MX2007012704A - Celula huesped que comprende vector para la produccion de proteinas que requieren carboxilacion-gamma. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una celula huesped que comprende un vector de expresion que comprende una molecula de acido nucleico que codifica una proteina que requiere gama-carboxilacion y secuencias de control de expresion asociadas y una molecula de acido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresion asociadas y una molecula de acido nucleico que codifica una carboxilasa y-glutamilo y secuencias de control asociadas. La presente invencion se refiere ademas a un metodo para producir una proteina que requiere gama-carboxilacion de alto rendimiento.

Description

CÉLULA HUÉSPED QUE COMPRENDE VECTOR PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS QUE REQUIEREN CARBOXI LAC ION -GAMMA Campo de la Invención La presente invención se refiere a una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere carboxilación-gamma y secuencias de control de expresión asociados de una molécula de ácido nucleico que codifica una reductasa de epóxido de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas, y una carboxilasa de ?-glutamilo y secuencias de control asociadas. La presente invención se refiere además a un método para producir una proteína que requiere carboxilación-gamma de alto rendimiento. Antecedentes de la Invención El sangrado es un problema clínico común. Es la consecuencia de una enfermedad, trauma, cirugía y tratamiento médico. Es importante detener mecánicamente el sangrado. Esto se puede dificultar o incluso ser imposible debido a la ubicación del sangrado o debido a que se difunde a partir de muchos vasos (pequeños). Los pacientes que están sangrando pueden requerir por lo tanto tratamiento con agentes que soportan la hemostásis. Estos pueden ser productos derivados de sangre (hemoterapia), agentes que originan la liberación de agentes hemostáticos endógenos, factores de coagulación recombinantes (F), o agentes que retrasan la disolución de coágulos sanguíneos. El tratamiento de primera línea entre los productos derivados de sangre, con frecuencia obtenidos del hospital local, es sangre completa para sustitución de volumen y soporte de hemostásís, glóbulos rojos empacados para la mejoría de la capacidad de transportación de oxígeno, concentrados de plaqueta para elevar el número de plaquetas (si es bajo o defectuoso) y plasma congelado fresco para soportar la hemostásis (coagulación de sangre y agregación de plaqueta). Los productos derivados de plasma de segunda línea que soportan la hemostasis, son crioprecipitado de plasma, concentrados de complejo de protrombina, concentrados de complejo de protrombina activados y factores de coagulación purificados. Algunos factores de coagulación están disponibles a la fecha en la forma de proteína recombinantes humanas, inactivas (factores de coagulación VIII y IX) y activadas (factor de coagulación Vlla). La hemofilia es un padecimiento de sangrado heredado o adquirido ya sea con un factor de coagulación anormal o deficiente o anticuerpos dirigidos hacia un factor de coagulación que inhibe la función pro-coagulante. Las hemofilias más comunes son hemofilia A (carencia de factor de coagulación VIII) y hemofilia B (factor IX). Los factores de coagulación simple o purificados recombinantes son el tratamiento principal de pacientes con hemofilia. Los pacientes con anticuerpos inhibidores poseen un problema de tratamiento, ya que también pueden neutralizar el factor de coagulación que se administra al paciente. La forma activa de la proteína C (APC) es un inhibidor de coagulación de plasma mediante la degradación de los factores de coagulación activados Va y Villa. La APC recombinante ha mostrado ser un tratamiento efectivo para la coagulación de plasma indebida en pacientes con sepsis. Los factores de coagulación para uso terapéuticos se pueden obtener de plasma humano, aunque el proceso de purificación no es simple y requiere muchos pasos de los cuales varios de ellos ayudan en la eliminación de virus contaminantes. Aunque incluso con medidas de seguridad extensas y con elaboración de pruebas de productos derivados de la sangre, la contaminación con virus infecciosos o priones no puede ser regulada. Debido a este riesgo exactamente deseable producir proteínas terapéuticas humanas a partir de células recombinantes crecidas en un medio sin componentes derivados de animales. Esto no siempre es sencillo, ya que muchas proteínas requieren un huésped mamífero para ser producidas en una forma completamente funcional, es decir, son modificadas en forma post-traducción correctamente. Entre los factores de coagulación producidos comercialmente en las células recombinantes se encuentran FVIII (NovoSeven), FVIII (Kogenate, Recombinate, Refacto) y FIX (BeneFix) (Roddie y Ludlam. Blood Rev. 11:169-177, 1997) y la Proteína Activa C (Xigris). Uno de los obstáculos más importantes en la obtención de grandes cantidades de factores de coagulación humana recombinante completamente funcional se apoya en el dominio-Gla que se encuentra en Fll, FVII, FIX, FX, Proteína S y Proteína C. Este dominio contiene residuos de ácido glutámico que son modificados en forma post-traducción a través de la adición de grupos carboxilo. La producción de estos factores se ve obstaculizada por el hecho de que la sobre-expresión de ellos da como resultado una proteína sub-carboxilada, y por lo tanto inactiva. Las modificaciones Gla son un resultado de la acción de una enzima dependiente de vitamina K denominada carboxilasa de ?-glutamilo (GGCX). Esta enzima ha sido estudiada extensamente por muchos científicos, particularmente los científicos involucrados en la investigación del factor de coagulación (Publicación WO-A-8803926; Wu y asociados, Science 254(5038): 1634-1636, 1991; Rehemtulla y asociados, Proc Natl Acad Sci E.U.A. 90:4611-4615, 1993, Stanley J. Biol. Chem. 274(24):16940-16944, 1999; Vo y asociados, FEBS letters 445:256-260, 1999; Begley y asociados, The Journal of Biological Chemistry 275(46):36245-36249, 2000; Walker y asociados, The Journal of Biological Chemistry 276(11 ):7769-7774, 2001; Bandyopadhyay y asociados, Proc Natl Acad Sci E.U.A. 99(3):1264-1269, 2002; Czerwiec y asociados, Eur Biochem 269:6162-6172, 2002; Hallgren y asociados, Biochemistry 41 (50): 15045-15055, 2002; Harvey y asociados, The Journal of Biological Chemistry 278(10)8363-8369, 2003). Los intentos para co-expresar GGCX con el factor de coagulación FIX, han sido tratados por al menos dos grupos de científicos, pero no han tenido éxito (Rehemtulla y asociados, 1993, ibid; Hallgren y asociados 2002, ibid). Considerando el gran interés en las enzimas GGCX se puede asumir que muchas más pruebas han fallado y por lo tanto no han sido reportadas. GGCX requiere vitamina K reducida como un co-factor. La vitamina K reducida es mediante GGCX convertido a epóxido de vitamina K, el cual es reciclado a vitamina K reducida mediante epoxireductasa de vitamina K (VKOR). Por lo tanto para una carboxilación dependiente de vitamina K eficiente de proteínas, se requieren dos enzimas GGCX y VKOR. La clonación e identificación de VKOR se reportó en el 2004 (Li y asociados, Nature 427:451-543, 2004, Rost y asociados, Nature 427:537-541, 2004). La proteína VKOR es un polipéptido de 163 aminoácidos con al menos una región de transmembrana anticipada. A partir de las células recombinantes que expresan la actividad VKOR se localiza la fracción subcelular microsomal.

Para Fll humano (protrombina) al menos 8 de 10 residuos Glu han sido modificados correctamente con el objeto de obtener protrombina completamente funcional (Malhotra, y asociados, J. Bíol. Chem. 260:279-287, 1985; Seegers y Walz Prothrombin and other vitamin K proteins0 CRC Press, 1986). Similarmente la actividad de coagulación de factor IX de coagulación humana requiere ?-carboxilación de al menos 10 de 12 residuos glutámicos en el dominio Gla (White y asociados, Thromb. Haemost. 78:261-265, 1997). Se han realizado esfuerzos extensos para obtener niveles de alta producción de rhFII, utilizando en diferentes sistemas tales como células CHO, células BHK, células 293 y sistemas de expresión de virus de vacunas, pero todos han fallado dado como resultado un producto sub-carboxilado y por lo tanto una protrombina funcionalmente inactiva (Jorgensen y asociados, J. Biol. Chem. 262:6729-6734, 1987; Russo y asociados, Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233, 1991; Fischer y asociados, J. Biotechnol 38(2): 129-136, 1995; Herlitschka y asociados Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996; Russo y asociados, Protein Expr. Purif. 10:214-225, 1997; Vo y asociados, 1999, ibid; Wu y Suttie Thromb Res 96(2):91-98, 1999). Las productividades reportadas anteriormente para la protrombina humana recombinante carboxilada son bajas; 20 mg/l de protrombina mutante (Cote y asociados, J. Biol. Chem. 269:11374-11380, 1994), 0.55 mg/l de protrombina humana expresado en células CHO (completamente carboxiladas, Jorgensen y asociados 1987, ibid), 25 mg/L en células CHO (grado de carboxilación no mostrado, Russo y asociados 1997, ibid).

Tal como se sabe, la expresión conjunta de una proteína requiere ?-carboxilación y VKOR no había sido reportado anteriormente. La Publicación WO 92/19636 describe la clonación e identificación de secuencia de una carboxilasa dependiente de vitamina K de humano y bovino. La Solicitud sugiere la coexpresión de la carboxilasa dependiente de la vitamina K y una proteína dependiente de vitamina K en una célula huésped adecuada, con el objeto de preparar la proteína dependiente de vitamina K. La no expresión conjunta de la carboxilasa y la proteína dependiente de la vitamina K está ejemplificada. La Publicación WO 92/19636 describe la clonación e identificación de secuencia de una carboxilasa dependiente de vitamina K de humano y bovino. La Solicitud sugiere la expresión conjunta de la carboxilasa dependiente de la vitamina K (GGCX) y la proteína dependiente de vitamina K en una célula huésped adecuada, con el objeto de preparar la proteína dependiente de vitamina K. La no expresión conjunta de la carboxilasa y la proteína dependiente de la vitamina K está ejemplificada. La Publicación WO 2005/038019 reclama un método para incrementar la productividad general de la proteína ?-carboxilada a través de una expresión conjunta controlada de proteína ?-carboxilada y GGCX. La presente invención está simplificada con productividad mejorada de factores de coagulación II y FIX. La Publicación WO 2005/030039 sugiere la expresión conjunta de proteína dependiente de vitamina K con reductasa epóxida de Vitamina K (VKOR) con el objeto de mejorar la ?-carboxilación. Sin embargo, no se ejemplifica dicha expresión conjunta. La expresión conjunta de factor de coagulación X (FX) y VKOR ha mostrado mejorar la capacidad de compartir de la proteína ?-carboxilada a través de la Publicación de Sun y asociados (Blood 106: 3811-3815, 2005). Wajih y asociados (JBC 280:31603-31607, 2005) también ha demostrado en forma adicional una capacidad de compartir mejorada de factor de coagulación ?-carboxilado IX (FIX) a través de la expresión conjunta con VKOR. Ambas Publicaciones reportaron que VKOR incrementó la capacidad de compartir de la proteína ?-carboxilada pero la expresión conjunta de VKOR no mejoró la productividad general de factor de coagulación. Existe la necesidad de métodos mejorados para producir factores de coagulación de sangre activa en altas producciones. La presente invención se establece para atender esta necesidad. Breve Descripción de la Invención De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control asociadas, y un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de expresión de control asociadas, en donde la célula huésped comprende además una molécula de ácido nucleico que codifique una carboxilasa ?-glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas. En otro aspecto, se proporciona una célula que está proyectada para expresar (i) una proteína que requiere gama-carboxilación, e (ii) epoxidoreductasa de vitamina K, en donde las proteínas (i) y (ii) se expresan en una proporción de entre 10:1 y 500:1. De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona una célula huésped eucariótica modificada en forma genética que comprende: (i) un polinucleótido que codifica la proteína de epoxidoreductasa de vitamina K en donde la secuencia que codifica la proteína de epoxireductasa de vitamina K está enlazada en forma operable a las secuencias de control de expresión, lo que permite la expresión de la proteína de epoxidoreductasa de vitamina K a través de dicha célula; (ii) un polinucleótido que codifica una proteína que requiere carboxilación a través de la proteína de carboxilasa ?-glutamilo enlazado en forma operable a las secuencias de control de expresión que permiten la expresión de la proteína que requiere la carboxilación a través de dicha célula, y (iii) un polinucleótido que codifica la carboxilasa gama-glutamilo. De acuerdo aún con otro aspecto se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control de expresión asociadas y una molécula de ácido nucleico que codifica un epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas. De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método para producir una proteína gama-carboxilada que comprende: (i) cultivar una célula que expresa una proteína recombinante que requiere gama-carboxilación, epoxidoreductasa de vitamina K y una carboxilasa de ?-glutamilo e (ii) aislar la proteína gama-carboxilada . De acuerdo con otro aspecto se proporciona un método para producir una composición farmacéutica adecuada para inducir la coagulación de la sangre o promover coagulación incrementada o disminuida, en donde el método comprende purificar la proteína carboxilada activa producida de acuerdo con los métodos anteriores, y mezclar en adiciones la proteína carboxilada purificada con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona un método para promover la coagulación incrementada o disminuida en un sujeto en donde el método comprende administrar una cantidad farmacológicamente efectiva de una proteína gama-carboxilada aislada obtenida a través de los métodos anteriores a un paciente que necesita del mismo. La proteína que requiere gama-carboxilación producida a través de los métodos de la presente invención se pueden utilizar en terapia haemostática o antitrombótica. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra un mapa de plásmido de un vector de expresión conjunta de FIONopA (factor X + GGCX) y un mapa de plásmido del vector de expresión VKORzeo (VKOR). La figura 2, muestra mapas de plásmido de vectores utilizados para la expresión conjunta de Fll, GGCX y VKOR. Descripción Detallada de la Invención De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control de expresión asociadas, y un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas, en donde la célula huésped comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una carboxilasa y glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control de expresión asociadas que comprende un primer promotor, y la molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas comprenden un segundo promotor. En otra modalidad, el primer promotor es más fuerte lo suficiente que el segundo promotor de modo que la proteína que requiere gama-carboxilación y la epoxidoreductasa de vitamina K se expresa en una proporción de al menos 10:1. En otra modalidad, el primer promotor es lo suficientemente más fuerte que el segundo promotor de modo que la proteína que requiere gama-carboxilación y la epoxidoreductasa de vitamina K se expresa en una proporción de al menos 5:1. En otra modalidad, la célula comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una carboxilasa de y-glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica la carboxilasa de ?-glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas comprende además un tercer promotor, en donde el primer promotor es lo suficientemente más fuerte que el tercer promotor de modo que la proteína que requiere la gama-carboxilación y la carboxilasa de ?-glutamilo se expresan en una proporción de al menos 10:1. En otra modalidad, el primer promotor lo suficientemente más fuerte que el segundo promotor de modo que la proteína que requiere la gama- carboxilación y la epoxidoreductasa de vitamina K se expresan en una proporción de al menos 5:1. El primer promotor puede ser un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (hCMV) y el segundo y tercer promotor puede ser un promotor temprano de SV40. En una modalidad particular, tanto la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control de expresión asociadas, como la molécula de ácido nucleico que codifica la epoxidoreductasa de vitamina K, y opcionalmente la carboxilasa de ?-glutamilo, y las secuencias de control de expresión asociadas, se localizan en el mismo vector de expresión. En otra modalidad, existen dos u opcionalmente tres moléculas de ácido nucleico en dos o más vectores de expresión separados. En otro aspecto se proporciona una célula que está construida para expresar (i) una proteína que requiere gama-carboxilación, e (ii) epoxidoreductasa de vitamina K, en donde las proteínas (i) y (ii) se expresan en una proporción de entre 10:1 y 500:1. En otra modalidad, las proteínas (¡) y (ii) se expresan en una proporción de entre 5:1 y 500:1. La proteína que requiere gama-carboxilación es seleccionada del grupo que consiste en: factor de coagulación Vil, coagulación FVII, factor de coagulación IX, FIX de coagulación, protrombina, factor de coagulación II, Fll de coagulación, factor de coagulación X, FX de coagulación, y sus formas activadas FVIIa, FlXa, FXa, Proteína C, Proteína S, Proteína Z, proteína Gla de Hueso, proteína Gla de Matriz, proteína específica de detención de Crecimiento 6, proteasas de veneno de serpientes similares a factores de coagulación tales como proteasas de veneno de serpiente tipo Factor X, y proteína tipo Acanthophiinae FXa. A partir de una modalidad, la proteína que requiere gama-carboxilación es un factor de coagulación dependiente de vitamina K. En otra modalidad, la proteína que requiere gama-carboxilación es el Factor IX. En una tercera modalidad, la proteína que requiere gama-carboxilación es protrombina. En una cuarta modalidad, la proteína que requiere gama-carboxilación es Factor X. En una quinta modalidad, la proteína que requiere gama-carboxilación es factor Vil. La proteína que requiere gama-carboxilación es preferentemente una proteína humana aunque todas las proteínas eucarióticas están comprendidas por la presente invención. La epoxidoreductasa de vitamina K es preferentemente una proteína humana aunque se pueden utilizar todas las epoxidoreductasas de Vitamina K eucariótica en la presente invención, la carboxilasa ?-glutamilo es preferentemente una proteína humana aunque se pueden utilizar todas las carboxilasas ?-glutamilo eucarióticas en la presente invención. De acuerdo con un aspecto adicional, se proporciona una célula huésped eucariótica modificada genéticamente que comprende: (i) un polinucleótido que codifica una proteína de epoxidoreductasa de vitamina K, en donde la secuencia que codifica la proteína de epoxidoreductasa de vitamina K está enlazada en forma operable a las secuencias de control de expresión que permiten la expresión de la proteína epoxidoreductasa de vitamina K a través de dicha célula; y (ii) un polinucleótido que codifica una proteína que requiere carboxilación a través de la proteína de carboxilasa y-glutamilo enlazada en forma operable a secuencias de control de expresión que permiten la expresión de la proteína que requiere carboxilación a través de dichas células. (iii) un polinucleótido que codifica carboxilasa gama-glutamilo en donde la secuencia que codifica la proteína carboxilasa gama-glutamilo están enlazada en forma operable a secuencias de control de expresión que permiten la expresión de proteína de carboxilasa gama-glutamilo a través de dicha célula. En una modalidad, la célula tiene la capacidad de expresar la proteína de epoxidoreductasa de vitamina K y la proteína que requiere la carboxilación en la proporción de al menos 1:10. En otra modalidad, la proporción es al menos 1:5. La célula huésped es preferentemente una célula eucariótica. Las células huésped típicas incluyen, pero no se limitan a células de insecto, células de levadura, y células de mamífero. Las células de mamífero son particularmente preferidas. Las líneas de células de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a células CHO, HEK, NSO, 293, Per C.6, BHK y COS, y derivados de las mismas. En una modalidad la célula huésped es la línea de célula de mamífero CHO-S. De acuerdo aún con otro aspecto, se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control de expresión asociadas y molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control de expresión asociadas comprende un primer promotor, y la molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas comprende un segundo promotor. El primer promotor puede ser lo suficientemente más fuerte que el segundo promotor de modo que la proteína que requiere gama-carboxilación y la epoxidoreductasa de vitamina K se expresa en una proporción de al menos 10:1. En otra modalidad, esta proporción es de 5:1. El vector puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica una carboxilasa ?-glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas. Dicha molécula de ácido nucleico que codifica una carboxilasa ?-glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas puede comprender un tercer promotor, en donde el primer promotor es lo suficientemente más fuerte que el tercer promotor de modo que la proteína que requiere gama-carboxilación y la carboxilasa ?-glutamilo se expresa en una proporción de al menos 10:1. En otra modalidad, esta proporción es de 5:1. La proteína que requiere gama-carboxilación puede ser seleccionada del grupo que consiste en: factor de coagulación Vil, FVII de coagulación, factor de coagulación IX, FIX de coagulación, protrombina, factor de coagulación II, Fll de coagulación, factor de coagulación X, FX de coagulación, y sus formas activadas FVIIa, FlXa, Fxa, proteasa de veneno de serpiente similar a factores de coagulación tales como proteasas de veneno de serpiente tipo Factor X y proteína tipo Acanthophiinae FXa, Proteína C, Proteína S, Proteína Z, Proteína Gla de hueso, Proteína Gla de matriz, Proteína específica de detención de crecimiento 6. De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un método para producir una proteína gama-carboxilada que comprende: (i) cultivar una célula que expresa una proteína recombinante que requiere gama-carboxilación, epoxidoreductasa de vitamina K y una carboxilasa ?-glutamilo e (ii) aislar la proteína gama-carboxilada. La célula que expresa la proteína que requiere gama- carboxilación y la epoxidoreductasa de vitamina K en una proporción de al menos 10:1, bajo condiciones adecuadas para la expresión de ambas proteínas. Los factores de coagulación dependientes de vitamina K (Fll, FVII, FIX, FX y sus formas activadas Fila o trombina, FVIIa, FlXa, FXa) producidos a través del método de la presente invención para la expresión conjunta de VKOR sola o en combinación con GGCX, se puede esperar que sean útiles en la prevención y tratamiento de sangrado después de un trauma, cirugía o enfermedades del hígado, ríñones, plaquetas o factores de coagulación sanguínea (hemofilia). De igual forma la Proteína C de factor de coagulación y su forma activada APC puede esperarse que sea útil en la prevención o tratamiento de trastornos de coagulación incrementados con o sin niveles disminuidos de Proteína C. El método también puede aplicar a otras proteínas que requieren carboxilación-post-traducción. La presente invención podrá aplicarse para mejorar la productividad de cualquier proteína que sea dependiente de y-carboxilación, dichas proteínas incluyen, pero no se limitan a: factor de coagulación de protrombina II (Fll), factor de coagulación Vil (FVII), factor de coagulación IX (FIX), factor de coagulación X (FX), Proteína C, Proteína S, Proteína Z, Proteína Gla de hueso (también conocida como: BGP o osteocalcina), Proteína Gla de matriz (MGP), Polipéptido Gla 1 con alto contenido de prolina (PRRG1), Polipéptido Gla 2 con alto contenido de prolina (PRRG2), Proteína específica de detención de crecimiento 6 (Gas 6). Otras proteínas adecuadas son: proteína tipo FXa en veneno de serpiente elapid (subfamilia de Acanthophiinae) y veneno de serpiente de cono (Conus textile). Cada una de estas proteínas, incluyendo sus secuencias de ácido nucleico y aminoácido, son bien conocidas. La Tabla 1 identifica las secuencias representativas de formas tipo natural y mutantes de las diversas proteínas que se pueden utilizar en la presente invención.

Tabla 1 Se podrá apreciar que la presente invención no está restringida a una proteína en particular o secuencia de codificación de proteína de una de estas proteínas que serán expresadas en conjunto. Además, y en particular con respecto a factores de coagulación de sangre, se han descrito en la técnica numerosas formas mutantes a las proteínas. La presente invención aplica de igual manera a estas formas mutantes, incluyendo variantes alélicas que ocurren naturalmente, de las proteínas tal como la secuencia tipo natural. En una modalidad la presente invención puede tomarse con cualquier proteína tipo natural o con al menos el 90%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia. La identidad de secuencia entre dos secuencias se puede determinar a través de análisis de alineación por pares de computadora, utilizando programas tales como BestFit, Gap o FrameAlign. La herramienta de alineación preferida es BestFit. En práctica, cuando se busca secuencias similares/idénticas con las secuencias de consulta, dentro de una base de datos de secuencia, generalmente es necesario llevar a cabo una identificación inicial de secuencias similares utilizando un software adecuado, tal como Blast, Blast2, NCBI Blast2, WashU Blast2, FastA, Fasta3 y PILEUP, y una matriz de calificación tal como Blosum 62. Dichos paquetes de software se empeñan en aproximarse cercanamente al algoritmo de alienación "estándar de oro" de Smith-Waterman. Por lo tanto, el software/programa de ingeniería de búsqueda preferido para utilizarse en una evaluación de similitud, es decir, que tanto dos alineaciones de secuencias de polipéptido primarias son Smith-Waterman. La identidad se refiere a coincidencias directas, la similitud permite substituciones conservadoras. El término epoxidoreductasa de vitamina K o "VKOR", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una enzima que cataliza la reducción de un epóxido de vitamina K y vitamina K para formar la vitamina K reducida. Las reductasas de vitamina K son altamente distribuidas, y han sido clonadas a partir de varias diferentes especies tales como ratón (Mus musculus), rata (Rattus norveigicus), pollo (Gallus gallus) y vaca (Bos taurus). Las proteínas homologas pueden ser anticipadas a partir de secuencias de organismos de origen filogenético altamente dispersas tales como mamíferos, aves, anfibios, peces con huesos, moscas, cinetoplástidos y bacterias. La Tabla 2 representa una lista no limitante de secuencias representativas de proteínas anticipadas homologas a VKOR humano (clasificadas después del origen de la especie) que se puede utilizar en la presente invención. Tabla 2.

Especies Acceso a base de Datos #/ ID Homo sapiens (hombre) NP_775788 NP_996560 AAR28759 AAQ13668 AAQ88821 C AHÍ 0673 El término "carboxilasa ?-glutamilo" ó "GGCX", tal como se usa en la presente invención, se refiere a una enzima dependiente de vitamina K que cataliza la carboxilación de residuos de ácido glutámico. Las enzimas GGCX son altamente distribuidas, y han sido clonadas a partir de muchas diferentes especies tales como ballena beluga Delphinapterus leucas, el pez sapo Opsanus tau, pollo (Gallus gallus), mixino (Myxine glutinosa), cangrejo pata de caballo (Limulus polyphemus), y serpiente de cono Conus textile (Begley y asociados, 2000, ibid; Bandyopadhyay y asociados, 2002, ibid). La carboxilasa de veneno de cono es similar a la carboxilasa de bovino, y ha sido expresado en células COS (Czerwiec y asociados, 2002, ibid). Proteínas adicionales similares a GGCX se pueden encontrar en insectos y procariotes tales como Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster y Leptospira con números de acceso NCBI: gi 31217234, gi 21298685, gi 24216281, gi 24197548 y (Bandyopadhyay y asociados, 2002, ibid), respectivamente. La enzima de carboxilasa muestra una conservación de evolución remarcada. Varias de las enzimas no humanas han mostrado, o pueden anticiparse que tienen, actividad similar a la de GGCX humana que hemos utilizado como por consiguiente, han sido utilizadas como una alternativa a la enzima humana. La Tabla 3 identifica secuencias representativas de proteínas anticipadas homologas para GGXC humana (clasificadas después del origen de la especie) que se pueden utilizar en la presente invención.

Tabla 3.

Cada una de las proteínas GGCX identificadas anteriormente, se pueden utilizar como la enzima de carboxilasa en la presente invención. Una forma de efectuar las proteínas expresadas en conjunto, es utilizar diferentes promotores como parte de las secuencias de control de expresión respectivas. La técnica está repleta de ejemplos de diferentes vectores de clonación, promotores y otras secuencias de control de expresión que tienen la capacidad de expresar proteínas heterólogas en diferentes grados o extensiones. La tecnología de expresión recombinante está avanzada de modo que un experto en la técnica de la expresión de proteínas tenga la capacidad de seleccionar promotores y otras secuencias de control para llevar un aproximado expresión conjunta de la proteína que requiere carboxílación, epoxidoreductasa de vitamina K y, opcionalmente, la y-carboxilasa. La selección de dichos promotores particulares y otras secuencias de control de expresión es utilizar una materia de elección individual. En una modalidad, las secuencias de control asociadas con la proteína que requiere gama-carboxilación comprenden un promotor fuerte. En una modalidad este es el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (hCMV). Un promotor fuerte se define en la presente invención como un promotor que da surgimiento al menos a números 5 veces mayores de transcripciones de ARNm que un promotor debe utilizarlo en la misma célula bajo condiciones similares. En otra modalidad, las secuencias de control con la epoxidoreductasa de vitamina K, y cuando se encuentra en la carboxilasa ?-glutamilo, comprenden un promotor débil. En una modalidad este es un promotor temprano SV40. En otra modalidad la proteína que requiere gama-carboxilación y la epóxido reductasa de vitamina K, y opcionalmente la carboxilasa y-glutamilo, están bajo el control de diferentes promotores con el promotor que controla la expresión de la epóxido reductasa de vitamina K, y opcionalmente la carboxilasa ?-glutamilo, siendo más débil que el promotor que controla la expresión de la proteína que requiere gama-carboxilación. La presente invención ha sido ejemplificada a través del uso del promotor CMV fuerte (Boshart y asociados Cell 41: páginas 521 a 530, 1985) para sobre-expresar el Factor X y el promotor SV40 más débil (Wenger y asociados Anal Biochem 221: páginas 416 a 418, 1994) para controlar la expresión de la epóxido reductasa de vitamina K y opcionalmente la expresión GGCX. Otro promotor fuerte que puede utilizarse de acuerdo con la presente invención incluye, pero no se limita a pEF-1a [factor de elongación humano-gen subunidad 1a) (Mizushima and Nagata, Nuc Acids Res 18: página 5322, 1990; Goldman y asociados, BioTechniques 21: páginas 1013 a 1015, 1996)], pRSV [virus de sarcoma de Rous (Gorman y asociados, Proc Natl Acad Sci EUA 79: páginas 6777 a 6781, 1982)] y pUbC [ubiquitina humana (Schorpp y asociados, Nuc Acids Res 24: páginas 1787 a 1788, 1996)]. La presente invención también se extiende a una proteína gama carboxilada purificada producida a través de los métodos de la presente invención y su uso en terapia de coagulación. De acuerdo aún con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para promover la coagulación incrementada o disminuida en un sujeto, en donde el método comprende administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad farmacológicamente efectiva de una proteína gama-carboxilada aislada obtenida a través de los métodos descritos anteriormente. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para producir una composición farmacéutica adecuada para inducir la coagulación de la sangre, que comprende purificar la proteína carboxilada activa expresada a partir de una célula huésped adaptada para expresar una proteína que requiere gama-carboxilación y carboxilasa ?-glutamilo en una proporción de al menos 5:1 y mezclar en adiciones la proteína carboxilada purificada con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones de la presente invención se pueden obtener a través de procedimientos convencionales utilizando excipientes farmacéuticos convencionales, bien conocidos en la técnica, pero que probablemente estén en una forma adecuada para inyección, ya sea inyección, ya sea en forma parenteral o directamente en el sitio de la herida. Los polvos adecuados para la preparación de una preparación acuosa para inyección, a través de la adición de un diluyente adecuado, contiene generalmente el ingrediente activo junto con transportadores y excipientes adecuados, un agente de suspensión y uno o más estabilizadores o conservadores. El diluyente puede contener otros excipientes, tales como conservadores, modificadores de tonicidad y estabilizadores. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, también pueden estar en la forma de emulsiones de aceite en agua. La fase aceitosa puede ser un aceite vegetal, tal como aceite de hígado o aceite de arachis, o un aceite mineral, tal como por ejemplo parafina líquida o una mezcla de cualquiera de estos. Los agentes de emulsificación adecuados pueden ser, por ejemplo, gomas que ocurren naturalmente, tales como acacia de goma o goma de tragacanto, fosfatidas que ocurren naturalmente tales como fríjol soya, lecitina un éster o esteres parciales derivados de ácido graso y anhídridos de hexitol (por ejemplo monooleato de sorbitano) y productos de condensación de los esteres parciales con óxido de etileno tal como monooleato de sorbitano de políoxietileno. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, también pueden estar en la forma de una solución o suspensión estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, el cual puede ser formulado de acuerdo con procedimientos conocidos que utilizan uno o más de los agentes de dispersión o humectación adecuados y agentes de suspensión, los cuales ya se han mencionado anteriormente. Una preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo una solución en 1 ,3-butanodiol. Para información adicional con respecto a la Formulación, el lector podrá ser referencia al Capítulo 25.2 en el Volumen 5 de la Publicación Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990; o, Volumen 99 de la Publicación Drugs and the pharmaceutical sciences; Protein formulation and delivery (Eugen J. McNally, executive editor), Marcel Dekker Inc 2000.

La cantidad de ingrediente activo que se combina con uno o más excipientes para producir una forma de dosis simple, variará necesariamente dependiendo del huésped tratado y la ruta de administración particular. Por ejemplo, una formulación proyectada para inyección a humanos generalmente contendrá, por ejemplo, de 0.2 mg, a 6 g ó de 0.5 mg a 2 g de un agente activo elaborado en compuesto con una cantidad adecuada y conveniente de excipientes que puede variar de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 98 por ciento en peso de la composición total. Las formas de unidad de dosificación generalmente contendrán de aproximadamente 0.2 mg hasta aproximadamente 10 g o de aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 500 mg del ingrediente activo. Los terapéuticos proteinaceos generalmente se almacenan congelados o se secan por congelación. Para información adicional con respecto a Rutas de Administración y Regímenes de Dosis, el lector hará referencia al Capítulo 25.3 en el Volumen 5 de la Publicación Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990. El tamaño de la dosis para propósitos terapéuticos o profilácticos de un compuesto, variará naturalmente de acuerdo con la naturaleza y severidad de las condiciones, la edad y sexo del animal o paciente y la ruta de administración, de acuerdo con principios de medicina bien conocidos. En el uso de un compuesto para propósitos terapéuticos o profilácticos generalmente se administrará de modo que una dosis diaria dentro del rango de, por ejemplo, 20 µg a 75 mg por kg de peso corporal o de 0.5 mg a 75 mg por kg de peso corporal sea recibida, si se requiere en dosis divididas. En general, las dosis inferiores se administrarán cuando se emplee una ruta parenteral. Por lo tanto, por ejemplo, para administración intravenosa, generalmente se utilizará una dosis dentro del rango, por ejemplo, de 20 µg a 30 mg por kilogramo de peso corporal o de 0.5 mg a 30 mg por kilogramo de peso corporal. En forma similar, para la administración mediante inhalación, se utilizará una dosis dentro del rango, por ejemplo, de 20 µg a 30 mg por kg ó de 0.5 mg a 25 mg por kg de peso corporal. Como una alternativa, el compuesto se puede administrar como una infusión de µg - 10 mg por kilogramo de peso corporal y por hora durante un período de tiempo de unas cuantas horas hasta varios días. Sección de experimentos La presente invención se describirá en forma adicional a través de los siguientes ejemplos no limitantes. La práctica de la presente invención empleará, al menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de las habilidades en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver por ejemplo la Publicación de Sambrook y asociados, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel y asociados, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY (2002); Glover & Hames, eds., DNA Cloning 3: A Practical Approach, Vols. I, II, & lll, IRL Press, Oxford (1995); Colowick & Kaplan, eds., Methods in Enzymology, Academic Press; Weir y asociados, eds., Handbook of Experimental Immunology, 5ta. Ed., Blackwell Scientific Publications, Ltd., Edinburgh, (1997). Ejemplo 1 Para investigar la importancia de VKOR en la expresión de proteínas carboxiladas, hemos expresado el factor X de coagulación humana (FX) en células CHO. FX completamente funcional ha sido expresada anteriormente por Camire y asociados 2000 (Biochemistry 39: páginas 14322 a 14329) quien obtuvo aproximadamente 1 µg de FX carboxilada por millón de células en un día, y por Himmelspach y asociados 2000 (Thromb Res 97: páginas 51 a 67) quien obtuvo hasta 25% (19.5 µg) de FX activo por millón de células al día utilizando una línea de célula CHO que ha sido sometida a amplificación DHFR. Himmelspach y asociados reportó el procesamiento incompleto de FX recombinante y la máxima productividad de FX activo que realmente mostró 5 µg/ml medio de cultivo. En ambas Publicaciones las células se crecieron como células adherentes en un medio que contiene suero. Las células se crecieron hasta una confluencia deseada, el medio reemplazado con medio libre de suero y la incubación continuaron para permitir la acumulación del producto. La cantidad de producto se estimó posteriormente a partir de este medio "libre de suero". Este procedimiento de cultivo no es adecuado para una producción de proteínas a gran escala, ya que las células únicamente producirán producto durante un período de tiempo corto. Además, el producto se contaminará con proteínas de suero tales como FX de bovino el cual es altamente indeseable como proteínas de suero que serán difíciles de eliminar y pueden originar la formación de anticuerpos si se encuentra en un producto inyectado a pacientes. Las líneas de células obtenidas por lo tanto no han mostrado ser adecuadas para producción comercial de FX farmacéutico. Establecimiento de líneas celulares estables produciendo un factor X humano recombinante La secuencia que codifica FX fue PCR amplificada a partir de ADNc de hígado humano utilizando los cebadores: F10F1: 5'-CACACCATGGGGCGCCCACT-3' (SEC ID NO: 2) F10R1: 5'-GAGTGGGATCTCACTTTAATGGA-3' (SEC ID NO: 3) La clonación del producto PCR se realizó primero a través de una clonación TA-TOPO en pCDNA3.1 -V5His (Invitrogen).

Los clones que contienen la secuencia FX correcta fueron identificados mediante secuenciación de ADN y mediante la expresión temporal en células COS-7. Posteriormente se clonó un fragmento con extremo romo que contiene la secuencia de codificación FX en el vector de expresión nopA tratado con fosfatasa y digerido con EcoRV. Los clones FIOnopA obtenidos (SEQ ID NO: 6) se verificaron mediante secuenciación de ADN de la secuencia insertada y mediante expresión temporal en COS-7. La secuencia de codificación VKOR, fue PCR amplificada a partir de ADNc de hígado humano utilizando los cebadores: VF1: 5'-CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA-3' (SEC ID NO: 4) VR1: 5'-GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT-3' (SEC ID NO: 5) La clonación del producto PCR se realizó primero mediante clonación TA-TOPO en pCDNA3.1 -V5His (Invitrogen). Los clones que contienen la secuencia de codificación VKOR correcta (SEQ ID NO: 1) se identificaron mediante secuenciación de ADN. El fragmento Hind\\\-Not\ que contiene la secuencia VKOR, se transfirió posteriormente al vector de expresión pZeoSV2+ (Invitrogen) digerido con las mismas enzimas. Los clones VKORzeo (SEQ ID NO. 7) obtenidos, fueron purificados mediante secuenciación de ADN. Se crecieron células CHO-S (Invitrogen) en un medio DMEM F12 que contiene Glutamax I y FBS tratado con calor al 9%, esencialmente como lo recomienda Invitrogen. La transfección de CHO-S se realizó digerido con Pvu\ (linearizado) FIOnopA, digerido con Sspl VKORzeo y Lipofectamina 2000 esencialmente tal como lo recomienda Invitrogen. La mezcla de transfección de ADN que contiene un exceso molar de 1.6 veces de FIONopA se comparó con VKORzeo. Al día posterior a la transfección, las células transfectadas se sembraron en un medio de selección; medio de crecimiento más 400 µg/ml G418, a placas de 96 depósitos. Por lo tanto la construcción VKORzeo no se seleccionó para, sino que se integró en forma aleatoria en los transfectantes resistentes a G418. Los siguientes días las placas se inspeccionaron para confirmar que se obtuviera un número adecuado de clones por depósito (5-10). Seis días después de la transfección, el medio de selección se reemplazó a través del medio de crecimiento suplementado con Vitamina K (1 µg/ml). Al siguiente día, las placas se muestrearon y se ensayaron con respecto a actividad FX utilizando un ensayo a base de Veneno Viper de Russels (RVV-X), lo cual activa FX a FXa. Posteriormente se midió la actividad FXa utilizando un substrato cromogénico (S2765, Chromogenix, Molndal, Suecia). El ensayo RVV-X es equivalente al ensayo utilizado por Himmelspach y asociados para el mismo propósito. Los depósitos con la mayor actividad fueron identificados y los clones contenidos fueron expandidos y sometidos a clonación de dilución limitante. Después de la clonación de dilución limitante y la selección de los mejores clones, los clones elegidos fueron expandidos y transferidos para crecimiento en un medio libre de proteína (CD-CHO suplementado tal como lo recomienda Invitrogen más 1 µg/ml vitamina K). Se estimó la productividad de FX recombinante a partir de cultivos de frasco-T. Se ensayó la expresión de VKOR mediante análisis PCR de Tiempo Real. Se descubrió que todos los clones seleccionados que expresan FX completamente activo también expresaron VKOR. A partir de esto se puede concluir que la expresión conjunta de VKOR mejora la expresión del Factor X de coagulación humana completamente activo. Las líneas celulares obtenidas crecieron bien en un medio libre de proteína y componentes animales y producen FX en ausencia de presión de selección antibiótica. Las líneas celulares obtenidas son consideradas por lo tanto, adecuadas para producción a gran escala de proteínas y tienen la capacidad de producir grandes cantidades de FX activo. La capacidad de compartir de FX completamente activo, también es significativamente mayor que la reportada previamente. Ejemplo 2 Análisis de productividad y proporciones ARNm para la expresión conjunta de FX, VKOR y GGCX Los clones obtenidos en el Ejemplo 1 se crecieron en frascos-T en un medio CHO químicamente definido de proteínas sin antibióticos (Invitrogen). Las muestras se recolectaron de cultivos de 4 días para la preparación de ADNc y las muestras para los estimados de productividad se recolectaron a partir de cultivos 5 días después de la división de rutina. Las muestras de control también se prepararon a partir de la línea celular CHO-S no transfectada de origen crecida en el mismo medio y los análisis de las muestras de control produjeron los resultados esperados. Los cultivos de sebo artificial de cuchara se crecieron en CD-CHO con o sin suplemento de aditivos libres de componentes de animales. La cantidad de rhFX activo se estimó a través de un ensayo a base de RVV-X como en el ejemplo 1, y un estándar de Factor X humano derivado de plasma purificado diluido en serie (Haematologic Technologies Inc., Vermont, EUA). El ARN se aisló con Trizol™ de acuerdo con el protocolo suministrado por el vendedor, Invitrogen. El ARN aislado fue DNasel tratado con un equipo ADN-free™ de Ambion. Se llevó a cabo la síntesis de ADNc utilizando cebadores de hexámero y contenidos de equipos de Superscript™First-Strand Synthesis System para RT-PCR (Invitrogen). Las sondas etiquetadas con cebadores y Vic- para RT-PCR de Tiempo Real fueron seleccionadas utilizando el software Primer Express™ de Applied Biosystems. Oligonucleótidos de y-Carboxilasa Humana 5'ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3' Cebador directo (SEC ID NO: 8) ' AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT3' Cebador inverso (SEC ID NO: 9) 5' CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3' Sonda (SEC ID NO: 10) Oligonucleótidos de Factor X Humano Los cebadores se fabricaron mediante Operon/Qiagen y las sondas se ordenaron en Applied Biosystems. 5'CCGCAACAGCTGCAAGCT-3' Cebador directo (SEC ID NO: 11) 5'TGTCGTAGCCGGCACAGA-3' Cebador inverso (SEC ID NO: 12) 5' CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG Sonda (SEC ID NO: 13) Oligonucleótidos Humanos VKOR 5'GCTGGGCCTCTGTCCTGAT-3' Cebador directo Sec(SEC ID NO: 14) 5' ATCCAGGCCAGGTAGACAGAAC-3' Cebador inverso Se(SEC ID NO: 15) 5' CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCG Sonda S(SEC ID NO: 16) También se utilizaron los cebadores de control de roedor GAPDH y la sonda (Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan® Rodent GAPDH Control Reagents Protocol)- Amplícon Longitud 177 pb. Se llevaron a cabo reacciones RT-PCR de Tiempo Real en el 7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems. La longitud esperada de los productos PCR amplificada se confirmó en geles de agarosa. Tabla 4. Resultados de análisis PCR de Tiempo Real de clones que expresan FX.

Nombre FX VKOR GGCX GAPDH de clon ARNm/célula ARNm/célula ARNm/célula ARNm/célula FX1-5 137 0.62 1 1553 FX2-5 13 0.48 0.26 2985 FX3-9 3 0.03 0.17 1891 FX6 267 3 11 2289 FX17-2 319 2 37 2381 Tabla 5. Estimados de productividad y proporciones ARNm. Se calcularon proporciones a partir de los datos de la Tabla 4. Se estimó una productividad a partir de los ensayos de actividad de muestras de cultivo diluidas.

Las productividades descritas en la Tabla 5 todas están arriba de las obtenidas previamente de líneas celulares no amplificadas. Los estimados de la concentración FX total, incluyen FX inactivo, se llevaron a cabo utilizando un ensayo Biacore y medíante SDS-PAGE y manchado Western. Ensayo Biacore para el estimado de la concentración de rhFX total Los sistemas analíticos BIAcore3000™, El amortiguador de corrida (10 mM HEPES, 0.15 M NaCI, 3.4 mM EDTA y 0.05% P20, pH 7.4), el Fc anti-ratón de conejo en 0.15 M NaCI (RAM Fc, lot no. 610) y los chios de sensor CM5 se compraron en Biacore AB (Uppsala, Suecia). El procedimiento se corrió en 5 µl/min a una temperatura de 25°C. Se utilizó un procedimiento de acoplamiento de amina estandarizado (35 µl de tiempo de activación) a una temperatura de 25°C, para acoplar en forma covalente 11000 RU del anticuerpo de captura RAMFc (35 µl, 30 µg /ml en 10 mM de sodio-acetato, pH5.0) para el canal 4 del chip CM5. Después de la inmovilización la superficie se regeneró con 5 µl 10 mM de amortiguador de glicina, pH 1.8 y se equilibró en forma adicional con el amortiguador de corrida. Con un flujo de 20 µl del anticuerpo IgG monoclonal anti-FX de ratón N77121M (Biodesign, Maine, EUA) (diluido 1/100 en el amortiguador de corrida) se capturó 660 RU. El enlace de FX en el medio dio como resultado un complejo muy estable con disociación insignificativa. Para cada muestra nueva de FX, la superficie RAM Fc se regeneró en forma reproducible para experimentos de emparedado múltiple. La diferencia en RU entre el canal 4 con RAM Fc acoplado y el canal 3 con una superficie limpia, se utilizó para cuantífícar el enlace de 5 µl FX. Se corrió un estándar (2, 4, 6, 8, 10, 15 y 20 µg/ml en el medio) de pdFX procedente de Haematologic Technologies Inc. (Vermont, EUA) y la diferencia en RU se trazó contra la concentración de phFX y la ecuación de un sitio de enlace se ajustó a los datos. La diferencia en RU de las muestras no conocidas se utilizó para calcular la concentración de rhFX de la curva estándar. Tabla 6. Distribución de rhFX completamente activo producido. La cantidad total de rhFX se estimó a partir de muestras de cultivo de sebo artificial de cuchara utilizando un ensayo Biacore y se estimó la cantidad de rhFX activo mediante ensayo RVV-X. Todas las muestras son de cultivos de sebo artificial de cuchara en un medio de crecimiento libre de componentes animales.

Los resultados en la Tabla 6 indican que la expresión conjunta de VKOR mejora la expresión de rhFX completamente activo. La distribución superior (43-103%) del rhFX completamente activo está de acuerdo con los datos de SDS-PAGE, manchado Western y purificación de proteína. Ejemplo 3 Expresión conjunta de protrombina humana, GGCX y VKOR Para tener una línea celular con la capacidad de producir mayores niveles de protrombina humana completamente activa (hFII), se han expresado en forma conjunta anteriormente la carboxilasa de ?-glutamilo de enzima de modificación dependiente de vitamina K (GGCX) y hFII. Utilizando esta estrategia hemos obtenido el clon P1E2. P1E2 es un clon altamente productivo que expresa rhFII, pero, aunque la expresión de rhFII modificado correctamente está ampliamente mejorada en comparación con otros clones que producen Fll, aún solamente de 20 y 60%, (dependiendo de las condiciones de cultivo) de la cantidad total de este rhFII producido está completamente ?-carboxilada. En un intento para mejorar en forma adicional el nivel de rhFII ?-carboxilado completamente y por lo tanto disminuye los costos de producción de rhFII, se ha probado una nueva estrategia de expresión utilizando epóxido reductasa de vitamina K (VKOR). Hemos clonado VKOR en dos diferentes vectores bajo el control de dos diferentes promotores; pCMV en el vector pHygro y pSV40 en el vector pZeo. En las células-CHO, el promotor pCMV se estima que tiene una actividad promotora ~6x mayor que el promotor pSV40. Ambas construcciones se utilizaron en dos co-transfecciones separadas para obtener líneas celulares de producción rhFII. Desarrollo v estimados de productividad de línea celular Se inicio el desarrollo de línea celular transfectando un conjunto CHO-S con la construcción PP6 (que codifica h F 11 y hGGCX) (SEQ ID NO: 20) y cualquiera de las construcciones VKOR (Figura 1-2). Las proporciones molar utilizadas en las transfecciones fueron 2:3 (PP6:VKOR). Después de sembrar y seleccionar los transfectantes en placas de 96 depósitos, se clasificaron totalmente clones 5500-8500 por transfección utilizando un ensayo cromogénico a base de ecarina. Se seleccionaron 18 conjuntos de clones después de la clasificación inicial. Después de la segunda clasificación se seleccionaron 9 conjuntos de clones, se expandieron y sometieron a un tercer ensayo de clasificación. Para cada transfección el mejor conjunto de clones de producción se seleccionó para una dilución limitante. Se sembraron seis placas de 96 depósitos con 0.5 células/depósito. Se seleccionaron 24 clones y se escalaron después de la clasificación. Ya que los vectores que codifican VKOR no han sido seleccionados, se realizaron análisis Taqman para verificar la expresión VKOR. En los tres clones superiores seleccionados; A3F4 (PP6/pZeoVKOR), B11E8 y B9A12 (PP6/pHygro VKOR), VKOR s detectó ARNm. Se realizaron cuatro corridas de experimentos de sebo artificial de cuchara para evaluar y comparar la productividad de rhFII para los clones PP6/VKOR en comparación con el clon P1E2. Tabla 7. Producción de rhFII en frascos de sebo artificial de cuchara.

El método novedoso para expresar en conjunto VKOR, GGCX y rhFII dio como resultado varios clones que expresan rhFII que producen una distribución mucho mayor (60-100%) de rhFII completamente activo en comparación con el clon P1E2 (20-60%, ver tabla 1). Para dos de los clones, B11E8 y B9A12 (ambos cotransfección PP6/pHigro VKOR) se obtuvo un rango de productividad específica mayor (cantidad de proteína activa producida por célula y día, SPR) que el clon P1E2 bajo ciertas condiciones de cultivo. El clon A3F4 produjo 100% de rhFII completamente carboxilado en todas las corridas de experimento de cultivo. Este clon tiene la proporción de ARNm más alta de ambas enzimas de modificación (GGCX y VKOR) para Fll en comparación con los otros dos clones. Sin embargo, A3F4 no produce rhFII más completamente activo que los otros clones. Ejemplo 4 ?-carboxilación mejorada mediante supertransfección con VKOR En un segundo intento de utilizar VKOR para mejorar la producción rhFII, se modificó el clon P1E2 (ejemplo 3) para expresar en conjunto VKOR. La construcción pHygroVKOR (SEQ ID NO: 22) fue en este caso utilizada para transfectar P1E2 (ver Apéndice, figura 1) y los clones se clasificaron con respecto a la productividad mejorada a través de un ensayo de actividad de protrombinasa. Se clasificaron totalmente clones 7000-8000 utilizando un ensayo de protrombinasa de punto de extremo adaptado a un formato de 96 depósitos. Se seleccionaron seis grupos de clones después de la clasificación inicial. Se expandieron conjuntos de clones elegidos y se clasificaron ambos con ensayos de ecarina y protrombinasa con el objeto de estimar la distribución de rhFM activo. Después de esta clasificación, se seleccionaron 6 conjuntos de clones y se expandieron. Los tres mejores conjuntos de clones de producción se seleccionaron con respecto a clonación de dilución limitante. Se seleccionaron veintiocho clones que se originan de los tres conjuntos y se escalaron después de la clasificación inicial de protrombinasa. Después de una segunda clasificación, se seleccionaron ocho clones y se escalaron. Se realizaron análisis Taqman para verificar la expresión VKOR en un clon procedente de cada conjunto clonado. En los tres clones superiores seleccionados; M3F6, P4A4 y O3G3, se detectó VKOR ARNm. Se realizaron tres corridas de agitación o cultivos de sebo artificial de cuchara para evaluar la productividad de rhFII para los clones P1E2/VKOR en comparación con el clon P1E2 de origen. Los análisis Taqman se realizaron para verificar la expresión VKOR en un clon de cada conjunto clonado. Los tres clones superiores seleccionados; M3F6, P4A4 y O3G3, se detectó ARNm VKOR. Debido a la selección y procedimientos de clasificación utilizados para obtener estos clones, se considera que expresan un nivel óptimo de expresión VKOR. Este nivel de expresión óptima está caracterizado en forma adicional en el Ejemplo 5. Tabla 8. Producción de rhFII en productividad pico en cultivos de sebo artificial de cuchara /agitador utilizando el medio libre de componentes animales.

La línea de célula de origen P1E2 que no contiene la construcción VKOR se creció en paralelo bajo las mismas condiciones que un control.

Los resultados de los experimentos de cultivo mostraron que la cantidad y distribución de rhFII activo durante diferentes condiciones de cultivo variaron, aunque para la mayoría de la corridas la cantidad de rhFII completamente activo producido fue mejor en los clones P1E2/VKOR novedosos que en la línea de célula P1E2 original. Ejemplo 5 Establecimiento de proporciones de expresión de ARNm óptimas Se analizó el ARN mensajero preparado a partir de las líneas celulares del Ejemplo 4 y 5 con una similitud PCR de Tiempo Real como en el Ejemplo 3. Para GGCX y VKOR se utilizaron los mismos oligonucleótidos que en el Ejemplo 3. Oligonucleótidos para protrombina fueron: 5'TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3' Cebador directo (SEC ID NO: 17) 5' CATCCGAGCCCTCCACAA 3' Cebador inverso (SEC ID NO: 18) 5' CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3' Sonda (SEC ID NO: 19) Tabla 9. Análisis de proporciones de ARNm en la expresión pico de protrombina humana (rhFII).

*Medida de productividad realizada bajo condiciones similares en frascos de cultivo de sebo artificial de cuchara o agitación.

Los resultados de la Tabla 9 indican que existe un nivel de expresión óptimo de GGCX y VKOR en relación con la proteína ?-carboxilada producida. Se obtuvieron los clones M3F4, O3G3 y P4A4 transfectando P1E2 (obtenido anteriormente mediante transfección con una construcción que contiene rhFII + GGCX) con una construcción que contiene VKOR bajo el control del promotor CMV fuerte. La clasificación se llevó a cabo con un ensayo que detecta en forma específica clones con una productividad mejorada de rhFII completamente activo. Los clones con un nivel de expresión óptima de VKOR en relación con rhFII y GGCX han sido seleccionados. El ARN mensajero preparado a partir de las líneas celulares del Ejemplo 4 y 5 se analizó con similitud de PCR de Tiempo Real como en el Ejemplo 3. Todos los análisis incluyeron una reacción de control GAPDH como en el Ejemplo 3.

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES 1. Una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control de expresión asociadas, y un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas, en donde la célula huésped comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una carboxilasa ?-glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas.
2. 2. La célula huésped tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control de expresión asociadas comprende un primer promotor, y la molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas comprende un segundo promotor, y en donde el primer promotor es lo suficientemente más fuerte que el segundo promotor de que la proteína que requiere gama-carboxilación y la epoxidoreductasa de vitamina K se expresan en una proporción de al menos 10:1.
3. 3. La célula huésped tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizada porque el primer promotor es los suficientemente más fuerte que el segundo promotor de modo que la proteína que requiere gama-carboxilacíón y la epoxidoreductasa de vitamina K se expresa en una proporción de al menos 5:1.
4. 4. La célula huésped tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizada porque el primer promotor es un promotor temprano-inmediato de citomegalovirus humano (hCMV) y el segundo promotor es un promotor temprano SV40.
5. 5. La célula huésped tal como se describe con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico que codifica una carboxilasa ?-glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas comprende además un tercer promotor, en donde el primer promotor es lo suficientemente más fuerte que el tercer promotor de modo que la proteína que requiere gama-carboxilación y la carboxilasa ?-glutam¡lo se expresa en una proporción de al menos 10:1.
6. 6. La célula huésped tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque el primer promotor es lo suficientemente más fuerte que el tercer promotor de modo que la proteína que requiere gama-carboxilación y la carboxilasa y-glutamilo se expresa en una proporción de al menos 5:1.
7. 7. La célula huésped tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizada porque el tercer promotor es un promotor temprano SV40.
8. 8. La célula huésped tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína que requiere gama-carboxilación y la molécula de ácido nucleico que codifica carboxilasa ?-glutamilo se localiza dentro de un vector de expresión simple.
9. 9. La célula huésped tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación, la molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y la molécula de ácido nucleico que codifica la carboxilasa ?-glutamilo se localizan dentro de un vector de expresión simple.
10. 10. Una célula que está construida para expresar (i) una proteína que requiere gama-carboxilación, e (ii) epoxidoreductasa vitamina K, en donde las proteínas (i) y (ii) se expresan en una proporción entre 10:1 y 500:1.
11. 11. Una célula tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizada porque las proteínas (i) e (ii) expresan una proporción de entre 5:1 y 500:1.
12. 12. Una célula tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la proteína que requiere gama-carboxilación es seleccionada del grupo que consiste de: factor de coagulación Vil, FVII de coagulación, factor de coagulación IX, FIX de coagulación, protrombina, factor de coagulación II, Fll de coagulación, factor de coagulación X, FX de coagulación, y sus formas activadas FVIIa, FlXa, Fxa, proteasa de veneno de serpiente similar a factores de coagulación tales como proteasas de veneno de serpiente tipo Factor X y proteína tipo Acanthophiinae FXa, Proteína C, Proteína S, Proteína Z, Proteína Gla de hueso, Proteína Gla de matriz, Proteína específica de detención de crecimiento 6.
13. 13. Una célula tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizada porque la proteína que requiere gama-carboxilación es un factor de coagulación dependiente de vitamina K.
14. 14. Una célula tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizada porque la proteína que requiere gama-carboxilación es un Factor IX.
15. 15. Una célula tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizada porque la proteína que requiere gama-carboxilación es Factor X.
16. 16. Una célula tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizada porque la proteína que requiere gama-carboxilación es proteasa de veneno de serpiente tipo Factor X.
17. 17. Una célula tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizada porque la proteína que requiere gama-carboxilación es protrombina.
18. 18. Una célula tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, caracterizada porque la proteína que requiere gama-carboxilación es un Factor Vil.
19. 19. Una célula tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la célula es una célula de mamífero.
20. 20. Una célula huésped eucariótica genéticamente modificada que comprende: (i) un polinucleótido que codifica una proteína de epoxidoreductasa de vitamina K en donde la secuencia que codifica la proteína de epoxidoreductasa de vitamina K está enlazada en forma operable a las secuencias de control de expresión que permiten la expresión de la proteína de epoxidoreductasa de vitamina K a través de dicha célula; (¡i) un polinucleótido que codifica una proteína que requiere carboxilación a través de la proteína de carboxilasa y-glutamilo enlazado en forma operable a secuencias de control de expresión que permiten la expresión de la proteína que requiere carboxilación a través de la célula; y (iii) un polinucleótido que codifica carboxilasa de y-glutamilo.
21. 21. Una célula huésped eucariótica modificada en forma genética tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizada porque la célula tiene la capacidad de expresar la proteína de epoxidoreductasa de vitamina K y la proteína que requiere carboxilación en una proporción de al menos 1:5.
22. 22. Una célula huésped eucariótica genéticamente modificada tal como se describe en la reivindicación 20 ó 21, caracterizada porque comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica la carboxilasa ?-glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas.
23. 23. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere garríacarboxilación y secuencias de control de expresión asociadas y una molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas.
24. 24. Un vector tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque: la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que requiere gama-carboxilación y secuencias de control de expresión asociadas comprenden el primer promotor, y la molécula de ácido nucleico que codifica una epoxidoreductasa de vitamina K y secuencias de control de expresión asociadas comprende un segundo promotor, en donde el primer promotor es lo suficientemente más fuerte que el segundo promotor de modo que la proteína que requiere gama-carboxilación y la epoxidoreductasa de vitamina K se expresa en una proporción de 5:1.
25. 25. Un vector tal como se describe en la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque el primer promotor es promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (hCMV) y el segundo promotor es promotor temprano SV40.
26. 26. Un vector tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 23 a la 25, caracterizado porque comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una carboxilasa de ?-glutamilo y secuencias de expresión de control asociadas.
27. 27. Un vector tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico que codifica una carboxilasa de ?-glutamilo y secuencias de control de expresión asociadas comprenden además un tercer promotor, en donde el primer promotor es lo suficientemente más fuerte que el tercer promotor de modo que la proteína que requiere gama-carboxilación y la carboxilasa ?-glutamilo son expresadas en una proporción de al menos 5:1.
28. 28. Un vector tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizado porque el tercer promotor es promotor temprano SV40.
29. 29. Un vector tal como se describe en la reivindicación de la 23 a la 28, caracterizado porque la proteína que requiere gama-carboxilación es seleccionada del grupo que consiste en: factor de coagulación Vil, FVII de coagulación, factor de coagulación IX, FIX de coagulación, protrombina, factor de coagulación II, Fll de coagulación, factor de coagulación X, FX de coagulación, y sus formas activadas FVIIa, FlXa, Fxa, proteasa de veneno de serpiente similar a Factor X Proteína C, Proteína S, Proteína Z, Proteína Gla de hueso, Proteína Gla de matriz, Proteína específica de detención de crecimiento 6.
30. 30. Un método para producir una proteína gama-carboxilada que comprende: (i) cultivar una célula que expresa una proteína recombinante que requiere gama-carboxilación y epoxidoreductasa de vitamina K y una carboxilasa ?-glutamilo y (ii) aislar la proteína gama carboxilada.
31. 31. Un método tal como se describe en la reivindicación 30, caracterizada porque la célula está expresando una proteína que requiere gama-carboxilación y epoxidoreductasa de vitamina K en una proporción de al menos 10:1, bajo condiciones adecuadas para expresión de ambas proteínas.
32. 32. Un método para producir una composición farmacéutica adecuada para inducir coagulación sanguínea o promover coagulación incrementada o disminuida, en donde el método comprende purificar la proteína carboxilada activa producida tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 30 ó 31, y mezclar en adiciones la proteína carboxilada purificada con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.