JPS59222420A - 第８因子含有製剤の製造法 - Google Patents
第８因子含有製剤の製造法Info
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- JPS59222420A JPS59222420A JP59101636A JP10163684A JPS59222420A JP S59222420 A JPS59222420 A JP S59222420A JP 59101636 A JP59101636 A JP 59101636A JP 10163684 A JP10163684 A JP 10163684A JP S59222420 A JPS59222420 A JP S59222420A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、第■因子（Ａ Ｉ−Ｉ Ｆ ）含有製剤の
製造法に関するものである。
製造法に関するものである。
ひとまたは動物の血漿から製造され一天然の血漿より高
い第■因子活性を示す第■因子（Ａ ＨＦ）濃縮物は既
に知られている。フラクション化法による公知の第■因
子濃縮物製造法は一血漿をエタノール、エーテル、ポリ
エチレングリコール、および／またはグリシンで処理す
ることを必要とする。またープールＣ１９６５年、「ザ
・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メデイシ
ン」２７３巻１４４３頁〕による血漿の低温沈殿（ｃｒ
ｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ）、またはショア
７７ ［Ｃｏｎｇｒ。
い第■因子活性を示す第■因子（Ａ ＨＦ）濃縮物は既
に知られている。フラクション化法による公知の第■因
子濃縮物製造法は一血漿をエタノール、エーテル、ポリ
エチレングリコール、および／またはグリシンで処理す
ることを必要とする。またープールＣ１９６５年、「ザ
・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メデイシ
ン」２７３巻１４４３頁〕による血漿の低温沈殿（ｃｒ
ｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ）、またはショア
７７ ［Ｃｏｎｇｒ。
Ｉｎｔ、 Ｓｏｃ、Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆ、オース
トラリア−シトニー−雑文抄録１１０９頁−１９６６年
〕による血漿のエタノール低温沈殿（ｃｒｙｏｅｔｈａ
ｎｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ）も知られテイル
。
トラリア−シトニー−雑文抄録１１０９頁−１９６６年
〕による血漿のエタノール低温沈殿（ｃｒｙｏｅｔｈａ
ｎｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ）も知られテイル
。
さらに−西独公開公報２５１６１８６号には、血漿から
得た低温沈殿をほぐし−はぐしたものをくえん酸・グル
コース緩衝液にけんだくし、遠心分離し、得られた緩衝
抽出液を６．０ないし６．８のｐＩ−（に調節する方法
が記載されている。これらの条件下では、望ましくない
不純物の沈殿が起り、その後第■因子含有残渣を滅菌し
凍結乾燥する。
得た低温沈殿をほぐし−はぐしたものをくえん酸・グル
コース緩衝液にけんだくし、遠心分離し、得られた緩衝
抽出液を６．０ないし６．８のｐＩ−（に調節する方法
が記載されている。これらの条件下では、望ましくない
不純物の沈殿が起り、その後第■因子含有残渣を滅菌し
凍結乾燥する。
この方法で得られる第■因子製品は一僅かな第■因子単
位／蛋白質■の特異的活性を示すにすぎない。さらに、
第■因子単位当りの免疫グロブリンＧ （ＩｇＧ ）量
が望ましくないほど高い。
位／蛋白質■の特異的活性を示すにすぎない。さらに、
第■因子単位当りの免疫グロブリンＧ （ＩｇＧ ）量
が望ましくないほど高い。
同様な方法がオーストリア特許３４９６３９号並びに米
国特許４１７０６３９号および４１０４２６６号に記載
され、そこでは−同様に血漿から出発し一低温沈殿を得
、これを中性ｐＨ域の緩衝液に溶解して望ましくない蛋
白質を分離し、プロトロンビン錯体を分離するために上
清を水酸化アルミニウムで処理し、次いで第■因子含有
溶液を濃縮し凍結乾燥している。この方法でも、第■因
子単位／蛋白質■の特異的活性が極めて低い。例えば、
米国特許４１０４２６６号による特異的活性は僅か０．
５ないし０．６単位／蛋白質ｍｇにすぎない。
国特許４１７０６３９号および４１０４２６６号に記載
され、そこでは−同様に血漿から出発し一低温沈殿を得
、これを中性ｐＨ域の緩衝液に溶解して望ましくない蛋
白質を分離し、プロトロンビン錯体を分離するために上
清を水酸化アルミニウムで処理し、次いで第■因子含有
溶液を濃縮し凍結乾燥している。この方法でも、第■因
子単位／蛋白質■の特異的活性が極めて低い。例えば、
米国特許４１０４２６６号による特異的活性は僅か０．
５ないし０．６単位／蛋白質ｍｇにすぎない。
第■因子濃縮物を製造する別の方法として、血漿をフロ
リゲル、ベントナイト、イオン交換体および透過クロマ
トグラフィー剤のような吸着剤で処理することからなる
方法がある。
リゲル、ベントナイト、イオン交換体および透過クロマ
トグラフィー剤のような吸着剤で処理することからなる
方法がある。
この発明は一上記の不利益および欠点を回避するために
なされたものであって、はぼ中性領域のｐＨで望ましく
ない蛋白質特にフィブリノーゲンの大部分を沈殿させる
方法を用いて、比活性が少なくとも第■因子１，５単位
／蛋白質哩であり一免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分が１
５ないし３０巧／第■因子１０００単位でフィブリノー
ゲン分が２０ないし４０〜／第■因子１００単位である
、第■１因子（ＡＨＦ）含有製剤を提供しようとするも
のである。
なされたものであって、はぼ中性領域のｐＨで望ましく
ない蛋白質特にフィブリノーゲンの大部分を沈殿させる
方法を用いて、比活性が少なくとも第■因子１，５単位
／蛋白質哩であり一免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分が１
５ないし３０巧／第■因子１０００単位でフィブリノー
ゲン分が２０ないし４０〜／第■因子１００単位である
、第■１因子（ＡＨＦ）含有製剤を提供しようとするも
のである。
この発明は、前記した方法に沿って上記の目的を達成す
るものであり、望ましくない蛋白質の沈殿をｐＨ６ない
し７で硫酸化多糖類の存在下に行ない、沈殿を捨てた後
、第■因子含有上清をｐＨ６ないし７で塩類の存在下に
蛋白沈殿剤で処理して第■因子含有沈殿を得、これを溶
解し、所望により、最終製品を抗トロンビン■・ヘパリ
ン錯体マタは抗トロンビン■・ヘパリノイド錯体と混合
することから構成される。
るものであり、望ましくない蛋白質の沈殿をｐＨ６ない
し７で硫酸化多糖類の存在下に行ない、沈殿を捨てた後
、第■因子含有上清をｐＨ６ないし７で塩類の存在下に
蛋白沈殿剤で処理して第■因子含有沈殿を得、これを溶
解し、所望により、最終製品を抗トロンビン■・ヘパリ
ン錯体マタは抗トロンビン■・ヘパリノイド錯体と混合
することから構成される。
この発明によると、高特異的活性−例えば第■因子１．
５ないし４．０単位／蛋白質■を有し一免疫グロブリン
が約１５ないし３０り／第■因子１０００単位の低含量
である製剤が得られる。この種の製品は、凍結乾燥後極
めて良好な溶解性を示す。再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔ
ｕｔｉｏｎ）時間は０．５ないし４分にすぎず、この発
明の方法の経済性は良好で、収率は高い。
５ないし４．０単位／蛋白質■を有し一免疫グロブリン
が約１５ないし３０り／第■因子１０００単位の低含量
である製剤が得られる。この種の製品は、凍結乾燥後極
めて良好な溶解性を示す。再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔ
ｕｔｉｏｎ）時間は０．５ないし４分にすぎず、この発
明の方法の経済性は良好で、収率は高い。
好ましい実施態様によると、硫酸化多糖類として、ムコ
多糖類ポリ硫酸エステル、ベントサンポリスルフェート
、デキストランスルフェートのようなヘパリフイド類が
用いられる。
多糖類ポリ硫酸エステル、ベントサンポリスルフェート
、デキストランスルフェートのようなヘパリフイド類が
用いられる。
この発明による有利な方法は一下記処理手段の結合、す
なわち 低温沈殿をくえん酸・ヘパリノイド緩衝液に溶解し、そ
のｐＨを６．０ないし６，４に調節し−けんだく液を０
ないし２５℃好ましくは４ないし８°Ｃに冷却して不活
性蛋白質を沈殿させること、沈殿を捨てた後、ｐＨ６，
０ないし７．０で最高グリシン１．４５モルおよび／ま
たは最低イオン強度０．１５の存在下にエチルアルコー
ルのような蛋白沈殿剤で沈殿させることにより精製箱■
因子含有上清溶液を濃縮すること、 抗トロンビン■・ヘパリノイド錯体または抗トロンビン
■ ヘパリン錯体の存在下に第■因子含有沈殿をグリシ
ン・くえん酸・ＮａＣｚ緩衝液に溶解し−これを安定な
形態に加工すること、の結合を特徴とするものである。
なわち 低温沈殿をくえん酸・ヘパリノイド緩衝液に溶解し、そ
のｐＨを６．０ないし６，４に調節し−けんだく液を０
ないし２５℃好ましくは４ないし８°Ｃに冷却して不活
性蛋白質を沈殿させること、沈殿を捨てた後、ｐＨ６，
０ないし７．０で最高グリシン１．４５モルおよび／ま
たは最低イオン強度０．１５の存在下にエチルアルコー
ルのような蛋白沈殿剤で沈殿させることにより精製箱■
因子含有上清溶液を濃縮すること、 抗トロンビン■・ヘパリノイド錯体または抗トロンビン
■ ヘパリン錯体の存在下に第■因子含有沈殿をグリシ
ン・くえん酸・ＮａＣｚ緩衝液に溶解し−これを安定な
形態に加工すること、の結合を特徴とするものである。
この実施態様の変法として、第■因子含有上清溶液に蛋
白沈殿剤と塩類を添加した後、得られるけんだく液を凍
結し、０ないし４°Ｃの温度で解凍し一上清を捨て、抗
トロンビン■・ヘパリノイド錯体または抗トロンビン■
・ヘパリン錯体の存在下に第■因子含有沈殿をグリシン
・くえん酸ＮａＣ１緩衝液に溶解し、安定な形態に加工
することから構成される方法がある。
白沈殿剤と塩類を添加した後、得られるけんだく液を凍
結し、０ないし４°Ｃの温度で解凍し一上清を捨て、抗
トロンビン■・ヘパリノイド錯体または抗トロンビン■
・ヘパリン錯体の存在下に第■因子含有沈殿をグリシン
・くえん酸ＮａＣ１緩衝液に溶解し、安定な形態に加工
することから構成される方法がある。
安定化を目的として、最終製品にアルブミンを添加する
のが適当である。
のが適当である。
この発明により製造された製剤の特異的第ＭＩ［因子活
性とは一第■因子活性／蛋白質ｍｙの比率を意味する。
性とは一第■因子活性／蛋白質ｍｙの比率を意味する。
第■因子活性は、いわゆる２段階法、すなわちオーステ
ンおよびライムズ−「ア・ラボラトリ−・マニュアル・
オブ・ブラッド・コアギュレーション」（ブラックウェ
ル・サイエンティフィック・パブリケーションズ−１９
７５年）にしたがって測定される。蛋白質濃度は、ゴー
ナル、バーダウィルおよびディピッド−Ｊ 、 Ｂｉｏ
ｌ 、Ｃｈｅｍ。
ンおよびライムズ−「ア・ラボラトリ−・マニュアル・
オブ・ブラッド・コアギュレーション」（ブラックウェ
ル・サイエンティフィック・パブリケーションズ−１９
７５年）にしたがって測定される。蛋白質濃度は、ゴー
ナル、バーダウィルおよびディピッド−Ｊ 、 Ｂｉｏ
ｌ 、Ｃｈｅｍ。
１７７巻７５１頁（１９４９年）記載の方法により測定
される。
される。
この発明の製剤に適用し得る免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ
）の定量法は一文献すなわちマンチニ、ベルマン、カル
ボナラおよびヘレマンス−［ア・シングル ラジアル・
ディツユジョン・メソッド・フォー・ジ・イムノロジカ
ル・クオンテイテーション・オン・プロテインズ・（Ｘ
Ｉコロキュウム・オン・プロチド・オン ザ・バイオロ
ジカル・フルイド、３７０頁、１９６４年−アムステル
ダムーエルスフイール）に記載されている。
）の定量法は一文献すなわちマンチニ、ベルマン、カル
ボナラおよびヘレマンス−［ア・シングル ラジアル・
ディツユジョン・メソッド・フォー・ジ・イムノロジカ
ル・クオンテイテーション・オン・プロテインズ・（Ｘ
Ｉコロキュウム・オン・プロチド・オン ザ・バイオロ
ジカル・フルイド、３７０頁、１９６４年−アムステル
ダムーエルスフイール）に記載されている。
測定法の原理は、抗原（ＩｇＧ）と抗体（抗ＩｇＧ）の
反応に存する。アガロース免疫拡散トレイ（例えばイム
ノ・ディアグノスチカによる）は−特異的抗血清（抗Ｉ
ｇＧ）を含んでいる。
反応に存する。アガロース免疫拡散トレイ（例えばイム
ノ・ディアグノスチカによる）は−特異的抗血清（抗Ｉ
ｇＧ）を含んでいる。
第■因子含有製剤とレファレンス標準製剤（ＷＨＯ基準
に基づく既知ＩｇＧ含有のもの）それぞれ５Ｘ１０
ｍｅをウェル（ｗｅｌｌ）に入れる。少なくとも２０な
いし２４°Ｃで４５時間反応後、環状沈殿の直径を測定
する。上記免疫グロブリンのレファレンス標準品と比較
して第■因子含有製剤の免疫グロブリン濃度を定量する
。
に基づく既知ＩｇＧ含有のもの）それぞれ５Ｘ１０
ｍｅをウェル（ｗｅｌｌ）に入れる。少なくとも２０な
いし２４°Ｃで４５時間反応後、環状沈殿の直径を測定
する。上記免疫グロブリンのレファレンス標準品と比較
して第■因子含有製剤の免疫グロブリン濃度を定量する
。
また、セルロースアセテート膜゛屯気泳動によるフィブ
リノーゲンの定量も、文献すなわちゲボット ト、「ベックマン・マイクロゾーン・エレクロホ△ レシス・マニュアル」（ベツクマンインストルメンツ
インコーホレイテッド、１９７７年、０１５−０８３３
６３Ｃ１−Ｃ）に記載されている。
リノーゲンの定量も、文献すなわちゲボット ト、「ベックマン・マイクロゾーン・エレクロホ△ レシス・マニュアル」（ベツクマンインストルメンツ
インコーホレイテッド、１９７７年、０１５−０８３３
６３Ｃ１−Ｃ）に記載されている。
そこに記載された指示によると、次のように操作スる。
セルロースアセテート膜をＰＨ８，６のベロナール／ベ
ロナール・ナトリウム緩衝液（ベックマンＢ−２緩衝液
）に浸漬し一平衡させる。マルチプル サンプル・アプ
リケータを用いて１２．５×１０ ■の第■因子含有製
剤を平衡膜に適用する。個々の成分（アルブミン、アル
ファーグロブリン、ベーターグロブリン、フィブリノー
ゲンおよびガンマ−グロブリン）の分類用レファレンス
物質として、ひと血漿を用いる。成分の遊走速度の測定
には、ひとアルブミンを標準として用いる。
ロナール・ナトリウム緩衝液（ベックマンＢ−２緩衝液
）に浸漬し一平衡させる。マルチプル サンプル・アプ
リケータを用いて１２．５×１０ ■の第■因子含有製
剤を平衡膜に適用する。個々の成分（アルブミン、アル
ファーグロブリン、ベーターグロブリン、フィブリノー
ゲンおよびガンマ−グロブリン）の分類用レファレンス
物質として、ひと血漿を用いる。成分の遊走速度の測定
には、ひとアルブミンを標準として用いる。
全試料、アルブミンおよび血漿を膜上に適用後、マイク
ロゾーン・セパレーション・チェンバー中−パワーユニ
ット（ベックマン４２６４）Ｃ電圧２５０Ｖ、電流３な
いし４ｍＡ／膜、時間２０分間〕で′嘔気泳動による分
離を実施する。
ロゾーン・セパレーション・チェンバー中−パワーユニ
ット（ベックマン４２６４）Ｃ電圧２５０Ｖ、電流３な
いし４ｍＡ／膜、時間２０分間〕で′嘔気泳動による分
離を実施する。
その後、蛋白質リボンをポンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ ）
Ｓで染色し、過剰の染色液を酢酸１部とメタノール１９
部の混合物で除く。ホイルを純メタノールで脱水し、酢
酸１部とメタノール３部の混合物に浸漬して透明にする
。次いて、ホイルをガラス板上で乾燥し、デンシトメー
タ（ベックマンデンシトメータＲ−１１２）で測定する
。総蛋白濃度中相対フィブリノーゲン濃度がプリントア
ウトされる。フィブリノーゲンの絶対量は相対フィブリ
ノーゲン濃度に第■因子含有製剤の蛋白濃度を剰じて得
られる。
Ｓで染色し、過剰の染色液を酢酸１部とメタノール１９
部の混合物で除く。ホイルを純メタノールで脱水し、酢
酸１部とメタノール３部の混合物に浸漬して透明にする
。次いて、ホイルをガラス板上で乾燥し、デンシトメー
タ（ベックマンデンシトメータＲ−１１２）で測定する
。総蛋白濃度中相対フィブリノーゲン濃度がプリントア
ウトされる。フィブリノーゲンの絶対量は相対フィブリ
ノーゲン濃度に第■因子含有製剤の蛋白濃度を剰じて得
られる。
以下−この発明の方法を実施例によりさらに詳細に説明
する。
する。
実施例１
冷凍新鮮血漿６６６０ｄを０℃ないし＋４°Ｃで解凍し
た。生成した低温沈殿を遠心分離し、デキストランスル
フェート（ファルマシア）０．１ｍｇ／−およびアプロ
チニン３０単位／Ｊを含むくえん酸３ナトリウム溶液７
００゜ｅに溶解した。溶液のｐＨを６．３に調節し一渦
度を４°Ｃに調節した。生成する沈殿を遠心分離し、捨
てた。
た。生成した低温沈殿を遠心分離し、デキストランスル
フェート（ファルマシア）０．１ｍｇ／−およびアプロ
チニン３０単位／Ｊを含むくえん酸３ナトリウム溶液７
００゜ｅに溶解した。溶液のｐＨを６．３に調節し一渦
度を４°Ｃに調節した。生成する沈殿を遠心分離し、捨
てた。
８％エタノールを添加することにより第■因子含有フラ
クションを沈殿させ、免疫グロブリン（ＩｇＧ−ＩｇＡ
−ＩｇＭ）の大部分を−１０％グリシンのようなアミノ
酸を添加するかまたはＮａＣｚもしくはくえん酸ナトリ
ウムによりイオン強度を増加することにより、溶液中に
保持した。分離した第■因子含有フラクションを含む沈
殿を、抗トロンビン濃度０５０５単位／Ｔｎｌの抗トロ
ンビン■・ヘパリン錯体を含むグリシン・くえん酸・Ｎ
ａＣ／緩衝液に溶解した。次いで、溶解した沈殿を最終
製品の容器に充填し凍結乾燥した。
クションを沈殿させ、免疫グロブリン（ＩｇＧ−ＩｇＡ
−ＩｇＭ）の大部分を−１０％グリシンのようなアミノ
酸を添加するかまたはＮａＣｚもしくはくえん酸ナトリ
ウムによりイオン強度を増加することにより、溶液中に
保持した。分離した第■因子含有フラクションを含む沈
殿を、抗トロンビン濃度０５０５単位／Ｔｎｌの抗トロ
ンビン■・ヘパリン錯体を含むグリシン・くえん酸・Ｎ
ａＣ／緩衝液に溶解した。次いで、溶解した沈殿を最終
製品の容器に充填し凍結乾燥した。
上記抗トロンビン・ヘパリン錯体の製造は次のように行
なった。
なった。
血漿１リツトルにヘパリン５ｏｏｏｏ単位を加え、＋４
°Ｃで３０分間攪拌した。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ
５０を１１まぜ込んだ後−十４℃でさらに２時間攪拌し
た。負荷ゲルをブフナー漏斗で沖過し、燐酸およびくえ
ん酸緩衝等張食塩水各１００ ｍｅで２回洗浄して随伴
している蛋白質を除いた。
°Ｃで３０分間攪拌した。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ
５０を１１まぜ込んだ後−十４℃でさらに２時間攪拌し
た。負荷ゲルをブフナー漏斗で沖過し、燐酸およびくえ
ん酸緩衝等張食塩水各１００ ｍｅで２回洗浄して随伴
している蛋白質を除いた。
洗浄した負荷ゲルを上記緩衝液５０ ＋ｎｌにけんだく
し、固体Ｎａ Ｃ１を加えて導電率を４２ ｍ Ｓ／ｃ
ｍに調節した。＋４°Ｃで１時間攪拌後−ブフナー漏斗
で分離し、抗トロンビン■・ヘパリン錯体を溶出液とし
て回収し、これを食塩水で透析した。
し、固体Ｎａ Ｃ１を加えて導電率を４２ ｍ Ｓ／ｃ
ｍに調節した。＋４°Ｃで１時間攪拌後−ブフナー漏斗
で分離し、抗トロンビン■・ヘパリン錯体を溶出液とし
て回収し、これを食塩水で透析した。
上記実施例で得た製品について前述した文献の方法によ
る測定値は下記の通りである。
る測定値は下記の通りである。
第■因子単位／蛋白質■ １．５１ｇＧ／
第■因子１０００単位 １７．０■フイブリノ一
ゲン含量／第■因子１００単位３５〜 再構成時間 ４分実施例２ デキストランスルフェートの代りにムコ多糖類ポリ硫酸
エステルを用いたほかは、実施例１と同様に操作して製
剤を得た。この製品の測定値は下記の通りである。
第■因子１０００単位 １７．０■フイブリノ一
ゲン含量／第■因子１００単位３５〜 再構成時間 ４分実施例２ デキストランスルフェートの代りにムコ多糖類ポリ硫酸
エステルを用いたほかは、実施例１と同様に操作して製
剤を得た。この製品の測定値は下記の通りである。
第■因子単位／蛋白質ｍｙ ３・ＩＩｇ
Ｇ／第■因子１０００単位 １５．６■フイブリ
ノ一ゲン含量／第■因子１００単位３ ０ ｒｑ 再構成時間 １分実施例３ デキストランスルフェートの代りにベントサンポリスル
フニー）（ＳＰ５４）を用い、溶解用緩衝液に抗トロン
ビン■・ヘパリノイド錯体を０．０５単位／ ｍｅの濃
度で含ませたほかは、実施例１と同様に操作して製品を
得た。この抗トロンビン■・ヘパリノイド錯体は次のよ
うにして製造した。
Ｇ／第■因子１０００単位 １５．６■フイブリ
ノ一ゲン含量／第■因子１００単位３ ０ ｒｑ 再構成時間 １分実施例３ デキストランスルフェートの代りにベントサンポリスル
フニー）（ＳＰ５４）を用い、溶解用緩衝液に抗トロン
ビン■・ヘパリノイド錯体を０．０５単位／ ｍｅの濃
度で含ませたほかは、実施例１と同様に操作して製品を
得た。この抗トロンビン■・ヘパリノイド錯体は次のよ
うにして製造した。
血漿１リツトルにポリアニオン５Ｐ５４を３ｇ！加え、
＋４℃で３０分間攪拌した。ＤＥＡＥ−セファデックス
Ａ５０を２．５Ｆまぜ込んだ後、＋４℃でさらに２時間
攪拌した。負荷ゲルをブフナー漏斗で沖過し一燐酸およ
びくえん酸緩衝等張食塩水２００ ｍｅで２回洗浄して
随伴している蛋白質を除いた。洗浄した負荷ゲルを上記
緩衝液ｉｏｏ、ｙにけんだくし、固体食塩を加えて導電
率を５ＱｍＳＺ口に調節した。＋４°Ｃで１時間攪拌後
、ブフナー漏斗で分離し、抗トロンビン■・ヘパリノイ
ド錯体（ＳＰ５４）を溶出液として回収し、これを食塩
水で透析した。
＋４℃で３０分間攪拌した。ＤＥＡＥ−セファデックス
Ａ５０を２．５Ｆまぜ込んだ後、＋４℃でさらに２時間
攪拌した。負荷ゲルをブフナー漏斗で沖過し一燐酸およ
びくえん酸緩衝等張食塩水２００ ｍｅで２回洗浄して
随伴している蛋白質を除いた。洗浄した負荷ゲルを上記
緩衝液ｉｏｏ、ｙにけんだくし、固体食塩を加えて導電
率を５ＱｍＳＺ口に調節した。＋４°Ｃで１時間攪拌後
、ブフナー漏斗で分離し、抗トロンビン■・ヘパリノイ
ド錯体（ＳＰ５４）を溶出液として回収し、これを食塩
水で透析した。
上記実施例で得た製品について得た測定値は次の通りで
ある。
ある。
第■因子単位／蛋白質ｍｌ ２．４７Ｉ
ｇＧ７第■因子１０００単位 １７．０−＋ｐフ
ィブリノーゲン含量／第■因子１００単位３ ３ ｍｇ 再構成時間 ７ １分実施例４ 冷凍新鮮血漿７０００−を０℃ないし＋４℃で、解凍し
た。生成した低温沈殿を分離し、ムコ多糖類ポリ硫酸エ
ステルを含むくえん酸３ナトリウム溶液５５０ ｍｅに
溶解した。溶液のｐＨを６．６５に調節し、温度を１°
Ｃに調節した。生成する沈殿を分離し捨てた。上清に８
％エタノールと７．５％グリシンを添加することにより
第■因子含有フラクションを沈殿させた。けんだく液を
（急速）冷凍し、０ないし＋４℃で再解凍した。
ｇＧ７第■因子１０００単位 １７．０−＋ｐフ
ィブリノーゲン含量／第■因子１００単位３ ３ ｍｇ 再構成時間 ７ １分実施例４ 冷凍新鮮血漿７０００−を０℃ないし＋４℃で、解凍し
た。生成した低温沈殿を分離し、ムコ多糖類ポリ硫酸エ
ステルを含むくえん酸３ナトリウム溶液５５０ ｍｅに
溶解した。溶液のｐＨを６．６５に調節し、温度を１°
Ｃに調節した。生成する沈殿を分離し捨てた。上清に８
％エタノールと７．５％グリシンを添加することにより
第■因子含有フラクションを沈殿させた。けんだく液を
（急速）冷凍し、０ないし＋４℃で再解凍した。
第■因子含有沈殿を分離した後、これを溶解し、容器に
充填し凍結乾燥した。この製品についての測定値は次の
通りである。
充填し凍結乾燥した。この製品についての測定値は次の
通りである。
第■因子単位／蛋白質■ １．６６ＩｇＧ
／第■因子１ｏｏｏ単位 ２２． Ｏｍ＆フィブ
リノーゲン含量／第■因子１００単位４０■ 再構成時間 ３分実施例５ 冷凍新鮮血漿５０００ ｍｅをｏ ”ｃないし＋４°Ｃ
で解凍した。生成した低温沈殿を分離し、ベントサンポ
リスルフェートを含むくえん酸３ナトリウム溶液３５０
ｍｅに溶解した。溶液のｐＨを６．２０に調節し一温
度を８℃に調節した。生成する沈殿を分離し捨てた。上
清に１５％グリシンを添加することにより第■因子含有
フラクションを沈殿させた。けんだく液を（急速）冷凍
し−０ないし＋４°Ｃで再解凍した。
／第■因子１ｏｏｏ単位 ２２． Ｏｍ＆フィブ
リノーゲン含量／第■因子１００単位４０■ 再構成時間 ３分実施例５ 冷凍新鮮血漿５０００ ｍｅをｏ ”ｃないし＋４°Ｃ
で解凍した。生成した低温沈殿を分離し、ベントサンポ
リスルフェートを含むくえん酸３ナトリウム溶液３５０
ｍｅに溶解した。溶液のｐＨを６．２０に調節し一温
度を８℃に調節した。生成する沈殿を分離し捨てた。上
清に１５％グリシンを添加することにより第■因子含有
フラクションを沈殿させた。けんだく液を（急速）冷凍
し−０ないし＋４°Ｃで再解凍した。
第■因子含有沈殿を分離した後−これを溶解し一容器に
充填し凍結乾燥した。この製品についての測定値は次の
通りである。
充填し凍結乾燥した。この製品についての測定値は次の
通りである。
第■因子単位／蛋白質■ ３．８０ＩｇＧ
／第■因子１０００単位 ２０■フイブリノ一ゲ
ン含量／第■因子１００単位２１■
／第■因子１０００単位 ２０■フイブリノ一ゲ
ン含量／第■因子１００単位２１■
Claims (11)
- （１）第■因子含有血漿分画を緩衝液に溶解して溶液と
し、望ましくない蛋白質をほぼ中性領域のｐＨで沈殿さ
せることにより上記溶液を精製して第■因子含有残留分
を得−上記第■因子含有残留分を濃縮して濃縮物を得、
上記濃縮物を安定な形態に加工することにより一比活性
が少なくとも第■因子１．５単位／蛋白質哩であり、免
疫グロブリフＧ（ＩｇＧ）分が１５ないし３０ｖ／第■
因子１０００単位でフィブリノーゲン分が２０ないし４
（ｌＩＩＩｆ／第■因子１００単位である一第■因子（
ＡＨＦ）含有製剤の製造法において、上記望ましくない
蛋白質の沈殿をｐＨ５ないし７で硫酸化多糖類の存在下
に行ない一沈殿を除去した後−第■因子含有上清をｐＨ
５ないし７で塩類の存在下に蛋白沈殿剤で処理して第■
因子含有沈殿を得、この第■因子含有沈殿を溶解して最
終製品を得ることからなる一改良方法。 - （２）抗トロンビン■・ヘパリン錯体を最終製品に添加
することからなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （３）抗トロンビン■・ヘパリノイド錯体を最終製品に
添加することからなる一特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - （４）硫酸化多糖類がムコ多糖類ポリ硫酸エステル、ベ
ントサンポリスルフェートおよびデキストランスルフェ
ートから選ばれたヘパリン錯体からなるものである一特
許請求の範囲第１項記載の方法。 - （５）第■因子含有血漿分画を緩衝液に溶解して溶液と
し−望ましくない蛋白質をほぼ中性領域のｐＩ４で沈殿
させることにより上記溶液を精製して第■因子含有残留
分を得、上記第■因子含有残留分を濃縮して濃縮物を得
−上記濃縮物を安定な形態に加工することにより、比活
性が少なくとも第■因子１．５単位／蛋白質〜であり、
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分が１５ないし３０■／第
■因子１０００単位でフィブリノーゲン分が２０ないし
４０ｍｇ／第■因子１００単位である、第■因子（ＡＨ
Ｆ）含有製剤の製造法において、下記処理手段の結合、
すなわち 低温沈殿をくえん酸・ヘパリノイド緩衝液に溶解し、そ
のｐＨを６．０ないし６．４に調節してけんだく液を得
−上記けんだく液を０ないし２５°Ｃに冷却して不活性
蛋白質を沈殿として沈降させること、上記沈殿を除去し
て精製第■因子含有上清溶液を得、ＰＨ６，０ないし７
．０で最高グリシン１．４５モルおよび最低イオン強度
０．１５のうち少なくとも１種の存在下に蛋白沈殿剤で
沈殿させることにより上記精製第■因子含有上清溶液を
濃縮して第■因子含有沈殿を得ること− 抗トロンビン■・ヘパリノイド錯体および抗トロンビン
■・ヘパリン錯体のうち１種の存在下に上記第■因子含
有沈殿をグリシン・くえん酸・Ｎａ Ｃ１緩衝液に溶解
し−これを安定な形態に加工すること、 の結合を特徴とする方法。 - （６）けんだく液を０ないし８°Ｃに冷却することから
なる、特許請求の範囲第５項記載の方法。 - （７）蛋白沈殿剤がエチルアルコールである、特許請求
の範囲第５項記載の方法。 - （８）第■因子含有上清溶液に蛋白沈殿剤と塩類の添加
後にけんだく液を得−これを凍結し０ないし４℃で再融
解して上清と第■因子含有沈殿を形成し、上記上清を除
去し第■因子含有沈殿を抗トロンビン■・ヘパリノイド
錯体および抗トロンビン・ヘパリン錯体のうち１種の存
在下にグリシン・くえん酸・ＮａＣ１緩衝液に溶解し、
安定な形態に加工する、特許請求の範囲第５項記載の方
法。 - （９）安定化のために最終製品にアルブミンを加える、
特許請求の範囲第１ないし８項の何れか１項記載の方法
。 - （１０）特許請求の範囲第１ないし８項の何れか１項記
載の方法により製造した、比活性が少なくとも第■因子
１．５単位／蛋白質■てあり、免疫グロブリン（ＩｇＧ
）分が１５ないし３０■／第■因子１０００単位でフィ
ブリノーゲン分が２０ないし４０ｒｎｇ／第■因子１０
０単位である、第■因子（Ａ Ｉ−Ｉ Ｆ ）含有製剤
。 - （１１）特許請求の範囲第９項記載の方法により製造し
た一比活性が少なくとも第■因子１．５単位／蛋白質巧
であり、免疫グロブリン（ＩｇＧ）分力１５ないし３０
巧／第■因子１０００単位でフィブリノーゲン分が２０
ないし４０■／第■因子１００単位である、第■因子（
Ａ ｔＩ Ｆ ）含有製剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT1858/83 | 1983-05-20 | ||
| AT0185883A AT379510B (de) | 1983-05-20 | 1983-05-20 | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf) -haeltigen praeparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59222420A true JPS59222420A (ja) | 1984-12-14 |
| JPH0553777B2 JPH0553777B2 (ja) | 1993-08-10 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP0127603B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59222420A (ja) |
| AT (2) | AT379510B (ja) |
| CA (1) | CA1225331A (ja) |
| DE (1) | DE3475871D1 (ja) |
| DK (1) | DK158281C (ja) |
| ES (1) | ES8505822A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62502116A (ja) * | 1985-03-07 | 1987-08-20 | セントラル・ブラツド・ラボラトリ−ズ・オ−ソリテイ− | 沈殿による血液凝固８因子の精製 |
| JP2014138614A (ja) * | 2014-04-09 | 2014-07-31 | Sk Chemicals Co Ltd | 第ｖｉｉｉ因子とその誘導体の製造及び精製方法 |
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|---|---|---|---|---|
| GB8403473D0 (en) * | 1984-02-09 | 1984-03-14 | Special Trustees For St Thomas | Purification of factor viii |
| US4965199A (en) * | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
| DE3512910A1 (de) * | 1985-04-11 | 1986-10-16 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur reinigung von plasminogenaktivatoren |
| DE3625090A1 (de) * | 1986-07-24 | 1988-01-28 | Behringwerke Ag | Mittel zur therapie faktor viii-resistenter haemophilie a und verfahren zu seiner herstellung |
| AT391808B (de) * | 1986-11-03 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf)-haeltigen fraktion |
| AT391809B (de) * | 1988-01-12 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur inaktivierung von vermehrungsfaehigen filtrierbaren krankheitserregern in blutplasmaprodukten |
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