JPS62500072A - 蛋白質の精製法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質の精製法 発明の技術的分野 本発明は蛋白質の精製法に関するものである。さらに詳細には本発明は、蛋白質 をコードするＤＮＡ配列によって形質転換された細胞の増殖に際し高度に不溶性 の凝集体を形成し、３個未満の表面システィンアミノ酸残基を特徴とする構造を 形成するようこれら細胞の抽出物から可溶化させかつ復元させうる蛋白質の精製 法に関するものである。

本発明の方法により精製される好適蛋白質は、免疫すなわちγインタフェロン（ ＩＦＮ−γ）である。本発明により製造される精製した同質の安定なγインクフ エロンは、ウィルス感染、腫瘍または隔の治療処置、並びに免疫変調の用途およ び方法に利用することができる。

発明の背景 たとえば沈澱、モレキュラシーブタロマトグラフイー、電気泳動、親和性クロマ トグラフィーおよび共有結合クロマトグラフィーのような精製法が当業界で周知 されており、細胞抽出物から蛋白質を精製する際に利用されている。しかしなが ら、蛋白質をコードする組換ＤＮＡ配列により形質転換された細胞によって生産 される蛋白質の精製には独特かつ困難な問題がある。

好ましくは組換ＤＮＡ配列の発現レベルは高く、したがってこのＤＮＡ配列によ り形質転換された宿主細胞は細胞内に所望の蛋白質を多量に生産する。したがっ て、形質転換細胞は多数の外来蛋白質分子を蓄積する。これらの蛋白質分子は次 いで互いに反応して、通常の細胞には典型的には見られないような高度に不溶性 の凝集体を形成する。次いで宿主細胞はこの異常な外来蛋白質の蓄積に対し、外 来蛋白質凝集体よりなる包蔵体を形成して反応する。したがって、生物学上活性 な形態のこれら外来蛋白質の精製には、これら高度に不溶性の蛋白質凝集体を可 溶化してその元来の構造を保持し或いは回復しろる手段を必要とし、さらに蛋白 質の生物学的活性を維持するように可溶性蛋白質を精製する手段を必要とする。

保健分野で価値の大きい遺伝子工学処理された蛋白質はインタフェロンである。

この分野においてはネイチャー、第２８６巻、第１１０頁（１９８０年７月１０ 日）に報告されインクフエロンの命名が使用される。ｒｒＦＮＪはインクフエロ ンをご味し、ｒｌＦＮ−α」は白血球インクフエロンを意味し、ｒｌＦＮ−β」 は繊維芽インクフエロンを意味し、またｒｌＦＮ−γ」はγ−インクフエロンを 意味する。

ＩＦＮは、ｍ胞ＲＮＡの誘発およびウィルス複製に向けられる蛋白質合成を介し 広範囲のウィルスに対して抗ウィルス活性を示す細胞蛋白質である。たとえば、 ヒ１−ＩＦＮは次のウィルス活性に対処するために使用されている：呼吸器感染 〔テキサス・レポート・オン・バイオロジー・アンド・メジスン、第３５Ｓ、第 ４８６−９６頁（１９７７）　（以下これ　５をテキサスレポートと呼ぶ）〕； 単純庖疹角膜炎〔テキサスレポート、第４９７−５００頁；Ｒ，サンドマフバー 、「エキソジニアス・インクフエロン・イン・アイ・ディシーズ」、インターナ ショナル・パイロロジー■、ザ・ハーグ、アブストラクト、階Ｗ２／２２、第９ ９頁（１９７Ｂ））ｉ急性出血合併症〔テキサスレポート、第５０．１−１０頁 〕　；アデノウィルス結膜炎（Ａ、ロマノ等、ＩＳＭメモｌ−Ａ３１３１（１９ ７９年１０月）〕；帯状庖疹〔テキサスレポート、第５１１−１５頁〕　；チト ネガロウイルス感染〔テキサスレポート、第５２３−２７頁〕　；およびＢ型肝 炎〔テキサスレポート、第５１６−２２頁〕。さらにＷ、Ｅ、スチュワード■、 ザ・インクフェロン・システム、第３０７−２１頁、スブリンガー出版（第２版 ）（４９８１）をも参照することができる（以下、これをザ・インクフェロンシ ステムと呼ぶ）。

ＩＦＮは、その抗ウィルス作用に加えて他の作用をも示す。

たとえば、これはコロニー刺戟因子の作用に拮抗し、増血コロニー形成細胞の増 殖を阻止し、かつ顆粒球およびマクロファージ先駆体の正常な分化を阻害する〔 テキサスレポート、第３４３−４９頁〕、さらに、これはＤＭＳＯ処理されたフ レンド白血病細胞における赤血球分化を阻害する〔テキサスレポート、第４２０ −２８頁〕。

さらに、［ＦＮは免疫反応の調節に役割を演する。たとえば、抗原に関する使用 量および使用時間に応じて、ＩＦＮは生体内および試験管内において免疫促進性 になりうると共に、免疫抑制的にもなりうる〔テキサスレポート、第３５７−６ ９頁〕、さらに、ＩＦＮはキラーリンパ球の活性および抗体依存性の細胞媒介細 胞毒性を向上させることも知られている（Ｒ，Ｒ，ハーバ−マン等、「天然かつ 抗体依存性のヒト細胞媒介細胞毒性のインクフェロンによる開始」、ネイチャー 、第２２７巻、第２２１−２３頁（１９７９）ｉＰ、ビバリーおよびり、ナンド 、「死滅は自然におこる」、ネイチャー、第２７８巻、第１１９−２０頁（１９ ７９）；テキサスレポート、第３７５−８０頁ｉＪ、Ｒ，バドルストーン等、「 インクフェロン治療の後のヒトにおける天然キラー細胞の誘発および動力学」、 ネイチャー、第２８２Ｓ、第４１７−１９頁（１９７９）、Ｓ、アインホルン等 、「ヒトにおけるインクフエロンおよび自然の細胞毒性、第■号、外来白血球イ ンクフェロンを接種した患者の研究」、アクタ・メジ力・スカンジナビャ、第２ ０４巻、第４７８−８３頁（１９７８））。

キラーリンパ球および抗体依存性の細胞媒介細胞毒性は、腫瘍細胞に対する免疫 学的作用に直接または間接に関与する。

したがって、抗ウィルス剤としての使用に加え、ＩＦＮは抗腫瘍および抗癌治療 並びに免疫変調剤および方法において有力な用途を有する〔ザ・インクフェロン ・システム、第３１９−２１頁、第２５０−５６頁〕、現在では、ＩＦＮは多く の動物における多種類のｉｔｓの増殖に作用することが知られている〔ザ・イン クフェロン・システム、第２９２−３０４０４頁〕ンクフェロンは、他の抗ｌＩ ｔ瘍剤と同様に、小さい腫瘍に向けられた場合、特に有効であると思われる。動 物ＩＦＮの抗腫瘍作用は投与量および時間に依存するが、この作用は毒性レベル 以下の濃度で示されている。したがって、多くの研究および臨床試験が、ヒ）Ｉ ＦＮの抗腫瘍および抗癌特性について行なわれ続けている。これらは、たとえば 卵巣癌、急性骨髄白血病、多発性骨髄腫およびホジキンス病などの幾つかの悪性 病の治療を含む〔テキサスレポート、第４２９−３５頁〕、これら臨床試験の結 果は有利なものであったが、抗腫瘍、抗癌および免疫変調などのヒ）ＩＦＮの用 途は精製ｒＦＮの充分な供給ができないため著しく阻害されている。

インクフェロンは２つの群、すなわち■型および■型のｒＦＮに分類されている ：■型のＩＦＮはウィルスまたは合成ポリヌクレオチドにより誘発される「典型 的」な酸安定性のＩＦＮであり、−ｍに２種類、すなわちＩＦＮ−αおよびＩＦ Ｎ−βよりなっている。■型のＩＦＮはＩＦＮ−ｒと命名された１種類のみであ り、これは当業界でγインタフエロンとも呼ばれる。

ＩＦＮ−γは特殊抗原または各種のミトゲンによりリンパ球において誘発される グリコ蛋白質であり、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βとは抗原的に異なっている（ Ａ、ｔズラし等、「インクフエロンのグリコシド化」、ジャーナル・バイオロジ カル・ケミストリー、第２５３Ｓ、第７６ｘ２−ｔｓ頁（１９７８）；ザ・イン クフェロン・システム、第１０７−０８Ｍ；Ｐ、グレー等、「イー・コリおよび サル細胞におけるヒト免疫インクフェロンｃＤＮＡの発現」、ネイチャー、第２ ９５巻、第５０３−０８頁（１９８２）　；Ｍ、　Ｐ、ラングフォード等、「ヒ ト免疫インクフエロンの大規模生産および物理化学的特性」、インフェクション ・アンド・イミｊＬ−ニチイ、第２６巻、第３６−４１頁（１９７９））、その 蛋白質は４０，０００〜４６．０００ダルトンの分子量を有すると報告されてお り、そのグリコジル化型は６５，０００〜７０，０００ダルトンの分子量を有す る可能性がある。酸不安定性（Ｐｌ！２において）である他、ＩＦＮ−γは５６ ℃にて１時間後に失活されると報告されている。これについてはさらに、Ｍ、デ レー等、［ミトゲンによりヒト白血球で誘発されるインクフエロン；生産、部分 精製および特性化」、ヨーロピアン・ジャーナル・イミュノロジー、第１０巻、 第８７７−８３頁（１９８０）；ｙ。

Ｋ６イノブ等、「ヒトγ　（免疫）インクフエロンの部分精製および特性化Ｊ、 プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第７８巻、 第１６０１−０５頁（１９８１）も参照することができる。ＩＦＮ−γはＩ’Ｆ Ｎ−αもしくは■ＦＮ−βとは異なる細胞受容体を識別すると報告されている（ Ａ、Ａ、ブランカ等、「Ｉ型および■型のインクフエロンは異なる受容体を有す るという証明」、ネイチャー、第２９４巻、第７６８−７０頁（１，９８１）） 。

ＩＦＮ−γは、その抗ウィルス活性に加え、抗腫瘍活性をも示すと報告されてい る。さらに、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βと比較して、ＩＦＮ−γの抗腫瘍活性 は少なくともネズミにおいて腫瘍の退化をもたらすと思われる。さらに、その天 然キラー細胞の活性化はＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βにつき観察されるように頭 打ちとならず、かつＩＦＮ−γはＴＦＮ−αおよびＩＦＮ−βよりもガングリオ シドの循環レベルによる抑制が低いと思われる〔■（、アルケル等、「ネズミの 繊維芽インクフェロン（Ｉ型）および免疫インクフエロン（■型）；ガングリオ シドに対する親和性およびネズミの白血病Ｌ　−１２１ＯＲ細胞に対する抗ウィ ルスおよび抗増殖作用における顕著な相違」、プロシーディング・ナショナル・ アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第７７巻、第２５２８−３２頁（１９８０） ）。したがって、ＩＦＮ−αもしくはＩＦＮ−βに対し貧弱な反応を示す細胞ま たは腫瘍は、ＩＦＮ−γによって効果的に処置されうると思われる〔たとえばフ レイン等、ジャーナル・ナショナル・カンサー・インスチチュート、第６１Ｓ１ 第８９１頁（１９’７Ｂ）；バーン等、アブストラクト・ニューヨーク・アカデ ミ−・サイエンス、第１１号（１９７９年１０月２３−２６日）；ブラロ・ツク 等、セルラー・イミュノロジー、第４９巻、第３９０−９４頁（１９８０）；Ｂ 、ｙ、ルピン等、「抗ウィルスおよび抗増殖剤としてのヒトＩ型および■型イン タフエロンの効果の差」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエ ンス、ＵＳＡ、第７７巻、第５９２８−３２頁（１９８０））。

さらに、ＩＦＮ−ｒの主たる機能は免疫調節剤としてであることが示唆されてい る。形質転換細胞に対するＩＦＮ−γの抗増殖作用は、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ −βの１０〜１００倍大きいと報告されている（ｐ、ｗ、グレー等、上記〕。

ヒＩ−細胞からのヒトＩＦＮ−γを精製するため、幾つかの技術が開示されてい る。この種の１つの技術は、調節細孔のガラス（ＣＰＧ）およびコンカナバリン Ａ−セファローズに対する順次の吸着に続いてＤＥＡＥ−セファセルに対する吸 着によってヒト白血球の培養物からのＩＦＮ−γを精製することである（Ｙ、に 、イノプ等、「２種類のヒトγ　（免疫）インクフェロンの精製」、プロシーデ ィング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ｔＪｓＡ、第７９巻、第１８２ ０−２４頁（］、９８２））。他の技術は、１９８３年５月３日付けで１．Ａ、 ブローテに対し発行された米国特許第４，３８２．０２７号公報に記載されてい る。ＩＦＮ−γはＣＰＧビーズ、コンカナバリンＡ−セファロース、レンチル・ レクチン−セファロースもしくは豆レクチンーアガロースおよびヘパリン−セフ ァロースまたはプロシアン・レフト−アガロースに対する順次の吸着に続くゲル 濾過クロマトグラフィーによって、ミトゲン誘発ヒト末梢血液白血球からほぼ同 質となるまで精製される。これについては、さらにＭ、Ｐ、ラングフォード、上 記；Ｍ、ビラスウスカースチュワード等、「ヒトおよびネズミインクフェロン■ 型の産生、部分精製および特性化」、モレキュラ・イミュノロジー、第１２巻、 第６２３−２５頁（１９８０）；Ｍ、デレー等、上記；ｙ、＋＜、インプ等、「 ヒトγ　（免疫）インクフエロンの部分精製および特性化」、プロシーディング ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第７８巻、第１６０１−０５ 頁（１９８１）；Ｊ。

八、ジョージＪイド、「ヒトインクフェロンγ　（ＨｕＩＦＮ−γ）の産生およ び精製」、テキサス・レポート・オン・バイオロジー・アンド・メジスン、第４ １巻、第１７９−８３頁（１９８１−８２）を参照することができる。

ヒ）ｆ（［１胞からのヒｔ−ＩＦＮ−ｒを精製する標準法は、精製用の充分量の ＩＦＮ−γを生産するため、抗原もしくはミトゲンによるｗ１胞の誘発または刺 戟をａ、要とする。たとえば、Ｊ、Ａ、ジョージエイズ、上記を参照することが できる。しかしながら、これらの精製法によってさえ臨床試験或いは抗ウィルス 、抗腫瘍、抗癌もしくは免疫変調法および薬剤において大規模使用するのに充分 量のＩＦＮ−γを生産することはできない。

ヒトＩＦＮ−γをコードするＤＮＡ配列をクローン化させかつ宿主細胞で発現さ せる遺伝子工学の技術は、多量の蛋白質の生産を可能にする。しかしながら、多 くの遺伝子工学による蛋白質の場合と同様に、宿主で産生されるヒｌ−Ｉ　ＦＮ −Ｔは高度に不溶性の蛋白質凝集体の形態である。したがって、産生された各種 の宿主の抽出物からＩＦＮ−γを単離しかつ精製するのは極めて困難であること が判明した。これらの精製問題は、抗ウィルス、抗癌および免疫変調法および薬 剤に使用するのに必要な量でＩＦＮ−γを入手しうろことを妨げ　゛本発明は、 遺伝子工学技術により生産された蛋白質の精製法を提供することにより上記の問 題を解決し、この蛋白質はこれをコードするＤＮＡ配列によって形質転換された 細胞の増殖に際し高度に不溶性の凝集体を形成すると共に、３個未満の表面シス ティン残基を特徴とする構造を形成するよう可溶化させかつ復元させることがで きる。

特に本発明の目的は、遺伝子工学処理された蛋白質、すなわち、ヒ）ＩＦＮ−ｒ を安定かつ元来の構造にて精製する手段を提供することである。

さらに本発明の目的は、ヒトにおける治療処置に使用するための［ＦＮ−γを精 製された同質かつ安定な非抗原製剤として提供することである。

特定具体例において、本発明は＋１１　Ｔ　Ｆ　Ｎ　−ｒをコードするＤＮＡ配 列で形質転換されかつこれら配列を細胞内で不溶性の複数凝集体またはこれら凝 集体を含有する包蔵体を形成させるような程度まで発現する細胞を破壊し、（２ ）ケイオＩ・ロープ剤での可溶化によってＩＦＮ−γ蛋白質を抽出し、（３）ケ イオドロープ剤の急速希釈または除去によって可溶性蛋白質をその元来の構成ま で復元させ、かつ（４）チオール樹脂における共有結合クロマトグラフィーに続 き寸法決定クロマトグラフィーによって蛋白質を精製する工程からなっている。

その元構成で得られる精製された［ＦＮ−γを使用して、治療的にヒトのウィル ス感染、腫瘍または癌に対処しかつ免疫変調用途に使用することができる。

３個未満の表面システィンををする他の蛋白質も、本発明にしたがって同様に生 産しかつ精製することができる。

発明を実施する最良方式 ここに記載した本発明をより良く理解しうるよう、以下詳細に説明する。

本発明は、ＩＦＮ−γ並びに蛋白質をコードするＤＮＡ配列により形質転換され た細胞で生産される３個未満の表面システィン残基を有する他の蛋白質を１’Ｊ ！するための方法を提供する。本発明の方法は、精製された蛋白質生成物を与え るだけでなく、ヒトに投与するのに通した安定な天然構造の蛋白質を与える。

ＩＦＮ−γを産生じかつ精製する本発明の好適実施例においては、ＩＦＮ−ｒの ための遺伝子を有しかつＩＦＮ−γ蛋白質の形態で遺伝子を発現するプラスミド にて形質転換されたイー・コリ細胞を培養増殖させる。この種の細胞は一般に、 全細胞蛋白質含有量に対し１０〜４０％の範囲のＩＦＮ−γの発現程度を示す。

この高度の発現は、細胞内に疏水性反応により互いに結合された多数のＩＦＮ− ｒのモノマーよりなる不ｌ容性の複数凝集体を形成する。細菌細胞は典型的には 細胞の細胞質内の包蔵体にこれら凝集体を封入する。

本発明による方法の最初の工程は、これら形質転換細胞を破壊してＩＦＮ−ｒ含 有の包蔵体を遊離させることを必要とする。細胞懸濁物を先ずリゾチームで処理 し、この酵素は細菌細胞壁のペプチドグリカン外層を消化して、細胞を浸透圧も しくは機械的破壊をより受け易くする。完全な細胞破壊は、たとえばフランスプ レスまたはマントン−ガラリンを用いて機械的破壊により達成される。得られた 細胞物質の遠心分離により、細胞中に存在する全ＩＦＮ−ｒの９９％を含有する 膜ペレットを生成させ、これはまだ複数の凝集体または包蔵体の形態である。さ らに、このペレットは脂質とリボ多糖類と微量の核酸とを含有する。殆んどのイ ー・コリ蛋白質は可　］溶性であるため、ペレット蛋白質の約７０％がＩＦＮ− ｒである。

本発明の次の工程は、たとえばグアニジン塩酸塩または尿素のようなケイオドロ ープ剤での処理によるｒＦＮ−γの可溶化である。これらの薬剤は、不溶性蛋白 質凝集体を可溶化させる能力が知られている。膜ペレットをケイオドロープ剤と 共にホモゲナイズして、ＩＦＮ−γの複数凝集体を可溶性の個々の分解した蛋白 質モノマーへ変換させる。可溶化しない物質を遠心分離により除去する。さらに 、ケイオドロープ剤での処理は、燐脂質とリポ多ｗＩ類と核酸とを同様にペレッ ト内で可溶させることも了解すべきである。

ＩＦＮ−ｒ蛋白質の復元は、水性生理緩衝液でのケイオドロープ抽出物の急速希 釈によりケイオドロープ剤の濃度を低下させることによって達成される。個々の ＩＦＮ−γモノマーは安定な天然構造に戻り、かつ溶液中に溶解した状態を保つ 。しかしながら、ＩＦＮ−γの場合、可溶化したＩＦＮ溶液の蛋白質濃度は最初 に約１■／１に調節して希釈または除去に際し可溶性の天然蛋白質を充分回収し うるようにせねばならないことが判明した。より高い蛋白質濃度はケイオドロー プ剤の希釈または除去に際しモノマー間での静電相互反応を促進して、蛋白質の 分解および可溶化を阻害する。したがって、ケイオドロープ含有の可溶化したＥ ＦＮｔＳ液は、最初にケイオドローブ剤含有緩衝液により約１■／ｍｌの蛋白質 濃度まで希釈される。

次いで、ケイオドロープ抽出物をＰＢＳ　（燐酸塩緩衝塩水）およびたとえば蔗 糖のような炭水化物を含有する水性生理緩衝液で希釈して復元を行なう、この希 釈工程は次の２つの機能を示す：（１）この希釈はケイオドロープ剤濃度を減少 させて蛋白質を分解し、かつ（２）希釈緩衝液における炭水化物の存在は蛋白質 から天然構造への復元に際し、ＩＦＮ−γの疏水性領域を安定化させる。

希釈工程に続いて、可溶性の元蛋白質の６０％が回収される。ＩＦＮ−γの４０ ％は沈澱物として損失され、これは濾過により除去される。この沈澱物は、復元 の弱かったＩＦＮ−１分子と燐脂質および核酸汚染物との相互作用によって生ず る。かくして、この復元工程は、ＩＦＮ−γを可溶性の原型で与えるだけでなく 、元蛋白質分子を燐脂質、核酸および蛋白質凝集体の汚染物から分離する選択機 構でもある。

この復元工程の第２の具体例は、抽出物中の可溶化脂質に対し高度の親和性を有 する洗剤の添加を必要とする。抽出物における燐脂質は洗剤で被覆されてミセル を形成し、かくして上記のような可溶性ＴＦＮ−γの沈澱形成および損失をもた らすような静電相互作用を防止する。次いで、ケイオドロープ剤を透析または透 析濾過により溶液から除去することができ、かつ洗剤とミセルとを親和性クロマ トグラフィーにより除去することができる。

復元工程の後に得られた濾液は、約り５％純度のＴ　ＦＮ−γである。しかしな がら、可溶性のイー・コリ蛋白質がまだ溶液を汚染している。ＩＦＮ−γを精製 しかつ濃縮するには、濾液をたとえば活性化チオール−セファロースのようなチ オール樹脂を用いて共有結合クロマトグラフィーにかける。バッチ式吸着を行な い、この場合スルフヒドリル側鎖を有する樹脂、すなわちセファロースビーズを 濾液に加える。この溶液を攪拌しかつカラムにポンプ輸送して、回収樹脂の充填 カラムを形成する。

天然構造におけるＩＦＮ−γはそのアミノ末端に２個の表面システィンを含有す るので、濾液に対するスルフヒドリル含有樹脂の添加は樹脂上のスルフヒドリル 基およびｒ　ＦＮ−Ｔの酸化をもたらして、両者間にジスルフィド結合を形成す る。かくして、溶液中のＩＦＮ−γはジスルフィド結合を介して樹脂に共有結合 され、かつ溶液中の残存蛋白質は樹脂カラムを通過し、その流過容量を捨てる。

この技術は、イー・コリ細胞から抽出されたＩＦＮ−γの精製に特に適している ことに注目される。何故なら、イー・コリ蛋白質は一般に表面システィン残基を 欠りｌし、したがってＩＪｙ液中の可溶性イー　コリ蛋白質ｌり染物は樹脂カラ ムに結合しないからである。さらに、この工程は、表面システィンを１１才る天 然構造にてＩ　Ｆ　Ｎ−７を選択する。システィンが露出されない復元蛋白質は 樹脂に結合せず、流過容量ｔごて力づ・ムを通過する。さらに、樹脂に対するＩ ＦＮ−γ蛋白質の共有結合は、ＩＦＮ−γの安定性をその天然構凸への復元を促 進するごとにより付加する。早期の復元工程は、安定な天然構造に′ｃＩＦＮ− γ集団を与えるが、この段階における蛋白質は充分には復元されなかった。この 段階にて樹脂カラムに蛋白質をそのアミノ末端で結合させれば、蛋白質が固定化 されてその元構造までより充分に復元されうる。Ｅｋｌ＆に、この工程並びにそ の前段の復元工程は、３個未満のシスティン残基を有する蛋白質を必要とするこ とにｌ′Ｉ：、目すべきである。

それより多数のシスティン残基は分子間および分子内のジスルフィド結合の形成 を促進し４、したがって適切な復元および樹脂にり１する蛋白質の結合を阻害す る。

ｆへ合し７たＩ　Ｆ　Ｎ　−ｒをたとえばＤＴＴ　（シナオスし・イト・−ル） またはシスティンのような還元剤によってカラムから溶出さ−ｕ３）。ンスティ ）／は、無毒性であり、かつ蛋白質上にスルフ、ヒ１リル基を還元状態で維持す るので好適であり、かく１−で経時的な蛋白質の凝集を防止する。この共有結合 クロマトグラフィーの工程は、希釈工程に際し１０〜２０倍まで濃縮された安定 な精製Ｉ　ＦＮ−γ集団をもたらす。

本発明の最終工程は、寸法決定、すなわちモレキュラシーブクロマトグラフイー による第２精製である。しかしながら、このクロマトグラフイ一工程は、寸法決 定用カラムに対し精製蛋白質を受容量で充填することを必要とする。したがって 、千オール樹脂カラムからｌ８出された蛋白質を硫酸アンモニウムで沈澱させ、 少最の配合緩衝液に再熔解させて、これを寸法決定用カラムに充填する。

溶液中に残存する大きいＩＦＮ−γ！Ｕ集体が最初に溶出される・次いで、精製 されたＩＦＮ−γが溶出し、後の使用のために回収される。イー　・コリ蛋白質 汚染物および化学試薬が１１１後にｌδ出する。か＜シ、て、このクロマトグラ フィ一工程ＬＳＩさらに、たとえばイー・コリ蛋白質、蛋白質凝集体またはたと えばグアニジン塩酸塩、プロテアーゼ阻止剤または還元剤のような望ましくない 化学試薬を全て除去することによりＩＦＮ−γ製剤を生成する。さらに、この工 程ば、ヒ１゛における最終的治療用途に適した充分な配合緩衝液中へ純粋４くＩ ＦＮ−γを交換することを可能にする。最後に、この精製は全てのバイロゲン燐 脂質を除去し、この燐脂質はＩＦＮ−γと共に精製されて、１ナノグラム以上の 濃度でヒトに段与すＳと毒性作用をもたらしうる。

安定な純ＩＦＮ−ｒ製剤を、ヒトにお＋Ｊるウィルス感染および腫蕩もしくは癌 の治療に使用するのに適した投与濃度まで希釈することができる。

本発明の方法は、遺伝子工学の技術により生産された全ての蛋白質をｔｉ　ｌす るのに使用Ｊることができ、この蛋白質は３個未満の表面システィンアミノ酸残 基を有すると共に形質転換宿を内で不溶性の凝集体を形成することが了解されよ ・う。

本発明を容易に理解しうるよう、ＩＦＮ−γの精製例を下プラスミドｐｔｒｐ− ＩＦＮ−γ　（すなわちｔｒｐに由来する発現制御配列に作用結合したＩＦＮ− ｒをコードするＤＮＡ配列を含んだプラスミド）によって形質転換されたイー・ コリに１２細胞を培養増殖させた。１　ｋｇのこれら細胞を、ポリトロンＰＴ４ ５／８０により３７！の牟別封ン夜阻１　（５％の蔗１唐と０．１Ｍのトリス（ ｐＨ７，５）と５ｍＭのＥＤＴＡと、上りなる）中でホモゲナイズした。０．４ ｇのリゾチーム「粉末」を加え、そして混合物を再びホモゲナイズし、かつ室温 で３０分間静置した。蔗糖とトリスとを含有する緩衝液は細胞の浸透圧溶菌を防 止すると共に、リゾチームでの処理は細菌細胞壁のペプチドグリカン外層の細胞 を除去した。この「軟化したｆｌｌ］胞」をベックマンＪ６Ｂ型にて５００　Ｏ ｒｐｍで６０分間遠心分離し、ポリトロンＰＴ４５／８０　（設定５）にて１１ １の緩（Ｍ液１ｂ２（０，１Ｍのトリス（ｐＨ７，５）および５ｍＭのＥＤＴＡ よりなる）に再懸濁させた。緩衝液阻２　（すなわち蔗糖を欠如した低張性の「 破壊緩衝液」）における細胞の懸濁はこれら細胞を膨潤させて、破壊に対するそ の感受性を増大した。

ホモゲナイズ物をマントン−ガラリンに８０００ｐｓｉで３回通過させることに より、細胞の完全機械破壊を行なった。

破壊された細胞の残骸を冷却された１５６容器（約８°Ｃにて氷上に保つ）に集 め、かつベックマンＪ６Ｂ型にて４０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。かく して模ベレットを得、これをポリトロンＰＴ４５／８０　（設定５）により２Ｉ ２の緩ｉ！ｉ液１ＩｋＬ３（０，５Ｍの尿素、０．２ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの ベンズアミジンおよび１　ｘＰＢＳ　（ｐＨ７，５）　）に再！濁させて洗浄し 、次いでベックマン７６Ｂ型にて４０００　ｒｐｍで６０分間遠心分離した。こ の洗浄によりバンクグランドとしてのイー・コリ蛋白質が除去された。洗浄した 膜ベレットの平を勺重量は、細胞１ｋｇ当り約５０ｇであった。ＩＦＮ−ｒはペ レ・ノド中に不溶性の複数凝集体として存在した。

Ｉ　Ｆ　Ｎ−ｒの抽出および復元 膜ベレットからの安定なＩＦＮ−γ蛋白質モノマーｔｌ＋よ、ケイオドロープ剤 によるべ１ノツトの可溶化を必要とする。次いで、抽出した可溶性蛋白質を、水 性生理緩衝液での可溶化溶液の急速希釈によって復元させた。

５０ｇの洗浄した膜ペレ・７１−を４．５ｅの４Ｎ　ＧｕＨＣｌ（グアニジン塩 酸塩）抽出緩衝液（０，２ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのベンズアミジンおよびＰ　 Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，２）　）に再懸濁させ、かつ約８℃にて３０分間静置した。

可溶化してない物質をペレット化させかつベックマン７６Ｂ型にて５０００　ｒ ｐｎ＋で６０分間遠心分離して捨てた。得られた透明な上澄は、可溶化されたＩ ＦＮ−γとペレット中に含まれる脂質および核酸とを含をした。

抽出物の蛋白質濃度を１■／ｍｌ、すなわち復元のための最適濃度まで低下させ るため、４ＭのＧ　ｕ　ＨＣＩ抽出物を先ず１０％の蔗を唐と１ｍＭのＥＤＴＡ と０．２ｍＭ　ＤＴＴと１０ｍＭのベンズアミンとを含有する４、５７！のＰＢ 　Ｓ　緩衝液（ｐ１１７．２）を添加して２Ｎ　ＧｕＨＣｌまで希釈した。抽出 物の試料を採取して、ビオラド染色試薬法により蛋白質濃度を測定した。この時 点における蛋白質濃度は、典型的には１．５〜２．５ｎｖ／ｍｌの範囲である。

さらに、蛋白質濃度を、１０％の蔗糖と１ｍＭのＥＤＴＡと０．２ｍＭのＤＴＴ と１０ｍＭのベンズアミジンとＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，２＞　とを含有する適当 量の２ＮＧ　ｕ　ＨＣＩ　／ｇ液を添加してＩｍｇ／ｍｌまで低下させた。典型 的には、これら希釈物の最終容積は１０〜２０βの範囲である、これらの希釈は 約８℃にて行なった。

安定な可溶性のＩＦＮ−ｒの復元は、５％の蔗糖と１０ｍＭのベンズアミジンと １ｍＭのＥＤＴＡとを含有するＰＢＳ希釈緩（Ｆ液（ｐｌ＋７．２）の９倍容量 で０〜４℃にて２ｍＭＧｕＨＣＩ抽出物を希釈して行なった。希釈緩衝液を、エ チレングリコール冷却ジャケットを装着した容器中で０−４℃に維持した。溶液 の通気は、収率を著しく低下させるので注意深く回避する。この１／１０希釈は 、復元した可溶性ＩＦＮ−γの約６０％回収をもたらした。ｒＦＮ−ｒの約４０ ％が、リポ多′ｍＲおよび核酸汚染物と共に溶液から沈澱した。この微細な沈澱 を、ミリポアＣＶ６ＬＯＩＴＰ１型の１０インチの０．２２ｍｍ親水性ＴＣジュ ロボアフィルタに通して所定容量（１００〜２００β）濾過することにより除去 した。ここで試料を採取して、ビオラド法により蛋白質濃度を測定した。

この段階における蛋白質濃度は典型的には０．０５５　Ｗ／　ｍｌであ復元した ＩＦＮ−γを含有する希釈混合物を、次いでチオール樹脂を用いる共有結合クロ マトグラフィーにかけた。

ＩＦＮ−γ蛋白質を樹脂に結合させるジスルフィド結合の形成を促進するため、 「希釈」混合物を先ずＩＮ　ＮａＯＨによりｐ１１８に調節した。活性化された チオールセファ０−ス４Ｂ（ファルマシア・ファイン・ケミカルス社）をバンチ 式（２容量％）で加え、そして４℃にて少な（とも２〜３時間または１晩攪拌し た。チオール樹脂は、製造業者により推奨された通りに作成し、すなわち１０倍 容量の蒸留水で洗浄し、次いで０．２　ＭのＧｕＨＣＩと５％の蔗糖と１０ｍＭ のベンズアミジンと５ｍＭのＥＤＴＡとを含有する５倍容量のＰＢＳ緩衝液（ｐ Ｈ８，０）で平衡化させた。ＩＦＮ−ｒは、その表面システィン残基を介し樹脂 上のスルフヒドリル側鎖に共有結合する。

バッチ式吸着の後、活性化したチオールセファロース４Ｂｔ−２００７！７ｈの 流速にてファルマシア力ラム（ＫＳ３７０／１５）にポンプ輸送した。溶出液の 流過容積を蛋白質濃度につき測定し、これからカラム樹脂に結合した蛋白質の量 を決定することができる。充填樹脂カラムを、０．２ＮのＧｕＨＣＩと１０ｍＭ のベンズアミジンと５ｍＭのＥＤＴＡと５％の蔗糖とを含有する５倍容量のＰＢ Ｓ緩衝液（ｐＨ１８，０）にて４０１／ｈの流速で洗浄した。結合したＴＦＮ− ｒの溶出は、洗浄したビーズをＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐｌ＋８．０　）　と４０ｍＭの 還元剤ＤＴＴもしくはシスティンと５％の蔗糖と５ｍＭのＥＤＴＡと１０ｍＭの ベンズアミジンとを含有する２倍容量の溶出緩衝液に４℃で４時間または１晩静 置して行なった。溶出液中に遊離した１ＦＮ−γを３０　ｆｆｉ／ｈの流速で回 収した。ビーズをさらに１容量の溶出緩衝液中に４°Ｃで３０分間静置すること により継続し、そして蛋白質濃度が０．１ｑ／ｍｌ以下になるまでフラクション を集めた。

決定カラムに充填するため少容量まで濃縮せねばならない。

すなわち、４００ｇの固体硫酸アンモニウムを１１のＩＦＮ−γ溶液に溶解させ 、そして４℃にて１晩静置した。生じた蛋白質沈澱物をベンクマンＪ６Ｂ型によ り５０００　ｒｐｍにて４℃で６０分間遠心分離することによりベレット化させ 、次いでＰ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，２）と５％の蔗糖とを含有する配合緩衝液２５ ０ｍ１に溶解させた。未熔解の物質を、２５０ｍ１のパケットを装着したツルバ ールＧＳＡ型ロークにおいて１２．　ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心分離して除去 した。

透明なＩＦＮ−’ｒ？８液（約１５ＩＩｗ／ｌ１１１の濃度で２５０　ｍｌ）を 、１０１のＳ−２００セファデックス寸法決定カラム（Ｋ１００／１００）　４ ：４℃で約５００ｍ１／ｈ（Ｄ流速ニテ加えた。

カラムからの物質の溶出は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により監 視することができ、純ＩＦＮ−γを含有するフラクションをその後の使用のため に集めた。ＩＦＮ−γをカラム容積の約５０％で溶出させ、１００ｍ１のフラク ションを集めた。

この手順により配合緩衝液にまだ存在する安定な純粋ＩＦＮ−γ凋製物が得られ 、これを追加配合緩ｊｆｔ液により適当な投与濃度まで希釈することができる。

特定実施例のみに限定されないことが了解されよう。

１、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８５１０　Ｏ２３６ 住所　オランダ領アンチル、クラカオ、ウィルムシュタ・２ト、ピーターマーイ 　１５ 名称　バイオジエン　ナームローズ　ベンノフトン中ソプ国陣！＋！査報告 ｌＡｌ４ｆｆ１ｊｌｌａ−＾、ユ１ｔｌｂ。、。ＰＣＴ／Ｇ１３８５１００２３ ６

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．蛋白質をコードするＤＮＡ配列により形質転換された細胞が増殖する際に、 高度に不溶性の凝集体を形成し、３個未満の表面システィン残基を有する構造を 形成するよう可溶化しかつ復元させうる蛋白質の精製法において、（ａ）前記形 質転換細胞を破壊し、（ｂ）前記蛋白質をケイオトロープ剤での可溶化によって 抽出し、（ｃ）前記蛋白質をケイオトロープ剤の急速な希釈もしくは除去によっ て復元させ、かつ（ｄ）前記蛋白質をチオール樹脂における共有クロマトグラフ ィーとそれに続く分子寸法決定クロマトグラフィーとによって精製することを特 徴とする蛋白質の精製法。
2. ２．蛋白質凝集体が、これを生産する細胞の増殖に際し包蔵体を形成する請求の 範囲第１項記載の方法。
3. ３．形質転換細胞がイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である請求の範囲第１項記 載の方法。
4. ４．蛋白質がヒトγ−インタフェロン（ＨｕＩＦＮ−γ）である請求の範囲第１ 項記載の方法。
5. ５．ケイオトロープ剤がグアニジン塩酸塩である請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．ケイオトロープ剤が尿素である請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．急速希釈を、たとえばリン酸塩緩衝塩水および炭水化物を含有するような水 性生理緩衝液で行なう請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．炭水化物が蔗糖である請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．蛋白質を還元剤によってチオール樹脂から溶出させる請求の範囲第１項記載 の方法。
10. １０．還元剤がジチオスレイトールまたはシスティンである請求の範囲第９項記 載の方法。
11. １１．請求の範囲第１項記載の方法により製造されるヒト免疫インタフェロン（ ＨｕＩＦＮ−γ）の安定な精製製剤。