JPH06511018A - 血漿分画精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血漿分画精製法 発明の分野 本発明は、精製された因子Ｘ６、リン脂質、Ｃａ”、及び因子Ｖ。

を含む血漿分画（ｐｌａｓｍａ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）を使用して、精製された プロトロンビン（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）　（因子１］）からトロンビン（ｔ ｈｒｏｍｂｉｎ）を調製するために有用な方法であって、因子（［１、Ｖ　、及 びＸ、）のすへてか単一の精製手順から得られるような方法に関する。

発明の背景 血液凝固の開始は、２つの異なるが類似した、内因性の及び外因性凝固経路又は カスケードといわれる分子機構による。この内因性の凝固経路は、血液成分に加 えて組織因子を含んでいる。この２つのカスケードの反応段階のそれぞれにおい て、ブロテイナーセが、　。

不活性チモーゲンをその酵素的に活性な形態に変換している。そのカスケードの 最後の段階においては、内因性経路及び外因性経路の両方において同しであるが 、不活性のプロトロンビンがトロンビンに変換され、これは、次に、可溶性フィ ブリノーゲンの不溶性フィブリンへの変換を触媒する。

両カスケードにおけるチモーゲンの活性ブロティナーセへの変換は、補助因子の 非存在中においては非常に遅い。この補助因子は、それらの非存在中において観 察される速度の１０’から１０５倍までのチモーゲン活性化速度を刺激する。こ のカスケードにおいては、３種類の補助因子・（１）Ｃａ”イオン、（２）血小 板又は損傷組織の膜二重層から生した酸性リン脂質、及び（３）与えられたチモ ーゲンの活性化に特に要求される蛋白補因子、が働いている。約６９．０００〜 約８０．０００の分子量をもつプロトロンビンは、１本のポリペプチド鎖から成 る。血液凝固チモーゲンのすへての活性化と同様に、プロトロンビンの活性化は 、血小板又は損傷組織から生した陰性に帯電したリン脂質、例えば、ホスファチ ジルセリンにより提供される表面上で起こるこのような脂質は、細胞膜の脂質二 重層の、はとんともっばら細胞質側又は内側に在る。プロトロンビンは、その細 胞か破壊されそれらの内表面を晒さない場合には、その赤血球又は内皮細胞に癒 着しない。したかって、陰性に帯電したリン脂質を露出させる細胞破壊は、プロ ）・ロンヒンが上記のリン脂質に結合することができるようにする。これが、プ ロトロンビンの活性化における第一段階である。プロトロンビンの上記のリン脂 質への結合は、Ｃａ２“−依存性の過程である。

プロトロンビンの活性化は、Ｃａ”−依存性相互作用を介してリン脂質にも結合 する、因子Ｘ、により触媒される。しかしながら、プロトロンビンの活性化の最 大速度は、因子Ｖ、も上記のプロトロンビン−Ｘ　、　−Ｃａ”−リン脂質複合 体に結合する場合にのみ得られる。

因子Ｘは、約５９．０００〜約７０．０００の分子量をもつ糖蛋白であり、そし て２つのサブユニット、すなわち、約４０．０００の分子量をもつ１つのサブユ ニット及び約１９．０００の他のサブユニット、から成る。因子Ｘは、内因性経 路及び外因性経路の両方において、因子Ｘ、に活性化される。

３３０、０００の分子量をもつ因子■は、■、の活性化のために不可欠の１つの 固く結合したＣａ”を含む１つのポリペプチド鎖から成る糖蛋白である。因子■ １は、プロテイナーセではないが、プロトロンビン活性化のための補助蛋白とし て働き、これは、プロトロンビン活性化の速度を増加させるように働く。因子Ｖ それ自体は、トロンビンにより活性化され、それ故、トロンビン活性化反応にお いて、生したトロンビンか因子■を因子■、に活性化し、これは、次に、トロン ヒン合成速度を増加させる。

インビトロにおける研究は、Ｃａ”及びリン脂質が、因子Ｘ、単独による変換速 度に比へて約５０倍径、プロトロンビンのトロンヒンヘの因子Ｘ、による変換速 度を増加させることを示した。因子■、は、約３５０倍、Ｘ、による変換速度を 増加させるが、因子のすへてか一緒になれば、少なくとも約２０．０００倍の速 度に増加される。このように、Ｃａ”−リン脂質−Ｘ、−Ｖ、複合体は、２週間 に因子Ｘ、単独により作られるであろうものと同し量のトロンビンを１分間以内 に作りだす。

トロンビンは、フィブリノーゲンからフィブリン、すなわち、血塊を形成する不 溶性蛋白への変換における活性剤であるので、トロンビンは、創傷（ｗｏｕｎｄ ｓ）、出血潰瘍、外科手術、及び他のこのような損傷（ｉｎｊｕｒｉｅｓ）から の血液の損失の防止における用途をもつ。天然の血液凝固は、損傷部位から血液 の流れを効果的に停止させるま　・で数分間を必要とする。しかしながら、損傷 部位におけるトロンビンの使用は、即効性の凝固をもたらす。それ故、トロンビ ンの典型的な用途は、外科手術及び外傷（ｔｒａｕｍａ）後に存在する症状にお いて、好ましく、又は致死の多量の血液損失を防ぐための、潰瘍の治療における 経口用途において好ましい。また、眼の外科手術の間の硝子体腔へのトロンビン の注入は、焼灼術（ｃａｕｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）についての識別することが困 難である部位からの出血を防止することができる。

このような治療は、定例的な外科手術の間の眼内圧における上昇を原因とするそ の眼に対する損傷の危険を減少させる。

最近、ウシ・トロンビン調製物が、時事的用途のために入手可能である。しかし ながら、ウソ・トロンビン調製物は、治療されている患者内で、しばしは、不所 望の免疫応答を引き起こす。このような応答は、ヒト・トロンビン調製物の使用 により避けることができる。しかしなから、ヒト・トロンビン調製物は、高価で あり、したがって、それらの使用の必要性を減少させている。それ故、ヒト源か ら、プロトロンビンを精製し、そしてそれをトロンビンに活性化する経済効果の ある手段についての必要性が在る。

発明の要約 本発明は、因子Ｖ、及び因子Ｘ、を使用して因子１１を因子ＩＩ、に活性化する 方法であって、因子［１、■、及びＸ、がすへて単一の純粋でない蛋白画分から 得られるような方法について記載している。

この活性化方法は、因子１１を活性化バッファーに添加し、因子！［溶液を提供 する工程を含んで成る。この因子］Ｉを、純粋でない蛋白分画の水溶液を提供す ることにより調製す。この純粋でない蛋白画分中に含まれる因子ＩＩ、■及びＸ を、ＤＥＡＥリガントに結合させ、そして次に、そのＤＥＡＥリガントから回収 する。この回収した因子］］及びＸの蛋白画分を、塩化バリウムの添加により沈 殿させる。この塩化バリウム沈殿物を、溶解させ、ぞして因子Ｘと結合するが因 子（１には弱く結合するか場合によっては全く結合しないリガントにより結合さ れているクロマトグラフィー樹脂に、適用する。因子Ｉ］を、その因子Ｘ結合リ ガ：ノトに結合せずに又は弱く結合して残った両分から回収する。

因子Ｖを、上記の因子］１溶液に添加し、因子１１／因子Ｖ溶液を提供する。こ こで、この因子■を、上記の因子１［調製手順により純粋でない血漿画分から作 った塩化バリウム上澄液から回収する。因子Ｖを、因子＋＋、による因子］ｌ活 性化反応の間に、活性化する。この活性化反応（こおいては、因子＋１は、因子 ■、の非存在中で非常（二ゆつくりと活性化される。しかしながら、少量の因子 ＩＩ、が作られる。

これらの少量の因子Ｉ＋、を、次に入手し、因子■を因子■８に活性化すること かでき、そしていくつかの因子■、か、この精製工程の間に作られる。このよう に、因子Ｖ、を、次に入手し、上記の因子ＩＩ活性化反応において相互作用させ ることができる。これは、因子Ｉ１．合成の速度における増加をもたらす。それ 故、因子■のための別個の活性化段階は、必７ない。

因子Ｘ、を、上記の因子［１／因子■溶液に添加し、因子［１／因子■／因子Ｘ 、溶液を提供する。この因子Ｘ、を、上記の因子１１調製手順の因子Ｘ結合リガ ントから因子Ｘを回収することにより調製する。

リン脂質膜及びカルシウム・イオンを、この因子［１／因子■／因子Ｘ、溶液に 添加し、そして得られた混合物を、因子Ｉ］を因子Ｉ１．に活性化させるために インキュベートする。

図面の簡単な説明 本発明の特徴、態様、及び利点は、以降の詳細な説明、添付の請求の範囲及び、 本発明の方法の好ましい態様を示しているフロー・ダイアグラムである添付の図 面に関して考慮するとき、さらに十分に理解されるであろう。

詳細な説明 本発明の実施に従って提供される方法は、単一の純粋でない両分からの因子Ｉ］ 、■及びＸの分離に関する。本明細書中で使用するとき、”純粋でない蛋白画分 （ｉｍｐｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）＋は、因子１１、■及び Ｘに加えて１以上の蛋白を含むことを意味する。因子Ｘを次に活性化し、そして 活性化反応物であってカルシウム、リン脂質及び因子■２をも含むものに添加し 、その因子ＩＩのチモーゲンを活性な触媒作用のある因子［１，に活性化させる 。

因子Ｉ＋、■及びＸの精製 フロー・ダイアグラム中に説明する因子１１、■及びＸの精製は、米国食品及び 医薬品局により認可された手順に従って回収及びテストされたヒト血漿からのも のである。この血漿を、所望によりこの精製段階に先立って低温沈殿させること ができる。この血漿画分を、電気透析し、そのナトリウム濃度をその元の値から ８５と１０５ｍＭとの間まで減少させることができる。この透析された血漿を、 次に酢酸の添加によりはとんと中性のｐＨに調整する。

このｐＨ調整血漿中に含まれる因子ＩＩ　Ｖ　、　［Ｘ及びＸを、再生ＤＥＡＥ （ジエチル・アミノエチル）セルロース、ＤＥＡＥセファデックス、又は他の好 適なイオン−交換媒質、すなわち、バッファー、例えば、約６．８のｐＨにおけ る約０．０３Ｍリン酸ナトリウム及び約０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム（リン 酸／クエン酸バッファ−）により平衡としである因子［ｌ、■、ＩＸ及びＸに結 合する媒質の上に吸着させる。この　・ＤＥＡＥ樹脂及び低温沈殿血漿を、約３ ０分間混合し、そしてこのＤＥＡＥ樹脂を次に遠心分離により回収する。このＤ ＥＡＥ樹脂を、バッファー、例えば、リン酸／クエン酸バッファーで洗浄する。

この洗浄液を廃棄する。この洗浄したＤＥＡＥ樹脂を、バッファー、例えば、リ ン酸／クエン酸バッファー中で懸濁させる。得られた懸濁液を、次にカラムに濯 ぎ、そして溶出液を廃棄する。このＤＥＡＥ樹脂を、バッファー、例えば、リン 酸／クエン酸バッファーで洗浄し、そしてこの洗浄液を、また、廃棄する。因子 Ｉｔ、　Ｖ、］ＩＸびＸを、約６．８のｐＨにおける約０．０３Ｍリン酸ナトリ ウム及び約０．２　ｋｌ　ＮａＣ１を含む約０．０３八１のクエン酸すトリウム を含んて成るバッファーで溶出させることにより、このＤＥＡＥ樹脂を洗浄する ことにより、溶出させる。この溶出液を回収し、そして因子ｌｌ５Ｖ　、　ＩＸ 及びＸ含有画分を、プールし、モしてバルク溶液中に回収する。この回収された 画分の適切なテストを行い、そしてこのバルク溶液のｐＨがほとんと中性に調整 された後、この溶液を、無菌ハクティア−保持カートリッジ又は膜を通して濾過 し、それにより因子ＩＩ、Ｖ、ＩＸ及びＸのバルク溶液を作る。このバルク溶液 を、さらに処理するまで凍結させる。

さらなる処理のために、このバルク溶液を解凍し、そしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　 Ｃａｒｐ、　ｏｆ　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡにより提供された”＾ｌ１ｌｌｉｐ ｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ”濃縮器を使用してダイアフィルトレージョンを行い 、その溶出液を約１０ｇ蛋白／ｌまて濃縮することができる。１つの例示的な態 様においては、因子１１、Ｖ、ＩＸ及びＸのバルク溶液を、処理し、その溶液中 に含まれるウィルス汚染物のいずれをも不活性化させる。このウィルス不活性化 段階（溶媒−界面活性剤（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）処理又はＤ− Ｓ処理ともいわれる）を、このダイアフィルトレージョン・バルク溶液を約３（ ｖ／ｖ）％のＴｒｉ−（ｎ）ブチル・ホスフェート及び約１０％のポリソルベー ト８０を含んで成る水溶液と混合することにより行う。約０．０８〜０．１４ｋ ｇのＴｒｉ−（ｎ）ブチル・ホスフェート、ポリソルベート８０溶液を、バルク 溶液のｋｇ当たりに添加する。得られた溶液を、約２７°Ｃにおいて約６〜約８ 時間、混合する。処理された因子ｌｌ−１Ｖ−１ＩＸ−及びχ−含有溶液を、次 に本発明の処理に従ってさらに処理する。

バリウム／クエン酸塩沈殿による因子］ｌ、■及びＸの精製本発明の実施の１つ の例示的な態様においては、先に記載したように作られた、ウィルス不活性化因 子［［−、Ｖ−１［Ｘ−、及びＸ−含有溶液を、希釈バッファー（約７．３〜約 ７．５のｐＨにおける、０．０２Ｍのクエン酸ナトリウムにより、約２〜ｌＯ倍 希釈する。所望により、因子＋１−　、Ｖ−１ＩＸ−、及びＸ−含有溶液てあっ てウィルスを不活性化されているもの、又は先に記載した方法以外の方法により ウィルスを不活性化されているものを、使用することができる。

因子］］、ＩＸ、及びＸを沈殿させるのに十分な０．５〜２Ｍ塩化バリウム溶液 の１容量を、上記の希釈１１−　、　Ｖ−１ＩＸ−、及びＸ−含有溶液に添加す る。得られた塩化バリウム濃度は、約ｏ、１〜約０．２Ｍである。この沈殿物（ バリウム又はＢａ沈殿物ともいわれる）を、回収し、そして０．２〜０．６　Ｍ 　ＥＤＴＡ（（エチレンージニトリロ）テトラ酢酸）に溶液中に溶解させ、そし て先に記載したように、バリウム及びＥＤＴＡを除去するために、低−ナトリウ ム・バッファー（約６．０と約９．０との間のｐｌに緩衝化した溶液中の０〜約 ０．２　Ｍ　ＮａＣ１）に対し、ダイアフィルトレージョンを行い、そしてさら なる処理のための好ましい低ナトリウム濃度を得る。このダイアフィルトレージ ョンに好適なバッファーは、約６．６〜約７のｐＨにおける約０．０２λ１のク エン酸ナトリウム、及び約１０５　Ｍ　ＮａＣ１を含んて成る。

因子■を含む上澄液を、先に記載したように、約０．０６　Ｍ　Ｔｒｉｓ、　・ ｐＨ７，２，０，０９！、Ｉ　ＮａＣｌ　、及び０．０１　Ｍ　ＣａＣｌ　２を 含んて成るバッファーに対して、別個にダイアフィルトレージョンを行う。因子 Ｖ含有溶液を、使用のために必要とされるまで凍結させる。

塩化バリウム沈殿が、約１．２〜約３までの因子１１、ＩＸ及びＸの比活性にお ける増加を生しさせた。

このダイアフィルトレージョンされた、溶解したバリウム沈殿物を、硫酸デキス トラン（ＤＳＳ）と結合したシリカ樹脂を含むカラムに適用する。

硫酸デキストラン・シリカ樹脂の調製 本発明の原理の実施において有用なりＳＳ樹脂の調製の１つの例示的な態様にお いては、登録商標ＣＮＢＲ５Ｐ５００の下、５ＥＲＶＡ　Ｆｉｎｅ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、　ｏｆ　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　ＮＹにより供給された 、活性化されたシリカ樹脂を、米国特許第４．７２５．６７３号中に記載される ように使用し、そして本明細書中に本引用により取り込んだ。簡単に言えば、そ のＣＮＢｒ−活性化形態において供給される、Ｉｋｇの樹脂を、２ｋｇの蒸留水 により穏やかにスラリー化し、そして次に、ブフナー漏斗中の湿気溜（ｄａｍｐ ｎｅｓｓ）に吸引する。このスラリー／洗浄段階を、２回以上繰り返した。硫酸 デキストラン溶液を、バッファー溶液、好ましくは約０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ ３（約８．３のｐＨニおける）中ニ１０〜２ｏｏグラムの硫酸デキストランを溶 解させることにより調製し、そしてその洗浄したシリカ樹脂と硫酸デキストラン 溶液を合わせ、そしてｌから約２４時間までの間混合し、その硫酸デキストラン ・リガントをその活性化シリカ樹脂に結合させる。このリガント結合樹脂を、次 に、プフナー漏斗内でｌ容量以上の蒸留水で３回洗浄し、そして湿気溜から吸引 した。このリガント結合樹脂を、次にさらに、ブフナー漏斗を使用して、約６〜 ８のｐＨにおいて、約２．０〜約４．ＯＭ　ＮａＣｌを含　・む溶液で、数回洗 浄し、そして湿気溜に吸引した。この樹脂を、さらに、１容量以上の約６〜８の ｐＨにおける約０〜約０．２　Ｍ　ＮａＣｌを含むバッファー溶液による同様の 洗浄及び吸引により洗浄した。

この洗浄したリガンド結合樹脂を、次に、数容量の血清アルブミンと、■から１ ０時間までの間、混合することにより処理し、”遊離（ｔｒｅｅ）−の結合基の いずれをもブロックした。このブロックされたリガント結合樹脂を、ブフナー漏 斗内で蒸留水により数回洗浄し、過剰のブロック剤を除去した。このブロックさ れた、リガント結合樹脂を、次に約６〜８のｐＨにおいて、約２．０〜約４．Ｏ Ｍ　ＮａＣｌを含む溶液の１容量以上で、数回洗浄した。蒸留水での最後の洗浄 を提供し、そしてその樹脂を湿気溜に吸引した。

リガンド結合樹脂のだめの最後の調製段階は、数樹脂容量の“アルカトン（ａｌ ｃａｔｏｎｅ）”（５０容量％のアセトン、３５容量％のエタノール、及び１５ 容量％の水の溶液）による反復洗浄を含んでぃた。このスラリーを、その使用に 先立って２°Ｃ〜８℃において保管した。この樹脂を、上記のアルカトンからデ カンテーションし、そして約６．８のｐＨにおいて蒸留水で洗浄し、カラムに詰 め、そして使用に先立ち、約６〜約９のｐＨにおいて、約０と約０．０５Ｍ　と の間のＮａＣｌにより平衡化した。このクロマトグラフィー樹脂を平衡化するの に好適なバッファーは、約６．６〜約７のｐＨにおいて、約０．０２Ｍのクエン 酸ナトリウム、及び約０．０５Ｍ　ＮａＣ１を含んで成る。

因子］１及び因子Ｘの分離 普通には、２と５リツターとの間の硫酸デキストラン・シリカ樹脂が、処理され るウィルス不活性化因子ＩＬ　［Ｘ及びＸ溶液のそれぞれの５ｋｇについて必要 である。この硫酸デキストラン・シリカ樹脂が、好ましい。なせなら、このシリ カ樹脂は、カラム・クロマドグ　・ラフイー手順において使用されるとき容易に 圧縮されず、そしてそれ故上記のような段階を通して所望の流速を維持するから である。

しかしながら、他の樹脂、例えば、セファロースを、使用することもてきるであ ろう。また、硫酸デキストランを特に記載したが、他のりガント、例えば、ヘパ リンを、使用することもできるであろう。

ダイアフィルトレージョンされたバリウム沈殿物を含む溶液を、先に記載したよ うに、調製する。この溶液を、次に、その溶液に含まれる因子［Ｘ及びＸかその 樹脂上に吸収されるように、そのカラム中の硫酸デキストラン・シリカ樹脂を通 して、ポンプて送った。因子］１は、吸着されずに残ったか又は緩やかに吸着さ れ、そしてブレークスルー（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）溶出液中に、又はその 後の溶出段階の初期において、そのカラムから洗浄される。この吸着段階の終了 後、因子ＩＸ−、Ｘ−吸着樹脂を、そのカラムの樹脂容量の約１〜３倍の洗浄バ ッファー容量で洗浄する。好適な洗浄バッファーは、約６．６〜約７のｐＨにお いて、約０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム、及び約０．０５ＭのＮａＣ１を含ん で成る。背景を超えるＡ２．。をもっ、溶出液及び洗浄溶液（すなわち、上記の 平衡化工程の間にそのカラムから溶出されたバッファーについて得られたＡ２ｇ 。の読み）を、この両方が因子］Ｉを含むか、プールする。この因子ＩＩ含有画 分を、直ちにさらに処理するか又はその後の処理のために凍結させそして保管す るかのいずれかとする。

因子（Ｘ及びＸを、約６．６〜約７のｐＨにおいて、約０．０２Ｍのクエン酸ナ トリウムを含んで成るバッファー溶液中の約０．０５Ｍから約０．６Ｍ　ＮａＣ ｌまでの線型塩（ＮａＣ１）グラジェントによりその樹脂がら溶出する。このＮ ａＣ１濃度が約０．２＋１１のとき、因子Ｘは、そのカラムから溶出する。因子 Ｘ含有画分をプールし、そして直ちにさらに処理するが又はその後の処理のため に凍結させそして保管するかのいずれがと　・する。所望により、因子Ｘ含有画 分を、ＤＯ３樹脂に再適用し、そして先に記載したように、さらなる精製のため に溶出させることができる。この因子Ｘ溶出液を、さらなる処理又は凍結に先立 って濾過することができる。数回の操作からの別々にプールされた因子＋１、［ Ｘ及びＸ画分か集積したとき、この画分をそれぞれ、さらに処理する。

上記の塩グラジェントが、約０．２５Ｍ〜約０．４＆ｌの濃度に達したとき、因 子＋ＸとＸとの両方か溶出する。約０．１１を超える濃度においては、因子ＩＸ のみが、溶出する。因子ＩＸ含を画分をプールし、そして直ちにさらに処理する か又はその後の処理のために凍結させそして保管するかのいずれかとする。

さらなる処理のために、因子Ｘ含有画分を、（凍結している場合に）解凍し、そ して合わせ、そしてそのｐＨを、はぼ中性に調整する。

この合わせたプールを、次に活性化バッファー、例えば、約７．４のｐＨにおけ る、約０．０２　Ｍ　ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラ ンンーエタンスルホン酸）、及び０．１５　Ｍ　ＮａＣ１に対して、ダイアフィ ルトレージョンを行い、因子Ｘ活性及びナトリウム濃度の正確な標的パラメータ ーを得る。これは、好ましくは、０．０２九Ｉ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７゜４及び ０．１５　Ｍ　ＮａＣ１である。

因子Ｘの無菌バルクを、因子Ｘ活性についてサンプリングする。

この因子Ｘを使用のための要求があるまで凍結させることかできる。

さらなる処理のために、因子ＩＩ含有画分を、（凍結している場合に）解凍し、 そして合わせ、そしてそのｐＨを、はぼ中性に調整する。

この合わせたプールを、因子ＩＩを濃縮するために、次に限外濾過し、因子１［ 活性及びナトリウム濃度の正確な標的パラメーターを得る。

このｐＨを、チェックし、そして必要により再調整する。所望にいより、因子Ｉ Ｉの濃縮の他の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、そ　。

の後のダイアフィルトレージョン、又は当業者に知られた他の好適な手段を、使 用することができる。

因子Ｉ＋を使用のだめの要求があるまで凍結させ又は凍結乾燥させることができ る。

因子Ｘの因子Ｘ、への活性化 血液中では、因子Ｘは、内因性カスケードにおいて、因子Ｖｌｌｌ。

、カルシウム・イオン及びリン脂質の存在中で因子ＩＸ、により、そして外因性 経路においては、因子Ｉ１１　、リン脂質、及びカルシウム・イオンの存在中て 因子Ｖｌｌ　、により、活性化される。本発明における、因子Ｘの活性化を、こ れらの血液因子の働きにより達成することができる。あるいは、他の蛋白分解酵 素、例えば、ラッセルクサリヘビ蛇毒（Ｒｕｓｓｅｌｌ’ｓ　ｖｉｐｅｒ　ｖｅ ｎｏｍ）を、使用することができる。

好ましくは、先に記載した手順により精製された因子Ｘを、う。

セルクサリヘビ（Ｖｉｐｅｒａ　ｒｕｓｓｅｌｌｉ）蛇毒がら得られた蛇毒の蛋 白分解酵素とのインキュベーションにより、その活性な触媒作用のある形態に活 性化する。

約２ｇの因子Ｘを、０．５〜１０ｍｇ／ｍｌのラッセルクサリヘビ蛇毒及び０． ００５　Ｍ　ＣａＣ１ｔと共に、３７°Ｃにおいて３０分間インキュベートし、 因子Ｘを因子Ｘ、に変換する。この活性化の終点において、この蛇毒蛋白分解酵 素を、ベンズアミジン−セファ０−ス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｏｆ　Ｕｐｐｓａ ｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎにより提供される）上で、カラム・クロマトグラフィーに より、除去する。このベンズアミジン−セファロースを、活性化バッファー、例 えば、０．０２　Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，４、及び０．１５＾Ｉ　ＮａＣ１ により平衡化する。この活性化因子Ｘを、適用し、そしてこのベンズアミジン− セファ０−スに結合させる。因子Ｘ、を、活性化バ　。

ソファ−中に約０．００５Ｍのベンズアミジンを含むクロマトグラフィー媒質か ら洗浄する。溶出した因子Ｘ、を、回収し、そして約０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　Ｈ ＣＩ　、ｐＨ５，５、及び０．１５　ｉｔ　ＮａＣｌに対してダイアフィルトレ ージョンし、そして０．１（ｗｔ／ｗｔ）％アルブミン及びＩ（Ｗｔ／Ｗｔ）％ ポリエチレン・グリコール又はグリセロールの添加により安定させることかでき る。

因子１１の因子Ｉ＋、への活性化 因子［ｌの因子１１．への活性化を、リン脂質膜及びカルシウムの存在中におけ る因子Ｘ、及び因子■、の両方の働きにより達成する。

リン脂質膜を、個々のリン脂質から合成し、又はリン脂質／脂肪エマルジョン、 例えば、商標５ＯＹＣＡＬ及びＦＬＵＯ３ＯＬの下、Ａｌｐｈａ　Ｔｈｅｒａｐ ｅｕｔｉｃ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｓ、　ＣＡに より販売されるものにより、提供することができる。リン脂質膜を、音波処理に より、個々のリン脂質、例えば、ホスファチジルセリン及びホスファチジルコリ ンから合成することかできる。

精製された因子■を、先に記載したように得て、又は、あるいは、純粋でなく且 つ未分画の血漿を使用することができる。因子■は、因子Ｉ１．による因子［１ 活性化手順の間に、活性化される。活性化反応においては、因子１１は、因子Ｖ 、の非存在中において非常にゆっくりと活性化される。しかしながら、少量の因 子Ｉｆ、が作られる。

これらの少量の因子Ｉ１．は、因子■を因子■、に活性化するために使用される ことができ、そしていくらかのＶ、も、その精製工程の間に作られる。したがっ て、この生じた因子Ｖ、は、次に、因子１１活性化反応において相互作用させる ために使用されることができ１、これが、因子Ｉ１．合成速度における増加をも たらす。それ故、因子Ｖのための別個の活性化段階は全く必要ない。

因子ＩＩを活性化するために、先に述へたように得られた因子Ｉ＋を、約７．３ のｐＨにおける、約０．０６ｋｌのＴｒｉｓバッファー中で、約２〜約２０Ａ　 ２８０単位に希釈し、約０．０９　Ｍ　ＮａＣｌ　、約０．１　μｇ／ｍｌの因 子Ｘ１画分、約３０〜約２００μｇの因子ｖ画分、約５〜約５０ｎモル／ｍｌの リン脂質、約２〜２０ｍＭ　ＣａＣｌ　２　（最終濃度）、約０．３％Ｔｒｉ− （ｎ）ブチル・リン酸塩、及び約＋（ｗｔ／ｗＤ％のポリソルベート８０（最終 濃度）を添加する。この混合液を、約２４°Ｃ−約３０°Ｃにおいて約５〜約６ 時間の間インキュベートする。インキュベーションの終点において、この混合液 のｐＨを、約６．５に調整し、そしてその溶液を、約５（ｗｔ／ｗｔ）％のＰＥ Ｇ（最終濃度）の添加及び遠心分離により清澄化することかできる。

因子［１，を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｏｆ　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎに より供給されたスルファプロピル−セファデックス上のクロマトグラフィー、又 は他の好適なりロマトグラフィー樹脂により、その上澄液から回収する。

このクロマトグラフィー媒質を、バッファー、例えば、約６．５のｐＨにおける 約０．０１Ｍクエン酸ナトリウムにより平衡化する。このクロマトグラフィー媒 質に因子Ｉ１．含有含有物を適用した後に、このクロマトグラフィー媒質を、約 ６．５のｐｔ＋における約０．０１Ｍクエン酸ナトリウム又は他の好適なバッフ ァーで洗浄する。この因子Ｉ１．は、バッファー、例えば、約６．７のｐＨにお ける約０．１Ｍクエン酸ナトリウムにより、このクロマトグラフィー媒質から溶 出する。この因子Ｉ１．を、濾過し、そしてダイアフィルトレージョンを行い、 その組成を、約５〜１ｏｎｔｌヒスチジン、ｐＨ６，７、約０．１〜０．２％Ｃ ａイオン、そして約０．１〜０．２Ｍ　ＮａＣ１に調整する。この溶液を、次に 、前もって滅菌した）＜クチリア保持カートリッジ又は膜フィルターを使用して 滅菌濾過し、そして凍結乾燥させた。

因子＋１．　Ｖ　、　ＩＸ及びＸの精製のための本発明の実施の１つの態様にお いては、低温沈殿させた血漿中に含まれる因子Ｉ］、Ｖ、ｔＸ及びＸを、前もっ て６．８のｐＨにおける０、０３Ｍリン酸ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナ トリウムにより平衡化されているＤＥＡＥセルロース上に吸着させた。二のＤＥ ＡＥセルロース及び血漿を、約３０分間物合し、そして遠心分離により回収した ＤＥＡＥセルロースを、６．８のｐＨにおける０、０３ＡＩ　リン酸ナトリウム 及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウムで洗浄した。

この洗浄液を廃棄した。

この洗浄されたＤＥＡＥセルロースを、６．８のｐＨにおける０、０３Ｍリン酸 す１−リウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム中に懸濁させ、そしてカラム中 に濯いだ。二の溶出液を廃棄した。このＤＥＡＥセルロースを、６．８のｐＨに おける０、０３Ｍリン酸ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウムで洗浄し 、そしてこの洗浄液も廃棄した。因子１１、ｖ、ｒｘ及びＸを、６，８のｐｌに おける０、０３Ｍリン酸ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム及び０． ２　Ｍ　ＮａＣ１でＤＥＡＥセルロースを洗浄する二とにより溶出させた。この 溶出液を回収し、そして因子［［−、Ｖ−１ＩＸ−及びＸ−含有画分をプールし 、モしてバルク溶液中に回収した。この溶液を無菌バクテリア保持カートリッジ を通して濾過し、そして凍結乾燥させた。この凍結乾燥粉末を、ヘプタン中への 懸濁及び６０°Ｃにおける２０時間の加熱によりウィルス不活性とした。ヘプタ ンを、乾燥により除去した。

！’］２．０４ｋｇの乾燥粉末を、約６４．５ｋｇのインジェクションのための 冷水（ＣＷＦＩ）で再構築した。この再構築粉末を、２６６、６ｋｇの０．０２ １１１クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，４、及び４°Ｃにおける０、２５　ｋｌ　 ＮａＣ１で希釈し、そして２°Ｃ〜４°Ｃにおいて２０分間間物した。

約５３．４ｋｇの１．０＾１　塩化バリウム溶液（４’Ｃ）を、２時間の経過時 間にわたり添加し、そしてその混合物を、さらに１時間攪拌した。二の混合物を 、塩化バリウムの添加の間及び混合の間にＯ″Ｃと４°Ｃとの間に保った。混合 後、この溶液を、５ｈａｒｐｌｅＳ遠心分離機内で、１分間当たり１　リッター 当たり０．２と０．６との間における遠心分離機を通しての流速を保ちなから、 遠心分離した。約１０ｋｇの塩化バリウム沈殿物を、このように回収した。因子 ■を含む、上澄液を回収した。

この因子■含有上澄液を、ＭｉＨｉｐｏｒｅ　ＴＰカートリノン・フィルターを 通して祷過し、粒子のいずれをも除去した。この溶液を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　 Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ　濃縮器を通過させ、そしてその元の容量のｌ／３０と１７５ ０との間までａ縮した。この濃縮溶液を、次に、０．０６　Ｍ　Ｔｒｉｓ、０． ０９　Ｍ　ＮａＣＬ　、　ｐＨ７，２（−ＴＢＳ”溶液）で５倍に希釈した。二 の希釈の間、この物質を、そのＴＢＳ希釈前のその容量まで再濃縮した。この濃 縮及びＴＢＳ希釈段階を、３回以上繰り返した。因子■溶液を、最後に１回濃縮 し、次に、ＴＢＳによりその元の容量のｌ／１０〜ｌ／３０まで希釈した。この 点において、この溶液の導電率は、ＴＢＳ溶液のものとほぼ同してあった。

塩化バリウム沈殿物に、２０°Ｃ〜２５°Ｃにおける、約６６、７ｋｇの０．４ ％ＩεＤＴＡ溶液を添加し１、その沈殿物を溶解させ、そしてその沈殿物を。

Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＴＰカートリッジ・フィルターを通して濾過し、粒子を除 去した。濾過後、この溶液を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎｌｌ縮器 を通過させ、そしてその元の容量の１１５と１７１Ｏとの間まで濃縮した。この 濃縮溶液を、次に、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム及び０．０５　Ｍ　ＮａＣ１ により、元の容量まで希釈した。この濃縮及び希釈段階を、６回以上繰り返した 。この点において、この溶液の導電率は、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム及び０ ５０５　Ｍ　ＮａＣ１溶液のものとほぼ同じであった。最後の希釈後、このダイ アフィルトレージョン物質の重量は７Ｇ。４ｋｇであった。この再溶解沈殿物は 、因子Ｉｔ、ＩＸ、及びＸを含んでいた。

因子Ｉｆ　ＩＸ、及びＸを含む、ダイアフィルトレージョン物質の半分（３８， ６ｋｇ）を、約１７０ｔｎｌ／分の流速において、１８ｃｍ　ｙ、　９４　ｃｍ 　Ｍｏｄｕｌｉｎｅクロマトグラフィー・カラムであって硫酸デキストラン・シ リカ樹脂（ＤＳＳ）を含み洗浄バッファー（０，０２ｋｌクエン酸ナトリウム及 び０．０５　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ６，８）により平衡化されているものに、適用 した。

因子］Ｉを含む溶出液を、回収した。最終的に、４２５ｋｇの洗浄バッファーが このカラムを通過した。

約２５リツター（洗浄のｌカラム容量）の最初の洗浄液を、上記の因子Ｉ［の溶 出液と合わせた。この因子ＩＩのプールを、＆Ｉｉ　］　１ｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ ！１ｃｏｎａ縮器を使用するダイアフィルトレージョンにより濃縮した。

ａ縮径、この因子Ｉ＋溶出液を、（滅菌）０．２　ミクロン・フィルターを通し て濾過し、その後凍結させた。

カラムを先に記載したように洗浄した直後に、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、 ｐｉ（６，８中の０．０５Ｍ　ＮａＣ１から０．６Ｍ　ＮａＣ１まての、１５０ 　リッターの線型塩グラジェントを、６５０ｍ１／分の流速において、そのカラ ムに適用した。そのカラム溶出液の３．２５リツターの部分を、グラジェントの 間に回収し、そしてそれぞれの第三画分を、その因子ＩＸ及びＸの活性を測定す るために検定した。このグラジェントの終了後、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム 、ｐＨ６，８中の０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む追加の７５リツターの溶液を。この カラムに適用し、そしてこの溶出液の３．２５リツターの部分を回収し、そして 因子］Ｘ及びＸの活性について検定した。比較的高い因子Ｘ活性を含むが低い因 子］Ｘ活性を含む部分を、プールし、因子Ｘ溶出液プールを作った。二の因子Ｘ 溶出液プールを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ濃縮器を使用するダイ アフィルトレージョンにより濃縮した。濃縮後、この因子Ｘ溶出液を、（滅菌） ０．２　ミクロン・フィルターを通して濾過し、その後凍結させた。

因子１１−　、ＩＸ−、Ｘ−含有出発濃縮物からの物質及び上記の濃縮因子Ｉ］ ブールを、因子１１活性及び蛋白含量について検定した。因子］［−１■−１Ｉ Ｘ−及びＸ−含有濃縮物及び上記の濃縮因子Ｘ部分のプールを、因子Ｘ活性及び 蛋白含量について検定した。これらの検定の結果を、表１中に示す。

全単位　収率２　比活性 血漿画分　１．４　Ｘ　１０＠本　−４，７９ＤＳＳ　ａ度’　８．９１Ｘ　１ ０’　６３．６％　５．３８因子Ｘ 血漿画分　６．３　ｘ　１０’　本−２，２ＤＳＳ　ａ度　６．６７ｘ　１０’ 　１０．６％　２０．５因子　Ｖネ本 血漿画分　ＮＤ　Ｏ，０１７ Ｂａ　上澄液　ＮＤ　４６％　０．０２７ネ４５の別個の調製物から得られた、 平均因子１［／因子ＩＸ比及び平均因子Ｘ／因子ＩＸ比からの推定値。

本本　他の方法を使用した別の実験室の実験に基づく因子■の結果。

例Ｉ中に記載した調製からは全くデータを得ることができなかった。

ＮＤ　測定せず。

１　硫酸デキストラン・クロマトグラフィ一段階からの濃縮溶出液。

２　％収率は、出発物質における単位数と比較した上記の段階において回収され た単位数に１００を乗じたもの。

因子【（の純度（比活性）は、硫酸デキストラン・クロマトグラフイーにより１ ２％増加した。因子Ｖの純度は、バリウム沈殿により６０％増加した。因子Ｘの 純度は、硫酸デキストラン・クロマトグラフィーにより１０倍増加した。

例１の手順に従って調製した約４６０ｍｇの因子Ｘを、１〜２ｍｇのラソセルク サリ蛇毒及び５ｍｇの（ａｃｌｔと共に全容量１．３００ｍｇ中で３７°Ｃにお いて３０分間、インキュベートし、因子Ｘを因子Ｘ、に変換させた。この活性化 の終点において、この蛇毒を、ベンズアミジン−セファ０−ス上のカラム・クロ マトグラフィーにより除去した。このベンズアミジン−セファ０−スを、０．０ ２乳！　ＨＥＰＥＳ　、　ｐＨ７，４，０，１５ＭＮａＣｌにより平衡とした。

この活性化された因子Ｘを、上記のベンズアミジン−セファ０−スに適用し、そ して結合させた。非結合の物質を、０．０２Ｍ　ＨＥＰＥＳ　、　ｐＨ７，４， ０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，００５Ｍベンズアミジンにより上記のクロマトグラ フィー媒質から溶出させた。この溶出した因子Ｘ、を、回収し、０．０２Ｍ　Ｔ ｒｉｓ、　ｐＨｓ、ｓ、０．１５　Ｍ　ＮａＣ１に対して透析し、そして０．１ （ｗｔ／ｗｔ）％アルブミン及び１．０（ｗｔ／ｗｔ）％ポリエチレン・グリコ ールの添加により安定化させた。

Ｌ記の活性化及び精製は、約１．２０Ｑ単位／＋ｎｇの比活性をもつ因子Ｘ、を もたらした。

例３ ７５ｍｇのホスファチジルセリンと２２５ｍｇのホスファチジルコリンとを混合 し、そして３０〜４５分間、４°Ｃにおいて音波処理し、合成リン脂質膜を作っ た。

例１の手順に従って調製した２００ｍｇの因子１．１を、例２の手順に従って調 製した０、０９Ｍ　ＮａＣ１及び４μｇの因子Ｘ、を含むｐＨ７，３における０ 、０６Ｍ　Ｔｒｉｓバッファー中で、５ｍｇ／ｍｌに希釈し、因子Ｖを含む４０ ０μｍの塩化バリウム上澄液を例１の手順に従って調製し：ＩＯｎモル／ｍｌの リン脂質を、例３の手順に従って調製し＋７　ｍＭ　ＣａＣ１ｚ　、０．３（ｗ ｔ／ｗｔ）％のＴｒｉ−（ｎ）ブチル・ホスフェート及び１（Ｗｔ／Ｗｔ）％の ポリソルベート８０を添加した。この反応混合物を、室温において６時間インキ ュベートした。

インキュベーションの終点において、この混合物のｐＨを、６．７に調整し、Ｐ ＥＧの添加により、５（Ｗｔ／Ｗｔ）％ＰＥＧの最終濃度までもっていき、そし て室温において３０分間間物した。この沈殿物を、３．　ＯＯＯｒｐｍにおいて ３０分間、遠心分離により除去した、得られたＰＥＧ上澄液を、等容量の蒸留水 で希釈し、そして９．２ｍｌのスルファプロピル−セファデックス（６，５のｐ Ｈにおける０、０Ｅのクエン酸ナトリウムにより平衡化されているもの）と、１ 時間４°Ｃにおいて混合した。この因子１１含有スルファプロピル−セファデッ クスを、次にカラムに濯ぎ、そして６．７のｐＨにおける０、０１Ｍクエン酸ナ トリウムで洗浄した。この因子ＩＩ、を次に６゜５のｐＨにおける０、１Ｍクエ ン酸ナトリウムにより溶出した。１．２２０単位／Ａ０゜単位の比活性を、８５ ％の収率を伴う、小規模活性化手順により得た。この結果を、表ＩＩ中に要約す る。

！旦 全単位　収率本　比活性 （ｕｎｉｔｓ）　％　（ｕｎｉｔｓ 反応混合物　１５７．θ００　１００　５６０ＰＥＧ上澄液　１３０．０００　 ８３　５００零　％収率は、出発物質における単位数と比較した上記の段階（こ おいて回収された単位数に１００を乗じたもの。

気り 因子ＩＩから因子比へのパイロ・クト規模活性イヒ例１の手順に従って調製した ２０ｇの因子ＩＩを、例２の手順Ｃ二従って調製した０、０９Ｍ　ＮａＣｌを含 むｐＨ７，３における０、　０６Ｍ　Ｔｒｉｓ〕（−７フアー中て５ｍｇ／ｍｌ に希釈し：４ｍｇの因子Ｘ、を例２の和引こ従って調製し。

例１の手順に従って調製した因子■を含む１００ｍ１の塩化／＜１ノウム上澄液 を添加し、そしてこの溶液を、最終濃度までもって（、ｚき、そして例３の手順 に従って調製した２８ｎモル／ｍｌの１ノン月旨質、７　ｍＭ　ＣａＣ１２，０ ，３（ｗｔ／ｗｔ）％のＴｒｉ−（ｎ）ブチル・ホスフェート及び１（Ｗｔ／Ｗ ｔ）％のポリソルベート８０を添加した。この反応混合物を、室温におし）で６ 時間インキュベートした。インキュベーションの終点におｐｓで、この混合物の ｐＨを、６．５に調整し、固体ＰＥＧの添加により、５（ｗｔ／ｗｔ）％ＰＥＧ の最終濃度までもっていき、そして室温において３０分間間物し、そのＰＥＧを 溶解させた。この混合物を、次に、３．０００ｒｐｍｌこおＬｌて３０分間、遠 心分離し、そのＰＥＧ沈殿物を除去した。得られｔこＰＥＧ上澄液を、等容量の 蒸留水で希釈し、そして１１のスルファプロピル−セファデックス（６，５のｐ Ｈにおける０、Ｏ１＾（のクエン酸ナトリウム（こより平衡化されているもの） と、１時間４°Ｃにおいて混合した。この因子ＩＩ含有スルファプロピルーセフ ァデックスを、次にカラム（二濯ぎ、そして６．５のｐＨにおける０、０１Ｍク エン酸ナトリウムで洗浄した。この因子Ｉｔ、を次に６．７のｐｔ＋における０ 、　１Ｍクエン酸ナトリウムにより溶出した。１．１００単位／ｍｌの比活性を 、７５％の収率を伴う、パイロット規模活性化手順により得た。この結果を、表 ＩＩＩ中（こ要全単位　収率ネ　比活性 （ｕｎｉｔｓ）　％　（ｕｎｉｔｓ 活性化混合物　２１　１００　５２０ ＰＥＧ上澄液　１７．９　８５．２　４８０ＳＰ−七）Ｔデ、クス 溶出液　１５，７　７４．８　１．１００零　％収率は、出発物質における単位 数と比較した上記の段階において回収された単位数に１００を乗じたもの。

因子Ｉ！、ｖ、ｒｘ及びＸの精製のための、そして因子Ｘの因子Ｘ。

への活性化のための例示的な態様に関する上記の記載は、説明という目的のため のものである。当業者には変更は明らかであろうことから、本発明は、先に記載 した特定の態様に限定されることを意図されていない。また、開示された本発明 は、本明細書中に特に開示されていない要素のいずれの非存在中においても行わ れる二とができる。本発明の範囲を、以下の請求の範囲により定める。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ 、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、ＮＯ，ＮＺ、ＰＬ 、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ。

ＳＫ、ＵＡ （７２）発明者　ウニムラ、ハヒロ アメリカ合衆国、カリフォルニア　９１００６゜アーケイディア、サウス　サン タ　アニタアベニュ　４０８．　＃１２ （７２）発明者　ノダ　ムネヒロ 奈良県天理市田町５１５ （７２）発明者　シタニジ、ケネス　ティー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９１６０７゜エフオー。ハリウッド、シンプ ソン　アベニュ　５５０１

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．因子ＩＩ、Ｖ及びＸを含む単一の純粋でない蛋白画分から因子ＩＩ、因子Ｖ 及び因子Ｘのそれぞれを精製するための方法であって：上記の純粋でない蛋白画 分の水溶液を調製し；この水溶液を第一リガンドと接触させ、これにより、因子 ＩＩ、Ｖ及びＸを、この第一リガンドに結合させ；この第一リガンドから因子Ｉ Ｉ、Ｖ及びＸ蛋白画分を回収し；塩化バリウムをこの回収した因子ＩＩ、Ｖ及び Ｘ蛋白画分に添加し、因子ＩＩ及びＸを含んで成るバリウム沈殿物を作り；この バリウム沈殿物の上澄液から因子Ｖを回収し；このバリウム沈殿物を水溶液中で 溶解させ、因子ＩＩ−及び因子Ｘ−含有溶液を作り； この因子ＩＩ−及び因子Ｘ−含有溶液を、因子Ｘと結合することができるが因子 ＩＩとは弱く結合するか又は全く結合しない第二リガンドに適用し； 因子Ｘをこの第二リガンドに結合させ；この第二リガンドに結合しないか、又は 弱く結合した画分から因子ＩＩを回収し；そして、 この第二リガンドから因子Ｘを回収する、ことを含んで成る方法。
2. ２．第一リガンドがＤＥＡＥリガンドである、請求項１に記載の方法。
3. ３．因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を約０．２Ｍ　ＮａＣｌによる溶出によりＤＥ ＡＥリガンドから回収する、請求項２に記載の方法。
4. ４．因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を約０．０１Ｍ〜約０．２２Ｍの最終濃度まで 塩化バリウムを添加することにより沈殿させる、請求項１に記載の方法。
5. ５．第二リガンドが硫酸デキストランである、請求項１に記載の方法。
6. ６．因子Ｘを０．２Ｍ　ＮａＣｌによる溶出により第二リガンドから回収する、 請求項１に記載の方法。
7. ７．因子ＩＩを含む純粋でない蛋白画分から因子ＩＩを分離するための方法であ って； 上記の純粋でない蛋白画分の水溶液を調製し；この水溶液を第一リガンドと接触 させ、これにより、因子ＩＩ、Ｖ及びＸを、この第一リガンドに結合させ；この 第一リガンドから因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を回収し；塩化バリウムをこの回 収した因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分に添加し、因子ＩＩ及びＸを含んで成るバリ ウム沈殿物を作り；このバリウム沈殿物を水溶液中で溶解させ、因子ＩＩ−及び 因子Ｘ−含有溶液を作り； この因子ＩＩ−及び因子Ｘ−含有溶液を、因子Ｘと結合することができるが因子 ＩＩとは弱く結合するか又は全く結合しない第二リガンドに適用し；そして、 この第二リガンドに結合しないか、又は弱く結合した画分から因子ＩＩを回収す る、 ことを含んで成る方法。
8. ８．第一リガンドがＤＥＡＥリガンドである、請求項７に記載の方法。
9. ９．因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を約０．２Ｍ　ＮａＣｌによる溶出によりＤＥ ＡＥリガンドから回収する、請求項８に記載の方法。
10. １０．因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を約０．１Ｍ〜約０．２Ｍの最終濃度まで塩 化バリウムを添加することにより沈殿させる、請求項７に記載の方法。
11. １１．第二リガンドが硫酸デキストランである、請求項７に記載の方法。
12. １２．因子Ｖを含む純粋でない蛋白画分から因子Ｖを分離するための方法であっ て； 上記の純粋でない蛋白画分の水溶液を調製し；この水溶液を第一リガンドと接触 させ、これにより、因子ＩＩ、Ｖ及びＸを、この第一リガンドに結合させ；この 第一リガンドから因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を回収し；塩化バリウムをこの回 収した因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分に添加し、因子ＩＩ及びＸを含んで成るバリ ウム沈殿物を作り；そして、このバリウム沈殿物の上澄液から因子Ｖを回収する 、ことを含んで成る方法。
13. １３．第一リガンドがＤＥＡＥリガンドである、請求項１２に記載の方法。
14. １４．因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を約０．２Ｍ　ＮａＣｌによる溶出によりＤ ＥＡＥリガンドから回収する、請求項１３に記載の方法。
15. １５．因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を約０．１Ｍ〜約０．２Ｍの最終濃度まで塩 化バリウムを添加することにより沈殿させる、請求項１２に記載の方法。
16. １６．因子ＩＩを因子ＩＩａに活性化するための方法であって；活性化バッファ ー中て因子ＩＩ〔ここで、因子ＩＩを、以下の；因子ＩＩ、Ｖ及びＸを含んで成 る純粋でない蛋白画分の水溶液を調製し； この水溶液を第一リがンドと接触させ、因子ＩＩ、Ｖ及びＸをこの第一リガンド に結合させ； この第一リガンドから因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を回収し；塩化バリウムをこ の回収した因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分に添加し因子ＩＩ及びＸを含んで成るバ リウム沈殿物を作り；このバリウム沈殿物を水溶液中で溶解させ、因子ＩＩ−及 び因子Ｘ−含有溶液を作り； この因子ＩＩ−及び因子Ｘ−含有溶液を、因子Ｘと結合するが因子ＩＩとは弱く 結合するか又は全く結合しない第二リガンドに適用し；そして、 この因子Ｘ結合第二リガンドに結合しないで残ったか、又は弱く結合して残った 画分から因子ＩＩを回収する、ことを含んで成る方法により調製する。〕を希釈 し、因子ＩＩ溶液を提供し； 因子Ｖをこの因子ＩＩ溶液に添加し、因子ＩＩ／因子Ｖ溶液を提供し； 因子Ｘａ〔ここで、因子Ｘａを； 因子Ｘを上記の因子ＩＩ調製手順の第二リガンドから回収し；そして、 この因子Ｘを特異的な蛋白分解性解裂により活性化させる、ことにより調製する 。〕を、この因子ＩＩ／因子Ｖ溶液に添加し、因子ＩＩ／因子Ｖ／因子Ｘａ溶液 を提供し；リン脂質膜及びカルシウム・イオンを、この因子ＩＩ／因子Ｖ／因子 Ｘａ溶液に添加し；そして、 得られた混合物をインキュベートし、因子ＩＩを因子ＩＩａに活性化させる、 ことを含んで成る方法。
17. １７．第一リガンドがＤＥＡＥリがンドである、請求項１６に記載の方法。
18. １８．因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を約０．２Ｍ　ＮａＣｌによる溶出によりＤ ＥＡＥリガンドから回収する、請求項１７に記載の方法。
19. １９．因子ＩＩ、Ｖ及びＸ蛋白画分を約０．１Ｍ〜約０．２Ｍの最終濃度まで塩 化バリウムを添加することにより沈殿させる、請求項１６に記載の方法。
20. ２０．第二リガンドが硫酸デキストランである、請求項１６に記載の方法。
21. ２１．因子Ｘを約０．２Ｍ　ＮａＣｌによる溶出により第二リガンドから回収す る、請求項１６に記載の方法。
22. ２２．因子Ｘを、カルシウム・イオンの存在中、ラッセルクサリ蛇毒（Ｒｕｓｓ ｅｌｌ′ｓ　ｖｉｐｅｒ　ｖｅｎｏｍ）と共にインキュベーションすることによ り活性化させる、請求項１６に記載の方法。
23. ２３．因子Ｖを、因子ＩＩ調製手順により生じたバリウム上澄液から回収する、 請求項１６に記載の方法。
24. ２４．因子Ｖを、血漿の一部又は低温沈殿させた血漿により提供する、請求項１ ６に記載の方法。
25. ２５．リン脂質の濃度か約５〜約５０ｎモル／ｍｌである、請求項１６に記載の 方法。
26. ２６．カルシウム旗度が約２〜約２０ｍＭである、請求項１６に記載の方法。