JPS63501471A - インタ−フェロンの精製方法 - Google Patents
インタ−フェロンの精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
インターフェロンの精製方法
(技術の分野)
本発明は組み換えDNA技術によって得られる生理活性を有するポリペプチド、
特に生理活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドベクタ
ーによって形質転換された微生物によって生産されるポlj−?プチドを変性す
ることなく、かつプロテアーゼによって分解されることなく精製する方法に関す
る。本発明はインターフェロン、特にヒト免疫インターフェロン(または、ガン
マインターフェロン)活性を有するポリRゾチド生産微生物の培養物から目的ポ
リペプチドを精製するのに有効な方法を提供するものである。
(技術背景)
インターフェロン蛋白は抗原性及び構造の差異に基きα−βおよびγの3種(各
々、工FN−α、工FN−βおよびIFN−γと略す)に分類されている。IF
N−rはIFN−αおよび工FN−βと区別される多くの特徴を持っている。そ
れらの差異としては抗原区別性と免疫調節および抗腫瘍効果についてのよシ強い
作用とである。ヒトIFN−γ(以下、h−工FN−γと略す)は’l’ −リ
ン、e球が感作される免疫原または抗原によって刺激されたT−リンパ球によっ
て生産することができる。
更に、と)−IFN−γは従来技術で知られているクローニング及び発現技術に
よシ生産することもできる。
近年、遺伝子工学的手法の進展によシ、従来は生体からの分離、n製に頼ってい
た多くの生理活性ポリペプチド9を微生物や動物細胞から生産することが可能と
なった。しかしながら、それらの目的物質を薬剤として使用するのに十分な程純
粋に、しかも変性や分解を受けることなく抽出・精製する方法は未だ十分確立さ
れているとは言えない。
しかしながら、得られた工FN−γ含有細胞を集め、浸透圧ショック、超音波振
動、粉砕または高剪断力破砕のような種々の手段で破砕し、そして破砕された細
胞/工FN−、混合物を次いで処理してIFN−γを単離している。不溶性の破
砕片は遠心分離によって除去され、IFN−rを含有する上清は精製のために集
められる。
組換え微生物の生産するポリペプチドを塩酸グアニジンや尿素などを用いて抽出
、精製する方法(特開昭59−161321号公報および米国特許447へ04
9)や、モノクローナル抗体を用いた精製法(特開昭59−186995号公報
)など精製法に関する技術が開示されているが、これらの方法においても、目的
物質が変性を受けず、その活性が損われることなく十分精製され得るとは限らな
い。
ヨーロッパ特許出願Q 087.686は細胞を含まない上清からまた粗インタ
ーフェロン原料からの抽出液から、ヒト免疫インター7エロ/のための3工程精
製法が開示されている。第1工程(天然産出インターフェロンについて)ではコ
ンカナバリン−Aセファロースのようなアフィニティーカラムが使用され、次い
で増加塩濃度勾配を用いるカルボキシメチルシリカカラムによるクロマトグラフ
ィーを行い、最後にシリカゲル透過カラムによるクロマトグラフィーを行う。も
し十分な純度が得られない場合、TSKまたはCMのいずれかのカラムによる濃
縮およびクロマトグラフィーが用いられる。
ヨーロッパ特許出願QO63,482には1)制御された孔性ガラスヒ−,l:
、2) コンカバリン−Aセファロース、3)ヘパリン−セファロースまたはプ
ロジオンレッド−アガロース、および4)ゲル濾過、を用いるクロマトグラフィ
ー技術を用いる精製法が開示されている。
ヨーロッパ特許出願Q 107.498および0.0 ? 7.670には1)
ポリエチレンイミン沈澱;2)細菌蛋白質のpH沈澱;3)濃縮および透析;お
よび4)a)カルボキシメチルセルロース% b)!Jン酸カルシウムゲル、C
)カルボキシメチルセルロースおよびd)ゲル濾過樹脂、によるクロマトグラフ
ィー;を用いる精製方式が開示されている。
これらの精製法は複数工程を必要とし、インターフェロン分子の分解または凝集
によるインターフェロンの劣化を生じるか、またはそうでなければ、低い収率で
または低い活性の工FN−γ生成物しか得られない。
特に目的物質の生理活性を損うことなく、あるいは変性を伴うことなく目的物質
生産微生物の培養物からの目的ポリペプチドを抽出、n#する技術はそのポリペ
プチドを医薬品として使用する場合に重要であシ、その技術の確立が産業上有用
であることは言をまたない。
このような精製技術は、現在医薬品としての利用が進められているインターフェ
ロンについて特に望まれている。インターフェロンは抗ウィルス活性を有するが
、その中でもIFN−γは特に細胞増殖抑制作用が強いことから、抗ウィルス剤
の他、抗腫瘍剤、免疫調節剤としての利用が期待される。また、インターフェロ
ン活性は種特異性があることから、例えばそれらを薬剤としてヒトに用いる場合
、ヒト由来のインターフェロンを用いることが望まれる。遺伝子工学的に生産さ
れるインターフェロンでは特にその抽出、精製工程の確立が望まれている。
通常、組換え微生物からのポリペプチドの抽出、精製においては、まず培養微生
物を殺菌剤を用いて死菌としだ後(安全性の面から必須の工程)、菌体を破砕し
、続いて抽出操作に付す。
これらの処理において目的とするポリはプチドが変性したシ、その活性が損われ
ることがある。また、これらの処理は菌体に含まれるプロテアーゼの活性化をお
こしやすく目的ポリはプチドが分解されることもある。
これまで、組換え微生物から目的ポリペプチドを精製する場合、尿素や塩酸グア
ニジンなどの蛋白変性剤で変性、可溶化させた蛋白を抽出し、精製過程で変性剤
を除く手法が開示されている(前掲、特開昭59−161321号公報、米国特
許4.476.049等)。しかしながら、変性剤を除去しても目的ポリペプチ
ドが完全に復元した保証を得るのは困難である。従って、この方法は目的ポリペ
プチドを医薬品として使用する場合は好しいことではない。なぜなら、一部変性
したものが混在する場合は、抗原ともなシうるからである。
一方、モノクローナル抗体を用いた精製法も報告されていやが(前掲、特開昭5
9−186995など)、使用するモノクローナル抗体の認識する抗原決定基に
よっては変性された好しくないポリペプチドや、二量体、二量体のような重合し
たポリはプチドも結合し得ることが考えられる。最近、ポリペプチドのプロテア
ーゼによる分解を阻止する目的で、プロテアーゼインヒビター共存下で組換え大
腸菌の生産するh−IFN−γを抽出する方法が前掲米国特許に開示されたが、
ここで用いられる塩酸グアニジンは蛋白変性剤としても知られておシ(例えば、
特開昭59−161321号公報)、プロテアーゼによるポリはプチドの切断は
抑制し得るが、変性蛋白が生成されることが予想される。
更に、1)ガンマインターフェロンが生産された細胞の破砕の細胞片からガンマ
インターフェロンを分離する精製方式を提供し;2)細胞不純物から高収率で、
しかも高純度、高活性のガンマインターフェロンを分離し;3)組換えガンマイ
ンターフェロンを細胞不純物から分離し;4)実質上インターフェロンを分解す
ることなく細胞不純物からガンマインターフェロンを分離する;ことが好しいで
あろう。以下に述べる方法がその好しい分離方法である。
本発明における精製方法はポリペプチドの変性を伴うことなく、また、プロテア
ーゼによるポリペプチドの分解を抑えつ\、効率良く、実質的に純粋な目的生理
活性を有するポリペプチドを提供しようとするものである。尚、本発明は便宜上
h−IFN−γ活性を有するポリペプチドの精製について以下に説明するが、本
発明の方法は組換え微生物の産生するArg−LysやArg−Argなどのプ
ロテアーゼ分解を受け易いような部位を含むh−1FN−γ以外のポIJsプテ
ドの抽出、精製にも適用でき本発明によれば、抽出工程において亜鉛または銅の
塩類の1種または2種以上とポリエチレンイミン(以下、PEIと略す)を添加
することによシ上記の問題点を解決した。更に詳細には、組換え微生物の培養菌
体を亜鉛または銅の塩類の1種または2種以上を含む緩衝液で懸濁し、菌体を破
砕し、次にその遠心上清にPEIを添加し、続いて適当な精製工程に移ることに
よシ目的を達することができる。
使用される亜鉛または銅の塩類としては種々の化合物が考えられるが、塩化亜鉛
、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、亜鉛アセチルアセトネート、硫酸銅等があるが、塩化亜
鉛、酢酸亜鉛、硫酸銅が好しい。また、これら塩類の添加量は生産菌株によって
最適濃度に違いが認められるが、一般的には亜鉛の塩類の場合、0.5〜5mM
、好しくけ1〜3mMであシ、銅の塩類では0.01〜3mM、好しくけ0.2
5〜1mMの濃度である。
これらの塩類を上記濃度で緩衝溶液に配合し、培養終了後の菌体をこの溶液中に
懸濁後、菌体を破砕し、遠心によシ上清を得る。この上清にPEIを添加する。
PEIは最終濃度が0.5〜1.1%になるような量で添加される。PE工添加
は相当量の不純な蛋白を沈澱せしめる役割も有す。PE工添加後上滑液を充分低
温(例えば、4℃前後)に放置する。次に、生ずる沈澱を遠心・除去した後、常
法による精製工程に入る。精製は従来よシ用いられている種々のカラム、透析法
を適宜組み合わせて行なえる。場合によシ、塩析を工程中に含めることもある。
詳しくは後述する実施例で説明する。
本出願以前に、工FN−β生産に際して培養培地に亜鉛塩類を添加すると工F’
N−βの生産性が上がるという報告がちるが(特開昭59−146597号公報
)、単に培養時の力価向上を目的としたもので、!、本発明のようにPEIと共
に抽出時に添加することについては何ら記載されていない。銅化合物の精製段階
における使用については、特開昭59−167597号公報で銅キレート樹脂カ
ラムを使用する例が報告されているが、その発明は予備精製したIFN溶液の精
製法に関するものである。これらの発明も含め、終始蛋白を変性および分解させ
ることなく精製することを目的に抽出時に、これら金属塩を添加することを特徴
とする本発明とは本質的に異なるものである。
本発明のもう1つの目的として、本発明の抽出、精製法によって得られたh−I
FN−γ活性を有する実質的に純粋なポリペプチドの提供があげられる。
本発明で述べるh−工FN−γ活性を有するポリはプチド生産株の1つであるW
3110/1:1IN5T4 の造成についてはヨーロッパ特許出願Q134,
673に開示されている。この生産株によって生産されるポリはプチドはG工F
’145と命名され次のアミノ酸配列(1)で示される。
Aha Glu Aen Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
AlaGay Hls Ser Asp Van Ala Asp Asn G
ly ThrGln 工1e Val Ser Phe Tyr Phe Ly
s Leu Ph5Lye Asn Phe Lys Asp Asp Gln
Ser 工1θ GlnLye Ser Mal Glu Thr Ile
Lys Glu Asp MetAsn Mal Ly8 Phe Phe A
sn Ser Asn Lys LysLys Arg Asp Asp Ph
e G’lu Lys Leu Thr AsnTyr Ser Van Th
r Asp Leu Asn Van Gln ArgLys Ala 工me
Hls Glu Leu I’le Gln VaIMetAha Glu
Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr GlyLys A
rg Lys Arg Ser Gln Mec Leu Phe ArgGl
y Arg Arg Ala Ser Gln (1)とのG工F145生産株
は下記のGIF145をコードするDNA配列(I[)で示すDNA断片を含む
プラスミドベクター大腸菌W3110を形質転換したものである。
TGCTACTGCCAG GACCCA TACGTG AAG GAAAC
G ATG ACG GTCCTG GGT ATG CACTTCCTTGC
T GAA AACCTG AAG AAA TACTTCAACGCTCGA
CTT TTG GACTTCTTT ATG AAG TTG CGAGG
T CAT TCT GACGTT GCT GACAACGGT ACTCC
A GTA AGA CTG CAA CGA CTG TTG CCA TG
ACTG TTCCTG GGT ATCCTG AAA AACTGG AA
AGACAAG GACCCA TAG GACTTT TTG ACCTTT
GAA GAA TCT GACCGT AAA ATCATG CAG TC
TCTT CTT AGA CTG GCA TTT TAG TACGTCA
GACAG ATCGTT TCT TTCTACTTCAAG CTG TT
CGTCTAG CAA AGA AAG ATG AAG TTCGACAA
GAAA AACTTCAAG GACGACCAG TCT ATCCAGT
TT TTG AAG TTCCTG CTG GTCAGA TAG GTC
AAA TCT GTT GAA ACT ATCAAG GAA GACAT
GTTT AGA CAA CTT TGA TAG TTCCTT CTG
TACAACGTT AAG TTCTTCAACTCT AACAAG AA
ATTG CAA TTCAAG AAG TTG AGA TTG TTCT
TTAAG CGT GACGACTTCGAA AAG CTT ACT A
ACTTCGCA CTG CTG AAG CTT TTCGAA TGA
TTGTACTCT GTT ACT GACCTT AAT GTA CAG
CGTATG AGA CAA TGA CTG GAA TTA CAT
GTCGCAAAA GCT ATCCAT GAA CTG ATCCAG
GTT ATGTTT CGA TAG GTA CTT GACTAG GT
CCAA TACGCT GAA CTG TCCCCG GCT GCT A
AA ACT GGTCGA CTT GACAGG GGCCGA CGA
TTT TGA CCAAAG CGT AAA AGA TCT CAG A
TG CTG TTCCGTTTCGCA TTT TCT AGA GTCT
ACGACAAG GCAGGT CGT CGT GCT TCT CAG
TAACCA GCA GCA CGA AGA GTCATT (I[)一方
、h−IFN−r活性を有し、次のアミアミノ酸配列@)で示されるポリペブチ
);”(GIF143と言う)の生産株(w3110/p工N5T4N143)
は参考例で詳しく説明するが以下のように造成することができる。
Lau Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly Hls
5erAsp Val Ala Asp Aen Gly Thr Lau P
he LeuGly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Gl
u Glu 5erAsp Arg Lys 工le Met Gln Ser
Gln IIs ValSer Phe Tyr Phe Lye Leu
Ph8Lys Asn PheLys Asp Asp G’ln Ser I
le Gln Lye Ser VaIGlu Thr Ice Lys Gl
u Asp Met Asn Mal LyePhe Phe Asn Ser
Aan Lys Lys Lye Arg AspAsp Phe Glu
Lys Leu Thr Aan Tyr Ser MalThr Asp L
eu Asn Mal Gin Arg Lye Ala 工1eH1s Gl
u Leu Ile Gle VaIMet Ala Glu LeuSer
Pro Aha Aha Lys Thr Gly Lye Arg LysA
rg Sar Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg A
rgAxa Ser Gln (In)
(尚、Gln はGlnまたはp−Glnを示す。)また、このポリペプチド”
(G工F’143) をコード−iるDNA配列で示されるDNA断片が目的プ
ラスミドベクターの造成に使用できる。
CAG GACCCA TACGTG AAG GAA GCT GAA AA
CGTCCTG GGT ATG CACTTCCTT CGA CTT TT
GCTG AAG AAA TACTTCAACGCT GGT CAT TC
TGACTTCTTT ATG AAG TTG CGA CCA GTA A
GAGACGTT GCT GACAACGGT ACT CTG TTCCT
GCTG CAA CGA CTG TTG CCA TGA GACAAG
GACGG’l’ ATCCTG AAA AACTGG AAA GAA G
AA TCTCCA TAG GACTTT TTG ACCTTT CTT
CTT AGAGACCGT AAA ATCATG CAG TCT CAG
ATCGTTCTG GCA TTT TAG TACGTCAGA GTC
TAG CAATCT TTCTACTTCAAG CTG TTCAAA A
ACTTCAGA AAG ATG AAG TTCGACAAG TTT T
TG AAGAAG GACGACCAG TCT ATCCAG AAA T
CTGTTTTCCTG CTG GTCAGA TAG GTCTTT AG
A CAAGAA ACT ATCAAG GAA GACATG AACGT
T AAGCTT TGA TAG TTCCTT C!TG TACTTG
CAA TTCTTCTTCAACTCT AACAAG AAA AAG C
GT GACAAG AAG TTG AGA TTG TTCTTT TTC
GCA CTGGACTTCGAA AAG CTT ACT AACTACT
CT GTTCTG AAG CT、T TTCGAA TGA TTG AT
G AGA CAAACT GACCTT AAT GTA CAG CGT
AAA GCT ATCTGA CTG GAA TTA CAT GTCGC
A TTT CGA TAGCAT GAA CTG ATCCAG GTT
ATG GCT GAA CTGGTA CTT GACTAG GTCCAA
TACCGA CTT GACTCCCCG GCT GCT AAA AC
T GGT AAG CGT AAAAGG GGCCGA CGA TTT
TGA CCA TTCGCA TTTAGA TCT CAG ATG CT
G TTCCGT GGT CGT CGTTCT AGA GTCTACGA
CAAG GCA CCA GCA GCAGCT TCT CAG TAA
CGA AGA GTCATT (■)(図面の簡単な説明)
第1図は本発明のn製方法が適用されるGIF143を生産するだめの大腸菌形
質転換用プラスミドベクターpIN5T4N143の造成経路を説明する図であ
る。
第2図は本発明のガンマインターフェロン精製方法の好しい態様を示すフローダ
イアダラムである。
第3図は主としてクロマhダラフイー精製手段を示す本精製方法のよシ好しい態
様のフローダイアダラムである。
第4図は本発明の特に好しい態様のフローダイアダラムである。
第5図は、各種濃度の塩化亜鉛を含む緩衝液中で菌体(W3110/pIN5T
4N146 )を破砕しその上清を5DS−PAGE にかけて得られる蛋白バ
ンドを示す写真である。
第6図は、塩化亜鉛に代えて硫酸銅を使用して得られる5DS−PAGE の蛋
白バンドを示す写真である。
第7図は各種濃度の塩化亜鉛を含む緩衝液中で菌体(w31.10/p工N5T
4N143を破砕し、その上清を5DS−PAGE にかけて得られる蛋白バン
ドを示す写真である。
添付の図面第1図を参照して説明すると、まずpG工F’54(特開昭58−2
01995中に開示されているpG工F4と実質的に同じプラスミド)のAst
llとBg111切断によシ得られるDNA断片を、さらにAval[で処理し
、第1図に示す様なAvall −Bglll断片を得る。次に、この断片のA
va[サイトと、pIN5T4 (ヨーロッパ特許出願Q134,673に開示
)をBgl[とEcoRIで処理して得られるテトラサイクリン耐性遺伝子(T
cr)を持つ長い方のDNA断片のEcoRIサイトの間に、両端にEcoRI
とAva[lのサイトを持つ合成リンカ−DNAリガーゼの存在下に挿入するこ
とによシ、目的とするプラスミドpIN5T4N143を得る。これは、GIF
’145のN末端側の3個のアミノ酸残基からなる配列、 Cys −Tyr−
Cys配列が欠除したポIJ−eプチドG工F143に対応する遺伝子を含んで
いる。続いて、このプラスミドル工N5T4N143によシ宿主(E、Co11
W3110)を常法によシ形質転換して、GIF’143生産形質転換大腸菌株
(W3110/p工N5T4N143 )を得る。
全ての図面において、精製方法はホモジナイズされたガンマインターフェロン含
有細胞の遠心分離によって生じる上清から、核酸を除去することから開始される
。それ以前の工程は説明のために示されているが本発明の一部ではない。
なお、実施例においては亜鉛の塩類として塩化亜鉛を用いた精製例を述べるが、
塩類としてはこれに限ることなく、例えば硫酸亜鉛や酢酸亜鉛のような亜鉛の塩
類、また硫酸銅のような銅の塩類を用いてもよい。第1表は、種々の金属塩化合
物のプロテアーゼ阻害効果を、それらの化合物を1mMと0.2 m M含む緩
衝溶液中で組換え菌体を破砕し、その上清に含まれるh−IFN−γ活性を有す
るポリペプチドの安定性を指標にして調べたものである。第1表から明らかなよ
うに塩化亜鉛の他に硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、亜鉛アセチルアセトネート、硫酸銅な
どが効果があることがわかる。
第1表: Zn、Cuおよび他の金属塩の添加によるポリペプチドに対するプロ
テアーゼ分解阻止効果
ポリペプチドの分解阻止効果
塩化亜鉛 十 −
(IIIt酸並鉛 十 −
酢酸亜鉛 十 −
亜鉛アセチルアセトネート+−
サリチル酸亜鉛 士 −
硫酸銅 廿 十
硫酸第一鉄 −−
塩化コバルト −−
モIJ/’7’ン酸アンモニウム ± −十 分解阻止効果Mシ
III なし
また、第5図(写真)はh−IFN−r活性を有するポリペプチド(図中GIF
”146と表示した矢印で示した蛋白の);ンド)の安定性を示す5DS−PA
GEのパターンである。試験サンプルは各種濃度の塩化亜鉛を含む望ましい緩衝
溶液中で菌体を破砕して調製された。第5図からh−IFN−γ活性を有するポ
リペプチド◆は0.5 m M〜2mMの塩化亜鉛存在下で安定であシ、塩化亜
鉛を含まない場合または低濃度の場合では分解を受け易いことを示している。矢
印Bで示す蛋白のバンドは、精製工程中プロテアーゼによってGIF145が部
分分解されたポリペプチドのバンドを示す。尚、2−1で示されるサンプルは2
mMのZ n Clzを使用して同様に処理し、更に精製を進めた段階で得たサ
ンプルによるものでおる。また、2−2で示されるサンプルはZ n C12を
使用せずに処理し、更に精製を進めた段階で得たサンプルによるものである。
塩化亜鉛の代わシに硫酸銅を用いた同様な実験例を第6図(写真)に示すが、こ
の場合、Q、 l m M〜4mMで有効であることを示している。これらの塩
化合物は高い方が充分なプロテアーゼ阻害作用を示すが、精製工程でこれらの塩
化合物は最終的にとシのぞく必要があるのでできるだけ低くするのが好ましい。
塩化亜鉛の場合、1〜3mM、硫酸銅の場合、0.25mM〜1mMが好ましい
。
第7図(写真)はGIF143生産菌について第5図について行ったものと同様
の処理して得た写真である。図中、G工F143と表示した矢印で示した蛋白の
バンドはh−工FN−γ活性を有するポリはプチドであシ、EはGIF143の
プロテアーゼによる部分分解ポリRプチト2を示す。
破砕された細胞/ガンマインターン二ロン混合物中の主たる不純物は微小サイズ
の粒子および水溶性画分であシ、水溶性画分としては核酸、蛋白分解酵素、細胞
蛋白、炭水化物、脂質、インターフェロン分解断片、インターフェロン凝集物お
よびインターフェロンが生産された細胞の破砕によって生じる他の断片等である
。発明者等は、インターフェロン含有混合物を下記の具体的順序で処理してイン
ターフェロンの分解を最少にし、混合物から不純物を以下に特定する順に除去す
ることによシ、高純度かつ生物学的活性を保持しながら、しかも良好な収率でガ
ンマインターフェロンを得ることができる。
十分に改善された純度および活性は、以下の順でインターフェロン含有混合物中
の不純物を除去することによって得られる。
1)核酸;
2)負に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白;3)正に荷電した蛋白分
解酵素および不純物細胞蛋白;および
4)分解および凝集インターフェロン。
この工程順序は本発明の所望の結果を得るためには必須である。上に列挙した不
純物を特定した順に除去することを前提として、高分子量疎水性物質のような他
の不純物が存在する場合、追加の工程によってその不純物を除去できる。これら
の他の不純物は工程3)または工程4)の後で除去するのが好都合である。
これらの分離のそれぞれについては多くの公知の方法がある。
前述のように、最も穏かな条件で分離を行ってインターフェロンの分解を最も少
くすることができるこれら方法が最も望しい。
発明者等は、好しい方法としては最初にポリエチレンイミン沈澱を行い、次いで
いくつかのクロマトグラフィーによる分離を行うことによシ上に特定した順序で
不純物を除去すること、であることを見出した。クロマトグラフィー分離で使用
される樹脂およびそれらの使用順は次の通シである。
1)陰イオン交換樹脂
2)陽イオン交換樹脂
3)分子ふるい
クロマトグラフィー分離に加えて、沈澱、濾過、濃縮および透析等の手法を用い
ることが有益である。
好しい方法において、ガンマインターフェロン含有混合物に次の方法を行う。
1)ホリエチレンイミンを用いる核酸の除去;2)弱堪基性陰イオン交換樹脂を
用いる負に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白の除去;
3)弱酸性陽イオン交換樹脂を用いる正に荷電した蛋白分解酵素および不純物細
胞蛋白の除去;
4)分子ふるいを用いる分解及び凝集インターフェロンおよび細胞フラグメント
の除去。
各工程後の濾過、工程3および/または4の後の濃縮および工程5の後の透析が
有益な付加的工程である。
この新規方法では、5チ以上の収率で少くとも95%の純度を持つガンマインタ
ーフェロンが確実に生産された。
本発明の重要な特徴は新規な精製方式にあり、この方法は組織培養によって増殖
されたヒトの細胞から、血液サンプルから集められた白血球から、または当業界
においてよく知られているクローニングの技術による等の多くの方法のいずれか
で生産されたガンマインターフェロンへの使用に適している。この精製方式は大
腸菌細胞から回収される組換えガンマインターフェロンの精製に非常に適してい
る。細胞は、例えばクロルヘキシジングルコネートのような化学殺菌剤の添加に
よる等の標準的ないずれかの方法により不活化される。不活化細胞を遠心し、緩
衝液に再懸濁し、そしてホモジナイズする。ガンマインターフェロン含有細胞の
ホモシネ−ジョンのだめの便利な方法はマントンーガーリン(Manton−G
aulin )ホモジナイザーを用いる高剪断破砕である。破砕された細胞を遠
心分離によシ沈澱物と上清とに分離する。この方法で得た上清は以下に述べる方
法によって単離および精製されるガンマインターフェロンの好適な原料である。
溶解された細胞の懸濁液は蛋白、脂質、炭水化物および核酸、並びに不溶性細胞
破砕片を含んでいる。慣用の方法を利用することによシ、水不溶性成分は、上清
中に残っている細胞の水溶性成分から分離される。
細胞からのガンマインターフェロンの抽出に先立って、ある種の予備的処理、例
えば処理中のインターフェロンの分解を最少にするような方法を行うことがしば
しば望ましい。どのような予備処理も、それが本発明の精製方式を妨害しないこ
とを前提に、使用できる。
この多工程精製方式によれば、生物活性を保持しながら、高純度インターフェロ
ンについての高収率が達成される。分離工程の順序は非常に区別性があり、開示
された所望の結果を達成するのに臨界的である。
インターフェロン含有混合物からの不純物の除去の順序は次の通シである。
a)核酸の除去;
b)負に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白の除去;C)正に荷電した
蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白の除去;d)低および高分子量不純物、分解
されたインターフェロンおよびインターフェロン凝集物の除去。
現在では未だ理由は知られていないが、前記の順序での不純物の除去は、生物活
性を保持した精製ガンマインターフェロンについて高い収率を達成するのに臨界
的である。それぞれの群の不純物の除去に使用される個々の工程は慣用であシ、
当該技術分野において知られている。ガンマインターフェロンカ苛酷な条件下で
は分解または凝集して不活性体になる傾向があるため、最も穏かな処理条件下で
行うことができる精製工程が好しい。
インターフェロンの分解を最も少くできることが判った具体的処理工程および条
件を用いて、この発明を更に説明するが、不゛純物除去の順を記述のように維持
することを前提にして、開示の方法を他の慣用の処理工程で置き換えることがで
きる。
以下の記述において、別途言及しないかぎシ、与えられたpH値は一般に±0.
5、好しくけ±0.25、最も好しくは±0.1の範囲で変わシ得る。導電率の
値は±5mSの範囲で変え得るが、±3mSの範囲に維持することが好しい。操
作は約2〜約15℃の温度で行われる。
本処理方式の第I工程は核酸の除去である。溶解されたガンマインターフェロン
含有細胞の遠心した混合物からの上清にポリエチレンイミンを添加することによ
って、この除去を行うことが好都合である。別法として、所望によ多細胞のホモ
ジナイズの前にポリエチレンイミン溶液を添加することもできる。攪拌下にポリ
エチレンイミンを最大濃度的0.8%にまでゆつくシ添加し、そして混合物を適
当な期間、一般的には約30〜90分間静置する。次いで混合物を遠心し、上清
を集める。ポリエチレンイミンを10%(V/V )水溶液として、溶液全量に
対して約07〜0.8%(v/v )となるような十分な量を添加する場合に、
優れた結果が得られる。溶液のpHは8±0,5、好しくは±01であシ、温度
は約2〜15℃の範囲に保持される。上清中の蛋白濃度は、標準のコマ−ジブル
ー結合検定によシ、この工程および他の各処理工程において測定される。
核酸除去の別法は、ヒドロキシアパタイトまたは固定化PE工のクロマトグラフ
ィーを用いることによる。プロタミン硫酸塩による沈澱は別の有用な方法である
。
核酸の除去後、ガンマインターンェロン含有混合物を第一の除去工程にかける。
蛋白分解酵素を除去する最も便利な方法は陰イオン交換樹脂を用いて、核酸除去
工程からの上清をクロマトグラフィーにかけることによる。第四級7ミノエチル
、混合アミンまだはその他の中間体塩基樹脂またはp−アミノベンジルセルロー
スのような弱塩基樹脂が特に有用である。
第四級アミノエチルは好しい陰イオン交換樹脂である。第四級アミノエチルは架
橋デキスラン、セルロース、アガロースまたはアクリル系支持体に結合すること
ができる。上清のpHは水酸化ナトリウムまたは他のいずれかの好しい塩基を用
いることによ!D、8.7±0.5、好しくは±0,1に調節する。溶液の導電
率は脱イオン水を添加することによ510m5以下、好しくは約4〜BmSの範
囲に調節する。
溶出緩衝液は2QmMの4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ビベラジンープロ
ノξン硫酸ナトリウムおよびO,1% (v/v) 2−メルカプトエタノール
を含んでいる。この緩衝液のpHは水酸化ナトリウムまたは他の塩基によシ約8
.7に調節される。同じpH範囲での使用に適する他の緩衝液をピー!5ジン誘
導体に代えることができ、しかも他の抗酸化剤を上記メルカプトエタノールに代
えることもできる。
第四級アミノエチルカラムは緩衝溶液で予じめ予備平衡化し、ガンマインターフ
ェロン含有溶液を添加し、そして吸着物質を同じ緩衝液で溶出する。溶出された
蛋白溶液の最初の2/3、すなわち全容積の最初の273を、次の精製工程忙移
すために溜める。溶出された液の残りの1/3は同じ方法で平衡化した同じカラ
ムで再度クロマトグラフィーにかけることができる。残シの溶液は更に同じ方法
で処理できる。前に述べたように、蛋白濃度はコマ−ジブルー結合検定によって
測定される。
精製のこの時点で任意の濃縮工程が使用できる。溶液を濃縮する1つの便利な方
法は硫酸アンモニウムによる沈澱である。
第四級アミノエチルカラムからの溶出液を0.2μフイルターを通過させ、硫酸
アンモニウムを攪拌下、5〜10分間にわたって添加し、最終濃度約40〜60
チ飽和にする。懸濁液を水浴中で数時間放置する。次いで、沈殿物遠心分離で集
め、更に処理が必要なときまで約−20℃で保存できる。
必要な場合、20mMトリス−HCAl および0.1チ2−メルカプトエタノ
ールからなる溶液(pH,約7.5)で予じめIQOOO分子量カットオンフィ
ルターを通したものに沈澱物を溶解する。溶液の導電率を、] OmM) リス
−H(J および0、112−メルカプトエタノールから成る溶液(pH,約7
.5)を添加することによシ約3〜5mSに低下させる。この溶液を0.2μフ
イルターに通し、後続の処理に供する。同一のpH範囲での使用に適する他の緩
衝液をトリス−HO2に代え、他の抗酸化剤を前記メルカプトエタノールに代え
て使用できる。
溶液中の正に荷電した蛋白分解酵素およびその他の蛋白は、陽イオン交換樹脂を
用いることによシ好都合に実施される次の処理工程において除去される。
カルボキシメチル陽イオン交換樹脂(カルボキシメチル結合架橋デキストラン、
セルロース、アガロースまたはアクリル支持体)を用いることによシ優れた結果
が得られる。前の工程で得られた溶液のpHは、HCl ’またけ他の適当な酸
を用いることによシ約7.5に調節される。2−メルカプトエタノールまたは他
の適当な抗酸化剤を約0.1 % (v/v)の濃度に添加する。
0、1 % (v/v)の2−メルカプトエタノールを含有する脱イオン水を添
加し、導電率を20m5以下、好しくけ約3〜5mSに低下させる。この溶液を
0,2μフイルターを通して濾過し、後のクロマトグラフィーに備える。
陽イオン交換樹脂カラムを20mM)リス−HC1および0.1チ2−メルカプ
トエタノールから成る溶液(pH,約7.5)のような適当な緩衝液で平衡化す
る。平衡化カラムを同じ緩衝液で2〜3回洗浄し、ガンマインターフェロン含有
溶液を添加した後、この溶液を、平衡化に使用した緩衝液中に溶解した塩化ナト
リウムの勾配(カラム容積の約13〜15倍量)で溶出する。
塩化ナトリウム含量は緩衝液中0ないしほぼ0.5 Mの濃度に増加される。
適当な両分を集め、ゲル電気泳動(SDS−PAGE)、分析HPLCおよび抗
ウィルス活性について分析することもできる。最も純度の高い両分を以後の処理
のためにプールする。低濃度のインターフェロン含有画分はほぼ40〜60%飽
和度の硫酸アンモニウムで沈澱し、再溶解し、済過し、前述のようにカルボキシ
メチルカラムによシ再度クロマトグラフィーにかける。
再クロマトグラフィー溶液から回収した画分を分析し、最も純度の高い画分を第
一のカルボキシメチル溶出液から得た画分と共にプールする。
もし、高分子量の疎水性不純物の存在が5DS−PAGE −iたはその他の適
当な方法で検出される場合には、溶出液を任意のクロマトグラフィーにかけて精
製方法におけるこの時点で前記不純物を除去する。フェニル樹脂によって満足す
べき結果が得られることが判明した。まだ、オクチルおよびブチル樹脂も使用で
きる。前工程で得た溶液を0.2μフイルターを通して濾過し、塩化ナトリウム
(0,5〜0.75 M )を加えて溶液の導電率をほぼ50〜75m5に上昇
させる。
緩衝液は20mM)リス−HC4,0,1%(v/v)2−メルカプトエタノー
ルおよび導電率を適切な範囲に上昇させるためのNaClを500〜850mM
、好しくは500〜700mMである。
カラムは緩衝液で予備平衡化し、サンプルをカラムにかける。
カラム容積の約2〜4倍量の緩衝液をカラムに添加する。次いで吸着された物質
を、20mM)リス−HC1,100mMN a Cl および0.1%(V/
V)2−メルカプトエタノールから成る溶液(pH,はぼ7.5)のカラム容積
の少くとも1倍以上、好しくけ約5〜約10倍量で溶出する。適当なサイズの画
分を集め、5DS−PAGE、分析HLPCおよび抗ウィルス活性について分析
し、最高純度の画分をプールする。
インターフェロン含有溶液を、フェニルカラムクロマト/、7フイーの後で濃縮
することが一般に好しい。また、任意工程である疎水性カラムクロマトグラフィ
ーが用いられない場合の事例では、この時点でインターフェロン含有溶液を濃縮
することが一般的に望しい。
溶液の蛋白濃度はコマ−ジブルー結合検定によって決定される。蛋白濃度が0.
2 my /rat以下である場合、その溶液をIQOOO分子量カットオフ膜
を用いる限外渥過によって濃縮することが好しい。
この溶液に最終濃度約40〜約60%飽和度となるように硫酸アンモニウムを攪
拌下に5〜10分間に亘って添加するととによシ、更に濃縮を行うことができる
。懸濁液を水浴中に放置し、その後沈澱物を遠心分離で集める。この沈澱物を、
2oInMトリスーHCl、500mM NaC/および0.1%2−メルカプ
トエタノールから成シ予じめIQOOO分子量カットオフフィルターを通して濾
過した溶液(pH,約7.5)に溶解する。この濃縮液を0.2μフイルターを
通過させ、次の精製工程に供する。
低分子量および高分子量不純物、および分解されたガンマインターフェロンおよ
びインターフェロン凝集物を最終クロマトダラフイー精製工程で除去する。この
工程は前の処理工程からのガンマインターフェロン含有溶液をゲル濾過樹脂を通
過させることによって行われる。親水性濾過ゲルは分子ふるいとして働き、溶液
中に含まれる低および高分子量不純物から適当なサイズの画分を分離する。特に
有用な濾過ゲルはファルマシアファインケミカル社製の商標名セファデックスG
−Zooとして特定される架橋デキストランをベースとするゲルである。この樹
脂は球状蛋白およびRプチドについて4,000〜15QOOOの分画分子量お
よび多糖類について1. OO,O=−:1:QOOOの分画分子量を持つ。蛋
白について約LOOO〜約20QOOOのカットオフ範囲を持つ他の樹脂も使用
できる。
セファデックスG−100樹脂カラムは20mMのトリス−HCl、500mM
NaClおよび0.112−メルカプトエタノールから成る緩衝溶液(pH,
約7.5)で予じめ平衡化される。吸着された物質を上記緩衝液で溶出し、次い
で適当な両分を集める。各両分の蛋白濃度をコマ−ジノル−結合検定で測定する
。画分は、5DS−PAGE、分析HPLCおよび抗ウィルス活性によシ判断し
た純度に基いていっしょにされる。
別法として、硫酸アンモニウム濃縮工程での沈澱物を、20mMリン酸ナトリウ
ム、500mM Na(J、および0.1チ(v/v)2−メルカプトエタノー
ルから成る溶液(pH1約7.5)に溶解することができる。このガンマインタ
ーフェロン含有溶液を予じめ上記緩衝液で平衡化したセファクリルS−200ゲ
ル濾過カラムにかける。(尚、セファクリルS−200はアクリルアミドで架橋
されたアガロース樹脂であるファルマシアファインケミカル社の商標名である。
)最終生成物は透明々いし僅かに曇った溶液で、無色ないし淡黄色である。5D
S−PAGEで決定された見かけ分子量は17,000〜IC4500でおる。
精製されたガンマインターフェロンは前に用いた緩衝液に対して透析する。適当
な緩衝液は20mMのリン酸ナトリウムおよび5mML−シスラインから成シ、
pH約6.8である。他の適当な緩衝液は15mMのリン酸ナトリウム、8mM
のクエン酸ナトリウムおよび6mMのL−システィンHClかう成るpH5,0
の溶液である。8時間以上透析を継続し、系中に窒素を連続的に通して酸化を最
底に押えることが好しい。
必要に応じて、精製ガンマインターフェロン溶液は上記の方法で濃縮できる。
以下参考例および実施例1−3で本発明をさらに詳しく説明する。
参考例(GIF’143発現イクターの作製G工F143発現イクターを以下の
手順に従って作製した。
dcm大腸菌(シトシンのメチル化反応が欠損し九株)形質転換体であるWA8
02/pGIE’54 よシ常法に従ってpGIF54(GIF146に相当す
る遺伝子を含むpGIF’4と実質的に同等なシラスミ1)を得た。spyのp
GIF’54を2Q unitのAat■及び2Q unitのBa111で処
理し、約600塩基対の、G工F’146遺伝子の一部と1acUV5 プロモ
ーターを含むDNA断片を得た。次に、このDNA断片約0.5pflを5 u
nitのAvanを用いて切断し、G工F146遺伝子の一部を含む約400塩
基対のDNA断片を得た。一方pIN5T4 5μgを、20unitのEco
R工と20 unitのBgl■ を用いて切断し、テトラサイクリン耐性遺伝
子、lppプロモーター、及び複製起点を含むDNA断片を得た。この両DNA
断片と第1図に示した化学合成リンカ−(D N A 5ynthesizer
; AppHd、Biosystems380A を用いて合成)0.5μI
を混合ライゲーションすることによシ、pIN5T4N143を得た。さらに得
られたp工N5T4N143を常法例えば、特願昭56−163303記載の方
法によシW3110に形質転換し、W 3110/pIN5T4N143を得た
。
得られた形質転換体がGIF143生産株であることは、以下に示す手順で確認
した。
W3110/p1N5T4N143 をポリイブトン3チ、酵母エキス2%、グ
ルコース2%、KH2PO40,5%、MgSO4・7H200,01%および
テトラサイクリン20μi/rat を含む培地1.5mlと共に、16.5m
m試験管で30℃、24時間振盪培養した。
培養終了後(OD66oキ8)培養液0.5 mlを1.5ml容エツd 7ド
ルフカツプにとシ、遠心分離(1a o o o rpm、s分間)することに
よシ集菌した。これを、1 my/ml リゾチーム・1mM−EDTAを含む
PBS溶液(0,81NaC/、0.02%KCJ。
0.115%Na2HPO4,0,02%N a H2PO2) 0.5 ml
に懸濁し0℃、30分間反応後、凍結融解を3回線シ返すことによシ細胞を破壊
し、遠心分離(]、 Q O00rpm、10分間)して上清画分を回収した。
この上清両分を特開昭58−201995に記載の方法に従って抗ウィルス活性
を検討した。その結果6 X 10’ unit/mlの抗ウィルス活性を認め
た。一方、同様に集菌し得られた菌体をSDSサンプル溶液(7M尿素、1チS
DS、1%2−メルカプトエタノールを含んだl QmMリン酸緩衝液1)H7
,2)200μlに溶解後、沸騰水浴中で10分間加熱した。このサンプル20
μlをl 3%SDS/PAGE で分離後、コマ−ジブルーR250で蛋白染
色を行った。その結果、大腸菌総蛋白の約20%に相当するGIFI 43蛋白
(分子量約IBKa)の生産を認めた。
実施例I G工F146の抽出・精製
GIF146生産株であるW3110/p1N5T4 をポリープトン3%、酵
母エキス2チ、ダルコース2%、xa2po、o、sチ、MgSO4・7H20
0,01%およびテトラサイクリア20μm77m1 を含む培地で、24時間
通気攪拌培養した。培養液の菌体をグルコン酸クロルヘキシジンで完全に殺菌後
、遠心分離しく a 000 rpm、10分間)、w3110/p工N5T4
の湿菌体800gを得た。これを1 m M ZaCl 2 を含む冷却した2
0mM)リス塩酸バッファー(以下THE)pH7,45,1lIに懸濁し、氷
冷したManton Gaulin社製ホモジナイザーM15にて、ホモジナイ
ズした後、遠心分離しく7.OOOrpm、20分間)上清を得た。これに、1
5チポリエチレンイミン(以下PgI)水溶液(pH8,0、HCIで調整)を
最終濃度0,75チとなる様に加え10分間攪拌後、4℃で2時間放置した。生
じた沈澱を遠心分離(7,OOOrpm、20分間)で除去し、上清4゜71を
得た。この上清を、20mMN−2−ヒドロキシエチルピはラジンーN′−3−
フロパンスルフォン酸バッファー(EPPSバッファー)pH8,6で平衡化し
たQAEセファデックスA−25(ファルマシア社製)カラムにかけ、素通シ画
分を得た。次に、0.1%の2−メルカプトエタノール(以下2−ME)を含む
20mMTHB pH74で平衡化した0Mセファロース0L6B(ファルマシ
ア社製)カラムに、この素通り画分をかけ吸着した活性画分をO〜0.5MのN
aCl 直線濃度勾配で溶出し、インターフェロン活性の高い区分を集めた。
なお、インターフェロン活性は特開昭58−201995号公報に記載した方法
に準じて測定した。続いてこの両分に50%飽和となる様に硫酸アンモニウムを
添加し、塩析を行い、7000 rpm、20分間遠心分離して沈澱を得た。沈
澱部を0.3M Na(J’及び0.1%2MEを含む20mMリン酸ナトリウ
ムバッファー(以下、2QmMPBS )pH7,4に溶解し、同バッファーで
平衡化したセファクリルS−200(ファルマシア社製)カラムにかけ、最終n
製品として298■のGIF146に対応するポリペプチドを得た(インターフ
ェロンの比活性1.6〜1.7 X 106U/my蛋白)。コ(7)ポリペプ
チドのSDS/PAGEによる純度検定では純度99チ以上で1、また同S D
S/P A G Eのバント3の位置は分解を受けていないGIF’146の
位置と一致した。更に、アミノ酸分析よシ得られたポリペプチドが前記アミノ酸
配列(1)と同じアミノ酸配列を有することも確認し、本発明の抽出精製方法が
有用であることが認められた。
尚、上記の精製過程中で用いたセファクリルS−200の代シにセファデックス
G−100(フマルマシア社製)を用いても同様な結果を得た。
実施例2 GIF143の抽出および精製実施例1と同様に、V/3110/p
IN5T4N143 (参考側参照)を培養の後、グルコン酸クロルヘキシジン
で殺菌し、集菌して得られた湿菌体300!!を3mM ZnCA’2 を含む
冷却しり20 mM THB pH7,42,11に懸濁し、ホモジナイズした
後、遠心分離しく 7000 rpm、20分間)、上清画分を得た。
これを実施例1と同様にPEI処理して、上清10100Q!を得た。次に、こ
の上清を0.1%2MEを含む20 m M T HE(pH7,4)で平衡化
したCMセファロースCL5Bカラムに吸着させた後、0.1〜0.8M Na
Clの直線濃度勾配で溶出した。活性画分to、1%2MEを含む20mMTH
Eで10倍稀釈し、同/ζソファ−で平衡化したCM−)−ヨーパールカラム(
東洋曹達社製)に吸着させ、洗浄後、0.1〜0.BM Na(J直線濃度勾配
で溶出した。インターフェロン活性を有する区分を集め、硫酸アンモニウムを加
えて20%飽和とした後、プチルトーヨーバールカラム(東洋曹達社製)を通過
させ、通過区分を蒸留水に対して透析した。これによシ最終的に396m9の蛋
白を得た(インターフェロン比活性: 4.8 X to’tJAny蛋白)。
実施例1の場合と同様にアミノ酸分析及びSDS/PAGEの結果から、純度9
9チ以上で前記アミノ酸配列側と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド(GI
F143)が得られた。更に、抽出時に添加した亜鉛化合物は原子吸光分析を行
っても検出できなかった。
組換えガンマインターフェロンを含む不活性化した大腸菌(W3110/p工N
5T4)細胞を遠心分離によって集める。細胞を1mM ZnCl2を含有する
2 0 mM )リス−HCl緩衝液(pH7,5)中に懸濁する。細胞は高圧
ホモジナイザー中で破砕し、細胞破砕物を遠心分離し、上清を回収する。塩酸で
pH8に調節したxo%(v/v)ポリエチレンイミン(PEI)水溶液を上清
に添加し、最終PEI濃度を最大0.8%にする。混合物を遠心分離し、上清を
集める。
■、第四級アミノエチル(QAE)カラムクロマトグラフィーPEI上清のpH
を4NNaOHによシ8.7に調節する。脱イオン水を添加して導電率を10m
5以下に減じる。このバッチをゲル11当シ蛋白質509以下の負荷でQAEカ
ラムにかける。カラムにかける前に、20mMの4−(2−ヒドロキシエチル)
−1−ピRラジ/−プロノぐンスルホン酸ナトリウムおょヒ0.1%の2−メル
カプトエタノールの緩衝液(pH8,7)でカラムを平衡化する。溶出は同じ緩
衝液で行う。蛋白溶液を集め、次の第■工程でクロマトグラフィーにかける。
工程2からの蛋白溶出液のpHを4NHC/で7.5に調節し、2−メルカプト
エタノールを最終濃度0.1チとなるように添加する。0.1%の2−メルカプ
トエタノールを含有する限外濾過水で稀釈することによシ導電率を20m5以下
に調節する。この溶液を0.2μフイルターに通し、次いでゲル11当シ蛋白3
5g以下の負荷で0Mカラムに加える。カラムにかける前に、pH7,5であシ
、NaC!! で導電率を2QmS以下に調節した2omM)リス−H(J と
0.1%2−メルカプトエタノールとから成る緩衝液でカラムを平衡化する。こ
の平衡化緩衝液をカラム容量の少くとも2倍でカラムを洗浄する。この平衡化緩
衝液に溶解した0〜0.5M NaC1の塩濃度勾配でガンマインターフェロン
を溶出する。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SD
S−PAGE)で決定される両分をいっしょにする。
IV、フェニルカラムクロマトグラフィー5DS−PAGEによって高分子量不
純物が検出された後、フェニルカラムによるクロマトグラフィーが行われる。N
aCJを添加して導電率を50〜75m5にし、その後溶液を、ゲルB’当シ蛋
白15.9以下の負荷でフェニルカラムに添加する。
カラムにかける前に、20m1i’!)リス−HCl、0.5M NaCJおよ
び0.112−メルカプトエタノール(pH7,5)で平衡化する。サンプルを
カラムに負荷した後、少くともカラム容積量の平衡化緩衝液を加える。カラムを
20mMトリス−HCl。
0.15M NaCC0,1% 2−メルカプトエタノール(1)H7,5)で
溶出する。5DS−PAGEおよび抗ウイルス検定によって決定される活性画分
をいっしょにする。
■、硫酸アンモニウム沈澱
いっしょにしたカルボキシメチル(工程■)またはフェニル(工程■)画分の蛋
白濃度が0.2 my/m1未満の場合、この溶液をIQOOOM、W、カット
オフ膜を用いる限外濾過によシ濃縮する。硫酸アンモニウムを最終濃度40〜6
0チ飽和度となるように添加する。必要であれば沈澱物を遠心分離で集め、約−
20℃で保存する。
■、セファデックスG−100カラムクロマトグラフィー硫酸アンモニウム沈澱
物を20mM)リス−HC1!、0,5MNa(J、0.1%2−メルカプトエ
タノールから成る緩衝液(pH7,5)に溶解する。この溶液を0.2μフイル
ターに通過させる前に遠心分離する。F液を、予じめ上記の緩衝液で平衡化した
セファデックスG−100カラムに供給する。負荷はゲル1/当シ蛋白3.51
!以下である。カラムを上記緩衝液で溶出し、両分を5D8−PAGEで決定し
ていっしょにする。
セファデックスG−100画分をいっしょにしたものを15mMリン酸ナトリウ
ム、8mMクエン酸ナトリウム、5mML−システィン塩酸塩から成る液(pH
5,0)で透析する。透析は、短かくとも5時間の間隔で緩衝液を2回交換し、
緩衝液中を通して窒素を連続吹込みして行う。必要であれば、透析溶液をIQO
OO分子量カットオフ膜を用いる限外濾過によシ、蛋白濃度1m97m1以上に
濃縮する。精製ガンマインターフェロン溶液を0.2μフイルターに通し、約−
20℃以下で保存する。
精製ガンマインターフェロンは、その溶液に50%グリセロールを添加すること
によシ、はぼ−20〜約−30℃の温度で少くとも数ケ月保存できる。
カンマインターフェロンは0.2μフイルターを通ステ過オヨび20mMリン酸
ナトリウムおよび5mML−システィンから成る溶液(pH,約6.8)に対し
て透析することによって使用に供せられる。別法としては、透析液を、15mM
リン酸ナトリウム、 8mMクエン酸ナトリウムおよび6mML−システィン塩
酸塩から成る溶液(98%約5)にする。連続窒素吹込み下で少くも8時間透析
を行った後、溶液を、IQOOO分子量カットオフ膜により濾過することが好し
い。
得られる生成物は少くとも95チのガンマインターフェロン純度を持ちおよび約
5%以上の収率である。
算ア5図
秦6 図
基7図
国際調査報告
1m#11amaal Ae両−IhPcT/JP 85100715ANNE
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ON
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)組換えDNA技術によつて得られる生理活性を有するポリペプチドの生産微 生物を培養して得られる培養物から、該ポリペプチドの抽出または精製工程にお いて亜鉛又は銅の塩及びポリエチレンイミンを添加することを特徴とする生理活 性を有するポリペプチドの精製方法。 2)前記生産微生物の培養物から得られる微生物細胞を亜鉛又は銅の塩を含む溶 液に懸濁して破砕し、その遠心上清にポリエチレンイミンを添加することを特徴 とする請求の範囲第1項記載の精製方法。 3)前記生理活性を有するポリペプチドがインターフェロン活性、好しくはヒト ガンマインターフエロン活性を有するポリペプチド、特にGIF146またはG IF143である請求の範囲第1項又は第2項記載の精製方法。 4)前記亜鉛の塩の添加量が0.5〜5mMの範囲であり;または前記銅の塩の 添加量が0.05〜3mMの範囲であり;かつポリエチレンイミンを0.5〜1 .5%濃度と左るように添加することを特徴とする請求の範囲第1項、第2項ま たは第3項のいずれかの項に記載の精製方法。 5)ガンマインターフエロン−含有溶液から負に荷電した不純物蛋白;高分子量 物質を除去する工程から成り、該工程は (1)弱塩基性陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーにより負に荷電した 不純物蛋白を除去し、(2)弱酸性陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー による正に荷電した不純物蛋白を除去し、ついで13)グルろ過樹脂による透過 クロマトグラフィーで低及び高分子量物質を除去する、から成ることを特徴とす る請求の範囲第1項左いし第4項のいずれかの項記載の方法。 6)正に荷電した蛋白を除去した直後か又は低又は高分子量物質を除去した直後 にガンマインターフェロン含有溶液から高分子量疎水性物質を除去する工程を更 に含むことを特徴とする請求の範囲第5項記載の方法。 7)前記陰イオン交換樹脂が第四級アミノエチル樹脂であり;および/または前 記弱酸性陽イオン交換樹脂がカルボキシメチル樹脂であり;および/またはゲル 濾過樹脂がセフアデツクスG−100またはセフアクリルS−200から選択さ れ;および/またはガンマインターフェロン含有溶液を、工程1、すなわち硫酸 アンモニウムによる沈澱(具体的には限外濾過し、硫酸アンモニウムによる沈澱 、または限外濾過と硫酸アンモニウムによる沈澱)の後に濃縮することを特徴と する請求の範囲第5項記載の方法。 8)当該方法が、酸素を含まない環境でのシステイン含有緩衝液に対するガンマ インターフェロン含有溶液の透析を最終工程として包含する請求の範囲第5左い し7項のいずれかの項記載の方法。 9)(1)ポリエチレンイミンおよび亜鉛または銅塩を含有する混合物を遠心分 離し、得られた沈澱物を上清から分離し;(2)上記(1)からの溶液を陰イオ ン交換樹脂を含むカラムに吸着させ; (3)吸着物質を溶出し; (4)陽イオン交換樹脂を含むカラムに上記(3)で得た溶出液を吸着させ; (5)吸着物質を溶出し; (6)ゲル濾過樹脂を含むカラムに上記(5)の溶出液を吸着させ;そして (7)吸着された物質を溶出する;の各工程を更に含む請求の範囲第1ないし4 項のいずれかの項記載の方法。 10)工程2からの吸着物質を4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジン −プロパンスルホン酸すトリウムと抗酸化剤、好しくは2−メルカプトエタノー ルとから成る緩衝液で溶出し;および/または工程4からの吸着物質をトリスー HClおよび抗酸化剤から成る緩衝液で溶出し;および/または工程6からの吸 着物質をトリスーHClから成る緩衝液で溶出する、ことを特徴とする請求の範 囲第9項記載の方法。 11)陰イオン交換樹脂が第四級アミノエチル樹脂であり;陽イオン交換樹脂が カルボキシメチル樹脂であり;ゲル濾過樹脂がセフアデツクスG−100である 、ことを特徴とする請求の範囲第10項記載の方法。
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