JPH01502556A - イー・コリにおいて発現したピー・ファルシパラム・ｃｓタンパク質ワクチンの単離および精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イー・コリにおいて発現したピー・ファルシパラム・ＣＳタンパク質ワクチンの 単離および精製方法 本発明は、組換型イー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）において発現し、マラリアの発現 因子であるプラズモディウム・７アルシバラム（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕａｆａｌ ｃｉｐａｒｕｍ）による感染に対するヒト保護用ワクチンとしての治療有用性を 有する精製ポリペプチドを産生ずる方法に関する。

参考のために引用するバロウら（Ｂａｌｌｏｕ　ｅｔ　ａｌ＝）による欧州特許 ゛出願、ＥＰ−Ａ−１９２６２６号（米国特許出願番号第６９９１１６号）にお いて、ピー・ファルシパラムによる感染に対して哺乳動物の免疫付与能を有する 免疫原性ポリペプチドおよび免疫原性ポリペプチドからなるワクチンが開示され 、かつ特許請求されている。免疫原性ポリペプチドは、４個以上のタンデム（ｔ ａｎｄｅｍ）リピート単位のピー・７アルシバラムＣＳタンパク質からなる。ピ ー・ファルシパラムリピート単位は、以下の配列： アスパラギン（Ａ　５ｎ）−アラニン（Ａｌａ）−Ａｓｎ−プロリン（Ｐｒｏ） −を有するテトラペプチドである。参考のために引用するグロスら（Ｇｒｏｓｓ 　ｅｔ　ａｌ、）による欧州特許出願、ＥＰ−Ａ−１９１７４８号（米国特許出 願番号第６９９１１５号）において、ＣＳタンパク質ピー・ファルシパラムのす べてのまたは一部のリピート単位用のコーディング配列を有するイー・コリ発現 ベクターならびに発現ベクターで形質転換したイー・コリおよび産生イー・コリ 培養からの免疫原性ポリペプチドを精製する方法が記載され、かつ特許請求され ている。

組換ＷＤＮＡ法により産生される新規な薬剤および生化学的薬剤の工業的製造に おける不変的な問題は、その意図する用途に対して十分に純粋な形態における産 物の回収にある。例えば、ワクチンは、ポリペプチド、タンパク質、核酸および 発熱性物質を包含する細胞起源の種々の混入物がまったくなく、かかる混入物に 対する好ましくない免疫または毒性反応の発生は阻止されなければならない。単 離および精製法は、特に、微生物の核酸混入、好ましくない抗原物質および発熱 性物質、すなわち、レシピエンドにおいて発熱応答を誘発する物質を排除するよ うにしなければならない。発熱性物質は、代表的には、リポ多糖類のような細菌 エンドトキシンである。

前記の欧州特許ＥＰ−Ａ−１９１７４８号およびＥ　Ｐ−Ａ−１９２６２６号に 開示されている精製方法によれば、ピー・ファルシパラムＣＳタンパク質から誘 導されたポリペプチドは、′ｆ＃澄細胞抽出物を。

約８０℃に加熱し、つづいてデタージェントを加え、タンパク質の溶解性を維持 することにより他のポリペプチドから分離することができる。少なくとも約４分 間、８０℃に加熱することは、実質的に所望の免疫原性ポリペプチドを分解する ことなく、はとんどすべての好ましくない細菌ポリペプチドおよびタンパク質を 沈澱させる。

かくして、沈澱した細菌ポリペプチドおよびタンパク質は遠心分離によりペレッ ト状にされ、除去することができる。ヤングら（Ｙ　ｏｕｎｇｅｔ　ａｌ、）、 サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２８　：　９５８　（１９８５）は、欧州 特許ＥＰ−Ａ−１９２６２６号および１９１７４８号に開示されているある種の ペプチドおよび硫酸アンモニウム沈澱および逆相クロマトグラフィーによるその 精製を報告している。

ピー・ファルシパラムＣＳタンパク質から誘導されたポリペプチドの生産規模の 単離および精製操作を進歩させるさらなる試みは、前記の熱処理が、大部分の細 胞ポリペプチド混入物を分離するのに効果的であるが、発熱性物質および核酸の ような他の混入物を有意に除去しないことを示す。この問題は、特に、アルギニ ンに冨む３２アミノ酸「尾部」（“ｔａｉｌ”）での少なくとも４個のリピート からなるＲ　ｔｅｔ３．ポリペプチドのような比較的長い塩基性「尾部」を有す るピー・７アルシパラムＣＳタンパク質から誘導されたポリペプチドにおいて重 大である。「尾部」の塩基特性のため、ＤＮＡは複合体中に強固に保持される。

熱処理細胞抽出物におけるエンドトキシン濃度もまた、望ましくなくはと高いこ とが判明した。

発明の要約 本発明によれば、細胞起源のタンパク質、核酸および発熱性混入物を有する組換 型イー・コリ宿主細胞培養から誘導された部分的に精製された細胞溶解質から、 ４個以上のタンデムリピート単位のピー・ファルシパラムＣＳタンパク質からな るポリペプチドを単離し、精製する方法を提供する。該方法は、−運の選択的沈 澱工程、つづいて２回のクロマトグラフィ一工程、イオン交換クロマトグラフィ ーおよび逆相クロマトグラフィーからなる。

さらに詳しくは、本発明は、 （ａ）細菌混入物を選択的に沈澱させ、（ｂ）工程（ａ）の上澄液から免疫原性 ポリペプチドを選択的に沈澱させ、 （ｃ）免疫原性ポリペプチドを含有する工程（ｂ）からの沈澱物を再溶解させ、 該溶液から細菌混入物を選択的に沈澱させ、（ｄ）免疫原性ポリペプチドの溶液 をイオン交換担体と接触させ、ポリペプチドを有するフラクションを収集し、（ ｅ）免疫原性ポリペプチドの溶液を、固体の疎水性担体と接触させ、ポリペプチ ドを該担体に吸着させ、該ポリペプチドを該担体から極性有機溶媒で溶出し、精 製ポリペプチドを含有するフラクションを収集することからなり、組換型イー・ コリ宿主細胞培養からの清澄細胞溶解質から、４個以上のタンデムリピート単位 のピー・ファルシパラムＣＳタンパク質からなる免疫属性ポリペプチドを精製す る方法である。

本発明の好ましい具体例は、 ａ）細胞を分裂させ、該懸濁液から細胞残骸を分離し、所望でないポリペプチド 、タンパク質、ＤＮＡおよびエンドトキシンと共にペプチドＲ３２ＮＳ１ｍ＋を 含有する清澄細胞抽出物を得、ｂ）清澄抽出物をポリエチレンイミンで処理し、 所望でない細菌混入物を沈澱させ、その後、ペプチドＲ３２ＮＳ１ｍ＋を含有す る上澄液から沈澱した細菌混入物を分離し、Ｃ）硫酸アンモニウムを、約２０％ ないし約４０％飽和の濃度まで、Ｒ３２ＮＳ１ｍ＋含有上澄液に加え、細胞抽出 物からペプチドＲ３２ＮＳ１ｍ＋と共に硫酸アンモニウムを沈澱させ、該沈澱物 の懸濁液を形成させ、その懸濁液からペプチドＲ３２ＮＳ１ｍ＋含有上澄液、を 分離し、 ｄ）該上澄液を酸で約ｐＨ２に調整することにより、細菌混入物を沈澱させ、Ｒ ３２ＮＳ１ｍ＋含有上澄液から沈澱した細菌混入物を分離し、 ｅ）Ｒ３２ＮＳｌ□を含有する上澄液にカオトロビズム剤を加え、該上澄液をカ チオン交換体と接触させ、つづいてｐＨ約６．５で溶出し、溶出液を収集し、 ｆ）固定相として固体担体上のＣ２〜１８アルキル基、および移動相として極性 有機溶媒を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、該イオ ン交換溶出液から残りの細菌混入物を除去し、細菌混入物のない溶出液を得、 ｇ）逆相ＨＰＬＣ溶出液をダイアフィルトレージョン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉ ｏｎ）に付し、純粋なポリペプチドＲ３２ＮＳ１ｍ＋のりテンテート（ｒｅｔｅ ｎｔａｔｅ）を得ることからなるＲ３２ＮＳ１ｍｌの単離および精製方法である 。

本発明のもう一つの好ましい具体例は、ペプチドＲ３２Ｌｅｎｓｓを産生するイ ー・コリの細胞培養から、ポリペプチドＲ３２ｔｅｔｓｘを単離し、かつ精製す る方法であり、該方法は、ａ）細胞を分裂させ、該懸濁液から細胞残骸を分離し 、所望でな特表千１−５０２５５６　（５） いポリペプチド、タンパク質、ＤＮＡおよびエンドトキシンと共にペプチドＲ３ ２ｔｅｔｘｚを含有する清澄細胞抽出物を得、ｂ）清澄抽出物を約り５℃〜約９ ０℃の温度まで加熱し、ポリペプチドＲ３２ｔｅｔ３！の実質的な沈澱または分 解を伴うことなく、所望でない細菌混入物を選択的に沈澱させ、その後、該細胞 抽出物を冷却し、Ｒ３２ｔｅＬ３２を含有する上澄液から沈澱した細菌混入物を 分離し、゛ ｃ　）Ｒ３２ｔｅｔｓｚを含有する冷却上澄液に、約２５％ないし約４０％飽和 の濃度まで硫酸アンモニウムを加え、上澄液からペプチドＲ３２ｔｅｔｘｘと共 に硫酸アンモニウムを沈澱させ、該沈澱物の懸濁液を形成させ、その懸濁液から ペプチドＲ３２Ｌｅｔｓｘを含有する上澄液を分離し、 ｄ）上澄液に可溶性塩を加え、該上澄液のイオン強度を増加させ、該上澄液を酸 でｐＨ約２に調整することにより、細菌混入物を沈澱させ、Ｒ３２ｔｅｔ３ｊ含 有上澄液から沈澱した細菌混入物を分離し、ｅ）酸沈澱の上澄液を、ｐＨ約５に てジチオトレイトールを有する酢酸アンモニウム緩衝液を用いるダイアフィルト レージョンに付すことにより、ペプチドＲ３２Ｌｅｔｓｘを含有するりテンテー トを得、ｆ）リチンテートをカチオン交換体と接触させ、つづいてｐＨ約５にて 塩で溶出し、溶出液を収集し、 ｇ）固定相として固体担体上のＣ２〜１８アルキル基、および移動相として極性 有機溶媒を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、残りの 細菌混入物を該イオン交換溶出液から除去し、細菌混入物のない溶出液を得、 ｈ）逆相ＨＰＬＣ溶出液をダイアフィルトレージ房ンに付し、純粋なポリペプチ ドＲ３２Ｌｅｎｓｓのりテンテートを得ることからなる。

本発明のさらに好ましい具体例は、ペプチドＲ３２ＬＡを産生ずるイー・コリの 細胞培養からポリペプチドＲ３２ＬＡを単離し、かつ精製する方法であり、該方 法は、 ａ）細胞を分裂させ、該懸濁液から細胞残骸を分離し、所望でないポリペプチド 、タンパク質、ＤＮＡおよびエンドトキシンと共にポリペプチドＲ３２ＬＡを含 有する清澄細胞抽出物を得、ｂ）清澄抽出物を約７５℃ないし約９０℃の温度に 加熱し、ポリペプチドＲ３２ＬＡの実質的な沈澱または分解を伴うことなく、所 望でない細菌混入物を選択的に沈澱させ、その後、細胞抽出物を冷却し、沈澱し た細菌混入物をＲ３２ＬＡ含有上澄液から分離し、Ｃ）硫酸アンモニウムを、Ｒ ３２ＬＡ含有の冷却上澄液に、約２５％ないし約６０％飽和の濃度まで加え、上 澄液からペプチドＲ３２ＬＡと共に硫酸アンモニウムを沈澱させ、該沈澱物の懸 濁液を形成させ、その懸濁液からペプチドＲ３２ＬＡ含冑上澄液を分離し、ｄ） ペプチドＲ３２ＬＡ含有上澄液を、酸でｐＨ約２に調整することにより、細菌混 入物を沈澱させ、Ｒ３２ＬＡ含有上澄液から沈澱した細菌混入物を分離し、 ｅ）上澄液をｐＨ約６．５に調整し、該上澄液をアニオン交換体と接触させ、溶 出液を収集し、 ｆ）固定相として固体担体上のＣ２〜１８アルキル基および移動相として極性有 機溶媒を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、残りの細 菌混入物を該イオン交換溶出液から除去し、細Ｎ混入物のない溶出液を得、 ｇ）逆相ＨＰＬＣ溶出液をダイアフィルトレージョンに付し、純粋なポリペプチ ドＲ３２ＬＡリチンテートを得ることからなる。

本発明の好ましい具体例は、Ｒ３２ｔｅＬ３２、Ｒ３２ｔｅｔｇ＋またはＲ３２ ＬＡのようなピー・ファルシバラムＣｓタンパク質かう誘導される、純粋な、す なわち、測定不能な量の所望でないポリペプチドまたはタンパク質、２　ｎｇ／ ＋ｎｇ以下のＤＮＡおよび１０個以下のエンドトキシン単位（ＥＵ）／ａｇを有 するポリペプチドを産生ずることである。本明細書において用いる場合、「エン ドトキシン単位」なる語は、限定量のＵ、Ｓ、標準エンドトキシンにおいて活性 であることをいう。定義によれば、１．ＯＥＵは０．２ｎｇのＵ、Ｓ、標準エン ドトキシン、１ｏｔＥｃ−２に均等である。生化学的薬剤局（Ｕ、Ｓ、Ｆ。

Ｄ、Ａ、）は、この基準を確立し、Ｕ、Ｓ、標準エンドトキシンの連続ロットで ＥＵの連続性を維持している。かかる純粋なポリペプチドは、所望の免疫応答を 得るのに有効な量の投与に対して、患者に混入物による悪影響を生じさせない。

発明の詳説 前記の欧州特許ＥＰ−Ａ−１９２６２６号およびＥ　Ｐ−Ａ−１９１７４８号に 開示されているような、テトラペプチドリピートのピー・ファルシパラム・サー カマスポロゾイト・タンノ（り質２５）らなる免疫原性ポリペプチドは、本発明 の方法にしｔ：がって精製することカｉできる。これらは、Ｒｔｅｔ３２ポリペ プチド、ＲＬｅｔｇ５ポリペプチド、ＲＧポリペプチド、ＲＬＲポリペプチド、 Ｎ５ＩＲポリペプチド、ＲＮＳ　１ポリペプチド、ＲＮＳ１ｇ＋Ｎ５ＩＲポリペ プチドポリペプチドを包含する。この方法はｓ　Ｒ３２ＬｅＬ３ｊ、Ｒ３２ｔｅ ｔｍ＋およびＲ３２ＬＡからのマラリアワクチンの製造１；特ｔ；有用であり、 それは、ピー・ファルシパラム・スポロゾイトに対する哺乳動物の免疫応答を引 き起こすのに非常に有効であることが判明した。Ｒ３２ｔｅｔおよびＲ３２ＬＡ は、前記の欧州特許ＥＰ−Ａ−１９２６２６号（米国特許出願番号第６９９１１ ６号）およびＥＰ−Ａ−１９１７４８号（米国特許出願番号第６９９１１５号） に記載されてしする。Ｒ３２ＮＳ１８．は、ＮＳＩの８ＯＮ−末端アミノ酸に融 合しｔ７同−のＲ３２抗原配列からなる。該融合において、μ３２はＮＳＩの別 のアミノ酸に融合し、Ｃ−末端にてＮＳＩのアミノｌｍ８１が一１ｉｕ−ｖａｌ −ａｓｎ配列に融合する。すなわち、該配列は： Ｎ　−ａｓｐ−ｐｒｏ（ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐｒｏ）　ｒ　ｓ　−（ａｓ ｎ−ｖａ　１−ａｓｐ−ｐｒｏ）　Ｉ−（ａｓｎ−ａ　１ａ| ａｓｎ−ｐｒｏ）＋１−ａｓｎ−ｖａｌ−Ｎ　Ｓ　１５ｒ−Ｃ［Ｎ５１ｍ＋配列 は、−ａｓｐ−ｐｒｏ一本本本−ｍｅｔ−１ｅｕ−ｖａｌ−ａｓｎ−Ｃである］ で示される。このポリペプチドは、前記特許文献に開示されている技法を用いて 製造する。

前記のように、本発明の方法は、細胞起源の発熱性、タンパク質様、核酸混入物 を含有し、組換型イー・コリ宿主細胞培養から誘導された清澄細胞溶解質を、一 連の沈澱および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を包含するクロマ トグラフィー操作に付すことを包含し、寅質的に混入物のない所望の免疫原性ポ リペプチドを得る。

組換型イー・コリ宿主を、標準的組換型ＤＮＡ法により製造する。

例えば、参考のために本明細書に引用されているヤングら、サイエンス、２２８ 　罎９５ｇ　（１９８５）参照。かかる組換型細胞は、酸素の存在下、標準的な 発酵法により、炭素、窒素および無機物の同化源を含有する栄養培地にて培養す る。免疫原性Ｃｓポリペプチドを発現するに十分な時間発酵させた後、遠心分離 または濾過により細胞を収集する。ついで、得られた細胞ペーストを再懸濁さ゛ せ、細胞溶解に付す。

細胞溶解は、リゾチームまたは他の溶解あるいは透過剤を該細胞ペレットの緩衝 懸濁液に、湿潤細胞ペレットの重量に基づき約１００〜３００ｇ／ｆｆの細胞濃 度にて添加することにより行うことができる。生産規模操作における細胞ペレッ トの重量は８００〜３０００ｇの範囲にあればよく、精製を受ける個々のポリペ プチドに依存する。適当な溶解緩衝液は、ｐＨ８，０を有するトリス（５０ｍＭ ）、ＥＤＴＡ（２＋ｎＭ）、ジチオスレイトール（Ｄ　Ｄ　ＴＸｏ　、１　＋ｎ Ｍ）およびグリセロール（５％）である。また、ｐＨ６，５を有するリン酸ナト リウム（５０ｍＭ）、ＥＤＴ、Ａ（２ｍＭ）およびグリセロール（５％）からな る緩衝液を用いてもよい。細胞溶解はまた、リゾチームの不在において、機械的 または超音波分裂手段により行ってもよい。満足のいく結果が、ガラス・ビーズ ・ダイノミル（ＤｙｎｏｍｉｌｌＸインパンデツクス、メイララド、ニニージャ ージ州（Ｉ　ｍｐａｎｄｅｘ、　Ｍａｙｗｏｏｄ、　Ｎ　Ｊ　））まブ二はガラ リン・ホモジナイザー（Ｇａｕｌｉｎ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒＸＡ　Ｐ　Ｖガ ラリン・インコーホレイティラド、ニベレット、マサチューセッツ州（Ａ”Ｐ　 Ｖ　Ｇａｕｌｉｎ、　Ｉ　ｎｃ、、　Ｅ　ｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅ ｔｔｓ））を用いる生産規模において得られた。所望により、化学的、機械的お よび／または超音波溶解手段の組み合わせを用いてもよい。

この操作は必須ではないが、（細胞）溶解懸濁液を、デオキシコール酸塩、例え ば、ナトリウム塩（約０．１％）のようなデタージエントで処理し、所望の免疫 原性ポリペプチドの細胞残骸に対する結合を阻止することができる。デオキシコ ール酸塩は、所望により、溶解緩衝液に組み入れてもよい。溶解懸濁液を、例え ば、流速１００〜５００ｍ１／分にてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｊ　ＣＦ− Ｚローター３９９００ｘｇでの連続遠心分離により清澄にする。

ついで、清澄にした抽出物を処理し、細菌混入物、すなわち、タンパク質、およ び好ましくは核酸もまた選択的に沈澱させる。かかる沈澱は、種々の手段により 実施することができる。例えば、Ｒｔｅｔ３１、Ｒｔｅｔ８６、ＲＬＡ％ＲＧ、 ＲＮ、ＲＮＳＩ、ＲＮＳ１ｍ＋およびＮ５ＩＲポリペプチドは熱安定性であり、 約８０℃にて溶解する。

したがって、清澄細胞溶解質を約７５〜９０℃、好ましくは約８０゜℃に加熱す ることにより、細菌タンパク質混入物は適宜選択的に沈澱する。さらに例えば、 核酸を選択的に沈澱させる化学剤を用いることができる。例えば、約０．１〜１ ％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、大部分のイー・コリ・ＤＮＡおよびＲＮ Ａならびにいくらかの可溶性細菌タンパク質を除去する。本発明の１つの具体例 において、分裂後、ＰＥＩを加えることにより清澄にした細胞抽出物をＰＨ１で 処理する。使用可能な他の選択的沈澱操作は、アンモニウム、カリウムまたはナ トリウムのような単価カチオンとの硫酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩での塩析 、炭素数１〜３のアルコーノ呟アセトン、アセトニトリルまたはテトラヒドロフ ランのような有機溶媒を用いる沈澱、ポリエチレングリコールのような有機ポリ マーまたはポリアクリレート、カプリル酸塩およびリバノール（ｒｉｖａｎｏｌ ）のような電荷高分子電解質での沈澱、およびｐＨ調整による沈澱を包含する。

かかる選択的沈澱工程により、大部分、例えば、７５％以上のマラリア抗原が溶 液中に残存する。

ピー・ファルシバラムリピート部位は、高温にて非常に安定しているので、熱沈 澱は、それに融合したより小さな熱安定　配列を有さないペプチド、例えば、Ｒ ＬＡ、ＲＧおよびＲＮポリペプチドの精製に特に有用である。しかしながら、ｔ ｅｔｓｚ配列に融合した他のポリペプチドの場合、初期精製工程としてポリエチ レンイミン沈澱はあまり効果的ではなかった。

初期工程の後、マラリア抗原を選択的に沈澱させる。マラリア抗原を選択的に沈 澱させる好ましい技法は、前記のように、好ましくは硫酸アンモニウムを用いて 塩析することである。

硫酸アンモニウムを、最初の選択沈澱からの上澄液と、ピー・ファルシバラムＣ Ｓタンパク質から誘導されるポリペプチドを選択的に沈澱するに十分な濃度まで 混合する。Ｒ３２ＬｅＬ３Ｈの場合、硫酸アンモニウムの濃度は、２５％と４０ ％飽和の間でなければならず、Ｒ３２ＬＡの場合、２５％と６０％飽和の間の硫 酸アンモニウムの。

添加が所望のポリペプチドの選択沈澱に有用であり、ＮＳＩ構成の場合、２０％ 〜４０％飽和の硫酸アンモニウムが有用である。硫酸アンモニウム添加は段階的 に行ってもよく、それにより、各選択段階でのｖＬ酸アンモニウム飽和により沈 澱しうるそれらのタンパク質を除去する。硫酸アンモニウムは４℃にて６０分間 にわたって加え、さらに４℃にて３０分間撹拌することが好ましい。ついで、懸 濁液を遠心分離に付し、粗製免疫原性ポリペプチドを含有するペレットを得る。

この選択沈澱の結果、寅質的にはすべての免疫原性ポリペプチドが該ペレット中 に含まれる。ついで、硫酸アンモニウムペレットを、適当な緩衝液に再溶解する 。

ついで、再溶解したポリペプチドを、細菌核酸を除去することを目的とした第３ の選択沈澱に付す。この工程は、酸性化により行うことが好ましい。実際に、Ｒ ３２ｔｅｔ４２について、酸処理と関連し部分的に精製した細胞溶解質のイオン 強度が有意に増加する。この目的用の適当な塩は、２〜４Ｍ　ＭｇＣＱ、または ２〜４Ｍ　ＮａＣｌ２＊たはその混合物を包含する。その後、細胞溶解質を、ト リフルオロ酢酸、リン酸または塩酸のような適当な酸でｐＨ約２．０に調整する 。

ａ処理により沈澱した核酸は、遠心分離により細胞溶解質から容易に除去するこ とができる。

記載方法における細胞溶解質の部分精製は、細胞溶解質中に最初に存在する細胞 ポリペプチドおよびタンパク質の量を有意に減少させる。選択沈澱工程の後、免 疫原性ポリペプチドを有する溶液をさらに、一連の２回のクロマトグラフィー操 作、すなわち、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーに より精製する。

イオン交換による部分的に精製した細胞溶解質からの残りの細菌混入物の分離は 、適当なマトリックスに結合したカルボキシメチル（ＣＭ）、スルホプロピル（ ＳＰ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）の ようなカチオンまたはアニオン交換基を有する微粒子カラム充填剤を用いて行う 。イオン交換体は、精製すべきポリペプチドが通過するに十分に多孔性で開口し ているマトリックスを提供しなければならない。一般に、直径が１０−１００ミ クロンからのビーズ径を有し、１０ダルトンの排除限界であるイオン交換体が、 十分な性能を有している。Ｒ３２ｔｅｔｓｚのイオン交換について、特に良好な 結果が、ｃＮｑ−＋−リサクリル”　Ｍ（ＣＭ−Ｔ　ｒｉｓａｃｒｙｌ”　Ｍ） （Ｌ　Ｋ　Ｂプロダクツ、ブロマ、スエーデン（ＬＫＢＰｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｂ ｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のようなＣＭカチオン交換担体を用いて得られた。

高塩基性Ｃ−末端「尾部」がＣＭ−担体に堅固に結合し、細胞溶解質中に存在す る他の混入物から所望のポリペプチドの分離がなされる。ポリペプチドＲ３２Ｌ Ａを含有する部分的に精製した細胞溶解質からの核酸の分離は、アニオン交換担 体、ＤＥＡＥ−トリサクリル”Ｍ（ＬＫＢプロダクツ、ブロマ、スニーデン）で 達成される。Ｒ３２ＮＳ１ｇ＋の場合、特に良好な結果が、カチオン交換担体す なわちスルホプロピル−セファ０−ス３（）７−マシア、ビス力タウエイ、ニュ ージャージ州）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ。

Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）架橋アガロースを用いて得られた。

免疫原性ペプチドの溶液をイオン交換担体と接触させ、ついで、そのイオン交換 担体から溶出する。溶出は適当な緩衝溶液を用いて行い、実質的にポリペプチド 、タンパク質および核酸混入物のない所望の免疫原性ポリペプチドを有するアラ クシ３ンを得ることができる０本明細書において、溶出液として用いられる緩衝 溶液は、生化学物質のイオン交換クロマトグラフィーにおいて広く用いられてい る緩衝溶液である。カチオン交換担体からのグラジイニント溶出は、ｔｅｔ　ｒ 尾部」を有するピー・７アルシパラムｃｓタンパク質から誘導されるある種のポ リペプチドに有利に用いられる。ポリペプチドＲ３２ＬＡについて、核酸混入物 がイオン交換マトリックス上に吸着するが、所望のポリペプチドはイオン交換を 通過し、溶出液および洗液中にて収集される。この流出液は、数回連続して同じ イオン交換カラム、または異なる充填剤を有する別のカラムを通してもよい。

Ｒ３２ＮＳ１ｍ＋の場合、イオン交換の前に、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐ ｅ）、例えば、尿素、チオシアネート、グアニジン、塩化グアニジニウムまたは エチレングリフールを塩沈澱からのペプチド含有上澄液に加え、該上澄液を、例 えば、水酸化ナトリウムで、ｐＨ約４に調整することが好ましい。好ましいカオ トロープは、最終濃度が約３Ｍでの尿素である。カオトロープおよびｐＨＩ！！ 整は、ペプチドの集合物を分裂させるのに有用である。カチオン交換担体への吸 着後、該担体をｐＨ４およびｐＨ５にて緩衝液、例えば、５０＋ｎＭ酢酸ナトリ ウムで洗浄する。ついで、Ｒ３２ＮＳ１１１が、ｐＨ約６　。

５にて塩、例えば、ｌＯｍＭＤＴＴ中、２０＋ｎＭリン酸ナトリウムおよび０． ５Ｍ塩化ナトリウムで溶出する。

前記のように、ポリペプチド、タンパク質および核酸混入物を除去処理した後、 細胞溶解質を、逆相ＨＰＬＣにより、細胞エンドトキシンのような発熱性物質お よびまた残りの他の混入物を含む残りの細菌混入物が実質的にない状態にする。

例えば、逆相ＨＰＬＣは、産生混合物中、密接に関連する抗原の分割に重要であ る。組成分割のよい例は、Ｒ３２ＬＡの精製である。

この場合、たとえ混合物中の主要成分が９５％より多くても、３−アミノ酸残基 により異なる２種のタンパク質の分離が達成される。

逆相ＨＰＬＣにより平頭のまたは酸化されたＣ−末端誘導体が除去される他のタ ンパク質の調製の間にも同様の分離が達成された。

逆相クロマトグラフィーは、所望のタンパク質の溶液、固体の疎水性担体または 固定相と接触させることを包含し、それによりタンパク質が担体に吸着する。つ いで、洗浄後、担体を極性有機溶媒、すなわち、移動相でリンスすることにより 、タンパク質が溶出する。

固定相は、アルミナのような担体またはシリカベース担体からなることが好まし く、後者は種々の非極性有機基に結合していることが好ましい。かかる結合相は 、当業者によく知られているように、例えば、シリカ上の表面シラノール基をオ ルガノクロロシランと反応させることにより製造してもよい。シリカベース担体 は、例えば、球状シリカ粒子、異形シリカ粒子またはシリカで被覆された粒状支 持体を包含する。粒径および多孔性は、精製すべき特定のポリペプチドの分離に 適していなければならない。逆相ＨＰＬＣによる免疫原性ポリペプチドからの混 入物の分離は、炭素数２〜１８のアルキル基の群から選択される固定相、好まし くは、シリカベース担体を用いて寅箆することが好ましい。

逆相ＨＰＬＣ用に選択される移動相は、低毒性および底粘度を有し、純粋形にて 容易に入手可能でなければならない。移動相は、例えば、メタノール、ｎ−プロ パツールまたはイソプロノ（ノールのような水混和性低級アルコール１、テトラ ヒドロフラン、ジオキサンまｔ；はアセトニトリルの群から選択してもよい。本 発明の使用ｌ；好ましい移動相は、炭素数１〜３のアルコール、アセトニトリル またはテトラヒドロ７ランの群から選択される。選択される移動相１よ、主とし て、精製すべき免疫原性ポリペプチドに対する所定の溶媒の強度および選択性に 依存する。

酸、例えば、ヘプタフルオロブチル酸、リン酸、酢酸またはトリフルオロ酢酸中 、０〜３５％イソプロパツールを用いるグラディエンド溶出が、Ｒ３２ＮＳｌｉ ＋、Ｒ３２ｔｅｔｓｚおよびＲ３２ＬＡの精製に有効であることが見いだされた 。０．１〜０．２容量％のトリフルオロ酢酸が好ましい。

以下に例示するように、逆相ＨＰＬＣは、最適条件下、単一工程における部分精 製の細胞溶解質のエンドトキシン含量を１０”倍減少させる能力を有する。ダイ アフィルトレージリンおよび滅菌濾過をまた、ＨＰＬＣにおいて用いｔ；酸およ び有機溶媒を除去する最終精製工程として、逆相ＨＰＬＣカラムの溶出液に対し て行い、ｐＨをｐＨ６〜８に調整する。

他の操作は、高度に精製した医薬品グレード産物を得るのに必要ではないが、種 々の他の操作を本発明の方法と共に用いることができる。かかる操作は、前記方 法工程の間、前または後に用いることができる。かかる最適工程の１つが、ダイ アフィルトレージョンである。

「ダイアフィルトレージョン」なる語は、零朗細書中、その分野において認識さ れた意味で用いられ、多数の緩衝液交換を行うに非常に効果的である連続透析形 をいう。ダイアフィルトレージョンは、セルロース膜または限外フィルターを交 差して行うことが好ましし１゜適当な膜／フィルターは、約１０００分子量（Ｍ Ｗ）カットオフを有し、２．４μｍ径までの孔径を有する膜／フィルターである 。ダイアフィルトレージョンに適応可能ないくつかの異なる系は、ｌＯＫアミコ ン（Ａｍｉｃｏｎ）デュアル・スパイラル・カートリッジ系のように商業的に入 手可能である。本発明の方法において、ｐＨ約５にてＤＴＴを含有する酢酸アン モニウム緩衝液を用いるダイアフィルトレージョンを、イオン交換前、低分子量 の混入物を除去するためポリペプチドＲ３２ｔｅｔｓｚの精製に用いることがで きる。精製後、純粋なポリペプチドを含有する溶液をダイアフィルトレージョン に付し、残りの塩を除去することができる。

タンパク質−ポリヌクレオチド複合体の分裂、すなわち、核酸混入物の除去に有 用であることが判明した他の操作は、ヌクレアーゼで不純抗原を処理することで ある。ヌクレアーゼ分解は、細胞溶解直後または加熱および／または硫酸アンモ ニウム沈澱のような部分精製後、本発明の方法に組み入れることができる。例え ば、緩衝液をヌクレアーゼ酵素活性と抗原との適合性について選択することを除 いては、硫酸アンモニウム単離物を、前記のように、ダイア濾過することができ る。この目的用の適当な緩衝液は、１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび２０ｍＭ　 Ｚｎ５Ｏ４（ｐＨ５−０）である。ダイアフィルトレージョン後、ヌクレアーゼ 酵素を、ダイアフィルトレージョン装置中のタンパク質を含有するりテンテート に加える。核酸を低分子量ヌクレオチドに加水分解するに十分な持続期間を保持 した後、ダイアフィルトレージョンを高塩緩衝液を用いて続行し、ヌクレオチド フラグメントと抗原の間のイオン性相互作用を弱める。この状態の間、低分子量 ヌクレオチドフラグメントは透過物中に取り除かれるが、抗原はりテンテート中 に保持される。ダイアフィルトレージョンを、次の精冥工程と適合するように選 択する第３の緩衝液を用いて終える。

抗原と適合する緩衝液中、核酸基質とホスホシュステラーゼ活性を有するいずれ かの酵素または酵素組合体を用いることができる。

一本および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを加水分解し、エンド−およびエキソ加水 分解機構により作用するヌクレアーゼと称されるホスホジェステラーゼが好まし い。ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｉｔｒｉｎｕｍ） およびミクｏ　コ−７カル−ヌクレアーゼ（Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃａｌ　ｎｕｃ ｌｅａｓｅ）により産生されるＰ、ヌクレアーゼが、好ましい例のヌクレアーゼ である。

本発明の実施において、逆相ＨＰＬＣに対する補助として、サイズ排除クロマト グラフィーを用いてもよい。

サイズ排除クロマトグラフィーを用いる場合、１Ｏ００〜３０００００ダルトン の作用範囲および直径が約ｌＯと約１００ミクロンの間の粒径を有する多孔性粒 状マトリックスを用いて適宜行うことができる。本発明の使用についての適当な サイズ排除カラム充填剤は、タンパク質−適合親木性ポリマーコーティングを施 し、１３ミクロンの平均粒径を有する球状シリカ粒子であるスフエロゲルＩＴＳ Ｋ２０００ＳＷおよび３０００　ＳＷ（Ｓｐｈｅｒｏｇｅｌ”Ｔ　Ｓ　Ｋ　２０ ００ＳＷおよび３０００ＳＷＸベツクマン・インストラメント、パークレー、カ リフォルニア州（Ｂａｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｂｅｒｋｅｌｅ ｙ、　ＣＡ））を包含する。また、セファデックス”Ｇ−５０、Ｇ−７０、Ｇ− １００またはセファクリル”Ｓ−２００（Ｓｅｐｈａｄｅｘ”Ｇ−５Ｑ、Ｇ−７ ０、Ｇ−１００または５ｅｐｈａｃｒｙｌ”Ｓ−２００Ｘ７フーマシア、ビス力 タウェイ、ニュージャージ州）またはバイオゲル”Ｐ−１０ないしＰ−６０（Ｂ ｉｏｇｅｌ”Ｐｉ　ＯないしＰ−６０Ｘバイオラツド、リッチモンド、カリフォ ルニア州（ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ））のような他の商業上 入手可能なサイズ排除物質を用いてもよい。

すなわち、本発明の方法によるＲ　３２　ｔｅｔ、、の精製は、下の工程＝（１ ）溶解　（２）熱処理　（３）ｔＥ酸アンモニウム沈澱　（４）酸沈澱（５）ダ イアフィルトレージコン　（６）イオン交換（７）逆相ＨＰＬｃ（８）ダイアフ ィルトレージョンおよび（９）滅菌濾過からなることが好ましい。Ｒ３２ＬＡの 精製は、以下の工程：（１）溶解　（２）熱も理　（３）（ｉｉｌｉ酸アンモニ ウム沈澱　（４）酸沈澱　（５）イオン交換（６）逆相ＨＰＬＣ’　（７）ダイ アフィルトレージョンおよび（８）滅菌濾過により実施することが好ましい。Ｒ ３２ＮＳ１ｍ＋の精製は、以下の工程：（１）溶解　（２）ＰＨ１沈澱　（３） 硫酸アンモニウム沈澱（４）酸沈澱　（５）イオン交換　（６）逆相ＨＰＬＣ（ ７）ダイアフィルトレージョンおよび（８）滅菌濾過により５！施することが好 ましい。

以下の実施例は、本発明の方法を例示するが、限定するものではない。実施例１ および２は、Ｒ３２ｔｅｔｘｚを産生する組換型イー・コリ宿主細胞の発酵およ び細胞集菌を記載している。

実施例１−発酵 マスター細胞バンクは、５０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン（Ｋｎ）を有する寒 天プレートから、プラスミドｐＲ３２ｔｅｔ３２Ｋｎを有するエシェリキア・コ リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２、菌株ＡＲ５８のカナマイシ ン耐性クローンを選択し、３２℃にてインキュベーションすることによって調製 した。菌株ＡＲ５８は、ｃ１８５７突然変異を含む溶原菌である。ｐＲ３２ｔｅ ｔ３２ＫｎはｐＡｓｌの誘導体であり、それはローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅ ｒｇ）、米国特許第４５７８３５５号に記載されている。カナマイシン耐性を、 ｐＡｓｌにおけるアンピシリン耐性に置き換えることを除いて、ベクターが、実 質的に、ヤングら、サイエンス　２２８　：　９５８　（１９８５）に記載され ている。

マスター細胞バンクは、貯蔵用に一６５℃にて凍結させた。

作用細胞バンクをマスター細胞バンクから調製し、−６５℃にて凍結保存しｔ； 。

種子培養培地は、グリセロール（２６ｇ）、イースト抽出物（２４ｇ）、トリプ トン（１２ｇ）、ＫｚＨＰＯ，（１５，３ｇ）、ＫＨ，ＰＯ，（１，７ｇ）、（ ＮＨ＝）ｚｓｏ、（２，０）、ＰＰＧ２０００（０，５ｍ１）カナマイシン（フ ラスコ振盪のみ、５０．０μｇ／ｍｌ）およびｌΩの容量にするに十分な量の脱 イオン水から調製した。種子培養培地のｐＨは７．１〜７．２作用細胞バンクか らのバイアルを、液体窒素貯蔵所から取り出し、室温にて解氷した。解氷した一 部の懸濁液を、滅菌Ｋｎを加えた滅菌種子培地を含有する２つの各振盪フラスコ に移植した。該振盪フラスコを、３２℃にて約１５時間キラトリー振盪器（ｑｙ ｒａｔｏｒｙ　５ｈａｋｅｒ）上でインキュベーションした。培養サンプルを各 振盪フラスコから取り出し、光学密度を測定した。得られた値を用い、接種後の 発酵培地において、特定の光学密度（０，１以上）を得るのに必要な種子培養の 体積を算定した。算定した体積の接種物を、滅菌アスピレータ−フラスコに移植 した。

リン酸カリウム塩が省かれている以外、該種子培養培地と同じ成分からなる不完 全培養培地を有するファーメンタ−を、系内にて１５分間撹拌しながら１２１° Ｃにて滅菌化しＩ；。リン酸カリウム塩溶液を、オートクレーブにより別々に滅 菌化した。該滅菌溶液を、ファーメンタ−中の滅菌不完全培養培地に無菌状態で 加えた。得られた完全培地の組成は、種子培養培地について前に記載されている 組成であった。

ファーメンタ−の接種は、前記の調製接種物をアスピレータ−フラスコから、無 菌条件下、添加口を介してポンプ注入することにより達成した。増殖の間、温度 は３２℃に調整し、ｐＨは滅菌ＮＨ，ＯＨを添加することにより６．５以上に調 整し、溶解酸素を１５％飽和以上に調整した。

増殖段階でのサンプルを取り出し、光学密度を測定しｔ；。適当な密度（ＯＤ１ ２．０以上）に到達した後、培養温度を３２℃から４２℃に上昇させることによ り、抗原の発現を誘発した（ローゼンバーグら、メソッド・イン・エンザイモロ ジ−（Ｍｅｔｈ、　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ　、）、−日一１：１２３　（１９８３） 参照）。発酵は、これらの条件下、９０〜２４０分間続行した。

実施例２−細胞集菌 ブロス培養を２０℃以下に冷却し、ファーメンタ−から０．１ミクロンのカート リッジを備えた中空繊維（ｈｏｌｌｏｗ　ｆｉｂｅｒ）濃縮装置、アミコン（Ａ ｍｉｃｏｎ）Ｄ　Ｃ１０Ｌに移植した。移植が完了しＩ；後、該濃縮装置を４℃ の冷室に置いた。リチンテート体積が培養体積の約１５％になるまで濾過を続け た。濾過が完了した後、リチンテートをアスピレータ−フラスコ中に流水した。

アスピレータ−フラスコを切り離し、クラス■、タイプＢ生物学ウッドに置いた 。アスピレータ−内容物をボトルに分配し、懸濁液を遠心分離した。上澄液を除 去し、ペレットをいくつかのコンテナーに分配した。細胞ペレットは、精製工程 の關始まで一７０℃にて貯蔵した。

実施例３〜９は、精製したポリペプチドＲ３２Ｌｅｔ３．の回収についての単離 操作および種々の精製操作を記載している。

実施例３−産生細胞からのＲ３２Ｌｅｔ、、の単離前記実施例２に記載したよう に調製しＩ；重量２０ｇの細胞ペレットを、室温にて、５０ｍＭトリス−ＨＣＱ 、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＤＴＴ、５％グリセロール（ｐＨ８）からなる溶 解緩衝液中、湿潤細胞ペレット重量に基づいて約１　ｇ／　５　ｍｌの濃度まで 懸濁させることに。

より解氷した。以下のすべての工程は、他に断らない限り、４℃にて行った。

リゾチームを、細胞懸濁液に０　、２　ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、該懸濁 液を３０分間撹拌した。溶液を、ワリング・プレンデ−（Ｗａｒｉｎｇｂｌｅｎ ｄｅｒ）において、各１分間の間隔で３回ブレンドし、つし１で４０％使用サイ クルおよび出力値６にセ・ノドしたブランソン・モデル・３５叶ソニフｙ　−（ Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｍｏｄｅｌ　３５０５ｏｎｉｆｉｅｒ）を用い、各１分間の間 隔で３回音波処理した。デオキシコレート（ＤＯＣ）を、０．１％（ｗ／ｖ）の 濃度まで溶解懸濁液に加えた。混合物を３０分間撹拌し、ツイテ、ソーバルーモ デル・ＲＣ−５Ｂ（Ｓｏｒｖａｌｌ　Ｍｏｄｅｌ付した。

遠心分離により得られた上澄液を、撹拌しながら１０分間、沸騰水浴にて加熱し 、ついで室温にて１時間冷却した。熱処理懸濁液を前記のように３０分間遠心分 離に付した。粒状ＷＬ＠アンモニウムを、熱処理した上澄液に１５分間にわＩ； って１５〜２５％飽和の濃度まで撹拌しながら徐々に添加し、該溶液を３０分間 撹拌した。該懸濁液を前記のように再度３０分間遠心分離し、粗製Ｒ３２ｔｅｔ Ｂを含有するペレットを得た。該ベレットを１／１５容量の溶解緩衝液に再懸濁 させた。

寅旅例４−Ｍ沈澱、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣによるＲ 　３２　ｔｅｔｌ、の精製４℃にて撹拌しながら、寅施例３から得られた溶液を １〜２Ｍ塩化マグネシウムに調整した。トリフルオロ酢酸を用いてｐＨを２に調 整し、溶液を数時間撹拌した。沈澱した核酸を３０分間遠心分離することにより 除去した。

酸−処理上澄液を、ＣＭ−トリサクリルＭ（ＣＭ−Ｔ　ｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍ） 上でクロマトグラフィーに付した。上澄液を、１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ ５）で予め平衡にしたＣ　Ｍ　−トリサクリルＭ（装填したタンパクｉｔｌ〜８ 　＋ｏｇ／ゲル１　ｍｌ）のカラム上に、流速６０ｃｍ／時間でポンプ注入した 。該カラムを１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５）で洗浄しｔ；。産物を、０〜 ０．５Ｍ塩化アンモニウムのリニア・グラディエンドまたは０．３Ｍつづいて０ ．６Ｍ塩化アンモニウムのステップ・グラディエンドのいずれかで溶出させた。

２８０ｎｍにてモニター測定しＩ：場合、所望の産物が、リニア・グラディエン ドにおける０、５Ｍ塩およびステップ・グラディエンドにおける０、６塩で溶出 した。

°　イオン交換カラムからの溶出液を、ＤＴＴの１０ｍＭにした１０＋ｎＭリン 酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）に対して透析した。透析溶液を５％酢酸に調整し、５ ％酢酸中、２−プロパツールのグラディエンドを用いるバイダック３００・アン ゲストロム・Ｃ−４（Ｖｙｄａｃ　３００Ａｎｇｓｔｒｏｍ　Ｃ−４）、５ミク ロンの逆相カラム（０，４６ｘ　２５ｃｍ）上でクロマトグラフィーに付した。

２２９ｎｍにてモニター測定した場合、所望の産物が、３０％の溶媒濃度で溶出 した。所望の産物を、発熱物質不合１０ｍＭリン酸塩、０．１５Ｍ塩化物緩衝液 （ｐＨ６，５）に対して透析した。この操作は、タンパク質１ｍｇ当たり約６個 のエンドトキシン単位を有するＲ　３２　ｔｅｔｓ２および０．００１％（Ｗ／ Ｗ）次数のＤＮＡをもたらした。

実魔例５−ヌクレアーゼ処理 前記のように調製したポリペプチドＲ３２ｔｅｔＢ２の硫酸アンモニウム沈澱物 を、ｌｏｍＭ）リス、ｌ　ＯｍＭＤＴＴ（ｐＨ８）に再溶解した。溶液を、公称 １００００ダルトン単位カットオフのスパイラル限外濾過系（アミコンＳ　Ｉ　 Ｙ　Ｉ　Ｏ）を用いて、１０倍容量の１０ｍＭ酢酸アンモニウム、２０　ｍＭ　 Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏａ（ｐＨ５）に対してダイア濾過した。再循環ポンプを停止し、 リチンテートを含有する再循環容器を開けた。Ｐ１ヌクレアーゼ、すなわち亜鉛 要酵素を、再循環容器に１０　ｒｒｒｇ／（ｌの濃度まで添加した。リチンテー トを撹拌しながら３７℃にて１時間インキュベーションした。１０倍容量の２　 Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＱ　ｚつづいて１０倍容量のＩ　Ｏ＋ｏＭ　ＮＨ，０Ａｃ（ｐＨ ５）を用いてダイアフィルトレージ厘ンを再度寅施した。つづいて、リチンテー トを、前記と同じイオン交換（ＣＭ−）およびＨＰＬＣ−クロマトグラフィー操 作により精製した。

ヌクレアーゼダイアフィルトレージョン操作の効果を、代表的にはｌ　ＯＯＯＯ ＯｎｇＤＮＡ／タンパク質１ｍｇを有する硫酸アンモニウム単離物を用いる標準 的ダイアフィルトレージョン操作と比較した。

標準的ダイアフィルトレージョン操作からの産物においては１４０００ｎｇＤＮ Ａ／タンパク質ｌｌｌ１ｇであるのに対し、該ヌクレアーゼダイアフィルトレー ジョン操作では、１００ｎｇＤＮＡ／タンパク質１１ｇ含有産物が得られる。こ れは、ヌクレアーゼダイアフィルトレージョン工程の結果として、１０００倍の 核酸減少および標準的ダイアフィルトレージョン方法よりもＤＮＡ混入が１４０ 倍減少していることを示している。

寅施例６および７は、各々、ポリペプチドＲ３２ｔｅｔｓ２およびＲ３２ＬＡに ついての生産規模単離および精製プロトコルを記載している。

実施例６−ポリペプチドＲ３２ｔｅｔｓｚについての生産規模単離および精製プ ロトコル 前記実施例２に記載のように調製した重量２６００ｇの細胞ベレットを室温にて 解氷し、湿潤細胞ベレット重量に基づいて、約２００ｇ／Ｑの濃度まで５０ｍＭ トリス、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、Ｏ，１ｍＭ　ＤＴＴ。

５％グリセロール（ｐＨ８，０）からなる緩衝液中に懸濁させた。リゾチームを 最終濃度０−１５　ｍｇ／ｍｌまで加え、混合物を４℃にて３０分間インキュベ ーションした。この懸濁液を、４℃に冷理しながら１００ｍ１／分の速度にて、 ０．２ｍｍビーズを用いるダイノミル・ガラスピーズ・細胞粉砕器にポンプ注入 しｔ；。溶解懸濁液を０．１％デオキシコレートと共に４℃にて３０分間処理し 、つづいてベックマンＪＣＦ−Ｚｔ：＋−ターにおいて２５０ｍ１／分の流速に て３９９０００ｘｇで連続遠心分離に付した。

遠心分離により得られた上澄液を約１５０ｇ＃ｌｔに希釈し、蒸気浴した。この 熱処理した懸濁液を前記のように遠心分離に付した。

粒状ｉｉ！酸アンモニウムを２５％飽和まで３０分間にわたって加え、遠心分離 し、沈澱物を除去し；。該上澄液に、粒状硫酸アンモニラ　。

ムを、約４０％飽和の濃度まで、４°Ｃにて３０分間にゎにって撹拌しながら徐 々に添加した。懸濁液を前記のように遠心分離に付し、粗製ポリペプチドＲ３２ Ｌｅｔ、、を有するペレットを得た。硫酸アンモニウムベレットを、ｌＯｍＭＤ ＴＴを含有する１／１５倍容量の１０ｍλクトリ２級衝液に懸濁させ、４℃にて 一夜撹拌し、４℃にて３０分間１４０００ｘｇにて遠心分離に付した。

再溶解したペレットの上澄液を、ＭｇＣＯ２の２Ｍに調整し、トリフルオロ酢酸 でｐＨ２に調整し、４℃にて２時間撹拌した。沈澱核酸を、４℃にて３０分間、 １４０００ｘｇにて遠心分離することにより除去しｔ；。

酸沈澱からの上澄液を、ｌＯｍＭＤＴＴを含有する１０倍容量の１０ｍＭでｐＨ ５，０の酢酸アンモニウム緩衝液で、１０にアミコンデュアル・スパイラル・カ ートリッジ系を用いてダイア濾過した。

ダイア濾過したりテンテートを、１００ｍ１／分にてＣＭ−トリサクリルＭの１ ．２Ｑカラム上にポンプ注入し、該カラムをＩＯ＋ｎＭでｐＨ５の酢酸アンモニ ウム緩衝液中、塩化アンモニウムのステップ・グラディエンド（０，０，３およ び０．６Ｍ）で溶出した。所望の産物が０．６Ｍ塩化アンモニウムで溶出しｌ； 。

イオン交換産物を、ＤＴＴの１０１Ｍおよび酢酸の５％にし、１００ｍ１／分で のライエン・オートブレプ（Ｒａｉｎｉｎ　Ａｕｔｏｐｒｅｐ）ＨＰ　ＬＣ装置 を用い、５％酢酸中、インプロパツールのグラディエンドでバイダック３００ア ンゲストロムＣ−４（Ｖｙｄａｃ３００　ＡｎｇｓｔｒｏｍＣ−４）の５．ｌｘ ３０ｃｍカラム内の１５ないし２０ミクロン逆相充填剤上でクロマトグラフィー に付した。２８０正にてモンター測定した場合、産物が約１８％インプロパツー ルにて溶出した。

滅菌濾過後、逆相産物を、１０にアミコン・スパイラル・カートリッジを用い、 滅菌発熱物質不含ＰＢＳ緩衝液（ＩＯＫの中空繊維カートリッジを介して濾過し た１０ｍＭでｐＨ６，６のリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）７（２でダイ ア濾過し、滅菌バルク産物を得た。

前記操作を用いる代表的産生操作の結果を以下の第２表に示す。

第２表 産生操作したＲ　３２　ｔｅｔ、、抗原の分析工程　総合タンパ　抗原　エント ドキシ’　ＤＮＡり　（ｇ）’　（ｇ）ゝ　ン　ＬＯＧ　ＥＵ／ｍｇ　ｎｇ／＋ ａｇ　’溶解質　３６８．０　３２．０　１０．０　６０００００加熱した上澄 液１１６．０　１０．０　１０．０　１４０００００硫酸アンモニ　１１．０　 ３．４　６．０　９００００ウムペレツト 酸上澄液　６．０　３．５　４．５　＜　０．５ダイア濾液　３．３　２．５　 ５．５　＜２０イオン交換　１．５　２−０　２．６　＜０．５逆相　１．３　 １．９　０．５　＜０．５最終産物　１．０　１．３　０．８　０．５ａ−標準 物としてアルブミンを用いるロウリー（Ｌ　ｏｗｒｙ）分析により測定した；プ ロトコルの後段において、抗原よりも総合タンパクｂ−抗原レベルは、ＨＰＬＣ 分析により修正した粒子蛍光検定を用いて概算した。

Ｃ−リムラス・アメポサイト・リセイト（Ｌ　ｉｍｕｌｕｓ　Ａｍｅｂｏｃｙｔ ｅＬ　ｙｓａｔｅ）血液凝固検定により測定し、抗原１　＋ｎｇ当たりの総合Ｅ Ｕ（エンドトキシン単位）の対数として表した。

ｄ−プロトコルの前段はジフェニルアミン比色分析により、後段は雑種形成によ り測定し、抗原１ｍｇ当たりのＤＮＡｎｇで表した。

実施例７−ポリペプチドＲ３２ＬＡについての生産規模単離および精製プロトコ ル Ｒ３２ＬＡ（配列が、Ｎ−Ｎｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ［Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ− Ｐｒｏ）、、−（Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ）］　］２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ｃである）を産生ずるイー・コリの細胞培養から得られた重量１０００ｇの細 胞ペレットを、室温にて解氷し、湿潤細胞ペレット重量に基づき約２００ｇ／Ｑ の濃度まで、５０ｍＭリン酸塩、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％デオキシコレート を含有する５％グリセロールからなる緩衝液（ｐＨ６，５）中に懸濁させた。該 懸濁液を、４℃に冷却しながら１００ｍ１／分の速度にて、０．２ｍｍビーズを 用いるダイノミル・ガラスピーズ細胞粉砕機にポンプ注入した。

溶解懸濁液を、３００ｍ１／分の流速でベックマンＪＣＦ−Ｚ−ローターの３９ ９００ｘｇにて連続遠心分離により清澄にした。

遠心分離により得られｔ；上澄液を蒸気浴上にて約８０℃に加熱し、ついで約１ ５℃に冷却した。熱処理した懸濁液を前記のように遠心分離に付した。

粒状硫酸アンモニウムを、２５％飽和の濃度まで４℃にて３０分間にわたって撹 拌しなから熱処理清澄液に徐々に添加した。懸濁液を、ベックマンＪＣＦ−２０ −ターにおいて、３９９００ｘｇ、２００ｍ１／分で遠心分離し、粗製ポリペプ チドＲ３２ＬＡを含有する上澄液を得た。粒状硫酸アンモニウムを、６０％飽和 の濃度まで４℃にて３０分間にわＩこって、撹拌しながら、熱処理上澄液に徐々 に加え、該溶液を４℃にてさらに１５分間撹拌した。懸濁液を同一条件下、再度 遠心分離に付し、粗製ポリペプチドＲ３２ＬＡを含有するペレットを得た。硫酸 アンモニウムペレットを、１／１５倍容量の１０ｍＭでｐＨ６，５のリン酸塩緩 衝液に再懸濁させ、４℃にて１時・間撹拌し、４℃にて３０分間１４０００ｘｇ で遠心分離に付した。

再溶解しｌ；ペレットからの上澄液を、トリフルオロ酢酸でｐＨ２に調整し、４ ℃にて一夜撹拌した。沈澱した核酸を、４℃にて３０分間１４０００ｘｇで遠心 分離することにより除去した。酸沈澱からの上澄液を、４℃にて撹拌しながら６ Ｍ水酸化アンモニウムを滴下することによりｐＨ６，５まで中和した。

中和した上澄液を、ｌｏＯｍｌ／分にてＤＥＡＥ−）リサクリルＭの２、Ｏａカ ラムにポンプ注入し、該カラムをＯ，１Ｍ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭリ ン酸塩（ｐＨ６，５）で洗浄した。溶出液および洗液は、ポリペプチドＲ３２Ｌ Ａを有した。カラムをＩＭＮａＯｆｆを含有する１０＋ｎＭリン酸塩緩衝液（ｐ Ｈ６−５）で再生した。ポリペプチドＲ３２ＬＡを含有する最初の洗液をカラム に通し、つづいてもう一度０．１ＭＮａＣＱ含有１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６−５ ）で洗浄した。

イオン交換カラムからの溶出液および洗液を、トリフルオロ酢酸の０．２％にし 、１００ＩＩｌ１分にてライエン・オートプレプ・ＨＰＬＣを用い、０．２％ト リフルオロ酢酸中、インプロパツールのグラディエンドを用い、バイダック３０ ０アンゲストロムＣ−１’８の５．１ｘ３０ｃ＋ｎカラム内の１５ないし２０ミ クロン逆相充填剤上でクロマトグラフィーに付した。２２０ｎｍでモニター測定 した場合、産物が約１０％インプロパツールにて溶出した。

逆相産物を５００ｍ１に濃縮し、２つの５にセルロース膜を用いるＬａｂ−２０ 限外濾過系を用い、滅菌発熱物質不合緩衝液（１０にの中空繊維カートリッジを 介して濾過した１０ｍＭでｐＨ６，６のリン酸塩、１５０ｔＭ塩化ナトリウム） ５１２でダイア濾過した。リチンテートを、ミリパック６０（Ｍｉｌｌｉｐａｋ ６０）カートリッジを介して濾過し、滅菌バルク産物を得た。

該記載操作を用いる代表的生成操作の結果を、以下の第３表に示す。

第３表 生成操作したＲ３２ＬＡ抗原の分析 工程　総合タンパ　抗原　エントドキシ’　ＤＮＡり質（ｇ）”　（ｇ）ゝ　ン ＬＯＧ　ＥＵ／ｍｇ　ｎｇ／ｍｇ　’溶解質　１４４．０　６．２　１０　１８ ０００００加熱した上澄液　２３．０　４．２　７　１４０００００硫酸アンモ ニ　７．０　３．０　８　７０００００ウム 酸上澄液　：３．０　３．０　４　８ イオン交換　３．０　２．９　２　＜１逆相　１．９　２．６　０　＜１ 最終産物　１６　２．０　１　＜］ ａ−前記第２表参照 す−抗原はＨＰＬＣ分析を用いて概算したＣ−前記第２表参照 ｄ−前記第２表参照 実施例８−Ｒ３２ＮＳ１．１の精製 ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）沈澱工程を熱処理で置き換える以外、実質的に前 記実施例６における記載のように、Ｒ３２ＮＳ１ｍ＋を精製する。この工程にお いて、清澄細胞溶解質を、２〜８℃にて約１時間撹拌しながら、０．５％ＰＥＩ 中でインキユベーションし、つづいて遠心分離に付し、沈澱した細菌核酸および タンパク質を分離する。第２の選択的沈澱工程において、Ｒ３２ＮＳＩＥＩを２ ０〜４０％飽和の硫酸アンモニウムにおいて収集する。硫酸アンモニウム沈澱物 を再懸濁させ、塩化物の塩を加えることなく、酸を沈澱させる。深索を、約３Ｍ ！素の最終濃度まで上澄液に加え、イオン交換の前に、ｐＨを水酸化ナトリウム でｐＨ４に調整する。

代表的イオン交換工程においては、スルホプロピル−セファロースカラムを用い る。かかるカラムは、低ｐＨではほとんどプロトン化に付されないため、前記！ ｉ！施例において用いたＣＭ−トリサクリル力ラムよりもより大きな能力を有し ている。マラリア抗原は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム 、１０ｉＭＤＴＴ（ｐＨ６，５）にて溶出する。

ついで、酢酸の代わりに０．２％トリフルオロ酢酸を用いることを除いて、実質 的に実施例６に記載されているように、イオン交換工程からの溶出液を逆相クロ マトグラフィーおよび濾過により処理し、純粋なＲ３２ＮＳｌｓ、を得る。

これらの実施例の結果は、高度に精製されｔ；有効なマラリアワクチン抗原が、 イー・コリ発現系から産生できることを示している。

ビー・ファルシバラムＣ５構成物の特異なアミノ酸組成にかかわらず、各産物が 総合細胞タンパク質の４〜１１％まで蓄積しており、熱誘発の間および後にて安 定している。精製方法の適応性は、Ｒ３２ペプチド配列の優性特性に起因する。

これらの特性（温度および酸ｐＨ安定性）は、単なる沈澱手段を用いることによ り実質的な精製が得られる。ｔｅｔＢペプチドは、８０℃における処理に対して 安定しているほどではないが、精製因子が非常に高いのでタンパク質喪失はこの 物質の初期産生に対してかなり良好であった。したがって、本発明の方法は、ピ ー・ファルシパラムＣ５Ｐからの少なくとも４個のタンデムリピートからなるイ ー・コリ由来免疫原性ポリペプチドを精製するのに用いることができる。

精製免疫原性ポリペプチドは、その免疫強度を増加させるため適当なアジュバン ト上に吸着させ、または混合することによりワクチンとして処方してもよい。適 当なアジュバントの例は、水酸化アルミニウムおよび硫酸アルミニウムを包含す る。

前記は本発明およびそのすべての好ましい具体例を十分に記載しているが、本発 明が特に記載されている具体例に限定されることなく、以下の請求の範囲内に属 するそのすべての変形を包含することを認識すべきである。

Ｉ際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）細菌混入物を選択的に沈澱させ、（ｂ）工程（ａ）の上澄液から免疫 原性ポリペプチドを選択的に沈澱させ、 （ｃ）免疫原性ポリペプチドを含有する工程（ｂ）からの沈澱物を再溶解させ、 該溶液から細菌混入物を選択的に沈澱させ、（ｄ）免疫原性ポリペプチドの溶液 をイオン交換担体と接触させ、ポリペプチドを有するフラクションを収集し、（ ｅ）免疫原性ポリペプチドの溶液を、固体の疎水性担体と接触させ、ポリペプチ ドを該担体に吸着させ、該ポリペプチドを該担体から極性有機溶媒で溶出し、精 製ポリペプチドを含有するフラクションを収集することを特徴とする組換型イー ・コリ宿主細胞培養からの清澄細胞溶解質から、４個以上のタンデムリピート単 位のピー・ファルシパラムＣＳタンパク質からなる免疫原性ポリペプチドを精製 する方法。 ２．工程（ａ）が清澄細胞溶解質を加熱するか、またはポリエチレンイミンでの 沈澱により実施され、工程（ｂ）が免疫原性ポリペプチドを塩析することにより 実施され、工程（ｃ）がｐＨをｐＨ約２．５以下に調整することにより実施され 、工程（ｅ）が免疫原性ポリペプチドの溶液を炭素数２〜１８のアルキル担体と 接触させ、該免疫原性ポリペプチドを炭素数１〜３のアルコール、アセトニトリ ルまたはテトラヒドロフランで溶出することにより実施される前記第１項の方法 。 ３．工程（ａ）が清澄細胞溶解質を７５〜９０℃に加熱するか、または０．１〜 １％ポリエチレンイミンでの沈澱により実施され、工程（ｂ）が単価カチオンと の硫酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩で免疫原性ポリペプチドを塩析することに より実施され、工程（ｃ）がトリフルオロ酢酸、リン酸または塩酸でｐＨをｐＨ ２．０〜２．４に調整することにより実施され、工程（ｄ）がカルボキシメチル またはスルホプロピル担体を用いて実施され、工程（ｅ）が炭素数４または炭素 数１８のアルキルシリカ担体を用いて実施される前記第２項の方法。 ４．工程（ａ）が清澄細胞溶解質を８０〜９０℃に加熱するか、または０．２〜 １％ポリエチレンイミンでの沈澱により実施され、工程（ｂ）が単価カチオンと の硫酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩で免疫原性ポリペプチドを塩析することに より実施され、工程（ｃ）がトリフルオロ酢酸、リン酸または塩酸でｐＨをｐＨ ２．０〜２．４に調整することにより実施され、工程（ｄ）がＤＥＡＥまたはＱ ＡＥカルボキシメチルまたはスルホプロピル担体を用いて実施され、工程（ｅ） が炭素数４または炭素数１８のアルキルシリカ担体を用いて実施される前記第２ 項の方法。 ５．工程（ａ）の前、工程（ａ）の後で工程（ｂ）の前または工程（ｂ）の後で 工程（ｃ）の前に、清澄細胞溶解質をヌクレアーゼで処理し、タンパク質−核酸 複合体を分裂させる前記第２項の方法。 ６．免疫原性ポリペプチドが、Ｒｔｅｔ３２ポリペプチド、Ｒｔｅｔ８６ポリペ プチド、ＲＧポリペプチド、ＲＬＲポリペプチド、ＲＮポリペプチド、ＮＳｌＲ ポリペプチドおよびＲＮＳ１ポリペプチドからなる群より選択される前記第１項 の方法。 ７．ａ）細胞を分裂させ、該懸濁液から細胞残骸を分離し、所望でないポリペプ チド、タンパク質、ＤＮＡおよびエンドトキシンと一緒にペプチドＲ３２ＮＳｌ ■１を含有する清澄細胞抽出物を得、ｂ）清澄抽出物をポリエチレンイミンで処 理し、所望でない細菌混入物を沈澱させ、その後、ペプチドＲ３２ＮＳｌ■１を 含有する上澄液から沈澱した細菌混入物を分離し、ｃ）硫酸アンモニウムを、約 ２０％ないし約４０％飽和の濃度まで、Ｒ３２ＮＳｌ■１含有上澄液に加え、細 胞抽出物からペプチドＲ３２ＮＳｌ■１と一緒に硫酸アンモニウムを沈澱させ、 該沈澱物の懸濁液を形成させ、その懸濁液からペプチドＲ３２ＮＳｌ■１を含有 する上澄液を分離し、 ｄ）該上澄液を酸でｐＨ約２に調整し、細菌混入物を沈澱させ、Ｒ３２ＮＳｌ■ １含有上澄液から沈澱した細菌混入物を分離し、ｅ）カオトロピズム剤をＲ３２ ＮＳｌ■１を含有する上澄液に加え、該上澄液をカチオン交換体と接触させ、つ づいてｐＨ約６．５で溶出し、溶出液を収集し、 ｆ）固定相として固体担体上の炭素数２〜１８のアルキル基、および移動相とし て極性有機溶媒を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、 該イオン交換溶出液から残りの細菌混入物を除去し、細菌混入物のない溶出液を 得、ｇ）逆相ＨＰＬＣ溶出液をダイアフィルトレーションに付し、純粋なポリペ プチドＲ３２ＮＳｌ■１のりテンテートを得ることを特徴とするポリペプチドＲ ３２ＮＳｌ■１を産生するイー・コリの細胞培養からポリペプチドＲ３２ＮＳｌ ■１を単離し、かつ精製する方法。 ８．ａ）細胞を分裂させ、該懸濁液から細胞残骸を分離し、所望でないポリペプ チド、タンパク質、ＤＮＡおよびエンドトキシンと一緒にペプチドＲ３２ｔｅｔ ３２を含有する清澄細胞抽出物を得、ｂ）清澄抽出物を約８０℃〜約９０℃の温 度まで加熱し、ポリペプチドＲ３２ｔｅｔ３２の実質的な澱または分解を伴うこ となく、所望でない細菌混入物を選択的に沈澱させ、その後、該細胞抽出物を冷 却し、Ｒ３２ｔｃｔ３２を含有する上澄液から沈澱した細菌混入物を分離し、 ｃ）硫酸アンモニウムを、Ｒ３２ｔｅｔ３２含有の冷却上澄液に、約２５％ない し約４０％飽和の濃度まで加え、上澄液からペプチドＲ３２ｔｅｔ３２と一緒に 硫酸アンモニウムを沈澱させ、該沈澱物の懸濁液を形成させ、その懸濁液からペ プチドＲ３２ｔｅｔ３２含有上澄液を分離し、 ｄ）上澄液に可溶性塩を加え、該上澄液のイオン強度を増加させ、該上澄液を酸 でｐＨ約２に調整し、細菌混入物を沈澱させ、Ｒ３２ｔｅｔ３２含有上澄液から 沈澱した細菌混入物を分離し、ｅ）酸沈澱の上澄液を、ｐＨ約５にてダイアフィ ルトレーションに付し、ペプチドＲ３２ｔｅｔ３２を含有するリテンテートを得 、ｆ）リテンテートをカチオン交換体と接触させ、つづいてｐＨ約５にて塩で溶 出し、溶出液を収集し、 ｇ）固定相として固体担体上の炭素数２〜１８のアルキル基、および移動相とし て極性有機溶媒を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、 残りの細菌混入物を該イオン交換溶出液から除去し、細菌混入物のない溶出液を 得、ｈ）逆相ＨＰＬＣ溶出液をダイアフィルトレーションに付し、純粋なポリペ プチドＲ３２ｔｅｔ３２のリテンテートを得ることを特徴とするポリペプチドＲ ３２ｔｅｔ３２を産生するイー・コリの細胞培養からポリペプチドＲ３２ｔｅｔ ３２を単離し、かつ精製する方法。 ９．ａ）細胞を分裂させ、該懸濁液から細胞残骸を分離し、所望でないポリペプ チド、タンパク質、ＤＮＡおよびエンドトキシンと一緒にポリペプチドＲ３２Ｌ Ａを含有する清澄細胞抽出物を得、ｂ）清澄抽出物を約７５℃ないし約９０℃の 温度に加熱し、ポリペプチドＲ３２ＬＡの実質的な沈澱または分解を伴うことな く、選択的に所望でない細菌混入物を沈澱させ、その後、細胞抽出物を冷却し、 沈澱した細菌混入物をＲ３２ＬＡ含有上澄液から分離し、ｃ）硫酸アンモニウム を、Ｒ３２ＬＡ含有の冷却上澄液に、約２５％ないし約６０％飽和の濃度まで加 え、上澄液からペプチドＲ３２ＬＡと共に硫酸アンモニウムを沈澱させ、該沈澱 物の懸濁液を形成させ、その懸濁液からペプチドＲ３２ＬＡ含有上澄液を分離し 、ｄ）ペプチドＲ３２ＬＡ含有上澄液を、酸でｐＨ約２に調整し、細菌混入物を 沈澱させ、Ｒ３２ＬＡ含有上澄液から沈澱した細菌混入物を分離し、 ｅ）上澄液をｐＨ約６．５に調整し、該上澄液をアニオン交換体と接触させ、溶 出液を収集し、 ｆ）固定相として固体担体上の炭素数２〜１８のアルキル基および移動相として 極性有機溶媒を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、該 イオン交換溶出液から残りの細菌混入物を除去し、細菌混入物のない溶出液を得 、ｇ）逆相ＨＰＬＣ溶出液をダイアフィルトレーションに付し、純粋なポリペプ チドＲ３２ＬＡのリテンテートを得ることを特徴とするポリペプチドＲ３２ＬＡ を産生するイー・コリの細胞培養から、ポリペプチドＲ３２ＬＡを単離し、かつ 精製する方法。