JPS6079000A - ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法 - Google Patents
ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法Info
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- JPS6079000A JPS6079000A JP58186383A JP18638383A JPS6079000A JP S6079000 A JPS6079000 A JP S6079000A JP 58186383 A JP58186383 A JP 58186383A JP 18638383 A JP18638383 A JP 18638383A JP S6079000 A JPS6079000 A JP S6079000A
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
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- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/811—Interferon
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/142—Interferon
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトγ型インターフェロン単量体の製造法に
関する。
関する。
インターフェロン（以下工ＦＮと略称することがある）
は、高等動物の細胞がウィルスや核酸などの刺激によっ
て誘発されて産生ずる蛋白であシ、抗ウィルス作用、抗
腫瘍作用などを有する。
は、高等動物の細胞がウィルスや核酸などの刺激によっ
て誘発されて産生ずる蛋白であシ、抗ウィルス作用、抗
腫瘍作用などを有する。
ヒトのインターフェロンには、現在α型、β型およびγ
型の３種の性状の異なるタイプが存在することが知られ
ている。
型の３種の性状の異なるタイプが存在することが知られ
ている。
β型インターフェロン（以下ＩＦ’Ｎ−αと略称する）
、β型インターフェロン（以下工Ｆ’Ｎ−βと略称する
）に関する研究は比較的す＼んでおり、精製法もそれら
の物性もかなυ明らかになって来ている。
、β型インターフェロン（以下工Ｆ’Ｎ−βと略称する
）に関する研究は比較的す＼んでおり、精製法もそれら
の物性もかなυ明らかになって来ている。
γ型インターフェロン（以下ＩＰ”Ｎ−γと略称するこ
とがある。）はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が
起るような状況下で、免疫担当細胞から産生されるため
免疫インターフェロンとも呼ばれている。工Ｆ’Ｎ−γ
はＩＦ’Ｎ−αや工Ｆ’Ｎ−βと比較して、抗細胞増殖
活性や抗腫瘍活性が高いといわれておル、臨床的応用面
からよシ期待されている。しかし、その産生に新群なリ
ンパ球が必要であることなどの制約があるため、これま
で効率のよい産生糸は確立されていない。また、異なる
実験系では、異なる細胞種が異なる分子種のＩＰＨ−４
を産生ずる可能性も示唆されておシ、その構造や性質に
関しても不明な点が数多く残されている。
とがある。）はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が
起るような状況下で、免疫担当細胞から産生されるため
免疫インターフェロンとも呼ばれている。工Ｆ’Ｎ−γ
はＩＦ’Ｎ−αや工Ｆ’Ｎ−βと比較して、抗細胞増殖
活性や抗腫瘍活性が高いといわれておル、臨床的応用面
からよシ期待されている。しかし、その産生に新群なリ
ンパ球が必要であることなどの制約があるため、これま
で効率のよい産生糸は確立されていない。また、異なる
実験系では、異なる細胞種が異なる分子種のＩＰＨ−４
を産生ずる可能性も示唆されておシ、その構造や性質に
関しても不明な点が数多く残されている。
本発明者らは、遺伝子組み換え技術により生産されたと
）ＩＰ’Ｎ−γの精製につき技術開発研究を行っている
際、工ＦＮ−γが非常に多量化を起しやすく、その結果
書られると）ＩＦＮ−γ単量体の収量が悪いことを見出
しだ。
）ＩＰ’Ｎ−γの精製につき技術開発研究を行っている
際、工ＦＮ−γが非常に多量化を起しやすく、その結果
書られると）ＩＦＮ−γ単量体の収量が悪いことを見出
しだ。
ヒ）ＩＦＮ−γの性状に関する報告はあまりないが、多
量体が存在することは知られてる。しかし多量体を単量
体に変換する方法、単量体の多量体への移行を阻止する
方法に関してはまったく知られていない。
量体が存在することは知られてる。しかし多量体を単量
体に変換する方法、単量体の多量体への移行を阻止する
方法に関してはまったく知られていない。
本発明者らは、さらに研究を行いヒ） Ｉ Ｆ’ Ｎ
−ｒ単量体の製造法を確立して本発明を完成した。
−ｒ単量体の製造法を確立して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、粗ヒトγ７（＋＋インターフェロ
ンを還元性硫黄化合物および蛋白変性剤の共存下にゲ／
Ｉ／沖過することを特徴とするヒ占１ノインターフェロ
ン単へ体の製造法である。
ンを還元性硫黄化合物および蛋白変性剤の共存下にゲ／
Ｉ／沖過することを特徴とするヒ占１ノインターフェロ
ン単へ体の製造法である。
ここで番十粗ヒトγ型インターフェロンはヒト工ＦＮ−
γを含有するものであればいかなるものでもよい。天然
に存在するヒ）ＩＦＮ−γを濃縮、分離したものや遺伝
子組み換え技術によって得られるヒト１Ｆ’Ｎ−γ生産
能を有する微生物の培養によシ製造されたヒト１ＦＮ−
γ〔特願昭５８−４９６８１号明細書；ヌクレイツク
アシッドリサーチ、第１０巻、２４８７−２５０１頁（
１９８２年）１ネイチャ、第２９５巻、５０３−５０８
頁（１９８２年）参照〕を用いることができる。実用面
からは、上記と）ＩＦＮ−γ生産能を有する微生物を培
養して得られる菌体抽出液、硫安分画液、抗体カラム溶
出液−イオン交換溶出液を粗ヒトエＦＮ−γとして用い
るが、不純蛋白量が多いほど還元性硫黄化合物の量が多
く必要にな９経済的ではないため、一般には抗体カラム
あるいはイオン交換カラム溶出液等を適用するのが好ま
しい。また粗ヒ）ＩＦＮ−γは多量化していてもさしつ
かえない。
γを含有するものであればいかなるものでもよい。天然
に存在するヒ）ＩＦＮ−γを濃縮、分離したものや遺伝
子組み換え技術によって得られるヒト１Ｆ’Ｎ−γ生産
能を有する微生物の培養によシ製造されたヒト１ＦＮ−
γ〔特願昭５８−４９６８１号明細書；ヌクレイツク
アシッドリサーチ、第１０巻、２４８７−２５０１頁（
１９８２年）１ネイチャ、第２９５巻、５０３−５０８
頁（１９８２年）参照〕を用いることができる。実用面
からは、上記と）ＩＦＮ−γ生産能を有する微生物を培
養して得られる菌体抽出液、硫安分画液、抗体カラム溶
出液−イオン交換溶出液を粗ヒトエＦＮ−γとして用い
るが、不純蛋白量が多いほど還元性硫黄化合物の量が多
く必要にな９経済的ではないため、一般には抗体カラム
あるいはイオン交換カラム溶出液等を適用するのが好ま
しい。また粗ヒ）ＩＦＮ−γは多量化していてもさしつ
かえない。
還元性硫黄化合物としては、例えばシスティン、Ｎ−ア
七チルシスティン、Ｎ−アセチルホモシスティ″／、還
元型グルタチオン、チオエタノールアミン、モノチオグ
リセロール、ジチオスレイトール＊ ／＋ｙｃ 素数１
〜７のチオアルカン、ロンガリットなどの有機含硫黄化
合物やメタ重亜硫酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩）な
どの無機含硫黄化合物があげられる。
七チルシスティン、Ｎ−アセチルホモシスティ″／、還
元型グルタチオン、チオエタノールアミン、モノチオグ
リセロール、ジチオスレイトール＊ ／＋ｙｃ 素数１
〜７のチオアルカン、ロンガリットなどの有機含硫黄化
合物やメタ重亜硫酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩）な
どの無機含硫黄化合物があげられる。
蛋白変性剤としては、例えば、グアニジン塩（塩酸塩、
硫酸塩）、尿素、チオシアン酸塩（ナトリウム塩、カリ
ウム塩）などがあげられる。
硫酸塩）、尿素、チオシアン酸塩（ナトリウム塩、カリ
ウム塩）などがあげられる。
グ／ｌ／Ｆｌ適用のゲルとしては市販のものなどから自
由に選択されるが、デキストラン、ポリアクリルアミド
、アガロースなどのゲル粒子が好しい。
由に選択されるが、デキストラン、ポリアクリルアミド
、アガロースなどのゲル粒子が好しい。
また、例えば遺伝子組み換え技術によシ製造されると）
ＩＦＮ−γに適用する場合、その分子量が１７．１４３
であることや他の不純蛋白との分ば（効率を考え、分画
範囲１．０００〜ｓ ｏ、ｏ ｏ ｏ程度の性能を有す
るものから選択して使用するのが好都合である。具体的
にはとりわけセファデックスＧ−５０、Ｇ−７５、に７
７クリ／ｌ／Ｓ−２００゜ｔ＜イオケ１ＶＰ−１０、Ｐ
−３０、Ｐ−６０等があげられる。
ＩＦＮ−γに適用する場合、その分子量が１７．１４３
であることや他の不純蛋白との分ば（効率を考え、分画
範囲１．０００〜ｓ ｏ、ｏ ｏ ｏ程度の性能を有す
るものから選択して使用するのが好都合である。具体的
にはとりわけセファデックスＧ−５０、Ｇ−７５、に７
７クリ／ｌ／Ｓ−２００゜ｔ＜イオケ１ＶＰ−１０、Ｐ
−３０、Ｐ−６０等があげられる。
使用するゲルの量は、通常付加するサンプルの５〜１０
０倍（Ｗ／Ｗ ）好しくけ１０〜３０倍（Ｗ／Ｗ）量で
ある。
０倍（Ｗ／Ｗ ）好しくけ１０〜３０倍（Ｗ／Ｗ）量で
ある。
ゲ／Ｉ／Ｆ３過の方法は、通常用いられるカラム法が適
している。
している。
すなわち、粗ヒ） Ｉ Ｆ’ Ｎ −ｒを緩衝液などに
溶解し水溶液となし、展開溶媒であらかじめ平衝とした
ゲルカラムに付加する。これを展開溶媒により溶出する
。溶出速度は、サンプルの不純度、ゲルの種類、量によ
り異なるが、通常ＳＶ（スペース ベロシティ）０゜１
〜１０１好しくは、Ｓｖｏ、５〜３である。溶出液は通
常の方法によυ分画する。
溶解し水溶液となし、展開溶媒であらかじめ平衝とした
ゲルカラムに付加する。これを展開溶媒により溶出する
。溶出速度は、サンプルの不純度、ゲルの種類、量によ
り異なるが、通常ＳＶ（スペース ベロシティ）０゜１
〜１０１好しくは、Ｓｖｏ、５〜３である。溶出液は通
常の方法によυ分画する。
ヒト１ＦＮ−γの画分は、通常の方法、たとえば０−Ｄ
−２８０ｎｍの吸収等で溶出曲線として表わすことによ
り容易に検出することができる。
−２８０ｎｍの吸収等で溶出曲線として表わすことによ
り容易に検出することができる。
ヒトＩＰ’Ｎ−γと還元性＠、ｖｔ化合物および蛋白父
性剤を共存させるのは上記ゲ／Ｉ／濾過操作のいずれの
工程においてでもよいが、ヒト１ＦＭ−γをゲルに付加
するだめの水溶液および展開溶媒に還 ・光性硫黄化合
物および蛋白変性剤を加えておくのが好しい。
性剤を共存させるのは上記ゲ／Ｉ／濾過操作のいずれの
工程においてでもよいが、ヒト１ＦＭ−γをゲルに付加
するだめの水溶液および展開溶媒に還 ・光性硫黄化合
物および蛋白変性剤を加えておくのが好しい。
なお蛋白変性剤は、抽出、抗体カラム処理など・ 前処
理で使用している場合には、カラムに付加するための水
溶液に改めて加えることなくその溶液のまま使用するこ
とが可能である。
理で使用している場合には、カラムに付加するための水
溶液に改めて加えることなくその溶液のまま使用するこ
とが可能である。
上記付加川水溶液および展開溶媒は、ｐＨについては５
．０〜８．０、とシわけ中性付近で、還元性硫黄化合物
を１〜１００ ｍＭとりわけ５〜２０ｍＭの濃度で含有
させるのが好ましく、蛋白変性剤を０．１〜７Ｍとりわ
け１〜２Ｍの濃度で含有させることが好ましい。
．０〜８．０、とシわけ中性付近で、還元性硫黄化合物
を１〜１００ ｍＭとりわけ５〜２０ｍＭの濃度で含有
させるのが好ましく、蛋白変性剤を０．１〜７Ｍとりわ
け１〜２Ｍの濃度で含有させることが好ましい。
このようにして得られた精製されたヒ１４Ｆ’Ｎ−γ単
量体を含む溶出液は、還元性ｒｉＪｊ黄化合物化合物変
性剤が含まれているが、必要によりこれらを除去するこ
とができる。これらの低分子化合物ととトエＦＮ−γの
ような高分子化合物の分離にはゲｖｆ過によるのが好し
い。
量体を含む溶出液は、還元性ｒｉＪｊ黄化合物化合物変
性剤が含まれているが、必要によりこれらを除去するこ
とができる。これらの低分子化合物ととトエＦＮ−γの
ような高分子化合物の分離にはゲｖｆ過によるのが好し
い。
零ゲ）ｖＦＩ過は、上記単量化のためのゲｙｖＦ３過と
同様に行うことができるが、用いるゲルはと９わけセフ
ァデックス２５など低分子化合物の１余去に適したもの
があげられる。
同様に行うことができるが、用いるゲルはと９わけセフ
ァデックス２５など低分子化合物の１余去に適したもの
があげられる。
さらに還元性硫黄化合物の除去を確実に行う必要がある
時は通常の操作によシ限外膜濾過に付することもできる
。
時は通常の操作によシ限外膜濾過に付することもできる
。
これらの低分子化合物とヒ）ＩＦ’Ｎ−γの分１、雅操
作においては、ヒト血清アルブミン等を加えてヒトエＦ
Ｎ−γの安定化を図ることもできる。
作においては、ヒト血清アルブミン等を加えてヒトエＦ
Ｎ−γの安定化を図ることもできる。
本ヒ）ＩＦＮ−γ単量体は、必要によりこれを凍結乾燥
により粉末とすることができる。
により粉末とすることができる。
本発明により製造されるヒ）ＩＦＮ−γ単量体は従来の
方法で得られるＩＩＦ’Ｎ−γと同様の目的に同様の用
法によシ使用できるが、従来品に比し、夾雑蛋白質１発
熱物質が少ないので、注射剤原体等としてより安全に使
用される。
方法で得られるＩＩＦ’Ｎ−γと同様の目的に同様の用
法によシ使用できるが、従来品に比し、夾雑蛋白質１発
熱物質が少ないので、注射剤原体等としてより安全に使
用される。
本発明によシ製造されるヒ）ＩＦ’Ｎ−γ坩軟体は抗ウ
ィルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制および免疫増強作用を示
し、公知の１ＦＮ−γと同様にして投与することができ
る。
ィルス、抗腫瘍、細胞増殖抑制および免疫増強作用を示
し、公知の１ＦＮ−γと同様にして投与することができ
る。
本明細書中でＩＦＨの活性としての抗ウィルス活性；Ｕ
／ｍ／（ユニッ） ／ ａｔ ）の出し方は以下の様に
行った。ユニットの確定した国際標準ＩＦＮ−αと白血
球由来の粗ＩＦ’Ｎ−γをヒト羊膜由来ＦＬｉＪ］］胞
株に対するＶＳＶの細胞変性効呆阻止試験を用いて測定
し、その力価の比較から白血球由来粗ＩＦＮ−１の力価
を決定し工ＦＮ−γの標準品とした。目的とする資料中
のＩＦＮ−γの力価算定のためには、常にこの標準工Ｆ
Ｎ−γを並べて前述のＷ工５Ｈ−ｖｓｖＯ系でアッセイ
を行い、その比率から力価を算出した。
／ｍ／（ユニッ） ／ ａｔ ）の出し方は以下の様に
行った。ユニットの確定した国際標準ＩＦＮ−αと白血
球由来の粗ＩＦ’Ｎ−γをヒト羊膜由来ＦＬｉＪ］］胞
株に対するＶＳＶの細胞変性効呆阻止試験を用いて測定
し、その力価の比較から白血球由来粗ＩＦＮ−１の力価
を決定し工ＦＮ−γの標準品とした。目的とする資料中
のＩＦＮ−γの力価算定のためには、常にこの標準工Ｆ
Ｎ−γを並べて前述のＷ工５Ｈ−ｖｓｖＯ系でアッセイ
を行い、その比率から力価を算出した。
以下実施例および参考例にょシ木発明をより具体的に説
明するが、これらにょシ木発明は制限されるものではな
い。
明するが、これらにょシ木発明は制限されるものではな
い。
なお実施例中に記載した抗体カラムＡｂ（ｙ。
ｒ２−１１．１）は国際出１ｉｉＩＴＰ ＣＴ／ Ｊ
Ｐ ８３１０実施例１ （１） 参考例１ｊで得た凍結菌体１０（ｌに７Ｍ塩酸
グアニジンおよび２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オライドを含む１００ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
０）を３００ｍ／加え、４℃で１時間攪拌したのち遠心
分離機（１７，００Ｏｒｐｍ／３０分）にかけ澄明表土
清液をえた。この上清液を１３７ｍＭ１ｉ化ナトリウム
、 ２．７ ｍ Ｍ塩（ＩＪ ！Ｊウム、８ｍＭリン酸
二ナトリウムおよび１．４７ｍＭリン酸−カリウムから
戒名ＡＪ２ ｇＴ ｒ＆ （以下ｐ、 ｎ ｓと略す）
で７０倍に希釈し、生じてくる沈１’３物をシャープレ
ス遠心外ｇｉＬｕ！ （１０、０００ｒ ｐ＋ａ ）
Ｉ（Ｃ力は除去した。次いでえられた上清液２２Ａをベ
リコン（ミリポア社製２分両分子ｆｆｌ： １０．００
０ ）で１．５１にまで濃縮した。この湿縮液を４℃で
一夜放散し、生じた沈嫂物をさらに遠心外ｉＶ＋：’！
（ｔｏ。
Ｐ ８３１０実施例１ （１） 参考例１ｊで得た凍結菌体１０（ｌに７Ｍ塩酸
グアニジンおよび２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オライドを含む１００ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
０）を３００ｍ／加え、４℃で１時間攪拌したのち遠心
分離機（１７，００Ｏｒｐｍ／３０分）にかけ澄明表土
清液をえた。この上清液を１３７ｍＭ１ｉ化ナトリウム
、 ２．７ ｍ Ｍ塩（ＩＪ ！Ｊウム、８ｍＭリン酸
二ナトリウムおよび１．４７ｍＭリン酸−カリウムから
戒名ＡＪ２ ｇＴ ｒ＆ （以下ｐ、 ｎ ｓと略す）
で７０倍に希釈し、生じてくる沈１’３物をシャープレ
ス遠心外ｇｉＬｕ！ （１０、０００ｒ ｐ＋ａ ）
Ｉ（Ｃ力は除去した。次いでえられた上清液２２Ａをベ
リコン（ミリポア社製２分両分子ｆｆｌ： １０．００
０ ）で１．５１にまで濃縮した。この湿縮液を４℃で
一夜放散し、生じた沈嫂物をさらに遠心外ｉＶ＋：’！
（ｔｏ。
０００ｒｐｍ／３０分）にかけて除去した。この上４・
ｉ液を予め充填した抗体カラム（Ａｂ （Ｍｏ γ２−
１１．１）；５ｘ３ｃ＋＋＋）に流速１．０００ ｒｙ
ｅ１時１；ｉで負荷したのち、ＰＢＳの５００ ｒ：４
、Ｉ Ｍ Ｊｆ＋４化す（・リウムおよび０．１９１
６ツイーン２ｏを含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）の１．０００ｒｒｉ 、 Ｐ ｍＳの５００ｇ／
、および０．５Ｍ塩酸グアニジンを含んだ２ＱｍＭリン
酸緩衝液（１？Ｈ７，Ｏ）の５００ゴの各洗浄液を遂次
抗体カラムをｉ１ｎ過させたのぢ、２Ｍ塩酸グアニジン
を含む２０ｍＭ！Ｊノド２１’ｊ 包ｒ液（ＰＨ７，０
）で溶出し、抗ウィルス活性を有する溶出画分６２ｗｔ
ｔを集めた。
ｉ液を予め充填した抗体カラム（Ａｂ （Ｍｏ γ２−
１１．１）；５ｘ３ｃ＋＋＋）に流速１．０００ ｒｙ
ｅ１時１；ｉで負荷したのち、ＰＢＳの５００ ｒ：４
、Ｉ Ｍ Ｊｆ＋４化す（・リウムおよび０．１９１
６ツイーン２ｏを含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）の１．０００ｒｒｉ 、 Ｐ ｍＳの５００ｇ／
、および０．５Ｍ塩酸グアニジンを含んだ２ＱｍＭリン
酸緩衝液（１？Ｈ７，Ｏ）の５００ゴの各洗浄液を遂次
抗体カラムをｉ１ｎ過させたのぢ、２Ｍ塩酸グアニジン
を含む２０ｍＭ！Ｊノド２１’ｊ 包ｒ液（ＰＨ７，０
）で溶出し、抗ウィルス活性を有する溶出画分６２ｗｔ
ｔを集めた。
（ＩＩ） 実施例１（１）で得たＩＦ’Ｎ−ｒの６２ｙ
ｓｌを予め１ｍＭエチレンジアミン四酢【俊υＬ１５０
ｍλ（塩化ナトリウム＋’ ｌ Ｏｍ Ｍシスティン塩
酸塩および２Ｍ」光酸グアニジンを含んだ２５ｍＭｒｉ
ｔｆ酸緩衝液（ｐＨ５，９）で平衡化したセファクリ−
／Ｌ’Ｓ −２００（ファルマシア社製）のカラム（５
，ＯＸ６０、 Ｏｃｍ ）に負荷し、同一緩衝液で溶出
し、化ツマー溶出画分８３ｍ１を隼めた。このようにし
てえられた画分はドデシル＠酸ナトリウムのスフブ電作
により比活性１．５ Ｘ １０’ Ｕ／＋ＩＩｇ・タン
白の１ＦＮ−γを３．７〜得た。なお実施例１（１）と
同じ方法で得た工ＦＮ−γを実施例１ （１１）で使用
したゲμ濾過の展開剤のうち、１０ ｍ Ｍシスティン
塩酸塩を除いたもので同様の処理を行ったところ、ダイ
マーやオリゴマー自分が溶出液全体の約９０％を占め、
化ツマー両分は約１０％と少なかった。この結果から、
システィン塩酸塩およびグアニジン塩酸塩の共存下にお
けるモノマーへの収斂効果が明らかとなった。
ｓｌを予め１ｍＭエチレンジアミン四酢【俊υＬ１５０
ｍλ（塩化ナトリウム＋’ ｌ Ｏｍ Ｍシスティン塩
酸塩および２Ｍ」光酸グアニジンを含んだ２５ｍＭｒｉ
ｔｆ酸緩衝液（ｐＨ５，９）で平衡化したセファクリ−
／Ｌ’Ｓ −２００（ファルマシア社製）のカラム（５
，ＯＸ６０、 Ｏｃｍ ）に負荷し、同一緩衝液で溶出
し、化ツマー溶出画分８３ｍ１を隼めた。このようにし
てえられた画分はドデシル＠酸ナトリウムのスフブ電作
により比活性１．５ Ｘ １０’ Ｕ／＋ＩＩｇ・タン
白の１ＦＮ−γを３．７〜得た。なお実施例１（１）と
同じ方法で得た工ＦＮ−γを実施例１ （１１）で使用
したゲμ濾過の展開剤のうち、１０ ｍ Ｍシスティン
塩酸塩を除いたもので同様の処理を行ったところ、ダイ
マーやオリゴマー自分が溶出液全体の約９０％を占め、
化ツマー両分は約１０％と少なかった。この結果から、
システィン塩酸塩およびグアニジン塩酸塩の共存下にお
けるモノマーへの収斂効果が明らかとなった。
（Ｉｌｌ） 実施例１ （ＩＩ）でえたＩＰ’Ｎ−γの
８３河ｆを予め１９ｍＭシスティン塩酸塩、１５０ｍＭ
Ｊｊ４化ナトリウムおよび０．０１％ツイー７２０を含
む２５ｍＰＡ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセ
ファデック、スＧ−２５のカラム（５，Ｏｘ ６０．Ｏ
ｃｎ＋）に負荷し、同一緩衝液で溶出し、塩酸グアニジ
ンを除いたＩＦＮ−γの溶出画分９０乃ｔ（２，７４１
）をえた。このＩＦＮ−ゴの比活性は１．７ Ｘ １０
０７Ｋｇ・タン白であった。
８３河ｆを予め１９ｍＭシスティン塩酸塩、１５０ｍＭ
Ｊｊ４化ナトリウムおよび０．０１％ツイー７２０を含
む２５ｍＰＡ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセ
ファデック、スＧ−２５のカラム（５，Ｏｘ ６０．Ｏ
ｃｎ＋）に負荷し、同一緩衝液で溶出し、塩酸グアニジ
ンを除いたＩＦＮ−γの溶出画分９０乃ｔ（２，７４１
）をえた。このＩＦＮ−ゴの比活性は１．７ Ｘ １０
０７Ｋｇ・タン白であった。
Ｇｙ） 実施例１ （ｆｉｌ）でえだ工ＦＮ−ｒ９０ｍ
ｌｌｔてヒト血清アルブミンを４５０■量添加、溶１゛
イしたのち、ダイアフローＰＭ−１０（アミコン社製限
外ｐ過膜）の膜で限外ｐ適法により６０Ｋｇにまで閥縮
した。この濃縮液を予め１５０ｍＭ塩化ナトリウム２５
ｍＭリン酸Ｍ衝液（ｐ Ｈ７，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−７５（５ｘ６０ｃ＋ｎ）Ｋ負荷し、同一緩
衝液で展開、溶出し、ＩＦＮ−γ画分を集めた。この操
作で、実施例１ （ｌｉｔ）でえられだＸ Ｆ Ｎ−γ
に残存するシスティンは除かれ、代９にヒト血清アルブ
ミンを含んだ比活性１．５ Ｘ １０７Ｕ／Ｅ’ｊ・タ
ン白のＩＦＮ−γ溶ｒｔ３３ｇ／（２，２４）をえた。
ｌｌｔてヒト血清アルブミンを４５０■量添加、溶１゛
イしたのち、ダイアフローＰＭ−１０（アミコン社製限
外ｐ過膜）の膜で限外ｐ適法により６０Ｋｇにまで閥縮
した。この濃縮液を予め１５０ｍＭ塩化ナトリウム２５
ｍＭリン酸Ｍ衝液（ｐ Ｈ７，０）で平衡化したセファ
デックスＧ−７５（５ｘ６０ｃ＋ｎ）Ｋ負荷し、同一緩
衝液で展開、溶出し、ＩＦＮ−γ画分を集めた。この操
作で、実施例１ （ｌｉｔ）でえられだＸ Ｆ Ｎ−γ
に残存するシスティンは除かれ、代９にヒト血清アルブ
ミンを含んだ比活性１．５ Ｘ １０７Ｕ／Ｅ’ｊ・タ
ン白のＩＦＮ−γ溶ｒｔ３３ｇ／（２，２４）をえた。
実施例２
実施例１（１）と同様の方法でえた抗体カラムからの溶
出液に還元型グルタチオンを１０ｍＭ１添加し、比活性
３．０ Ｘ １０６Ｕ／’Ｋｌ・タン白のモノマーリッ
チな粗ＩＦ’Ｎ−γを６３河ｆ（１１り）えた。
出液に還元型グルタチオンを１０ｍＭ１添加し、比活性
３．０ Ｘ １０６Ｕ／’Ｋｌ・タン白のモノマーリッ
チな粗ＩＦ’Ｎ−γを６３河ｆ（１１り）えた。
次いで、この粗ＩＦＮ−γを実施例１（Ｉｌｌと同様の
方法、但しゲル濾過用緩衝液のうちシスティンを１０ｍ
Ｍ還元型グルタチオンに代えたものを用い、七ツマー溶
出画分８５ゴを集めた、１このようにしンを溶出画分（
８５簿／）に４２５ｍｔ量添加し、ゲｌｖ濾過を行い塩
酸グアニジンを除いた比活性１．８Ｘ１０Ｕ／＃Ｉｉタ
ン白のＩＦ’Ｎ−ｒ溶液を９０ｒｒｒｌ得た。
方法、但しゲル濾過用緩衝液のうちシスティンを１０ｍ
Ｍ還元型グルタチオンに代えたものを用い、七ツマー溶
出画分８５ゴを集めた、１このようにしンを溶出画分（
８５簿／）に４２５ｍｔ量添加し、ゲｌｖ濾過を行い塩
酸グアニジンを除いた比活性１．８Ｘ１０Ｕ／＃Ｉｉタ
ン白のＩＦ’Ｎ−ｒ溶液を９０ｒｒｒｌ得た。
β前例
米国特許出願第３９７．３８８号（１９８２年７月１２
日出願）明細書実施例８記、；３：の発現用ヒトＩＦＮ
−１遺伝子を有する白株ＲＲＩ （ｐＲＩＣ２４８ｃＩ
ｔｓ 、 ｐＲｃ２３１／工ＦＩ −９００）をＭ９−
グルコース培地で３０℃で菌体潤度が３−４＜１０”’
細胞／清ｌになるまで培４ｔ シた後、グルコース、カ
ザミノ酸を濃度がそれぞれ１０％、０５％になるように
加えて４２℃で１時間誘発させた。イ（）られた培養液
を遠心分離にかけて閏体を集め、凍結して保存した。
日出願）明細書実施例８記、；３：の発現用ヒトＩＦＮ
−１遺伝子を有する白株ＲＲＩ （ｐＲＩＣ２４８ｃＩ
ｔｓ 、 ｐＲｃ２３１／工ＦＩ −９００）をＭ９−
グルコース培地で３０℃で菌体潤度が３−４＜１０”’
細胞／清ｌになるまで培４ｔ シた後、グルコース、カ
ザミノ酸を濃度がそれぞれ１０％、０５％になるように
加えて４２℃で１時間誘発させた。イ（）られた培養液
を遠心分離にかけて閏体を集め、凍結して保存した。
Claims (1)
- 粗ヒトγ型インターフェロンを還元性硫黄化合物および
蛋白変性剤の共存下にゲ／ｌ／濾過することを特徴とす
るヒトγ型インターフェロン単量体の製造法。
Priority Applications (17)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58186383A JPS6079000A (ja) | 1983-10-04 | 1983-10-04 | ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法 |
| ZA847501A ZA847501B (en) | 1983-10-04 | 1984-09-24 | Production of monomeric human ypsilon-interferon |
| US06/654,789 US4686284A (en) | 1983-10-04 | 1984-09-26 | Production of monomeric human γ-interferon |
| DE8484111753T DE3481193D1 (de) | 1983-10-04 | 1984-10-02 | Herstellung menschlichen monomer-gamma-interferons. |
| PT79298A PT79298B (en) | 1983-10-04 | 1984-10-02 | Production of monomeric human gama-interferon |
| KR1019840006083A KR910006603B1 (ko) | 1983-10-04 | 1984-10-02 | 인체 γ-인터페론 단량체의 제조방법 |
| AT84111753T ATE49981T1 (de) | 1983-10-04 | 1984-10-02 | Herstellung menschlichen monomer-gammainterferons. |
| EP84111753A EP0136694B1 (en) | 1983-10-04 | 1984-10-02 | Production of monomeric human gamma-interferon |
| GR80545A GR80545B (en) | 1983-10-04 | 1984-10-03 | Production of monomeric human g-interferon |
| ES536471A ES536471A0 (es) | 1983-10-04 | 1984-10-03 | Un metodo para producir -interferon humano monomero |
| DK474384A DK474384A (da) | 1983-10-04 | 1984-10-03 | Fremgangsmaade til fremstilling af monomert humant gamma-interferon |
| PH31298A PH20251A (en) | 1983-10-04 | 1984-10-03 | Production of monomeric human y-interferon |
| CA000464589A CA1239094A (en) | 1983-10-04 | 1984-10-03 | PRODUCTION OF MONOMERIC HUMAN .gamma.-INTERFERON |
| AU33804/84A AU572196B2 (en) | 1983-10-04 | 1984-10-03 | Production of monomeric human y-interferon |
| NZ209758A NZ209758A (en) | 1983-10-04 | 1984-10-03 | Production of monomeric human #q#-interferon |
| IL73166A IL73166A (en) | 1983-10-04 | 1984-10-04 | Production of monomeric human ypsilon-interferon |
| CN198585101907A CN85101907A (zh) | 1983-10-04 | 1985-04-01 | 单节显性人体γ-干扰素的制造 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58186383A JPS6079000A (ja) | 1983-10-04 | 1983-10-04 | ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6079000A true JPS6079000A (ja) | 1985-05-04 |
| JPH0428279B2 JPH0428279B2 (ja) | 1992-05-13 |
Family
ID=16187426
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58186383A Granted JPS6079000A (ja) | 1983-10-04 | 1983-10-04 | ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4686284A (ja) |
| EP (1) | EP0136694B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6079000A (ja) |
| KR (1) | KR910006603B1 (ja) |
| CN (1) | CN85101907A (ja) |
| AT (1) | ATE49981T1 (ja) |
| AU (1) | AU572196B2 (ja) |
| CA (1) | CA1239094A (ja) |
| DE (1) | DE3481193D1 (ja) |
| DK (1) | DK474384A (ja) |
| ES (1) | ES536471A0 (ja) |
| GR (1) | GR80545B (ja) |
| IL (1) | IL73166A (ja) |
| NZ (1) | NZ209758A (ja) |
| PH (1) | PH20251A (ja) |
| PT (1) | PT79298B (ja) |
| ZA (1) | ZA847501B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
| US4855238A (en) | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
| IL74093A0 (en) * | 1984-01-23 | 1985-04-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Stable composition of gamma-interferon |
| GB8414354D0 (en) * | 1984-06-05 | 1984-07-11 | Biogen Nv | Purifying protein |
| GB8508340D0 (en) * | 1985-03-29 | 1985-05-09 | Creighton T E | Production of protein |
| US4873312A (en) * | 1985-04-25 | 1989-10-10 | Amgen | Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| US4950470A (en) * | 1986-10-06 | 1990-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions employing interferon-gamma |
| CA2090701C (en) * | 1990-09-05 | 2000-05-16 | Southern Cross Biotech Pty. Ltd. | Solubilization of proteins in active forms |
| AU648214B2 (en) * | 1991-12-31 | 1994-04-14 | Lucky Limited | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc. |
| US5434249A (en) * | 1992-05-27 | 1995-07-18 | Viragen Inc. | Method for modulating specific activity of inteferon alpha |
| JP3452779B2 (ja) * | 1997-11-28 | 2003-09-29 | 株式会社東海理化電機製作所 | 回転量制限装置及びウエビング巻取装置 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7404589A (nl) * | 1974-04-03 | 1975-10-07 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het stabiliseren van interferon. |
| US4100150A (en) * | 1975-11-04 | 1978-07-11 | G. D. Searle & Co. | Stabilization of interferon against mechanical stress using thioctic acid |
| US4278661A (en) * | 1979-10-12 | 1981-07-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Purification of interferon |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| EP0080879B1 (en) * | 1981-11-28 | 1986-10-01 | Sunstar Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition containing interferon in stable state |
| CA1210714A (en) * | 1982-03-23 | 1986-09-02 | Alan Sloma | .alpha.-INTERFERON GX-1 |
| US4432895A (en) * | 1982-11-24 | 1984-02-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Monomeric interferons |
| US4476049A (en) * | 1983-09-20 | 1984-10-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the extraction of immune interferon |
-
1983
- 1983-10-04 JP JP58186383A patent/JPS6079000A/ja active Granted
-
1984
- 1984-09-24 ZA ZA847501A patent/ZA847501B/xx unknown
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1985
- 1985-04-01 CN CN198585101907A patent/CN85101907A/zh active Pending
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| PT79298A (en) | 1984-11-01 |
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| PESTKA | Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Medicine and Dentistry of New Jersey |