JPS60155137A - 高濃度ヒトγ型インタ−フエロン水溶液の製造法 - Google Patents
高濃度ヒトγ型インタ−フエロン水溶液の製造法Info
- Publication number
- JPS60155137A JPS60155137A JP59010858A JP1085884A JPS60155137A JP S60155137 A JPS60155137 A JP S60155137A JP 59010858 A JP59010858 A JP 59010858A JP 1085884 A JP1085884 A JP 1085884A JP S60155137 A JPS60155137 A JP S60155137A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- solution
- aqueous solution
- protein
- gamma
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、高濃度ヒトγ型インターフェロン水溶液の製
造法に関する。
造法に関する。
インターフェロン（以下ＩＦＮと略称することがある）
は、高等動物の細胞がウィμスや核酸などの刺激によっ
て誘発されて産生ずる蛋白であシ、抗つイμス作用、抗
ｍ瘍作用などを有する。
は、高等動物の細胞がウィμスや核酸などの刺激によっ
て誘発されて産生ずる蛋白であシ、抗つイμス作用、抗
ｍ瘍作用などを有する。
ヒトのインターフェロンには、現在α型、β型およびＴ
型の３種の性状の異なるタイプが存在することが知られ
ている。
型の３種の性状の異なるタイプが存在することが知られ
ている。
β型インターフェロン（以下工１″Ｎ−αと略称スル）
、β型インターフェロン（以下工ＦＭ−βと略称する）
に関する研究社比較的す−んでおり、精製法もそれらの
物性もかなり明らかになって来ている。
、β型インターフェロン（以下工ＦＭ−βと略称する）
に関する研究社比較的す−んでおり、精製法もそれらの
物性もかなり明らかになって来ている。
γ型インターフェロン（以下工ＦＭ−γと略称すること
がある。）はリンパ球の芽球化やりンホカイン産生が起
るような状況下で、免疫担当細胞から産生されるため免
疫インターフェロンとも呼ばれている。工ＦＨ−γは工
ＦＮ−αや工Ｆｌｆ−βと比較して、抗測胞増殖活性や
抗腫瘍活性が高いといわれておル、臨床的応用面からよ
り期待されている。しかし、その産生に新鮮なリンパ球
が必要であることなどの制約があるため、これまで効率
のよい産生糸は確立されていない。また、異なる実験系
では、異なる細胞種が異なる分子柚の工ＷＭ−７を産生
ずる可能性も示唆されておυ、その構造や性質に関して
も不明な点が数多く残されてｉる。
がある。）はリンパ球の芽球化やりンホカイン産生が起
るような状況下で、免疫担当細胞から産生されるため免
疫インターフェロンとも呼ばれている。工ＦＨ−γは工
ＦＮ−αや工Ｆｌｆ−βと比較して、抗測胞増殖活性や
抗腫瘍活性が高いといわれておル、臨床的応用面からよ
り期待されている。しかし、その産生に新鮮なリンパ球
が必要であることなどの制約があるため、これまで効率
のよい産生糸は確立されていない。また、異なる実験系
では、異なる細胞種が異なる分子柚の工ＷＭ−７を産生
ずる可能性も示唆されておυ、その構造や性質に関して
も不明な点が数多く残されてｉる。
本発明者らは、遺伝子組換え技術によシ生産されたヒ）
ＩＦＮ−γの精製につき技術開発研究を行なっている際
、ヒトエＦＮ−γが非常に多量化を起しやすく、精製が
困雌であることを認め、これを解決するために還元性硫
黄化合物および蛋白変性剤の共存下にゲｙｖｐ過するこ
とを特徴とするヒトエＦＮ−７単量体の製造法を開発し
た（特願昭５８−１８６３８３号明細書参照）。この方
法で得られたと）ＩＦＮ−γ単蓋体水溶液には還元性硫
黄化合物および蛋白変性剤が含まれておシ、これらの低
分子化合物のうち特に蛋白変性剤は製剤には用いられな
いので除去する必要があるが、該除去処理により得られ
る水溶液中のヒトエｌｉ″Ｍ−γは溶解度が低く、濃縮
操作等において容易に析出するため、製剤原料としては
あまり適切でないことが判明した。
ＩＦＮ−γの精製につき技術開発研究を行なっている際
、ヒトエＦＮ−γが非常に多量化を起しやすく、精製が
困雌であることを認め、これを解決するために還元性硫
黄化合物および蛋白変性剤の共存下にゲｙｖｐ過するこ
とを特徴とするヒトエＦＮ−７単量体の製造法を開発し
た（特願昭５８−１８６３８３号明細書参照）。この方
法で得られたと）ＩＦＮ−γ単蓋体水溶液には還元性硫
黄化合物および蛋白変性剤が含まれておシ、これらの低
分子化合物のうち特に蛋白変性剤は製剤には用いられな
いので除去する必要があるが、該除去処理により得られ
る水溶液中のヒトエｌｉ″Ｍ−γは溶解度が低く、濃縮
操作等において容易に析出するため、製剤原料としては
あまり適切でないことが判明した。
本発明者らは、さらに鋭意研究を行ないヒトエＦＮ−γ
難溶化の原因を究明し、高濃度ヒトエＦＮ−γ水溶液の
製造法を確立した。
難溶化の原因を究明し、高濃度ヒトエＦＮ−γ水溶液の
製造法を確立した。
すなわち、本発明は、蛋白変性剤を含有するヒトエＦｌ
ｆ−γの希薄水溶液から蛋白変性剤を除去し、該溶液を
液体状態で熟成させ、ついで濃縮することを特徴とする
高濃度ヒトエＦＮ−γ水溶液の製造法である。
ｆ−γの希薄水溶液から蛋白変性剤を除去し、該溶液を
液体状態で熟成させ、ついで濃縮することを特徴とする
高濃度ヒトエＦＮ−γ水溶液の製造法である。
上記、蛋白変性剤を含有するヒトＩＦＮ−γ水溶液とし
て、好ましくは、粗ヒ）ＩＦＮ−γを還元性硫黄化合物
および蛋白変性剤の共存下ゲ／Ｉ／濾過して得られると
トエＦＮ−γ単量体水溶液が用いられる。
て、好ましくは、粗ヒ）ＩＦＮ−γを還元性硫黄化合物
および蛋白変性剤の共存下ゲ／Ｉ／濾過して得られると
トエＦＮ−γ単量体水溶液が用いられる。
希薄水溶液は、例えば、単量化しているＩＦＮ−ｒの溶
液を凝集沈澱しないように緩衝液を用いて３０〜２００
μｇ／ｍｅに稀釈して得られるが、凝集沈澱しないよう
にすればどんな方法をとってもかまわない。通常、ｐｕ
５ 、０−８ 、０のＭ！衝液のみで稀釈すると、ただ
ちに自沈が出るので、好ましくは、これに２Ｍ程度の蛋
白変性剤を緩衝液に含ませたもので稀釈すると凝集沈澱
のない稀薄な溶液を得ることができる。上記緩衝液には
、さらに還元性硫黄化合物を含有させてもよい。
液を凝集沈澱しないように緩衝液を用いて３０〜２００
μｇ／ｍｅに稀釈して得られるが、凝集沈澱しないよう
にすればどんな方法をとってもかまわない。通常、ｐｕ
５ 、０−８ 、０のＭ！衝液のみで稀釈すると、ただ
ちに自沈が出るので、好ましくは、これに２Ｍ程度の蛋
白変性剤を緩衝液に含ませたもので稀釈すると凝集沈澱
のない稀薄な溶液を得ることができる。上記緩衝液には
、さらに還元性硫黄化合物を含有させてもよい。
上記蛋白変性剤としては、例えば、グアニジン塩（塩酸
塩、硫酸塩）、尿素、チオシアン酸塩（ナトリウム塩、
カリウム塩）などがあげられる。
塩、硫酸塩）、尿素、チオシアン酸塩（ナトリウム塩、
カリウム塩）などがあげられる。
蛋白変性剤は、上記希薄水溶液を、ゲｌ”１Ｅｐｉａま
たは限外膜濾過することＫよ〕除去されるが、ゲ／ｌ／
濾過するのが好都合である。
たは限外膜濾過することＫよ〕除去されるが、ゲ／ｌ／
濾過するのが好都合である。
ゲ／Ｌ／濾過の方法は、通常用いられるカラム法が適し
ている。
ている。
ゲ／Ｌ／ｆｆｉ過の原液として上記ヒトエＦＮ−γ希薄
水溶液が好ましいが、多少析出物があってもゲ！沖過に
さしつかえない程度であればかまわない。
水溶液が好ましいが、多少析出物があってもゲ！沖過に
さしつかえない程度であればかまわない。
またゲル濾過中に一部析出することもあるが、析出物は
、たとえば、０．２２μのメンブレンで濾過すれば、除
去できる。
、たとえば、０．２２μのメンブレンで濾過すれば、除
去できる。
ゲ／Ｉ／濾過用のゲルとしては市販のものなどから自由
に選択されるが、デキストフン、ポリアクリＦ−０５な
ど低分子化合物の除去に適したものがあげられる。
に選択されるが、デキストフン、ポリアクリＦ−０５な
ど低分子化合物の除去に適したものがあげられる。
使用するゲルの量は、通常員看するサンプルの２〜１０
０倍量（Ｖ／Ｙ八好へしくは５〜２゜倍量である。
０倍量（Ｖ／Ｙ八好へしくは５〜２゜倍量である。
展開溶媒は、通常ｐＨについて５．０〜８．０、とシわ
け中性付近の緩衝液を用い、好ましくは還元性硫黄化合
物を１〜１００ ｍＭとシわけ５〜２０ｍＭの濃度で含
有させる。
け中性付近の緩衝液を用い、好ましくは還元性硫黄化合
物を１〜１００ ｍＭとシわけ５〜２０ｍＭの濃度で含
有させる。
具体的には、展開溶媒であらかじめ平衡としたゲルカラ
ムに上記希薄水溶液を１１ａＲする。これを展開溶媒に
よシ溶出する。溶出速度は、サンプμの不純度、ゲルの
種類、量によシ異なるが、通常ＳＶ（スベ−７，べｔｆ
ｆｓ／ティ）０．１−１０、好ましくは、８７ ９．５
〜３である。溶出液は通常の方法によシ分画する。
ムに上記希薄水溶液を１１ａＲする。これを展開溶媒に
よシ溶出する。溶出速度は、サンプμの不純度、ゲルの
種類、量によシ異なるが、通常ＳＶ（スベ−７，べｔｆ
ｆｓ／ティ）０．１−１０、好ましくは、８７ ９．５
〜３である。溶出液は通常の方法によシ分画する。
ヒトエＦＮ−γの両分は、通常の方法、たとえばＯ−Ｄ
、２８０ｎｍ の吸収等で溶出曲線として表わすことに
よシ容易に検出することができる。
、２８０ｎｍ の吸収等で溶出曲線として表わすことに
よシ容易に検出することができる。
蛋白変性剤を除去した希薄水溶液の液体状態での熟成は
、該希薄溶液を適当な時間、温度で放置することで達成
できる。
、該希薄溶液を適当な時間、温度で放置することで達成
できる。
熟成の温度、時間の両ファクターは適宜決められるが、
温度についてはヒト１ＦＮ−γの安定性。
温度についてはヒト１ＦＮ−γの安定性。
雑菌汚染等の観点から低温、たとえば４℃附近が好まし
いが、０℃〜４０℃附近であれば、適当な温度を選ぶこ
とができる。時間については、グμ濾過直後を濃縮する
と白濁してくるが、１時間も放置しておけば、白濁はず
っと少なくなる。通常２４〜７２時間放置後濃縮すれば
十分である。
いが、０℃〜４０℃附近であれば、適当な温度を選ぶこ
とができる。時間については、グμ濾過直後を濃縮する
と白濁してくるが、１時間も放置しておけば、白濁はず
っと少なくなる。通常２４〜７２時間放置後濃縮すれば
十分である。
なお、必要によシ、熟成を行う前またはその途中で無菌
濾過等の操作をすることもできる。
濾過等の操作をすることもできる。
濃縮は、限外膜処理によ）好都合に行うことができる。
限外膜はＭＷＣＯ１０１０００程度のものを用いるのが
好ましく、通常の操作によって行うことができる。
好ましく、通常の操作によって行うことができる。
１紀によル製造されるとトエＦＮ−７水溶液は、０ 、
２−１ 、５Ｍｆ／ｚｌｏと） Ｉ ＦＮ−７を含有し
、前記の製造法による０、０５ｑ／ｗｔ程度のものに比
し、易溶化されたヒトエＦＨ−γを含有する高濃度水溶
液であシ、ヒトエＩＦ！ｉ−７の大量製造中間体として
好適である。
２−１ 、５Ｍｆ／ｚｌｏと） Ｉ ＦＮ−７を含有し
、前記の製造法による０、０５ｑ／ｗｔ程度のものに比
し、易溶化されたヒトエＦＨ−γを含有する高濃度水溶
液であシ、ヒトエＩＦ！ｉ−７の大量製造中間体として
好適である。
本発明によるとトエ［１−４の易溶化は以下によ如達成
するものと考えられる。
するものと考えられる。
すなわち粗ヒ）ＩＮ’Ｎ−γを還元性硫黄化合物および
蛋白変性剤の共存下にゲＡ／濾過して得られる原料のヒ
トエＦＮ−γは、共有結合的にも非共有結合的にも単量
体であるが、蛋白変性剤を除去すると非共有結合的に多
量体となルその溶解度が低下するものと推定される。こ
れを希薄水溶液状態で熟成させると、一度生じたヒトＩ
ＦＮ−７多量体が、安定な非共有結合二斂体となυ、そ
の易溶化が達成され、容易に高濃度に濃縮が可能となっ
たと考えられる。
蛋白変性剤の共存下にゲＡ／濾過して得られる原料のヒ
トエＦＮ−γは、共有結合的にも非共有結合的にも単量
体であるが、蛋白変性剤を除去すると非共有結合的に多
量体となルその溶解度が低下するものと推定される。こ
れを希薄水溶液状態で熟成させると、一度生じたヒトＩ
ＦＮ−７多量体が、安定な非共有結合二斂体となυ、そ
の易溶化が達成され、容易に高濃度に濃縮が可能となっ
たと考えられる。
本発明によシ製造される高濃度ヒトエＦＮ−γ水溶液は
前記の方法で得られるヒトエＦＮ−γ水溶液に比し高濃
度であるので、保存用凍結晶や凍結乾燥して得られる注
射用製剤等の原液として、よル有利に使用される。
前記の方法で得られるヒトエＦＮ−γ水溶液に比し高濃
度であるので、保存用凍結晶や凍結乾燥して得られる注
射用製剤等の原液として、よル有利に使用される。
本発明によシ製造されるヒトエＦＮ−γは、低毒性で、
従来の方法で得られる工ＦＮ−７と同様の目的に同様の
１η法によシ使用でき、抗ウィルス。
従来の方法で得られる工ＦＮ−７と同様の目的に同様の
１η法によシ使用でき、抗ウィルス。
抗腫瘍、ｍ胞増殖抑制および免疫増強作用等を有するの
で、公知の工１ｉ’１Ｎ−γと同様にして投与すること
かできる。
で、公知の工１ｉ’１Ｎ−γと同様にして投与すること
かできる。
なお、原料の蛋白変性剤を含有するヒトエＦＮ−γ水溶
液は、例えば粗ヒ）Ｉｌｌ−γを還元性硫黄化合物およ
び蛋白変性剤の共存下にゲｌｖ濾過することにより製造
できる。
液は、例えば粗ヒ）Ｉｌｌ−γを還元性硫黄化合物およ
び蛋白変性剤の共存下にゲｌｖ濾過することにより製造
できる。
ここで粗ヒトエＦＨ−γはヒトエＦＮ−γを含有するも
のであればいかなるものでもよい。天然に存在するヒト
エＦＮ−γを濃縮９分離したものや遺伝子組み換え技術
によって得られるヒト１ＦＭ−７生産能を有する微生物
の培養により製造されたヒトエＦＮ−γ〔特開昭５８−
１８９１９７号公報；ヌクレイツク アンウド リサー
チ、第１０巻、２４８７−２５０１頁（１９８２年）；
ネイチャ、第２９５巻、５０３−５０８頁（１９８２年
）参照〕を用いることができる。実用面からは、上記ヒ
トエＦＭ−７生産能を有する微生物を培養して得られる
菌体抽出液、硫安分画液、抗体カラム溶出液、イオン交
換溶出液を粗ヒトエＦＨ−７として用いるが、不純蛋白
量が多いほど還元性硫黄化合物の量が多く必要にな〕経
済的ではないため、一般には抗体カラムあるいはイオン
交換カラム溶出液等を適用するのが好ましい。また粗ヒ
トエＦＨ−γは多量化していてもさしつかえない。
のであればいかなるものでもよい。天然に存在するヒト
エＦＮ−γを濃縮９分離したものや遺伝子組み換え技術
によって得られるヒト１ＦＭ−７生産能を有する微生物
の培養により製造されたヒトエＦＮ−γ〔特開昭５８−
１８９１９７号公報；ヌクレイツク アンウド リサー
チ、第１０巻、２４８７−２５０１頁（１９８２年）；
ネイチャ、第２９５巻、５０３−５０８頁（１９８２年
）参照〕を用いることができる。実用面からは、上記ヒ
トエＦＭ−７生産能を有する微生物を培養して得られる
菌体抽出液、硫安分画液、抗体カラム溶出液、イオン交
換溶出液を粗ヒトエＦＨ−７として用いるが、不純蛋白
量が多いほど還元性硫黄化合物の量が多く必要にな〕経
済的ではないため、一般には抗体カラムあるいはイオン
交換カラム溶出液等を適用するのが好ましい。また粗ヒ
トエＦＨ−γは多量化していてもさしつかえない。
還元性硫黄化合物としては、例えばシスティン。
Ｎ−アセチ／Ｌ／Ｖスティン、Ｎ−アセチｐホモＶステ
ィン、還元型グμタチオン、チオエタノールアミン、モ
ノチオグリセロ−μ、ジチオスレイトー〜、 次素１＆
１〜Ｔのチオアルカン、ロンガリットなどの有機含硫
黄化合物やメタ重亜硫酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩
）などの無機含硫黄化合物があげられる。
ィン、還元型グμタチオン、チオエタノールアミン、モ
ノチオグリセロ−μ、ジチオスレイトー〜、 次素１＆
１〜Ｔのチオアルカン、ロンガリットなどの有機含硫
黄化合物やメタ重亜硫酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩
）などの無機含硫黄化合物があげられる。
蛋白変性剤としては、前記したものがあげられる。
ゲｆｉ／濾過用のゲルとしては市販のものなどから自由
に選択されるが、デキストフン、ポリアクリルアミド、
アガロースなどのゲル粒子が好ましい。
に選択されるが、デキストフン、ポリアクリルアミド、
アガロースなどのゲル粒子が好ましい。
また、例えば遺伝子組み換え技術にょ９製造されるヒト
エＦｌｆ−γに適期する場合、その分子量が１７．１４
３であることや他の不純蛋白との分離効率を考え、分画
範囲１．０００〜８０．０００程度の性能を有するもの
から選択して使用するのが好都合である。具体的にはと
シわけセフ１デックスＧ−５０、Ｇ−７５、セフ１クリ
１ｖ８−２００゜バイオゲ／Ｉ／Ｐ−１０ｐｐ−３ｏ＊
ｐ−６ｏ等があげられる。
エＦｌｆ−γに適期する場合、その分子量が１７．１４
３であることや他の不純蛋白との分離効率を考え、分画
範囲１．０００〜８０．０００程度の性能を有するもの
から選択して使用するのが好都合である。具体的にはと
シわけセフ１デックスＧ−５０、Ｇ−７５、セフ１クリ
１ｖ８−２００゜バイオゲ／Ｉ／Ｐ−１０ｐｐ−３ｏ＊
ｐ−６ｏ等があげられる。
使用するゲ／Ｌ／Ｊｉは、通常組付するサンプ〜の５〜
１００倍（Ｗ／Ｗ ）好ましくは１０〜３０倍（Ｗ／Ｗ
）Ｊｌである。
１００倍（Ｗ／Ｗ ）好ましくは１０〜３０倍（Ｗ／Ｗ
）Ｊｌである。
ゲ／Ｌ’沖過の方法は、通常用いられるカラム法が適し
ている。
ている。
すなわち、粗ヒトエＦＮ−γを緩衝液などに溶解し水溶
液となし、展開＃媒であらかじめ平衝としたゲμカツム
に勇荷する。これを展開溶媒によシ溶出する。溶出速度
は、サンプｐの不純度、ゲルの種類、ｔにより異なるが
、通常８Ｖ（スベーヌ ベロシティ）０．１〜１０、好
まＬ＜はｓｖＯ，５〜３である。溶出液は通常の方法に
よシ分画する。
液となし、展開＃媒であらかじめ平衝としたゲμカツム
に勇荷する。これを展開溶媒によシ溶出する。溶出速度
は、サンプｐの不純度、ゲルの種類、ｔにより異なるが
、通常８Ｖ（スベーヌ ベロシティ）０．１〜１０、好
まＬ＜はｓｖＯ，５〜３である。溶出液は通常の方法に
よシ分画する。
ヒトエＦＮ−γと還元性硫黄化合物および蛋白変性剤を
共存させるのは上記ゲｌｖ濾過操作のいずれの工程にお
いてでもよいが、ヒトエＰＭ−γをゲμにＪｉ荷１する
ための水溶液および展開溶媒に還元性硫黄化合物および
蛋白変性剤を加えておくのが好ましい。
共存させるのは上記ゲｌｖ濾過操作のいずれの工程にお
いてでもよいが、ヒトエＰＭ−γをゲμにＪｉ荷１する
ための水溶液および展開溶媒に還元性硫黄化合物および
蛋白変性剤を加えておくのが好ましい。
なお蛋白変性剤は、抽出、抗体カラム処理など前処理で
使用している場合には、カラムにＪＡＡ４ｉするための
水溶液に改めて加えることなくその溶液のｉｔ使用する
ことが可能である。
使用している場合には、カラムにＪＡＡ４ｉするための
水溶液に改めて加えることなくその溶液のｉｔ使用する
ことが可能である。
上記美荷、用水溶液および展開溶媒は、ｐＨについては
５．０〜８．０、とりわけ中性付近で、還元性硫黄化合
物を１〜１００ｍＭ とりわけ５〜２０ ｍＭの濃度で
含有させるのが好ましく、蛋白質性剤を０．１〜７Ｍ、
！：＃）わけ１〜２Ｍ＋７）濃度で含有させることが好
ましい。
５．０〜８．０、とりわけ中性付近で、還元性硫黄化合
物を１〜１００ｍＭ とりわけ５〜２０ ｍＭの濃度で
含有させるのが好ましく、蛋白質性剤を０．１〜７Ｍ、
！：＃）わけ１〜２Ｍ＋７）濃度で含有させることが好
ましい。
本願明細書中、工ＦＮ−γの活性としての抗ウィルス活
性；国際単位（ＩＵ）は、単位（ユニット）の確彪した
国際標準ＩＦＮ−γと目的とする資料を、ヒト重膜由来
ＦＬＩＩＩ胞株に対するＳ／ンドビス ウィルス（８１
ｎｄｂｉｓ Ｖｉｒｕｓ ）の＃ｌ胞変性効果阻止試験
を用いて測定し、その比率から力価を算出してめたもの
である。溶液中の蛋白量は、Ｅ ： ２８０ｎｍ ＝
１．０ を１１１１／として計算してめた。
性；国際単位（ＩＵ）は、単位（ユニット）の確彪した
国際標準ＩＦＮ−γと目的とする資料を、ヒト重膜由来
ＦＬＩＩＩ胞株に対するＳ／ンドビス ウィルス（８１
ｎｄｂｉｓ Ｖｉｒｕｓ ）の＃ｌ胞変性効果阻止試験
を用いて測定し、その比率から力価を算出してめたもの
である。溶液中の蛋白量は、Ｅ ： ２８０ｎｍ ＝
１．０ を１１１１／として計算してめた。
以下実施例および参考例によプ本発明をよ５シ具体的に
説明するが、これらによル本発明は制限されるものでは
ない。
説明するが、これらによル本発明は制限されるものでは
ない。
なお参考例中に記載した抗体カラムＡｂ（ｌｉ。
γ２−１１．１ ）は特願昭５８−１７６０９１号（昭
和５８年９月２２日出願）明和書記載の方法で調製した
。
和５８年９月２２日出願）明和書記載の方法で調製した
。
実施例１
参考例２Ｃｎ）でえた工ＦＮ−γ（モノマー）含有溶出
画分５３０ｍ１（ＤうちＯ２６ｇｔ（９、８５ダ含有）
に１０ ｍＭ ｖスティン塩酸塩、１５０ｍＭ塩化ナト
リウム、０．５Ｍ塩酸グアニジンおよび０．０１％ツイ
ーン２０を含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ［６、０）の
希釈液１７４ｍを添加、混合し、タン白含量０ 、０５
ＩＩＩ／ｍｅの低濃度溶液を調１した。この溶液を予
め１０ｍＭ５’ステイン塩酸塩＝１５０ｍｉ［塩化す）
リウムおよび０．０１％ツイーン２０を含む’ｌ ５
ｍＭ酢酢酸ｍ液液ｐＨ６，０）で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５のカラム（５Ｘ６０１１）に負荷し、・同
−Ｍ衝液で溶出し、塩酸グアニジンを除去した工ＦＮ−
γの溶出画分１９０ｇｊ（９，１２ダ含有）をえた。こ
の溶液のタン白含量は０．０４８Ｗ／ばて、澄明でめっ
た。
画分５３０ｍ１（ＤうちＯ２６ｇｔ（９、８５ダ含有）
に１０ ｍＭ ｖスティン塩酸塩、１５０ｍＭ塩化ナト
リウム、０．５Ｍ塩酸グアニジンおよび０．０１％ツイ
ーン２０を含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ［６、０）の
希釈液１７４ｍを添加、混合し、タン白含量０ 、０５
ＩＩＩ／ｍｅの低濃度溶液を調１した。この溶液を予
め１０ｍＭ５’ステイン塩酸塩＝１５０ｍｉ［塩化す）
リウムおよび０．０１％ツイーン２０を含む’ｌ ５
ｍＭ酢酢酸ｍ液液ｐＨ６，０）で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５のカラム（５Ｘ６０１１）に負荷し、・同
−Ｍ衝液で溶出し、塩酸グアニジンを除去した工ＦＮ−
γの溶出画分１９０ｇｊ（９，１２ダ含有）をえた。こ
の溶液のタン白含量は０．０４８Ｗ／ばて、澄明でめっ
た。
タン白回収率は９２．５％で、工ＦＮ−７の比活性は３
．７Ｘ１０ 工Ｕ／ダ タン白であった。
．７Ｘ１０ 工Ｕ／ダ タン白であった。
実施例２
実施例１でえた工ＦＮ−γの溶出画分４０ｍ１（１，９
２Ｍｇ含有）を４℃で２４時間熟成したのち、ダイアフ
ローＰＭ−１０，４３鱈φ（アミコン社製限外濾過＠）
を用い限外濾過により４ｍ／まで濃縮した。この濃縮液
は澄明で、タン白含足は０ 、４７０ Ｗ／ｇｌであっ
た。またタン白回収率は９８％（１，８８ｑンであった
。この工ＦＮ−γの比活性は６．８Ｘ１０’ 工Ｕ／Ｉ
Ｆ タン白であった。
２Ｍｇ含有）を４℃で２４時間熟成したのち、ダイアフ
ローＰＭ−１０，４３鱈φ（アミコン社製限外濾過＠）
を用い限外濾過により４ｍ／まで濃縮した。この濃縮液
は澄明で、タン白含足は０ 、４７０ Ｗ／ｇｌであっ
た。またタン白回収率は９８％（１，８８ｑンであった
。この工ＦＮ−γの比活性は６．８Ｘ１０’ 工Ｕ／Ｉ
Ｆ タン白であった。
実施例３
実施例１でえた工ｙｎ−ＴＯ溶出自分４０ｓｔ＜１．９
２ｍ１含有）を４℃で１００時間熟成したのち、室液例
２÷桿→と同様の方法で４ｄまで濃縮した。この濃縮液
状澄明で、タン白含量は０ 、４７５ ’１／／ｗｌで
６．た。１７白回収率は９９％（１，９４）であった。
２ｍ１含有）を４℃で１００時間熟成したのち、室液例
２÷桿→と同様の方法で４ｄまで濃縮した。この濃縮液
状澄明で、タン白含量は０ 、４７５ ’１／／ｗｌで
６．た。１７白回収率は９９％（１，９４）であった。
なお工ｌｌＮ−γの比活性は７ 、３ Ｘ １０’ 工
Ｕ／Ｗ タン白であった。
Ｕ／Ｗ タン白であった。
実施例４
参考例２（…）と同様の方法でえた工Ｆｌｌｉ−γ溶出
画分５１０諺ｔ（０，３８８岬／１１ｔ）に、実施例１
と同様の希釈液３４４７ｇ？を添加、混合しタン白含量
０ 、０５１１ｆ／／ｍｌ濃度の溶液を＃ｉした。
画分５１０諺ｔ（０，３８８岬／１１ｔ）に、実施例１
と同様の希釈液３４４７ｇ？を添加、混合しタン白含量
０ 、０５１１ｆ／／ｍｌ濃度の溶液を＃ｉした。
次いで、この溶液を予め実施例１と同様の平衡化ｉｌ衝
液で平衡化したセフ１デックスＧ−２５０カラム（１４
Ｘ１００１１）に負荷し、同一緩衝液で溶出し、塩酸グ
アニジンを除いた工ＦＮ−γの溶出画分３７６０ ｗｅ
をえた。この溶液のタン白含量は０．０４８呼／ ｗｅ
であ夛、その工ＦＮ−７の比活性は３．５Ｘ１０ 工Ｕ
／ダタン白であった。
液で平衡化したセフ１デックスＧ−２５０カラム（１４
Ｘ１００１１）に負荷し、同一緩衝液で溶出し、塩酸グ
アニジンを除いた工ＦＮ−γの溶出画分３７６０ ｗｅ
をえた。この溶液のタン白含量は０．０４８呼／ ｗｅ
であ夛、その工ＦＮ−７の比活性は３．５Ｘ１０ 工Ｕ
／ダタン白であった。
この溶液を４℃で４８時間熟成したのち、ダイアフロー
ｐｉｉ−ｔｏ、ｔｓ、ｏ−φ嘆を用％ｆ％１８８ｇｔま
で濃縮し、タン白含量０．９６１１ＩＩ／ＩＩｔの澄明
な工ＩＨ−ｒ溶液をえた。この工ＦＮ−γの比活性は６
．７Ｘ１０ １Ｕ／Ｗ ｊ’ｙ白で、８Ｄ８−ＰＡＧＥ
ではモノマーに収斂した。
ｐｉｉ−ｔｏ、ｔｓ、ｏ−φ嘆を用％ｆ％１８８ｇｔま
で濃縮し、タン白含量０．９６１１ＩＩ／ＩＩｔの澄明
な工ＩＨ−ｒ溶液をえた。この工ＦＮ−γの比活性は６
．７Ｘ１０ １Ｕ／Ｗ ｊ’ｙ白で、８Ｄ８−ＰＡＧＥ
ではモノマーに収斂した。
実施例５
参考例４でえたヒトエＦＮ−γ（モノマー）溶出画分４
５０ゴに１０ｍＭ還元型グμタチオン。
５０ゴに１０ｍＭ還元型グμタチオン。
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５ｍｌ酸グアニジンお
よび０．０１囁ツイーン２０を含む２５ｍＭ酢酸Ｍ！衝
液（ｐＨ６，０）の希釈液３．２４０ｍを添加、混合し
、タン白含量０ 、０５ Ｑ／ｗｅの低濃度溶液を１嘔
した。この溶液を予め、１０ｍＭ還元型グルタチオン＊
１５ Ｑ ｍＭ ＭＬ化ナナトリウムよび０．０１囁
ツイーン２０を含む２５ｍＭ酢酸畿衝液ｔｐａｓ 、
０ ）で平衡化したセフ１デックスＧ−２５のカラム（
１４Ｘ１００ｃ１Ｍ）に負荷し、同一緩衝液でゲＩｖ濾
過を行い、塩酸グアニジンを除去したヒトエＦＮ−γの
溶出画分３．１８０ ｗｌ（１５５，８１Ｆ）をえた。
よび０．０１囁ツイーン２０を含む２５ｍＭ酢酸Ｍ！衝
液（ｐＨ６，０）の希釈液３．２４０ｍを添加、混合し
、タン白含量０ 、０５ Ｑ／ｗｅの低濃度溶液を１嘔
した。この溶液を予め、１０ｍＭ還元型グルタチオン＊
１５ Ｑ ｍＭ ＭＬ化ナナトリウムよび０．０１囁
ツイーン２０を含む２５ｍＭ酢酸畿衝液ｔｐａｓ 、
０ ）で平衡化したセフ１デックスＧ−２５のカラム（
１４Ｘ１００ｃ１Ｍ）に負荷し、同一緩衝液でゲＩｖ濾
過を行い、塩酸グアニジンを除去したヒトエＦＮ−γの
溶出画分３．１８０ ｗｌ（１５５，８１Ｆ）をえた。
この溶液のタン白含量紘０．０４８岬／耐であっ九。タ
ン白回収率は８４．４％であった。その比活性は３．５
Ｘ１０工Ｕ／ＩＩタン白であった。この溶液を４℃で４
８時間熟成させたのち、実施例２と同様の方法で１５９
ｗｒｅまで濃縮した。この濃縮液は澄明で、そのタン
白含量は０ 、９２１１１１／ｍｌであった。タン白回
収率は９３．９％１４６．３＃）であった。
ン白回収率は８４．４％であった。その比活性は３．５
Ｘ１０工Ｕ／ＩＩタン白であった。この溶液を４℃で４
８時間熟成させたのち、実施例２と同様の方法で１５９
ｗｒｅまで濃縮した。この濃縮液は澄明で、そのタン
白含量は０ 、９２１１１１／ｍｌであった。タン白回
収率は９３．９％１４６．３＃）であった。
なおヒトエＦＮ−γの比活性は６．８Ｘ１０工Ｕ／ｑ
タン白であった。
タン白であった。
実施例６
参考例２と同様の方法でえたヒトエＩ？Ｍ−γ（化ツマ
−）溶出画分４３５ ｍｌ （０、３９２１１９／ｇ＃
）に１５０１ｎｉｉ塩化ナトリウム、０．５Ｍ塩酸グア
ニジンおよび０．０１５Ｇツイ−７２０を含む２５ｍ１
酢酸Ｉｌ衝液（ｐＨ６，０）の希釈液２，９７５ｓ＃を
添加し、タン白含量ｏ、ｏｓｖｉｗの溶液を調整した。
−）溶出画分４３５ ｍｌ （０、３９２１１９／ｇ＃
）に１５０１ｎｉｉ塩化ナトリウム、０．５Ｍ塩酸グア
ニジンおよび０．０１５Ｇツイ−７２０を含む２５ｍ１
酢酸Ｉｌ衝液（ｐＨ６，０）の希釈液２，９７５ｓ＃を
添加し、タン白含量ｏ、ｏｓｖｉｗの溶液を調整した。
この溶液を予め窺素ガスを注入し、十分に脱気した１５
９ｍ１ｌｊｊｌ化ナトリウムおよび０．０１囁ツイーン
２０を含む２５ｍ菫酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化
したセフ１デックスＧ−２５力ｔム（１４ｘｌＯＯａｌ
）に負荷したのち同−Ｍｌｒ液でゲ／Ｌ／濾過を行い、
塩酸グアニジンおよび還元型グルタチオンを除去した七
トエＦＮ−γの溶出画分３，２８０ｍ（１３８ＩＩＩ含
有）をえた。この溶液のタン白含量ｔｉ−０−，０４２
ＭＩ／ｄであった。タン白回収率は８１％で、そのヒト
エＦＮ−ｒの比活性は２ 、８ Ｘ １ Ｇ’ 工Ｕ／
ｌ１ｉＦ タン白であった。
９ｍ１ｌｊｊｌ化ナトリウムおよび０．０１囁ツイーン
２０を含む２５ｍ菫酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化
したセフ１デックスＧ−２５力ｔム（１４ｘｌＯＯａｌ
）に負荷したのち同−Ｍｌｒ液でゲ／Ｌ／濾過を行い、
塩酸グアニジンおよび還元型グルタチオンを除去した七
トエＦＮ−γの溶出画分３，２８０ｍ（１３８ＩＩＩ含
有）をえた。この溶液のタン白含量ｔｉ−０−，０４２
ＭＩ／ｄであった。タン白回収率は８１％で、そのヒト
エＦＮ−ｒの比活性は２ 、８ Ｘ １ Ｇ’ 工Ｕ／
ｌ１ｉＦ タン白であった。
この溶液を：４℃で２４時間熟成させたのち、実施例２
と同様の方法で３００Ｗｉｔまで濃縮した。そのタン白
含量は０ 、２３９ ＊／ｍｅであった。タン白回収率
は５２％（７１，８＃）”ｔ”、１１： ） Ｉ Ｆ
Ｎ −γの比活性は１．ｌＸ１０６ 工Ｕ／Ｗ タン白
であうた。 一 実施例１ ゛ 本発明の製造法で得られるとトエＦＮ−γの性状は以下
のとおシてあった。
と同様の方法で３００Ｗｉｔまで濃縮した。そのタン白
含量は０ 、２３９ ＊／ｍｅであった。タン白回収率
は５２％（７１，８＃）”ｔ”、１１： ） Ｉ Ｆ
Ｎ −γの比活性は１．ｌＸ１０６ 工Ｕ／Ｗ タン白
であうた。 一 実施例１ ゛ 本発明の製造法で得られるとトエＦＮ−γの性状は以下
のとおシてあった。
（ｉ） ドデシμ硫酸ナトリウムのスラブ電気原動法（
８Ｄ８−ＰＡＧＥ）による分子量測定見かけ上の分子量
約１８，０００でモノマー−に収斂しえ。
８Ｄ８−ＰＡＧＥ）による分子量測定見かけ上の分子量
約１８，０００でモノマー−に収斂しえ。
測定条件’８Ｄ８濃度、０．１％＝アクリμアミド濃度
６％（濃縮ゲ／Ｌ／）、１２．５％（分離用ゲ、／Ｌ／
）；電圧、６０７（濃縮時）。
６％（濃縮ゲ／Ｌ／）、１２．５％（分離用ゲ、／Ｌ／
）；電圧、６０７（濃縮時）。
１８０Ｖ（分離時）；濃縮６０分１分離２．５−３．０
時間；発色剤、クマＶ−ブリリアント プμ− （２） ゲ〜ｐ過による量測定 見かけ上の分子量は約４０，０００であった（第１図）
。
時間；発色剤、クマＶ−ブリリアント プμ− （２） ゲ〜ｐ過による量測定 見かけ上の分子量は約４０，０００であった（第１図）
。
測定条件
（１）資料二本発明の高濃度ヒト１１Ｍ−７水溶液（タ
ン白濃度−１，２３１ ダ／ゴ、但しツイーン２０ｔ−含 まない） 標準タン白：牛血清アルブミン（Ｍ、Ｗ。
ン白濃度−１，２３１ ダ／ゴ、但しツイーン２０ｔ−含 まない） 標準タン白：牛血清アルブミン（Ｍ、Ｗ。
６８．０００）、卵白アルブミン
（Ｍ、Ｗ、４５．０００）、キモト
リプシノーゲンＡ （Ｍ、Ｗ。
２５．０００）、チトクＣ１−ムＣ
（Ｍ、Ｗ、１２，５００）
（２） ゲ／Ｌ／濾過：２５ｍＭ酢酸アン４＝ウム。
ｉ ５０ ｍＭ ＮａＣ１および１０ｍＭ還元型グμタ
チオンを含むｐＨ６，０の緩衝 液で平衡化したセファデックスＧ− １００カラム（２，７ｘ８７ｃ１１）に資料２ 、４６
１１１／２ｘｌ＞ヨＣＦ各標準タン白５ｑ／２ばを負荷
し、溶出速度２１譚ｌ／時間、フフクＶＷン４．５ｍＭ
でゲルｐ過を行った。
チオンを含むｐＨ６，０の緩衝 液で平衡化したセファデックスＧ− １００カラム（２，７ｘ８７ｃ１１）に資料２ 、４６
１１１／２ｘｌ＞ヨＣＦ各標準タン白５ｑ／２ばを負荷
し、溶出速度２１譚ｌ／時間、フフクＶＷン４．５ｍＭ
でゲルｐ過を行った。
本発明で製造されるヒトエＦＮ−γは、８ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅでは単量体（見かけ上の分子量約１８．０００）とし
て検出され、ゲＡ／ｐ過では二量体（見かけ上の分子量
約４０，０００）として検出されることから、分子量約
１８，０００のサブユニットからなる二量体であシ、そ
の結合は非共有結合であることが判明した。
Ｅでは単量体（見かけ上の分子量約１８．０００）とし
て検出され、ゲＡ／ｐ過では二量体（見かけ上の分子量
約４０，０００）として検出されることから、分子量約
１８，０００のサブユニットからなる二量体であシ、そ
の結合は非共有結合であることが判明した。
参考例１
特開［５８−１８９１９７号公報実施例８記載の発現用
ヒトエＦＮ−γ遺伝子を有する菌株ＲＲ工（ｐＲＫ ２
４８ ｃＩｔａ、ｐＲＣ２３１／ｚｒｒ−９００）ｔ−
Ｍ９−グμコース培地で３０℃で菌体濃度が３−４Ｘ１
０８Ｍ胞／ ｗｅになるまで培養した後、グμコース、
カザミノ酸を濃度がそれぞれ１．０％。
ヒトエＦＮ−γ遺伝子を有する菌株ＲＲ工（ｐＲＫ ２
４８ ｃＩｔａ、ｐＲＣ２３１／ｚｒｒ−９００）ｔ−
Ｍ９−グμコース培地で３０℃で菌体濃度が３−４Ｘ１
０８Ｍ胞／ ｗｅになるまで培養した後、グμコース、
カザミノ酸を濃度がそれぞれ１．０％。
０．５％になるように加えて４２℃で１時間誘殉させた
。得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、凍結
して保存した。
。得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、凍結
して保存した。
参考例２
ＣＩ）参考例１でえた凍結菌体１０００Ｆに７Ｍ塩酸グ
アニジンおよび２ｍＭ フエ二μメチルス〃ホニμ７μ
オフイドを含む１００ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７、
０）を３００Ｏｍ！加え、４℃で１時間攪拌したのち遠
心分離機（１７，０００ｒｐｍ／３０分）に付し、澄明
な上清液をえた。この上清液を１３７ｍＭ ｆｉ化ナナ
トリウム ２７ ｍＭ塩化カリウムｔ８ｍＭリン酸二ナ
トリウムおよび１４７ｍＭリン酸−カリウムから成るＭ
Ｗｋ液（以下Ｐ。
アニジンおよび２ｍＭ フエ二μメチルス〃ホニμ７μ
オフイドを含む１００ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７、
０）を３００Ｏｍ！加え、４℃で１時間攪拌したのち遠
心分離機（１７，０００ｒｐｍ／３０分）に付し、澄明
な上清液をえた。この上清液を１３７ｍＭ ｆｉ化ナナ
トリウム ２７ ｍＭ塩化カリウムｔ８ｍＭリン酸二ナ
トリウムおよび１４７ｍＭリン酸−カリウムから成るＭ
Ｗｋ液（以下Ｐ。
ｐ、８と略す）で７０倍に希釈し、生じてくる沈澱物を
シャープレス遠心分離機（１０，０００ｒｐｍ）ｋ付し
て除去した。次いでえられ九上清液２２０４をベリコン
（ミリポア社製９分両分子量：１０．０００）で１５４
にまで濃縮した。この濃縮液を４℃で一夜放置し、生じ
た沈澱物をさらにンヤーブレス遠心分ａｖＡにかけて除
去し友。この上清液を予め充填した抗体カラム（Ａｂ（
Ｍｏγ２−１１．１）＋５ｘ３０ｍ）に流速１．０００
ゴ／時間で負荷したのち、ＰＢ８の２．５００ゴ、１Ｍ
塩化ナトリウムおよび０．１％ツイー７２０を含んだ１
０ｍＭリン酸ｉｌ衝液（ｐＨ７，０）の５，０００ｓ？
。
シャープレス遠心分離機（１０，０００ｒｐｍ）ｋ付し
て除去した。次いでえられ九上清液２２０４をベリコン
（ミリポア社製９分両分子量：１０．０００）で１５４
にまで濃縮した。この濃縮液を４℃で一夜放置し、生じ
た沈澱物をさらにンヤーブレス遠心分ａｖＡにかけて除
去し友。この上清液を予め充填した抗体カラム（Ａｂ（
Ｍｏγ２−１１．１）＋５ｘ３０ｍ）に流速１．０００
ゴ／時間で負荷したのち、ＰＢ８の２．５００ゴ、１Ｍ
塩化ナトリウムおよび０．１％ツイー７２０を含んだ１
０ｍＭリン酸ｉｌ衝液（ｐＨ７，０）の５，０００ｓ？
。
ＰＢ８の２，５００ｓ？および０．５Ｍ塩酸グアニジン
を含んだ２０ｍＭリン酸１１１Ｗ液（ｐＨ７、０）の２
．５００ｓ？の各洗浄液を遂次抗体カラムを通過させた
のち、２ｍｍｔａグアニジンを含む２０ｍＭ リン酸緩
衝液（ｐＨ７、０）で溶出し、抗つイμス活性を有する
溶出−分５００ｄを集めた。
を含んだ２０ｍＭリン酸１１１Ｗ液（ｐＨ７、０）の２
．５００ｓ？の各洗浄液を遂次抗体カラムを通過させた
のち、２ｍｍｔａグアニジンを含む２０ｍＭ リン酸緩
衝液（ｐＨ７、０）で溶出し、抗つイμス活性を有する
溶出−分５００ｄを集めた。
（ＩＬ）参考例２（１）で得た溶出画分にシスティン塩
酸塩を１０ｍＭ量添加し、ヒトエＦＮ−ｒをモノマーに
収斂させた。
酸塩を１０ｍＭ量添加し、ヒトエＦＮ−ｒをモノマーに
収斂させた。
このヒトエＦ！ｇ−７水溶液５０１］＋ｌｔ予め１ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸塩、１５０ｍＭ 塩化ナトリウ
ムｅｌＯｉｉＭシスティン塩ｍ塩および２Ｍ塩酸グアニ
ジンを含んだ２５ ＸＩＬＭ ＠：酸ｌｌ！１＃液（ｐ
Ｈ６．０）で平衡化したセファクリ−μＢ−２００（フ
ァルマシア社製）のカラム（’９Ｘｉ００ｃｍ）に負荷
し、同一緩衝液で溶出し、七ツマー溶出画分５３０ ｗ
ｔｔを集めた。このようにして見られた両分はドデシル
硫酸ナトリウムのスラブ電気泳動法（以下８ＤＳ−ＰＡ
ＧＥと略す）でもモノマーに収斂した。（見かけ上の分
子量約１８．０００）。
エチレンジアミン四酢酸塩、１５０ｍＭ 塩化ナトリウ
ムｅｌＯｉｉＭシスティン塩ｍ塩および２Ｍ塩酸グアニ
ジンを含んだ２５ ＸＩＬＭ ＠：酸ｌｌ！１＃液（ｐ
Ｈ６．０）で平衡化したセファクリ−μＢ−２００（フ
ァルマシア社製）のカラム（’９Ｘｉ００ｃｍ）に負荷
し、同一緩衝液で溶出し、七ツマー溶出画分５３０ ｗ
ｔｔを集めた。このようにして見られた両分はドデシル
硫酸ナトリウムのスラブ電気泳動法（以下８ＤＳ−ＰＡ
ＧＥと略す）でもモノマーに収斂した。（見かけ上の分
子量約１８．０００）。
この分子ふるい操作によシ比活性３ 、３ Ｘ １０’
工Ｕ／１ｑタン白のヒトエＦＮ−γを２０１ ！えた。
工Ｕ／１ｑタン白のヒトエＦＮ−γを２０１ ！えた。
参考例３
参考例２（■）でえたヒトエＦＮ−γ（化ツマ−）溶出
画分５３０ｇ？（０，３７９ｑ／ｇ／）のうちの２００
ｇ／（１５、８１ｑ）を予め１０ｍＭシスティン塩酸塩
、１５０ｍＭｆｉ化ナトリウムおよび０．０１％ツイー
ン２０を含む２５ｍＭ酢酸Ｍ％液（Ｐ）（６＋ ０ ）
の平衡化緩衝液で平衡化したセファダック、ｘＧ−２５
０カラム（５Ｘ６０ｃＩＩ）に負荷し、同一緩衝液で溶
出し、塩酸グアニジンを除去したヒトエＦＮ−７の溶出
−分１８０ｇＪをえた。
画分５３０ｇ？（０，３７９ｑ／ｇ／）のうちの２００
ｇ／（１５、８１ｑ）を予め１０ｍＭシスティン塩酸塩
、１５０ｍＭｆｉ化ナトリウムおよび０．０１％ツイー
ン２０を含む２５ｍＭ酢酸Ｍ％液（Ｐ）（６＋ ０ ）
の平衡化緩衝液で平衡化したセファダック、ｘＧ−２５
０カラム（５Ｘ６０ｃＩＩ）に負荷し、同一緩衝液で溶
出し、塩酸グアニジンを除去したヒトエＦＮ−７の溶出
−分１８０ｇＪをえた。
この溶出液は溶出直後に白濁を生じ沈澱したので、遠心
分離（１０，０００ｒｐｍ ／ ３０分）に付しその上
清液のタン白含量を測定したところ０．０５ｑ／ｍｅで
あった。タン白回収率は１１．９％（９１Ｂｇ）であっ
た。な訃ヒ）ＩＦＮ−γの比活性は３．３×１０ エＵ
／■タン白であった。
分離（１０，０００ｒｐｍ ／ ３０分）に付しその上
清液のタン白含量を測定したところ０．０５ｑ／ｍｅで
あった。タン白回収率は１１．９％（９１Ｂｇ）であっ
た。な訃ヒ）ＩＦＮ−γの比活性は３．３×１０ エＵ
／■タン白であった。
参考例４
参考例２（１）の方法で得た溶出画分４２０ 譚／に還
元型グルタチオンを１０ ｍＭ ：ｉ添加し、ヒトエＦ
Ｎ−γをモノマーに収斂させた。
元型グルタチオンを１０ ｍＭ ：ｉ添加し、ヒトエＦ
Ｎ−γをモノマーに収斂させた。
このヒトエＦＭ−γ水溶液４２０ ｍｌを予め１ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム＋
１０ｍＭ還元型グμタチオンおよび２Ｍ塩酸グアニジン
を含んだ２５ｍＭ＃酸１ｉｉ）ＨＩ４Ｊ液（ｐＨ６，０
）で平衡化したセファクリ−Ａ／Ｓ−２００（）１１ｖ
マシア社製）のカラム（９Ｘ１００ａＩＩ）に負荷し、
同一緩衝液で溶出し、七ツマー溶出画分４５０ｄを集め
た。本操作によシ比活性３．４×１０６ 工Ｕ／ｑタン
白のヒト１ＦＮ−γ（０，４１０ｑ／ ｗｅ ）を得た
。
チレンジアミン四酢酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム＋
１０ｍＭ還元型グμタチオンおよび２Ｍ塩酸グアニジン
を含んだ２５ｍＭ＃酸１ｉｉ）ＨＩ４Ｊ液（ｐＨ６，０
）で平衡化したセファクリ−Ａ／Ｓ−２００（）１１ｖ
マシア社製）のカラム（９Ｘ１００ａＩＩ）に負荷し、
同一緩衝液で溶出し、七ツマー溶出画分４５０ｄを集め
た。本操作によシ比活性３．４×１０６ 工Ｕ／ｑタン
白のヒト１ＦＮ−γ（０，４１０ｑ／ ｗｅ ）を得た
。
第１図は、実施例Ｔのゲ／Ｌ’濾過り結果を示す。
・は本発明のヒトエＦＮ−γを、Ｏは標準タン白（Ａ：
キモトリグシノーゲンＡ、Ｂ：卵白アμグミン＋Ｃ：牛
血清アルブミン）を示す。 算 １ 閤 １０ ２０ ３０ ４０５０ ７０ １００冷号量（ｘ
ｌＯ３）
キモトリグシノーゲンＡ、Ｂ：卵白アμグミン＋Ｃ：牛
血清アルブミン）を示す。 算 １ 閤 １０ ２０ ３０ ４０５０ ７０ １００冷号量（ｘ
ｌＯ３）
Claims (1)
- 蛋白変性剤を含有するヒトγ型インターフェロンの希薄
水溶液から蛋白変性剤を除去し、該溶液を液体状態で熟
成させ、ついで濃縮することを特徴とする高濃度ヒトγ
型インターフェロン水溶液の製造法。
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59010858A JPS60155137A (ja) | 1984-01-23 | 1984-01-23 | 高濃度ヒトγ型インタ−フエロン水溶液の製造法 |
| IL74094A IL74094A0 (en) | 1984-01-23 | 1985-01-18 | Highly solubilised protein and production thereof |
| IL8574093A IL74093A0 (en) | 1984-01-23 | 1985-01-18 | Stable composition of gamma-interferon |
| EP85100549A EP0150066A3 (en) | 1984-01-23 | 1985-01-19 | Highly solubilized protein and production thereof |
| GR850157A GR850157B (ja) | 1984-01-23 | 1985-01-21 | |
| NZ210896A NZ210896A (en) | 1984-01-23 | 1985-01-22 | Producing highly concentrated human gamma-interferon aqueous solutions |
| PT79853A PT79853B (en) | 1984-01-23 | 1985-01-22 | Process for the preparation of an highly solubilized protein |
| CA000472599A CA1255220A (en) | 1984-01-23 | 1985-01-22 | Highly solubilized protein and production thereof |
| KR1019850000357A KR850005456A (ko) | 1984-01-23 | 1985-01-22 | 고농도 단백질의 제조방법 |
| ES539736A ES8702441A1 (es) | 1984-01-23 | 1985-01-22 | Un metodo de producir una solucion acuosa, muy concentrada, de gamma-interferon de humano |
| DK28885A DK28885A (da) | 1984-01-23 | 1985-01-22 | Hoejkoncentreret vandig human gamma-interferonoploesning samt fremgangsmaade til fremstilling deraf |
| ZA85496A ZA85496B (en) | 1984-01-23 | 1985-01-22 | Highly solubilized protein and production thereof |
| AU38017/85A AU3801785A (en) | 1984-01-23 | 1985-01-23 | Concentrated solutions of human gamma interferon |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59010858A JPS60155137A (ja) | 1984-01-23 | 1984-01-23 | 高濃度ヒトγ型インタ−フエロン水溶液の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60155137A true JPS60155137A (ja) | 1985-08-15 |
| JPH0480887B2 JPH0480887B2 (ja) | 1992-12-21 |
Family
ID=11762050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59010858A Granted JPS60155137A (ja) | 1984-01-23 | 1984-01-23 | 高濃度ヒトγ型インタ−フエロン水溶液の製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60155137A (ja) |
| ZA (1) | ZA85496B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62292796A (ja) * | 1986-06-04 | 1987-12-19 | ベ−リングヴエルケ・アクチエンゲゼルシヤフト | 生物学的に不活性な形態のものから活性タンパク質を取得する方法 |
| JPH01175995A (ja) * | 1987-12-29 | 1989-07-12 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 生理活性物質の農縮・脱塩方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5598118A (en) * | 1979-01-18 | 1980-07-25 | Hayashibara Takeshi | Preparation of type-2 interferon and drug containing the same |
| JPS59161321A (ja) * | 1982-12-22 | 1984-09-12 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 沈澱異種蛋白質の精製及び活性化法 |
-
1984
- 1984-01-23 JP JP59010858A patent/JPS60155137A/ja active Granted
-
1985
- 1985-01-22 ZA ZA85496A patent/ZA85496B/xx unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5598118A (en) * | 1979-01-18 | 1980-07-25 | Hayashibara Takeshi | Preparation of type-2 interferon and drug containing the same |
| JPS59161321A (ja) * | 1982-12-22 | 1984-09-12 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 沈澱異種蛋白質の精製及び活性化法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62292796A (ja) * | 1986-06-04 | 1987-12-19 | ベ−リングヴエルケ・アクチエンゲゼルシヤフト | 生物学的に不活性な形態のものから活性タンパク質を取得する方法 |
| JPH01175995A (ja) * | 1987-12-29 | 1989-07-12 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 生理活性物質の農縮・脱塩方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0480887B2 (ja) | 1992-12-21 |
| ZA85496B (en) | 1986-09-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1188244A (en) | Angiotropins of leukocytes and inflamed tissue and process for their preparation | |
| US3808189A (en) | Isolation of gamma globulin preparations enriched in iga and igm using polyethylene glycol | |
| US5196323A (en) | Process for preparing and purifying alpha-interferon | |
| JPH07503851A (ja) | 改良インターフェロン及びヒトの末梢血液白血球からのその製造方法 | |
| JPS63169995A (ja) | β−インターフェロンの回収及び精製方法 | |
| JPS5813397A (ja) | 免疫インタ−フエロン及びそのｍＲＮＡの製造方法 | |
| JPH0558000B2 (ja) | ||
| US4670544A (en) | Process for the manufacture of the cold insoluble globulin and pharmaceutical preparation containing it | |
| US4476109A (en) | Method of preparing gamma globulin suitable for intravenous administration | |
| US4322403A (en) | Method for the preparation of an immune globulin solution suitable for intravenous use | |
| KR0131204B1 (ko) | 암 면역치료용 보조제 | |
| JPS59222420A (ja) | 第８因子含有製剤の製造法 | |
| US4686284A (en) | Production of monomeric human γ-interferon | |
| Free et al. | Separation and properties of multiple components of bovine growth hormone | |
| JPS62500072A (ja) | 蛋白質の精製法 | |
| EP0168008A2 (en) | Stable composition of gamma-interferon | |
| JP2566919B2 (ja) | α−インタ−フエロンの製造方法 | |
| CN116023466B (zh) | 纯化PEG修饰重组人干扰素β1b蛋白的方法 | |
| US4617378A (en) | Purification of biologically active human immune interferon | |
| JPS60155137A (ja) | 高濃度ヒトγ型インタ−フエロン水溶液の製造法 | |
| JP2548822B2 (ja) | マカラスムギ由来の糖タンパク質、その製造法及びそれを含有する免疫調節剤 | |
| EP4073084A1 (en) | Protein bioprocess | |
| EP0150066A2 (en) | Highly solubilized protein and production thereof | |
| JPH064680B2 (ja) | 高濃度ヒトγ型インターフェロンフラグメント水溶液の製造法 | |
| RU1829938C (ru) | Способ очистки гамма-глобулина дл внутривенного введени |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |