提供理论基础，也是近年来组蛋白修饰研究领域的前沿科学问题。

在识别或催化机制研究中，均质结构的泛素修饰组蛋白是不可或缺的底物分子。近年来，化学全合成、半合成以及基于半胱氨酸修饰的蛋白质交联方法被相继开发用于制备泛素修饰组蛋白，如以1,3-二氯丙酮或1,3-二溴丙酮作为双反应活性的连接臂，系列单位点泛素修饰组蛋白被合成并用于生化活性分析和核小体复合物结构测定，极大促进了对组蛋白泛素化识别和催化机制的理解。然而，这些方法目前普遍局限于单位点泛素修饰，而针对多位点单泛素修饰组蛋白的制备仍缺乏合成方法。

发明内容

本发明旨在针对上述现有合成方法中存在的空缺和不足，提供了一种多位点单泛素修饰组蛋白及其合成方法，能够快速制备多位点单泛素修饰组蛋白，具有普适性高、操作简单、耗时短和可大量制备等优点。

按照本发明的技术方案，所述多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法，包括以下步骤，

S1：在弱酸缓冲盐条件下，采用交联剂活化泛素突变体(UbG76C)，得到活性中间体(UbG76C-DBA)；所述泛素突变体的C端甘氨酸被半胱氨酸取代，所述交联剂能够与半胱氨酸特异性反应；

S2：加入组蛋白突变体，调节pH至偏中性，原位诱发所述活性中间体与所述组蛋白突变体交联，得到所述多位点单泛素修饰组蛋白；所述组蛋白突变体的修饰位点被半胱氨酸取代。

本发明使用双反应活性的1，3-二溴丙酮(DBA)作为连接臂，通过二硫丙酮(bis-thio-acetone，BTA)键共价交联泛素突变体与组蛋白突变体，快速制备多位点单泛素修饰组蛋白。

进一步的，所述多位点单泛素修饰组蛋白为双位点或三位点单泛素修饰组蛋白。

进一步的，所述弱酸的pH范围为4.5-5.0，所述的缓冲盐为硼酸缓冲盐。

进一步的，所述泛素突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述交联剂为1,3-二溴丙酮和/或1,3-二氯丙酮，能够与半胱氨酸侧链巯基特异性反应。

进一步的，所述泛素突变体与所述交联剂的摩尔比为1：20-30。

进一步的，所述步骤S2中，加入组蛋白突变体前还包括去除步骤S1中未反应的交联剂的步骤。

进一步的，通过加入有机萃取剂，萃取去除步骤S1中未反应的交联剂。

进一步的，所述有机萃取剂为无水乙醚。

具体的，步骤S1反应完成后，加入有机萃取剂，萃取过量未反应的交联剂(DBA)，去除有机相，收集保留于水相中的UbG76C-DBA。

进一步的，所述组蛋白突变体的两个或三个修饰位点同时被半胱氨酸取代，对应制得双位点或三位点单泛素修饰组蛋白。

进一步的，所述组蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2-5中任一所示。

进一步的，所述组蛋白突变体与所述泛素突变体的摩尔比为2-5：10。

进一步的，所述步骤S2中，调节pH至6.5-7.0。

进一步的，所述步骤S1和S2中的反应均在冰浴条件下进行；进一步的，参与反应的组分在反应之前需要在冰上预冷。

具体的，所述步骤S1的操作可以如下：

1a、称取1当量的泛素突变体UbG76C蛋白冻干粉末，使其完全溶解在10mM HCl水溶液中；

1b、加入250mM硼酸缓冲液(pH＝7.0)，混合均匀，硼酸终浓度为71.4mM；

1c使用NaOH水溶液调节混合液的pH至4.6，冰上静置8min；

1d、加入30当量的DBA(溶剂为DMF(N,N-二甲基甲酰胺))，在冰浴条件下，缓慢搅拌45min；

1f、反应完成后，加入有机萃取剂，萃取过量未反应的(DBA)，去除有机相，收集保留于水相中的UbG76C-DBA。

所述步骤S2的具体操作可以如下：

2a、称取0.2-0.5当量组蛋白突变体，使其溶解于10mM HCl水溶液中，再加入250mM硼酸缓冲液(pH＝7.0)，混合均匀，缓冲盐终浓度为71.4mM，冰上静置，得到组蛋白突变体溶液；

2b、当步骤1f完成后，加入组蛋白突变体溶液，混合均匀；

2c、使用NaOH水溶液快速调节反应液的pH至6.6，冰浴缓慢搅拌1.5-2.0h；

2d、反应结束后，使用0.22μm滤膜过滤，半制备型反向高效液相色谱纯化，收集目标产物，冷冻干燥后得到多位点单泛素修饰组蛋白粉末。

本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明以重组蛋白为原料，经位点选择性的正交反应合成结构复杂的目的蛋白，具有操作简单、合成效率高、可大量制备等优点。

附图说明

图1为泛素突变体UbG76C的高效液相色谱图。

图2为泛素突变体UbG76C的ESI-MS质谱图。

图3为组蛋白突变体H3K14CK18C的高效液相色谱图。

图4为组蛋白突变体H3K14CK18C的ESI-MS质谱图。

图5为双泛素化组蛋白H3K_C14UbK_C18Ub的高效液相色谱图。

图6为双泛素化组蛋白H3K_C14UbK_C18Ub的ESI-MS质谱图。

图7为双泛素化组蛋白H3K_C14UbK_C23Ub的高效液相色谱图。

图8为双泛素化组蛋白H3K_C14UbK_C23Ub的ESI-MS质谱图。

图9为双泛素化组蛋白H3K_C18UbK_C23Ub的高效液相色谱图。

图10为双泛素化组蛋白H3K_C18UbK_C23Ub的ESI-MS质谱图。

图11为三泛素化组蛋白H3K_C14UbK_C18UbK_C23Ub的高效液相色谱图。

图12为三泛素化组蛋白H3K_C14UbK_C18UbK_C23Ub的ESI-MS质谱图。

图13为本发明合成方法的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

如图13所示，本发明多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法，具体包括以下步骤：

步骤1：采用双反应活性的交联剂1,3-二溴丙酮(DBA)激活泛素突变体UbG76C，制备泛素突变体中间体UbG76C-DBA。

1a、挑取泛素突变体UbG76C单克隆菌落至10mL含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB培养基中，37℃、200rpm下培养14-16h；

1b、取1a中培养的菌液按体积比1:100加入到含有氨苄(100μg/mL)抗性的1L LB培养基中，37℃、200rpm继续培养，待菌液OD600吸光值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG对菌液进行诱导，37℃、200rpm继续培养5-6h；

1c、离心收集1b培养完成的菌液(25℃，6500rpm，10min)，弃去上清液，用裂解缓冲液(50mM Tris-HC1,150mM NaC1，pH＝7.5)将所得菌体充分重悬，使用超声破碎仪冰浴超声裂解菌体1h；

1d、将1c获得的细胞破碎液高速离心(12000rpm，30min，4℃)，收集上清液，向上清液中加入70％高氯酸，使其终体积为1％，沉淀杂蛋白。高速离心(12000rpm，30min，4℃)后收集上清液；

1e、使用半制备型反相高效液相色谱对透析液进行纯化，收集纯化后的样品，进行冷冻干燥；

1f、取1当量1e纯化的蛋白冻干粉UbG76C，使其完全溶解在10mM HCl溶液中；加入250mM硼酸缓冲液(pH＝7.0)，调节混合液的pH至4.5-6，加入30倍当量的DBA(溶剂为DMF)，在冰浴条件下，缓慢搅拌45min。反应结束后，加入反应液体积4-6倍的冰乙醚，上下翻转后静置3-5min，去除有机相，重复4-5次。UbG76C-DBA中间体存在于水相中。步骤1f中所有参与反应的组分需要提前在冰上预冷。

步骤2：加入组蛋白突变体，通过调节pH至偏中性，原位引发UbG76C-DBA与组蛋白突变体的交联，从而制备多位点泛素化组蛋白；

2a、挑取组蛋白突变体单克隆菌落至10mL含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB培养基中，37℃、200rpm下培养14-16h；

2b、取2a中培养的菌液按体积比1:100加入到含有氨苄(100μg/mL)抗性的1L LB培养基中，37℃、200rpm继续培养，待菌液OD600吸光值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG对菌液进行诱导，37℃、200rpm继续培养16-20h；

2c、离心收集2b培养完成的菌液(25℃，5000rpm，10min)，弃去上清液，用裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA，1mM PMSF，10mM DTT，pH＝7.5)将所得菌体充分重悬(每1L LB培养基所得菌体重悬于20mL裂解缓冲液中)，使用超声破碎仪冰浴超声裂解菌体1h；

2d、将2c获得的细胞破碎液高速离心(12000rpm，30min，4℃)，弃去上清液，沉淀加入含有1％(V/V)TritonX-100的washbuffer(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，10mMDTT，pH＝7.5)进行洗涤，重复两次。再用washbuffer(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mMEDTA,10mM DTT，pH＝7.5)进行洗涤，重复两次，使沉淀变白；

2e、使用变性剂(6M Gu-HCl，20mM Tris-HCl，10mM DTT，pH＝7.5)溶解2d得到的包涵体沉淀(10mL变性剂/每升菌)，超声助溶；

2f、将上述2e超声的溶液，过夜透析到含有0.1％TFA的双蒸水中。透析液离心(12000rpm，4℃，30min)后，取上清，0.22μm滤膜过滤。使用半制备型反相高效液相色谱对透析液进行纯化，收集纯化后的样品，进行冷冻干燥。

2g、取0.2-0.5倍当量的组蛋白突变体蛋白粉末，使其完全溶解在10mM HCl溶液中，再加入250mM硼酸缓冲液(pH＝7.0)；直接加入到1f萃取后的水相中，调节pH至6.5-7，冰浴缓慢搅拌1.5-2h。反应完成后，0.22μm滤膜过滤，使用半制备型反相高效液相色谱进行纯化，收集样品，经冷冻干燥后得到目标产物。步骤2g中所有参与反应的组分需要提前在冰上预冷。

实施例1泛素突变体UbG76C的制备

挑取泛素突变体UbG76C单克隆菌(转染目的基因(质粒载体：pET-22b，酶切位点：NdeI/XhoI，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)的大肠杆菌BL21(DE3))落至10mL含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB培养基中，37℃、200rpm下培养14h；

取上述培养的菌液按体积比1:100加入到含有氨苄(100μg/mL)抗性的1LLB培养基中，37℃、200rpm继续培养，待菌液OD600吸光值达到0.8时，加入400μL的1.0M IPTG母液对菌液进行诱导，37℃、200rpm继续培养6h；

离心收集菌液(25℃，5000rpm，10min)，弃去上清液，用裂解缓冲液(50mM Tris-HC1,150mM NaC1，pH＝7.5)将所得菌体充分重悬(每1L LB培养基所得菌体重悬于20mL裂解缓冲液中)，使用超声破碎仪冰浴超声裂解菌体1h；

细胞裂解液高速离心(12000rpm，30min，4℃)后，收集上清液，向上清液中加入70％高氯酸，使其终体积为1％，沉淀杂蛋白。高速离心(12000rpm，30min，4℃)后收集上清液。0.22μm滤膜过滤。使用半制备型高效液相色谱对透析液进行纯化，收集纯化后的样品，进行冷冻干燥，即获得泛素突变体UbG76C。

所得泛素突变体UbG76C的高效液相色谱图如图1所示，ESI-MS质谱图如图2所示，氨基酸序列为：

MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGC。

实施例2组蛋白突变体的制备

挑取组蛋白突变体H3K18CK23C单克隆菌(转染目的基因(质粒载体：pET-22b，酶切位点：NdeI/XhoI，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)的大肠杆菌BL21)落至10mL含有氨苄(100μg/mL)抗性的LB培养基中，37℃、200rpm下培养16h；

将上述培养的菌液按体积比1:100加入到含有氨苄(100μg/mL)抗性的1LLB培养基中，37℃、200rpm继续培养，待菌液OD600吸光值达到0.8时，加入400μL的1.0M IPTG母液对菌液进行诱导，37℃、200rpm继续培养20h。

离心(25℃，6500rpm，10min)收集菌液，弃去上清液，用25mL裂解缓冲液(20mMTris-HCl,150mM NaCl,1mM EDTA，1mM PMSF，10mM DTT，pH＝7.5)将菌体充分重悬(每1L LB培养基所得菌体重悬于20-30mL裂解缓冲液中)，使用超声破碎仪冰浴超声裂解菌体1h。

高速离心(12000rpm，30min，4℃)细胞破碎液，弃去上清液，向沉淀加入15mL含有1％(V/V)Triton X-100的washbuffer(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，10mM DTT，pH＝7.5)进行洗涤，重复两遍，以去除细胞碎片和杂蛋白。再用15mL washbuffer(50mMTris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA,10mM DTT，pH＝7.5)进行洗涤，重复两遍。

使用10mL unfolding buffer(6M Gn-HCl，20mM Tris-HCl，10mM DTT，pH＝7.5)溶解包涵体沉淀，超声助溶；将超声后液体转移到3.5KDa透析袋中，放入透析液(含0.1％TFA的双蒸水)中透析16h。透析完成后，将透析液高速离心(12000rpm，4℃，30min)，取上清，0.22μm滤膜过滤。使用半制备型高效液相色谱对透析液进行纯化，收集纯化后的样品，进行冷冻干燥，得到组蛋白突变体H3K18CK23C蛋白粉末约70mg，组蛋白突变体H3K18CK23C的氨基酸序列(SEQ ID No.4)为：

ARTKQTARKSTGGKAPRCQLATCAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALR EIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEASEAYLVGL FEDTNLSAIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA。

通过同样的方法制备：

组蛋白突变体H3K14CK18C，单克隆菌为转染目的基因(质粒载体：pET-22b，酶切位点：NdeI/XhoI，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)的大肠杆菌BL21，其高效液相色谱图如图3所示，ESI-MS质谱图如图4所示，氨基酸序列(SEQ ID No.2)为：

ARTKQTARKSTGGCAPRCQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALR EIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEASEAYLVGL FEDTNLSAIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA；

组蛋白突变体H3K14CK23C，单克隆菌为转染目的基因(质粒载体：pET-22b，酶切位点：NdeI/XhoI，核苷酸序列如SEQ ID No.8所示)的大肠杆菌BL21，氨基酸序列(SEQ IDNo.3)为：

ARTKQTARKSTGGCAPRKQLATCAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALR EIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEASEAYLVGL FEDTNLSAIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA；

组蛋白突变体H3K14CK18CK23C，单克隆菌为转染目的基因(质粒载体：pET-22b，酶切位点：NdeI/XhoI，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示)的大肠杆菌BL21，氨基酸序列(SEQID No.5)为：

ARTKQTARKSTGGCAPRCQLATCAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALR EIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEASEAYLVGL FEDTNLSAIHAKRVTIMPKDIQLARRIRGERA。

实施例3多位点单泛素化组蛋白的制备

取6.4mg(1.0equiv)UbG76C蛋白冻干粉，使其完全溶解在640μL 10mM HCl水溶液中，加入256μL 250mM硼酸缓冲液(pH＝7.0)，混合均匀。用NaOH水溶液调节混合液的pH至4.6，冰上静置8min，加入37μL 600mM DBA(溶剂为DMF)，在冰浴条件下，缓慢搅拌45min。在上述反应过程中，取2.5mg(0.22equiv)组蛋白突变体H3K18CK23C，使其溶解于250μL 10mMHCl水溶液中，再加入100μL 250mM硼酸缓冲液(pH＝7.0)，混合均匀，冰上静置。当上述反应结束后，加入5mL的冰无水乙醚，上下翻转、震荡后静置4min，吸去乙醚，以除去多余的DBA，重复5次。萃取完成后，加入H3K18CK23C的混合液，快速调节混合液pH至6.6，随后冰浴缓慢搅拌2h。反应结束后，0.22μm滤膜过滤反应溶液，使用半制备型高效液相色谱对样品溶液进行纯化，收集反应后目标产物的峰，进行冷冻干燥，得到双位点单泛素化组蛋白H3K_C18UbK_C23Ub，其高效液相色谱图如图9所示，ESI-MS质谱图如图10所示。

通过同样的方法制备：双泛素化组蛋白H3K_C14UbK_C18Ub，其高效液相色谱图如图5所示，ESI-MS质谱图如图6所示；双泛素化组蛋白H3K_C14UbK_C23Ub，其高效液相色谱图如图7所示，ESI-MS质谱图如图8所示；三泛素化组蛋白H3K_C14UbK_C18UbK_C23Ub，其高效液相色谱图如图11所示，ESI-MS质谱图如图12所示。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州大学

<120> 一种多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法

<130> 1.21

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 76

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 1

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

20 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Cys

65 70 75

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 2

Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Cys Ala Pro

1 5 10 15

Arg Cys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr

20 25 30

Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu

35 40 45

Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg Lys

50 55 60

Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr

65 70 75 80

Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala Ser

85 90 95

Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Ser Ala Ile

100 105 110

His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg

115 120 125

Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala

130 135

<210> 3

<211> 135

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 3

Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Cys Ala Pro

1 5 10 15

Arg Lys Gln Leu Ala Thr Cys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr

20 25 30

Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu

35 40 45

Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg Lys

50 55 60

Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr

65 70 75 80

Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala Ser

85 90 95

Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Ser Ala Ile

100 105 110

His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg

115 120 125

Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala

130 135

<210> 4

<211> 135

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 4

Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro

1 5 10 15

Arg Cys Gln Leu Ala Thr Cys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr

20 25 30

Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu

35 40 45

Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg Lys

50 55 60

Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr

65 70 75 80

Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala Ser

85 90 95

Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Ser Ala Ile

100 105 110

His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg

115 120 125

Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala

130 135

<210> 5

<211> 135

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 5

Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Cys Ala Pro

1 5 10 15

Arg Cys Gln Leu Ala Thr Cys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr

20 25 30

Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu

35 40 45

Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg Lys

50 55 60

Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr

65 70 75 80

Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala Ser

85 90 95

Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Ser Ala Ile

100 105 110

His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg

115 120 125

Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala

130 135

<210> 6

<211> 231

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 6

atgcaaatat ttgtaaaaac actaactgga aagacgatca ctttggaggt tgaaccgagc 60

gacaccattg aaaacgtgaa agctaagatc caagataaag agggcatccc gccggatcag 120

cagcgtctga ttttcgcggg taagcagctg gaggacggcc gtaccttgtc cgactacaat 180

attcaaaaag aaagcacctt acacctggtc ctgcgtctgc gcggttgcta a 231

<210> 7

<211> 411

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 7

atggcgcgta ccaagcagac cgcgcgtaaa agcaccggtg gctgcgcgcc gcgttgccaa 60

ctggcgacca aagcggcgcg taaaagcgcg ccggcgaccg gtggcgtgaa gaaaccgcac 120

cgttaccgtc cgggtaccgt tgcgctgcgt gagatccgtc gttatcagaa aagcaccgaa 180

ctgctgattc gtaagctgcc gttccagcgt ctggtgcgtg agatcgcgca agacttcaag 240

accgatctgc gttttcagag cagcgcggtg atggcgctgc aagaggcgag cgaagcgtac 300

ctggttggtc tgtttgagga caccaacctg agcgcgatcc acgcgaaacg tgttaccatc 360

atgccgaagg atattcaact ggcgcgtcgt attcgtggcg aacgtgcgta a 411

<210> 8

<211> 411

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 8

atggctagaa caaaacaaac tgcaaggaag tcaactggtg gttgtgctcc gcgtaagcag 60

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atgccgaaag acatccagtt ggcgagacgt attcgtggtg aacgtgcata a 411

<210> 9

<211> 411

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 9

atggcgcgta ccaagcagac cgcgcgtaaa agcaccggtg gcaaagcgcc gcgttgccaa 60

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accgatctgc gttttcagag cagcgcggtg atggcgctgc aagaggcgag cgaagcgtac 300

ctggttggtc tgtttgagga caccaacctg agcgcgatcc acgcgaaacg tgttaccatc 360

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<210> 10

<211> 411

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 10

atggcgcgta ccaagcagac cgcgcgtaaa agcaccggtg gctgcgcgcc gcgttgccaa 60

ctggcgacct gcgcggcgcg taaaagcgcg ccggcgaccg gtggcgtgaa gaaaccgcac 120

cgttaccgtc cgggtaccgt tgcgctgcgt gagatccgtc gttatcagaa aagcaccgaa 180

ctgctgattc gtaagctgcc gttccagcgt ctggtgcgtg agatcgcgca agacttcaag 240

accgatctgc gttttcagag cagcgcggtg atggcgctgc aagaggcgag cgaagcgtac 300

ctggttggtc tgtttgagga caccaacctg agcgcgatcc acgcgaaacg tgttaccatc 360

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Claims

1.一种多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1：在弱酸缓冲盐条件下，采用交联剂活化泛素突变体，得到活性中间体；所述泛素突变体的C端甘氨酸被半胱氨酸取代；

S2：加入组蛋白突变体，调节pH至偏中性，原位诱发所述活性中间体与所述组蛋白突变体交联，得到所述多位点单泛素修饰组蛋白；所述组蛋白突变体的修饰位点被半胱氨酸取代，其氨基酸序列如SEQ ID No.2-5中任一所示；

所述泛素突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述交联剂为1,3-二溴丙酮和/或1,3-二氯丙酮；

所述泛素突变体与所述交联剂的摩尔比为1：20-30；

所述组蛋白突变体与所述泛素突变体的摩尔比为2-5：10；

所述步骤S1和S2中的反应均在冰浴条件下进行。

2.如权利要求1所述的多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法，其特征在于，所述步骤S2中，加入组蛋白突变体前还包括去除步骤S1中未反应的交联剂的步骤。

3.如权利要求2所述的多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法，其特征在于，通过加入有机萃取剂，萃取去除步骤S1中未反应的交联剂。

4.如权利要求3所述的多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法，其特征在于，所述有机萃取剂为无水乙醚。