JP5461008B2 - ベクター - Google Patents

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Description

本発明は、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列群、ならびにビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列群、ならびにγ−グルタミルカルボキシラーゼ（をコードする核酸分子）および関連するコントロール配列群、を包含する発現ベクターを包含するホスト細胞に関する。本発明はさらに、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質を高収量で製造する方法に関する。
出血は一般的な臨床上の問題である。出血は、疾患、外傷、外科手術および医学的治療の１つの結果である。出血を物理的に停止させることは不可避である。このことは出血の位置によって、または出血が多くの（小さな）血管から起こるという理由で、困難または不可能とさえなり得る。したがって出血している患者は、止血をサポートする薬剤による治療を必要とする可能性がある。このような薬剤は、血液由来産物（血液療法）、内在する止血物質の放出を引き起こす薬剤、リコンビナント凝固因子（Ｆ）、または血餅の溶解を遅延させる薬剤であってよい。
血液由来産物の中で、しばしば地方病院で使用される一次治療に用いられるのは、容量補充および止血のサポートのための全血、酸素輸送能力の改善のための濃縮赤血球、血小板の数（低いまたは欠損のある場合）を増加させるための血小板濃縮液、ならびに止血のサポート（血液凝固および血小板凝集）のための新鮮凍結血漿である。止血をサポートする二次治療の血漿由来産物は、血漿クリオプレシピテート、プロトロンビン複合体濃縮液、活性化プロトロンビン複合体濃縮液、および精製凝固因子である。いくつかの凝固因子が、不活性（凝固因子ＶＩＩＩおよびＩＸ）および活性型（凝固因子ＶＩＩａ）のヒトリコンビナントタンパク質として今日入手可能である。
血友病は、異常もしくは欠損のいずれかのある凝結因子、または凝結原機能を阻害する凝固因子に対する抗体を伴う、遺伝性または後天性の出血障害である。最も一般的な血友病は、血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩの欠乏）および血友病Ｂ（因子ＩＸの欠乏）である。精製されたまたはリコンビナントの単一の凝固因子が、血友病患者の主な治療薬である。阻害抗体を有する患者はその抗体が、患者に投与される凝固因子もまた中和してしまうと思われるため、治療上の問題を有する。
活性型プロテインＣ（ＡＰＣ）は、活性型凝固因子ＶａおよびＶＩＩＩａを分解することによる血漿凝固阻害薬である。リコンビナントＡＰＣは、敗血症の患者における過度の血漿凝固の有効な治療薬であることが示されている。
治療に使用するための凝固因子は、ヒト血漿より得ることができる。しかしながら精製過程は簡単ではなく、そのいくつかのステップは混入するウイルスを排除することを目的とする、多くのステップを必要とする。しかし血液由来産生物の過剰な安全性の測定および試験を持ってしてもなお、感染性ウイルスまたはプリオンの混入は除外できない。このリスク故、動物由来成分を含まない培地で成長させたリコンビナント細胞由来のヒト治療用タンパク質を製造することは、非常に望ましい。タンパク質が完全に機能的な形で産生されるために、すなわち翻訳後に正しく修飾されるためには哺乳類のホストを必要とするタンパク質が多いので、この方法は常に単刀直入とは限らない。凝固因子の中で、リコンビナント細胞内で商業的に製造されているのは、ＦＶＩＩ(NovoSeven)、ＦＶＩＩＩ(Kogenate, Recombinate, Refacto)、およびＦＶＸ(BeneFix)、(Roddie and Ludlam. Blood Rev. 11:169 - 177, 1997)ならびに活性化プロテインＣ(Xigris)である。大量の完全に機能的なリコンビナントヒト凝固因子を得る上での主な障壁の１つは、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、プロテインＳおよびプロテインＣ中に存在するＧｌａ−ドメインにある。このドメインは、カルボキシル基の付加により翻訳後修飾されるグルタミン酸残基を含有する。これらの因子の産生は、それらの過剰発現が低カルボキシル化タンパク質、そしてこれ故不活性なタンパク質を結果的に得ることになるという事実により妨げられている。Ｇｌａ修飾は、γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＧＧＣＸ）と呼ばれるビタミンＫ依存性酵素の作用の結果である。この酵素は、多くの科学者により、特に凝固因子の研究に携わる科学者により広範に研究されてきた。(WO-A-8803926; Wu et al. Science 254(5038):1634-1636, 1991; Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:4611-4615, 1993; Stanley J. Biol. Chem. 274(24):16940-16944, 1999; Vo et al., FEBS letters 445:256-260, 1999; Begley et al., The Journal of Biological Chemistry 275(46):36245-36249, 2000; Walker et al., The Journal of Biological Chemistry 276(11):7769-7774, 2001; Bandyopadhyay, et al. Proc Natl Acad Sci USA 99(3):1264-1269, 2002; Czerwiec et al., Eur J Biochem 269:6162-6172, 2002; Hallgren et al., Biochemistry 41(50):15045-15055, 2002; Harvey et al., The Journal of Biological Chemistry 278(10):8363-8369, 2003)。ＧＧＣＸを、凝固因子ＦＩＸと共に共発現させる試みは、少なくとも２つの科学者グループにより試みられたが、成功しなかった(Rehemtulla, et al. 1993, 前出; Hallgren et al. 2002, 前出)。ＧＧＣＸ酵素への多大な関心を考慮すれば、多くのさらなる試みが失敗に帰し、そのため報告されなかったと仮定してよいだろう。ＧＧＣＸは、補助因子として還元型ビタミンＫを必要とする。還元型ビタミンＫは、ＧＧＣＸによりビタミンＫエポキシドに変換され、これはビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）により還元型ビタミンＫにリサイクルされる。したがってタンパク質の効率的なビタミンＫ依存性カルボキシル化のためには、２つの酵素、すなわちＧＧＣＸおよびＶＫＯＲが必要である。ＶＫＯＲのクローニングおよび同定は、２００４年(Li et al., Nature 427:541-543, 2004, Rost et al., Nature 427:537-541, 2004)に報告された。ＶＫＯＲタンパク質は、少なくとも１つの予想される膜貫通領域を有する１６３アミノ酸のポリペプチドである。ＶＫＯＲ活性を発現するリコンビナント細胞によれば、活性は細胞内ミクロソーム画分に局在する。
ヒトＦＩＩ（プロトロンビン）に関して、１０のＧｌｕ残基の少なくとも８残基は、完全に機能的なプロトロンビンを得るために正しく修飾されなければならない(Malhotra, et al., J. Biol. Chem. 260:279-287, 1985; Seegers and Walz 'Prothrombin and other vitamin K proteins', CRC Press, 1986)。同様にヒト凝固因子ＩＸの凝固活性は、Ｇｌａ−ドメイン中の１２のグルタミン酸残基のうちの少なくとも１０残基のγ−カルボキシル化を必要とする。(White et al, Thromb. Haemost. 78:261-265, 1997)。ｒｈＦＩＩの高い産生レベルを得るための広範な努力が、いくつかの異なる系、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、およびワクシニアウイルスの発現系を用いてなされてきたが、すべて失敗、または低カルボキシル化産生物、したがって機能的に不活性なプロトロンビンを得るに至った(JOrgensen et al., J. Biol. Chem. 262:6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233, 1991; Fischer et al., J Biotechnol 38(2):129-136, 1995; Herlitschka et al. Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif. 10:214-225, 1997; Vo et al. 1999, 前出; Wu and Suttie Thromb Res 96(2):91-98, 1999)。より早期に報告されたカルボキシル化リコンビナントヒトプロトロンビンに関する生産性は低い；変異プロトロンビンに関しては２０ｍｇ/Ｌ(COte et al., J. Biol. Chem 269:11374-11380, 1994)；ＣＨＯ細胞において発現させたヒトプロトロンビンに関しては０．５５ｍｇ/Ｌ（完全にカルボキシル化されたもの、JOrgensen et al. 1987, 前出）、ＣＨＯ細胞において２５ｍｇ/Ｌ（カルボキシル化の程度は示されていない、Russo et al. 1997, 前出）。
知られている限り、γ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびＶＫＯＲの共発現は、これまでに報告されていない。
ＷＯ ９２/１９６３６は、ヒトおよびウシのビタミンＫ依存性カルボキシラーゼのクローニングおよび配列同定を開示している。この出願は、ビタミンＫ依存性タンパク質を調製するため、適切なホスト細胞におけるビタミンＫ依存性カルボキシラーゼおよびビタミンＫ依存性タンパク質の共発現を示唆している。カルボキシラーゼおよびビタミンＫ依存性タンパク質の共発現は例証されていない。
ＷＯ ９２/１９６３６は、ヒトおよびウシのビタミンＫ依存性カルボキシラーゼのクローニングおよび配列同定を開示している。この出願は、ビタミンＫ依存性タンパク質を調製するため、適切なホスト細胞におけるビタミンＫ依存性カルボキシラーゼ（ＧＧＣＸ）およびビタミンＫ依存性タンパク質の共発現を示唆している。カルボキシラーゼおよびビタミンＫ依存性タンパク質の共発現は例証されていない。
ＷＯ ２００５/０３８０１９は、γ−カルボキシル化タンパク質およびＧＧＣＸのコントロールされた共発現により、γ−カルボキル化タンパク質の全生産性を増加させる方法を特許請求している。この発明は、凝固因子ＩＩおよびＦＩＸの改善された生産性により例証されている。
ＷＯ ２００５/０３００３９は、γ−カルボキシル化を改善するため、ビタミンＫ依存性タンパク質の、ビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）との共発現を示唆している。しかしながらそのような共発現は例証されていない。
凝固因子Ｘ（ＦＸ）およびＶＫＯＲの共発現は、γ−カルボキシル化タンパク質の占有率を改善することが、Sun ら (Blood 106: 3811-3815, 2005) により示された。 Wajih ら (JBC 280: 31603-31607, 2005)は、ＶＫＯＲとの共発現によるγ−カルボキシル化凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）の改善された占有率を付加的に実証した。双方の公開文献とも、ＶＫＯＲがγ−カルボキシル化タンパク質の占有率を増加すると報告したが、ＶＫＯＲの共発現は、凝固因子の全体の生産性は改善しなかった。
活性化された血液凝固因子を高収量で製造する改善された方法が必要とされている。本発明は、この必要性への取り組みについて述べる。
発明の概要
本発明の第１の側面に従って、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、ならびにビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、を包含するホスト細胞であって、ここでホスト細胞がさらにガンマ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する、前記ホスト細胞を提供する。
もう１つの側面において、（ｉ）ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質、および（ｉｉ）ビタミンＫエポキシド還元酵素、を発現するように操作されている細胞であって、ここでタンパク質（ｉ）および（ｉｉ）が１０：１および５００：１の間の比率で発現される、前記細胞を提供する。
さらなる側面に従って、遺伝子修飾された真核ホスト細胞であって、以下：（ｉ）ビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで前記ビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質をコードする配列が、前記細胞によるビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に、作動可能なように連結されている前記ポリヌクレオチド；（ｉｉ）前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に作動可能なように連結された、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および（ｉｉｉ）ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、を包含する前記ホスト細胞を提供する。
なおもう１つの側面に従って、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、ならびにビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、を包含するベクターを提供する。
もう１つの側面に従って、以下：（ｉ）ガンマ−カルボキシル化を必要とするリコンビナントタンパク質、ビタミンＫエポキシド還元酵素、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを発現する細胞を培養すること、および（ｉｉ）ガンマ−カルボキシル化タンパク質を単離すること、を包含するガンマ−カルボキシル化タンパク質を製造するための方法を提供する。
もう１つの側面に従って、上の方法に従って製造された活性なカルボキシル化タンパク質を精製し、そして精製されたカルボキシル化タンパク質を１つまたはそれより多くの医薬的に受容可能な担体または賦形剤と共に混合することを包含する、血液凝固を誘発する、または増大もしくは低減された凝固を促進するために適する医薬組成物を製造する方法を提供する。
さらなる側面に従って上の方法により得られた、単離されたガンマ−カルボキシル化タンパク質の薬理学的有効量を、それを必要とする患者に投与することを包含する、被験者における増大または低減された凝固を促進する方法を提供する。
本発明の方法により製造されたガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質は、止血療法または抗凝固 (antithrombothic)療法において使用することができる。
発明の詳細な説明
本発明の第１の側面に従って、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、ならびにビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、を包含するホスト細胞であって、ここでホスト細胞がさらにγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する、前記ホスト細胞を提供する。
１つの態様において、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列は、第１のプロモーターを包含し、そしてビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列は、第２のプロモーターを包含する。もう１つの態様において、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびビタミンＫエポキシド還元酵素が、少なくとも１０：１の比率で発現されるように、第１のプロモーターは第２のプロモーターより十分に強い。もう１つの態様において、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびビタミンＫエポキシド還元酵素が、少なくとも５：１の比率で発現されるように、第１のプロモーターは第２のプロモーターより十分に強い。
もう１つの態様において、細胞はさらにγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する。１つの態様において、γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列は、さらに第３のプロモーターを包含し、ここでガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼが、少なくとも１０：１の比率で発現されるように、第１のプロモーターは第３のプロモーターより十分に強い。もう１つの態様において、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびビタミンＫエポキシド還元酵素が、少なくとも５：１の比率で発現されるように、第１のプロモーターは第２のプロモーターより十分に強い。
第１のプロモーターはヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）即時型初期プロモーターであることができ、そして第２および第３のプロモーターはＳＶ４０初期プロモーターであることができる。
１つの特定の態様において、ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸配列および関連する発現コントロール配列、ならびにビタミンＫエポキシド還元酵素、および所望によりγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子、および関連する発現コントロール配列は、同じ発現ベクター上に位置する。もう１つの態様において、これら２つまたは所望により３つの核酸分子は、２つまたはそれより多くの別個の発現ベクター上に位置する。
もう１つの側面において、（ｉ）ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質、および（ｉｉ）ビタミンＫエポキシド還元酵素、を発現するように操作されている細胞であって、ここでタンパク質（ｉ）および（ｉｉ）が１０：１および５００：１の間の比率で発現される、前記細胞を提供する。もう１つの態様において、タンパク質（ｉ）および（ｉｉ）は５：１および５００：１の間の比率で発現される。
ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質は、以下：凝固因子ＶＩＩ、凝固ＦＶＩＩ、凝固因子ＩＸ、凝固ＦＩＸ、プロトロンビン、凝固因子ＩＩ、凝固ＦＩＩ、凝固因子Ｘ、凝固ＦＸ、およびその活性型であるＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質、マトリクスＧｌａタンパク質、増殖抑制特異的タンパク質(Growth arrest-specific protein)６、凝固因子に類似する蛇毒プロテアーゼ 例えば第Ｘ因子様蛇毒プロテアーゼおよびAcanthophiinae ＦＸａ様タンパク質、から成る群より選択される。
１つの態様においてガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質は、ビタミンＫ依存性凝固因子である。もう１つの態様においてガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質は、第ＩＸ因子である。第３の態様においてガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質は、プロトロンビンである。第４の態様においてガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質は、第Ｘ因子である。第５の態様においてガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質は、第ＶＩＩ因子である。
ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質は、好ましくはヒトタンパク質であるが、すべての真核細胞のタンパク質は本発明により包括的に含まれる。ビタミンＫエポキシド還元酵素は、好ましくはヒトタンパク質であるが、すべての真核細胞のビタミンＫエポキシド還元酵素を本発明において使用することができる。γ−グルタミルカルボキシラーゼは、好ましくはヒトタンパク質であるが、すべての真核細胞のγ−グルタミルカルボキシラーゼを本発明において使用することができる。
さらなる側面に従って、遺伝子修飾された真核ホスト細胞であって、以下：
（ｉ）ビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで前記ビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質をコードする配列が、前記細胞によるビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に、作動可能なように連結されている前記ポリヌクレオチド；および
（ｉｉ）前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に作動可能なように連結された、γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、ここで前記ガンマ-グルタミルカルボキシラーゼタンパク質をコードする配列が、前記細胞によるガンマ-グルタミルカルボキシラーゼタンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に、作動可能なように連結されている前記ポリヌクレオチド、
を包含する前記ホスト細胞を提供する。
１つの態様において当該細胞は、ビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質、およびカルボキシル化を必要とするタンパク質を、少なくとも１：１０の比率で発現する能力がある。もう１つの態様において、前記比率は少なくとも１：５である。
ホスト細胞は好ましくは真核細胞である。典型的なホスト細胞は、昆虫細胞、酵母菌細胞、哺乳類細胞を含むがこれに限定されない。哺乳類細胞が特に好ましい。適切な哺乳類細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＮＳ０、２９３、Ｐｅｒ Ｃ．６、ＢＨＫ、およびＣＯＳの細胞、およびその誘導体を含むがこれに限定されない。１つの態様においてホスト細胞は、哺乳類細胞株のＣＨＯ-Ｓである。
なおもう１つの側面に従って、ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、ならびにビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、を包含するベクターを提供する。１つの態様において、ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列は、第１のプロモーターを包含し、そしてビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列は、第２のプロモーターを包含する。ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびビタミンＫエポキシド還元酵素が、少なくとも１０：１の比率で発現されるように、第１のプロモーターは第２のプロモーターより十分に強いことができる。もう１つの態様においてこの比率は５：１である。ベクターはまた、γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含することができた。γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列は、第３のプロモーターを包含することができ、ここでガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼが、少なくとも１０：１の比率で発現されるように、第１のプロモーターは第３のプロモーターより十分に強い。もう１つの態様においてこの比率は５：１である。ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質は、以下：凝固因子ＶＩＩ、凝固ＦＶＩＩ、凝固因子ＩＸ、凝固ＦＩＸ、プロトロンビン、凝固因子ＩＩ、凝固ＦＩＩ、凝固因子Ｘ、凝固ＦＸ、およびそれらの活性型のＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、凝固因子に類似する蛇毒プロテアーゼ 例えば第Ｘ因子様蛇毒プロテアーゼおよびAcanthophiinae ＦＸａ様タンパク質、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質、マトリクスＧｌａタンパク質、増殖抑制特異的タンパク質６、から成る群より選択することができる。
もう１つの側面に従って、以下：（ｉ）ガンマ−カルボキシル化を必要とするリコンビナントタンパク質、ビタミンＫエポキシド還元酵素、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを発現する細胞を培養すること、ならびに（ｉｉ）ガンマ−カルボキシル化タンパク質を単離すること、を包含するガンマ−カルボキシル化タンパク質を製造するための方法を提供する。
前記細胞は、ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質およびビタミンＫエポキシド還元酵素を、双方のタンパク質の発現に適する条件下で、少なくとも１０：１の比率で発現する。
ＶＫＯＲのみとの共発現、またはＧＧＣＸを組み合わせての共発現という本発明の方法により製造されるビタミンＫ依存性凝固因子（ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、およびその活性型であるＦＩＩａまたはトロンビン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ）は、外傷後出血、肝臓、腎臓、血小板または血液凝固因子の疾患の予防または治療（血液療法）において有用であると期待できる。同様に凝固因子プロテインＣおよびその活性型ＡＰＣは、プロテインＣの減少したレベルを伴う場合も伴わない場合も、増加した凝固の障害の予防および治療に有用であると期待できる。この方法はまた、翻訳後カルボキシル化を必要とするその他のタンパク質にも適用できる。
本発明は、γ−カルボキシル化に依存するあらゆるタンパク質の生産性を改善するために適用でき、そのようなタンパク質として：プロトロンビン、凝固因子ＩＩ（ＦＩＩ）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）、凝固因子Ｘ（ＦＸ）、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、骨Ｇｌａタンパク質（ＢＧＰまたはオステオカルシンとしても知られている）、マトリクスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、プロリンリッチＧｌａポリペプチド１（ＰＲＲＧ１）、プロリンリッチＧｌａポリペプチド２（ＰＲＲＧ２）、増殖抑制特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）、を含むがこれに限定されない。その他の適切なタンパク質は：コブラ（Acanthophiinae亜科）、およびイモガイ(Conus textile)の毒中のＦＸａ様タンパク質である。
これらの各タンパク質は、それらの核酸配列およびアミノ酸配列を含め、周知である。表１は、本発明において使用することのできる多様なタンパク質の野生型および変異型の代表的配列を示す。
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本発明は共発現するために、特定のタンパク質、またはこれらのタンパク質の１つの配列をコードするタンパク質に限定されないことは理解されるであろう。さらにそして特に血液凝固因子に関して、タンパク質の多数の変異型が当該技術において開示されてきた。本発明は、天然に発生する対立形質バリアントを含むタンパク質のこれらの変異型に対しても、野生型配列に対するように等しく適用できる。１つの態様において本発明は、あらゆる野生型タンパク質、または野生型と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列の同一性を有するものを用いて行うことができる。
２つの配列間の配列の同一性は、プログラム、例えばBestFit、GapまたはFrameAlignを用いて、ペアワイズアラインメントコンピュータ分析により決定することができる。より好ましいアラインメントツールは、BestFitである。実際に、配列データベースの範囲内からクエリー検索に対する類似/同一の配列について検索する場合、適切なソフトウェア、例えばBlast、Blast2、NCBI Blast2、WashU Blast2、FastA、Fasta3 および PILEUP、ならびにスコアリングマトリクス、例えばBlosum 62を用いて、類似する配列の最初の同定を行うことが、一般に必要である。そのようなパッケージソフトウェアは、Smith-Watermanの“ゴールドスタンダード”アラインメントアルゴリズムに近接して近似するように努めている。したがって、類似性、すなわち２つのポリペプチド一次配列がどのように並んでいるかを評価する上で使用するための、より好ましいソフトウェア/検索エンジンプログラムはSmith-Watermanである。同一性は、直接マッチすることを言い、類似性は保存的置換を認める。
ビタミンＫエポキシド還元酵素または“ＶＫＯＲ”という用語は、本明細書において使用する場合、ビタミンＫエポキシドおよびビタミンＫの還元を触媒して、還元型ビタミンＫを形成する酵素をいう。
ビタミンＫ還元酵素は広く分布しており、いくつかの異なる種、例えばマウス（Mus musculus）、ラット（Rattus norveigicus）、ニワトリ（Gallus gallus）、およびウシ（Bos taurus）からクローン化されている。相同のタンパク質は、広く分散した系統発生起源、例えば哺乳動物、鳥類、両生類、硬骨魚類、ハエ類、キネトプラスト類、および細菌類という有機体に由来する配列から予測することができる。表２は、本発明において使用できるヒトＶＫＯＲとの相同性の予測されるタンパク質の代表的配列の非限定的リスト（種の起源に従って並べてある）を示す。
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“γ−グルタミルカルボキシラーゼ”または“ＧＧＣＸ”という用語は、本明細書において使用する場合、グルタミン酸残基のカルボキシル化を触媒するビタミンＫ依存性酵素を言う。
ＧＧＣＸ酵素は広く分布しており、多くの異なる種、例えばシロイルカ (Delphinapterus leucas)、フグ(Opsanus tau)、ニワトリ(Gallus gallus)、メクラウナギ(Myxine glutinosa)、カブトガニ(Limulus polyphemus)、およびイモガイ(Conus textile)(Begley et al., 2000, 前出; Bandyopadhyay et al. 2002, 前出)からクローン化されている。イモガイ由来カルボキシラーゼは、ウシカルボキシラーゼと類似しており、ＣＯＳ細胞において発現された(Czerwiec et al. 2002, 前出)。ＧＧＣＸと類似するさらなるタンパク質は、昆虫および原核生物、例えばAnopheles gambiae、Drosophila melanogaster および Leptospira（各々ＮＣＢＩアクセション番号： gi 31217234, gi 21298685, gi 24216281, gi 24197548および(Bandyopadhyay et al., 2002, 前出)中に見出すことができる。カルボキシラーゼ酵素は、顕著な進化的保存を示している。いくつかのヒト以外の酵素が、筆者らが使用したヒトＧＧＣＸの活性と類似する活性を有することを示す、または有すると予測してよく、したがってヒト酵素の代替え品として使用してよい。
表３は、本発明において使用することのできる、ヒトＧＧＣＸと相同であると予測されるタンパク質の代表的配列（種の由来に従って並べてある）を示す。
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上に同定したＧＧＣＸの各タンパク質を、本発明においてカルボキシラーゼ酵素として使用することができる。
タンパク質の共発現を達成するための１つのやり方は、個々の発現コントロール配列の一部として異なるプロモーターを使用することである。当該技術には、異種のタンパク質を異なる程度または範囲に発現する能力のある、種々のクローニングベクター、プロモーター、およびその他の発現コントロール配列の例が多々ある。タンパク質発現技術における当業者が、カルボキシル化を必要とするタンパク質、ビタミンＫエポキシド還元酵素、および所望によりγ−カルボキシラーゼの共発現を引き起こすためのプロモーターおよびその他のコントロール配列を選択することができるような、リコンビナント発現技術が適切に進歩している。どの特定のプロモーターおよびその他の発現コントロール配列を使用するかの選択は、個人個人の好みの問題である。
１つの態様において、ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質に関連するコントロール配列は、強いプロモーターを包含する。１つの態様において、これはヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）即時型初期プロモーターである。強いプロモーターは本明細書において、類似の条件下で同一細胞内で使用する弱いプロモーターに比して、少なくとも５倍数のｍＲＮＡ転写物を生じさせるプロモーターとして定義する。
もう１つの態様において、ビタミンＫエポキシド還元酵素、そして存在する場合にはγ−グルタミルカルボキシラーゼに関連するコントロール配列は、弱いプロモーターを包含する。１つの態様において、これはＳＶ４０初期プロモーターである。もう１つの態様において、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質およびビタミンＫエポキシド還元酵素、および所望によりγ−グルタミルカルボキシラーゼは、ビタミンＫエポキシド還元酵素、および所望によりγ−グルタミルカルボキシラーゼの発現をコントロールするプロモーターが、ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質の発現をコントロールするプロモーターより弱い、という異なるプロモーターエレメントのコントロール下にある。
本発明は、強いＣＭＶプロモーター(Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985)の使用により第Ｘ因子を過剰に発現すること、ならびにより弱いＳＶ４０プロモーター(Wenger et al. Anal Biochem 221:416-418, 1994)の使用によりビタミンＫエポキシド還元酵素の発現、および所望によりＧＧＣＸの発現をコントロールすることにより例証した。本発明に従って使用することのできるその他の強いプロモーターとして、ｐＥＦ−１α[ヒト伸長因子 −１aサブユニット遺伝子) (Mizushima and Nagata, Nuc Acids Res 18:5322, 1990; Goldman et al., BioTechniques 21:1013-1015, 1996)]、ｐＲＳＶ[ラウス肉腫ウイルス(Gorman et al ., Proc Natl Acad Sci USA 79:6777-6781 ,1982)]、およびｐＵｂＣ[ヒトユビキチン(Schorpp et al., Nuc Acids Res 24:1787-1788, 1996)]を含むが、これに限定されない。
本発明はまた、本発明の方法により製造された精製ガンマカルボキシル化タンパク質、および凝固療法におけるそれらの使用へと拡大する。
本発明のなおもう１つの側面に従って、上に記載した方法により得られた単離ガンマ-カルボキシル化タンパク質の医薬的有効量を、それを必要とする患者に投与することを包含する、被験者における増大または低減された凝固を促進する方法を提供する。
本発明のさらなる側面に従って、ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質およびγ−グルタミルカルボキシラーゼを、少なくとも５：１の比率で発現するように適合させたホスト細胞から発現された活性なカルボキシル化タンパク質を精製すること、そして精製されたカルボキシル化タンパク質を、１つまたはそれより多くの医薬的に受容可能な担体または賦形剤と共に混合することを包含する、血液凝固を誘発するために適する医薬組成物を製造する方法を提供する。
本発明の組成物は、当該技術において周知の従来の医薬賦形剤を用いて従来の方法により得てよいが、創傷部位内に非経口的または直接のいずれかの注射に適する剤形とするのが最も適当であろう。
適切な希釈剤の添加による注射用水性調製剤の調製に適する粉末は一般に、適切な担体および賦形剤、すなわち懸濁剤、および１つまたはそれより多くの安定剤または保存剤と共に活性成分を含有する。希釈剤は、他の適切な賦形剤、例えば保存剤、張度調節剤、および安定剤を含有してよい。
本発明の医薬組成物はまた、水中油滴型エマルジョンの剤形であってよい。油相は、植物油、例えばオリーブ油もしくはラッカセイ油、または鉱物油、例えば流動パラフィン、またはこれらのいずれかの混合物であってよい。適切な乳化剤は、例えば天然に生成されるゴム、例えばアカシアゴムまたはトラガカントゴム、天然に生成されるホスファチド、例えば大豆、レシチン、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導されるエステルまたは部分エステル（例えばソルビタンモノオレエート）、および前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物 例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってよい。
本発明の医薬組成物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の溶液または懸濁液の形でもよく、この剤形は、上述した１つまたはそれより多くの適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、公知の方法に従って製剤化してよい。無菌の注射可能な調製剤はまた、非毒性の非経口に受容可能な希釈剤または溶媒中の、無菌の注射可能な溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。
製剤化のさらなる情報に関しては、Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990の第５巻の２５．２章；またはDrugs and the pharmaceutical sciences; Protein formulation and delivery (Eugen J. McNally, executive editor), Marcel Dekker Inc 2000の第９９巻を参照されたい。
１回の投与剤形を製造するため、１つまたはそれより多くの賦形剤と組み合わせる活性成分の量は、治療するホストおよび特定の投与経路に依存して必然的に変わることになる。例えばヒトへの注射用に意図された製剤は、一般に組成物全体の重量の約５から約９８パーセントまで変化してよい、適当なそして都合のよい量の賦形剤と共に配合された、０．２ｍｇから６ｇ、または０．５ｍｇから２ｇの活性物質を含有するものとする。投与ユニット剤形は、一般に約０．２ｍｇから約１０ｇ、または約１ｍｇから約５００ｍｇの活性物質を含有するものとする。タンパク質性の治療薬(therapeutics)は通常、凍結または凍結乾燥して保存される。投与経路および投与計画におけるさらなる情報に関しては、Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990の、第５巻 ２５．３章を参照されたい。
化合物の治療目的または予防目的のための用量のサイズは、動物または患者の状態の性質および重症度、年齢および性別、ならびに投与経路に従って、すなわち医薬剤の周知の原則に従って、当然変化することになる。治療目的または予防目的のための化合物の使用において、例えば体重１ｋｇ当たり２０μｇから７５ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇから７５ｍｇの範囲の１日の用量を、必要であれば分割投与として与えるように、一般に投与するものとする。非経口経路を用いる場合、一般により低い用量を投与するものとする。したがって例えば静脈内投与に関しては、体重１ｋｇ当たり２０μｇから３０ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇから３０ｍｇの範囲の１日の用量を一般に使用するものとする。同様に吸入による投与に関しては、例えば体重１ｋｇ当たり２０μｇから３０ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇから２５ｍｇの範囲の用量を使用するものとする。これに代わる方法として化合物は、体重１ｋｇおよび１時間当たり１μｇ−１０ｍｇの輸液として、数時間から数日の期間投与することができる。
〔実験の項〕
本発明を、以下の非限定的実施例によりさらに記載することにする。
本発明の実施は、他に指摘していなければ、当該技術の範囲内の分子生物学およびリコンビナントＤＮＡ技術の従来の方法を使用するものとする。
そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrookら編、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第３版) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)；Ausubel ら編、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY (2002)；Glover & Hames編、DNA Cloning 3: A Practical Approach, 第I, II, & III巻, IRL Press, Oxford (1995)；Colowick & Kaplan編、 Methods in Enzymology, Academic Press； Weir ら編、Handbook of Experimental Immunology,第５版 , Blackwell Scientific Publications, Ltd., Edinburgh, (1997)を参照のこと。

〔実施例１〕
カルボキシル化タンパク質の発現におけるＶＫＯＲの重要性を調べるため、筆者らはＣＨＯ細胞においてヒト凝固因子Ｘ（ＦＸ）を発現させた。完全に機能的なＦＸは、Camire et al. 2000 (Biochemistry 39:14322-14329)（１００万細胞および１日当たりおよそ１μｇのカルボキシル化ＦＸを得た）により、そしてHimmelspach et al 2000 (Thromb Res 97:51-67)（ＤＨＦＲ増殖を行ったＣＨＯ細胞を用いて、１００万細胞および１日当たり２５％（１９．５μｇ）までの活性なＦＸを得たと主張した）により、より早期に発現されている。Himmelspachらは、リコンビナントＦＸの不完全なプロセシングを報告しており、実際に示された活性なＦＸの最大の生産性は５μｇ/ｍｌ培養液であった。双方の公開文献において、細胞は血清を含有する培地において接着細胞として成長させた。細胞は所望のコンフルエンスまで成長させ、培地を血清不含培地に交換し、インキュベーションを継続して産生物を蓄積させた。その後産生物の量を、この“血清不含”培地から見積もった。この培養法は、細胞が産生物を短期間のみ産生するにとどまるため、ラージスケールのタンパク質の製造には適さない。加えてこの産生物は血清タンパク質、例えばウシＦＸが混入されることになる。この混入物は、血清タンパク質として非常に望ましくなく、除去が困難であり、そしてもし患者に注射される産生物中に存在すれば、抗体形成を引き起こすと思われる。したがって得られた細胞株は、医薬用ＦＸの商業的製造には適さないことが示された。

リコンビナントヒト第Ｘ因子を産生する安定な細胞株の確立
ＦＸコード配列は、ヒト肝臓ｃＤＮＡから以下のプライマー：
F10F1: 5’-CACACCATGGGGCGCCCACT-3’ (配列番号：２)
F10R1: 5’-GAGTGGGATCTCACTTTAATGGA-3’ (配列番号：３)
を用いてＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ産物のクローニングは、最初にｐＣＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈｉｓ中へのＴＡ−ＴＯＰＯクローニング(Invitrogen)により行った。正しいＦＸ配列を含有するクローンをＤＮＡ配列決定により、そしてＣＯＳ−７細胞における一過性発現により同定した。次に、ＦＸコード配列を含有する平滑末端フラグメントを、ＥｃｏＲＶ消化およびホスファターゼ処理した発現ベクターｎｏｐＡ中にクローニングした。得られたＦ１０ｎｏｐＡ（配列番号：６）クローンを、挿入した配列のＤＮＡ配列決定により、そしてＣＯＳ−７における一過性発現により検証した。
ＶＫＯＲコード配列は、ヒト肝臓ｃＤＮＡから以下のプライマー：VF1:5’-CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA-3’ (配列番号：４)
VR1: 5’-GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT-3’ (配列番号：５)
を用いてＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ産物のクローニングは、最初にｐＣＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈｉｓ中へのＴＡ−ＴＯＰＯクローニング(Invitrogen)により行った。正しいＶＫＯＲコード配列（配列番号：１）を含有するクローンをＤＮＡ配列決定により同定した。次に、ＶＫＯＲ配列を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、同じ酵素で消化した発現ベクターｐＺｅｏＳＶ２＋(Invitrogen)に導入した。得られたＶＫＯＲｚｅｒｏクローン（配列番号：７）を、ＤＮＡ配列決定により検証した。
ＣＨＯ−Ｓ細胞(Invitrogen)は、本質的にはInvitrogenにより推奨されているように、
Glutamax Iおよび９％の加熱処理したＦＢＳを含有するＤＭＥＭ Ｆ１２培地中で成長させた。ＣＨＯ−Ｓへの形質移入は、本質的にはInvitrogenにより推奨されているように、Ｐｖｕl消化（直線化）したＦ１０ｎｏｐＡ、ＳｓｐＩ消化したＶＫＯＲｚｅｒｏ、およびリポフェクタミン２０００にて行った。ＤＮＡ形質移入混合物は、ＶＫＯＲｚｅｒｏに比して１．６倍過剰モルのＦ１０ｎｏｐＡを含有していた。形質移入後その日に形質移入した細胞を９６ウェルプレートに、選択培地；成長培地 ＋ ４００μｇ/ｍｌ Ｇ４１８中に播種した。したがってＶＫＯＲｚｅｒｏコンストラクトは選択しなかったが、Ｇ４１８耐性形質移入体にランダムに組み込まれた。その後プレートを検査して、１ウェル当たり適切な数のクローン（５−１０）が得られたことを確認した。形質移入後６日に選択培地を、ビタミンＫ（１μｇ/ｍｌ）を補充した成長培地に交換した。その翌日プレートからサンプリングし、ＦＸをＦＸａに活性化するRussels’ Viper Venom（ＲＶＶ−Ｘ）に基づいたアッセイを用いて、ＦＸ活性についてアッセイした。次にＦＸａ活性を、発色基質(S2765, Chromogenix, Molndal, Sweden)を用いて測定した。ＲＶＶ−Ｘアッセイは、同じ目的のためにHimmelspachらの使用したアッセイと均等である。最も高い活性を有するウェルを同定し、含有するクローンを拡大(expand)し、限界希釈クローニングを行った。限界希釈クローニングおよび最適クローンの選択の後、選ばれたクローンを拡大し、タンパク質不含培地（Invitrogenにより推奨されているように１μｇ/ｍｌ ビタミンＫを加えて補充したＣＤ−ＣＨＯ）中での成長に移行させた。リコンビナントＦＸの生産性は、Ｔフラスコ培養から見積もった。ＶＫＯＲの発現は、リアルタイムＰＣＲ分析によりアッセイした。完全に活性なＦＸを発現する選択されたすべてのクローンは、ＶＫＯＲもまた発現することが見出された。このことから、ＶＫＯＲの共発現は完全に活性なヒト凝固因子Ｘの発現を改善すると結論した。得られた細胞株は、タンパク質および動物成分の不含培地中で十分に成長し、抗生物質の選択というプレッシャーなしにＦＸを産生する。それ故得られた細胞株は、ラージスケールのタンパク質の製造に適すると考えられ、大量の活性なＦＸを製造する能力がある。完全に活性なＦＸの占有率もまた、これまでに報告されたものより有意に高い。

〔実施例２〕
ＦＸ、ＶＫＯＲおよびＧＧＣＸの共発現に関する生産性およびｍＲＮＡ比の分析
実施例１で得られたクローンを、抗生物質を含まないタンパク質不含の化学的に定義されたＣＨＯ培地（Invitrogen）中のＴフラスコ内で成長させた。サンプルは、ｃＤＮＡの調製用に培養４日から採集し、そして生産性の見積り用のサンプルは、ルーチンの分割後培養５日から採集した。コントロールサンプルもまた、同じ培地中で成長させた形質移入していない親ＣＨＯ−Ｓ細胞株から調製し、コントロールサンプルの分析から予想される結果を得た。撹拌（スピナー）培養により、動物成分不含添加物を補充したまたは補充しないＣＤ−ＣＨＯ中で成長させた。活性なｒｈＦＸの量は、実施例１におけるようにＲＶＶ−Ｘに基づいたアッセイにより、精製した血漿由来ヒト第Ｘ因子を連続希釈したものをスタンダードとして見積もった(Haematologic Technologies Inc., Vermont, USA)。ＲＮＡは、販売元のInvitrogenより供給されたプロトコルに従って、Trizol（登録商標）を用いて単離した。単離したＲＮＡを、AmbionからのDNA-free（登録商標）キットを用いてＤＮａｓｅＩ処理した。ｃＤＮＡの合成は、ＲＴ−ＰＣＲ用のSuperscript（登録商標）First-Strand Synthesis System (Invitrogen)からのヘキサマープライマーおよびキットの内容物を用いて行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーおよびＶｉｃ標識プローブは、Applied Biosystems からのソフトウェアPrimer Express（登録商標）を用いて選択した。
[ヒトγ−カルボキシラーゼオリゴヌクレオチド]
5´ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3´ フォワードプライマー (配列番号：８)
5´AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3´ リバースプライマー (配列番号：９)
5´CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3´ プローブ (配列番号：１０)
[ヒト第Ｘ因子オリゴヌクレオチド]
プライマーはOperon/Qiagen により製造し、プローブはApplied Biosystemsに発注した。
5´CCGCAACAGCTGCAAGCT-3´ フォワードプライマー (配列番号：１１)
5´TGTCGTAGCCGGCACAGA-3´ リバースプライマー (配列番号：１２)
5´ CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG プローブ (配列番号：１３)
[ヒトＶＫＯＲオリゴヌクレオチド]
5´GCTGGGCCTCTGTCCTGAT-3´ フォワードプライマー (配列番号：１４)
5´ ATCCAGGCCAGGTAGACAGAAC-3´ リバースプライマー (配列番号：１５)
5´CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCG プローブ (配列番号：１６)
げっ歯類ＧＡＰＤＨコントロールプライマーおよびプローブもまた使用した(Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan（登録商標） Rodent GAPDH Control Reagents Protocol)−単位複製配列の長さ１７７ｂｐ。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応は、Applied Biosystems の7500 Real Time PCR Systemにて行った。増幅されたＰＣＲ産物の予想される長さを、アガロースゲルで確認した。
Figure 0005461008
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表５に列記した生産性は、非増幅細胞株からこれまでに得た値られをすべて上回っていた。不活性なＦＸを含む総ＦＸ濃度の見積りは、Biacoreアッセイを用いて、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより行った。

総ｒｈＦＸの濃度の見積りのためのBiacoreアッセイ
BIAcore3000（登録商標）分析システム、ランニングバッファー(１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ Ｐ２０、ｐＨ７．４）０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のウサギ抗マウスＦｃ（ＲＡＭ Ｆｃ、ロット番号６１０)、およびＣＭ５センサーチップは、Biacore AB (Uppsala, Sweden)より購入した。本方法は、５μｌ/分、２５℃で通過させた。２５℃での標準化されたアミンカップリング法（３５μｌ活性化時間）を用いて、ＣＭ５チップのチャネル４に１１０００ＲＵのキャプチャリング(capturing)用抗体ＲＡＭ Ｆｃ（３５μｌ、３０μｇ/ｍｌ １０ｍＭ 酢酸ナトリウム中、ｐＨ５．０）を共有結合によりカップルさせた。固定化後、表面を５μｌの１０ｍＭグリシンバッファー ｐＨ１．８で再生し、さらにランニングバッファーで平衡化した。マウス抗ＦＸモノクローナルＩｇＧ抗体 Ｎ７７１２１Ｍ(Biodesign, Maine, USA)（ランニングバッファー中に１/１００希釈）を２０μｌ流して、６６０ＲＵをキャプチャリングさせた。培地中のＦＸの結合は、解離を無視できる非常に安定な複合体が得られた。新規ＦＸサンプル毎に、複数回のサンドイッチ実験用にＲＡＭ Ｆｃ表面を再現性よく再生した。カップルしたＲＡＭ Ｆｃを有するチャネル４、およびクリーンな表面のチャネル３との間のＲＵ差を用いて、５μｌのＦＸの結合を定量した。Haematologic Technologies Inc. (Vermont, USA) からのｐｄＦＸのスタンダード（２、４、６、８、１０、１５および２０μｇ/ｍｌ 培地中）を通過させ、ＲＵの差異をｐｈＦＸの濃度に対してプロットし、１結合部位に関する式をデータに当てはめた。未知のサンプルのＲＵ差を使用して、標準曲線からｒｈＦＸの濃度を算出した。
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表６の結果は、ＶＫＯＲの共発現が完全に活性なｒｈＦＸの発現を増加させることを示す。完全に活性なｒｈＦＸの高い占有率（４３−１０３％）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、およびタンパク質の精製によるデータとも一致する。

〔実施例３〕
ヒトプロトロンビン、ＧＧＣＸ、およびＶＫＯＲの共発現
高レベルの完全に活性なヒトプロトロンビン（ｈＦＩＩ）を産生する能力のある細胞株を得るため、筆者らはより早期に、ビタミンＫ依存性修飾酵素であるγ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＧＧＣＸ）およびｈＦＩＩの共発現を行った。この戦略を用いて筆者らはＰ１Ｅ２クローンを得た。Ｐ１Ｅ２は、ｒｈＦＩＩを発現する高度に生産的なクローンであるが、正しく修飾されたｒｈＦＩＩの発現は、他のＦＩＩ産生クローンに比較して大きく改善されているものの、産生されたこのｒｈＦＩＩの総量のわずか２０−６０％（培養条件に依存する）が、完全にγ−カルボキシル化されているに過ぎない。完全にγ−カルボキシル化されたｒｈＦＩＩのレベル、およびこれ故ｒｈＦＩＩのより低い製造コストをさらに改善する試みにおいて、ビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）を用いる、新規発現戦略を検討した。２つの異なるプロモーターのコントロール下での２つの異なるベクター（ｐＨｙｇｏベクターにおいてはｐＣＭＶ、およびｐＺｅｏベクターにおいてはｐＳＶ４０）中に、ＶＫＯＲをクローン化した。ＣＨＯ細胞において、ｐＣＭＶプロモーターはｐＳＶ４０プロモーターより〜６倍高いプロモーター活性を有すると見積もられている。ｒｈＦＩＩ産生細胞株を得るため、双方のコンストラクトを２つの別個の同時形質移入において使用した。

細胞株の開発および生産性の見積り
細胞株の開発は、ＰＰ６コンストラクト（ｈＦＩＩおよびｈＧＧＣＸをコードする）（配列番号：２０）、およびＶＫＯＲコンストラクト（図１−２）のいずれかを用いて、ＣＨＯ−Ｓに同時形質移入することにより開始した。形質移入に使用したモル比は２：３（ＰＰ６：ＶＫＯＲ）であった。播種および９６ウェルプレートにおける形質移入体の選択の後、１つの形質移入当たり総計５５００−８５００のクローンを、発色アッセイに基づいたエカリンを使用してスクリーニングした。最初のスクリーニングの後、１８クローンのプールを選択した。第２のスクリーニング後、９クローンのプールを選択し、拡大して第３のスクリーニングアッセイを行った。各形質移入について、最良の産生クローンのプールを限界希釈用に選択した。６枚の９６ウェルプレートに、０．５細胞/ウェルにて播種した。２４クローンを選択し、スクリーニング後スケールを拡大(upscale)した。ＶＫＯＲをコードするベクターを選択しなかったので、ＶＫＯＲ発現を評価するためTaqman分析を行った。選択した３つの最良のクローン：Ａ３Ｆ４（ＰＰ６／ｐＺｅｏＶＫＯＲ）、Ｂ１１Ｅ８およびＢ９Ａ１２（ＰＰ６／ｐＨｙｇｒｏＶＫＯＲ）において、ＶＫＯＲ ｍＲＮＡが検出された。４回のスピナーでの実験を行って、Ｐ１Ｅ２クローンと比較してのＰＰ６/ＶＫＯＲクローンに関するｒｈＦＩＩの生産性を評価および比較した。
Figure 0005461008
ＶＫＯＲ、ＧＧＣＸ、およびｒｈＦＩＩを共発現する新規アプローチは、Ｐ１Ｅ２クローン（２０−６０％、表１参照のこと）と比較して、完全に活性なｒｈＦＩＩのずっと高い占有率（６０−１００％）を産生するいくつかのｒｈＦＩＩ発現クローンを得るに至った。クローンのうちの２つ、すなわちＢｌｌＥ８およびＢ９Ａ１２（双方ともＰＰ６／ｐＨｙｇｒｏＶＫＯＲの同時形質移入）に関して、Ｐ１Ｅ２クローンに比してより高い特異的生産性比率（１細胞および１日当たり産生される活性タンパク質の量、ＳＰＲ）が、いくつかの培養条件下で得られた。Ａ３Ｆ４クローンは、すべての培養実験の施行において１００％の完全にカルボキシル化されたｒｈＦＩＩを産生した。このクローンは他の２つのクローンを用いた場合に比して、ＦＩＩに対する双方の修飾酵素（ＧＧＣＸおよびＶＫＯＲ）の最も高いｍＲＮＡ比を有する。しかしＡ３Ｆ４は、他のクローンに比してより多量の完全に活性なｒｈＦＩＩは産生しない。

〔実施例４〕
ＶＫＯＲを用いてのスーパー形質移入(supertransfection)により改善されたγ−カルボキシル化
ｒｈＦＩＩ産生の改善のためＶＫＯＲを使用する第２の試みにおいて、Ｐ１Ｅ２クローン（実施例３）をＶＫＯＲと共発現するように修飾した。このケースにおいてはｐＨｙｇｒｏＶＫＯコンストラクト（配列番号：２２）を使用して、Ｐ１Ｅ２（添付の図１を参照のこと）に形質移入し、プロトロンビン活性アッセイにより改善された生産性について、クローンをスクリーニングした。総計７０００−８０００クローンを、９６ウェルフォーマットに適合させたエンドポイントのプロトロンビナーゼアッセイを使用してスクリーニングした。１６クローンのプールを最初のスクリーニング後に選択した。選択したクローンのプールを拡大し、活性なｒｈＦＩＩの占有率を見積もるため、エカリンアッセイおよびプロトロンビナーゼアッセイの双方によりスクリーニングした。このスクリーニングの後、６クローンのプールを選択し、拡大した。３つの最良の産生クローンのプールを、限界希釈クローニング用に選択した。３つのすべてのプールに由来する２８クローンを選択し、最初のプロトロンビナーゼスクリーニング後スケールを拡大した。第２のスクリーニング後、８クローンを選択し、スケールを拡大した。Taqmanアッセイを行い、各クローンのプールからの１つのクローンにおけるＶＫＯＲ発現を検証した。すべての中で、３つの最良のクローン；Ｍ３Ｆ６、Ｐ４Ａ４、およびＯ３Ｇ３を選択し、ＶＫＯＲｍＲＮＡを検出した。震盪培養または撹拌培養を３回行い、親Ｐ１Ｅ２クローンと比較してのＰ１Ｅ２/ＶＫＯＲクローンについてｒｈＦＩＩの生産性を評価した。
Taqman分析を行って、各クローンのプールからの１つのクローンにおけるＶＫＯＲ発現を検証した。選択した３つのすべての最良のクローン；Ｍ３Ｆ６、Ｐ４Ａ４、およびＯ３Ｇ３において、ＶＫＯＲ ｍＲＮＡを検出した。これらのクローンを得るために使用した選択法およびスクリーニング法から、それらクローンは至適レベルのＶＫＯＲを発現すると考察される。この至適発現レベルについて、実施例５においてさらに特徴づける。
Figure 0005461008
Figure 0005461008
培養実験からの結果は、異なる培養条件間で活性なｒｈＦＩＩの量および占有率が変化することを示したが、ほとんどの実験に関して、産生された完全に活性なｒｈＦＩＩの量は、オリジナルのＰ１Ｅ２細胞株についての値より、新規Ｐ１Ｅ２/ＶＫＯＲクローンの方が高かった。

〔実施例５〕
至適ｍＲＮＡ発現比率の確立
実施例４および５の細胞株から調製したメッセンジャーＲＮＡを、実施例３と同様にリアルタイムＰＣＲにより分析した。ＧＧＣＸおよびＶＫＯＲに関して、実施例３と同じオリゴヌクレオチドを使用した。
プロトロンビンに関するオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：
5´TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3´ フォワードプライマー (配列番号：１７)
5´ CATCCGAGCCCTCCACAA 3´ リバースプライマー (配列番号：１８)
5´ CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3´ プローブ (配列番号：１９)
Figure 0005461008
表９の結果は、産生されるγ−カルボキシル化タンパク質に関してＧＧＣＸおよびＶＫＯＲの至適発現レベルがあることを指摘する。クローンのＭ３Ｆ４、Ｏ３Ｇ３、およびＰ４Ａ４は、強いＣＭＶプロモーターのコントロール下でＶＫＯＲを含有するコンストラクトを用いてＰ１Ｅ２（ｒｈＦＩＩ＋ＧＧＣＸを含有するコンストラクトを用いての形質移入によりより早期に得られた）に形質移入することにより得られた。完全に活性なｒｈＦＩＩの改善された生産性を有するクローンを特異的に検出するアッセイにより、スクリーニングを行った。したがってｒｈＦＩＩおよびＧＧＣＸに関してＶＫＯＲの至適発現レベルを有するクローンを選択したことになる。
実施例４および５の細胞株から調製したメッセンジャーＲＮＡを、実施例３と同様にリアルタイムＰＣＲにより分析した。すべての分析には、実施例３のようにＧＡＰＤＨのコントロールの反応を含めた。

〔配列表〕
配列番号１
VKOR CDS
//ATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCTGGCTGGGTGCGGCTCGCTCTTTGCCTGACGGGCTTAGTGCTCTCGCTCTACGCGCTGCACGTGAAGGCGGCGCGCGCCCGGGACCGGGATTACCGCGCGCTCTGCGACGTGGGCACCGCCATCAGCTGTTCGCGCGTCTTCTCCTCCAGGTGGGGCAGGGGTTTCGGGCTGGTGGAGCATGTGCTGGGACAGGACAGCATCCTCAATCAATCCAACAGCATATTCGGTTGCATCTTCTACACACTACAGCTATTGTTAGGTTGCCTGCGGACACGCTGGGCCTCTGTCCTGATGCTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCGCTGGTTCTGTCTACCTGGCCTGGATCCTGTTCTTCGTGCTCTATGATTTCTGCATTGTTTGTATCACCACCTATGCTATCAACGTGAGCCTGATGTGGCTCAGTTTCCGGAAGGTCCAAGAACCCCAGGGCAAGGCTAAGAGGCACTGA//

配列番号２
CACACCATGGGGCGCCCACT

配列番号３
GAGTGGGATCTCACTTTAATGGA

配列番号４
CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA

配列番号５
GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT

配列番号６
F10nopA constructの配列
//gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattctgcagatcacaccatggggcgcccactgcacctcgtcctgctcagtgcctccctggctggcctcctgctgctcggggaaagtctgttcatccgcagggagcaggccaacaacatcctggcgagggtcacgagggccaattcctttcttgaagagatgaagaaaggacacctcgaaagagagtgcatggaagagacctgctcatacgaagaggcccgcgaggtctttgaggacagcgacaagacgaatgaattctggaataaatacaaagatggcgaccagtgtgagaccagtccttgccagaaccagggcaaatgtaaagacggcctcggggaatacacctgcacctgtttagaaggattcgaaggcaaaaactgtgaattattcacacggaagctctgcagcctggacaacggggactgtgaccagttctgccacgaggaacagaactctgtggtgtgctcctgcgcccgcgggtacaccctggctgacaacggcaaggcctgcattcccacagggccctacccctgtgggaaacagaccctggaacgcaggaagaggtcagtggcccaggccaccagcagcagcggggaggcccctgacagcatcacatggaagccatatgatgcagccgacctggaccccaccgagaaccccttcgacctgcttgacttcaaccagacgcagcctgagaggggcgacaacaacctcaccaggatcgtggggggccaggaatgcaaggacggggagtgtccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaaccattctgagcgagttctacatcctaacggcagcccactgtctctaccaagccaagagattcaaggtgagggtaggggaccggaacacggagcaggaggagggcggtgaggcggtgcacgaggtggaggtggtcatcaagcacaaccggttcacaaaggagacctatgacttcgacatcgccgtgctccggctcaagacccccatcaccttccgcatgaacgtggcgcctgcctgcctccccgagcgtgactgggccgagtccacgctgatgacgcagaagacggggattgtgagcggcttcgggcgcacccacgagaagggccggcagtccaccaggctcaagatgctggaggtgccctacgtggaccgcaacagctgcaagctgtccagcagcttcatcatcacccagaacatgttctgtgccggctacgacaccaagcaggaggatgcctgccagggggacagcgggggcccgcacgtcacccgcttcaaggacacctacttcgtgacaggcatcgtcagctggggagagggctgtgcccgtaaggggaagtacgggatctacaccaaggtcaccgccttcctcaagtggatcgacaggtccatgaaaaccaggggcttgcccaaggccaagagccatgccccggaggtcataacgtcctctccattaaagtgagatcccactcatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcaccttcgaccccaaaaaacttgattagggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgccctttccgcagagcaatggcggtgtctgccgggtccgcgcggacctcgcccagctcagataaagtacagaaagacaaggctgaactgatctcagggcccaggcaggacagccgaatagggaaactcttgggttttgagtggacagatttgtccagttggcggaggctggtgaccctgctgaatcgaccaacggaccctgcaagcttagctgtctttcgttttctttttgggttcttgatggtgctagacattccccaggagcgggggctcagctctctggaccggaaataccttgatgggctggatgtgtgccgcttccccttgctggatgccctacgcccactgccacttgactggatgtatcttgtctacaccatcatgtttctgggggcactgggcatgatgctgggcctgtgctaccggataagctgtgtgttattcctgctgccatactggtatgtgtttctcctggacaagacatcatggaacaaccactcctatctgtatgggttgttggcctttcagctaacattcatggatgcaaaccactactggtctgtggacggtctgctgaatgcccataggaggaatgcccacgtgcccctttggaactatgcagtgctccgtggccagatcttcattgtgtacttcattgcgggtgtgaaaaagctggatgcagactgggttgaaggctattccatggaatatttgtcccggcactggctcttcagtcccttcaaactgctgttgtctgaggagctgactagcctgctggtcgtgcactggggtgggctgctgcttgacctctcagctggtttcctgctcttttttgatgtctcaagatccattggcctgttctttgtgtcctacttccactgcatgaattcccagcttttcagcattggtatgttctcctacgtcatgctggccagcagccctctcttctgctcccctgagtggcctcggaagctggtgtcctactgcccccgaaggttgcaacaactgttgcccctcaaggcagcccctcagcccagtgtttcctgtgtgtataagaggagccggggcaaaagtggccagaagccagggctgcgccatcagctgggagctgccttcaccctgctctacctcctggagcagctattcctgccctattctcattttctcacccagggctataacaactggacaaatgggctgtatggctattcctgggacatgatggtgcactcccgctcccaccagcacgtgaagatcacctaccgtgatggccgcactggcgaactgggctaccttaaccctggggtatttacacagagtcggcgatggaaggatcatgcagacatgctgaagcaatatgccacttgcctgagccgcctgcttcccaagtataatgtcactgagccccagatctactttgatatttgggtctccatcaatgaccgcttccagcagaggatttttgaccctcgtgtggacatcgtgcaggccgcttggtcaccctttcagcgcacat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配列番号７
VKOR zeo constructの配列

//ggatcgatccggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgcccttcaccatgggcagcacctgggggagccctggctgggtgcggctcgctctttgcctgacgggcttagtgctctcgctctacgcgctgcacgtgaaggcggcgcgcgcccgggaccgggattaccgcgcgctctgcgacgtgggcaccgccatcagctgttcgcgcgtcttctcctccaggtggggcaggggtttcgggctggtggagcatgtgctgggacaggacagcatcctcaatcaatccaacagcatattcggttgcatcttctacacactacagctattgttaggttgcctgcggacacgctgggcctctgtcctgatgctgctgagctccctggtgtctctcgctggttctgtctacctggcctggatcctgttcttcgtgctctatgatttctgcattgtttgtatcaccacctatgctatcaacgtgagcctgatgtggctcagtttccggaaggtccaagaaccccagggcaaggctaagaggcactgaacaagggcaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagcatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttccattcgccattcaggctgaactagatctagagtccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacggaccgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacactcgacctcgaaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtct//

配列番号８
ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT

配列番号９
AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT

配列番号１０
CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC

配列番号１１
CCGCAACAGCTGCAAGCT

配列番号１２
TGTCGTAGCCGGCACAGA

配列番号１３
CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG

配列番号１４
GCTGGGCCTCTGTCCTGAT

配列番号１５
ATCCAGGCCAGGTAGACAGAAC

配列番号１６
CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCG

配列番号１７
TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA

配列番号１８
CATCCGAGCCCTCCACAA

配列番号１９
CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC

配列番号２０
PP6:
//gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgcccttattcctcagtgacccaggagctgacacactatggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagccagcatgtgttcctggctcctcagcaagcacggtcgctgctccagcgggtccggcgagccaacaccttcttggaggaggtgcgcaagggcaacctggagcgagagtgcgtggaggagacgtgcagctacgaggaggccttcgaggctctggagtcctccacggctacggatgtgttctgggccaagtacacagcttgtgagacagcgaggacgcctcgagataagcttgctgcatgtctggaaggtaactgtgctgagggtctgggtacgaactaccgagggcatgtgaacatcacccggtcaggcattgagtgccagctatggaggagtcgctacccacataagcctgaaatcaactccactacccatcctggggccgacctacaggagaatttctgccgcaaccccgacagcagcaccacgggaccctggtgctacactacagaccccaccgtgaggaggcaggaatgcagcatccctgtctgtggccaggatcaagtcactgtagcgatgactccacgctccgaaggctccagtgtgaatctgtcacctccattggagcagtgtgtccctgatcgggggcagcagtaccaggggcgcctggcggtgaccacacatgggctcccctgcctggcctgggccagcgcacaggccaaggccctgagcaagcaccaggacttcaactcagctgtgcagctggtggagaacttctgccgcaacccagacggggatgaggagggcgtgtggtgctatgtggccgggaagcctggcgactttgggtactgcgacctcaactattgtgaggaggccgtggaggaggagacaggagatgggctggatgaggactcagacagggccatcgaagggcgtaccgccaccagtgagtaccagactttcttcaatccgaggacctttggctcgggagaggcagactgtgggctgcgacctctgttcgagaagaagtcgctggaggacaaaaccgaaagagagctcctggaatcctacatcgacgggcgcattgtggagggctcggatgcagagatcggcatgtcaccttggcaggtgatgcttttccggaagagtccccaggagctgctgtgtggggccagcctcatcagtgaccgctgggtcctcaccgccgcccactgcctcctgtacccgccctgggacaagaacttcaccgagaatgaccttctggtgcgcattggcaagcactcccgcaccaggtacgagcgaaacattgaaaagatatccatgttggaaaagatctacatccaccccaggtacaactggcgggagaacctggaccgggacattgccctgatgaagctgaagaagcctgttgccttcagtgactacattcaccctgtgtgtctgcccgacagggagacggcagccagcttgctccaggctggatacaaggggcgggtgacaggctggggcaacctgaaggagacgtggacagccaacgttggtaaggggcagcccagtgtcctgcaggtggtgaacctgcccattgtggagcggccggtctgcaaggactccacccggatccgcatcactgacaacatgttctgtgctggttacaagcctgatgaagggaaacgaggggatgcctgtgaaggtgacagtgggggaccctttgtcatgaagagcccctttaacaaccgctggtatcaaatgggcatcgtctcatggggtgaaggctgtgaccgggatgggaaatatggcttctacacacatgtgttccgcctgaagaagtggatacagaaggtcattgatcagtttggagagtagaagggcaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcggttcctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacatcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtcgaggctgatcagcgggtttaaacgggccctctagactcgaattgcccttccaacatctggcccccttcagaactctgagtggacaggatcaggatttgactcaggaggattagaatgtgaagaatccgtgtttgagggattcagttctccaactgcctcaaagggtctcaagtttgcataagtcacctcctgggccagctgctccagggaaggacggcctaatatcagatttcgaagtgagatacaagtcatcaggaagctgcggcgaaagacatagagctttcgcaacaagaagcggaagaatcgctcatggaaaggagtatttcgccggcgttcaatctcctggagcctttgttggcgtctaagaaaggtctgaaccagaggtgttggctcagggcccccttttacttccccttccaacagaggctgcagctctgggggtagaggccctgtttcacttccattctccaccttttcctttaattcttgcagatatgccaggtcttgctccagtgcaagctctgtagtgttgacatagacgtacatgtagcaagaagggctaggtgatgtcgtatacaccttatggtactcaccagcaggcaactgcattttttctccctctcgaagagtctggttcttctgttctgccacaagctccacagtcacttccccctgcagcagctggatgctagtgttgcccaggtcttcactcacaaaattctccaagtgcagtccagggaaatctgcaatgaagaccacctcagtgtggttgtctaggctgctcttgatttcctgtaacttggccctccagggagacaggtccatcaagagtggttgcacccaggatgtgcgctgaaagggtgaccaagcggcctgcacgatgtccacacgagggtcaaaaatcctctgctggaagcggtcattgatggagacccaaatatcaaagtagatctggggctcagtgacattatacttgggaagcaggcggctcaggcaagtggcatattgcttcagcatgtctgcatgatccttccatcgccgactctgtgtaaataccccagggttaaggtagcccagttcgccagtgcggccatcacggtaggtgatcttcacgtgctggtgggagcgggagtgcaccatcatgtcccaggaatagccatacagcccatttgtccagttgttatagccctgggtgagaaaatgagaatagggcaggaatagctgctccaggaggtagagcagggtgaaggcagctcccagctgatggcgcagccctggcttctggccacttttgccccggctcctcttatacacacaggaaacactgggctgaggggctgccttgaggggcaacagttgttgcaaccttcgggggcagtaggacaccagcttccgaggccactcaggggagcagaagagagggctgctggccagcat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tcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc/

/

配列番号２１
PN32:
//gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgcccttattcctcagtgacccaggagctgacacactatggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagccagcatgtgttcctggctcctcagcaagcacggtcgctgctccagcgggtccggcgagccaacaccttcttggaggaggtgcgcaagggcaacctggagcgagagtgcgtggaggagacgtgcagctacgaggaggccttcgaggctctggagtcctccacggctacggatgtgttctgggccaagtacacagcttgtgagacagcgaggacgcctcgagataagcttgctgcatgtctggaaggtaactgtgctgagggtctgggtacgaactaccgagggcatgtgaacatcacccggtcaggcattgagtgccagctatggaggagtcgctacccacataagcctgaaatcaactccactacccatcctggggccgacctacaggagaatttctgccgcaaccccgacagcagcaccacgggaccctggtgctacactacagaccccaccgtgaggaggcaggaatgcagcatccctgtctgtggccaggatcaagtcactgtagcgatgactccacgctccgaaggctccagtgtgaatctgtcacctccattggagcagtgtgtccctgatcgggggcagcagtaccaggggcgcctggcggtgaccacacatgggctcccctgcctggcctgggccagcgcacaggccaaggccctgagcaagcaccaggacttcaactcagctgtgcagctggtggagaacttctgccgcaacccagacggggatgaggagggcgtgtggtgctatgtggccgggaagcctggcgactttgggtactgcgacctcaactattgtgaggaggccgtggaggaggagacaggagatgggctggatgaggactcagacagggccatcgaagggcgtaccgccaccagtgagtaccagactttcttcaatccgaggacctttggctcgggagaggcagactgtgggctgcgacctctgttcgagaagaagtcgctggaggacaaaaccgaaagagagctcctggaatcctacatcgacgggcgcattgtggagggctcggatgcagagatcggcatgtcaccttggcaggtgatgcttttccggaagagtccccaggagctgctgtgtggggccagcctcatcagtgaccgctgggtcctcaccgccgcccactgcctcctgtacccgccctgggacaagaacttcaccgagaatgaccttctggtgcgcattggcaagcactcccgcaccaggtacgagcgaaacattgaaaagatatccatgttggaaaagatctacatccaccccaggtacaactggcgggagaacctggaccgggacattgccctgatgaagctgaagaagcctgttgccttcagtgactacattcaccctgtgtgtctgcccgacagggagacggcagccagcttgctccaggctggatacaaggggcgggtgacaggctggggcaacctgaaggagacgtggacagccaacgttggtaaggggcagcccagtgtcctgcaggtggtgaacctgcccattgtggagcggccggtctgcaaggactccacccggatccgcatcactgacaacatgttctgtgctggttacaagcctgatgaagggaaacgaggggatgcctgtgaaggtgacagtgggggaccctttgtcatgaagagcccctttaacaaccgctggtatcaaatgggcatcgtctcatggggtgaaggctgtgaccgggatgggaaatatggcttctacacacatgtgttccgcctgaagaagtggatacagaaggtcattgatcagtttggagagtagaagggcaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcaccttcgaccccaaaaaacttgattagggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgccctttccgcagagcaatggcggtgtctgccgggtccgcgcggacctcgcccagctcagataaagtacagaaagacaaggctgaactgatctcagggcccaggcaggacagccgaatagggaaactcttgggttttgagtggacagatttgtccagttggcggaggctggtgaccctgctgaatcgaccaacggaccctgcaagcttagctgtctttcgttttctttttgggttcttgatggtgctagacattccccaggagcgggggctcagctctctggaccggaaataccttgatgggctggatgtgtgccgcttccccttgctggatgccctacgcccactgccacttgactggatgtatcttgtctacaccatcatgtttctgggggcactgggcatgatgctgggcctgtgctaccggataagctgtgtgttattcctgctgccatactggtatgtgtttctcctggacaagacatcatggaacaaccactcctatctgtatgggttgttggcctttcagctaacattcatggatgcaaaccactactggtctgtggacggtctgctgaatgcccataggaggaatgcccacgtgcccctttggaactatgcagtgctccgtggccagatcttcattgtgtacttcattgcgggtgtgaaaaagctggatgcagactgggttgaaggctattccatggaatatttgtcccggcactggctcttcagtcccttcaaactgctgttgtctgaggagctgactagcctgctggtcgtgcactggggtgggctgctgcttgacctctcagctggtttcctgctcttttttgatgtctcaagatccattggcctgttctttgtgtcctacttccactgcatgaattcccagcttttcagcattggtatgttctcctacgtcatgctggccagcagccctctcttctgctcccctgagtggcctcggaagctggtgtcctactgcccccgaaggttgcaacaactgttgcccctcaaggcagcccctcagcccagtgtttcctgtgtgtataagaggagccggggcaaaagtggccagaagc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配列番号２２
VKORhygro:
//gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgcccttcaccatgggcagcacctgggggagccctggctgggtgcggctcgctctttgcctgacgggcttagtgctctcgctctacgcgctgcacgtgaaggcggcgcgcgcccgggaccgggattaccgcgcgctctgcgacgtgggcaccgccatcagctgttcgcgcgtcttctcctccaggtggggcaggggtttcgggctggtggagcatgtgctgggacaggacagcatcctcaatcaatccaacagcatattcggttgcatcttctacacactacagctattgttaggttgcctgcggacacgctgggcctctgtcctgatgctgctgagctccctggtgtctctcgctggttctgtctacctggcctggatcctgttcttcgtgctctatgatttctgcattgtttgtatcaccacctatgctatcaacgtgagcctgatgtggctcagtttccggaaggtccaagaaccccagggcaaggctaagaggcactgaacaagggcaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttggggatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccaggcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagcacgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaa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図１は、Ｆ１０ＮｏｐＡ（第Ｘ因子＋ＧＧＣＸ）共発現ベクターのプラスミドマップ、およびＶＫＯＲｚｅｏ（ＶＫＯＲ）発現ベクターのプラスミドマップを示す。 図２−１は、ＦＩＩ、ＧＧＣＸ、およびＶＫＯＲの共発現のために使用したベクターのプラスミドマップを示す。 図２−２は、ＦＩＩ、ＧＧＣＸ、およびＶＫＯＲの共発現のために使用したベクターのプラスミドマップを示す（図２−１の続き）。

Claims (22)

  1. ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、ならびにビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含する発現ベクター、を包含するホスト細胞であって、
    ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第１のプロモーターを包含し、そしてビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第２のプロモーターを包含し、
    第１のプロモーターが第２のプロモーターより十分に強く、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とビタミンＫエポキシド還元酵素遺伝子が、ｍＲＮＡ比で少なくとも５：１の比率で発現され、
    ここでホスト細胞が、γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列をさらに包含し、
    ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号６であり、ビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号７であるか；または、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号２０であり、ビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号７または配列番号２２であり；そしてホスト細胞がＣＨＯ細胞である、前記ホスト細胞。
  2. 第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）即時型初期プロモーターであり、第２のプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターである、請求項１に記載のホスト細胞。
  3. γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列が、さらに第３のプロモーターを包含し、第１のプロモーターが第３のプロモーターより十分に強く、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とγ−グルタミルカルボキシラーゼ遺伝子が、ｍＲＮＡ比で少なくとも５：１の比率で発現される、請求項１または２に記載のホスト細胞。
  4. 第３のプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターである、請求項３に記載のホスト細胞。
  5. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする前記核酸分子、およびγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子が、１つの発現ベクター内に位置する、請求項１〜４のいずれかに記載のホスト細胞。
  6. （ｉ）ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質、（ｉｉ）ビタミンＫエポキシド還元酵素、および（ｉｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼを発現するように操作されている細胞であって、ここでタンパク質（ｉ）の発現を制御するプロモーターが、タンパク質（ｉｉ）の発現を制御するプロモーターより十分に強く、タンパク質（ｉ）と（ｉｉ）をコードする遺伝子がｍＲＮＡ比で少なくとも５：１の間の比率で発現される、前記細胞。
  7. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が、以下：凝固因子ＶＩＩ、凝固因子ＩＸ、凝固因子ＩＩ、凝固因子Ｘ、第Ｘ因子様蛇毒プロテアーゼ、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテインＺから成る群より選択される、請求項６に記載の細胞。
  8. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質がビタミンＫ依存性の凝固因子である、請求項７に記載の細胞。
  9. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が第ＩＸ因子である、請求項８に記載の細胞。
  10. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が第Ｘ因子である、請求項８に記載の細胞。
  11. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が第Ｘ因子様蛇毒プロテアーゼである、請求項８に記載の細胞。
  12. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が凝固因子ＩＩである、請求項８に記載の細胞。
  13. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が第ＶＩＩ因子である、請求項８に記載の細胞。
  14. 細胞が哺乳類細胞である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
  15. 遺伝的に改変された真核ホスト細胞であって、以下：
    （ｉ）ビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで前記ビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質をコードする配列が、前記細胞によるビタミンＫエポキシド還元酵素タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に、作動可能なように連結されている前記ポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）γ−グルタミルカルボキシラーゼタンパク質によるカルボキシル化を必要とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記細胞によるカルボキシル化を必要とする前記タンパク質の発現を可能にする発現コントロール配列に作動可能なように連結されている前記ポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、
    を包含し、
    ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とビタミンＫエポキシド還元酵素遺伝子を、ｍＲＮＡ比で少なくとも５：１の比率で発現する能力があり、
    ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号６であり、ビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号７であるか；または、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号２０であり、ビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子を包含する発現ベクターが配列番号７または配列番号２２であり；そして
    ホスト細胞がＣＨＯ細胞である、前記ホスト細胞。
  16. γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列をさらに包含する、請求項１５に記載の遺伝的に改変された真核ホスト細胞。
  17. ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、およびビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、を包含するベクター、並びに、γ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含するベクター、を含むベクターのセットであって、
    ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第１のプロモーターを包含し、そしてビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第２のプロモーターを包含し、
    第１のプロモーターが第２のプロモーターより十分に強く、宿主細胞に導入した際にガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とビタミンＫエポキシド還元酵素遺伝子が、ｍＲＮＡ比で少なくとも５：１の比率で発現される、前記ベクターのセット。
  18. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、ビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列、並びにγ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする核酸分子および関連する発現コントロール配列を包含するベクターであって、
    ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第１のプロモーターを包含し、そしてビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする前記核酸分子および関連する発現コントロール配列が、第２のプロモーターを包含し、
    第１のプロモーターが第２のプロモーターより十分に強く、宿主細胞に導入した際にガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子とビタミンＫエポキシド還元酵素遺伝子が、ｍＲＮＡ比で少なくとも５：１の比率で発現される、前記ベクター。
  19. 第１のプロモーターがヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）即時型初期プロモーターであり、第２のプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターである、請求項１７に記載のベクターのセット又は請求項１８に記載のベクター。
  20. ガンマ-カルボキシル化を必要とするタンパク質が、以下：凝固因子ＶＩＩ、凝固因子ＩＸ、凝固因子ＩＩ、凝固因子Ｘ、第Ｘ因子様蛇毒プロテアーゼ、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテインＺから成る群より選択される、請求項１７から１９のいずれか1項に記載のベクターのセットまたはベクター。
  21. 以下：
    （ｉ）請求項１に記載された細胞を培養すること、ここで、前記細胞は、ガンマ−カルボキシル化を必要とするタンパク質をコードする遺伝子およびビタミンＫエポキシド還元酵素遺伝子を、ｍＲＮＡ比で少なくとも５：１の比率で発現する、および
    （ｉｉ）ガンマ−カルボキシル化タンパク質を単離すること、
    を包含するガンマ−カルボキシル化タンパク質を製造するための方法。
  22. 請求項２１に記載の方法に従って活性なカルボキシル化タンパク質を製造、精製し、そして精製されたカルボキシル化タンパク質を、１つまたはそれより多くの医薬的に受容可能な担体または賦形剤と共に混合する工程を包含する、血液凝固を誘発する、または血液凝固を増大させるために適する医薬組成物を製造する方法。
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