BRPI0609120A2 - célula, vetor, e, métodos para produzir proteìna gama-carboxilada e para produzir uma composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

CéLULA, VETOR, E, METODOS PARA PRODUZIR PROTEìNA GAMA-CARBOXILADA E PARA PRODUZIR UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma proteína requerendo gama-carboxilação e às seqüências de controle de expressão associadas e a uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e às seqüências de controle de expressão associadas e a uma molécula de ácido nucleico codificadora de <sym>-glutamil-carboxilase e às seqüências de controle associadas. A invenção refere-se em adição a um método de produção de uma proteína requerendo -gama-carboxilação em rendimentos altos.

Description

"CÉLULA, VETOR, Ε, MÉTODOS PARA PRODUZIR PROTEÍNAGAMA-CARBOXILADA E PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA"

Campo técnico

A presente invenção refere-se a uma célula hospedeiracompreendendo um vetor de expressão compreendendo uma molécula deácido nucleico codificadora de uma proteína requerendo gama-carboxilação eàs seqüências de controle de expressão associadas e a uma molécula de ácidonucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e às seqüências decontrole de expressão associadas e a uma molécula de ácido nucleicocodificadora de γ-glutamil-carboxilase e às seqüências de controle associadas.A invenção refere-se em adição a um método de produção de uma proteínarequerendo gama-carboxilação em rendimentos altos.

Fundamentos da invenção

Sangramento é um problema clínico comum. E umaconseqüência de doença, trauma, cirurgia e tratamento médico. E imperativointerromper mecanicamente o sangramento. Isto pode ser difícil ou até mesmoimpossível devido à localização do sangramento ou porque ele se difunde demuitos vasos (pequenos). Pacientes que estão sangrando podem portantorequerer tratamento com agentes que suportam hemóstase. Estes podem serprodutos derivados de sangue (hemoterapia), agentes que causam a liberaçãode agentes hemostáticos endógenos, fatores de coagulação recombinantes (F),ou agentes que retardam a dissolução de coágulos de sangue.

O tratamento de primeira linha dentre os produtos derivados desangue, muitas vezes obtidos do hospital local, são sangue inteiro parasubstituição de volume e suporte de hemóstase, células vermelhasempacotadas para a melhoria da capacidade de transporte de oxigênio,concentrados de plaquetas para elevar o número de plaquetas (se baixo oudefectivo) e plasma congelado fresco para suporte da hemóstase (coagulaçãode sangue e agregação de plaquetas). Produtos derivados de plasma desegunda linha que suportam hemóstase são crioprecipitado de plasma,concentrados de complexo de protrombina, concentrados de complexo deprotrombina ativado e fatores de coagulação purificados. Vários fatores decoagulação estão hoje disponíveis como proteínas recombinantes de humano,inativas (fatores de coagulação VIII e IX) e ativadas (fator de coagulação Vila).

Hemofilia é um distúrbio de sangramento herdado ouadquirido quer com fator de coagulação anormal ou deficiente quer comanticorpos direcionados para um fator de coagulação que inibe a função depró-coagulante. As hemofilias mais comuns são hemofilia A (falta de fator decoagulação VIII) e hemofilia B (fator IX). Os fatores de coagulaçãoindividuais recombinantes ou purificados são o tratamento principal depacientes com hemofilia. Pacientes com anticorpos inibitórios possuem umproblema de tratamento porque também podem neutralizar o fator decoagulação que é administrado ao paciente.

A forma ativa de Proteína C (APC) é um inibidor decoagulação de plasma pela degradação dos fatores de coagulação ativados Vae VIIIa. Tem sido mostrado que APC recombinante é um tratamento efetivode coagulação de plasma indevida em pacientes com sepsia.

Fatores de coagulação para uso terapêutico podem ser obtidosde plasma de humano, embora o processo de purificação não seja simples erequeira muitas etapas das quais muitas almejam a eliminação de víruscontaminantes. Mas mesmo com medidas de segurança extensivas e teste deprodutos derivados de sangue, contaminação com príon ou vírus infecciososnão pode ser excluída. Devido a este risco é elevadamente desejável produzirproteínas terapêuticas de humano a partir de células recombinantes crescidasem meios sem componentes derivados de animal. Isto nem sempre é diretoporque muitas proteínas requerem um hospedeiro mamífero para seremproduzidas em uma forma totalmente funcional, i.e. serem corretamentemodificadas após a tradução. Dentre os fatores de coagulação comercialmenteproduzidos em células recombinantes encontram-se FVII (NovoSeven), FVIII(Kogenate, Recombinate, Refacto) e FEX (BeneFix) (Roddie e Ludlam. BloodRev. 11:169 - 177, 1997) e Proteína C Ativa (Xigris). Um dos maioresobstáculos na obtenção de quantidades grandes de fatores de coagulação dehumano recombinantes totalmente funcionais reside no domínio-Gla presenteem FIIs FVII, FIX, FX, Proteína S e Proteína C. Este domínio contémresíduos de ácido glutâmico que são modificados após a tradução pela adiçãode grupos carboxila. A produção destes fatores é impedida pelo fato de quesobre-expressão deles resulta em proteína sub-carboxilada, econseqüentemente inativa. As modificações em Gla são um resultado da açãode uma enzima dependente de vitamina K chamada γ-glutamil-carboxilase(GGCX). Esta enzima tem sido extensivamente estudada por muitoscientistas, particularmente aqueles envolvidos em pesquisa de fator decoagulação (WO-A-8803926; Wu et al. Science 254(5038): 1634-1636, 1991;Rehemtulla et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:4611-4615, 1993; Stanley J.Biol. Chem. 274(24): 16940-16944, 1999; Vo et al., FEBS letters 445:256-260, 1999; Begley et al., The Journal of Biological Chemistry 275(46):36245-36249, 2000; Walker et al., The Journal of Biological Chemistry276(11):7769-7774, 2001; Bandyopadhyay, et al. Proe Natl Aead Sei USA99(3): 1264-1269, 2002; Czerwiec et al, Eur J Biochem 269:6162-6172,2002; Hallgren et al., Bioehemistry 41(50):15045-15055, 2002; Harvey et al.,The Journal of Biologieal Chemistry 278(10):8363-8369, 2003). Tentativaspara co-expressar GGCX com fator de coagulação FIX têm sido tentadas porpelo menos dois grupos científicos mas não foram bem sucedidas(Rehemtulla, et al. 1993, ibid; Hallgren et al. 2002, ibid). Considerando ainteresse grande por enzimas GGCX, pode ser assumido que muito maistentativas têm falhado e portanto não têm sido relatadas. GGCX requervitamina K reduzida como um cofator. A vitamina K reduzida é convertidapor GGCX em vitamina-K-epóxido, que é reciclado para vitamina K reduzidapor Vitamina-K-epóxido-redutase (VKOR). Assim para carboxilaçãoeficiente de proteínas dependente de vitamina K são requeridas duas enzimas,GGCX e VKOR. Clonagem e identificação de VKOR foram relatadas 2004(Li et al., Nature 427:541-543, 2004, Rost et al., Nature 427:537-541, 2004).

A proteína VKOR é um polipeptídeo de 163 aminoácidos com pelo menosuma região de transmembrana predita. Atividade de VKOR expressada porcélulas recombinantes está localizada na fração subcelular microssômica.

Para FII de humano (protrombina) pelo menos 8 de 10resíduos de Glu têm que ser corretamente modificados com o propósito deobter protrombina totalmente funcional (Malhotra, et al., J. Biol. Chem.260:279-287, 1985; Seegers e Walz 'Protrombina and other vitamin Kproteins', CRC Press, 1986). Similarmente, atividade coagulante de fator decoagulação IX de humano requer γ-carboxilação de pelo menos 10 de 12resíduos glutâmicos no domínio-Gla (White et al, Thromb. Haemost. 78:261-265, 1997). Esforços extensivos para obter níveis de produção altos de rhFIItêm sido feitos usando sistemas diferentes tais como células CHO, célulasBHK, células 293 e sistemas de expressão de vírus de vacínia, mas todos têmfalhado ou resultado em um produto sub-carboxilado e portanto emprotrombina funcionalmente inativa (JOrgensen et al., J. Biol Chem.262:6729-6734, 1987; Russo et al., Biotechnol Appl Biochem 14(2):222-233,1991; Fischer et al., J Biotechnol 38(2): 129-136, 1995; Herlitschka et al.Protein Expr. Purif. 8(3):358-364, 1996; Russo et al., Protein Expr. Purif.10:214-225, 1997; Vo et al. 1999, ibid; Wu e Suttie Thromb Res 96(2):91-98,1999). Produtividades inicialmente relatadas para protrombina recombinantecarboxilada de humano são baixas; 20 mg/L para protrombina mutante (COteet al., J. Biol. Chem 269:11374-11380, 1994), 0,55 mg/L para protrombina dehumano expressada em células CHO (totalmente carboxilada, JOrgensen etal. 1987, ibid), 25 mg/L em células CHO (grau de carboxilação não mostrado,Russo et al. 1997, ibid).

Até onde sabido a co-expressão de uma proteína requerendo γ-carboxilação e VKOR não tem sido relatada anteriormente.

WO 92/19636 descreve a clonagem e a identificação deseqüência de uma carboxilase dependente de vitamina K de bovino e dehumano. O pedido sugere a co-expressão de carboxilase dependente devitamina K e de uma proteína dependente de vitamina K em uma célulahospedeira adequada com o objetivo de preparar a proteína dependente devitamina K. Não é exemplificada a co-expressão de carboxilase e de proteínadependente de vitamina K.

WO 92/19636 descreve a clonagem e a identificação deseqüência de uma carboxilase dependente de vitamina K de bovino e dehumano. O pedido sugere a co-expressão de carboxilase dependente devitamina K (GGCX) e de uma proteína dependente de vitamina K em umacélula hospedeira adequada com o objetivo de preparar a proteína dependentede vitamina K. Não é exemplificada a co-expressão da carboxilase e daproteína dependente de vitamina K.

WO 2005/038019 reivindica um método de aumentar aprodutividade total de proteína γ-carboxilada por uma co-expressãocontrolada de proteína γ-carboxilada e de GGCX. A invenção é exemplificadacom produtividade aumentada de fatores de coagulação II e FIX.

WO 2005/030039 sugere a co-expressão de proteínasdependentes de vitamina K com Vitamina-K-epóxido-redutase (VKOR) como objetivo de melhorar a γ-carboxilação. Contudo, tal co-expressão não éexemplificada.

Tem sido mostrado que a co-expressão de fator de coagulaçãoX (FX) e de VKOR melhora o compartilhamento de proteína γ-carboxiladapor Sun et al. (Blood 106: 3811-3815, 2005). Wajih et al. {JBC 280:31603-31607, 2005) têm demonstrado em adição o compartilhamento de fator decoagulação IX (FIX) γ-carboxilado pela co-expressão com VKOR. Ambas aspublicações relataram que VKOR aumentou o compartilhamento de proteínaγ-carboxilada mas co-expressão de VKOR não melhorou a produtividade totalde fator de coagulação.

Há uma necessidade de métodos melhorados para produzirfatores de coagulação de sangue ativados em rendimentos altos. A presenteinvenção procura atender a esta necessidade.

Sumário da invenção

De acordo com um primeiro aspecto da invenção éproporcionada uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressãocompreendendo uma molécula de ácido nucleico codificadora de umaproteína requerendo gama-carboxilação e seqüências de controle de expressãoassociadas, e um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácidonucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e seqüências decontrole de expressão associadas, na qual a célula hospedeira compreendeadicionalmente uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase e seqüências de controle de expressão associadas.

Em outro aspecto, é proporciona uma célula a qual estáengenheirada para expressar (i) uma proteína que requer gama-carboxilação, e(ii) vitamina-K-epóxido-redutase, na qual as proteínas (i) e (ii) sãoexpressadas em uma razão entre 10:1 e 500:1.

De acordo com um outro aspecto é proporcionada uma célulaeucariótica geneticamente modificada compreendendo: (i) um polinucleotídeocodificador de proteína vitamina-K-epóxido-redutase na qual a citadaseqüência codificadora de proteína vitamina-K-epóxido-redutase estáoperacionalmente ligada nas seqüências de controle de expressão permitindoa expressão de proteína vitamina-K-epóxido-redutase pela citada célula; (ii)um polinucleotídeo codificador de uma proteína requerendo carboxilação pelaproteína g-glutamil-carboxilase operacionalmente ligada em seqüências decontrole de expressão permitindo a expressão de citada proteína requerendocarboxilação pela citada célula, e (iii) um polinucleotídeo codificador degama-glutamil-carboxilase.

De acordo com ainda outro aspecto é proporcionado um vetorcompreendendo uma molécula de ácido nucleico codificadora de umaproteína requerendo gama-carboxilação e seqüências de controle de expressãoassociadas e uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e seqüências de controle de expressão associadas.

De acordo com outro aspecto é proporcionado um método paraproduzir proteína gama-carboxilada compreendendo: (i) cultivar uma célulaexpressando uma proteína recombinante que requer gama-carboxilação,vitamina-K-epóxido-redutase e uma γ-glutamil-carboxilase e (ii) isolar aproteína gama-carboxilada.

De acordo com outro aspecto é proporcionado um método deprodução de uma composição farmacêutica adequada para induzir coagulaçãode sangue ou promover coagulação aumentada ou diminuída, compreendendopurificar proteína carboxilada produzida de acordo com os métodos acima emisturar a proteína carboxilada purificada com um ou mais excipientes ouveículos farmaceuticamente aceitáveis.

De acordo com um outro aspecto é proporcionado um métodode promoção de coagulação aumentada ou diminuída em um indivíduocompreendendo administrar uma quantidade farmacologicamente efetiva deuma proteína gama-carboxilada isolada obtida pelos métodos acima a umpaciente em necessidade da mesma.

A proteína requerendo gama-carboxilação produzida pelosmétodos da presente invenção pode ser usada em terapia hemostática ou anti-trombótica.

Breve descrição das figurasFigura 1 mostra um mapa de plasmídeo de vetor de co-expressão (fator X + GGCX) F1 ONopA e um mapa de plasmídeo de vetor deexpressão VKORzeo (VKOR).

Figura 2 mostra mapas de plasmídeo de vetores usados paraco-expressão de FII, GGCX e VKOR

Descrição detalhada da invenção

De acordo com um primeiro aspecto da invenção éproporcionada uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressãocompreendendo uma molécula de ácido nucleico codificadora de umaproteína requerendo gama-carboxilação e seqüências de controle de expressãoassociadas, e um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácidonucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e seqüências decontrole de expressão associadas, na qual a célula hospedeira compreendeadicionalmente uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase e seqüências de controle de expressão associadas.

Em uma modalidade a citada molécula de ácido nucleicocodificadora de uma proteína requerendo gama-carboxilação e seqüências decontrole de expressão associadas compreende um primeiro promotor, e acitada molécula de ácido nucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e seqüências de controle de expressão associadas compreende umsegundo promotor. Em outra modalidade o primeiro promotor ésuficientemente mais forte do que o segundo promotor de modo que aproteína requerendo gama-carboxilação e a vitamina-K-epóxido-redutase sãoexpressadas em uma razão de pelo menos 10:1. Em outra modalidade oprimeiro promotor é suficientemente mais forte do que o segundo promotorde modo que a proteína requerendo gama-carboxilação e a vitamina-K-epóxido-redutase são expressadas em uma razão de pelo menos 5:1.

Em outra modalidade a célula adicionalmente compreendeuma molécula de ácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase eseqüências de controle de expressão associadas. Em uma modalidade, amolécula de ácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase eseqüências de controle de expressão associadas adicionalmente compreendeum terceiro promotor, na qual o primeiro promotor é suficientemente maisforte do que o terceiro promotor de modo que a proteína requerendo gama-carboxilação e a γ-glutamil-carboxilase são expressadas em uma razão de pelomenos 10:1. Em outra modalidade o primeiro promotor é suficientementemais forte do que o segundo promotor de modo que a proteína requerendogama-carboxilação e a vitamina-K-epóxido-redutase são expressadas em umarazão de pelo menos 5:1.

O primeiro promotor pode ser promotor precoce imediato decitomegalovírus de humano (hCMV) e os segundo e terceiro promotorespodem ser o promotor precoce de SV40.

Em uma modalidade particular, tanto a molécula de ácidonucleico codificadora de proteína requerendo gama-carboxilação e seqüênciasde controle de expressão associadas, quanto a molécula de ácido nucleicocodificadora de vitamina-K-epóxido-redutase, e opcionalmente de γ-glutamil-carboxilase, e seqüências de controle de expressão associadas estãolocalizadas no mesmo vetor de expressão. Em outra modalidade estas duas ouopcionalmente três moléculas de ácido nucleico estão localizadas em dois oumais vetores de expressão.

Em outro aspecto é proporcionada uma célula a qual estáengenheirada para expressar (i) uma proteína que requer gama-carboxilação, e(ii) vitamina-K-epóxido-redutase, na qual as proteínas (i) e (ii) sãoexpressadas em uma razão entre 10:1 e 500:1. Em outra modalidade, asproteínas (i) e (ii) são expressadas em uma razão entre 5:1 e 500:1

A proteína que requer gama-carboxilação é selecionada dogrupo consistindo de: fator de coagulação VII, coagulação FVII, fator decoagulação IX, coagulação FIX, protrombina, fator de coagulação II,coagulação FII, fator de coagulação X, coagulação FX5 e suas formas ativadasFVIIa, FLXa, FXa, Proteína C, Proteína S, Proteína Z, Proteína Gla de Osso,Proteína Gla de Matriz, Proteína 6 específica de parada de crescimento,proteases de veneno de cobra similares aos fatores de coagulação tais comoproteases de veneno de cobra semelhantes a Fator X, e proteína semelhante aFXa de Acanthophiinae.

Em uma modalidade, a proteína que requer gama-carboxilaçãoé um fator de coagulação dependente de vitamina K. Em outra modalidade, aproteína que requer gama-carboxilação é Fator EX. Em uma terceiramodalidade, a proteína que requer gama-carboxilação é protrombina. Em umaquarta modalidade, a proteína que requer gama-carboxilação é Fator X. Emuma quinta modalidade, a proteína que requer gama-carboxilação é fator VII.

A proteína que requer gama-carboxilação é preferivelmenteuma proteína de humano mas todas as proteínas eucarióticas estão incluídasna invenção. Vitamina-K-epóxido-redutase é preferivelmente uma proteína dehumano mas todas as Vitamina-K-epóxido-redutases eucarióticas podem serusadas na presente invenção. γ-Glutamil-carboxilase é preferivelmente umaproteína de humano mas todas as γ-glutamil-carboxilases eucarióticas podemser usadas na presente invenção.

De acordo com um outro aspecto é proporcionada uma célulaeucariótica geneticamente modificada compreendendo:

(i) um polinucleotídeo codificador de proteína vitamina-K-epóxido-redutase na qual a citada seqüência codifícadora de proteínavitamina-K-epóxido-redutase está operacionalmente ligada nas seqüências decontrole de expressão permitindo a expressão de proteína vitamina-K-epóxido-redutase pela citada célula; e

(ii) um polinucleotídeo codificador de uma proteínarequerendo carboxilação pela proteína γ-glutamil-carboxilaseoperacionalmente ligada em seqüências de controle de expressão permitindo aexpressão de citada proteína requerendo carboxilação pela citada célula.

(iii) um polinucleotídeo codificador de gama-glutamil-carboxilase na qual citada seqüência codificadora de proteína gama-glutamil-carboxilase está operacionalmente ligada nas seqüências de controle deexpressão permitindo a expressão de proteína gama-glutamil-carboxilase pelacitada célula.

Em uma modalidade, a célula é capaz de expressar a proteínavitamina-K-epóxido-redutase e a proteína requerendo carboxilação na razãode pelo menos 1:10. Em outra modalidade, citada razão é pelo menos 1:5.

A célula hospedeira é preferivelmente uma célula eucariótica.Células hospedeiras típicas incluem, mas não são limitadas às células deinseto, célula de levedura, e células de mamífero. Células de mamífero sãoparticularmente preferias. Linhagens de células de mamífero adequadasincluem, mas não são limitadas a, células CHO, HEK, NSO, 293, Per C.6,BHK e COS, e seus derivados. Em uma modalidade a célula hospedeira é alinhagem de célula de mamífero CHO-S.

De acordo com ainda outro aspecto é proporcionado um vetorcompreendendo uma molécula de ácido nucleico codificadora de umaproteína requerendo gama-carboxilação e seqüências de controle de expressãoassociadas e uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e seqüências de controle de expressão associadas.

Em uma modalidade a molécula de ácido nucleico codifica uma proteínarequerendo gama-carboxilação e seqüências de controle de expressãoassociadas compreendem um primeiro promotor, e a molécula de ácidonucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e seqüências decontrole de expressão associadas compreendem um segundo promotor. Oprimeiro promotor pode ser suficientemente mais forte do que o segundopromotor de modo que a proteína requerendo gama-carboxilação e avitamina-K-epóxido-redutase são expressadas em uma razão de pelo menos10:1. Em outra modalidade esta razão é 5:1. O vetor também poderiacompreender uma molécula de ácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase e seqüências de controle de expressão associadas. Citadamolécula de ácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase eseqüências de controle de expressão associadas poderiam compreender umterceiro promotor, na qual o primeiro promotor é suficientemente mais fortedo que o terceiro promotor de modo que a proteína requerendo gama-carboxilação e γ-glutamil-carboxilase são expressadas em uma razão de pelomenos 10:1. Em outra modalidade esta razão é 5:1. A proteína que requergama-carboxilação pode ser selecionada do grupo consistindo de: fator decoagulação VII, coagulação FVII, fator de coagulação IX, coagulação FIX,protrombina, fator de coagulação II, coagulação FII, fator de coagulação X,coagulação FX, e suas formas ativadas FVIIa, FIXa, Fxa, proteases de venenode cobra simulares aos fatores de coagulação tais como Proteases de venenode cobra semelhantes a Fator X e proteína semelhante a FXa deAcanthophiinae, Proteína C, Proteína S, Proteína Z, Proteína Gla de Osso,Proteína Gla de Matriz, Proteína 6 específica de parada de crescimento.

De acordo com outro aspecto é proporcionado um método paraproduzir proteína gama-carboxilada compreendendo: (i) cultivar uma célulaexpressando uma proteína recombinante que requer gama-carboxilação,vitamina-K-epóxido-redutase e uma g-glutamil-carboxilase e (ii) isolar aproteína gama-carboxilada.

A citada célula expressa a proteína que requer gama-carboxilação e vitamina-K-epóxido-redutase em uma razão de pelo menos10:1, sob condições adequadas para expressão de ambas as proteínas.

Pode ser esperado que os fatores de coagulação dependentesde vitamina K (FII, FVII, FEX, FX e suas formas derivadas FIIa ou trombina,FVIIa, FIXa, FXa) produzidos pelo presente método de co-expressão comVKOR sozinha ou em combinação sejam úteis na prevenção e no tratamentode sangramento após trauma, cirurgia ou doenças do fígado, dos rins, deplaquetas ou fatores de coagulação de sangue (hemofilia). Igualmente podeser esperado que o fator de coagulação Proteína C e sua forma ativada APCsejam úteis na prevenção e no tratamento de distúrbios de coagulaçãoaumentada com ou sem níveis diminuídos de Proteína C. O método também éaplicável a outras proteínas que requerem carboxilação após tradução.

A presente invenção será aplicável para melhorar aprodutividade de qualquer proteína que seja dependente de γ-carboxilação,tais proteínas incluem, mas não se limitam a: protrombina, fator decoagulação II (FII), fator de coagulação VII (FVII), fator de coagulação IX(FIX), fator de coagulação X (FX), Proteína C, Proteína S, Proteína Z,Proteína Gla de Osso (também conhecida como: BGP ou osteocalcina),Proteína Gla de Matriz (MGP), polipeptídeo 1 de Gla rico em prolina(PRRG1), polipeptídeo 2 de Gla rico em prolina 2 (PRRG2), Proteína 6específica de parada de crescimento (Gas 6). Outras proteínas adequada são:proteína semelhante a FXa em veneno de cobra elapídea (subfamíliaAcanthophiinae) e veneno de lesma de cone (Conus textilé).

Cada uma destas proteínas, incluindo suas seqüências de ácidonucleico e de aminoácidos, são bem conhecidas. Tabela 1 identificaseqüências representativas e formas mutantes das várias proteínas que podemser usadas na presente invenção.

Tabela 1.

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Será reconhecido que a invenção não é restringida a umaproteína ou seqüência codificadora de proteína particular de uma destasproteinase serem co-expressadas. Ainda mais, e em particular com respeitoaos fatores de coagulação de sangue, numerosas formas mutantes dasproteínas têm sido descritas na técnica. A presente invenção é igualmenteaplicável a estas formas mutantes, incluindo variantes alélicas naturalmenteocorrentes, das proteínas do mesmo modo à seqüência de tipo selvagem. Emuma modalidade a invenção pode ser realizada com qualquer proteína de tiposelvagem ou uma com pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95% deidentidade de seqüência em relação à mesma.

A identidade de seqüência entre duas seqüências pode serdeterminada por análise computacional de alinhamento por pareamento,usando programas tais como, BestFit, Gap ou FrameAlign. A ferramenta dealinhamento é BestFit. Na prática, quando se pesquisam seqüências similares /idênticas para a pesquisa interrogativa, a partir de um banco de dados deseqüências, é geralmente necessário realizar uma identificação inicial deseqüências similares usando programa de computador adequado tal comoBlast, Blast2, NCBI Blast2, WashU Blast2, FastA, Fasta3 e PDLEUP, e umamatriz de substituição tal como Blosum 62. Tais pacotes de programas decomputador empenham-se em aproximar rigorosamente o algoritmo dealinhamento "padrão-ouro" de Smith-Waterman. Assim, o programa decomputador de serviço de busca preferido para uso em avaliação desimilaridade, i.e., como duas seqüências de polipeptídeo primárias se alinham,é Smith-Waterman. Identidade refere-se às combinações diretas, similaridadepermite substituições conservadoras.

O termo vitamina-K-epóxido-redutase ou "VKOR", como aquiusado, refere-se a uma enzima que catalisa redução de vitamina-K-epóxido evitamina K para formar vitamina K reduzida.

Vitamina-K-redutases estão amplamente distribuídas, e têmsido clonadas de várias espécies diferentes tais como camundongo (Musmusculus), rato (Rattus norveigicus), frango (Gallus gallus) e vaca (Bostaurus). Proteínas homólogas podem ser preditas de seqüências de organismosde origem filogenética amplamente dispersa tais como mamíferos, pássaros,anfíbios, osteíctes, moscas, cinetoplastídeos e bactérias. Tabela 2 representauma lista não limitada de seqüências representativas de homólogos deproteína preditos à VKOR de humano (classificado segundo origem deespécie) que podem ser usadas na presente invenção.

Tabela 2.

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O termo "γ-glutamil-carboxilase" ou "GGCX", como aquiusado, refere-se à enzima dependente de vitamina K que catalisa acarboxilação de resíduos de ácido glutâmico.

Enzimas GGCX estão amplamente distribuídas, e têm sidoclonadas de muitas espécies diferentes tais como a baleia belugaDelphinapterus leucas, o peixe-sapo (Opsanus tau), frango (Gallus gallus),peixe-bruxa {Myxine glutinosa), límulo (Limulus polyphemus), e lesma decone Conus textile (Begley et al., 2000, ibid; Bandyopadhyay et ai. 2002,ibid). A carboxilase de lesma de cone é similar à carboxilase de bovino e temsido expressada em células COS (Czerwiec et al. 2002, ibid). Proteínasadicionais similares a GGCX podem ser encontradas em insetos e procariotostais como Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster e Leptospira comnúmeros de acesso NCBI: gi 31217234, gi 21298685, gi 24216281, gi24197548 e (Bandyopadhyay et al., 2002, ibid), respectivamente. A enzimacarboxilase exibe conservação evolucionária notável. Várias das enzimas denão-humano têm mostrado, ou podem ser preditas para possuírem, atividadesimilar àquela de GGCX de humano, que foi usado, e podem ser portantoutilizadas como uma alternativa à enzima de humano.

Tabela 3 identifica seqüências representativas de proteínas5 preditas homólogas à GGXC de humano (classificadas segundo a espécie) quepodem ser usadas na presente invenção.

Tabela 3.

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Cada uma das proteínas GGCX identificadas acima podem serusadas como a enzima carboxilase na presente invenção.

Um modo de efetuar as proteínas co-expressadas é o uso depromotores diferentes como parte das respectivas seqüências de controle deexpressão. A técnica está repleta de exemplos de diferentes vetores declonagem, promotores e outras seqüências de controle de expressão que sãocapazes de expressarem proteínas heterólogas em diferentes graus ouextensões.Tecnologia de expressão recombinante está adequadamenteavançada de tal modo que uma pessoa experiente na técnica de expressão deproteína é capaz de selecionar promotores e outras seqüências de controlepara realizar a co-expressão de uma proteína requerendo carboxilação,vitamina-K-epóxido-redutase e, opcionalmente, a γ-carboxilase. A seleção depromotores específicos e de outras seqüências de controle de expressão aserem usadas é questão de escolha individual.

Em uma modalidade, as seqüências de controle associadascom uma proteína requerendo gama-carboxilação compreendem um promotorforte. Em uma modalidade este é o promotor precoce imediato decitomegalovírus de humano (hCMV). Um promotor forte é aqui definidocomo um promotor que ocasiona pelo menos cinco vezes mais números detranscritos de mNA do que um promotor fraco usado na mesma célula sobcondições similares.

Em outra modalidade, as seqüências de controle associadascom a vitamina-K-epóxido-redutase, e quando presente a γ-glutamil-carboxilase, compreende um promotor fraco. Em uma modalidade este épromotor precoce de SV40. Em outra modalidade a proteína requerendogama-carboxilação e a vitamina-K-epóxido-redutase, e opcionalmente a γ-glutamil-carboxilase, estão sob o controle de diferentes elementos promotorescom o promotor controlando expressão da vitamina-K-epóxido-redutase, eopcionalmente da γ-glutamil-carboxilase, sendo mais fraco do que o promotorcontrolando a expressão de uma proteína requerendo gama-carboxilação.

A invenção tem sido exemplificada pelo uso de promotor fortede CMV (Boshart et al. Cell 41:521-530, 1985) para sobre-expressar Fator Xe o promotor mais fraco de SV40 (Wenger et al. Anal Biochem 221:416-418,1994) para controlar a expressão de vitamina-K-epóxido-redutase eopcionalmente a expressão de GGCX. Outros promotores fortes que poderiamser usados de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam a,pEF-Ια [gene de subunidade de Fator-ΐα de alongamento de humano)(Mizushima e Nagata, Nuc Aeids Res 18:5322, 1990; Goldman et al.,BioTeehniques 21:1013-1015, 1996)], pRSV [vírus do sarcoma de Rous] epUbC [ubiquitina de humano (Schorpp et al., Nuc Acids Res 24:1787-1788,1996)].

A invenção também se estende à proteína gama-carboxiladapurificada produzida pelos métodos da presente invenção e ao seu uso emterapia coagulante.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção éproporcionado um método de promoção de coagulação aumentada oudiminuída em um indivíduo compreendendo administrar uma quantidadefarmacologicamente efetiva de uma proteína gama-carboxilada isolada obtidapelos métodos descritos acima a um paciente em necessidade da mesma.

De acordo com um outro aspecto da invenção é proporcionadoum método de produção de uma composição farmacêutica adequada parainduzir coagulação de sangue, compreendendo purificar proteína carboxiladaexpressada de uma célula hospedeira adaptada para expressar uma proteínarequerendo gama-carboxilação e γ-glutamil-carboxilase em uma razão de pelomenos 5:1 e misturar a proteína carboxilada purificada com um ou maisexcipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

As composições da invenção podem ser obtidas porprocedimentos convencionais usando excipientes farmacêuticosconvencionais, bem conhecidos na técnica, mas mais provavelmente estarãoem uma forma adequada para injeção, quer parenteral quer direta para dentrodo sítio de ferimento.

Pós adequados para preparação de uma preparação aquosapara injeção, pela administração de um diluente adequado, geralmente,contêm o ingrediente ativo junto com excipientes e veículos, agentes desuspensão e um ou mais conservantes ou estabilizadores adequados. Odiluente pode conter outros excipientes adequados, tais como conservantes,modificadores de tonicidade e estabilizadores.

As composições farmacêuticas da invenção também podemestar na forma de emulsões de óleo-em-água. A fase oleosa pode ser um óleovegetal, tal como azeite de oliva ou óleo de aráquis, ou um óleo mineral, talcomo por exemplo parafina líquida ou uma mistura de quaisquer destes.Agentes emulsificadores adequados podem ser, por exemplo, gomasnaturalmente ocorrentes tal como goma acácia ou goma tragacanto,fosfatídeos naturalmente ocorrentes tais como feijão-soja, lecitina, ésteres ouésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol (porexemplo monooleato de sorbitana) e produtos de condensação dos citadosésteres parciais com óxido de etileno tal como monooleato de polioxietileno-sorbitana.

As composições farmacêuticas da invenção da invençãotambém podem estar na forma de uma solução ou suspensão estéril em umsolvente ou diluente parenteralmente aceitável não-tóxico, que podem serformuladas de acordo com procedimentos conhecidos usando um ou maisagentes de suspensão e agentes umectantes ou de dispersão apropriados, quetêm sido mencionados acima. Uma preparação injetável estéril também podeser uma suspensão ou solução injetável estéril em um solvente ou diluenteparenteralmente aceitável não-tóxico, por exemplo uma solução em 1,3-butanodiol.

Para informação adicional sobre Formulação o leitor deve sereferir ao Chapter 25.2 em Volume 5 de Comprehensive Medicinal Chemistry(Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990; ou,Volume 99 de Drugs e the pharmaceutical Sciences-, Protein formulation edelivery (Eugen J. McNally, executive editor), Mareei Dekker Inc 2000.

A quantidade de ingrediente ativo que é combinada com umou mais excipientes para produzir uma forma de dosagem unitárianecessariamente variará dependendo do hospedeiro tratado e da rota deadministração particular. Por exemplo, uma formulação intencionada parainjeção em humanos geralmente conterá, por exemplo, de 0,2 mg a 6 g ou de0,5 mg a 2 g de ingrediente ativo composto com uma quantidade apropriada econveniente de excipientes que pode variar de cerca de 5 a cerca de 98 porcento em peso da composição total. Formas de unidade de dosagemgeralmente conterão cerca de 0,2 mg a cerca de 10 g ou cerca de 1 mg a cercade 500 mg de ingrediente ativo. Agentes terapêuticos proteináceos sãonormalmente armazenados congelados ou secos por congelamento. Parainformação adicional sobre Rotas de Administração e Regimes de Dosagem oleitor deve ser referir ao Chapter 25.3 em Volume 5 de ComprehensiveMedicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), PergamonPress 1990.

O tamanho da dose para propósitos profiláticos ou terapêuticosde um composto naturalmente variará de acordo com a natureza e aseveridade das condições, a idade e o seco do animal ou paciente e a rota deadministração, de acordo com princípios de medicina bem conhecidos. Emuso um composto para propósitos profiláticos ou terapêuticos em geral seráadministrado de modo que uma dose diária dentro da faixa de, por exemplo,20 μ§ a 75 mg por kg de peso corpo ou de 0,5 mg a 75 mg por kg de pesocorporal seja recebida, dada se requerido em doses divididas. Em geral dosesmenores serão administradas quando uma rota parenteral for empregada.

Assim, por exemplo, para administração intravenosa, uma dose dentro dafaixa de, por exemplo, 20 μg a 30 mg por kg de peso corporal ou de 0,5 mg a30 mg per kg de peso corporal em geral será usada. Similarmente, paraadministração por inalação, uma dose dentro da faixa de, por exemplo, 20 μga 30 mg por kg ou de,5 mg a 25 mg por kg de peso corporal será usada. Comouma alternativa o composto pode ser administrado como uma infusão de 1 μg- 10 mg por quilograma de peso corporal e hora durante um período de tempode umas poucas horas a vários dias.

Seção Experimental

A invenção será adicionalmente descrita por meio de seguintesexemplos não limitantes.

A prática da presente invenção empregará, a não ser que sejaindicado de outro modo, métodos convencionais de técnicas de DNArecombinante e de biologia molecular dentro da capacidade da técnica. Taistécnicas são explicadas totalmente na literatura. Veja, e.g., Sambrook et al,eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al, eds.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY(2002); Glover & Hames, eds., DNA Cloning 3: A Practical Approach, Vols.I, II, & III, IRL Press, Oxford (1995); Colowick & Kaplan, eds., Methods inEnzymology, Academic Press; Weir et al, eds., Handbook of ExperimentalImmunology, 5Λ ed., Blackwell Scientific Publications, Ltd., Edinburgh,(1997).

Exemplo 1

Para investigar a importância de VKOR em expressão deproteínas carboxiladas temos expressado fator de coagulação X (FX) dehumano em células CHO. FX totalmente funcional tem sido expressadoanteriormente por Camire et al. 2000 CBiochemistry 39:14322-14329) queobtiveram aproximadamente 1 μg de FX carboxilado por milhão de células edia, e por Himmelspach et al 2000 (Thromb Res 97:51-67) que reivindicarama obtenção de até 25% (19,5 μ§) de FX ativo por milhão de células e diausando uma linhagem de célula CHO que tem sido submetida à amplificaçãode DHFR. Himmelspach et al. relataram processamento incompleto de FXrecombinante e a produtividade máxima de FX ativo realmente mostrada foide 5 μg/mL de meio de cultura. Em ambas as publicações as células foramcrescidas como células aderentes em meio contendo soro. Células foramcrescidas para a confluência desejada, o meio foi substituído por meio livre desoro e a incubação continuou para permitir o acúmulo de produto. Aquantidade de produto foi então estimada desta meio "livre de soro". Esteprocedimento de cultura não é adequado para produção de proteína em grandeescala porque as células apenas produzirão por um período de tempo curto.Em adição o produto será contaminado com proteínas de soro tal como FX debovino que é elevadamente indesejável porque proteínas de soro serão dedifícil remoção e podem causar formação de anticorpo se presentes em umproduto injetado em pacientes. Portanto as linhagens celulares obtidas nãotêm se mostrado adequadas para produção comercial de FX farmacêutico.Estabelecimento de linhagens de células estáveis produtoras de Fator Xrecombinante

A seqüência codificadora de FX foi amplificada por PCR apartir de cDNA de fígado de humano usando iniciadores:F10F1: 5'-CACACCATGGGGCGCCCACT-3' (SEQID NO: 2)F10R1: 5'-GAGTGGGATCTCACTTTAATGGA-3' (SEQ ID NO: 3)

Clonagem do produto de PCR foi primeira feita por clonagemde TA-TOPO em pCDNA3.1-V5His (Invitrogen). Clones contendo aseqüência de FX correta foram identificados por seqüenciamento de DNA epor expressão transiente em células COS-7. Um fragmento de extremidadecega contendo a seqüência codificadora de FX foi então clonado em vetornopA de expressão tratado com fosfatase e digerido por EcoRV. Clones deFlOnopA (SEQ ID NO: 6) obtidos foram verificados por seqüenciamento deDNA da seqüência inserida e por expressão transiente em COS-7.

A seqüência codificadora de VKOR foi amplificada por PCR apartir de cDNA de fígado usando iniciadores:

VFl: 5'-CACCATGGGCAGCACCTGGGGGA-3' (SEQ ID NO: 4)VRl: 5'-GCTCAGTGCCTCTTAGCCTT-3' (SEQ ID NO: 5)

Clonagem do produto de PCR foi feita primeiro por clonagemde TA-TOPO em pCDNA3.1-V5His (Invitrogen). Clones contendo aseqüência codificadora de VKOR correta (SEQ ID NO: 1) foram identificadospor seqüenciamento de DNA. Um fragmento Hindlll-Notl contendo aseqüência de VKOR foi então transferido para o vetor de expressãopZeoSV2+ (Invitrogen) digerido com as mesmas enzimas. Clones VKORzeo(SEQ ID NO: 7) obtidos foram verificado por seqüenciamento de DNA.

Células CHO-S (Invitrogen) foram crescidas em meio DMEMF12 contendo Glutamax I e 9% de FBS tratado por calor, essencialmentecomo recomendado por Invitrogen. Transfecção de CHO-S foi feita comFlOnopA digerido (Iinearizado) por PvmI5 VKORzeo digerido por Sspl eLipofectamine 2000 essencialmente como recomendado por Invitrogen. Amistura de transfecção de DNA continha um excesso molar de 1,6 vezes deF IONopA comparado com VKORzeo. Um dia após transfecção, as célulastransfectadas foram semeadas em meio de seleção; meio de crescimento mais400 μg/mL de G418, em placas de 96 cavidades. O construto VKORzeo foiportanto não selecionado para, mas foi aleatoriamente integrado nostransfectantes resistentes a G418. Nos dias seguintes as placas foraminspecionadas para confirmar se foi obtido um número adequado de clonespor cavidade (5-10). Seis dias após a transfecção o meio de seleção foisubstituído por meio de crescimento suplementado com vitamina K (1μg/mL). No dia seguinte as placas foram amostradas e ensaiadas paraatividade de FX usando um ensaio baseado em Veneno de Víbora de Russel(RW-X), que ativa FX para FXa. Atividade de FXa foi então medida usandoum substrato cromogênico (S2765, Chromogenix, Mõlndal, Suécia). O ensaiode RW-X é equivalente ao ensaio usado por Himmelspach et al. para omesmo propósito. As cavidades com a atividade mais alta foram identificadase os clones contidos foram expandidos e submetidos à clonagem de diluiçãolimitante. Após a clonagem de diluição limitante e seleção dos melhoresclones, os clones escolhidos foram expandidos e transferidos para crescimentoem meio livre de proteína (CD-CHO suplementado como recomendado porInvitrogen mais 1 μg/mL de vitamina K). Produtividade de FX recombinantefoi estimada das culturas em frasco-T. A expressão de VKOR foi ensaiada poranalise de PCR em Tempo Real. Foi verificado que todos os clonesselecionados expressando FX totalmente ativo também expressaram VKOR.

Disto concluímos que a co-expressão de VKOR melhora a expressão de fatorde coagulação X de humano totalmente ativo. As linhagens de célula obtidascrescem bem em meio livre de componente de animal e de proteína eproduzem FX na ausência de pressão de seleção de antibiótico. Linhagenscelulares obtidas são portanto consideradas adequadas para produção deproteína em grande escala e são capazes de produzirem quantidades altas deFX ativo. O compartilhamento de FX totalmente ativo também ésignificativamente maior do que previamente relatado.

Exemplo 2

Análises de produtividade e de razões de mRNA para co-expressão de FX,VKOR e GGCX

Clones obtidos no Exemplo 1 foram crescidos em frascos-Tem meio CHO quimicamente definido livre de proteína sem antibióticos(Invitrogen). Amostras foram colhidas de culturas de 4 dias para preparaçãode amostras de cDNA e amostras para estimativas de produtividade foramcolhidas de culturas 5 dias após divisão de rotina. Amostras de controletambém foram preparadas da linhagem de célula CHO-S não-transfectadaparental crescida no mesmo meio e análises das amostras de controle deramos resultados esperados. Culturas rotativas foram crescidas em CD-CHO comou sem suplementação de aditivos livres de componente animal. A quantidadede rhFX ativo foi estimada por um ensaio baseado em RW-X como emexemplo 1, e um padrão de plasma purificado serialmente diluído derivado deFator X de humano (Haematologic Technologies Inc., Vermont, USA). RNAfoi isolado com Trizol™ de acordo com o protocolo fornecido pelo vendedor,Invitrogen. O RNA isolado foi tratado por DNaseI com kit DNA-free™ deAmbion. Síntese de cDNA foi realizada usando iniciadores hexâmero econteúdos de kit de Superscript™First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen). Iniciadores e sondas marcadas com Vic para RT-PCR emTempo-Real foram selecionados usando o programa de computador PrimerExpress™ de Applied Biosystems.

Oligonucleotídeos para γ-Carboxilase de humano

5 'ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT 3' Iniciador direto (SEQID NO: 8)

5' AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT 3' Iniciador inverso (SEQ ID NO: 9)

5' CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3' Sonda (SEQ ID NO: 10)

Oligonucleotídeos para Fator X de humano

Iniciadores foram manufaturados por Operon/Qiagen e assondas foram adquiridas de =Applied Biosystems.

5 CCGCAACAGCTGCAAGCT-3' Iniciador direto (SEQ ID NO: 11)

5 TGTCGTAGCCGGCACAGA-3' Iniciador inverso(SEQ ID NO: 12)5' CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG Sonda (SEQID NO: 13)Oligonucleotídeos para VKOR de humano

5 GCTGGGCCTCTGTCCTGAT-3' Iniciador direto Seq(SEQ ID NO: 14)5' ATCCAGGCCAGGTAGACAGAAC-3' Iniciador inverso Se(SEQ ID NO: 15)5'CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCG Sonda S(SEQ ID NO: 16)

Sonda e iniciadores de controle GAPDH de roedor tambémforam usados (Applied Biosystems; ABI # 4308318 TaqMan® RodentGAPDH Control Reagents Protocol)- Amplicon length 177 bp. As reaçõesRT-PCR em tempo real foram realizadas no 7500 Real Time PCR System,Applied Biosystems. O comprimento esperado dos produtos amplificados porPCR foi confirmado sobre geles de agarose.

Tabela 4. Resultados de análises por PCR em tempo real dos clonesexpressando FX.

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Tabela 5. Estimativas de produtividade e razões de mRNA. Razões sãocalculadas dos dados na tabela 4. Produtividade foi estimada dos ensaios deatividade de amostras de cultura diluídas.

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As produtividades listadas em Tabela 5 estão todas acimadaquelas previamente obtidas de linhagens de célula não amplificadas.

Estimativas de concentração de FX total, incluindo FX inativo, foram feitasusando um ensaio Biacore e por SDS-PAGE e Western blotting.Ensaio Biacore para estimativa da concentração de rhFX total

O sistema analítico BIAcore3000™, o tampão de corrida(HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3,4 mM e P20 0,05%, pH 7,4), Fc decoelho anti-camundongo em NaCl 0,15 M (RAM Fc, lote no. 610) e os chipssensores CM5 foram adquiridos de Biacore AB (Uppsala, Suécia). Oprocedimento foi realizado a 5 pL/min a 25°C. Um procedimento decopulação de amina padronizado (tempo de ativação 35 |iL [sic]) a 25°C foiusado para covalentemente copular 11000 RU de anticorpo de capturaRAM Fc (35 30 μg /mL em acetato de sódio 10 mM, pH 5,0) para canal 4do chip CM5. Após imobilização a superfície foi regenerada com 5 μΙ. detampão glicina 10 mM de pH 1,8 e adicionalmente equilibrada com o tampãode corrida. Com um fluxo de 20 μι de anticorpo monoclonal N77121M IgGde camundongo anti-FX (Biodesign, Maine, USA) (diluído 1/100 em tampãode corrida) 660 RU foi capturado. Ligação de FX em meio resultou em umcomplexo muito estável com dissociação insignificante. Para cada amostranova de FX a superfície de RAM Fc foi reprodutivamente regenerada paramúltiplos experimentos de sanduíche. A diferença em RU entre canal 4 comRAM Fc copulado e canal 3 com uma superfície limpa foi usada paraquantificar a ligação de 5 \xL de FX. Um padrão (2, 4,6, 8, 10, 15 e 20 μg/mLem meio) de pdFX de Haematologic Technologies Inc. (Vermont, USA) foicorrido e a diferença em RU foi plotada contra a concentração de phFX e aequação para um sítio de ligação foi ajustada aos dados. A diferença em RUdas amostras desconhecidas foi usada para calcular a concentração de rhFXda curva padrão.

Tabela 6. Compartilhamento de rhFX totalmente ativo produzido. Aquantidade total de rhFX foi estimada das amostras de cultura de frascoagitador usando um ensaio Biacore e a quantidade de rhFX ativado foiestimada por um ensaio de RW-X. Todas as amostras são das culturas defrascos agitadores em meio de crescimento livre de componente animal.<table>table see original document page 30</column></row><table>

Resultados em tabela 6 indicam que a co-expressão de VKORintensifica a expressão de rhFX totalmente ativo. O compartilhamento alto(43-103%) de rhFX totalmente ativo está de acordo com os dados de SDS-PAGE, Western blot e purificação de proteína.

Exemplo 3

Co-expressão de protrombina de humano, GGCXe VKOR

Para obter uma linhagem celular capaz de produzir níveis altosde protrombina de humano totalmente ativa (hFII) temos inicialmente co-expressado a enzima de modificação dependente de vitamina K γ-glutamil-carboxilase (GGCX) e hFII. Usando esta estratégia obtivemos o clone P1E2.P1E2 é um clone elevadamente produtivo expressando rhFII, mas, emboraexpressão de rhFII corretamente expressado esteja vastamente melhoradacomparada com a de outros clones produtores de FII, ainda apenas 20-60%(dependendo de condições de cultura) da quantidade total deste rhFIIproduzido está totalmente γ-carboxilada. Em uma tentativa paraadicionalmente melhorar o rhFII totalmente γ-carboxilado e comoconseqüência diminuir os custos de produção de rhFII, foi testada uma novaestratégia de produção usando vitamina-K-epóxido-redutase (VKOR). Temosclonado VKOR em dois vetores diferentes sob o controle de dois promotoresdiferentes; pCMV no vetor pHygro e pSV40 no vetor pZeo. Em células CHO,é estimado que o promotor pCMV possua uma atividade promotora ~6x maisalta do que a do promotor pSV40. Ambos os construtos foram usados em duasco-transfecções separadas para obter linhagens celulares produtoras de rhFII.Desenvolvimento de linhagem celular e estimativas de produtividade

Desenvolvimento de linhagem celular foi iniciado por co-transfecção de CHO-S com o construto PP6 (codificador de hFII e hGGCX)(SEQ ID NO: 20) e qualquer um dos construtos VKOR (Figura 1-2). Razõesmolares usadas nas transfecções foram 2:3 (PP6:VKOR). Após semeadura eseleção de transfectantes em placas de 96 cavidades totalmente 5500-8500clones por transfecção foram então triado usando um ensaio cromogênicobaseado em ecarina. 18 reuniões de clone foram selecionadas após a triageminicial. Após a segunda triagem 9 reuniões de clone foram selecionadas,expandidas e submetidas a um terceiro ensaio de triagem. Para cadatransfecção a melhor reunião de clone produtora foi selecionada para diluiçãolimitante. Seis placas de 96 cavidades foram semeadas com 0,5célula/cavidade. 24 clones foram selecionados e supra-escalados após triagem.

Visto que os vetores codificadores de VKOR não têm sido selecionados, análisesTaqman foram realizadas para verificar a expressão de VKOR Em todos os trêsclones de topo selecionados; A3F4 (PP6/pZeoVKOR), B11E8 e B9A12(PP6/pHygroVKOR), VKOR mRNA foi detectado. Quatro corridas deexperimentos em frasco agitador foram realizadas para avaliar e comparar aprodutividade de rhFII para os clones PP6/VKOR comparados com o clone P1E2.

Tabela 7. Produção de rhFII em frascos agitadores.

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A abordagem nova para co-expressar VKOR, GGCX e rhFIIresultou em vários clones expressando rhFII produzindo um compartilhamentomuito maior (60-100%) de rhFII totalmente ativo comparado com o clone P1E2(20-60%, veja tabela 1). Para dois dos clones, B11E8 e B9A12 (ambos co-transfecção de PP6/pHygroVKOR) foi obtida uma taxa de produtividadeespecífica maior (quantidade de proteína ativa produzida por célula e dia, SPR) doque o clone P1E2 sob algumas condições de cultura. O clone A3F4 produziu rhFII100% totalmente carboxilado em toda série de experimentos de culturas. Esteclone possui a razão de mRNA mais alta de ambas as enzimas de modificação(GGCX e VKOR) para FII comparado com os dois outros clones. Contudo, A3F4não produz rhFII mais totalmente ativo do que os outros clones.

Exemplo 4.

γ-Carboxilação melhorada por supertransfecção com VKOR

Em uma segunda tentativa de uso de VKOR para melhoria deprodução de rhFII, o clone P1E2 (exemplo 3) foi modificado para co-expressar VKOR. O construto pHygroVKOR (SEQ ID NO: 22) foi neste casousado para transfectar P1E2 (veja Apêndice, figura 1) e clones foram triadospara produtividade melhorada por um ensaio de atividade de protrombinase.Totalmente 7000-8000 clones foram triados usando um ensaio deprotrombinase de ponto final adaptado para formato de 96 cavidades.Dezesseis reuniões de clone foram expandidas e tríadas com ambos ensaiosde ecarina e protrombinase com o propósito de estimar o compartilhamentode rhFII ativo. Após esta triagem 6 reuniões de clone foram selecionadas eexpandidas. As três melhores reuniões de clones produtoras foramselecionadas para clonagem de diluição limitante. Vinte e oito clonesoriginários de todas as três reuniões foram selecionados e supra-escaladosapós a triagem de protrombinase inicial. Após uma segunda triagem, oitoclones foram selecionados e supra-escalados. Análises Taqman foramrealizadas para verificar a expressão de VKOR em um clone de cada reuniãoclonada. Em todos os três clones de topo selecionados; M3F6, P4A4 e 03G3,VKOR mRNA foi detectado. Três corridas de culturas em vascolejador defrasco agitador foram realizadas para avaliar a produtividade de rhFII para osclones P1E2/VKOR comparados como o clone parental P1E2.

Análises Taqman foram realizadas para verificar a expressãode VKOR em um clone de cada reunião clonada. Em todos os clones de toposelecionados; M3F6, P4A4 e 03G3, VKOR mRNA foi detectado. Devido aosprocedimentos de seleção e triagem usados para obter estes clones, éconsiderado que expressam um nível ótima de expressão de VKOR. Estenível de expressão ótimo é adicionalmente caracterizado no exemplo 5.

Tabela 8. Produção de rhFII em produtividade de pico em culturas emvascolejador / frasco agitador usando meios livres de componente animal.

A linhagem celular parental P1E2 não contendo o construtoVKOR foi crescida em paralelo sob as mesmas condições como um controle.

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Resultados dos experimentos de cultura mostraram que aquantidade e o compartilhamento de rhFII ativo durante condições de culturadiferentes variaram, mas para a maioria das corridas a quantidade de rhFIItotalmente ativo produzida foi melhor para os clones novos P1E2/VK0R doque para a linhagem celular original P1E2.

Exemplo 5Estabelecimento de razões de expressão de mRNA ótimas

RNA mensageiro preparado de linhagens celulares emExemplo 4 e 5 foi analisado com PCR em Tempo Real similarmente como emExemplo 3. Para GGCX e VKOR foram usados os mesmos oligonucleotídeoscomo em Exemplo 3.

Oligonucleotídeos para protrombina foram:5 TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3' Iniciador direto (SEQ ID NO: 17)5' CATCCGAGCCCTCCACAA 3' Iniciador inverso (SEQ ID NO: 18)5' CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3' Sonda (SEQ ID NO: 19)

Tabela 9. Análises de razões de mRNA em expressão de pico de protrombinade humano (rhFII)

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* Medição de produtividade feita sob condições similares em frascos vascolej adores oufrascos agitadores.

Resultados em tabela 9 indica que há um nível ótimo deexpressão de GGCX e VKOR em relação à proteína γ-carboxilada produzida.Clones M3F4, 03G3 e P4A4 foram obtidos por transfecção de P1E2 (inicialmenteobtido por transfecção com um construto contendo rhFD+GGCX) com umconstruto contendo VKOR sob o controle de promotor forte de CMV. Triagem foirealizada com um ensaio especificamente detector de clones com umaprodutividade melhorada de rhFII totalmente ativo. Clones com um nível ótimo deexpressão de VKOR em relação a rhFII e GGCX têm sido assim selecionados.

RNA mensageiro de todas as linhagens celulares em Exemplo 4 e5 foi analisado com PCR em Tempo Real similarmente como em Exemplo 3.Todas as análises incluíram reação de controle de GAPDH como em Exemplo 3.LISTAGENS DE SEQÜÊNCIAS 101720 PCTSEQ ID NO: 1

VKOR CDS

//ATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCTGGCTGGGTGCGGCTCGCTCTT

TGCCTGACGGGCTTAGTGCTCTCGCTCTACGCGCTGCACGTGAAGG

CGGCGCGCGCCCGGGACCGGGATTACCGCGCGCTCTGCGACGTGG

GCACCGCCATCAGCTGTTCGCGCGTCTTCTCCTCCAGGTGGGGCAG

GGGTTTCGGGCTGGTGGAGCATGTGCTGGGACAGGACAGCATCCT

CAATCAATCCAACAGCATATTCGGTTGCATCTTCTACACACTACAG

CTATTGTTAGGTTGCCTGCGGACACGCTGGGCCTCTGTCCTGATGC

TGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCGCTGGTTCTGTCTACCTGGCCTGG

ATCCTGTTCTTCGTGCTCTATGATTTCTGCATTGTTTGTATCACCAC

CTATGCTATCAACGTGAGCCTGATGTGGCTCAGTTTCCGG AAGGTC

C AAGAACCCC AGGGC AAGGCTAAG AGGC ACTGA//

SEQ ID NO: 2

CACACCATGGGGCGCCCACTSEQ ID NO: 3

GAGTGGGATCTCACTTT AATGGASEQ ID NO: 4

CACCATGGGCAGCACCTGGGGGASEQ ID NO: 5

GCTCAGTGCCTCTTAGCCTTSEQ ID NO: 6

Seqüência do construto FlOnopA

//gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaag

ccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggca

aggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccag

atatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatg

gagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgt

caataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggta

aactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatg

gcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcg

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SEQ ID NO: 7

Seqüência do construto VKOR zeo

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SEQ ID NO: 8

ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTTSEQ ID NO: 9

AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTTSEQ ID NO: 10

CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC

SEQ ID NO: 11

CCGCAACAGCTGC AAGCT

SEQ ID NO: 12

TGTCGTAGCCGGCACAGA

SEQ ID NO: 13

CAGCAGCTTCATCATCACCCAGAACATG

SEQ ID NO: 14

GCTGGGCCTCTGTCCTGAT

SEQ ID NO: 15

ATCCAGGCCAGGTAGACAGAACSEQ ID NO: 16

CTGCTGAGCTCCCTGGTGTCTCTCGSEQ ID NO: 17

TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA

SEQ ID NO: 18

CATCCGAGCCCTCCACAA

SEQ ID NO: 19

CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC

SEQ ID NO: 20

PP6:

//gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccag

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Claims (32)

1. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreenderum vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleicocodificadora de uma proteína requerendo gama-carboxilação e seqüências decontrole de expressão associadas, e um vetor de expressão compreendendouma molécula de ácido nucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e seqüências de controle de expressão associadas, a citada célulaadicionalmente compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificadorade uma γ-glutamil-carboxilase e seqüências de controle de expressãoassociadas.

2. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a citada molécula de ácido nucleicocodificadora de uma proteína requerendo gama-carboxilação e seqüências decontrole de expressão associadas compreende um primeiro promotor, e acitada molécula de ácido nucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e seqüências de controle de expressão associadas compreende umsegundo promotor, na qual o primeiro promotor é suficientemente mais fortedo que o segundo promotor de modo que a proteína requerendo gama-carboxilação e a vitamina-K-epóxido-redutase são expressadas em uma razãode pelo menos 10:1.

3. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que o primeiro promotor é suficientemente maisforte do que o segundo promotor de modo que a proteína requerendo gama-carboxilação e a vitamina-K-epóxido-redutase são expressadas em uma razãode pelo menos 5:1.

4. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o primeiro promotor épromotor precoce imediato de citomegalovírus de humano (hCMV) e osegundo promotor é promotor precoce de SV40.

5. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácidonucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase e seqüências de controlede expressão associadas adicionalmente compreende um terceiro promotor, naqual o primeiro promotor é suficientemente mais forte do que o terceiropromotor de modo que a proteína requerendo gama-carboxilação e a γ-glutamil-carboxilase são expressadas em uma razão de pelo menos 10:1.

6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que o primeiro promotor é suficientemente maisforte do que o terceiro promotor de modo que a proteína requerendo gama-carboxilação e a γ-glutamil-carboxilase são expressadas em uma razão de pelomenos 5:1.

7. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5 a 6, caracterizada pelo fato de que o terceiro promotor épromotor precoce de SV40.

8. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a citada moléculade ácido nucleico codificadora de uma proteína requerendo gama-carboxilação e a molécula de ácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase estão localizadas dentro de um único vetor de expressão.

9. Célula hospedeira de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a molécula deácido nucleico codificadora de uma proteína requerendo gama-carboxilação, amolécula de ácido nucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutasee a molécula de ácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilaseestão localizadas dentro de um único vetor de expressão.

10. Célula, caracterizada pelo fato de estar engenheirada paraexpressar (i) uma proteína que requer gama-carboxilação, e (ii) vitamina-K-epóxido-redutase, na qual as proteínas (i) e (ii) são expressadas em uma razãoentre 10:1 e 500:1.

11. Célula de acordo com a reivindicação 10, caracterizadapelo fato de que as proteínas (i) e (ii) são expressadas em uma razão entre 5:1e 500:1.

12. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizada pelo fato de que a proteína que requer gama-carboxilação é selecionada do grupo consistindo de: fator de coagulação VII,coagulação FVII, fator de coagulação IX, coagulação FIX, protrombina, fatorde coagulação II, coagulação FII, fator de coagulação X, coagulação FX, esuas formas ativadas FVIIa, FIXa, FXa; Proteases de veneno de cobrasemelhantes a Fator X, Proteína C, Proteína S, Proteína Z, Proteína Gla deOsso, Proteína Gla de Matriz, e Proteína 6 específica de parada decrescimento.

13. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, caracterizada pelo fato de que a proteína que requer gama-carboxilação éum fator de coagulação dependente de vitamina K.

14. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, caracterizada pelo fato de que a proteína que requer gama-carboxilação éFator IX.

15. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, caracterizada pelo fato de que a proteína que requer gama-carboxilação éFator X.

16. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, caracterizada pelo fato de que a proteína que requer gama-carboxilação éproteases de veneno de cobra semelhantes a Fator X.

17. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, caracterizada pelo fato de que a proteína que requer gama-carboxilação éprotrombina.

18. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-12, caracterizada pelo fato de que a proteína que requer gama-carboxilação éFator VII

19. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizada pelo fato de ser uma célula de mamífero.

20. Célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada,caracterizada pelo fato de compreender:(i) um polinucleotídeo codificador de proteína vitamina-K-epóxido-redutase na qual a citada seqüência codificadora de proteínavitamina-K-epóxido-redutase está operacionalmente ligada nas seqüências decontrole de expressão permitindo a expressão de proteína vitamina-K-epóxido-redutase pela citada célula;(ii) um polinucleotídeo codificador de uma proteínarequerendo carboxilação pela proteína γ-glutamil-carboxilaseoperacionalmente ligada em seqüências de controle de expressão permitindo aexpressão de citada proteína requerendo carboxilação pela citada célula; e(iii) um polinucleotídeo codificador de gama-glutamil-carboxilase

21. Célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada deacordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de ser capaz deexpressar proteína vitamina-K-epóxido-redutase e a proteína requerendocarboxilação na razão de pelo menos 1:5.

22. Célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada deacordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato deadicionalmente compreender uma molécula de ácido nucleico codificadora deuma γ-glutamil-carboxilase e seqüências de controle de expressão associadas.

23. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender umamolécula de ácido nucleico codificadora de uma proteína requerendo gama-carboxilação e seqüências de controle de expressão associadas e umamolécula de ácido nucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutasee seqüências de controle de expressão associadas.

24. Vetor de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelofato de que a citada molécula de ácido nucleico codificadora de uma proteínarequerendo gama-carboxilação e seqüências de controle de expressãoassociadas compreende um primeiro promotor, e citada molécula de ácidonucleico codificadora de uma vitamina-K-epóxido-redutase e seqüências decontrole de expressão associadas compreende um segundo promotor, na qualo primeiro promotor é suficientemente mais forte do que o segundo promotorde modo que a proteína requerendo gama-carboxilação e a vitamina-K-epóxido-redutase são expressadas em uma razão de pelo menos 5:1.

25. Vetor de acordo com a reivindicação 23 ou 24,caracterizado pelo fato de que o primeiro promotor precoce imediato decitomegalovírus de humano (hCMV) e o segundo promotor é promotorprecoce de SV40.

26. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a-25, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma molécula deácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase e seqüências decontrole de expressão associadas.

27. Vetor de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que a citada molécula de ácido nucleico codificadora de uma γ-glutamil-carboxilase e seqüências de controle de expressão associadasadicionalmente compreende um terceiro promotor, na qual o primeiropromotor é suficientemente mais forte do que o terceiro promotor de modoque a proteína requerendo gama-carboxilação e γ-glutamil-carboxilase sãoexpressadas em uma razão de pelo menos 5:1.

28. Vetor de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelofato de que o terceiro promotor é promotor precoce de SV40.

29. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a-28, caracterizado pelo fato de que a proteína que requer gama-carboxilação éselecionada do grupo consistindo de: fator de coagulação VII, coagulaçãoFVII, fator de coagulação IX, coagulação FIX, protrombina, fator decoagulação II, coagulação FH, fator de coagulação X, coagulação FX, e suasformas ativadas FVIIa, FIXa, FXa, Proteases de veneno de cobra semelhantesa Fator X, Proteína C, Proteína S, Proteína Z, Proteína Gla de Osso, ProteínaGla de Matriz, e Proteína 6 específica de parada de crescimento.

30. Método para produzir proteína gama-carboxilada,caracterizado pelo fato de compreender: (i) cultivar uma célula expressandouma proteína recombinante que requer gama-carboxilação e vitamina-K-epóxido-redutase e uma γ-glutamil-carboxilase e (ii) isolar a proteína gama-carboxilada.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que a citada célula está expressando uma proteína que requergama-carboxilação e vitamina-K-epóxido-redutase em uma razão de pelomenos 10:1, sob condições adequadas para expressão de ambas as proteínas

32. Método para produzir uma composição farmacêuticaadequada para induzir coagulação de sangue ou promover coagulaçãoaumentada ou diminuída, caracterizado pelo fato de compreender purificarproteína carboxilada produzida de acordo com qualquer uma dasreivindicações 30 a 31, e misturar a proteína carboxilada purificada com umou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.