JPS62502116A - 沈殿による血液凝固８因子の精製 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 沈殿による血液凝固ＶＩＩ因子の精製 本発明は血漿濃縮物、特に凍結沈殿物からの■因子（抗血友病因子、ＡＨＦ）の 精製に関する。

血液凝固■因子（本明細書中ではＦ■とも記す）は、血中の■因子の不足又は不 在により生ずる遺伝病である古典的な血友病（血友病Ａ）の患者の治療に長年使 用されてきた血液の蛋白質成分である。１９６０年代までは、血友病の治療は全 面又は血漿輸血であった。しかしながら、最近の１０〜２０年では、■因子に富 む蛋白質濃縮物が徐々にこれらの全血漿輸血に取って替り、抗血友病療法の効果 を増大させた。

近年使用されている血漿濃縮物の商業上辺も重要なものは凍結沈殿物（ＣｒｖＯ ｐｒｅＣｉｐｉｔａｔｅ）として一般に知られている血漿画分であり、凍結沈殿 物から調製した精製濃縮物である。従来、凍結沈殿物は、■因子、フィブリノー ゲン（血液凝固工因子）及びフィブロネクチン（冷間不溶性グロブリン、ＣＩａ ）を多く含む沈殿物と定義されており、低温血漿分画法により、凍結した新しく ＩＩ製したヒト血漿から製造する。典型的には、急速冷凍した血漿を一５℃〜− １５℃に軟化し、次に、手動で又は機械械で充分撹拌しながら、約３℃以下の温 度までゆっくりと温める。これらの条件下では、凍結した血漿は部分的に溶けて 液相と固相になり、遠心により回収するこの固相が商業上価値ある凍結沈殿物で ある。この方法で調製した凍結沈殿物は典型的には、血漿を得た全血中に含まれ ている■因子の金石の４０〜６０％の濃縮物を含有する。

凍結沈殿物及び他の血漿画分からの■因子の収率を改善するために、及びそれを 安定化させて更に精製するために多くの研究が成されてきた。例えば、他の血液 凝固因子のいくつかを排除し、■因子の活性を安定化し、その次の■因子の滅菌 濾過を容易にする／ｌ　（ＯＨ）３ゲルによる凍結沈殿物の処理が最少の精製法 である。しかしながら、通常は、十分純粋なＦＶＩ製剤を製造するためには冷凍 沈殿物の多段階処理が必要である。

現在の技術の主要な欠点は、大部分は血漿の多段階処理法はむしろ■因子活性の 経費的な損失を生み出すことにある。更に、長い間、抗血友病活性、全蛋白質含 量及び特にフィブリノーゲン及びフィブロネクチンである他の蛋白質の混在に関 し非常に巾のある市販の■因子製剤が受け入れられてきた。フィブリノーゲン及 びフィブロネクチンがＦＶｌｔＪ剤中に多量に存在すると処理段階のいくつかで Ｆ■が受容しえない位損失することが発見されており、望ましくない。通常フィ ブリノーゲンは血漿中及び凍結沈殿物中にフィブロネクチンよりずっと高濃度に 存在し、フィブロネクチンより通常は除去しにくいため、フィブリノーゲンが特 に重要である。従って、■因子製剤の精製法として現在公知の全ての方法は、製 剤中の■因子対全蛋白質含量の比を増大させるために少なくとも■因子からフィ ブリノーゲンを部分的に分離することを含んでいる。

血漿画分中に蛋白質であるフィブロネクチン及び特にフィブリノーゲンが存在す ると、これらの両分をねばねばした粘性のあるものにしがちなことは以前から認 められてきた。このことにより、特に濾過を使用するときには、これらの両分の 精製が難しくなる。この問題は、血漿画分濃度は失われるが、（例えば）バッフ ァ溶液で両分を希釈することによりある程度克服できる。これらの蛋白質につい てのもう一つの重大な問題点は、そこから単離した血漿画分又は血液製品を患者 に投与する前に、存在し得る血液由来のウィルスの全て、特にＢ型肝炎ウィルス 、非Ａ非Ｂ　（ＮＡＮＢ＞肝炎ウィルス及びＬＡＶ−ＨＴＬＶＩＩ［（ＡＩＤＳ ）ウィルスが不活化されていることを確保する必要性が多くなっていることにあ る。

従来、血液中のウィルスの不活性化は、血漿画分又はそれから製造した血液製品 を長時間加熱して行ってきた。例えば、凍結乾燥したＦ■のような凍結乾燥血液 製品を６０℃で２４時間加熱するとＢ型肝炎及びＡＩＤＳウィルスを不活化する には十分であることが臨床的に示されているが、この温度における７２時間の加 熱でＮＡＮＢ肝炎ウィルスの不活化を十分保証しえないことも示されている。し かしながら、中〜高温を長時間使用すると熱処理製品中に存在する全てのフィブ リノーゲン及びフィブロネクチンは変性しやすく、これらの変性した蛋白質は変 性前の蛋白質よりさらにより不溶性であることが発見されている。

もちろん静脈内投与用製剤中に不溶性の生成物が存在してはならず、熱処理後に これらを除去するとしてもこれらの不溶性生成物中にＦ■のような所望の血液製 品がかなりの最で失われる可能性がある。実際、凍結沈殿物からＦ■を精製する 場合にこの問題はとても重大であり、凍結沈殿物中に存在する全フィブリノーゲ ンの８０〜９０％を′うまく除去しえたとしてもＦ■の最終製剤中の蛋白質の不 溶性の問題は依然として重大であり、現在までの所、Ｆ■を顕著に損失させるこ となく凍結沈殿物から８０％以上、特に９０％以−ヒのフィブリノーゲンを除去 するのは非常に困難であった。血液製品の安全性を確保するために、フィブリノ ーゲン／フィブロネクチン変性度を更に増加させうるさらに厳しいウィルス不活 性化条件（例えば、７０〜８０℃で１２時間）を使用することを考慮する必要が あるので、この問題は更に重大である。

ＵＳ特許第４４０６８８６号明細書（Ｂｉｅｒら）は、亜鉛イオンの添加により 凍結沈殿ｌ！ｉ製物からフィブリノーゲンを沈殿させる■因子の１つの精製方法 を記載している。しかしながら、凍結沈殿物及びその他の血漿画分は通常、献血 直後に新鮮面に加えられ、濃縮物中にも含有されるクエン酸塩抗凝固剤を含んで いる。

Ｂｉｅｒらは、所与の沈殿を生じさせるのに必要な亜鉛イオンの濃度はクエン酸 塩イオン濃度に依存し、所与の分離を得るための亜鉛イオン濃度の最適域はかな り狭いと述べている。実際、異なる抗凝固剤中で血漿から凍結沈殿物を得ること が必要であることが多く、そして遠心分離により回収した凍結沈殿物は種々の量 の上清液を含んでいるため、血漿画分中のクエンｍ塩ビオン濃度は色々であり、 亜鉛添加の時点では通常は未知である。

このことにより、フィブリノーゲンの分離及び■因子の収率の両者について一定 の結果を得るのは非常に困難である。Ｂｉｅｒらの方法に伴うもう１つの問題は 、■因子の最適収率を得るために使用する条件が混在するフィブリノーゲン及び フィブロネクチンの溶８！２濃度をそのままにすることであり、これらはウィル スの不活化のための加熱のような別の方法の成功を限定する。

Ｂｉｅｒらの方法の問題点を少なくとも部分的に克服する、血漿画分からＦ■、 フィブリノーゲン及びフィブロネクチンを分離する別の方法は、ＥＰ−００２２ ０５２−Ａ２明ｉｌｌ書（Ａｍｒａｎｉ　）中に記載されている。この特許は血 漿からのＦ■、フィブロネクチン及びｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒｅｎｄ因子の高収 率の分離及び回収に特に関係している。この方法は、血漿１−当り０．２０１１ ＋９のムコ多糖の硫酸塩（例えばヘパリン）を血漿に加え、次に血漿を２〜４℃ に３時間冷却することによる血漿からのフィブリノーゲン及びフィブロネクチン の沈殿ステップを含んでいる。該特許明細書には、血漿という用語は希釈した塩 バッファ中に溶解した凍結沈殿物を包含するものであることが述べられている。

実際、同様の低温沈殿ステップでの緩衝した凍結沈殿物溶液の使用はＥＰ−０１ ２７６０３−Ａ（Ｅｉｂｌら）に記載されており、この中では、溶液１ｄ当り０ ．１■の硫酸化した多糖類（ＳＰＳ）を含有するバッファ液中に凍結沈殿物を溶 解し、次にこの溶液を４℃に維持して溶液からフィブリノーゲンを沈殿させる。

次に、遠心して沈殿を除去し、Ｆ■を大量に含む上清を得る。次に、沈殿、再構 成及び凍結乾燥により上清を濃縮し、製剤中に存在する全蛋白質１１Ｉｔｇ当り 少なくとも１．５国際単位（ｉｕ）の比活性を有する安定化したＦ■調製剤得る 。

多糖類の硫酸塩での沈殿による上記２つの方法の欠点は、このような沈殿がＦ■ 濃縮物の製造にある程度有用であることを示しているにもかかわらず、血漿画分 の多段階処理によるＦ■の損失はまだかなりなものであること及び／又は製造さ れた濃縮物がまだかなりの量の望ましくない蛋白質を含んでいることを添加する ことによりＦ■含有血漿画分の緩衝溶液からフィブリノーゲンとフィブロネクチ ンを沈殿させ、Ｆ■含有上清部から沈殿を除去するステップを含む、Ｆ■含有製 剤の改良された製法を提供することにより、これら欠点の１つ又は両者を少なく とも部分的に克服することである。より特定的には、ＳＰＳの添加によりｐＨ６ 〜８の凍結沈殿物の緩衝溶液からフィブリノーゲン及びフィブロネクチンを沈殿 させ、Ｆ■含有上清より沈殿を除去し、塩の存在下に蛋白質沈殿剤により上清か らＦ■を沈殿させ、Ｆ■沈殿を再溶解し、再溶解したＦ■を保存しうる形に変換 するステップからなる、高いＦ■比活性を有するＦ■含有製剤の改良された製法 を提供することが本発明の目的である。

本発明は、緩衝した血漿画分溶液１ｍ１当り少なくとも０．１５＃１９のＳＰＳ を添加し、一方では、フィブリノーゲンとフィブロネクチンの沈殿及び分離の間 、溶液の温度を１５℃以上に維持することによりこれらの目的を達成する。ＳＰ Ｓは、緩衝血漿画分溶液を調製するために使用した［ｊ溶液と共に、又は、好ま しくは緩衝した血漿画分溶液を調製した後で、血漿画分に添加しうる。

本発明に使用するＳＰＳは、好ましくは、ポリ硫酸ムコ多糖（ｍｕｃｏｐｏｌｙ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｐｏｌｙｓｕｌｐｈａｔｅ）、ポリ硫酸ベントサン（ｐ ｅｎｔｏｓａｎ　ｐｏｌｙｓｕｌｐｈａｔｅ）、硫１１ｖンドロイチン（ｃｈｏ ｎｄｒｏｉｔｉｎｓｕｌｐｈａｔｅ）　、又は硫酸デキストラン（ｄｅｘｔｒａ ｎ　５ｕｌｐｈａｔｅ）のようなヘパリノイドであり、ヘパリンが最も好ましい 。

ヘパリンはグルコサミン、グルクロン酸及び硫酸を含有する複合有ｍ酸である。

ヘパリンは血液凝固を遅らせることが知られており、内科及び外科で、通常は静 注又は皮下性で使用される。ヘパリンは通常は哺乳類の肺又は腸の粘膜から得ら れ、本発明では、好ましくは水溶性アルカリ金属塩、最も好ましくはナトリウム 塩の形で使用する。

現在までのところ、本発明のように中乃至高温の処理温度で高濃度のＳＰＳを用 いるとＦ■の回収率と所望ではない蛋白質の除去との両者を増強しうろことは認 められていなかった。本発明者は１５℃以上では、ＳＰＳの濃度が約０．１５Ｒ ｇ／　ｔｔｔｌ血漿画分溶液以上から最高濃度の約１．２１ｎｇ／ｍ血漿画分溶 液まで増加するにつれて、フィブロネクチン、特にフィブリノーゲンの沈殿は（ 所与の温度では）増加することを発見した。又、これらのような高いＳＰＳ濃度 では、Ｆ■精製法のＳＰＳ沈殿段階全体でのＦ■上清の収量は溶液の沈殿及び分 離温度が１０℃を超えて増加するにつれて一定に増加し、１５℃以上で非常に望 ましい収量が得られることも発見された。

フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの沈殿の程度は、所与の５ＰＳＩ度につ いては、温度が上昇するにつれて上清中のこれら蛋白質の溶解度が増加するため にいく分減少する。しかしながら本発明者は、驚くべきことに、血漿画分溶液中 のＳＰＳ濃度を０．１５■／ｄ以上、好ましくは０．３〜０．９■／ｄ、最も好 ましくは０．４４〜０．８８■／−に増加させることにより、高温でのフィブリ ノーゲン／フィブロネクチンの沈殿の減少のこの作用が補償されうるばかりでは なく、このような高いＳＰＳ？Ｉａ度では高いＦ■の上清収率を維持しうろこと を発見した。４０℃以上の温度では、フィブリノーゲンとフィブロネクチンの溶 解度はより御し難い問題となり、蛋白質の変性が発生しえ、従ってフィブリノー ゲン／フィブロネクチン沈殿物の沈殿及び分離の間の血漿画分の温度は好ましく は２０〜３５℃、最も好ましくは２５〜３０℃である。

血漿画分溶液中のｓｐｓ濃度の上限は一般に臨界的ではない。

しかしながら、血漿画分溶液１戒当り約１．２ｆｔｇ以上のＳＰＳではフィブリ ノーゲン／フィブロネクチンの沈殿が更に改善されることはほとんどなく、Ｆ■ の収量のわずかな損失が起りうろことを示す証拠がある。このために、５ＰＳＩ ＩＩ度の上限は３．０■／ｄが便利であり、好ましくは２．０Ｉｎ９／ｄである 。

沈殿の温度が上昇するにつれフィブリノーゲンとフィブロネクチンの沈殿効率は いくらか減少するにもかかわらず、驚くべきことに、血漿画分中に十分高い５ｐ ｓａ度（好ましくは０．３０η／Ｉｄ以上）を使用すると、フィブリノーゲンの 沈殿効率の損失は比較的わずかであることも発見された。血漿画分中にフィブリ ノーゲンは通常フィブロネクチンよりもずっと高い濃度で存在するので、所望で ない蛋白質の沈殿の全効率はある温度の限度（典型的には２０〜３５℃）内では 過度に損われることはない。

実際、従来のＦ■精製法ではフィブリノーゲンの除去がより難しいステップだっ たので、特にフィブリノーゲンを高い効率で除去しうろことが本発明の特別な利 点である。

所望ではない蛋白質が１５℃以上で効率よく除去しうるという発見の顕著な別の 利点は、沈殿させるための緩衝した血漿画分溶液を作るために必要な緩衝溶液の 量が一般にＳＰＳを用いる従来の低温（２〜８℃）沈殿法で必要なものより非常 に少ないことである。このことは主としてＦ■の溶解度が１５℃以上ではより大 きく、従ってより高いＦ■濃度でＦ■が溶液中に残存しうるという事実によるも のである。典型的には、血漿画分が凍結沈殿物である場合には、本発明方法に使 用する緩衝溶液の量は、凍結沈殿物を抽出する血漿の鏝初の８但の１％〜５％、 又は凍結沈殿物１部に対して０．５〜６部、好ましくは１〜３部でありうる。通 常は、その後の処理のために凍結沈殿物を溶解するには、凍結沈殿物は少なくと も０，５容量部の緩衝溶液で希釈すべきである。

比較的少量のＩｌｉ液しか必要でないことの利点は、次のＦ■の濃縮の程度、濃 縮装置の大きさ及びＦ■の濃縮に必要な試薬容量の全てを所与のＦ■の製造量に ついて減少しうろことである。さらに、緩衝溶液中のＳＰＳの同等な最終濃度に ついては緩衝溶液がより少量であればより少量の５ＰＳＬか必要としないであろ う。従って、本発明の最適ＳＰＳ濃度である０、４４〜０、８８ｒＩｒｇ／　ａ ｉ！は従来から使用されている濃度である０、１〜０．２　ｄ／ｄよりかなり高 いにもかかわらず、これらの高い最適濃度は有意に多い量のＳＰＳを使用するこ となく達成しうる。

本発明で使用する中程度のフィブリノーゲン／フィブロネクチン沈１ｍ度のもう １つの利点は、十分高い５ＰＳｉ！１度を使用すると、約５分間の撹拌の後にフ ィブリノーゲンの沈殿は最大になり、少なくとも２０分後までは更に有意な■因 子の沈殿は起らないことである。反応時間が短いことと、長時間の保持に対して 耐えられることとは大量生産にとっての利点である。

■因子のｐＨ安定性は比較的狭い範囲である。６．０〜８．０の中性ｐＨ域でも っとも安定であり、従って血漿画分のｐＨはＳＰＳ添加中及び添加後のいずれも この範囲にあるのが好ましい。適当なバッファ液を用いて血漿画分のＥ）Ｈを調 整する。最も好ましくは、両分のｐＨを６．０〜１．０の範囲に維持する。ｐＨ ７，０以上では、ＳＰＳ濃度が非常に高いときにしかフィブリノーゲン及びフィ ブロネクチンの有用な沈殿は得られない。ｐＨがｐＨ７からｐＨ６へ低くなると 、沈殿物中への■因子の損失は、フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの沈殿 の増加につれて増加する。従って、適当なバッファ溶液を使用してｐＨを容易に 操作し■因子の収量と必要とする純度とが両立する範囲を得ることができる。

ＳＰＳの沈殿が完了した後には、例えば遠心により直ちに上清から沈殿を除去す るのが好ましい。沈殿は捨ててもよく、さらに処理してフィブロネクチン（これ は臨床的興味が増加しつつある）及びフィブリノーゲンを抽出してもよい。

ＳＰＳ沈殿は血漿画分を精製するために単独で、又は、■因子の精製法の一部と して他の精製ステップと共に使用してもよい。

精製をＳＰＳ沈殿のみで行うときには、沈殿後に上清中に残っている残りのＳＰ Ｓは溶液中にそのまま残してもよく、あるいは例えばＡＩｌ　（ＯＨ）３ハイド Ｏゲル上への吸着による慣用のステップにより部分的にもしくは完全に除去して もよい。次に製剤を安定化し、凍結乾燥により更に濃縮し、次に使用前の適当な 濃度になるよう水溶液中で再構成してよい。

ＳＰＳ沈殿が■因子の精製法の一部分のみを構成するときには、何らかの他の精 製ステップの後にこの沈殿を行いうる。しかしながら、好ましくはＳＰＳ沈殿は 工程中できるだけ早いうちに実施する。何故ならば、フィブロネクチン及び特に フィブリノーゲンは他の精製ステップに影響を与えることが知られており、従っ てこれらの汚染物質は初期に有効に除去するのが望ましい。

商業的な■因子の精製法では、ＳＰＳ精製の次に通常は１つ以上の公知の濃縮ス テップを実施し、適宜、滅菌ステップを実施する。

滅菌は血液で媒介され得（例えば肝炎ウィルス）、凍結沈殿物のような血漿画分 中に保持される有害なウィルスを強力に不活化するので、滅菌は重要なステップ である。典型的な滅菌ステップは溶液中での６０℃、１０時間の熱処理からなる 。米国特許第４，２７９．３４４号（Ｓｃｈｗｉｎｎら）に記載のように、通常 は人聞の炭化水素例えばソルビトール及びアミノ酸例えばグリシンを添加してこ れ等の温度での■因子の安定化を助け、また滅菌を通しての■因子の収量は少量 のクエン酸塩イオン及びカルシウムイオンを添加することにより改善される。初 期のｓＰｓ沈殿のステップからの残留ＳＰＳの存在は典型的な滅菌ステップを通 しての■因子の収量に何ら有意な作用を示さないことが発見され°Ｃいる。加熱 後、■因子を回収し、限外濾過又はアミノ酸と中性の塩との混合物（例えば、グ リシンと塩化ナトリウム）で沈殿させた後に脱塩することにより濃縮しうる。

血液中に生存するウィルスを強力に不活化することを目的として「熱処理した」 ■因子の濃縮物を製造する他の２つの公知の方法が、ヘパリンでの沈殿よりフィ ブリノーゲンとフィブロ（ａ）　高濃度のアミノ酸／中性塩混合物（例えばグリ シンと塩化ナトリウム）を添加することによりヘパリン含有の上清部から■因子 を沈殿させ、゛沈殿を少量のバッファ溶液に再溶解する。（例えば）ゲル濾過に より脱塩した後、溶液を滅菌し、凍結乾燥し、■因子の活性又は溶解度をほとん ど又は全く失うことなく、そのＲｔｌｌ容器中で少なくとも７０℃の温度まで少 なくとも２４時間加熱する。

（ｂ）　（ａ）で再沈殿させ再溶解した■因子を、５ＣｈＷｉｎｎらの方法によ り高濃度のアミノ酸及び炭化水素（例えば、グリシンとソルビトール）を添加し た後に溶液中で滅菌する。次に、限外濾過又はアミノ酸／中性塩混合物による第 ２回目の沈殿とその後の脱塩により加熱した■因子を回収する。

ここで例示のためだけに、本発明による血漿画分からのフィブリノーゲン及びフ ィブロネクチンの沈殿法を記載する。

１一旦 実施例中では、次の材料を使用した。

１、ヘパリン 使用したヘパリンは、約１６８単位（Ｕ）／＃の比活性を有する米国薬局法（Ｕ ＳＰ）１級のヘパリンナトリウムの形として、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｇ＋１ｃａｌ 　Ｃｏ、、　Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ　ＵＳＡから市販されるブタ腸粘膜ヘパリンであ った。ヘパリンは３７５０　ｕ／ｄ　（２２ＩＩｔｇ／ｄ）のヘパリン濃度を有 する標準保存溶液とした。ヘパリンＵＳＰ以外の源も使用しうる。

一般手順 実施例では次の一般手順を用いた。

１、凍結沈殿物の製法 クエン酸ナトリウム抗凝固剤で凝固しないようにしだ全血を献血の数時間以内に 遠心し、分離した血漿をプラスチック容器内で一２５℃〜−４０℃で凍結させた 。生起の凍結沈殿の前に、０〜５℃の室内で数時間保存することにより、凍結し た血漿を一５℃〜−１５℃に軟化し、凍結した血漿を破壊することにより解凍過 程を容易にした。効果的に手動で又は機械的に撹拌しながら、被覆した容器内で 凍結血漿の一片を温め、所望の凍結沈殿物が液相の中に再溶解するのを防ぐため に懸濁液のどの部分も約＋３℃以上にならないようにした。理想的には、懸濁液 を＋１℃に維持した。約＋１℃〜＋３℃に維持した５ｈａｒｐｌｅｓ連続管遠心 で連続的に遠心することにより部分的に解凍した懸濁液から凍結沈殿物を分離し た。採取した血漿の２．４容量％に等しい、ｐＨ６゜８の２０ｍＭトリス−ＨＣ ｊバッファと共に２０℃〜２５℃で混合することにより凍結沈殿物を再溶解し、 溶液は直ちに使用するか又は後で使用するために一３０℃で凍結して保存した。

２、ヘパリンを用いるフィブリノーゲンとフィブロネクチンの沈殿法 凍結沈殿物溶液を約２５℃で解凍し、希釈せずに、又はいくつかの実施例では１ 容路までの２０１１１Ｍトリス（ｐＨ６，８）で希釈した。必要であれば、少量 の０．１Ｍ又は０．０５Ｍ　ＨＣｊ！と混合させて、解凍した凍結沈殿のｐＨを 所望のレベルに調整した。次に、混合物を撹拌しながら、ピペット又はシリンジ で急速な流れに保存したヘパリン溶液を加えた。十分混和した後、フィブリノー ゲンとフィブロネクチン沈殿物を含有する懸濁液を４０００ｘｇで１０分間遠心 し、上清部を取り除いた。約２５℃で全てのステップを実施した。

アッセイ 濃縮物中の種々の成分収量を測定するために、実施例に記載した方法を実施する 前及び後の両方に、血漿濃縮物について次のアッセイ方法を使用した。

１、■因子 通常は凍ったサンプルについて、時には新しいサンプルについて２段階の■因子 凝固剤（■Ｃ因子）アッセイを行った。アッセイ前にヘパリンを除去するために 、通常通りにヘパリン含有サンプルを３７℃で３分間、０．１容量のＡｉ）（０ １−１３）ＣＡ１１ハイドロゲル）に吸着させた。

２、全蛋白質及びフィブリノーゲン ビウレット法で全蛋白質をアッセイした。トロンビンで凝固しうる蛋白質の成分 としてフィブリノーゲンを測定した。

３、フィブロネクチン Ｌａｕｒｅｌｌ免疫電気泳動でフィブロネクチンをアッセイした。

４、ヘパリン ヘパリンは合成基質３　＝　２２２２の加水分解速度により測定したＸａ因子の 活性の阻害によりアッセイした（Ｔｅｉｎ　ＡＮ、　Ｌｉｅ、　Ｈ溶液のＤＨを ｐＨ５，８〜７．１に調整した後に、最終濃度が０．３１又は０．４４Ｒｇ／　 ｄ溶液となるように溶液にヘパリンを加えることにより、上記の一般手順を使用 して同じ凍結沈殿物溶液の希釈していないアリコートからフィブリノーゲンとフ ィブロネクチンを沈殿させた。ヘパリン添加の５分後に、得られた混合物を遠心 した。上清中の■：Ｃ因子、フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの収量とし てのヘパリン沈殿の結果を次の第１表に示す。

上清中の％収量 実施例　添加したヘパリン　上清のｐＨ■：Ｃフィブリノーゲン　フィブロネク チンク／Ｉｄ′因子 ｉ　０．４４　５．８　４２　１０　０２０．４４　６．４６５　７　１５ ３　０．４４　６．５７０８　１６ ４　０．４４　６．６　６８　１２　２０５　０．４４　６．７　６６　１５　 ２７６　０．３１　６．５　６９　１１　４２７　０．３１　７．１　７２　３ ０　７４これ等の実験及び他のｌ）Ｈ値及びヘパリン濃度でのこれらと同様の実 験から、ｐＨが減少するにつれ、■因子の損失の増加を犠牲として、フィブリノ ーゲン及びフィブロネクチンは増加する傾向にあり、最も好ましいのは約ｐ）ｌ 　６．５であったことが確認された。

実施例８〜１３ 上記の一般的手順を用いて、種々の血漿源から抽出した解凍した凍結沈殿物溶液 （このうちのいくらかは１容堡の０．０２Ｍ　トリス、ｐＨ６，８で希釈した） の５ｄ〜１５００ｄのサンプルについてフィブリノーゲン／フィブロネクチン沈 殿を行った。ＨＣｌ２溶液を加えてｐＨを６．５５±０．０３に調整した。次に 、ヘパリンを各サンプルに混和して、０．２２ＩＲｇ／ｍ１．〜０．８８ｍ９／ ｒｄの間の最終濃度としてフィブロネクチン及びフィブリノーゲン沈殿を行った 。ヘパリン添加の５分後に、得られた混合物を遠心した。■Ｃ因子、フィブリノ ーゲン及びフィブロネクチンの収量としてヘパリン沈殿の結果を下記第２表に示 す。

第２表（凍結沈殿物希釈の効果） 添加した勘口した実施した　上清中の％収量８０　１０．２２　１７　７８±７ １９±３５１±１２９　０　０．４４　９　７５±１１１０±３２９±６１０　 ０　０、ａａ　１　５６　４　１１１１　１　（Ｄ、２２　Ｇ　７５±６１±２ ２８±３１２　１　ｉｏ、４４　１　６８　６　３１１３　１　０．６７　１　 ６５　９　３５Ｉｎ〉１のときには、平均収積からの標準偏差を示す。

上記第２表は、ヘパリン濃度が上昇するにつれ、フィブリノーゲンとフィブロネ クチンの除去が増加することを示している。

トリスバッファで凍結沈殿物溶液を希釈すると（すなわち、蛋白質濃度を減少さ せると）、より低いヘパリン濃度で、■因子を良好な収率と共に、より効率よく フィブリノーゲンとフィブロネクチンを除去しうる。しかしながら、工業的な規 模では、凍結沈殿物溶液を希釈せず、約０，６６■／ｄのヘパリン濃度を用いる のが好ましく、０．４４■ヘパリン／＃＋２の希釈溶液中で得たと同様にフィブ リノーゲン及びフィブロネクチンから■因子を良好に分離し得る。

友１１旦二月 同じ血漿源から各々採取した凍結沈殿物溶液のｉｏ＃ｌｉ！のサンプルからフィ ブリノーゲン／フィブロネクチン沈殿を行うために上記の一般手順を用いた。Ｈ Ｃρ溶液を添加して、各サンプルのｐＨをｐＨ６，５５±０．０３に調整した。

次に、最終濃度が０．２２り／ｄ〜０．８８■／Ｉｄとなるように各サンプルヘ パリンを混和してフィブロネクチン及びフィブリノーゲン沈殿を実施した。５分 後に、得られた混合物を遠心した。■Ｃ因子、フィブリノーゲン及びフィブロネ クチンの収量としてのヘパリン沈殿の結果を下記第３表に示す。

上清中の％収量 実施例　添加したヘパリン　■：Ｃフィブリノーゲン　フィブロネクチンｍｙ／ 成　因子 １４　０．２２　６７　２９　３７ ＩＳ　Ｏ，３３６８１６２０ １６０，４４６９１１１６ １７０，６６７５６２０ １８０，８８６７３１３ 上記第３表は、ヘパリン濃度が上昇するにつれて、フィブリノーゲン及びフィブ ロネクチンの沈殿は増加する傾向にあるが、■因子の収量は比較的一定なことを 示している。

実施例１つ（比較例） ヘパリンの代りに凍結沈殿物中１．５　ＩＭの濃度の亜鉛イオンを用いて、解凍 した凍結沈殿物の９つの別なサンプルについて実施例６の方法を繰り返したとこ ろ、上清部中に■Ｃ因子７１±９％、フィブリノーゲン２４±５％及びフィブロ ネクチン５１±８％の収量（士標準偏差）を得た。これらの結果は、■Ｃ因子の 収量及び沈殿したフィブリノーゲン及びフィブロネクチン量について上記実施例 ２〜６の結果と一致しない。溶液中に残った高濃度のフィブリノーゲン及びフィ ブロネクチンは、例えば滅菌又は凍結乾燥状態での加熱のようなその後の処理に より得た濃縮物の特性、特に溶解度に対し重大な影響を与える。

実施例２０〜２２ ２５℃以外の温度を使用したことを除き、上記の一般的手順に従って、凍結沈殿 物溶液の１０ａｅサンプルをフィブリノーゲン／ライブ［コネクチン沈殿及び遠 心分離にかけた。各実施例において、添加したヘパリンの量は０．７３η／　ｍ Ｑ凍結沈殿物溶液であり、溶液のｐＨは６．５５±０．０５に維持した。上清中 の蛋白質収量としての結果を下記第４表に示す。

第４表（温度の作用） 上清中の％収量 実施例　凍結沈殿物溶液温度　■：Ｃフィブリノーゲン　フィブロネクチン２０ 　１０　２２　４．２　６．２ ２１　２０　７３　５．３　２１ ２２　３０　９１　７．７２１ 実施例２０は比較としての目的でのみ含まれている。

実施例２３（比較例） ５９４ｄの血漿から回収した４、９ｇの凍結沈殿物を、２０　ｍ１ｙｌＮａ３ク エン酸塩、０．１ｒｆｔｇ／ｄヘパリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ　１級）及び３ ０ｕ／ＩＲｆｌアプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ、　Ｂａｙｅｒ　Ａｅ）を含有 するｐＨ６，７のバッファ液６２ｄ中で２０℃で２０分間混合した。凍結沈殿物 を抽出した血漿Ｉ　Ｋｇ当りの得られた懸濁液の蛋白質含量は３５５ｉｕ　Ｆ■ ：　Ｃ、６０７ｑフイブリノーゲン及び３５５ｒｎｇフィブロネクチンであるこ とが判った。懸濁液中のＦ■：Ｃ含量は、特に、Ｆ■：Ｃの比活性０．３６ｉｕ ／Ｒｇ全蛋白質、０．５８ｉｕ／ＩＩｔ９フイブリノーゲン及び１．０Ｏｉｕ／ ■フイブロネクチンで１＃ｌ！！当り３．１ｉｕＦ■：Ｃであった。０．１Ｍ　 ＨＣｊ溶液を添加することにより得られた溶液をＩ）Ｈ６，３に調整し、次に＋ ４℃に冷却し、５分間この温度に保持し、フィブリノーゲン及びフィブロネクチ ンを沈殿させた。４℃で１０分間、ａｏｏｏｘｇで混合物を遠心して沈殿を除去 した。その後上清を取り眸いた。

上清部中のＦ■：０１フイブリノーゲン、フィブロネクチンの収量は沈殿させる 前の緩衝溶液中のこれらの蛋白質の濃度の各々６６％、２５．５％及び１９％と 測定され、上清中のＦ■：Ｃの比活性は０．６２ｉｕ／η全蛋白質、１．５０　 ｉｕ／■フィブリノーゲン、及び３．５０ｉｕ／Ｉｔｇフィブロネクチンと計算 された。

食塩水と２゜２Ｍのグリシン溶液とを用いる慣用の沈殿によりＦ■：Ｃを上清か ら回収した。沈殿物は前と同様に遠心で回収し、次にｐＨ６，９のトリス／クエ ン酸塩／塩化物バッファ液に再度溶解した。再溶解した沈殿は、Ｆ■：Ｃ沈殿前 の上清中に存在したものに対し、Ｆ■：Ｃは９９％、フィブリノーゲンは９１％ 、フィブロネクチンは２６％を保持したことが判った。再溶解沈殿物中のＦ■： Ｃの比活性は、１．３７ｉｕ／ｑ全蛋白質、１．６４ｉｕ／Ｒｇフィブリノーゲ ン及び１３．２ｉｕ／■フイブロネクヂンと計算され実施例２４ ３２３１の血漿から回収した２６６５　ｇの凍結沈殿物を、２０℃で２０分間撹 拌しながら７．７５４！！のｐＨ６，７の２０ｍＭトリスバッファ溶液液の蛋白 質台（５）は３８８ｉｕ　Ｆ■：　Ｃ、７９３Ｉｎｇフィブリノーゲン及び２６ ９＃ＦＪフイブロネクチンであることが判った。溶液中のＦ■：Ｃ含量は１１． ７ｉｕ／ｄでＦ■：Ｃの比活性がＱ、３０ｉｕ／Ｉｎｇ全蛋白質、０．４９ｉｕ ／ｑフイブリノーゲン及び１．４４ｉｕ／クフイブロネクチンであることが判っ た。２５℃で０．１Ｍ　ＨＣＩ！溶液を加えて、得られた緩衝溶液を′ｒＪＩ（ ６，５５に調整し、次に、緩衝溶液中のヘパリンナトリウムの濃、度が０．６６ ＩＩ６／　ｄ溶液となるまで溶液に２２ｑ／ｄの濃いヘパリンナトリウム（Ｓｉ ｇｍａ　１級）の保存液を加えた。

混合物を連続的に撹拌しながら速い流れの中にヘパリン溶液を加え、５分間良く 撹拌した後に、形成されたフィブリノーゲン／フィブロネクチン沈殿物を２５℃ に保ったまま４０００Ｘ（ｌで１０分間混合物を遠心することにより除去した。

その後上清部を取り除いた。

上清部中のＦ■：Ｃ、フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの収量は各々９２ ％、１．３％及び２７％と測定された。上清部中のＦ■：Ｃの比活性は、０．８ ７ｉｕ／Ｉ！ｇ全蛋白質、６．２１　ｉｕ／　ＩＦＪ　７　イブリノーゲン及び ４．９２ｉｕ／■フイブロネクチンと計算された。

沈殿により上清部からＥ■：Ｃを回収し、次に実施例２３に概説したものと同じ 手順で、より濃厚な形で再び溶解した。再溶解した沈殿は、Ｆ■：Ｃ沈殿を行う 前の上清中に存在したものに対し、Ｆ■：Ｃは８９％、フィブリノーゲンは８３ ％、フィブロネクチンは１７％保持していたことが判った。再溶解沈殿中のＦ■ ：Ｃ比活性は４．１１１６ｉｕ／ｑ全蛋白質、６．６８ｉｕ／ｑフイブリノーゲ ン及び２５．７ｉｕ／Ｒｇフィブロネクチンと計算された。

臨床使用に適したＦ■：Ｃ！！！Ｊ剤を調製するために′、上記の再溶ｗＩＦ■ ：Ｃ溶液をゲル濾過により脱塩し、！ＩＭ濾過により滅菌し、バイアル中に１０ １＋１１！のアリコートとして入れ、次に凍結乾燥させた。凍結乾燥製剤に存在 する血液由来のウィルスを不活性化するために、バイアルを８０℃のオーブンで １２時間加熱した。

各バイアルに１０Ｉｄの蒸留水を加えて再構成した後、製剤は完全に溶解し、５ 分間以内に使用の準備ができることが判った。平均して、８０℃に加熱する前に 存在したＦ■：Ｃ活性の９０％が再構成製剤中に存在することが判った。

国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＦｊ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＳＥＡＲＣＨＲＥＰＯ ＲＴ　ＯＮ

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．ＳＰＳの添加によりＦＶＩＩ含有血漿面分の緩衝溶液からフィブリノーゲン とフィブロネクチンを沈殿させ、ＦＶＩＩ含有上清から沈殿物を除去するステッ プを含むＦＶＩＩ含有製剤の製造方法であって、血漿画分に添加するＳＰＳの量 が緩衝溶液１ｍｌ当り少なくとも０．１５ｍｇであること及びフィブリノーゲン 及びフィブロネクチンの沈殿及び除去の間の緩衝溶液温度を１５℃以上に維持す ることを特徴とする方法。
2. ２．血漿画分に添加するＳＰＳの量が緩衝溶液１ｍｌ当り３．０ｍｇ以下である ことを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．血漿画分に添加するＳＰＳの量が緩衝溶液１ｍｌ当り０．３〜１．２ｍｇで あることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
4. ４．血漿面分に添加するＳＰＳの量が緩衝溶液１ｍｌ当り０．４４〜０．８８ｍ ｇであることを特徴とする請求の範囲３に記載の方法。
5. ５．フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの沈殿及び除去温度が４０℃以下に 維持されることを特徴とする請求の範囲１から４のいずれかに記載の方法。
6. ６．フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの沈殿及び除去温度が２０゜Ｃ〜３ ５゜Ｃに維持されることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。
7. ７．フイブリノーゲン及びフィブロネクチンの沈殿及び除去温度が２５℃〜３０ ゜Ｃに維持されることを特徴とする請求の範囲６に記載の方法。
8. ８．緩衝溶液のＰＨが６．０〜７．０であることを特徴とする請求の範囲１〜７ のいずれかに記載の方法。
9. ９．ＳＰＳが、ポリ硫酸ムコ多糖、ポリ硫酸ベントサン、硫酸コンドロイチン及 び硫酸デキストランから選択したへパリノイドであることを特徴とする請求の範 囲１〜８のいずれかに記載の方法。
10. １０．ＳＰＳがヘパリン又はその可溶性のアルカリ金属塩であることを特徴とす る請求の範囲９に記載の方法。
11. １１．ＳＰＳの添加によりＰＨ６〜８の凍結沈殿物の緩衝溶液からフィブリノー ゲン及びフィブロネクチンを沈殿させ、ＦＶＩＩ含有上清から沈殿を除去し、塩 の存在下に蛋白質沈殿剤により上清からＦＶＩＩを沈殿させ、ＦＶＩＩ沈殿物を 再溶解し、再溶解したＦＶＩＩを保存しうる形に変換させるステップからなる高 いＦＶＩＩ比活性を有するＦＶＩＩ含有製剤の製法であって、凍結沈殿物に添加 するＳＰＳ量が緩衝溶液１ｍｌ当り少なくとも０．１５ｍｇであること及びフィ ブリノーゲン及びフィブロネクチンの沈殿及び除去の間の緩衝溶液温度を１５゜ Ｃ以上に維持することを特徴とする方法。
12. １２．凍結沈殿物に添加するＳＰＳ量が緩衝溶液１ｍｌ当り３．０ｍｇ以下であ ることを特徴とする請求の範囲１１に記載の方法。
13. １３．凍結沈殿物に添加するＳＰＳ量が、緩衝溶液１ｍｌ当り０．３〜１．２ｍ ｇであることを特徴とする請求の範囲１２に記載の方法。
14. １４．凍結沈殿物に添加するＳＰＳ量が、緩衝溶液１ｍｌ当り０．４４〜０．８ ８ｍｇであることを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。
15. １５．フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの沈殿及び除去温度を４０゜Ｃ以 下に維持することを特徴とする請求の範囲１１から１４のいずれかに記載の方法 。
16. １６．フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの沈殿及び除去温度を２０゜Ｃ〜 ３５℃に維持することを特徴とする請求の範囲１５に記載の方法。
17. １７．フィブリノーゲン及びフィブロネクチンの沈殿及び除去温度を２５℃〜３ ０℃に維持することを特徴とする請求の範囲１６に記載の方法。
18. １８．緩衝溶液のｐＨが６．０〜７．０であることを特徴とする請求の範囲１１ から１７のいずれかに記載の方法。
19. １９．ＳＰＳが、ポリ硫酸ムコ多糖類、ポリ硫酸ベントサン、硫酸コンドロイチ ン及び硫酸デキストランから選択されたへバリノイドであることを特徴とする請 求の範囲１１から１８のいずれかに記載の方法。
20. ２０．ＳＰＳがヘパリン又はその可溶性のアルカリ金属塩であることを特徴とす る請求の範囲１９に記載の方法。
21. ２１．凍結沈殿物を抽出する血漿の１％〜５％に等しい容量の緩衝液と凍結沈殿 物を混合することにより凍結沈殿物の緩衝溶液を調製することを特徴とする請求 の範囲１１から２０のいずれかに記載の方法。
22. ２２．凍結沈殿物１部と緩衝液０．５〜６部を混合することとにより凍結沈殿物 の緩衝溶液を調製することを特徴とする請求の範囲１１から２０のいずれかに記 載の方法。
23. ２３．凍結沈殿物１部と緩衝液１〜３部を混合することにより凍結沈殿物の緩衝 溶液を調製することを特徴とする請求の範囲２２に記載の方法。