CN114630584A - 具有致耐受性肽的深度乳清蛋白水解产物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于制备包含致耐受性肽的超滤乳清蛋白水解产物的方法,其中在超滤之前添加乳化剂和/或离液剂。本发明还涉及通过该方法可获得的产品。
Description
技术领域
本发明属于含有水解牛奶蛋白的配方食品领域,适用于患有牛奶蛋白过敏或有发生牛奶蛋白过敏风险的婴儿。
背景技术
在胃肠道中,膳食蛋白质暴露于免疫系统。作为免疫系统的默认反应,对这些无害的食物蛋白质产生了口服耐受性。婴儿中高度存在口服免疫耐受性的发展,婴儿在生命早期通过暴露于膳食蛋白质而暴露于许多无害的蛋白质。这种对无害蛋白质的自然反应发生破坏,就会出现食物过敏。人们普遍认为,近几十年来食物过敏的患病率一直在增加,特别是在西方国家。在生命早期,牛奶过敏(CMA)是最主要的食物过敏,目前有2-5%的婴儿患有此病。婴儿期CMA代表着日益增加的全球健康和经济负担,这不仅是由于过去几十年患病率的增加引起,而且是由于病症的持续性、严重性和复杂性增加引起。除了急性临床表现外,生命早期的CMA还可能具有长期影响,包括生长发育延迟,以及在生命后期患特应性疾病的风险增加。因此,治疗或预防CMA的策略非常重要。
婴儿和儿童CMA的标准饮食管理是通过从饮食中消除牛奶来避免过敏原。已经开发了多种配方食品来消除牛奶蛋白。对于患有轻度CMA的婴儿,建议使用深度水解配方食品(eHF),而对于患有严重CMA的婴儿以及不能耐受eHF或eHF无法解决CMA症状的婴儿,建议使用基于氨基酸的配方食品(AAF)。然而,这种配方食品的缺点是仅仅避免了过敏反应而没有进行治疗。当婴儿或儿童接触牛奶蛋白时,会发生过敏反应。
另一种方法是专注于能够诱导对蛋白质的口服免疫耐受性但不能引起过敏反应的肽。为此,销售了含有部分水解的牛奶蛋白的配方食品,所述部分水解的牛奶蛋白具有能够诱导口服免疫耐受性的肽。当将完整的牛奶蛋白引入饮食时,这些降低了过敏反应的风险。然而,此类配方食品通常含有过敏原残留物,不适合已经患有过敏的婴儿。
EP 0 629 350公开了使用基本上不含过敏原的乳清蛋白水解产物,据说其能够诱导牛奶蛋白耐受性。当用淋巴细胞刺激测试进行检测时,包含经超滤的具有3.3%大于5kDa的肽的部分水解的乳清蛋白水解产物的配方食品能够诱导对全牛奶蛋白和α乳清蛋白的免疫耐受性。未发现对β乳球蛋白有影响。
EP 0 827 697公开了乳清的用途,其已被酶水解用于制备在易感哺乳动物中诱导对牛奶的口服耐受性的组合物。乳清对致敏蛋白的免疫检测水平比未水解的乳清低100倍。
WO 00/42863公开了一种低致敏性组合物,用于在处于蛋白质过敏风险的婴儿中诱导蛋白质耐受性,该组合物包含非致敏性深度水解的蛋白质主要成分(basis)和/或游离氨基酸主要成分,所述组合物包含作为活性成分的至少一种致敏蛋白的致耐受性肽。实施例表明,在将它们添加到婴儿配方食品中之前,源自β乳球蛋白的致耐受性肽已从水解产物中纯化或化学合成。
WO 2011/151059公开了含有部分水解的蛋白质和非消化性寡糖的婴儿营养品,用于诱导对天然膳食蛋白质的口服耐受性。特别是成熟β乳球蛋白分子的第13-48位氨基酸区域中的肽在诱导口服耐受性诱导方面是有效的。结果表明,深度水解的乳清蛋白不能诱导口服免疫耐受性。
WO 2013/083691公开了能够治疗过敏的在成熟β乳球蛋白分子的第13-48位氨基酸区域中的合成的肽。公开了添加此类肽的不含过敏原的配方食品。
JP 2010-105915公开了通过水解β乳球蛋白获得并用于食品和饮料的肽。
WO 2015/090347涉及鉴定的肽,其能够诱导对牛奶的耐受性,尤其是对β乳球蛋白的耐受性。
WO 2016/0148572公开了使用合成的β乳球蛋白肽和益生菌的特定混合物的口服免疫耐受性。
Gouw等人,2018 Clin Exp Allergy;48:1345-1353,示出部分乳清蛋白水解产物包含在成熟β乳球蛋白分子的第13至48位氨基酸区域中的特定的致耐受性肽。
WO 2014/14713公开了一种过敏原制剂,其在水包油乳液中包含过敏原。
因此,需要包含乳清蛋白的深度水解产物的营养品,该营养品不含过敏原并含有特定的牛β乳球蛋白肽,并且以简单方便的方式生产(无需纯化或合成的肽),增强患有食物过敏的受试者的口服免疫耐受性,对食物蛋白质,特别是牛奶蛋白的口服免疫耐受性诱导具有改善的效果。
发明内容
本领域惯用的是对乳清蛋白水解产物进行超滤步骤以减少致敏蛋白,尤其是β乳球蛋白的量。由于蛋白质的大小大于肽的大小,因此选择对大蛋白质不可渗透但允许较小肽通过的孔径,从而预期致耐受性肽能够渗透。然而,应用这种传统技术,发明人发现成熟β乳球蛋白分子的第13至48位氨基酸区域中的致耐受性β乳球蛋白肽不存在于常规的超滤乳清蛋白水解产物中。虽然发现这些肽实际上是在蛋白质被蛋白水解酶降解的第一步中产生的,但在膜过滤步骤之后的渗透物中不存在这些肽,而是保留在渗余物(retentate)中,如实施例1所示。这种保留不能用肽的大小来解释,它远低于超滤膜的截止值。
因此,发明人开发了用于生产超滤乳清蛋白水解产物的改进方法。发明人惊奇地发现,通过在乳清蛋白水解之前、期间或之后但在膜过滤步骤之前添加食品级乳化剂(实施例2)或离液剂(实施例3),致耐受性β乳球蛋白肽能够通过膜并出现在渗透物中。这导致水解乳清蛋白富含致耐受性β乳球蛋白肽,而没有较大的致敏性肽和蛋白质(如免疫原性β乳球蛋白)的残留物的存在。
在第一方面,本发明涉及制备超滤乳清蛋白水解产物的方法,所述方法包括:
a)用一种或多种蛋白水解酶对乳清蛋白A进行水解1,从而获得乳清蛋白水解产物B,和
b)对乳清蛋白水解产物B进行膜超滤2,从而获得渗透物C1和渗余物C2,
其中:
(i)在水解1之前或期间将乳化剂E添加到乳清蛋白A中,或者其中在膜超滤2之前将乳化剂和/或离液剂E添加到乳清蛋白水解产物B中,
其中超滤乳清蛋白水解产物在渗透物C1中,
和/或其中:
(ii)在步骤b)之后
c)将乳化剂E和/或离液剂E加入渗余物C2中,从而获得渗余物C3,
d)对渗余物C3进行膜超滤3,从而获得渗透物D1和渗余物D2,和
e)将渗透物D1的至少一部分添加到渗透物C1中,从而获得渗透物D3,其中超滤乳清蛋白水解产物在渗透物D3中。
步骤a)中提供的乳清蛋白A可以源自一种或多种乳清蛋白来源。不受理论束缚,发明人相信在不存在乳化剂和/或离液剂E的情况下致耐受性片段成簇。簇的大小使得它们不会渗透超滤膜。通过添加乳化剂和/或离液剂E,相信可以防止或逆转簇的形成;在超滤时实现渗透。由于离液剂可能影响酶(它们本身是蛋白质),优选地,离液剂仅在步骤(i)和/或步骤(ii)中的水解之后添加。
在第二方面,本发明涉及通过上文和本文所述的方法可获得的超滤乳清蛋白水解产物。更具体地,本发明涉及超滤乳清蛋白水解产物,其具有:
-每克蛋白质少于6微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选小于1%的大小为5kDa的肽,和
-至少一种β乳球蛋白肽,其包含根据SEQ ID No.2-30中任一项,优选地,根据SEQID No.31-57中任一项,更优选地,根据SEQ ID No.58-70中任一项的氨基酸序列。
在一个实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物是深度水解的超滤乳清蛋白水解产物,其具有:
-每克蛋白质少于0.8微克,优选地少于0.2微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选地小于1%的大小为5kDa的肽,和
-至少一种β乳球蛋白肽,其包含根据SEQ ID No.2-70中任一项,优选地,根据SEQID No.2-30中任一项,更优选地根据SEQ ID No.31-57中任一项,更优选地,根据SEQ IDNo.58-70中任一项的氨基酸序列。在详细描述中可以找到更多优选项。
在上文中,基于总蛋白质的肽的量可以使用本领域已知的尺寸排阻高压液相色谱来确定。Saint-Sauveur等人“Immunomodulating properties of a whey proteinisolate.its enzymatic digest and peptide fractions”Int.Dairy Journal(2008)第18(3)卷,第260-270页描述了其实例。简而言之,色谱图的总表面积被积分并分成质量范围,以总表面积的百分比表示。使用具有已知分子量的肽/蛋白质校准质量范围。
超滤水解产物可优选地包含每克蛋白质至少25mg,更优选地至少50mg离液剂;和/或每克蛋白质至少5mg乳化剂,这指示本发明的方法。
有利地,超滤乳清蛋白仅含有降低水平的致敏蛋白,还含有治疗有效量的致耐受性肽。
在第三方面,本发明涉及改进的超滤乳清蛋白水解产物在制备用于治疗患有牛、绵羊和/或山羊奶蛋白过敏的婴儿或幼儿配方食品中的用途,以治疗过敏并诱导针对牛、绵羊和/或山羊奶蛋白的口服免疫耐受性。此外,由于致耐受性片段在预防过敏方面也具有经证实的效果,所述改进的超滤乳清蛋白水解产物可有利地用于制备婴儿或幼儿配方食品,以预防牛、绵羊和/或山羊奶蛋白过敏,和为了诱导对牛、绵羊和/或山羊奶蛋白的口服免疫耐受性,特别是如果婴儿或幼儿有对牛、绵羊和/或山羊奶蛋白过敏的风险。过敏优选地是牛奶蛋白过敏。
附图列表
图1提供了根据本发明的一个实施方案的制造方法的示意图。提供了在步骤1中首先水解的乳清蛋白A,其中获得了乳清蛋白水解产物B。随后,对乳清蛋白水解产物B进行超滤2,产生渗透物C1和渗余物C2。超滤乳清蛋白水解产物在渗透液C1中。在步骤1之前、期间和/或之后但在步骤2之前添加离液剂E和/或乳化剂E。
图2提供了根据本发明的另一个优选实施方案的制造方法的示意图。提供了在步骤1中首先水解的乳清蛋白A,其中获得了乳清蛋白水解产物B。随后,对乳清蛋白水解产物B进行超滤2,产生渗透物C1和渗余物C2。随后将离液剂和/或乳化剂E加入渗余物C2以获得渗余物C3。对渗余物C3进行超滤3,产生渗透物D1和渗余物D2。将渗透物D1的至少一部分与渗余物C1合并以获得渗透物D3,其中超滤乳清蛋白水解产物在渗透物D3中。另外,离液剂E和/或乳化剂E可以在步骤1之前、期间和/或之后但在步骤2之前添加。
条款列表
1)制备超滤乳清蛋白水解产物的方法,所述方法包括:
a)用一种或多种蛋白水解酶对乳清蛋白A进行水解1,从而获得乳清蛋白水解产物B,和
b)对乳清蛋白水解产物B进行膜超滤2,从而获得渗透物C1和渗余物C2,
其中
(i)在水解1之前或期间将乳化剂E添加到乳清蛋白A中,或者其中在膜超滤2之前将乳化剂和/或离液剂E添加到乳清蛋白水解产物B中,
其中超滤乳清蛋白水解产物在渗透物C1中,
和/或其中:
(ii)在步骤b)之后
c)将乳化剂和/或离液剂E加入渗余物C2中,从而获得渗余物C3,d)对渗余物C3进行膜超滤3,从而获得渗透物D1和渗余物D2,和
e)将渗透物D1的至少一部分添加到渗透物C1中,从而获得渗透物D3,
其中超滤乳清蛋白水解产物在渗透物D3中。
2)根据条款1所述的方法,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含至少一种β乳球蛋白肽,所述至少一种β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.2-70中任一项的氨基酸序列,优选地根据SEQ ID No.31-70中任一项的氨基酸序列。
3)根据条款1或2所述的方法,其中超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质小于100mg、优选地小于50mg、更优选地小于10mg的大小大于5kDa的肽;和/或其中超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质小于30mg,优选地每克蛋白质小于10mg,最优选地每克蛋白质小于5mg的大小大于10kDa的肽。
4)根据前述条款中任一项所述的方法,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质至少300mg大小为1kDa或以下的肽,甚至更优选地每克蛋白质至少500mg;和/或其中超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质至少900mg大小为5kDa或以下的肽,甚至更优选地每克蛋白质至少950mg,最优选地每克蛋白质至少990mg。
5)根据前述条款中任一项所述的方法,其中超滤乳清蛋白水解产物的水解度为5-50%,优选地10-30%,更优选地15-25%。
6)根据前述条款中任一项所述的方法,其中所述超滤乳清蛋白水解产物源自牛(Bos)属、野牛(Bison)属、水牛(Bubalus)属或山羊(Capra)属物种,更优选地牛属的奶,优选地源自牛奶。
7)根据前述条款中任一项所述的方法,其中用于膜超滤2和/或膜超滤3的膜具有截止值在5-15kDa、优选地5-11kDa,更优选地9-11kDa范围内的孔径。
8)根据前述条款中任一项所述的方法,其中添加乳化剂E,其中所述乳化剂优选地选自由柠檬酸单双甘油酯(Citrem)、双乙酰酒石酸单双甘油酯(Datem)、单酰基甘油(MAG)、二酰基甘油(DAG)、蔗糖酯(SE,E473)和大豆卵磷脂,以及其组合组成的组,更优选地是或包含Citrem。
9)根据前述条款中任一项所述的方法,其中在水解之前或期间,优选地在水解之前,将乳化剂E添加到乳清蛋白中;并且优选地浓度为每克其添加到的蛋白质中至少50mg和/或浓度为至少1g/L。
10)根据前述条款中任一项所述的方法,其中加入离液剂,优选地浓度为每100ml至少1克和/或每克其添加到的蛋白质中至少25mg;并且其中离液剂优选地是或包含尿素。
11)根据条款10所述的方法,其中在膜超滤之前将离液剂E添加到乳清蛋白水解产物B中。
12)可通过根据前述条款中任一项所述的方法获得的超滤乳清蛋白水解产物。
13)根据条款12所述的超滤乳清蛋白水解产物,其包括:
-每克蛋白质少于6微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选地小于1%的大小为5kDa的肽,和
-至少一种β乳球蛋白肽,其包含根据SEQ ID No.2-30中任一项,优选地,根据SEQID No.31-57中任一项,更优选地,根据SEQ ID No.58-70中任一项的氨基酸序列;和
-优选地,每克蛋白质至少50mg离液剂和/或每克蛋白质至少5mg乳化剂。
14)超滤乳清蛋白水解产物,其中所述超滤乳清蛋白水解物包含具有以下大小分布的肽:基于水解产物的总蛋白质,
60-90%,大小<1kDa,
10-40%大小为1至<5kDa的肽,
0-0.5%大小为5至<10kDa的肽,以及
0-0.2%大小>10kDa的肽,
和
其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含:
ο每克蛋白质少于6微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选地小于1%的大小为5kDa的肽,和
ο至少一种,优选地至少两种,更优选地至少三种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.66-70中任一项的氨基酸序列。
15)根据条款14所述的超滤乳清蛋白水解产物,其可通过根据条款1-11中任一项的方法获得。
16)乳清蛋白水解产物组合物,其包含超滤乳清蛋白水解产物,浓度为每克蛋白质至少0.8克超滤乳清蛋白水解产物,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含:
-每克蛋白质少于6微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选地小于1%的大小为5kDa的肽,和
-至少一种β乳球蛋白肽,其包含根据SEQ ID No.2-70中任一项,优选地根据SEQID No.31-70中任一项的氨基酸序列;和
-优选地,每克蛋白质至少50mg尿素和/或每克蛋白质至少5mg乳化剂。
17)根据条款13-15中任一项所述的超滤乳清蛋白水解产物或根据条款16所述的乳清蛋白水解产物组合物,其中包含根据SEQ ID No.2-70中任一项,优选地根据SEQ IDNo.31-70中任一项,更优选地根据SEQ ID No.31-57中任一项,甚至更优选地根据SEQ IDNo.58-70中任一项,最优选地根据SEQ ID No.66-70中任一项的的氨基酸序列的所述至少一种β乳球蛋白肽以每克蛋白质至少10微克优选地50微克的量存在。
18)根据条款13-15中任一项所述的超滤乳清蛋白水解产物或根据条款16所述的乳清蛋白水解产物组合物,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含具有以下大小分布的肽,基于水解产物的总蛋白质:
60-90%,大小<1kDa,
10-40%大小为1至<5kDa的肽,
0-0.5%大小为5至<10kDa的肽,以及
0-0.2%大小>10kDa的肽。
19)营养组合物,其包含根据条款13-15中任一项所述的超滤乳清蛋白水解产物或根据条款16所述的乳清蛋白水解产物组合物,其中所述组合物是婴儿配方食品、婴儿后续(follow-on)配方食品或幼儿配方食品,优选地婴儿配方食品或婴儿后续配方食品。
20)根据条款19所述的营养组合物,进一步包含一种或多种非消化性寡糖和/或一种或多种乳酸产生细菌。
21)根据条款19或20所述的营养组合物在制造产品中的用途,所述产品,
(i)用于提供营养给下述受试者;和/或
(ii)用于下述受试者中治疗/预防过敏;和/或
(iii)用于下述受试者中诱导针对过敏原,优选地食物过敏原的口服免疫耐受性,
所述受试者患有过敏,优选地患有食物过敏,优选牛、绵羊和/或山羊奶蛋白,优选地选自由牛奶蛋白过敏、山羊奶蛋白过敏和绵羊奶蛋白过敏组成的组的过敏,
其中所述受试者优选地为至多6岁的儿童,更优选地为0至12个月的婴儿。
22)根据条款19或20所述的营养组合物,用于治疗和/或预防过敏,优选地治疗过敏,和/或用于诱导针对过敏原,优选地食物过敏原的口服免疫耐受性。
23)根据条款22的应用的营养组合物,其中所述过敏是食物过敏,优选地牛、绵羊和/或山羊奶蛋白过敏,优选地选自由牛奶蛋白过敏、山羊奶蛋白过敏和绵羊奶过敏组成的组的过敏和/或过敏原选自由牛奶蛋白、山羊奶蛋白和绵羊奶蛋白组成的组,优选地其中过敏是牛奶蛋白过敏和/或过敏原是牛奶蛋白。
24)根据条款21的用途或根据条款22或23的应用的营养组合物,其中奶蛋白是β乳球蛋白。
25)根据条款13-15中任一项所述的超滤乳清蛋白水解产物或根据条款16所述的乳清蛋白水解产物组合物在制造营养组合物中的用途,其中所述组合物优选地为婴儿配方食品、婴儿后续配方食品或幼儿配方食品,优选地婴儿配方食品或婴儿后续配方食品。
详细说明
因此,本发明涉及制备超滤乳清蛋白水解产物的方法,所述方法包括:
a)用一种或多种蛋白水解酶对乳清蛋白A进行水解1,从而获得乳清蛋白水解产物B,和
b)对乳清蛋白水解产物B进行膜超滤2,从而获得渗透物C1和渗余物C2,
其中
(i)在水解1之前或期间将乳化剂E添加到乳清蛋白A中,或者其中在膜超滤2之前将乳化剂和/或离液剂E添加到乳清蛋白水解产物B中,
其中超滤乳清蛋白水解产物在渗透物C1中,
和/或其中:
(ii)在步骤b)之后
c)将乳化剂和/或离液剂E加入渗余物C2中,从而获得渗余物C3,
d)对渗余物C3进行膜超滤3,从而获得渗透物D1和渗余物D2,和
e)将渗透物D1的至少一部分添加到渗透物C1中,从而获得渗透物D3,
其中超滤乳清蛋白水解产物在渗透物D3中。
本发明还涉及通过该方法可获得的超滤乳清蛋白水解产物。
此外,本发明涉及超滤乳清蛋白水解产物,其中超滤乳清蛋白水解产物包含具有以下大小分布的肽:基于水解产物的总蛋白质,
60-90%,大小<1kDa,
10-40%大小为1至<5kDa的肽,
0-0.5%大小为5至<10kDa的肽,以及
0-0.2%大小>10kDa的肽,
和
其中超滤乳清蛋白水解产物包含:
ο每克蛋白质少于6微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选地小于1%的大小为5kDa的肽,和
ο至少一种,优选地至少两种,更优选地至少三种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.66-70中任一项的氨基酸序列。
本发明还涉及乳清蛋白水解产物组合物,其包含超滤乳清蛋白水解产物,浓度为每克蛋白质至少0.8克超滤乳清蛋白水解产物,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含:
-每克蛋白质少于6微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选地小于1%的大小为5kDa的肽,和
-至少一种β乳球蛋白肽,其包含根据SEQ ID No.2-70中任一项,优选地根据SEQID No.31-70中任一项的氨基酸序列;和
-优选地,每克蛋白质至少50mg尿素和/或每克蛋白质至少5mg乳化剂。
此外,本发明涉及包含超滤乳清蛋白水解产物或乳清蛋白水解产物组合物的营养组合物,其中所述组合物是婴儿配方食品、婴儿后续配方食品或幼儿配方食品,优选地婴儿配方食品或婴儿后续配方食品。
本发明还涉及营养组合物在制造产品中的用途,所述产品,(i)用于提供营养给下述受试者;和/或
(ii)用于下述受试者中治疗/预防过敏症;和/或
(iii)用于下述受试者中诱导针对过敏原,优选地食物过敏原的口服免疫耐受性,
所述受试者患有过敏,优选地患有食物过敏,优选地牛、绵羊和/或山羊奶蛋白,优选地选自由牛奶蛋白过敏、山羊奶蛋白过敏和绵羊奶蛋白过敏组成的组的过敏,其中所述受试者优选地为至多6岁的儿童,更优选地为0至12个月的婴儿。
本发明还涉及超滤乳清蛋白水解产物或乳清蛋白水解产物组合物在制造营养组合物中的用途,其中所述组合物优选地为婴儿配方食品、婴儿后续配方食品或幼儿配方食品,优选地婴儿配方食品或婴儿后续配方食品。
蛋白质水平
在本发明的上下文中,蛋白质被定义为蛋白质、肽和游离氨基酸的总和。根据本发明的蛋白质也可以被称为蛋白质等效物。如果数字基于蛋白质表示,则意味着它基于所有蛋白质材料的总和,包括蛋白质、肽和游离氨基酸。氨基酸是可以是真核蛋白质和肽的一部分的20种不同的天然氨基酸。在本发明的上下文中,氨基酸被认为是游离氨基酸,不同于肽。总蛋白水平来源于众所周知的凯氏定氮分析并乘以6.25的系数。这给出了总蛋白水平,有时也被称为粗蛋白水平。因此,总蛋白是本文定义的蛋白质等效物加上非蛋白质氮(NPN)的总和。测定蛋白质和肽以及游离氨基酸的方法是本领域已知的。例如,一种方法是合适的,其中首先沉淀蛋白质肽,然后是普通蛋白质测定,并且可以通过HPLC(其中用芴基甲基-氯甲酸酯进行柱前衍生)以及UV和荧光检测测定未沉淀部分中的游离氨基酸。
乳清蛋白(A)
在本发明的上下文中,乳清蛋白来源于哺乳动物的奶汁。乳清蛋白A是优选地来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属、更优选地来自牛属的物种的奶,优选来自牛奶。乳清蛋白A可以来源于一种或多种不同的奶源。换言之,乳清蛋白优选地为牛属、野牛属、水牛属或山羊属乳清蛋白,或其组合,更优选地牛属乳清蛋白,优选地牛奶乳清蛋白。因此,乳清蛋白水解产物B或超滤乳清蛋白水解产物优选地来源于牛属、野牛属、水牛属或山羊属、更优选来源于牛属的物种的奶,优选来源于牛奶。换言之,乳清蛋白水解产物B或超滤乳清蛋白水解产物优选地为牛属、野牛属、水牛属或山羊属(超滤)乳清蛋白水解产物,更优选地牛属(超滤)乳清蛋白水解产物,优选牛奶(超滤)乳清蛋白水解产物。
优选地,乳清蛋白A是选自由酸性乳清蛋白、甜乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清蛋白分离物(WPI)或脱矿质乳清粉组成的组中的一种或多种。这些乳清类型是可商购的。合适的来源是酸性乳清蛋白和脱矿质甜乳清蛋白的混合物。甜乳清是凝乳凝固干酪的副产物,包含酪蛋白糖巨肽(CGMP),酸乳清(也称为酸性乳清)是酸凝干酪的副产物,不含CGMP。乳清蛋白的合适来源是脱矿质乳清(Deminal,Friesland Campina,荷兰)和/或乳清蛋白浓缩物(WPC80,Friesland Campina,荷兰)。待水解的乳清蛋白优选地包含酸乳清,更优选地基于总乳清蛋白至少50wt%,更优选地至少70wt%酸乳清。与甜乳清蛋白相比,酸乳清具有改进的氨基酸谱。乳清蛋白的来源对本发明的方法不是关键的。
乳清蛋白A包含大量的β乳球蛋白(BLG)。牛属和野牛属物种中BLG的氨基酸序列相似。在山羊属和水牛属的物种中,位置1的氨基酸是不同的(异亮氨酸而不是亮氨酸)。包含或具有根据SEQ ID No.2-70中任一项、优选地根据SEQ ID No.31-70中任一项、更优选地根据SEQ ID No.2-24、31-51和66-70中任一项,甚至更优选地根据SEQ ID no.31-51和66-70中任一项,特别优选地根据SEQ ID no.2-17、31-44、66和68-70中任一项,甚至更优选地根据SEQ ID no.31-44、66和68-70,最优选地根据SEQ ID no.66和68-70中任一项的至少一种β乳球蛋白肽,无论乳清蛋白的来源如何,都具有相同的致耐受性性质。
水解(1)
水解涉及蛋白质水解并且使用一种或多种蛋白水解酶进行。用于水解的蛋白水解酶来自动物或植物来源(例如胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、肠粘膜提取物、胰腺提取物、凝乳酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶)、细菌或真菌来源(例如来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、米曲霉(Aspergillus orysae)、文氏曲霉(Aspergilluswentii)的丝氨酸和金属-5蛋白酶和来自米曲霉(Aspergillus orizae)、温特曲霉(Aspergillus wentii)、米黑毛霉(Mucor miehei)、微小毛霉(Mucor pusillus)、寄生内座壳菌(Endothia parasitica)的酸性蛋白酶)或这些的组合。例如,蛋白水解酶可以是碱性蛋白酶、来自米曲霉的酸性蛋白酶或胰蛋白酶。
在水解过程中,溶液或悬浮液中的蛋白质浓度优选地在2-20%重量(wt%)的范围内,并且可以在引入蛋白酶之前进行巴氏杀菌。酶/蛋白质的比例优选地在0.1-10%重量/重量之间,更优选地在0.25-4%重量/重量之间。技术人员具有进行常规酶水解的技能和知识。水解优选地在约35℃至65℃的温度下进行。水解优选地进行30分钟至10小时,更优选地30分钟至4小时。水解期间的pH在2.5和11之间,优选地在5和9之间,更优选地在6和8.5之间。如果需要,可用柠檬酸、食品级HCl或NaOH、NH4OH、KOH、Ca(OH)2和/或Mg(OH)2调节溶液的pH值,例如浓度为2N纯或混合。
水解的酶促过程可以通过快速冷却来停止。优选地,水解后获得的(或在步骤a中获得的)乳清蛋白水解产物在任何后续工艺步骤如膜超滤之前被冷却。优选地,乳清蛋白水解产物被冷却至低于30℃,更优选地低于20℃,最优选地低于10℃。备选或另外地,优选地在约70至130℃的温度下对蛋白质水解产物进行约0.01至10分钟的热处理以灭活残留的酶,即蛋白酶。冷却可以在热处理之前和/或之后进行。如此获得的乳清蛋白水解产物B可以通过离心或过滤来澄清以去除不溶性蛋白质,并回收澄清溶液。
如果需要,回收的(澄清的)水解产物溶液可以通过蒸发浓缩至例如10-50%(重量/重量)的干燥固体含量,用于后续处理或喷雾干燥。
膜超滤
本发明的方法还涉及在水解1之后的膜超滤(UF)。即,随后对上文获得的乳清蛋白水解产物进行UF。下面关于超滤的所有内容都适用于膜超滤2和3,详见图1和图2。
膜超滤(或超滤)2和/或3可以用本领域已知的任何UF膜进行,包括平板膜、陶瓷膜、管状和有机螺旋缠绕膜。优选地,UF膜是螺旋缠绕膜(spiral wound membrane)。UF膜的分子量截止值使完整的蛋白质,优选地致敏性β乳球蛋白能够保留在渗余物中,并允许肽渗透通过膜。技术人员能够很好地确定合适的截止值。膜超滤2和/或3优选地使用具有至多15kDa、更优选地5-11kDa、更优选地至少9kDa的分子量截止值的膜进行。膜超滤2和/或3优选地使用具有5-15kDa、优选地5-11kDa、更优选地9-11kDa的截止值的孔径的膜进行。
膜超滤2和/或3优选地在低于40℃、更优选地在3℃和30℃之间、甚至更优选地在5℃和20℃之间进行。
膜超滤2和/或3优选地以5-50、更优选地10-25范围内的体积浓缩因子(VCF)进行,已发现其在UF渗透物的组成方面提供最佳结果。在本发明的上下文中,术语“体积浓缩因子”或“VCF”是液体组合物在过滤时被浓缩的因子,即过滤前进入流的总体积除以过滤后渗余物的总体积,与总固体含量无关。因此,当100kg的液体组合物在超滤膜上被分馏成93kg的渗透物和7kg的渗余物时,该UF工艺以100/7的约15的VCF进行操作。
使用这样的加工参数,UF渗透物流C1通常包含至少80%(w/w)、优选地至少80%(w/w)、更优选地90%(w/w)的乳清蛋白A。超滤3将主要从渗余物C3递送致耐受性肽。
超滤乳清蛋白水解产物
在本发明的上下文中——并且根据本领域——术语“肽大小”和“肽重量”可以互换使用。肽大小和肽重量均以道尔顿(Da)或千道尔顿(kDa)表示。
其他重量以千克(kg)、克(g)、毫克(mg)和微克(mcg或μg)表示;这些单位的缩写在括号内。
水解1将主要递送肽。随后超滤2将进一步减少渗透物中任何完整蛋白质的量。肽混合物可以通过其大小分布或水解程度来表征。因此,根据本发明的超滤乳清蛋白水解产物可以通过肽大小分布或水解程度来表征。大小分布不需要包含完整分布。一种或多种特定大小范围的特定量的肽的存在可能足以表征。
在本领域中,有时乳清蛋白水解产物进一步表征为部分乳清蛋白水解产物或部分水解的乳清蛋白或“pHP”,以及深度乳清蛋白水解产物或深度水解的乳清蛋白或“eHP”。如果这种蛋白质被用于配方食品中,通常命名为pHF和eHF,pHF为包含部分水解的乳清蛋白的配方食品,eHF为包含深度水解的乳清蛋白的配方食品。技术人员理解eHP中的总肽大小与pHP相比将更小。在本发明的上下文中,eHP被表征为一种乳清蛋白水解产物,其具有基于总蛋白质的小于1%的大小为5kDa的肽,pHP为基于总蛋白质的小于3%的大小为5kDa的肽。
优选地,超滤乳清蛋白水解产物B是深度水解的乳清蛋白。eHP可以通过将乳清蛋白水解至高度水解(大量水解)或通过超滤去除水解乳清蛋白的较大肽段来获得。大量水解的缺点是一方面在过敏情况下仍可能存在大量完整的致敏性蛋白质,例如致敏性β乳球蛋白,另一方面蛋白质被水解到没有或只有少量致耐受性肽的程度,因为对于要致耐受的肽,它们需要最小尺寸。尽管乳清蛋白水解产物的超滤解决了残留完整致敏蛋白的问题,但出现了另一个问题,因为致耐受性肽不从超滤膜渗透。因此,有益的致耐受性特性将丧失。
超滤乳清蛋白水解产物或乳清蛋白水解产物优选地具有5-50%、更优选地10-30%、甚至更优选地15-25%的(蛋白质的)水解度。水解度被定义为已被酶水解破坏的肽键的百分比,其中100%是存在的总潜在肽键。水解度太高将导致不希望的低水平或甚至不存在致耐受性肽,而水解度太低将提供不希望的高水平的完整致敏蛋白。如果不过滤掉完整的蛋白质,可能会引起过敏反应。同时,如果超滤乳清蛋白水解产物的水解度太低(因为过多的蛋白质保留在渗余物中),过滤会导致不吸引人的低收率。具有上述水解度的蛋白质可提供足够的链长为2至30的肽。
肽大小和分子量分布可以通过技术人员已知的常规方法确定,例如HPLC或尺寸排阻色谱法(SEC),特别是高效尺寸排阻色谱法。Saint-Sauveur等人“Immunomodulatingproperties of a whey protein isolate,its enzymatic digest and peptidefractions”Int.Dairy Journal(2008)第18(3)卷,第260-270页描述了其实例。简而言之,色谱图的总表面积被积分并分成质量范围,以总表面积的百分比表示。使用具有已知分子量的肽/蛋白质校准质量范围。包含所述肽的蛋白质水解产物优选地特征在于其包含55-85%的分子量低于1000Da的肽、15-45%的分子量为1000-5000Da的肽和0-1%的分子量为5000Da及以上的肽或分子量为5000Da及以上的蛋白质,均以水解产物的总蛋白质计。
在优选的实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物的特征在于水解产物包含具有以下大小分布的肽:基于水解产物的总蛋白质,
60-90%,大小<1kDa,
10-40%大小为1至<5kDa的肽,
0-0.5%大小为5至<10kDa的肽,以及
0-0.2%大小>10kDa的肽。
在本发明的优选实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物的特征在于其包含每克蛋白质小于100mg、优选地每克蛋白质小于50mg、更优选地每克蛋白质小于10mg的大小大于5kDa的肽。优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质小于30mg,优选地每克蛋白质小于10mg,最优选地每克蛋白质小于5mg/克的大小大于10kDa的肽。
优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质至少300mg大小为1kDa或以下的肽,甚至更优选地每克蛋白质至少500mg。优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质至少900mg大小为5kDa或以下的肽,甚至更优选地每克蛋白质至少950mg,最优选地每克蛋白质至少990mg。
超滤乳清蛋白水解产物不包含合成的肽,更优选地不包含合成的致耐受性肽。超滤乳清蛋白水解产物不包含纯化的致耐受性肽。致耐受性肽的纯化和纯化的致耐受性肽是本领域已知的;例如在WO 00/42863中描述了纯化方法和纯化的致耐受性肽。
致耐受性肽
超滤乳清蛋白水解产物包含致耐受性肽。致耐受性肽是诱导免疫耐受性的肽,其针对该肽是其片段的蛋白质的免疫反应的不希望的激活。β乳球蛋白是一种已知的过敏原。β乳球蛋白的氨基酸13-48区域以其致耐受性潜力而闻名(Gouw等人,2018,Clin.Exp.Allergy 48:1345-1253)。在Gouw等人的这项研究中,发现具有β乳球蛋白13-48区域序列的肽是致耐受性的。WO 00/42863 A1公开了与β乳球蛋白具有8个重叠的氨基酸的序列的β乳球蛋白肽是致耐受性的。WO 2011/151059 A1公开了与β乳球蛋白的13-48区域具有17个重叠的氨基酸的序列的β乳球蛋白肽是致耐受性的。JP 2010/105915 A1公开了具有19个氨基酸的序列的β乳球蛋白肽是致耐受性的,该序列与β乳球蛋白的13-48区域有8个AA重叠。WO 2015/090347 A1公开了具有6-9个氨基酸的序列的β乳球蛋白肽是致耐受性的,该序列与β乳球蛋白的13-48区域具有至少7个AA重叠。WO 2016/148572 A1公开了与β乳球蛋白的13-48区域具有至少8个AA重叠的β乳球蛋白肽是致耐受性的。一般而言,致耐受效应与作为T细胞表位并与T细胞结合的致耐受性肽有关,例如在HLA-DR等位基因上。以这种方式诱导口服耐受性。为了使致耐受性肽有效地充当T细胞表位,通常假定最小大小为8个AA。
例如,可根据Gouw等人,2018,Clin.Exp.Allergy 48:1345-1253确定超滤乳清蛋白水解产物中包括致耐受性肽在内的β乳球蛋白肽的氨基酸序列的测定,可选地修改为使用micro LC-MS ESI MS2代替nanoLC-ESI MS2。
在优选的实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物包含至少一种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID no.2-30中任一项的长度为8个氨基酸的氨基酸序列,更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少一种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ IDno.31-57中任一项的长度为10个氨基酸的氨基酸序列。优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID no.2-30中任一项的氨基酸序列。更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID No.31-57中任一项的氨基酸序列。
在进一步优选的实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物包含至少一种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.58-70中任一项的氨基酸序列,更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少一种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.66-70中任一项的氨基酸序列,最优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少一种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.66和68-70中任一项的氨基酸序列。在最优选的实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种、优选地至少三种、更优选地至少四种、甚至更优选地至少五种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No 58-70中任一项的氨基酸序列。
在进一步优选的实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物包含至少一种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.2-24、31-51和66-70中任一项、甚至更优选地根据SEQ ID No.31-51和66-70中任一项,特别优选地根据SEQ ID no.2-17、31-44、66和68-70中任一项,甚至更优选地根据SEQ ID no.31-44、66和68-70中任一项的氨基酸序列。
更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID No.2-70中任一项,优选地根据SEQ IDNo.31-70中任一项的氨基酸序列。更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID No.2-24、31-51和66-70中任一项的氨基酸序列。甚至更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID No.31-51和66-70中任一项的氨基酸序列。更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID No.2-17、31-44和68-70中任一项的氨基酸序列。更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID No.31-44、66和68-70中任一项,更优选地根据SEQ ID No.66和68-70中任一项的氨基酸序列。
在优选的实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物包含至少一种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.2-57和66-70中任一项、优选地根据SEQ ID No.31-57和66-70中任一项,甚至更优选地根据SEQ ID no.31-51和66-70中任一项的氨基酸序列。更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID No.2-57和66-70中任一项的氨基酸序列。更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID No.31-57和66-70中任一项的氨基酸序列。更优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少两种,甚至更优选地至少三种肽,所述肽包含根据SEQ ID No.31-51和66-70中任一项的氨基酸序列。
至少一种特定的β乳球蛋白肽优选地是天然肽。天然肽被定义为从天然存在的蛋白质的水解中获得。合成的肽被定义为化学合成的。
在整个说明书和权利要求书中,具有SEQ ID NO:1-70的的氨基酸序列的BLG肽在下文中被鉴定为:
这里,X定义选自亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)的氨基酸,优选地X是亮氨酸。X是亮氨酸还是异亮氨酸的选择是哺乳动物奶源的直接结果。亮氨酸是优选的,因为来自牛属的哺乳动物奶,优选牛奶,是最优选的。
在本发明的优选实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质至少10微克,更优选地每克蛋白质至少50微克,甚至更优选地每克蛋白质至少100微克的β乳球蛋白肽的总和,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.2-70中任一项,优选地根据SEQ IDNo.31-70中任一项的氨基酸序列。优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质10-50,000微克,更优选地每克蛋白质20-20,000微克,更合适每克蛋白质30-10,000微克,特别优选地每克蛋白质50-5,000微克的β乳球蛋白肽的总和,所述β乳球蛋白肽包括根据SEQ IDNo.2-70中任一项,优选地根据SEQ ID No.31-70中任一项的氨基酸序列。β乳球蛋白衍生肽优选地以治疗有效量存在。
在本发明的优选实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质至少10微克,更优选地每克蛋白质至少50微克,甚至更优选地每克蛋白质至少100微克的β乳球蛋白肽的总和,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID no.2-30中任一项的长度为8个氨基酸的氨基酸序列,更优选地根据SEQ ID no.31-57中任一项的长度为10个氨基酸的氨基酸序列。
致敏性β乳球蛋白
优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含小于6微克致敏性β乳球蛋白/g蛋白质,更优选地小于0.8微克致敏性β乳球蛋白/g蛋白质,最优选地小于0.2微克/g蛋白质。在本发明的上下文中,表述“致敏性β乳球蛋白”是指完整的或免疫原性的β乳球蛋白,并且不考虑水解的β乳球蛋白。为比较起见,超滤水解乳清蛋白表现出小于0.2微克致敏性β乳球蛋白/g蛋白质。致敏性β乳球蛋白可以通过本领域已知的方法来确定,例如Elisa。
乳化剂
食品乳化剂充当食品中相互冲突的成分(如水和油)之间的界面。为了使这两种成分兼容,使用了乳化剂。不受理论束缚,发明人推测乳化剂可以防止致耐受性肽的成簇或破坏致耐受性肽的簇,使这些肽能够从超滤膜渗透。乳化剂的实例是磷脂、硬脂酸镁和脂肪酸的钠盐、钾盐和钙盐。其他实例是卵磷脂,例如大豆卵磷脂、硬脂酰-2-乳酸钙(CSL)、聚甘油酯(PGE)、山梨糖醇酯(SOE)例如山梨糖醇单硬脂酸酯、丙二醇单酯(PGME)、蔗糖酯(SE/E473),甘油单酯/单酰基甘油(MAG)、甘油二酯/二酰基甘油(DAG)、磷酸化甘油单酯、乙酰化甘油单酯(AMG)、乳酰化甘油单酯(LMG)、双乙酰酒石酸单双甘油酯(Datem)、柠檬酸单双甘油酯(Citrem)。标准是食品乳化剂应适用于婴儿和婴儿后续配方食品。在本发明的上下文中,优选地乳化剂选自由Citrem、Datam、MAG、DAG、SE(E473)和大豆卵磷脂及其组合组成的组,更优选地为或包含Citrem。优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含乳化剂,所述乳化剂选自由Citrem、Datem、MAG、DAG SE(E473)和大豆卵磷脂及其组合组成的组,更优选为或包含Citrem。
优选地,乳化剂在制备超滤乳清蛋白水解产物的过程中以每克蛋白质中加入其至少50mg,更优选地每克蛋白质至少100mg,最优选地每克蛋白质150-500mg的浓度加入。优选地,乳化剂在制备超滤乳清蛋白水解产物的过程中以至少1克/升,更优选地至少2克/升,最优选地2-20克/升,特别是5-15克/升的浓度加入。
优选地乳化剂在制备超滤乳清蛋白水解产物的方法中在水解之前和/或在水解期间,更优选地在水解之前加入。
离液剂
在一个实施方案中,使用离液剂作为确保致耐受性β乳球蛋白肽通过膜过滤器的成分。离液剂是破坏大分子(例如蛋白质)的结构并使其变性的物质。适用于本发明制造方法的常用离液剂包括正丁醇、乙醇、盐酸胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、硫脲、SDS和尿素。对于本发明,优选地离液剂是或包含尿素。离液剂可以在水解后溶解肽聚集体和/或防止肽聚集体的形成。
由于离液剂可能对所有蛋白质(包括蛋白水解酶)具有变性作用,因此优选地仅在水解1后添加离液剂。
根据本发明的超滤乳清蛋白水解产物和/或制备超滤乳清蛋白水解产物的方法优选地包含尿素作为离液剂,这标志着尿素在制造方法中的用途。尿素也被称为碳酰二胺,CO(NH2)2。尿素可从各种食品级质量来源商购获得,例如来自美国加利福尼亚州的NuGenTec,美国Spectrum chemical,或者它可以从牛奶中富集,如US 6,506,305中公开的。
根据本发明,在一个实施方案中,离液剂在本发明方法中的用量为每100毫升至少10克离液剂,更优选地每100毫升20-100克离液剂,优选地尿素。优选地,在本发明的方法中,离液剂以每克蛋白质中加入至少5g离液剂,优选地每克蛋白质5-20g的量提供。超滤乳清蛋白水解产物优选地包含每克蛋白质1至25克离液剂(优选地尿素),更优选地每克蛋白质5至20克,更优选地每克蛋白质7至15克。优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含至少1g/100ml,更优选地5-80g离液剂/100ml,最优选地20-60g离液剂/100ml。
根据本发明,在另一个优选实施方案中,在本发明方法中,离液剂的用量为每100毫升至少1克离液剂(优选地尿素),更优选地每100毫升至少3克离液剂,甚至更优选地每100ml 1-10g离液剂,优选地尿素。优选地,在本发明的方法中,离液剂以每克蛋白质中加入至少25mg离液剂,优选地每克蛋白质50-200mg的量提供。优选地,超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质10-250mg离液剂(优选地尿素),更优选地每克蛋白质20-200mg,更优选地每克蛋白质50-150mg。备选地或另外地,超滤乳清蛋白水解产物包含每克干重至少10mg离液剂(优选地尿素),优选地每克干重至少50mg,更优选地每克干重至少100mg。在根据本发明的另一个实施方案中,超滤乳清蛋白水解产物包含至少15mg/100ml,更优选15-75mg离液剂/100ml。
乳酸产生细菌
根据本发明的营养组合物优选地包含乳酸产生细菌种的菌株,其增强本发明的β乳球蛋白肽的口服免疫致耐受能力。细菌菌株优选地是益生菌。协同作用的证据附在实施例中。发现乳酸产生细菌的存在增加了树突细胞表面上HLA-DR分子的表达。HLA-DR的表达增加也表明肽向T细胞的呈递改善,因此口服免疫耐受性诱导改善,并且表明治疗和/或预防如本文所定义的过敏。合适的乳酸产生细菌包括双歧杆菌属(Bifidobacteria)(例如,短双歧杆菌(B.breve)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、双歧杆菌(B.bifidum))、乳酸杆菌(Lactobacillus)(例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳杆菌(L.casei)、乳酸乳杆菌(L.lactis))和链球菌属(Streptococcus)(例如嗜热链球菌(S.thermophilus))菌株。短双歧杆菌和长双歧杆菌是特别合适的乳酸产生细菌。
根据本发明的营养组合物优选地包含属于双歧杆菌属的乳酸产生细菌菌株,优选地短双歧杆菌。与短双歧杆菌ATCC 15700的模式菌株相比,短双歧杆菌优选地具有至少95%的16S rRNA序列同一性,更优选地至少97%的同一性(Stackebrandt&Goebel,1994,Int.J.Syst.Bacteriol.44:846-849)。可以从健康的母乳喂养婴儿的粪便中分离出合适的短双歧杆菌菌株。通常,这些可从乳酸菌生产商处购得,但也可以直接从粪便中分离、鉴定、表征和产生。根据一个实施方案,营养组合物包含短双歧杆菌,所述短双歧杆菌选自由短双歧杆菌Bb-03(罗地亚/丹尼斯科)、短双歧杆菌M-16V(森永)、短双歧杆菌R0070(罗塞尔研究所,拉曼)、短双歧杆菌BR03(Probiotical)、短双歧杆菌BR92)(Cell Biotech)、DSM 20091、LMG 11613、YIT4065、FERM BP-6223和CNCM I-2219组成的组。短双歧杆菌可以是短双歧杆菌M-16V和短双歧杆菌CNCM I-2219,最优选地短双歧杆菌M-16V。短双歧杆菌I-2219公布在WO 2004/093899中,并由Compagnie Gervais Danone于1999年5月31日保藏在法国巴黎巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心(Collection Nationale de Cultures deMicroorganisms,Institute Pasteur)。短双歧杆菌M-16V保藏为BCCM/LMG23729,可从Morinaga Milk Industry Co.,Ltd.商购。
乳酸产生细菌可以任何合适的浓度存在于营养组合物中,优选地本发明上下文中以治疗有效量或“有效治疗/预防量”。优选地,乳酸产生细菌菌株以每克营养组合物干重104-1013cfu、优选地105-1011cfu/g、最优选地106-1010cfu/g的量包含在营养组合物中。
非消化性寡糖
在优选的实施方案中,本发明的营养组合物另外地包含一种或多种非消化性寡糖[NDO]。与乳酸产生细菌一样,这些进一步增加了β乳球蛋白的肽的口服免疫耐受性诱导特性,并改善了如本文所定义的过敏的治疗和/或预防。PCT/NL2019/050237和实验部分给出了增强效果的证据。
有利地和最优选地,非消化性寡糖是水溶性的(根据L.Prosky等人,J.Assoc.Anal.Chem 71:1017-1023,1988中公开的方法)并且优选地是聚合度(DP)为2至200的寡糖。非消化性寡糖的平均DP优选地低于200,更优选地低于100,甚至更优选地低于60,最优选地低于40。
非消化性寡糖优选地是益生元。它不会通过人体上消化道(小肠和胃)中存在的消化酶的作用在肠道中消化。非消化性寡糖由人体肠道微生物群发酵。例如,葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和麦芽糖糊精被认为是可消化的。寡糖原料可以包括单糖,如葡萄糖、果糖、岩藻糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸、GalNac等,但这些不属于寡糖。非消化性寡糖优选地选自由低聚果糖、非消化性糊精、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯寡糖、阿拉伯半乳糖-寡糖、葡糖-寡糖、葡甘露寡糖、半乳甘露寡糖、甘露寡糖、壳寡糖、糖醛酸寡糖、唾液酸寡糖和岩藻寡糖(fucooligosaccharide),以及其混合物组成的组,优选地低聚果糖。唾液酸低聚糖的实例是3-唾液酸乳糖、6″唾液酸乳糖、唾液酸乳-N-四糖、二唾液酸乳N四糖(disialyllactoNtertraoses)。岩藻寡糖的实例是(未)硫酸化岩藻聚糖寡糖、2′岩藻糖基乳糖、3′岩藻糖基乳糖、乳-N-岩藻五糖I、II、III、LNDH、乳二岩藻四糖、乳-N二岩藻六糖I和II。
一种合适类型的寡糖是短链寡糖,其平均聚合度小于10,优选地最多8,优选地在2-7范围内。短链寡糖优选地包含低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides)和/或低聚果糖(即scGOS和/或scFOS)。在一个实施方案中,营养组合物包含低聚半乳糖,优选地β-低聚半乳糖,优选地反式-低聚半乳糖。低聚半乳糖优选地具有2-8、优选地3-7范围内的平均聚合度,即是在本发明的上下文中的短链寡糖。(反式)低聚半乳糖例如可以商品名GOS(Friesland Campina Domo Ingredients,荷兰)、Bimuno(Clasado)、Cup-oligo(NissinSugar)和Oligomate55(Yakult)获得。营养组合物优选地包含短链低聚果糖和/或短链低聚半乳糖,优选地至少短链低聚果糖。低聚果糖可以是平均DP在上述(亚)范围内的菊粉水解产物;例如,此类FOS产品可作为Raftilose P95(Orafti)或从Cosucra商购。
另一种合适类型的寡糖是长链低聚果糖(1cFOS),其平均聚合度高于10,通常在10-100范围内,优选地15-50,最优选地高于20。特殊类型的长链低聚果糖是菊粉,例如Raftilin HP。
营养组合物可以包含两种或更多种类型的非消化性寡糖的混合物,最优选地两种非消化性寡糖的混合物。在NDO包含两种不同寡糖的混合物或由两种不同寡糖的混合物组成的情况下,一种寡糖可以是如上定义的短链并且一种寡糖可以是如上定义的长链。最优选地,短链寡糖和长链寡糖以短链与长链的重量比在1∶99-99∶1,更优选地1∶1-99∶1,更优选地4∶1-97∶3,甚至更优选地5∶1-95∶5,甚至更优选地7∶1-95∶5,甚至更优选地8∶1-10∶1,最优选地约9∶1存在。
在一个实施方案中,营养组合物包含至少两种低聚果糖和/或低聚半乳糖。合适的混合物包括长链低聚果糖与短链低聚果糖或短链低聚半乳糖的混合物,最优选地长链低聚果糖与短链低聚果糖的混合物。
基于营养组合物的干重,营养组合物优选地包含0.05至20wt%的所述非消化性寡糖,更优选地0.5至15wt%,甚至更优选地1至10wt%,最优选地2至10wt%。当为液体形式时,基于100ml,营养组合物优选地包含0.01至2.5wt%的非消化性寡糖,更优选地0.05至1.5wt%,甚至更优选地0.25至1.5wt%,最优选地0.5-1.25wt%。
在一个实施方案中,NDO混合物不包含任何可检测量的酸性寡糖。
当非消化性寡糖为混合物时,各参数的平均值用于定义本发明。
如上文定义的NDO和乳酸产生细菌的组合也被称为“合生元”。治疗有效量的NDO与乳酸产生细菌的存在被认为进一步提高了双歧杆菌菌株,优选地短双歧杆菌与低聚果糖的口服免疫耐受性诱导特性和治疗和/或预防过敏的效果。
其他成分
本发明的营养组合物可进一步包含长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)。LC-PUFA是其中酰基链具有20至24个碳原子(优选地20或22个碳原子)的长度并且其中酰基链在酰基链中的所述碳原子之间包含至少两个不饱和键的脂肪酸。更优选地,营养组合物包含至少一种LC-PUFA,其选自由二十碳五烯酸(EPA,20∶5n3)、二十二碳六烯酸(DHA,22∶6n3)、花生四烯酸(ARA,20∶4n6)和二十二碳五烯酸(DPA,22∶5n3)组成的组,优选地DHA、EPA和/或ARA。此类LC-PUFA对降低过敏风险具有进一步的有益作用。
营养组合物中LC-PUFA的优选含量不超过总脂肪酸的15wt.%,优选地不超过10wt.%,甚至更优选地不超过5wt.%。优选地,营养组合物包含总脂肪酸的至少0.2wt.%,优选地至少0.25wt.%,更优选地至少0.35wt.%,甚至更优选地至少0.5wt.%的LC-PTA,更优选地DHA。营养组合物优选地包含ARA和DHA,其中ARA/DHA的重量比优选地高于0.25,优选地高于0.5,更优选地0.75-2,甚至更优选地0.75-1.25。重量比优选地低于20,更优选地在0.5和5之间。基于总脂肪酸,DHA的量优选地高于0.2wt%,更优选地高于0.3wt%,更优选地至少0.35wt%,甚至更优选地0.35-0.6wt%。
营养组合物
根据本发明的营养组合物可用作营养疗法、营养支持、医疗食品、特殊医疗用途食品或营养补充剂。营养组合物优选地是肠内(口服)组合物。将营养组合物口服施用或打算口服施用至有需要的受试者,特别是儿童和婴儿,包括蹒跚学步的幼儿,优选地至多6岁的儿童,优选地通常0-36个月的婴儿或幼儿,更优选地0-12个月的婴儿,最优选地0-6个月的婴儿。因此,在一些实施方案中,营养组合物是婴儿配方食品、婴儿后续配方食品或幼儿配方食品(也称为成长奶),优选地它是婴儿配方食品婴儿后续配方食品,最优选地婴儿配方食品。术语“婴儿配方食品”和“后续配方食品”具有明确的定义,并受到监管机构国际一致的控制。特别地,CODEX STAN 73-1981“婴儿配方食品和婴儿特殊医学用途配方食品标准”被广泛接受。它推荐了营养价值和配方组成,要求调制奶每100毫升含有不少于60千卡(250千焦)和不超过70千卡(295千焦)的能量。FDA和其他监管机构已据此制定了营养要求。
优选地,本发明的营养组合物用于向人提供日常营养需求,特别是用于施用至人,尤其是喂养人,特别是婴儿,包括蹒跚学步的婴儿,优选地具有患牛、绵羊和/或山羊奶蛋白过敏的风险,优选地针对来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属、更优选来自牛属的物种的奶蛋白,最优选地牛奶蛋白过敏。在一个实施方案中,奶蛋白过敏涉及来自特定哺乳动物物种的奶,并且包含在营养组合物中的超滤乳清蛋白水解产物来自相同的哺乳动物物种,优选地两者都来自牛属。
为了满足婴儿的热量需求,本发明的营养组合物优选地包含50至200千卡/100ml液体,更优选地60至90千卡/100ml液体,甚至更优选地60至75千卡/100ml液体。这种热量密度确保了水和热量消耗之间的最佳比例。营养组合物的渗透压优选地为150至420mOsmol/l,更优选地260至320mOsmol/l。低渗透压旨在减少胃肠道压力。
优选地,本发明的营养组合物为液体形式,优选地粘度低于35mPa.s,更优选地低于6mPa.s,如在Brookfield粘度计中在20℃和100s-1的剪切速率下测量的。适宜地,营养组合物为粉末形式,其优选地可以用水复原以形成液体,或为液体浓缩物形式,其应当用水稀释。当营养组合物为液体形式时,每日施用的优选体积为每天约80至2500ml,更优选地每天约450至1000ml。
根据本发明的营养组合物包含脂质成分,优选地本领域已知的适用于婴儿营养的脂质成分。营养组合物的脂质成分优选地每100kcal营养组合物提供2.9至6.0g,更优选地4至6g。当为液体形式时,营养组合物优选地包含2.1至6.5g脂质/100ml,更优选地3.0至4.0g/100ml。基于干重,本发明婴儿或较大配方食品优选地包含12.5至40wt%的脂质,更优选地19至30wt%。
除了根据本发明的β乳球蛋白衍生肽之外,根据本发明的营养组合物可以包含另外的蛋白质材料。在本发明的上下文中,另外的“蛋白质”或“蛋白质材料”或“蛋白质等效物”包括蛋白质、肽、游离氨基酸和部分或深度水解的蛋白质。优选地,除了超滤乳清蛋白水解产物之外的另外的蛋白质材料不会引起过敏反应或是低致敏性的,例如游离氨基酸和水解蛋白质。作为另外的蛋白质成分,即除了超滤乳清蛋白水解产物之外,根据本发明的营养组合物可以包含游离氨基酸。根据本发明的营养组合物优选地包含小于1wt%的完整哺乳动物(牛)奶蛋白。营养组合物可以包含另外的蛋白质成分,其选自由游离氨基酸和来自其他来源(例如大豆、豌豆、水稻、胶原蛋白等)的完整形式、部分水解形式和/或深度水解形式的蛋白质组成。在最优选的实施方案中,组合物不含除超滤乳清蛋白水解产物以外的蛋白质成分。也就是说,优选超滤乳清蛋白水解产物是组合物中蛋白质材料的唯一来源。
基于总热量,营养组合物优选地含有4至25%,更优选地5至20%,更优选地7至16%,最优选地7至12%的蛋白质。营养组合物,当为液体形式时,优选地每100ml含有0.5至6.0g,更优选地0.8至3.0g,甚至更优选地1.0至2.5g蛋白质。基于总组合物的干重,营养组合物优选地包含至少7.0wt%、更优选地至少8.0wt%、最优选地至少9wt%或至少10wt%的蛋白质。优选地,基于总组合物的干重,营养组合物包含至多40wt%、更优选地至多15wt%、优选地至多20wt%的蛋白质。
营养组合物包含可消化的碳水化合物。通常,使用本领域已知适用于婴儿营养组合物的可消化的碳水化合物,例如选自可消化的多糖(例如淀粉、麦芽糖糊精)、可消化的单糖(例如葡萄糖、果糖)和可消化的二糖(例如乳糖、蔗糖)。特别合适的是乳糖和/或麦芽糖糊精。在一个实施方案中,营养组合物不包含乳糖。可消化的碳水化合物成分优选地包含基于总可消化的碳水化合物至少60wt%的乳糖,更优选地至少75wt%,甚至更优选地基于总可消化的碳水化合物的至少90wt%的乳糖。
人类受试者
人类受试者或靶标的群体是儿童和婴儿,包括蹒跚学步的幼儿,优选地最多6岁的儿童,优选地0-36个月的婴儿或幼儿,更优选地0-12个月,最优选地0-6个月的婴儿。在一个优选的实施方案中,受试者有发生过敏,优选地食物过敏,优选地牛、绵羊和/或山羊奶蛋白过敏,优选地来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属、更优选地来自牛属的物种的奶蛋白,最优选地牛奶蛋白过敏的风险,优选地患有奶蛋白过敏的婴儿,优选地对来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属、更优选地来自牛属的物种的奶蛋白,最优选地牛奶蛋白过敏。有风险的婴儿优选地由家族史确定,优选地,至少一位父母患有或具有过敏史。一方面,本发明因此涉及如上文定义的过敏的一级预防。
在更优选的实施方案中,本发明涉及如上文定义的过敏的二级预防。
在一方面,受试者患有过敏,优选地食物过敏,优选地牛、绵羊和/或山羊奶蛋白过敏,优选来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属、更优选地来自牛属的物种的奶蛋白,最优选低牛奶蛋白过敏,优选地患有奶蛋白过敏的婴儿,优选地针对来自牛属、野牛属、水牛属或山羊属、更优选地来自牛属的物种的奶蛋白,最优选地牛奶蛋白过敏。
本发明涉及根据本发明的超滤乳清蛋白水解产物或包含所述超滤乳清蛋白水解产物的组合物在制造产品中的用途,所述产品在如上定义的受试者中用于:
(i)提供营养;和/或
(ii)治疗/预防上文定义的过敏;和/或
(iii)诱导针对过敏原,优选地食物过敏原的口服免疫耐受性。该用途优选地涉及(ii)和/或(iii)。
本发明还涉及如上文定义的超滤乳清蛋白水解产物或包含所述超滤乳清蛋白水解产物的组合物,用于在如上定义的受试者中:
(i)提供营养;和/或
(ii)治疗/预防上文定义的过敏;和/或
(iii)诱导针对过敏原,优选地食物过敏原的口服免疫耐受性。该用途优选地涉及(ii)和/或(iii)。
换句话说,本发明还涉及方法,所述方法用于在如上定义的受试者中:
(i)提供营养;和/或
(ii)治疗/预防上文定义的过敏;和/或
(iii)诱导针对过敏原,优选地食物过敏原的口服免疫耐受性,
其中向所述受试者施用超滤乳清蛋白水解产物或包含所述超滤乳清蛋白水解产物的组合物。该方法优选地涉及(ii)和/或(iii)。在用于(i)提供营养的方法的情况下,该方法优选地为非治疗方法。
实施例
实施例1:水解乳清蛋白的膜过滤步骤导致致耐受性β乳球蛋白肽的保留。
在Multifors反应器(Infors HT)中,将50克乳清蛋白粉(WPC83,Arla Foods,含有约80%的乳清蛋白)在约75℃的温度下以约4wt%的最终浓度溶解在水中,得到蛋白质浓度约为3.2wt%。溶解后将混合物冷却至58℃并将pH调节至中性(pH 7-8)。添加蛋白水解酶(胰蛋白酶,Neova Technologies Inc)至浓度为33mg/100g的溶液,并在连续搅拌下水解约105分钟。在水解期间,pH保持恒定。水解后,将混合物快速冷却至4℃。
接下来过滤乳清蛋白水解产物和蛋白水解酶的混合物。将200ml混合物(进料)在配备有来自Koch的超滤膜(Koch:HFK-131,一种具有分子量截止值为10kDa的平面聚醚砜超滤膜)的MMS Triple System膜过滤装置(MMS AG Membrane Systems)上在8巴的压力下过滤20分钟。使用了一层过滤装置并且在过滤过程中使渗余物循环。每个膜仅使用一次以提高重现性。过滤冷却系统设置为15℃。对渗透物进行称重,使用MMS过滤软件记录渗透物通过量。从膜过滤之前的混合物(进料)以及膜过滤步骤之后的渗透物和渗余物进行取样。产生了约93%的渗透物(总进料的wt%),其包含约85wt%的肽(进料中肽的wt%)。样品储存在-50℃以供进一步分析。
根据Gouw等人,2018,Clin.Exp.Allergy 48∶1345-1253分析了样品中是否存在致耐受性β乳球蛋白肽,修改为使用micro LC-MS ESI MS2代替nanoLC-ESI MS2。测试了5种特定肽的存在(与β乳球蛋白的13-48氨基酸区域重叠的区域以粗体显示):
肽1:AA1-27;
肽2:AA 11-42;
肽3:AA 6-35;
肽4:AA 6-32;
肽5:AA 1-32;
这些肽分别对应于SEQ ID NO 66-70,其中X为L。
发现这些β乳球蛋白肽在膜过滤步骤之前的水解产物混合物中和在渗余物中被检测到,但在渗透物中未检测到。作为膜过滤步骤的结果,渗透物中致敏性β乳球蛋白的量低于0.2微克/克蛋白质,渗透物中大于10kDa的肽的量低于1毫克/克蛋白质。两个参数都可以通过本领域已知的方法(ELISA和尺寸排阻高压液相色谱)来确定。
实施例2a:水解过程中乳化剂的存在导致膜过滤步骤后的渗透物中存在β乳球蛋白肽。
重复实施例1的方法。唯一的区别是在调节pH值和添加蛋白水解酶之前添加的Citrem(Citrem,DuPont)的量为约3.6克。Citrem不被UF膜保留,因此渗透物和渗余物中的Citrem浓度相似。此外,发现添加Citrem对大于10kDa的肽和致敏性β乳球蛋白的保留没有影响。与实施例1一样,对进料、渗余物和渗透物进行了致耐受性肽的测试。出人意料地并且与实施例1相反,在渗透物中检测到所有5种致耐受性肽(实施例1的肽1-5(即,SEQ ID NO 66-70,X=L),其量为进料中这些肽的浓度的约1-10wt.%。
实施例2b:重复实施例2a的实验,但在水解步骤的中间加入Citrem,现在在渗透物中再次发现了特定的肽。
实施例3:,水解过程中离液剂的存在导致在膜过滤步骤之后的渗透物中存在β乳球疋白肽。
重复实施例2a的过程,唯一的区别是每100克水(8M)溶解51克尿素(来自默克)代替乳化剂,并在水解步骤之后和超滤之前添加。UF膜不保留尿素,因此渗透物和渗余物中的尿素浓度相似。此外,未发现添加尿素对大于10kDa的肽和致敏性β乳球蛋白的保留有影响。就在膜过滤步骤之前溶解尿素并使其冷却。发现过滤前的冷却时间足够长。发现致耐受性β乳球蛋白肽存在于进料和渗余物中,但令人惊讶的是还存在于渗透物中。所有肽都在渗余物和进料中检测到,并且在渗透物中检测到实施例1的肽1、3、4和5(即SEQ ID NO 66、68、69和70,X=L),其量约为进料中这些肽浓度的1-10wt.%。
实施例3:水解过程中离液剂的存在导致在膜过滤步骤之后的渗透物中存在β乳球蛋白肽。
重复实施例2a的过程,唯一的区别是100克水(8M)溶解51克尿素(来自默克)代替乳化剂,并在水解步骤之后和超滤之前添加。UF膜不保留尿素,因此渗透物和渗余物中的尿素浓度相似。此外,未发现添加尿素对大于10kDa的肽和致敏性β乳球蛋白的保留有影响。发现致耐受性β乳球蛋白肽存在于进料和渗余物中,但令人惊讶的是还存在于渗透物中。所有肽都在渗余物和进料中检测到,并且在渗透物中检测到实施例1的肽1、3、4和5(即SEQ IDNO 66、68、69和70,X=L),其量约为进料中这些肽浓度的1-10wt.%。
实施例4:婴儿配方食品
粉状婴儿配方食品,用于患有食物过敏的0-6个月的婴儿,当用水复原为即饮液体时,每100毫升含有66千卡热量,
-每100千卡包含约2.4g蛋白质,
-所述蛋白质是通过实施例2中描述的过程可获得的超滤水解乳清蛋白,包含至少3种选自由以下组成的组的β乳球蛋白肽
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS,
DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY,
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ,
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL,和
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL,
并且乳清蛋白水解产物中肽的MW的分布模式如下
该婴儿配方食品还包含每100千卡10.7克可消化的碳水化合物(主要是乳糖)、每100千卡5.1克脂肪、每100毫升0.8克非消化性寡糖(scGOS/lcFOS比例为9∶1)、citrem、维生素、矿物质和本领域已知的微量元素。
实施例5:婴儿配方食品
粉状婴儿配方食品,用于患有食物过敏的0-12个月的婴儿,当用水复原为即饮液体时,每100毫升含有66千卡热量,
-每100千卡包含约2.7g蛋白质,
-所述蛋白质是通过实施例3中描述的方法可获得的超滤水解乳清蛋白,包含至少3种选自由以下组成的组的β乳球蛋白肽
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS,
DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY,
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ,
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL,和
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL,
并且乳清蛋白水解产物中肽的MW的分布模式如下
该婴儿配方食品还包含每100千卡10.9克可消化的碳水化合物(主要是乳糖)、5.1克脂肪、每100毫升0.8克非消化性寡糖(scGOS/lcFOS比例为9∶1)、尿素、维生素、矿物质和本领域已知的微量元素。
实施例6:与单独的益生菌或益生元相比,合生元混合物显示出进一步改善的耐受
性诱导效果
几项已发表的研究支持这样一种观点,即肠腔内的膳食抗原(包括肽)可以被肠道抗原呈递细胞吸收并随后捕获和呈递(即抗原取样机制),而无需破坏的肠道屏障。至少有两种不同的机制在健康状态下持续对膳食抗原进行采样,即微褶/M细胞介导的转胞吞作用和杯状细胞相关的抗原通道。这两种途径都为肠道固有层CD103+DC提供膳食抗原,这反过来又可以将肠道归巢分子印在T细胞和B细胞上,可以促进肠道IgA产生浆细胞的分化,以及可以产生肠道Treg,被称为口服耐受的对喂食抗原的低反应状态的关键参与者。这表明测试的HP中的肽可以被口服吸收,然后由肠道CD103+DC捕获和呈递抗原,并随后最终产生功能性Treg。
为了发展口服耐受性,测试的HP中的T细胞表位需要在正确的环境下呈递。除了TCR活化外,共刺激和细胞因子信号传导在Treg的产生中起重要作用。益生菌或益生元在为向Treg的这种倾向性创造合适的环境方面发挥着重要作用。合成的BLG肽与益生菌或益生元饮食相结合,可增强预防作用。
为了证明益生菌、益生元和合生元的效果,进行了与WO 2016/148572的实施例4中描述的类似的实验,采用相同的方案,以及合成的肽(′Pepmix′)的相同浓度和混合物,pepmix在表8中确定。
表8.根据WO 2016/148572的pepmix
比较了几种饮食:
(a)WO 2016/14472的实施例1的合生元饮食(1wt%scFOS/lcFOS,重量比为9∶1+2wt%2x109cfu/g短双歧杆菌M-16V,
(b)WO 2016/148572的实施例4的益生菌饮食,具有2wt%2x109cfu/g短双歧杆菌M-16V,和
(c)含有1wt%scFOS/lcFOS重量比9/1的益生元饮食。
短链(Sc-)和长链(1c-)低聚果糖(FOS)分别以Raftilose P95(Orafti)和Raftiline HP商购获得。
所有组都用pepmix和上述饮食之一进行预处理,用乳清+霍乱毒素致敏并用乳清攻击。
用乳清攻击后,消耗(c)scFOS/lcFOS饮食的小鼠的δ耳肿胀约为174μm,消耗(b)益生菌饮食的小鼠的δ耳肿胀约为158μm,消耗(a)合生元饮食的约为112μm。合生元组(a)的耳肿胀在统计学上显著低于相应的scFOS/lcFOS组(c),并且与益生菌组(b)相比有较低反应的趋势(p=0.08)。这些结果表明对口服免疫耐受性诱导的进一步改善作用:
-当使用乳酸产生细菌,特别是来自短双歧杆菌的双歧杆菌菌株时,和
-尤其是在将乳酸产生细菌与NDO结合使用时。
基于这些实验,如果将这些成分与本发明的超滤乳清蛋白水解产物组合,将实现进一步改进的效果是可信的。
Claims (25)
1.制备超滤乳清蛋白水解产物的方法,所述方法包括:
a)用一种或多种蛋白水解酶对乳清蛋白A进行水解1,从而获得乳清蛋白水解产物B,和
b)对乳清蛋白水解产物B进行膜超滤2,从而获得渗透物C1和渗余物C2,
其中
(i)在水解1之前或期间将乳化剂E添加到乳清蛋白A中,或者其中在膜超滤2之前将乳化剂和/或离液剂E添加到乳清蛋白水解产物B中,
其中超滤乳清蛋白水解产物在渗透物C1中,
和/或其中:
(ii)在步骤b)之后
c)将乳化剂和/或离液剂E加入渗余物C2中,从而获得渗余物C3,
d)对渗余物C3进行膜超滤3,从而获得渗透物D1和渗余物D2,和
e)将渗透物D1的至少一部分添加到渗透物C1中,从而获得渗透物D3,
其中超滤乳清蛋白水解产物在渗透物D3中。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含至少一种β乳球蛋白肽,所述至少一种β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.2-70中任一项的氨基酸序列,优选地根据SEQ ID No.31-70中任一项的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质小于100mg、优选地小于50mg、更优选地小于10mg的大小大于5kDa的肽;和/或其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质小于30mg,优选地每克蛋白质小于10mg,最优选地每克蛋白质小于5mg的大小大于10kDa的肽。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质至少300mg的大小为1kDa或以下的肽,甚至更优选地每克蛋白质至少500mg;和/或其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含每克蛋白质至少900mg大小为5kDa或以下的肽,甚至更优选地每克蛋白质至少950mg,最优选地每克蛋白质至少990mg。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述超滤乳清蛋白水解产物的水解度为5-50%,优选地10-30%,更优选地15-25%。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述超滤乳清蛋白水解产物源自牛属、野牛属、水牛属或山羊属、更优选地牛属的物种的奶,优选地源自牛奶。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中用于膜超滤2和/或膜超滤3的膜具有截止值在5-1 5kDa、优选地5-11kDa,更优选地9-11kDa范围内的孔径。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中添加乳化剂E,其中所述乳化剂优选地选自由柠檬酸单双甘油酯(Citrem)、双乙酰酒石酸单双甘油酯(Datem)、单酰基甘油(MAG)、二酰基甘油(DAG)、蔗糖酯(SE,E473)和大豆卵磷脂,以及其组合组成的组,更优选地是或包含Citrem。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在水解之前或期间,优选地在水解之前,将乳化剂E添加到乳清蛋白中;并且优选地浓度为每克其添加到的蛋白质中至少50mg和/或浓度为至少1g/L。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中添加离液剂,优选地浓度为每100ml至少1克和/或每克其添加到的蛋白质中至少25mg;并且其中所述离液剂优选地是或包含尿素。
11.根据权利要求10所述的方法,其中在膜超滤之前将离液剂E添加到乳清蛋白水解产物B中。
12.可通过根据前述权利要求中任一项的方法获得的超滤乳清蛋白水解产物。
13.根据权利要求12所述的超滤乳清蛋白水解产物,其包括:
-每克蛋白质少于6微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选地小于1%的大小为5kDa的肽,和
-至少一种β乳球蛋白肽,其包含根据SEQ ID No.2-30中任一项,优选地,根据SEQ IDNo.31-57中任一项,更优选地,根据SEQ ID No.58-70中任一项的氨基酸序列;和
-优选地,每克蛋白质至少50mg离液剂和/或每克蛋白质至少5mg乳化剂。
14.超滤乳清蛋白水解产物,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含具有以下大小分布的肽:基于水解产物的总蛋白质,
60-90%,大小<1kDa,
10-40%大小为1至<5kDa的肽,
0-0.5%大小为5至<10kDa的肽,以及
0-0.2%大小>10kDa的肽,
和
其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含:
ο每克蛋白质少于6微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选地小于1%的大小为5kDa的肽,和
ο至少一种,优选地至少两种,更优选地至少三种β乳球蛋白肽,所述β乳球蛋白肽包含根据SEQ ID No.66-70中任一项的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的超滤乳清蛋白水解产物,其可通过根据权利要求1-11中任一项的方法获得。
16.乳清蛋白水解产物组合物,其包含超滤乳清蛋白水解产物,浓度为每克蛋白质至少0.8克超滤乳清蛋白水解产物,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含:
-每克蛋白质少于6微克致敏性β乳球蛋白;和/或基于总蛋白质,小于3%,优选地小于1%的大小为5kDa的肽,和
-至少一种β乳球蛋白肽,其包含根据SEQ ID No.2-70中任一项,优选地根据SEQ IDNo.31-70中任一项的氨基酸序列;和
-优选地,每克蛋白质至少50mg尿素和/或每克蛋白质至少5mg乳化剂。
17.根据权利要求13-15中任一项所述的超滤乳清蛋白水解产物或根据权利要求16所述的乳清蛋白水解产物组合物,其中包含根据SEQ ID No.2-70中任一项,优选地根据SEQID No.31-70中任一项,更优选地根据SEQ ID No.31-57中任一项,甚至更优选地根据SEQID No.58-70中任一项,最优选地根据SEQ ID No.66-70中任一项的氨基酸序列的所述至少一种β乳球蛋白肽以每克蛋白质至少10微克优选地50微克的量存在。
18.根据权利要求13-15中任一项所述的超滤乳清蛋白水解产物或根据权利要求16所述的乳清蛋白水解产物组合物,其中所述超滤乳清蛋白水解产物包含具有以下大小分布的肽,基于水解产物的总蛋白质:
60-90%,大小<1kDa,
10-40%大小为1至<5kDa的肽,
0-0.5%大小为5至<10kDa的肽,以及
0-0.2%大小>10kDa的肽。
19.营养组合物,其包含根据权利要求13-15中任一项所述的超滤乳清蛋白水解产物或根据权利要求16所述的乳清蛋白水解产物组合物,其中所述组合物是婴儿配方食品、婴儿后续配方食品或幼儿配方食品,优选地婴儿配方食品或婴儿后续配方食品。
20.根据权利要求19所述的营养组合物,进一步包含一种或多种非消化性寡糖和/或一种或多种乳酸产生细菌。
21.根据权利要求19或20所述的营养组合物在制造产品中的用途,所述产品
(i)用于提供营养给下述受试者;和/或
(ii)用于下述受试者中治疗/预防过敏;和/或
(iii)用于下述受试者中诱导针对过敏原,优选地食物过敏原的口服免疫耐受性,
所述受试者患有过敏,优选地患有食物过敏,优选地牛、绵羊和/或山羊奶蛋白,优选地选自由牛奶蛋白过敏、山羊奶蛋白过敏和绵羊奶蛋白过敏组成的组的过敏,
其中所述受试者优选地为至多6岁的儿童,更优选地为0至12个月的婴儿。
22.根据权利要求19或20所述的营养组合物,用于治疗和/或预防过敏,优选地治疗过敏,和/或用于诱导针对过敏原,优选地食物过敏原的口服免疫耐受性。
23.根据权利要求22的应用的营养组合物,其中所述过敏是食物过敏,优选地牛、绵羊和/或山羊奶蛋白过敏,优选地选自由牛奶蛋白过敏、山羊奶蛋白过敏和绵羊奶过敏组成的组的过敏和/或过敏原选自由牛奶蛋白、山羊奶蛋白和绵羊奶蛋白组成的组,优选地其中过敏是牛奶蛋白过敏和/或过敏原是牛奶蛋白。
24.权利要求21所述的用途或权利要求22或23的应用的营养组合物,其中奶蛋白是β乳球蛋白。
25.根据权利要求13-15中任一项所述的超滤乳清蛋白水解产物或根据权利要求16所述的乳清蛋白水解产物组合物在制造营养组合物中的用途,其中所述组合物优选地为婴儿配方食品、婴儿后续配方食品或幼儿配方食品,优选地婴儿配方食品或婴儿后续配方食品。
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