PT84850B - Processo de separacao e purificacao de vacina de proteina cs de p.falciparum expressa numa e.coli recombinante - Google Patents
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Classifications
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Description
MEMORIA DESCRITIVA
A presente invenção refere-se a um processo de preparação de um polipeptídeo purificado, expresso em E. coli recombinante, com utilidade terapêutica como vacina para a protecção de seres humanos contra a infecção por Plasmodium falciparum, o agente infeccioso da malária.
No Pedido de Patente Europeia EP-A-192 626, de Balou et al. (Pedido de Patente Norte-Americana Ns 699 116), que se incorpora por referência, apresenta-se e reivindica-se um polipeptídeo imunogénico susceptível de conferir imunidade a mamíferos contra infecções por P. falciparum, e a uma vacina compreendendo o polipeptídeo inunogénico. 0 polipeptídeo imunogénico compreende quatro ou mais unidades de repetição em sequência da proteína CS de F. falciparum. A unidade de repetição de P. falciparum é um tetrapeptídeo com a seguinte sequênciaí
Asparagina (Asn) - alanina (Ala) - Asn-prolina (pro) No pedido de Patente Europeia, EP-A-191 748 por Gross et al., (pedido de Patente Norte-Americana Ns 699 115)j que 6 incorporado por referência, descreve-se e reivindica-se num vector de expressão de E. coli com uma sequência de codificação para toda ou parte da unidade de repetição da proteína CS de P. falciparum, bem como E. coli transformada com o vector de expressão e um processo de purificação do polipeptídeo imunogénico de uma cultura produtora de E. coli.
Um problema persistente na produção de novos medicamentos e produtos biológicos obtidos pela tecnologia recombinante de ADN é a recuperação do produto em forma suficientemente pura para o seu uso pretendido. As vacinas, por exemplo, devem ser suficientemente livres de vários contaminantes de origem celular incluindo polipeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e materiais pirogénicos para evitarem o desenvolvimento de reacções imunes ou tóxicas indesejáveis desses contaminantes. As técnicas de isoiamsnto e purificação devem ser concebidas para eliminarem especificamente a contaminação por ácido nucleico microbiano, su-
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-3bstâncías antigénicas indesejáveis e materiais pirogénicos, isto é, materiais que provoquem uma resposta febril no paciente. Os materiais pirogénicos são tipicamente endotoxinas bacterianas, como por exemplo lipopolissacáridos.
De acordo com o procedimento de purificação apresentado nas EP-A-191 748, e EP-A-192 626, acima referidas, os polipeptídeos derivados da proteína CS de P.falciparum podem ser separados de outros polipeptídeos por aquecimento de extracto de células clarificado a cerca de 80° C após adição de um detergente para manter a solubilidade da proteína. 0 aquecimento a 8o°C durante pelo menos 4 minutos causa a precipitação de praticamente todos os polipeptídeos e proteínas bacterianos indesejáveis sem decomposição substancial do polipeptídeo imunogénico pretendido. Os polipeptídeos e proteínas bacterianos precipitados podem assim ser agregados por centrifugação e removidos. Young et al., Science 228:958 (19θ5), referem certos peptídeos apresentados em EP-A-192 626 e EP-A-191 748 e a sua purificação por precipitação com sulfato de amónio e cromatografia de fase inversa.
Esforços adicionais para desenvolver um procedimento de isolamento e purificação à escala industrial para polipeptídeos derivados da proteína CS de P. falciparum mostraram que o tratamento térmico acima descrito, embora eficaz para a separação de muitos contaminantes polipeptídeos celulares, não remove sa tisfatoriamente outros contaminantes como por exemplo pirogénios e ácidos nucleicos. Este problema é particularmente agudo em polipeptídeos derivados da proteína CS de P. falciparum possuindo caudas” básicas relativamente longas, como os polipeptídeos Rtet^g, que compreende pelo menos quatro repetições com uma cauda de 32 aminoácidos rica em arginina. Dado o carácter básico da cauda, o ADN está bem fixado no complexo. Verificou- se também que a concentração de endotoxinas no extracto de células tratadas termicamente é também indesejavelmente elevada.
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-4SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com a presente invenção, apresenta-se um processo de isolar e purificar um polipeptideo, compreendendo quatro ou mais unidades de repetição consecutivas de proteína CS de P. falciparum, a partir de um lisado de células parcialmente purificado derivado de uma cultura de células hospedeiras E. coli recombinantes, em que o lisado contém proteína, ácido nucleico e contaminantes pirogénicos de origem celular. 0 processo compreende uma série de passos de precipitação selectiva seguidos de dois passos de cromatografia, cromatografia de permuta iónica e cromatografia de fase inversa.
Mais particularmente, a invenção é um processo de purificação de um polipeptideo imunogénico, compreendendo quatro ou mais regiões repetidas sequencialmente da proteína CS de P.falciparum, a partir de um lisado clarificado de células de um recombinante de E. coli em cultura celular como célula hospedeira que compreendei (a) precipitarem-se selectivamente os contaminantes bacterianos;
(b) precipitar-se selectivamente o polipeptideo imunogénico a partir do sobrenadante do passo (a);
(c) ressolubilizar-se o precipitado do passo (b) contendo o polipeptideo imunogénico e precipitarem-se selectivamente os contaminantes bacterianos da solução;
(d) contactar-se a solução com o polipeptideo imunogénico com um suporte de permuta iónica e recolherem-se as fracções que contenham o polipeptideo; e (e) contactar-se a solução do polipeptideo imunogénico com um suporte hidrofóbico sólido por forma a que o polipeptídeo seja adsorvido pelo suporte, eluir-se o polipeptideo do suporte com um solvente orgânico polar e recolherem-se as fracções que contenham o polipeptideo purificado.
Numa concretização preferida, a invenção é um processo de isolar e purificar R32NSlg^ que compreendei
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Case 14331
(a) romperem-se as células e separarem-se os resíduos celulares da referida suspensão por forma a obter-se um extracto celular clarificado contendo o peptídeo R32NSlg1 em conjunto com polipeptídeos, proteínas, ADN e endotoxinas indesejáveis;
(b) tratar-se o extracto clarificado com polietileno-imina por forma a precipitarem-se os contaminantes bacterianos indesejáveis e posteriormente separarem-se os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo o peptídeo R32NS181;
(c) adicionar-se sulfato de amónio ao sobrenadante contendo R32NSlg^ numa concentração de cerca de 20% a cerca de 40% da saturação, precipitar-se a partir do extracto celular o sulfato de amónio em conjunto com o peptídeo Ε32ΝΒ181, formar-se uma suspensão do referido precipitado e separar-se dela o sobrenadante contendo o peptídeo R32N31g^;
(d) ajustar-se o referido sobrenadante liquido a um pH de cerca de 2 com ácido, precipitando assim os contaminantes bacterianos, e separarem-se os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo o R32NSlgj,; e (e) adicionar-se um agente caotrópico ao sobrenadante contendo R32NSlg-L e contactar-se o sobrenadante com um permutador catiónico, seguido pela eluição a pH de cerca de 6,5 e recolher-se o eluído; e (f) removerem-se os contaminantes bacterianos residuais do referido eluído de permuta iónica por cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) de fase inversa, utilizando como fase estacionária grupos alquilo θ2-18 nura suPorbe s61ido, e como fase móvel um solvente orgânico polar por forma a obter-se um eluído isento de contaminantes bacterianos; e (g) submeter-se o eluído de HPLC de fase inversa a uma diafiltração para se obter um retido do polipeptídeo R32NSlg^ puro.
Noutra concretização preferida, a invenção é um processo de isolamento e purificação do polipeptídeo R32tet^2 a partir de uma cultura celular de E. coli produzindo o referido peptídeo, que compreende:
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Case 14331
a) romperem-se as células e separarem-se os resíduos celulares da referida suspensão por forma a obter-se um extracto celular clarificado contendo o peptídeo R32tet^2 em conjunto com polipeptídeos, proteínas, ADN e endotoxinas indesejáveis;
b) aquecer-se o extracto clarificado a uma temperatura de cerca de 75°C até cerca de 90°C por forma a precipitarem-se selectivamente os contaminantes bacterianos indesejáveis, sem que ocorra uma precipitação ou degradação significativa do polipeptídeo R32tet^2 θ posteriormente arrefecer-se o extracto celular e separarem-se os contaminantes bacterianos do sobrenadante contendo R32tet^2j
c) adicionar-se sulfato de amónio ao sobrenadante arrefecido contendo R32tet^2 para uma concentração de cerca de 25% a cerca de 40% da saturação, precipitar-se o sulfato de amónio do sobrenadante em conjunto com o peptídeo R32tet^2» formar-se uma suspensão do referido precipitado e separar-se posteriormente dela o sobrenadante contendo o peptídeo R32tet^2?
d) adicionar-se ao sobrenadante líquido um sal solúvel por forma a aumentar a força iónica do referido sobrenadante líquido e ajustar-se 0 referido sobrenadante líquido a um pH de cerca de 2 com ácido, por forma a precipitarem-se os contaminantes bacterianos e separarem-se os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo o R32tet^2Í
e) submeter-se o sobrenadante da precipitação ácida a uma diafiltração usando um tampão de acetato de amónio contendo ditiotreitol a um pH de cerca de 5; obtendo-se assim um retido contendo o peptídeo R32tet^2?
f) contactar-se o retido com um permutador catiónico, seguido pela eluição com um sal a um pH de cerca de e recolher-se o eluído;
g) removerem-se os contaminantes bacterianos residuais do referido eluído de permuta iónica por cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) de fase inversa, utilizando como fase es-
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Case 14331
-7tacionária grupos alquilo ^2-18 num suPor4e sólido, e como fase móvel um solvente orgânico polar por forma a obter-se um eluído isento de contaminantes bacterianos; e
h) submeter-se o eluído da HPLC de fase inversa a uma diafiltração por forma a obter-se um retido do polipeptídeo R32tet^2 puro.
Numa terceira concretização preferida, a invenção é um processo de separação e purificação do polipeptídeo R32LA a partir de uma cultura de células E.coli produzindo 0 referido peptídeo, processo que compreende:
a) romperem-se as células e separarem-se os resíduos celulares da referida suspensão por forma a obter-se um extracto celular clarificado contendo 0 polipeptídeo R32LA em conjunto com polipeptídeos, proteínas, ADN e endotoxinas indesejáveis;
b) aquecer-se o extracto clarificado a uma temperatura de cerca de 75 °C até cerca de 90°C, por forma a precipitarem-se selectivamente os contaminantes bacterianos indesejáveis sem que ocorra uma precipitação ou degradação significativas do polipeptídeo R32LA, e posteriormente arrefecer-se o extracto celular e separarem-se os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo o R32LA;
c) adicionar-se sulfato de amónio ao sobrenadante arrefecido contendo R32LA para uma concentração de cerca de 25% a cerca de 60% da saturação, precipitar-se a partir do sobrenadante o sulfato de amónio em conjunto com o peptídeo R32LA, formar-se uma suspensão do referido precipitado e separar-se dela o sobrenadante contendo o peptídeo R32LA;
d) ajustar-se o sobrenadante líquido contendo o polipeptídeo R32LA a um pH de cerca de 2 com ácido, precipitando-se assim os contaminantes bacterianos e separarem-se os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo R32LA;
e) ajustar-se o sobrenadante a um pH de cerca de 6,5 e contactar-se o sobrenadante com um permutador aniónico e reco
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Case 14331 lher-se o eluído;
f) removerem-se os contaminantes bacterianos residuais do referido eluído de permuta iónica por cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) de fase inversa, utilizando-se como fase estacionária grupos alquilo Cg-18 num suPor^e sólido e, como fase móvel, um solvente orgânico polar por forma a obter-se um elúido isento de contaminantes bacterianos; e
g) submeter-se o eluído de HPLC de fase inversa a uma diafiltração por forma a obter-se um retido do polipeptídeo R32LA puro.
A concretização preferida da invenção produz polipeptídeo derivado da proteína CS de P. falciparum, como por exemplo R32tet3g, R32NSlg^ ou R32LA, que é pura, isto é, não contém polipeptídeos ou proteínas indesejáveis mensuráveis, 2 ng/mg ou menos de ADN e menos de 10 Unidades de Endotoxina (EU)/mg. Como aqui utilizado, o termo Unidade de Endotoxina refere-se à actividade num peso definido de Endotoxina/padrão Norte-Americano. Por definição 1,0 EU é igual a 0,2 ng de Endotoxina do Padrão Norte-Americano, lote EC-2. 0 Office A Biologics (U.S.F.D.A.) estabelece este padrão e mantém a continuidade da EU com lotes sucessivos de Endotoxina/Padrão Norte-Americano.. Esses polipeptídeos puros não causam efeitos adversos num paciente, devidos a contaminantes, após administração numa quantidade que seja eficaz para produzir a resposta imune desejada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Podem purificar-se de acordo com o processo da presente invenção polipeptídeos imunogénicos compreendendo as repetições de tetrapeptídeos da proteína de superfície do estado de esporozoito (CS) de P. falciparum, tais como os descritos em EP-A-192626 e EP-A-191 748, acima referidas. Estas incluem polipeptídeos Rtet32, polipeptídeos Rtet 86, polipeptídeos RG, polipeptídeos RLR, polipeptídeos NS1R, polipeptídeos RNS1, polipeptídeos RNSlgj· e polipeptídeos RN. Este processo é especialmen-
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Case 14-331 te útil para a preparação da vacina contra a malária a partir
te eficazes na produção de resposta imune, em mamíferos, a esporozoitos de P. falciparum. Descrevem-se R32 tet e R32LA em EP-A-192 626 (U.S.S.N. 699 116 e EP-A-191 748 (U.S.S.N. 699 115) acima citados.
R32NSlg^ compreende a mesma sequência antigénica R32 fundida aos aminoácidos 80 N-terminal de NS1. Na fusão, R32 funde-se ao segundo aminoácido de NS1; no C-terminal funde-se o aminoácido 81 de NS1 a uma sequência de leu-val-asn. Assim, a sequência é:
em que a sequência NSlon é
-asp-pro- -met-leu-val-asn-C
Preparou-se este polipeptídeo utilizando as técnicas referidas nos documentos das patentes mencionadas acima.
Tal como notado acima, o processo da presente invenção envolve submeter-se um lisado de células clarificado, derivado de uma cultura de células hospedeiras de E. coli recombinantes e contendo contaminantes pirogénicos, proteicos e de ácido nucleico de origem celular, a uma série de procedimentos de precipitação e cromatografia incluindo cromatografia liquida de alto rendimento (HPLC) de fase inversa para se obter o polipeptídeo imunogénico pretendido substancialmente livre de contaminantes.
hospedeiro E. coli recombinante é preparado por técnicas de ADN recombinante convencionais. Ver, por exemplo, Young et al. Scíence, 228: 95θ (1985), que aqui se incorpora como referência. Essas células recombinantes são cultivadas em meios nutrientes contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e minerais, na presença de oxigénio, por técnicas de fermentação convencionais. Após fermentação durante um período de tempo suficiente para exprimir o polipeptídeo CS, imunogénico, recolhem-
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Case 14331
-10-se as células por centrifugação ou filtração. A pasta de células resultante é em seguida ressuspensa e submetida a lise.
A lise de células pode ser conseguida por adição de lisozima ou outro agente de lise ou permeabilização, a uma suspensão tamponada do agregado celular a uma concentração de cerca de 100-300 g/1, com base no peso de agregado celular húmido. 0 peso do agregado celular em operações à escala industrial pode variar de 800-3000 g, dependendo do polipeptídeo particular que sofre a purificação. Um tampão de lise adequado é Tris (50 mM), EDTA (2 mM), ditiotreitol (DTT) (0,1 mM), e glicerol (5%) com pH de 8,0. Alternativamente, pode utilizar-se um tampão compreendendo fosfato de sódio (50 mM), EDTA (2 mM) e glicerol (5%), com um pH de 6,5· Pode também efectuar-se a lise por meios de destruição mecânica ou ultrassónicos na ausência de lisozima. Têm sido obtidos resultados satisfatórios à escala industrial usando uma esfera de vidro Dynomill (Impandex, Maywood, NJ) ou um homogeneizador de Gaulin (APV Gaulin, Inc., Everett, Massachusetts). Se desejado, pode utilizar-se, uma combinação de meios de lise químicos, mecânicos e/ /ou ultrassónicos.
Pode tratar-se a suspensão lisada com um detergente, como por exemplo desoxicolato; por exemplo sal de sódio, (approx. 0,1%), para evitar a ligação do polipeptídeo imunogénico desejado com os resíduos celulares, embora este procedimento não seja necessário. 0 desoxicolato pode ser incorporado no tampão de lise, se desejado. Clarifica-se a suspensão lisada, por exemplo, por centrifugação contínua a 39*900 x g num rotor Beckman JCF-Z a um caudal de 100-500 ml/min.
Trata-se em seguida o extracto clarificado para precipitar selectivamente os contaminantes bacterianos, isto é, proteínas e, preferivelmente, também ácidos nucleicos. Essa precipitação pode ser efectuada por vários meios. Por exemplo, os polipeptídeos Rtet^, Rtetgó, RLA, RG, RN, RNS1, RNSlgl e NS1R são estáveis termicamente e solúveis a cerca de 80°C. Portanto, os contaminantes proteicos bacterianos são convenientemente
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Case 14331 —11— e selectivamente precipitados por aquecimento do lisado celular clarificado a aproximadamente 75“90°C, preferivelmente a cerca de 8o°C. Como exemplo adicional, podem utilizar-se agentes químicos que precipitam selectivamente ácidos nucleicos. Por exemplo, a polietileno-imina (PEI), a cerca de 0,1 a 1$, remove a maior parte do ADN e ARN de E. coli e parte das proteínas bacterianas solúveis. Numa concretização da invenção, trata-se o extracto celular clarificado com PEI por adição de PEI após destruição. Outros procedimentos de precipitação selectiva que podem ser usados incluem a salificação com sais sulfato, fosfato ou citrato com catiões monovalentes como amónio, potássio ou sódio; precipitação com solventes orgânicos como álcool C2.-3’ acetonitrilo, ou tetra-hidrofurano; precipitação com polímeros orgânicos como polietilenoglicol ou com polielectrólitos carregados como poliacrilatos, sais do ácido caprílico e rivanol; e precipitação por ajuste do pH. Através desses passos de precipitação selectiva, a maior parte dos antigenos da malária, por exemplo, superior a 75$, permanece em solução.
Dado que a região de repetição de P.falciparum é muito estável a alta temperatura, a precipitação por calor é especialmente útil na purificação dos peptídeos não possuindo sequências menos estáveis ao calor neles fundidas, por exemplo, os polipeptídeos RLA, RG e RN. A precipitação por polietileno-imina, contudo não foi muito eficaz como passo inicial de purificação no caso de outro polipeptídeo fundido na sequência tet^g.
Após o passo inicial, precipita-se selectivamente o antigeno da malária. A técnica preferida para precipitar selectivamente o antigeno da malária é a salificação, como acima descrita, usando de preferência sulfato de amónio.
Mistura-se o sulfato de amónio com o sobrenadante da primeira precipitação selectiva para uma concentração suficiente para a precipitação selectiva do polipeptídeo derivado da proteína CS de P. falclparum. No caso de R32tet32, a concentração de sulfato de amónio deve ser entre 25$ e 40$ de saturação; no
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Case 14331
-12caso de R32LA a adição entre 25% e 60% da saturação é útil para a precipitação selectiva do polipeptídeo desejado; no caso da construção de NS1, é útil sulfato de amónio a 20-40% da saturação. A adição de sulfato de amónio pode efectuar-se em fases, em que se removem as proteínas precipitáveis por saturação com sulfato de amónio em cada fase escolhida. Adiciona-se de preferência sulfato de amónio durante um período de 60 minutos a 4°C, com agitação durante mais 30 minutos a 4°C. A suspensão é em seguida centrífugada para se obter um agregado contendo o polipeptídeo imunogénico bruto. Como resultado desta precipitação selectiva, substancialmente todo o polipeptídeo imunogénico está contido no agregado. Redissolve-se em seguida o agregado de sulfato de amónio num tampão adequado.
Submete-se em seguida o polipeptídeo redissolvido a uma terceira precipitação selectiva concebida para remover os ácidos nucleicos bacterianos. Este passo é de preferência efectuado por acidificação. Na prática, para o R32tet^2? aumenta-se significativamente a força iónica do lisado de células parcialmente purificado, em conjunção com o tratamento ácido, por adição de um sal com elevada solubilidade no lisado de células. Os sais adequados para este fim incluem MgGlg 2-4 M ou NaCl 2-4 M, ou suas misturas. Em seguida, ajusta-se o lisado de células a pH de cerca de 2,0 com um ácido adequado, como por exemplo ácido trifluoroacético, ácido fosfórico ou ácido clorídrico. Os ácidos nucleicos precipitados pelo tratamento ácido podem ser facilmente removidos do lisado de células por centrifugação.
A purificação parcial do lisado de células, do modo agora descrito, reduz significativamente a quantidade de polipeptídeos e proteínas celulares inicialmente presente no lisado celular. Após os passos de precipitação selectiva, purifica-se adicionalmente a solução contendo o polipeptídeo imunogénico por uma série de dois procedimentos cromatográficos, nomeadamente, cromatografia de permuta iónica e cromatografia de fase inversa.
A separação de contaminantes residuais bacterianos do lisado celular parcialmente purificado por permuta iónica é efec
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Case 14331
-13tuada usando urna coluna microparticulada contendo grupos de permuta catiónica e aniónica, tais como carboximetil (CM), sulfopropilo (SP), dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo quaternário (QAE), ligados a uma matriz adequada. 0 permutador iónico deve ter uma matriz suficientemente porosa e aberta para a passagem do polipeptídeo a purificar. Geralmente terá um comportamento satisfatório um permutador iónico com um tamanho de partículas de 10-100 jum de diâmetro, com um limite de exclusão de 10 daltons. Foram obtidos resultados particularmente bons usando um suporte de permuta catiónica de CM, como por exemplo CM-Trisacryl M (LKB Products, Bromma, Suécia) para permuta iónica de R32tet32* A cauda terminal-C altamente básica liga-se fortemente ao suporte-CM, efectuando a separação do polipeptídeo pretendido de outros oontaminantes então presentes no lisado ce lular. A separação dos ácidos nucleicos de um lisado celular parcialmente purificado contendo o polipeptídeo R32LA/cohseguida num suporte de permuta aniónica, DEAE-Trisacryl M (LKB Pro ducts, Bromma, Suécia). No caso de RBBNSlgp foram obtidos resultados particularmente bons usando o suporte de permuta catiónica, agarose reticulada com sulfopropil-Sepharose (Phar macia, Piscataway, New Jersey).
Faz-se contactar a solução do peptídeo imunogénico com o suporte de permuta iónica e em seguida elui-se dele. Pode e fectuar-se a eluição usando uma solução tampão adequada que produz uma fracção contendo o polipeptídeo imunogénico pretendido, substancialmente livre de contaminantes do tipo polipeptídeo, proteína e ácido nucleico. As soluções tampão usadas como eluentes nesta invenção são as largamente utilizadas em cromatografia de permuta iónica de substâncias biológicas. Utiliza-se como vantagem a eluição de gradiente de um suporte de permuta catiónica com certos polipeptídeos derivados da proteína CS de
P. falciparum contendo a cauda tet. Para o polipeptídeo R32LA, os contaminantes de tipo ácido nucleico são adsorvidos na matriz de permuta iónica, enquanto o polipeptídeo pretendido passa através da permuta iónica e é recolhido no eluato e lavado .
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Case 14331
-14Este efluente pode ser feito passar sucessivas vezes através da mesma coluna de permuta iónica, ou através de colunas separadas com diferentes enchimentos.
No caso de R32NSlg^, prefere-se adicionar um caótropo, por exemplo, ureia, tiocianato, guanidina, cloreto de guanidinío ou etileno glicol, ao sobrenadante contendo o peptídeo da precipitação salina e ajusta-se depois o pH do sobrenadante a 4 com, por exemplo, hidróxido de sódio, antes da permuta iónica. 0 caótropo preferido é a ureia numa concentração final de cerca de 3 lí. 0 caótropo e o ajuste de pH é útil no rompimento dos agregados de peptídeo. Após adsorção num suporte de permuta catiónica, lava-se o suporte com tampão a pH 4 e a pH 5, por exemplo, acetato de sódio 5θ mH. Em seguida elui-se R32NSlg^ cora sal a cerca de pH 6,5, por exemplo com fosfato de sódio 20 mH e cloreto de sódio 0,5 H em DTT 10 mlJ.
lisado de células, após tratamento para remoção dos contaminantes do tipo polipeptídeo, proteína e ácido nucleico, como acima descrito, fica substancialmente livre de contaminantes bacterianos residuais, incluindo material pirogénico, como por exemplo endotoxinas celulares, e incluindo também outros contaminantes residuais, usando HPLC de fase inversa.
Por exemplo, HPLC de fase inversa foi importante para a resolução de antígenos muito parecidos na mistura de produtos. Um bom exemplo da resolução de componentes é a purificação de R32LA. Neste caso, mesmo se a espécie mais importante na mistura tiver um teor superior a 95%, consegue-se a separação de 2 proteínas que difiram de 3 resíduos de aminoácidos. Conseguiram- se separações semelhantes durante a preparação de outras proteínas em que se removeram derivados C-terminais truncados ou oxidados, por HPLC de fase inversa.
A cromatografia de fase inversa envolve o contacto de uma solução de uma proteína desejada com um sólido, suporte hidrofóbico ou fase estacionária, sendo a proteína adsorvida no suporte, Eluí-se em seguida a proteína, após lavagem, lavando o suporte com um solvente orgânico polar, isto é, a fase móvel.
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Case 14331
-15A fase estacionária compreende preferivelmente um suporte como por exemplo alumina, ou um suporte com base em sílica, sendo o último preferido, a que se ligam vários grupos orgânicos não-polares. Essas fases ligadas podem ser preparadas, por exemplo, fazendo reagir os grupos de superfície silanol na sílica com um organoclorossilano, como se conhece bem na técnica. Os suportes com base em sílica incluem, por exemplo, partículas esféricas de sílica, partículas irregulares de sílica ou substratos particulados revestidos com sílica. 0 tamanho de partícula e a porosidade devem ser adequados para a separação do polipeptídeo específico que se pretende purificar. A separação de contaminantes de polipeptídeos imunogénicos por HPLC de fase inversa é efectuada preferivelmente utilizando uma fase estacionária escolhida do grupo de grupos alquilo C2“^18’ Pr®ferivelmente, num suporte com base em sílica.
A fase móvel escolhida para HPLC de fase inversa deve ter baixa toxicidade e viscosidade e ser facilmente disponível na forma pura. A fase móvel pode ser escolhida do grupo dos álcoois inferiores miscíveis em água, por exemplo, metanol, n-propanol, ou isopropanol, tetra^iidrofurano, dioxano ou acetonitrilo. A fase móvel preferida para uso na presente invenção é escolhida do grupo de álcoois C^-C^, acetonitrilo ou tetra-hidrofurano. A fase móvel escolhida dependerá primariamente da força e selectividade de um dado solvente para o polipeptídeo imunogénico que se pensa purificar.
Verificou-se que a eluição por gradiente, utilizando por exemplo 0-35/ de isopropanol em ácido, por exemplo, ácido heptafluorobutírico, ácido fosfórico, ácido acético ou ácido trifluoroacético, era eficaz na purificação de R32NSlg^, R32tet^2 e R32LA. Prefere-se o ácido trifluoroacético, 0,1 a 0,2 / em volume.
Em condições óptimas, como a seguir exemplificado, a HPLC de fase inversa é susceptivel de conseguir uma redução de 10^ do teor de endotoxina de um lisado celular parcialmente purificado, num passo único. Efectuam-se também diafiltração e fil
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Case 14331
-16tração estéril no eluato da coluna de HPLC de fase inversa como passo final de purificação para a remoção de ácidos e solventes orgânicos usados em HPLC e para ajustar pH a pH 6-8.
Podem utilizar-se vários outros procedimentos em ligação com o processo da presente invenção, embora esses outros procedimentos não sejam necessários para conseguir um produto altamente puro de qualidade farmacêutica.
Esses procedimentos podem ser utilizados entre, antes ou após os passos do processo acima descritos. Um desses passos óptimos é a diafiltração.
termo diafiltração aqui utilizado no sentido reconhecido na técnica, refere-se a uma forma de diálise continua que é extremamente eficaz para conseguir muitas permutas de tampão. A diafiltração é preferivelmente efectuada através de uma membrana celulósica ou ultrafiltro. As membranas/filtros adequados são os que têm um peso molecular (W) de cerca de 1000 e que sSo escolhidos entre os que possuem um tamanho de poros até 2,4 jum de diâmetro. São comercializáveis um certo número de sistemas diferentes adaptáveis a diafiltração, como por exemplo o sistema de cartucho de espiral dupla 10 K Amicon. No processo da presente invenção, pode efectivamente utilizar-se a diafiltração usando um tampão de acetato de amónio contendo DTT a cerca de pH 5? na purificação do polipeptídeo R32tetgg, antes da permuta iónica, de modo a remover contaminantes de baixo peso molecular. Após purificação, pode submeter-se a diafiltração a solução contendo o polipeptídeo puro para remover os sais residuais.
Outro procedimento que se verificou ser útil para o rompimento de complexos de proteína-polinucleótido e, portanto, para a remoção de contaminantes de ácido nucleico, é o tratamento do antigeno impuro com nucleases. A digestão com nuclease pode ser incorporada no processo da invenção imediatamente a seguir à lise de células ou após purificação parcial, como por exemplo após aquecimento e/ou após precipitação com sulfato de amónio. ror exemplo, pode submeter-se a diafiltração 0 isolado
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Case 14331
-17de sulfato de amónio, como acima descrito, com a excepção de se escolher o tampão pela sua compatibilidade com a actividade da enzima nuclease e com o antígeno. Uffl tampão adequado para este fim é o acetato de amónio 10 mM e ZnSO^ 20 mM (pH ,0).
Após a diafiltração, adiciona-se uma enzima nuclease ao retido contendo a proteína no dispositivo de diafiltração. Após um período de espera com a duração suficiente para permitir a hidrólise do ácido nucleico para nucleotidos de baixo peso molecular, continua-se a diafiltração utilizando um tampão altamente salino para enfraquecer as interacções iónicas entre os fragmentos de nucleótido e o antígeno. Durante esta fase, removem-se os fragmentos do nucleótido de baixo peso molecular, no produto obtido da permeação enquanto o antígeno é retido no produto retido. A diafiltração conclui-se usando um terceiro tampão que é o mesmo utilizado no procedimento original.
Pode utilizar-se qualquer enzima ou combinação de enzimas com actividade de fosfodiesterase com substratos de ácido nuclei co em tampões compatíveis com o antígeno. Preferem-se as fosfodiesterases chamadas nucleases que hidrolisam ADN e ARN de cadeia simples e dupla, e actuam por mecanismos endo- e exo-hidrolíticos. A nuclease P^ produzida por Penicillium citrinum e nuclease de Micrococos são exemplos de nucleases preferidas.
Pode utilizar-se a cromatografia de exclusão de tamanhos como auxiliar de HPLG de fase inversa na prática da presente invenção.
A cromatografia de exclusão de tamanhos, quando utilizada, pode ser convenientemente efectuada usando uma matriz particulada porosa com uma gama de trabalho de 1000 a 300 000 daltons e tamanho de partícula entre cerca de 10 e cerca de 100 de diâmetro. Os enchimentos de coluna para cromatografia de exclu*são de tamanhos adequada para uso na presente invenção incluem SpherogelR TSK 2000 SW e 3000 SW, (Beckman Instruments, Berkeley, CA) que são partículas de sílica esféricas com um revestimento de polímero hidrofílico compatível com a proteína e um tamanho médio de partícula de 13 jhm. Podem também usar-se outros mate-
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Case 14331
-18riais de exclusão de tamanho comercializados, como Sephadex ^-50, G-75, G-100 ou Sephacryl®· 3-200 (Pharmacia, Pisc.ataway, NJ) ou BiogelR P-10 a Ρ-6θ (BioRad, Richmond, CA).
ção
Assim, a compreende purificação de R32tet32 Ρθΐο processo preferivelmente os seguintes passos:
de inven(1) lise (2) tratamento térmico (3) precipitação com sulfato de amónio (4) precipitação ácida (5) diafiltração (6) permuta iónica (7) HPLC de fase inversa ¢8) diafiltração e (9) filtração es téril. A purificação de R32LA é efectuada preferivelmente pelos passos seguintes: (1) lise (2) tratamento térmico (3) pre cipitação com sulfato de amónio (4) precipitação ácida (5) per muta iónica (6) HPLC de fase inversa (7) diafiltração e (8) filtração estéril. A purificação de R32NSlg^ é preferivelmente efectuada pelos passos seguintes: (1) lise (2) precipitação com PEI (3) precipitação com sulfato de amónio (4) precipitação ácida, (5) permuta iónica (6) HPLC de fase inversa (7) diafiltração e (8) filtração estéril.
Os seguintes exemplos são ilustrativos, mas não limitati vos, do processo da invenção. Os exemplos 1 e 2 descrevem a fermentação e colheita de células de uma célula hospedeira E.co· li recombinante produtora de R32tet32·
Exemplo 1 - Fermentação
Preparou-se um banco de células mestras escolhendo um clone> resistente à canamicina, de Escherichia coli K12, estirpe AR58 contendo o plasmídeo pR32tet32 kn de placas de ágar contendo $0 Jig/ml de sulfato de canamicina (kn) e incubou-se a 32°C. A estirpe AR58 é um lisogénio de 1857· pR32tet32kn é um derivado de pASl, que é descrito em Rosenberg, Patente Norte-Americana 4 578 355· 0 vector é substancialmente descrito em Young et al.,
Science, 228; 958 (1985), com a excepção de se ter substituído a resistência à ampicilina por resistência à canamicina em pASi. Congelou-se a -65°C o banco de células mestras para armazenagem.
Preparou-se um banco de células de serviço a partir do
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Case 14331
-19banco de células mestras e congelou-se a -65°C e armazenou-se.
Preparou-se um meio de cultura de nucleação com glicerol (26 g), extrato de levedura (24 g), triptona (12 g), K2HP04 (15,3 g), KH2P04 (1,7 g), (NH4)2S04 (2,0 g); PPG 2000 (0,5 ml), canamicina (apenas agitando o frasco; 5θ,θ )ig/ml), e água desionizada suficiente para levar o volume até um litro. 0 pH do meio de cultura de nucleação foi de 7,1-7,2.
Removeu-se um frasco de um banco de células de serviço da armazenagem em azoto líquido e levou-se à temperatura ambiente. Transferiu-se uma alíquota de suspensão descongelada para cada um de dois frascos de agitação contendo meio estéril de nucleação a que se adicionou kn estéril. Incubaram-se os frascos de agitação num agitador giratório durante aproximadamente 15 horas a 32°C. Removeu-se uma amostra da cultura de cada frasco de agitação e mediu-se a densidade óptica, como descrito no exemplo 4 a seguir. Utilizou-se o valor obtido para calcular 0 volume de cultura de nucleação necessária para produzir uma densidade óptica específica (superior a 0,1) no meio de fermentação após inoculação. Transferiu-se o volume calculado do inóculo para um frasco estéril com aspiração.
Esterilizou-se in si tu a 121°0com agitação durante 15 minutos o fermentador contendo meio de cultura incompleto, obtido dos mesmos componentes do meio de nucleação de cultura, mas omitindo os sais de fosfato de potássio. Esterilizou-se separadamente por autoclavagem uma solução dos sais de fosfato de potássio. Adicionou-se assepticamente a solução estéril ao meio de cultura incompleto estéril no fermentador. A composição resultante do meio completo foi/descrita acima para 0 meio de nucleação da cultura.
Conseguiu-se a inoculação do fermentador transferindo por bomba o inóculo preparado acima, do frasco de aspiização através de uma boca ãe adição em condições assépticas.
Durante o crescimento, controlou-se a temperatura a 32°, controlou-se o pH acima de 6,5 pela adição de NH40H, estéril, e controlou-se o oxigénio dissolvido acima de 15$ de saturação.
66.135
Case 14331
20Removeram-se amostras durante a fase de crescimento para determinar a densidade óptica. Quando se atingiu a densidade adequada (superior a DO 12,0), induziu-se a expressão do antigeno aumentando a temperatura da cultura de 32°C para 42°C. Ver Rosenberg et al., Meth. Enzymol. 101: 123 (1983). Continuou-se a fermentação nestas condições durante 90-240 minutos.
Exemplo 2 - Colheita de células
Arrefeceu-se o caldo da cultura a temperatura inferior a 20°C e transferiu-se do fermentador para um concentrador de fibras ocas, Amicon DC10L, equipado com um cartucho de 0,1 jum. Quando a transferência se completou, colocou-se o concentrador numa sala arrefecida a 4°C. Prosseguiu-se a filtração até o volume retido ser aproximadamente 15% do volume de cultura. Após se terminar a filtração, drenou-se o retido para um frasco de aspiração. Desligou-se o frasco de aspiração e colocou-se numa câmara biológica de Classe II, tipo B. Colocaram-se os conteúdos do aspirador em garrafas e centrifugou-se a suspensão. Removeu-se o sobrenadante e dividiram-se/a|regados por vários recipientes. Armazenaram-se os agregados de célula a -70°C até à iniciação do processo de purificação.
Exemplos 3“9 descrevem um procedimento de isolamento e vários procedimentos de purificação para a recuperação de polipeptídeo R32tet^2 purificado.
Isolamento de R32tet^2 de células produtoras
Descongelou-se por suspensão, à temperatura ambiente, um agregado de células, preparado da forma descrita no exemplo 2 acima, e pesando 20 g, num tampão de lise obtido de Tris HC1 50 mM EDTA 2 mM, DTT 0,1 mM, glicerol a 5% (pH θ) para uma concentração de aproximadamente 1 g/5 ml, com base no peso de agregado de células húmido. Todos os passos subsequentes foram e
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Gase 14331
-21fectuados a 4°G a menos que se indique o contrário.
Adicionou-se lisozima à suspensão de células para uma concentração final de 0,2 mg/ml e agitou-se a suspensão durante 30 minutos. Misturou-se a solução três vezes durante intervalos de um minuto cada; num agitador misturador Waring e em seguida tratou-se por sônioação por três vezes com intervalos de um minuto cada, utilizando um sonicador Branson Modelo 35θ regulado a 40% do ciclo de serviço e com um valor de saída de 6. Adicionou-se desoxicolato (DOC) à suspensão lisada até uma concentração de 0,1% (p/v). Agitou-se a mistura durante 30 min e em seguida centrifugou-se a 10 000 x g numa centrifugadora Sorvall Modelo RC-5B durante 60 minutos.
Aqueceu-se o sobrenadante obtido por centrifugação num banho de água ebuliente durante 10 minutos com agitação e em seguida arrefeceu-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Centrifugou-se a suspensão tratada termicamente como acima indicado durante 30 minutos. Adicionou-se sulfato de amónio granular lentamente com agitação ao sobrenadante tratado termicamente até uma concentração de 15-25% da saturação durante um intervalo de 15 minutos e agitou-se a solução durante 30 minutos. Centrifugou-se de novo a suspensão como acima indicado durante 30 minutos para se obter um granulado contendo R32tet^2 bruto. Ressuspendeu-se o agregado num quinto do volume do tampão de lise.
Exemplo 4 - Purificação de R32tet^2 P°r
Precipitação Ácida, Cromatográfia de Permuta Iónica e HPLC de Ease Inversa
Ajustou-se a solução resultante do exemplo 3 a uma concentração 1-2 M em cloreto de magnésio, enquanto se agitava a 4°C. Ajustou-se o pH a 2 com ácido trifluoroacético e agitou-se a solução durante várias horas. Removeram-se os ácidos nucleicos precipitados por centrifugação durante 30 minutos.
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Case 14331
-22Submeteu-se a cromatografia em CM-Trisacryl Μ o sobrenadante tratado com ácido. Transferiu-se com uma bomba o sobrenadante para uma coluna de CM-Trisacryl M (carregada com 1-8 mg de proteína por ml de gel) que tinha sido previamente equilibra da com acetato de amónio 10 mM (pH 5)> a um caudal de 60 cm3/h. Lavou-se a coluna com acetato de amónio 10 mM (pH 5)· Eluiu-se o produto com ou um gradiente linear de cloreto de amónio 0-0,5 M ou um gradiente em passos de cloreto de amónio 0,3 e depois 0,6 M. 0 produto desejado eluia para sal 0,5 M no gradiente linear e sal 0,6 M no gradiente em passos como determinado por monitoração a 280 nm.
Fez-se a diálise do eluido da coluna permutadora de iões contra um tampão fosfato 10 mM (pH 6,5) e formou-se 10 mM em DTT. Ajustou-se a solução dialisada a 5$ de ácido acético e cromatografou-se em Vydac 300 Angstrõm C-4, coluna de fase inversa de 5 (0,46 x 25 cm) usando um gradiente de propanol-2 em ácido acético a 5$· 0 produto desejado elui-se para uma con centração de solventes de 3θ$ como determinado por monitoração a 229 nm. Dialisou-se o produto desejado contra fosfato 10 mM livre de pirogénio, tampão cloreto 0,15 M (pH 6,5). Este procedimento produziu R32tet^2 possuindo 6 Unidades de Endotoxinas por miligrama de proteína e cerca de 0,001$ (p/p) de ADN.
Exemplo 5
Tratamento com Nuclease
Ré dissolveu-se um precipitado de sulfato de amónio do po-
mM, DTT 10 mM (pH 8). Submeteu-se a solução a diafiltração contra 10 volumes de acetato de amónio 10 mM, sulfato de zinco 20 mM (pH 5) usando um sistema de ultrafiltração em espiral (Amicon S1Y10) com um valor de corte de 10 000 dalton. Parou-se a bomba de recirculação e abriu-se o vaso de recirculação contendo o retido. Adicionou-se nuclease P^, uma enzima requerendo zinco, ao vaso de recirculação até uma concentração de 10 mg/ml. Incubou-se o retido durante 1 hora a 37°C com agitação. Retomou-
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Case 14331
-23-se a diafiltração usando 10 volumes de liígC^ 2 M seguido de 10 volumes de NH^OAC 10 mM (pH 5)· Purificou-se em seguida o retido pelos mesmos procedimentos de permuta iónica (CM-) e cromatograf ia-HPLC.
Comparou-se a eficiência do procedimento de diafiltração com nuclease com o procedimento de diafiltração convencional usando um isolado de sulfato de amónio que contém tipicamente 100 000 ng de ADN/rag de proteína. 0 procedimento de diafiltração com nuclease dá um produto contendo 100 ng de ADN/mg de proteína comparado com 14 000 ng de ADN/mg de proteína no produto do procedimento convencional de diafiltração. Este facto representa uma redução^ de 1000 vezes, em ácido nucleico, como resultado do passo de diafiltração de nuclease e redução de 140 vezes no ADN contaminante sobre o processo convencional de diafiltração.
Os exemplos 6 e 7 descrevem procedimentos de isolamento e purificação à escala industrial para os polipeptídeos R32tet^2 e R32LA, respectivamente.
Exemplo 6 - Procedimento de Isolamento e
Purificação à Escala Industrial do Polipeptídeo R32tet^2
Descongelou-se para a temperatura ambiente um agregado celular, preparado como descrito no exemplo 2, acima, e pesando 26OO g, e suspendeu-se num tampão obtido de Tris 5θ EDTA 2 mM, DTT 0,1 mH, glicerol a 5$ (pH 8,0) até uma concentração de aproximadamente 200 g/1, com base no peso de agregado de células húmido. Adicionou-se lisozima até uma concentração final de 0,15 mg/ml e incubou-se a mistura durante 30 minutos a 4°C. Transferiu-se esta suspensão por bomba através de um aparelho de rompimento de células com esferas de vidro Dynomill, usando esferas de 2 mm, a um caudal de 100 ml/min, refrigerando a 4°C. Tratou-se a suspensão lisada com desoxicolato a 0,1 fo durante 30 minutos a 4 °C seguido de uma centrifugação contínua a 39900 x g num rotor Beckman JCF-Z, a um caudal de 250 ml/min.
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Case 14331
-24Diluiu-se o sobrenadante obtido por centrifugação para aproximadamente 150 g/1 e aqueceu-se num banho de vapor a uma temperatura de aproximadamente 8o°C a 9θ°0 e em seguida arrefeceu-se para 15“35°C. Centrifugou-se esta suspensão tratada termicamente, como acima descrito.
Adicionou-se sulfato de amónio granular durante um período de 3° minutos até 25% de saturação, centrifugou-se e removeu-se o precipitado. Adicionou-se lentamente ao líquido sobrenadante sulfato de amónio granular com agitação até uma concentração de aproximadamente 40% da saturação, durante um período de 30 minutos a 4°C. Centrifugou-se a suspensão como acima descrito, para se obter um agregado contendo o polipeptídeo bruto R32tet^2· Suspendeu-se 0 agregado de sulfato de amónio num quinto do volume de tampão Tris 10 mH contendo DTT 10 mM, com agitação durante a noite a 4°C e centrifugou-se a 14000 x g a 4°C durante 3θ minutos.
Ajustou-se o sobrenadante do agregado redissolvido a 2 M em MgCl2 e ajustou-se a pH 2 com ácido trifluoroacético, e agitou-se a 4°C durante 2 horas. Removeram-se os ácidos nucleicos precipitados, usando centrifugação a 14 000 x g a 4°C durante 30 min.
Submeteu-se a diafiltração o sobrenadante da precipitação ácida com 10 volumes de tampão de acetato de amónio 10 mlí pH 5,θ contendo DTT 10 mH usando um sistema de cartucho espiral duplo 10 K Amicon.
Transferiu-se por tomba o retido diafiltrado para uma coluna de 1,2 litros de CM-Trisacryl M a 100 ml/min e eluiu-se a coluna com um gradiente em passos de cloreto de amónio (0; 0,3 e 0,6 M) em tampão de acetato de amónio 10 mM pH 5· 0 produto desejado eluia a cloreto de amónio 0,6 M.
Tornou-se o produto de permutação iónica 10 mM em DTT e 5% em ácido acético e cromatografou-se em enchimento de Vydac 300 Angstrom C-4^15 a 20 jum;de fase inversa numa coluna de 5,1 x 30 cm com um gradiente de isopropanol em ácido acético a 5% usando uma unidade de HPLC Rainin Autoprep a 100 ml/min. 0 pro66.135
Case 14331
-25duto eluia a aproximadamente 18% de isopropanol como determinado por monitoração a 28o nm.
Diafiltrou-se o produto obtido de fase inversa com 7 1 de um tampão PBS livre de pirogénio estéril (fosfato 10 mM, pH 6,6, cloreto de sédio 150 mH, filtrado através de um cartucho de fibra oca 10 K) usando um cartucho espiral 10 K Amicon para se obter o produto bruto estéril, após filtração estéril.
Os resultados dum lote de produção típico usando o procedimento acima descrito são apresentados na tabela II a seguir.
TABELA II
Análise do Lote de Produção do Antígeno
R32tet32
| Passo | Proteína Totala (g) | Antígenob ui—. | Endotoxinac LOG EU/mg | ADNd ng/mg |
| Lisado | 368.0 | 32.0 | 10.0 | 600000 |
| Sobrenadante | ||||
| aquec ido | 116.0 | 10.0 | 10.0 | 1400000 |
| Agregado de sul- | ||||
| fato de amónio | 11.0 | 3.4 | 6.0 | 90000 |
| Sobrenadante ácido 6.0 | 3.5 | 4.5 | <0.5 | |
| •‘-'iafiltrado | 3.3 | 2.5 | 5.5 | <20 |
| Permuta iónica | 1.5 | 2.0 | 2.6 | 40.5 |
| Fase inversa | 1.3 | 1.9 | 0.5 | 40.5 |
| Produto final | 1.0 | 1.3 | 0.8 | 0.5 |
a - Determinada por análise de Lowry usando albumina como padrão; níveis mais baixos de proteína total do que de antígeno em fases posteriores do procedimento atribuídas a resposta de Lowry inferior ao antígeno.
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Case 14331
-26b - Níveis de antigeno estimados usando ensaios de fluorescência de partículas com correcção por análise de HPLC.
c - Determinada pelo ensaio de coagulação de lisado de Limulus Amebocyte e expresso sob a forma de log do EU total (unidades de endotoxinas) por mg de antigeno.
d - Determinado em fases anteriores do procedimento por ensaio de colorimetria de difenilamina e em fases posteriores por hibridação , e expressa em termos de ng de ADN por mg de antigeno.
Exemplo 7 - Procedimento de Isolamento e Purificação à Escala Industrial para o Polipeptídeo R32LA
Descongelou-se à temperatura ambiente um agregado de células obtido de uma cultura de células de E.coli produtora de R32LA cuja sequência é N-Met-Asp-Pro /~(Asn-Ala-Asn-Pro(Asn-Val-Asp-Pro)_72 - Leu-Arg-C), e pesando 1000 g, e suspendeu-se num tampão obtido de fosfato 5θ mM, EDTA 2 mM, glicerol a 5% contendo 0,1% de desoxicolato (pH 6,5) até uma concentração de aproximadamente 200 g/1, com base no peso do agregado de células húmido. Fez-se passar a suspensão, com o auxilio de uma bomba, através de um aparelho de rompimento de células com esferas de vidro Dynomill usando esferas de 0,2 mm a um caudal de 100 ml/min, refrigerando a 4°C. Clarificou-se a suspensão lisada por centrifugação contínua a 39900 x g num rotor Beckman JCF-Z a um caudal de 300 ml/min.
Aqueceu-se 0 sobrenadante obtido por centrifugação num banho de vapor a aproximadamente 8o°C e em seguida arrefeceu-se para 15°C. Centrifugou-se a suspensão tratada terraicamente como acima descrito.
Adicionou-se lentamente com agitação sulfato de amónio granular ao sobrenadante tratado termicamente até uma concentração
66.135
Case 14331
-27de 25% de saturação durante um período de 3θ minutos a 4°C. Centrifugou-se a suspensão a 39900 x g a 200 ml/min no rotor Beckman JCF-Z para se obter um sobrenadante contendo o polipeptídeo R32LA bruto. Adicionou-se lentamente cora agitação sulfato de amónio granular ao sobrenadante tratado termicamente até uma concentração de 60% da saturação durante um período de 30 minutos a 4°C e agitou-se a solução durante mais 15 minutos a 4°C. Centrifugou-se de novo a suspensão nas mesmas condições para se obter um agregado contendo o polipeptídeo bruto R32LA. Ressuspendeu-se o agregado de sulfato de amónio em um quinto do volume de tampão de fosfato 10 mMjpH 6,5, agitado durante uma hora a 4°C e centrifugou-se a 14 000 x g a 4°C durante 3θ minutos.
Ajustou-se o sobrenadante do agregado redissolvido a pH 2 com ácido trifluoroacético, e agitou-se durante a noite a 4°C. Removeram-se os ácidos nucleicos precipitados usando centrifugação a 14000 x g a 4°C durante 3θ minutos. Neutralizou-se o sobrenadante da precipitação ácida a pH 6,5 por adição gota a gota de hidróxido de amónio 6 M com agitação a 4°C.
Fez-se passar com o auxílio de uma bomba o sobrenadante neutralizado para uma coluna de 2,0 1 de DEAE-Trisacryl M a 100 ml/min e lavou-se a coluna com fosfato 10 mH contendo cloreto de sódio 0,1 M (pH 6,5). 0 eluido e o líquido de lavagem continham o polipeptídeo R32LA. Regenerou-se a coluna com tampão de fosfato 10 mM contendo NaCl 1 M (pH 6,5). Fez-se de novo passar o primeiro líquido de lavagem contendo o polipeptídeo R32LA através da coluna seguido de uma lavagem com fosfato 10 mM contendo NaCl 0,1 M (pH 6,5).
Levou-se o eluído e o líquido de lavagem da coluna de permuta iónica/B,2% em ácido trifluoroacético e cromatografou-se em enchimento Vydac 3θθ Angstrom C-18,15 a 20 jurn^de fase inversa numa coluna 5»1 x 3θ Gm usando um gradiente de isopropanol em ácido trifluoroacético a 0,2% usando HPLC de Rainín Autoprep a 100 ml/min. 0 produto eluiu a aproximadamente 10% de isopropanol como determinado por monitorização a 220 nm.
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Case 14331
-28Concentrou-se o produto da fase inversa para 500 ml e diafiltrou-se com 5 1 de tampão estéril livre de pirogénio (fosfato 10 mMypH 6,6, cloreto de sódio 150 mM, filtrado através de um cartucho de fibras ocas 10 K) usando um sistema de ultrafiltração Lab-20 com duas membranas celulósicas 5 k. Filtrou-se o retido através de um cartucho Millipak 60 para produzir o produto global estéril.
Os resultados de um lote de produção típico usando o procedimento acima descrito são apresentados na Tabela III, a seguir.
TABELA III
Análise do lote de Produção do Antígeno R321A
Passo Proteína Antígeno0 Endotoxina0 ADNa
Total3 (g) (g) 100 EU/mg ng/mg
| lisado | 144.0 | 6.2 | 10 | 1800000 |
| Sobrenadante aque- | ||||
| cido | 23.0 | 4.2 | 7 | 1400000 |
| Sulfato de amónio | 7.0 | 3.0 | 8 | 700000 |
| Sobrenadante ácido | 3.0 | 3.0 | 4 | 8 |
| Permuta iónica | 3.0 | 2.9 | 2 | <1 |
| Fase Inversa | 1.9 | 2.6 | 0 | <1 |
| Produto final | 1.6 | 2.0 | 1 | <1 |
a - Ver tabela II, acima b - antígeno estimado por análise HP1C c - Ver tabela II,acima d - Ver tabela II, acima
66.135
Case 14331
-29Exemplo 8 - Purificação de R32NSlg^
Purifica-se R32NSlg^ substancialmente como descrito no exemplo 6, acima, com a excepção de se ter substituído o tratamento térmico pelo passo de precipitação com polietileno-imina (PEI).
Neste passo, incuba-se o lisado de células clarificado em PEI a 0,5$ com agitação a 2-8°C durante cerca de uma hora, seguindo- se a centrifugação para separar ácidos nucleicos bactéria nos e proteínas precipitados. No segundo passo de precipitação selectiva, R32NSlg1 é recolhida em sulfato de amónio a 20-40$ de saturação. Ressuspende-se o precipitado de sulfato de amónio e precipita-se com ácido sem adição do sal cloreto. Adiciona-se ureia ao sobrenadante até uma concentração final de cerca de 3 M de ureia e ajusta-se o pH a pH 4 com hidróxido de sódio antes da permuta iónica.
Num passo de permuta iónica representativo, utiliza-se uma coluna de sulfopropil-Sepharose. Essa coluna tem uma capacidade superior à da coluna CM-Trisacryl usada nos exemplos precedentes dado que é menos sujeita a protonação a pH baixo. Eluiu-se o antígeno da malária em fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,5 M, DTT 10 mM (pH 6,5).
eluído do passo de permuta iónica é em seguida tratado por cromatografia de fase inversa e filtração substancialmente como descrito no exemplo 6, com a excepção de se utilizar ácido trifluoroacético a 0,2$ em vez de ácido acético, para produzir R32NSlg1 puro.
Os resultados destes exemplos demonstram que se podem produzir antígenos potenciais da vacina de maláda altamente purificados a partir de sistemas de expressão de E» coli. Apesar da composição em aminoácidos invulgar das construções GS de P. falciparum, cada produto acumula até 4-11$ do total de proteína celular e é estável durante e após a indução térmica. A flexibilidade do esquema de purificação resulta das propriedades dominantes da sequência de peptídeos R32. Estas propriedades (esta66.135
Case 14331
-30bilidade à temperatura e a pH ácido) têm como resultado uma purificação substancial usando apenas processos de precipitação.
o factor de purificação foi tão elevado que a perda de proteínas foi tolerável para a produção inicial deste material. Assim, o processo da invenção pode ser utilizado para purificar um polipeptídeo imunogénico derivado de E. coli compreendendo pelo menos 4 repetições consecutivas de PCS de P. falcíparum.
polipeptídeo imunogénico purificado pode ser formulado numa vacina por adsorpção ou mistura num adjuvante adequado de forma a aumentar a sua potência imunizante. Exemplos de adjuvantes adequados incluem hidróxido de alumínio e sulfato de alu mínio.
Embora 0 que anteriormente se disse descreva a invenção e todas as suas concretizações preferidas, deve notar-se que a invenção não se limita às concretizações descritas em particular mas inclui ainda todas as suas modificações’que estejam no âmbito das reivindicações.
Claims (8)
- - RE I V I N D I CAÇÕESIa. - Processo de purificação de um polipeptídeo imunogéníco incluindo quatro ou mais regiões repetidas sequencialmente da proteína CS de P. Falcíparum, a partir de um lisado clarificado de células de uma cultura de células hospedeiras de E.coli recombinante caracterizado por compreender:(a) precipitar selectivamente os contaminantes bacterianos;(b) precipitar selectivamente o polipeptídeo imunogénico a partir do sobrenadante do passo (a);(c) ressolubilizar o precipitado do passo (b) contendo o polipeptídeo imunogénico e precipitar selectivamente os contaminantes bacterianos da solução;(d) contactar a solução com o polipetídeo imunogénico num66.135Case 14331 suporte de permuta iónica e recolher as fracções que contenham o polipeptídeo; e (e) contactar a solução do polipeptídeo imunogénico com um suporte hidrofóbico sólido por forma a que o polipeptídeo seja adsorvido pelo suporte, eluir o polipeptídeo do suporte com um solvente orgânico polar e recolher as fracções que contenham o polipeptídeo purificado.
- 2«. - Processo de acordo com a reivinidcação 1, caracterizado por o passo (a) ser realizado por aquecimento do lisado cia rificado celular ou por precipitação com polietilenoimina; o passo (b) ser realizado por precipitação do polipetídeo imunogé nico; o passo (c) ser realizado por ajuste do pH abaixo de cerca de PH 2,5; e o passo (e) ser realizado por contacto da solu ção com o polipepetídeo imunogénico com um suporte alquilo C2-18 e por eluição do polipeptídeo imunogénico com um álcool acetonitrilo ou tetra-hidrofurano.
- 3a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o passo (a) ser realizado por aquecimento do lisado clarificado celular a 75-90 C ou por precipitação com polietilenoimina a 0,l-l%jo passo (b) ser realizado por precipitação do polipeptídeo imunogénico cora um sal sulfato, citrato ou fosfato de um catião monovalente; o passo (c) ser realizado por ajuste do pH a pH 2,0-2,4 com ácido trifluoroacético, ácido fosfórico ou ácido clorídrico; o passo (d) ser realizado utilizando um suporte de carboximetilo ou sulfopropilo; e o passo (e) ser realizado utilizando um suporte de alquil(C^ ou °18 Jsílica.
- 4a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o passo (a) ser realizado por aquecimento do lisado clarificado celular a 8O-9O°C ou por precipitação com polietilenoimina a 0,2-1%; o passo (b) ser realizado por precipitação do polipeptídeo imunogénico com um sal sulfato, citrato ou fosfato de um catião monovalente; o passo (c) ser realizado por ajuste do pH a pH 2,0-2,4 com ácido trifluoroacético, ácido fosfórico ou ácido clorídrico; o passo (d) ser realizado pela utilização66.135Case 14331-32de um suporte de carboximetilo ou sulfopropilo DEAE ou QAE; e 0 passo (e) ser realizado pela utilização de um suporte de alquil (C^ ou G^g)sílica,
- 5®.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por 0 polipetídeo imunogénico ser escolhido do grupo que inclui polipeptídeos Rtet32, polipeptídeos Rtet86, polipeptídeos RG, polipeptídeos RLR, polipeptídeos R1T, polipeptídeos 1T31R e polipeptídeos R1TS1.
- 6®. - Processo de separação e purificação do polipeptídeo R32TTSlg^ a partir de uma cultura de células de E. coli produtoras do referido polipeptídeo, caracterizado por compreender:(a) romper as células e separar os resíduos celulares da referida suspensão por forma a obter-se um extracto celular cia rificado contendo 0 peptídeo R32IíSlgj em conjunto com polipeptí deos, proteínas, ADN e endotoxinas indesejáveis;(b) tratar o extracto clarificado com polietilenoimina por forma a precipitarem-se os contaminantes bacterianos indesejáveis e posteriormente separarem-se os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo o peptídeo R32NSlg1;(c) adicionar sulfato de amónio ao sobrenadante contendo 0 R32NSlgjL numa concentração de cerca de 20% a 40% da saturação, precipitar a partir do extracto celular o sulfato de amónio em conjunto com 0 peptídeo R32NSlgp formar uma suspensão do referido precipitado e separar em seguida 0 sobrenadante contendo o peptídeo R32N31g-j (d) ajustar o referido líquido sobrenadante a um pH de cerca de 2 com ácido, precipitando assim os contaminantes bacterianos e separar os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo o R32NSlg^; e (e) adicionar um agentecaotrópico ao sobrenadante contendo 0 R32ITSlg^ e contactar 0 sobrenadante num permutador catiónico, seguido pela eluição a pH de cerca de 6,5 e recolher o eluído e;(f) remover os contaminantes bacterianos residuais do referido eluído de permuta iónica por cromatografia líquida de alto66.135Case 14331-33rendimento (HPLC) de fase inversa, utilizando como fase estacionária os grupos alquilo ^2-18 nura suPor^e sólido, e como fase móvel um solvente orgânico polar por forma a obter um eluído isento de contaminantes bacterianos; e (g) submeter o eluído da HPLC de fase inversa a uma diafiltração para se obter um resíduo do polipeptídeo R32NSlg^ puro.
- 7Ô. - Processo de separação e purificação do polipeptídeoR32tet^2 a partir de o referido peptídeo, uma cultura celular de E.coli produzindo caracterizado por compreender:(a) romper as células e separar os resíduos celulares da referida suspensão por forma a obter um extracto celular clarificado contendo o peptídeo R32tet^2 em conjunto com polipeptídeos, proteínas, ADN e endotoxinas indesejáveis;(b) aquecer o extracto clarificado a uma temperatura de cerca de 80°C até cerca de 90°C por forma a precipitar selectivamente os contaminantes bacterianos indesejáveis, sem que ocorra uma precipitação ou degradação significativa do polipeptídeoR32tet^2 e posteriormente arrefecer o extracto celular e separar os contaminantes bacterianos do sobrenadante contendo oR32tet32*’ (c) adicionar sulfato de amónio ao sobrenadante arrefeci- do contendo 0 R32tetg2 para uma concentração de cerca de 25% até cerca de 40% da saturação, precipitar o sulfato de amónio do sobrenadante em conjunto com o peptídeo R32tet^2í formar uma suspensão do referido precipitado e separar posteriormente o sobrenadante contendo o peptídeo R32tet^2;(d) adicionar ao líquido sobrenadante um sal solúvel por forma a aumentar a força iónica do referido líquido sobrenadante e ajustar o referido líquido sobrenadante a um pH de cerca de 2 com ácido, por forma a precipitar os contaminantes bacterianos e separar os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo o R32tet^2;(e) submeter o sobrenadante de precipitação ácida a uma diafiltração a um pH de cerca de 5; obtendo-se assim um resíduo66.135Case 14331-34retido contendo o peptídeo R32tet^2;(f) contactar o resíduo retido num permutador catiónico seguido pela eluição com um sal a um pH de cerca de 5, θ recolher o eluído;(g) remover os contaminantes bacterianos residuais do referido eluído de permuta iónica por cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) de fase inversa, utilizando como fase estacionária os grupos alquilo θ2-ΐδ nura suP°r^® sóli^0, ® como fase móvel um solvente orgânico polar por forma a obter-se um elui tdo isento de contaminantes bacterianos; e (h) submeter o eluído da HPLC de fase inversa a uma diafiltração por forma a obter-se um resíduo retido do polipeptídeo R32tet^2 puro.
- 8s. - Processo de separação e purificação do polipeptídeo R32LA a partir de uma cultura de E. coli produtora do referido peptídeo, caracterizado por compreender:(a) romper as células e separar os resíduos celulares da referida suspensão por forma a obter-se um extracto celular clarificado contendo o polipeptídeo R32LA em conjunto com polipeptídeos, proteínas, ADN e endotoxinas indesejáveis;(b) aquecer o extracto clarificado a uma temperatura de cerca de 75°C até cerca de 90°C por forma a precipitar selectivamente os contaminantes bacterianos indesejáveis sem que ocorra uma precipitação ou degradação significativas do polipeptídeo R32LA, e posteriormente arrefecer o extracto celular e separar os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo o R32LA;(c) adicionar sulfato de amónio ao sobrenadante arrefecido contendo o R32LA para uma concentração de cerca de 25% até cerca de 60% da saturação, precipitar o sulfato de amónio do sobrenadante em conjunto com o polipeptídeo R32LA formando uma suspensão do referido precipitado e separar posteriormente o sobrenadante contendo o peptídeo R32LA;(d) ajustar o líquido sobrenadante contendo o peptídeo R32LA a ura pH de cerca de 2 com ácido, precipitando-se assim os66.135Case 14331 “35“ contaminantes bacterianos e separar os contaminantes bacterianos precipitados do sobrenadante contendo 0 R32LA;(e) ajustar o sobrenadante a um pH de cerca de 6,5 ® colocar o sobrenadante num permutador aniónico e recolher o eluído;(f) remover os contaminantes bacterianos residuais do referido eluído de permuta iónica por cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC) de fase inversa utilizando-se como fase estacionária grupos alquilo θ2-18 nuin suPor^e sólido e, como fase móvel um solvente orgânico polar por forma a obter-se um eiiâdo isento de contaminantes bacterianos; e (g) submeter o eluído da HPLC de fase inversa a diafiltração por forma a obter-se uia resíduo retido do polipeptideo R32LA puro.
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