CN101960014B - 细胞系以及制备和使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型细胞和细胞系，以及关于制备和使用其的方法。

Description

细胞系以及制备和使用其的方法
发明领域
本发明涉及新型细胞和细胞系，以及关于制备和使用其的方法。
发明背景
目前，据报告关于医药公司中的药物开发项目的工业平均失败率是大约98％。尽管这包括在过程的所有阶段的失败，但高失败率意味着迫切需要在过程效率中的任何改善。
促成高失败率的一种因素是缺乏表达治疗性靶标的细胞系，所述治疗性靶标在药物开发过程中的基于细胞的功能测定法中使用。毫无疑问地，使用基于细胞的测定法的研究，特别是药物开发研究，将获益于在基于细胞的测定法中使用的细胞和细胞系。
因此，非常需要快速和有效建立基于细胞的测定法用于更快速开发新的和改良的药物。优选地，对于更有效的药物开发，测定法系统应提供调节剂在体内的效应的更生理学相关的预测物。
除需要基于细胞的测定法外，还需要改良细胞用于蛋白质生产、基于细胞的疗法和各种其他用途。
因此，存在关于表达目的功能蛋白质或RNA的细胞和细胞系的急切需要。
发明概述
在某些实施方案中，本发明提供了表达来自所引入核酸的目的异源二聚体蛋白质的细胞，所述所引入核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定法中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地和可重复性地产生，使得细胞在功能测定法中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。
在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定法中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地和可重复性地产生，使得细胞在功能测定法中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。
在某些实施方案中，本发明提供了表达来自所引入核酸的目的异源二聚体蛋白质的细胞，所述所引入核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质，其中所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养。
在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质，其中所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养。
在某些实施方案中，编码目的异源二聚体蛋白质的第二个亚单位的核酸是内源的。在其他实施方案中，编码目的异源二聚体蛋白质的第二个亚单位的核酸是引入的。在另外其他的实施方案中，目的蛋白质不包含蛋白质标签。
在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质选自：离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体和免疫受体。在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质选自：甜味受体和鲜味受体。在其他实施方案中，目的异源二聚体蛋白质不具有已知配体。
在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质不在相同类型的细胞中表达。在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，细胞的进一步特征在于它具有选自下述的另外所需性质：信噪比大于1，随着时间的过去是稳定的，无选择压力生长而不丧失表达，生理学EC50值和生理学IC50值。在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质以一定形式一致地和可重复性地产生选自下述的时间段：至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和至少9个月。在某些实施方案中，功能测定法选自：基于细胞的测定法、基于荧光细胞的测定法、高通量筛选测定法、基于报道细胞的测定法、G蛋白介导的基于细胞的测定法和钙流基于细胞的测定法。在其他实施方案中，细胞适合于在基于细胞的高通量筛选中使用。
在某些实施方案中，选择压力是抗生素。在其他实施方案中，细胞在不存在选择压力的情况下表达异源二聚体蛋白质以至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或150天。
在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述目的异源二聚体蛋白质包含至少3个亚单位，其中目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位由所引入核酸编码，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定法中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地和可重复性地产生，使得细胞在功能测定法中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。
在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述目的异源二聚体蛋白质包含至少3个亚单位，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定法中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地和可重复性地产生，使得细胞在功能测定法中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。
在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述目的异源二聚体蛋白质包含至少3个亚单位，其中目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位由所引入核酸编码，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质。
在某些实施方案中，本发明提供了表达目的异源二聚体蛋白质的细胞，其中所述目的异源二聚体蛋白质包含至少3个亚单位，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质。
在某些实施方案中，编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位的核酸是内源的。
在某些实施方案中，编码目的异源二聚体蛋白质的至少一个亚单位的核酸是引入的。
在某些实施方案中，目的蛋白质不包含蛋白质标签。
在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质选自：离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体和免疫受体。在其他实施方案中，目的异源二聚体蛋白质选自GABA、ENaC和NaV。在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质不具有已知配体。
在某些实施方案中，目的异源二聚体蛋白质不在相同类型的细胞中表达。在其他实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，细胞的进一步特征在于它具有选自下述的另外所需性质：信噪比大于1，随着时间的过去是稳定的，无选择压力生长而不丧失表达，生理学EC50值和生理学IC50值。在其他实施方案中，目的异源二聚体蛋白质以一定形式一致地和可重复性地产生选自下述的时间段：至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和至少9个月。
在某些实施方案中，功能测定法选自：基于细胞的测定法、基于荧光细胞的测定法、高通量筛选测定法、基于报道细胞的测定法、G蛋白介导的基于细胞的测定法和钙流基于细胞的测定法。在其他实施方案中，表达异源二聚体蛋白质的细胞适合于在基于细胞的高通量筛选中使用。
在某些实施方案中，表达异源二聚体蛋白质的细胞在不存在选择压力的情况下进行培养。在某些实施方案中，选择压力是抗生素。在其他实施方案中，根据权利要求35或36的细胞，其中细胞在不存在选择压力的情况下表达异源二聚体蛋白质以至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或150天。
在某些实施方案中，本发明提供了表达来自所引入核酸的2种或更多种目的蛋白质的细胞，所述所引入核酸编码至少一种目的蛋白质，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定法中使用的形式的目的蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地和可重复性地产生，使得细胞在功能测定法中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。
在某些实施方案中，本发明提供了表达2种或更多种目的蛋白质的细胞，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码至少一种目的蛋白质，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定法中使用的形式的目的异源二聚体蛋白质，其中所述目的蛋白质不包含蛋白质标签，或所述蛋白质以这样的形式一致地和可重复性地产生，使得细胞在功能测定法中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。
在某些实施方案中，本发明提供了表达来自所引入核酸的2种或更多种目的蛋白质的细胞，所述所引入核酸编码至少一种目的蛋白质，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质。
在某些实施方案中，本发明提供了表达2种或更多种目的蛋白质的细胞，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码至少一种目的蛋白质，所述细胞的特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质。
在某些实施方案中，2种或更多种目的蛋白质中的至少一种是二聚体蛋白质。在其他实施方案中，目的二聚体蛋白质是同源二聚体蛋白质。在其他实施方案中，目的二聚体蛋白质是异源二聚体蛋白质。在某些实施方案中，2种或更多种目的蛋白质中的至少一种是多聚体蛋白质。在其他实施方案中，目的多聚体蛋白质是同源多聚体蛋白质。在其他实施方案中，目的多聚体蛋白质是异源多聚体蛋白质。
在某些实施方案中，2种或更多种目的蛋白质之一由内源核酸编码。在其他实施方案中，2种或更多种目的蛋白质之一由所引入核酸编码。在其他实施方案中，目的蛋白质不包含蛋白质标签。
在某些实施方案中，2种或更多种目的蛋白质之一选自：离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体和免疫受体。在其他实施方案中，目的异源二聚体蛋白质不具有已知配体。
在某些实施方案中，2种或更多种目的蛋白质之一不在相同类型的细胞中表达。在某些实施方案中，表达2种或更多种蛋白质的细胞是哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，表达2种或更多种蛋白质的细胞的进一步特征在于它具有选自下述的另外所需性质：信噪比大于1，随着时间的过去是稳定的，无选择压力生长而不丧失表达，生理学EC50值和生理学IC50值。
在某些实施方案中，2种或更多种目的蛋白质以一定形式一致地和可重复性地产生选自下述的时间段：至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和至少9个月。
在某些实施方案中，功能测定法选自：基于细胞的测定法、基于荧光细胞的测定法、高通量筛选测定法、基于报道细胞的测定法、G蛋白介导的基于细胞的测定法和钙流基于细胞的测定法。在其他实施方案中，表达2种或更多种蛋白质的细胞适合于在基于细胞的高通量筛选中使用。
在某些实施方案中，表达2种或更多种蛋白质的细胞在不存在选择压力的情况下进行培养。在某些实施方案中，选择压力是抗生素。在其他实施方案中，细胞在不存在选择压力的情况下表达2种或更多种蛋白质以至少15天、30天、45天、60天、75天、100天、120天或150天。
在某些实施方案中，本发明提供了表达至少一种目的RNA的细胞，其中所述目的RNA由所引入核酸编码，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定法中使用的形式的至少一种目的RNA，其中所述目的RNA不包含标签，或所述RNA以这样的形式一致地和可重复性地产生，使得细胞在功能测定法中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。
在某些实施方案中，本发明提供了表达至少一种目的RNA的细胞，其中所述细胞进行改造以激活内源核酸的转录，所述内源核酸编码至少一种目的RNA，所述细胞的特征在于它产生以适合于在功能测定法中使用的形式的至少一种目的RNA，其中所述目的RNA不包含标签，或所述RNA以这样的形式一致地和可重复性地产生，使得细胞在功能测定法中具有至少0.4的Z′因子，或所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，或其任何组合。
在某些实施方案中，细胞表达至少2种目的RNA。在其他实施方案中，细胞表达至少3种目的RNA。在某些实施方案中，细胞进一步表达由所引入核酸编码的RNA。在某些实施方案中，目的RNA选自：编码离子通道的RNA、编码G蛋白偶联受体(GPCR)的RNA、编码酪氨酸受体激酶的RNA、编码细胞因子受体的RNA、编码核类固醇激素受体的RNA和编码免疫受体的RNA。
在某些实施方案中，目的RNA不在相同类型的细胞中表达。在某些实施方案中，表达目的RNA的细胞是哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，表达目的RNA的细胞的进一步特征在于它具有选自下述的另外所需性质：信噪比大于1，随着时间的过去是稳定的，无选择压力生长而不丧失表达，生理学EC50值和生理学IC50值。在某些实施方案中，目的RNA以一定形式一致地和可重复性地产生选自下述的时间段：至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和至少9个月。
在某些实施方案中，功能测定法选自：基于细胞的测定法、基于荧光细胞的测定法、高通量筛选测定法、基于报道细胞的测定法、G蛋白介导的基于细胞的测定法和钙流基于细胞的测定法。
在某些实施方案中，表达目的RNA的细胞适合于在基于细胞的高通量筛选中使用。
在某些实施方案中，本发明提供了由本文描述的细胞产生的细胞系。
在某些实施方案中，本发明提供了用于产生表达目的蛋白质的细胞的方法，其中所述细胞具有随着时间的过去保持一致的至少一种所需性质，所述方法包括步骤：
a)提供表达编码目的蛋白质的mRNA的多个细胞；
b)将细胞单个分散到单个培养器皿内，从而产生多个分离的细胞培养物；
c)使用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养细胞，所述自动化细胞培养法的特征在于所述条件对于分离的细胞培养物各自是基本上等同的，在这个培养过程中使细胞数目/分离的细胞培养物进行标准化，并且其中分离培养物根据相同时间表进行传代；
d)就目的蛋白质的至少一种所需特征测定分离的细胞培养物至少2次；和
e)鉴定在2种测定法中都具有所需特征的分离的细胞培养物。
在某些实施方案中，在本文描述的方法的步骤a)中的多个细胞在步骤b)中的分散前培养一段时间。
在某些实施方案中，在本发明的方法中使用的单个培养器皿选自：多孔平板的单个孔和小瓶。
在某些实施方案中，该方法进一步包括测定多个分离的细胞培养物的生长速率，并且通过其生长速率将分离的细胞培养物分成组的步骤，从而使得在任何组中最快和最慢的生长速率之间的差异在步骤b)和c)之间不超过1、2、3、4或5小时。
在某些实施方案中，该方法进一步包括制备一种或多种分离培养物的贮藏原种的步骤。在某些实施方案中，该方法进一步包括分离的细胞培养物的一个或多个复制组和与来源分离的细胞培养物分开培养一个或多个复制组的步骤。
在某些实施方案中，在本发明的方法的步骤d)中的测定是用于蛋白质的功能测定法。
在某些实施方案中，在步骤e)中保持不变的至少一种特征是蛋白质功能。
在某些实施方案中，在本发明的方法的步骤c)中的培养是机器人(robotic)细胞培养器。在某些实施方案中，机器人细胞培养器包括多通道机器人移液器。在某些实施方案中，多通道机器人移液器包括至少96个通道。在某些实施方案中，机器人细胞培养器进一步包括择优挑选(cherry-picking)臂。
在某些实施方案中，所述自动化方法包括下述中的一个或多个：培养基去除、培养基替换、细胞洗涤、试剂添加、细胞取出、细胞分散和细胞传代。
在某些实施方案中，在本发明的方法中使用的多个分离的细胞培养物是至少50个培养物。在其他实施方案中，多个分离的细胞培养物是至少100个培养物。在其他实施方案中，多个分离的细胞培养物是至少500个培养物。在另外其他的实施方案中，多个分离的细胞培养物是至少1000个培养物。
在某些实施方案中，生长速率通过选自下述的方法进行测定：测量ATP、测量细胞汇合、光散射、光密度测量。在某些实施方案中，组中最快和最慢的生长速率之间的差异不超过1、2、3、4或5小时。
在某些实施方案中，在本发明的方法的步骤c)中的培养是至少2天。
在某些实施方案中，多个分离的细胞培养物的生长速率通过分散细胞且测量细胞汇合进行测定。在某些实施方案中，本发明的方法的每个分离的细胞培养物中的细胞在测量细胞汇合前进行分散。在某些实施方案中，分散步骤包括将胰蛋白酶加入孔中并且消除凝块。在某些实施方案中，使用自动化微板读取器测量多个分离的细胞培养物的细胞汇合。
在某些实施方案中，在计算生长速率前进行至少2次汇合测量。在某些实施方案中，通过自动化平板读取器测量细胞汇合，并且汇合值与计算生长速率的软件程序一起使用。
在某些实施方案中，在步骤d)中分离的细胞培养物就选自下述的所需性状进行表征：脆性、形态、与固体表面的附着；缺乏与固体表面的附着和蛋白质功能。
在某些实施方案中，在本发明的方法中使用的细胞是真核细胞。在某些实施方案中，在本发明的方法中使用的真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞系选自：NS0细胞、CHO细胞、COS细胞、HEK-293细胞、HUVEC、3T3细胞和HeLa细胞。
在某些实施方案中，在本发明的方法中表达的目的蛋白质是人蛋白质。在某些实施方案中，目的蛋白质是异源多聚体。在某些实施方案中，目的蛋白质是G蛋白偶联受体。在其他实施方案中，蛋白质不具有已知配体。
在某些实施方案中，本发明的方法在鉴定步骤后进一步包括步骤：
a)在所需培养条件下扩增在步骤e)中鉴定的细胞培养物的贮藏等分试样；
b)测定a)的经扩增的细胞培养物是否具有所需特征。
在某些实施方案中，本发明提供了克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中克隆细胞系具有相同细胞类型，并且其中实验对象组中的每个细胞系表达目的蛋白质，并且其中实验对象组中的克隆细胞系相匹配，以共享相同生理特性，以允许平行加工。在某些实施方案中，生理特性是生长速率。在其他实施方案中，生理特性是与组织培养表面附着。在其他实施方案中，生理特性是Z′因子。在其他实施方案中，生理特性是编码目的蛋白质的RNA的表达水平。在另外其他的实施方案中，生理特性是目的蛋白质的表达水平。
在某些实施方案中，实验对象组中的克隆细胞系的生长速率在彼此的1、2、3、4或5小时内。在其他实施方案中，用于相匹配实验对象组的培养条件对于实验对象组中的所有克隆细胞系都是相同的。
在某些实施方案中，在相匹配实验对象组中使用的克隆细胞系是真核细胞系。在某些实施方案中，真核细胞系是哺乳动物细胞系。在某些实施方案中，在相匹配实验对象组中使用的细胞系细胞选自：原代细胞和永生化细胞。
在某些实施方案中，在相匹配实验对象组中使用的细胞系细胞是原核生物或真核生物的。在某些实施方案中，在相匹配实验对象组中使用的细胞系细胞是真核生物的，并且选自：真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、藻类、甲壳类动物细胞、节肢动物细胞、禽类细胞、爬行动物细胞、两栖动物细胞和植物细胞。在某些实施方案中，在相匹配实验对象组中使用的细胞系细胞是哺乳动物的，并且选自：人、非人灵长类动物、牛、猪、猫、大鼠、有袋动物、鼠类、犬、绵羊、山羊、兔、豚鼠、仓鼠。
在某些实施方案中，在相匹配实验对象组的细胞系中的细胞进行改造以表达目的蛋白质。在某些实施方案中，在相匹配实验对象组的细胞系中的细胞表达来自所引入核酸的目的蛋白质，所述所引入核酸编码蛋白质，或在多聚体蛋白质的情况下，编码蛋白质的亚单位。在某些实施方案中，细胞表达来自内源核酸的目的蛋白质，并且其中细胞进行改造以激活内源蛋白质的转录，或在多聚体蛋白质的情况下，激活蛋白质的亚单位的转录。
在某些实施方案中，实验对象组包括至少4个克隆细胞系。在其他实施方案中，实验对象组包括至少6个克隆细胞系。在另外其他的实施方案中，实验对象组包括至少25个克隆细胞系。
在某些实施方案中，实验对象组中的克隆细胞系中的2个或更多个表达相同目的蛋白质。在其他实施方案中，实验对象组中的克隆细胞系中的2个或更多个表达不同目的蛋白质。
在某些实施方案中，实验对象组中的细胞系表达不同形式的目的蛋白质，其中所述形式选自：同种型、氨基酸序列变体、剪接变体、截短形式、融合蛋白、嵌合体或其组合。
在某些实施方案中，实验对象组中的细胞系表达一组目的蛋白质中的不同蛋白质，其中所述目的蛋白质组选自：在相同信号传导途径中的蛋白质、相似蛋白质的表达文库、单克隆抗体重链文库、单克隆抗体轻链文库和SNP。
在某些实施方案中，在实验对象组中表达的目的蛋白质是单链蛋白质。在某些实施方案中，单链蛋白质是G蛋白偶联受体。在某些实施方案中，G蛋白偶联受体是味觉受体。在某些实施方案中，味觉受体选自：苦味受体、甜味受体、咸味受体和鲜味受体。
在其他实施方案中，在实验对象组中表达的目的蛋白质是多聚体蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质是异源二聚体或异源多聚体。
在某些实施方案中，在实验对象组中表达的目的蛋白质选自：离子通道、离子通道、G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体和免疫受体。在某些实施方案中，在相匹配实验对象组中表达的蛋白质是上皮钠通道(ENaC)。在某些实施方案中，ENaC包括α亚单位、β亚单位和γ亚单位。在其他实施方案中，在实验对象组中的细胞系表达不同ENaC同种型。在其他实施方案中，实验对象组中的细胞系包括ENaC的不同蛋白水解同种型。在某些实施方案中，ENaC是人ENaC。在某些实施方案中，在相匹配实验对象组中表达的蛋白质是电压门控的钠通道(NaV)。在某些实施方案中，NaV包括α亚单位和2个β亚单位。在某些实施方案中，NaV是人NaV。
在某些实施方案中，在相匹配实验对象组中表达的蛋白质选自：γ-氨基丁酸A受体(GABAA受体)、γ-氨基丁酸B受体(GABAB受体)和γ-氨基丁酸C受体(GABAC受体)。在某些实施方案中，蛋白质是GABAA受体。在某些实施方案中，GABAA受体包括2个α亚单位、2个β亚单位和γ或δ亚单位。
在某些实施方案中，在实验对象组中的克隆细胞系同时或在彼此不超过4周内产生。
在某些实施方案中，本发明提供了表达来自所引入核酸的目的单体蛋白质的细胞，所述所引入核酸编码所述目的单体蛋白质，其特征在于它产生以生物活性或能够变成生物活性的形式的目的蛋白质，其中所述细胞在不存在选择压力的情况下进行培养，并且其中蛋白质的表达经过3个月改变不超过5％。在某些实施方案中，蛋白质的表达经过6个月改变不超过5％。在某些实施方案中，目的单体蛋白质不具有已知配体。
在某些实施方案中，本发明提供了用于鉴定目的蛋白质的调节剂的方法，其包括步骤：
a)使根据上述细胞实施方案中任何一个的细胞与测试化合物接触；和
b)检测相比于未与测试化合物接触的细胞中的蛋白质活性，与测试化合物接触的细胞中的目的蛋白质活性中的改变；
其中与在不存在的情况下相比较，在存在下产生活性中的差异的化合物是目的蛋白质的调节剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过先前段落的方法鉴定的调节剂。
详述
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了示例性方法和材料，但与本文描述的那些相似或等价的方法和材料也可以在本发明的实践或测试中使用。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。
本文提及的所有出版物和其他参考文献通过引用整体合并。尽管本文引用了许多文件，但这种引用并不构成这些文件中的任何形成本领域的普通一般知识的部分的承认。
本说明书和权利要求自始至终，单词“包括”或变体例如“包含”或“含有”应理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。材料、方法和例子仅是示例性的并且不意欲是限制性的。
为了本发明可以更容易地理解，首先定义了特定术语。另外的定义在详述自始至终阐述。
术语“稳定的”或“稳定表达的”意欲使本发明的细胞和细胞系与瞬时表达蛋白质的细胞区分，如术语“稳定表达”和“瞬时表达”可以由本领域技术人员所理解。
如本文所使用的，目的“功能”RNA或蛋白质是在基于细胞的测定法中具有大于1∶1的信噪比的那种。在某些实施方案中，目的功能蛋白质或RNA具有天然存在或内源表达的蛋白质或RNA的一种或多种生物活性。
术语“细胞系”或“克隆细胞系”指其为单一起源细胞的后代的细胞群体。如本文所使用的，细胞系在体外在细胞培养中维持，并且可以以等分试样冷冻以建立克隆细胞库。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”描述用于使一种或多种核酸探针与核酸样品杂交且洗掉未与样品中的靶核酸特异性结合的探针的温度和盐条件。严格条件是本领域技术人员已知的，并且可以在例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中发现。水性和非水性的方法在方案中描述并且可以使用任何一种。严格杂交条件的一个例子是在6X SSC中在约45℃下杂交，随后为在0.2X SSC、0.1％SDS中在60℃下的至少一次洗涤。严格杂交条件的另一个例子是在6X SSC中在约45℃下杂交，随后为在0.2X SSC、0.1％SDS中在65℃下的至少一次洗涤。严格杂交条件还包括在0.5M磷酸钠、7％SDS中在65℃下杂交，随后为在0.2X SSC、1％SDS下在65℃下的至少一次洗涤。
与氨基酸和/或核酸序列相关的短语“等同百分比”或“同一性百分比”指在至少2个不同序列之间的相似性。同一性百分比可以通过标准比对算法进行测定，例如，由Altshul等人描述的Basic LocalAlignment Tool(BLAST)((1990)J.Mol.Biol.，215：403-410)；Needleman等人的算法((1970)J.Mol.Biol.，48：444-453)；或Meyers等人的算法((1988)Comput.Appl.Biosci.，4：11-17)。一组参数可以是具有缺口罚分12、缺口延伸罚分4和移码缺口罚分5的Blosum 62评分矩阵。2个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比还可以使用E.Meyers和W.Miller的算法((1989)CABIOS，4：11-17)进行测定，所述算法已并入ALIGN程序(版本2.0)内，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4。同一性百分比通常通过比较相似长度的序列进行计算。
蛋白质分析软件使相似氨基酸序列相匹配，其中使用对各种置换、缺失或其他修饰包括保守氨基酸置换指定的相似性量度。例如，GCGWisconsin Package(Accelrys，Inc.)包含诸如“Gap”和“Bestfit”的程序，其可以与缺省参数一起用于测定紧密相关多肽之间(例如来自不同物种的同源多肽)或野生型蛋白质及其突变蛋白质之间的序列同一性。参见例如，GCG版本6.1。多肽序列也可以使用FASTA进行比较，使用缺省或推荐参数。GCG版本6.1中的程序FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了查询和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。
就同一性比较的多肽序列的长度一般将是至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，一般至少约28个残基，和优选超过约35个残基。就同一性比较的DNA序列的长度一般将是至少约48个核酸残基，通常至少约60个核酸残基，更通常至少约72个核酸残基，一般至少约84个核酸残基，和优选超过约105个核酸残基。
与氨基酸或核苷酸序列相关的短语“基本上如所示的”、“基本上等同的”或“基本上同源的”意指，与比较器序列相比较，相关氨基酸或核苷酸序列将等同或不具有基本差异(例如，保守氨基酸置换或编码此种置换的核酸)。无基本差异包括较小的氨基酸改变，例如特定区域的50氨基酸序列和编码那些序列的核酸中的1或2个置换。
调节剂包括改变目的蛋白质活性的任何物质或化合物。调节剂可以是激动剂(增效剂或激活剂)或拮抗剂(抑制剂或阻断剂)，包括部分激动剂或拮抗剂、选择激动剂或拮抗剂和反激动剂，并且还可以是变构调节剂。即使物质或化合物的调节活性在不同条件或浓度下或就不同形式的目的蛋白质而言改变，它也是调节剂。在其他方面，调节剂可以改变另一种调节剂影响目的蛋白质功能的能力。
术语“增效剂”、“激动剂”或“激活剂”指增加目的蛋白质的一种或多种活性的化合物或物质。
术语“抑制剂”、“拮抗剂”或“阻断剂”指减少或阻断目的蛋白质的一种或多种活性的化合物或物质。
本发明首次提供了由细胞符合关于稳定表达目的功能RNA或目的功能蛋白质的细胞的急切需要的细胞产生的新型细胞和细胞系，所述目的蛋白质包括复杂蛋白质例如异源多聚体蛋白质和关于其的配体未知的蛋白质。本发明的细胞和细胞系适合于其中需要目的RNA或蛋白质的一致的功能表达的任何用途。申请人已产生了符合这种描述的细胞系，用于各种蛋白质，单个亚单位和异源多聚体(包括异源二聚体和具有超过2个不同亚单位的蛋白质)，包括膜蛋白质、细胞溶质蛋白质和分泌蛋白质，以及这些的各种组合。
在一个方面，本发明的细胞和细胞系适合于在基于细胞的测定法中使用。此类细胞和细胞系提供随着时间的过去目的蛋白质的一致和重现性表达，并且因此在此类测定法中是特别有利的。
在另一个方面，本发明提供了适合于产生生物分子的细胞和细胞系。用于此类用途的细胞和细胞系的特征在于例如蛋白质或多肽的一致表达，所述蛋白质或多肽是有功能的或能够变成有功能的。
本发明进一步提供了用于产生稳定表达目的RNA或蛋白质的细胞和细胞系的方法。使用本发明的方法，可以产生表达以功能形式的任何所需蛋白质的细胞和细胞系，包括复杂蛋白质例如多聚体蛋白质(例如异源多聚体蛋白质)和细胞毒性的蛋白质。本文公开的方法使得能够产生在本发明前先前未产生的、稳定表达功能蛋白质的经改造的细胞和细胞系。不受理论束缚，认为因为该方法允许在任何所需条件组下研究非常大量的细胞或细胞系，所以使得能够鉴定罕见细胞，其在较小群体中未产生或无法以其他方式被发现，并且最佳适合于在所需条件下表达以功能形式的所需蛋白质。
在一个进一步的方面，本发明提供了细胞系的相匹配实验对象组，即就一种或多种生理特性相匹配的克隆细胞系的集合。因为本发明的方法允许在等同条件下维持和表征大量细胞系，所以可以鉴定具有相似生理特性的任何数目的细胞系。使用本发明的方法，可以制备包括任何所需数目的细胞系的相匹配实验对象组或补足。此类相匹配实验对象组可以在等同条件包括细胞密度下维持，并且因此对于高通量筛选和其中需要比较且鉴定细胞系之间的差异的其他用途有用。还在本发明内的是就生长速率相匹配的细胞系的相匹配实验对象组。
在另一个方面，本发明提供了用于产生细胞或细胞系的方法，所述细胞或细胞系表达具有先前未知功能和/或关于其的配体先前未得到鉴定的蛋白质。此类蛋白质可以是已知的天然存在的蛋白质、先前未知的天然存在的蛋白质、已知的天然存在的蛋白质的先前未知形式或前述任何的修饰形式。
任何所需细胞类型都可以用于本发明的细胞。细胞可以是原核生物或真核生物的。细胞可以表达以其天然状态或非天然状态的目的蛋白质。可以使用的真核细胞包括但不限于真菌细胞例如酵母细胞、植物细胞和动物细胞。可以使用的动物细胞包括但不限于哺乳动物细胞和昆虫细胞。原代或永生化细胞可以衍生自真核生物体的中胚层、外胚层或内胚层。细胞可以是内皮、表皮、间充质、神经、肾、肝、造血或免疫细胞。例如，细胞可以是肠隐窝或绒毛细胞、克拉拉细胞、结肠细胞、肠细胞、杯状细胞、肠嗜铬细胞、肠内分泌细胞。在本发明中有用的哺乳动物细胞包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、山羊、绵羊、猪、啮齿类动物(包括大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠)、有袋动物、兔、犬和猫。细胞可以是分化细胞或干细胞，包括胚胎干细胞。
本发明的细胞可以是原代的、转化的、致癌转化的、病毒转化的、永生化的、条件转化的、外植体、组织切片的细胞、动物、植物、真菌、原生生物、古细菌和真细菌、哺乳动物、鸟类、鱼类、爬虫类动物、两栖类动物和节肢动物、禽类、鸡、爬行动物、两栖动物、蛙、蜥蜴、蛇、鱼、蠕虫、鱿鱼、龙虾、海胆、海参、海鞘、苍蝇、鱿鱼、水螅、节肢动物、甲虫类、鸡、七鳃鳗、ricefish、斑胸草雀、河豚和斑马鱼。
此外，细胞例如血液/免疫细胞、内分泌(甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)、GI(口、胃、肠)、肝、胰腺、胆囊、呼吸道(肺、气管、咽)、软骨、骨、肌肉、皮肤、毛发、泌尿道(肾、膀胱)、生殖(精子、卵子、睾丸、子宫、卵巢、阴茎、阴道)、感觉(眼、耳、鼻、口、舌、感觉神经元)，血液/免疫细胞例如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、天然杀伤T细胞、调节T细胞、T辅助细胞、T细胞、天然杀伤细胞；粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/多叶核(hypersegmented)嗜中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红血细胞(网织红细胞)、肥大细胞、凝血细胞/巨核细胞、树突状细胞；内分泌细胞例如甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)，神经系统细胞例如：胶质细胞(星形胶质细胞、小神经胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星形细胞、核链细胞、伯特彻氏细胞、脑下垂体(促性腺细胞、促皮质激素细胞、促甲状腺细胞、亲躯体细胞、催乳素细胞)，呼吸系统细胞例如肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞；循环系统细胞例如心肌细胞、周细胞；消化系统细胞例如胃(胃主细胞、胃壁细胞)、杯状细胞、潘氏细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝(肝细胞、肝巨噬细胞)、胰腺(β细胞、α细胞)、胆囊；软骨/骨/肌肉/外皮系统细胞例如成骨细胞、骨细胞、破骨细胞，牙齿细胞(成牙骨质细胞、成釉质细胞)，软骨细胞：成软骨细胞、软骨细胞、皮肤/毛发细胞：丝胞(trichocyte)、角化细胞、黑色素细胞，肌肉细胞：肌细胞、脂肪细胞、成纤维细胞，泌尿系统细胞例如足细胞、肾小球旁细胞、球内系膜细胞/球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞例如精子、支持细胞、莱迪希细胞、卵子、卵泡细胞；感觉细胞例如螺旋器细胞、嗅觉上皮、温度敏感的感觉神经元、merckel细胞、嗅觉感受器神经元、疼痛敏感的神经元、感光细胞、味蕾细胞、前庭器官的毛细胞、颈动脉体细胞用于制备本发明的细胞或细胞系。
有用的植物细胞包括根、茎和叶以及植物组织包括分生组织、薄壁组织、厚角组织、厚壁组织、分泌组织、木质部、韧皮部、表皮、周皮(树皮)。
对于本发明的细胞和细胞系有用的细胞也包括但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、已建立的神经元细胞系、嗜铬细胞瘤、成神经细胞瘤、成纤维细胞、横纹肌肉瘤、背根神经节细胞、NS0细胞、CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、L-细胞、HEK-293(ATCC CRL1573)和PC12(ATCC CRL-1721)、HEK293T(ATCC CRL-11268)、RBL(ATCC CRL-1378)、SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)、MDCK(ATCC CCL-34)、SJ-RH30(ATCCCRL-2061)、HepG2(ATCCHB-8065)、ND7/23(ECACC 92090903)、CHO(ECACC 85050302)、Vero(ATCC CCL 81)、Caco-2(ATCCHTB 37)、K562(ATCC CCL 243)、Jurkat(ATCC TIB-152)、Per.C6(Crucell、Leiden、The Netherlands)、Huvec(ATCC HumanPrimary PCS 100-010、小鼠CRL 2514、CRL 2515、CRL 2516)、HuH-7D12(ECACC 01042712)、293(ATCC CRL 10852)、A549(ATCC CCL 185)、IMR-90(ATCC CCL 186)、MCF-7(ATCHTB-22)、U-2OS(ATCC HTB-96)、T84(ATCC CCL 248)、或任何已建立的细胞系(极化或非极化的)或可从储库例如美国典型培养物中心(ATCC，10801 University Blvd.Manassas，Va.20110-2209USA)或欧洲细胞培养物中心(ECACC，Salisbury Wiltshire SP4 0JGEngland)获得的任何细胞系。
此外，在本发明的方法中有用的细胞是顺应在包含血清的培养基、无血清培养基、无任何动物衍生产物的完全限定的培养基中生长的哺乳动物细胞，和可以从这些条件之一转换成另一种的细胞。
本发明的细胞包括编码目的蛋白质的核酸(或在异源多聚体蛋白质的情况下，编码蛋白质的一个或多个亚单位的核酸)已引入其内的细胞。经改造的细胞还包括用于转录激活编码目的蛋白质的内源序列(或用于转录激活编码异源多聚体蛋白质的一个或多个亚单位的内源序列)的核酸已引入其内的细胞。经改造的细胞还包括包含编码目的蛋白质的核酸的细胞，所述核酸通过与激活化合物接触而被激活。经改造的细胞进一步包括前述的组合，即表达来自编码其的所引入核酸的异源多聚体蛋白质的一个或多个亚单位和通过基因激活表达蛋白质的一个或多个亚单位的细胞。
任何核酸都可以使用已知方法引入细胞内。用于将核酸引入细胞内的技术是技术人员众所周知且容易理解的。方法包括但不限于转染、病毒递送、蛋白质或肽介导的插入、共沉淀法、基于脂质的递送试剂(脂转染)、cytofection、脂多胺递送、树枝状聚合物(dendrimer)递送试剂、电穿孔或机械递送。转染试剂的例子是GENEPORTER、GENEPORTER2、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTAMINE 2000、FUGENE 6、FUGENE HD、TFX-10、TFX-20、TFX-50、OLIGOFECTAMINE、TRANSFAST、TRANSFECTAM、GENESHUTTLE、TROJENE、GENESILENCER、X-TREMEGENE、PERFECTIN、CYTOFECTIN、SIPORT、UNIFECTOR、SIFECTOR、TRANSIT-LT1、TRANSIT-LT2、TRANSIT-EXPRESS、IFECT、RNAISHUTTLE、METAFECTENE、LYOVEC、LIPOTAXI、GENEERASER、GENEJUICE、CYTOPURE、JETSI、JETPEI、MEGAFECTIN、POLYFECT、TRANSMESSANGER、RNAiFECT、SUPERFECT、EFFECTENE、TF-PEI-KIT、CLONFECTIN和METAFECTINE。
当引入2种或更多种核苷酸序列，例如编码异源多聚体蛋白质的2种或更多种亚单位的序列或编码2种或更多种不同目的蛋白质的序列时，序列可以在相同载体上或优选地在分离载体上引入。DNA可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其混合物。在某些实施方案中，编码目的蛋白质或部分目的蛋白质的核酸不包括另外的序列，从而使得目的蛋白质与另外的氨基酸一起表达，与蛋白质的生理功能相比较，所述另外的氨基酸可以改变细胞的功能。
在某些实施方案中，与编码野生型蛋白质的核酸序列相比较，编码目的蛋白质的核酸包含一个或多个置换、插入、突变或缺失。在包括包含突变的核酸的实施方案中，突变可以是随机突变或定点突变。这些核酸改变可以导致或不导致氨基酸置换。在某些实施方案中，核酸是编码目的蛋白质的核酸的片段。其为片段或具有此类修饰的核酸编码保留目的蛋白质的至少一种生物活性的多肽。
本发明还包括稳定表达核酸的细胞和细胞系，所述核酸的序列与编码目的蛋白质的“野生型”序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸或编码与那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸至少约85％等同。在某些实施方案中，与那些序列相比较，序列同一性是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。本发明还包括这样的细胞和细胞系，其中编码目的蛋白质的核酸在严格条件下与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸杂交。
在某些实施方案中，细胞或细胞系包括编码蛋白质的核酸序列，与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸比较，所述核酸序列包括至少一个置换。置换可以包括小于10、20、30或40个核苷酸，或高达或等于1％、5％、10％或20％的核苷酸序列。在某些实施方案中，被置换的序列可以基本上等同于野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸(例如与其至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高等同的序列)，或是在严格条件下能够与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸杂交的序列。
在某些实施方案中，细胞或细胞系包括编码蛋白质的核酸序列，所述核酸序列包括来自野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸的插入或缺失。插入或缺失可以小于10、20、30或40个核苷酸，或高达或等于1％、5％、10％或20％的核苷酸序列。在某些实施方案中，插入或缺失的序列可以基本上等同于野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸(例如与其至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高等同的序列)，或是在严格条件下能够与野生型序列、或衍生自除人外的物种的对应核酸、或编码与那些核酸中的任何的相同氨基酸序列的核酸杂交的序列。
在某些实施方案中，核酸置换或修饰导致氨基酸改变，例如氨基酸置换。例如，目的野生型蛋白质的氨基酸残基或衍生自除人外的物种的配对氨基酸可以由保守或非保守置换替换。在某些实施方案中，原始和经修饰的氨基酸序列之间的序列同一性可以相差约1％、5％、10％或20％，或不同于与其基本上等同的序列(例如与其至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高等同的序列)。
“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基由具有与亲本氨基酸残基具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基的另一个氨基酸残基置换的那种。在其中2个或更多个氨基酸序列彼此相差保守置换的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整以校正置换的保守性质。用于进行此类调整的方法是本领域技术人员众所周知的。参见例如，Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。
含有具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的例子包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐和天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地，保守氨基酸置换是在Gonnet等人，Science 256：1443-45(1992)中公开的PAM250对数似然性矩阵中具有阳性值的任何改变。“适度保守的”替换是在PAM250对数似然性矩阵中具有非负值的任何改变。
目的蛋白质中的保守修饰将产生具有与未经修饰的蛋白质的那些相似的功能和化学特征的蛋白质(即，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％相同)。
在一个实施方案中，宿主细胞是胚胎干细胞，其随后用作基础用于产生生产目的蛋白质的转基因动物。胚胎干细胞稳定表达目的功能蛋白质，可以直接植入到生物体内，或它们的核可以转移到其他接受者细胞内并且这些随后可以进行植入，或它们可以用于制备转基因动物。在某些实施方案中，蛋白质可以在具有所需时间和/或组织特异性表达的动物中表达。
如本领域技术人员应当理解的，适合于与所选宿主细胞一起使用的任何载体可以用于将编码目的蛋白质的核酸引入宿主细胞内。当超过一种载体用于例如引入2种或更多种不同亚单位或者2种或更多种目的蛋白质时，载体可以是相同类型或可以是不同类型。
可以用于将核酸引入宿主细胞内的载体的例子包括但不限于质粒、病毒包括逆转录病毒和慢病毒、粘粒、人工染色体，并且可以包括例如，pCMVScript、pcDNA3.1 Hygro、pcDNA3.1neo、pcDNA3.1puro、pSV2neo、pIRES puro、pSV2 zeo。用于制备本发明的细胞和细胞系的示例性哺乳动物表达载体包括：pFN11A(BIND)
Figure BPA00001214243700241
pGL4.31，pFC14A(7)CMV
Figure BPA00001214243700243
pFC14K(
Figure BPA00001214243700244
7)CMV
Figure BPA00001214243700245
pFN24A(7)CMVd3
Figure BPA00001214243700247
pFN24K(7)CMVd3
Figure BPA00001214243700249
HaloTagTM pHT2，pACT，pAdVAntageTM，
Figure BPA000012142437002410
-MAX，pBIND，
Figure BPA000012142437002411
3-Basic，
Figure BPA000012142437002412
3-Control，
Figure BPA000012142437002413
3-Enhancer，
Figure BPA000012142437002414
3-Promoter，pCI，pCMVTNTTM，pG5luc，pSI，pTARGETTM，pTNTTM，pF12A RMpF12K RMpReg neo，pYES2/GS，pAd/CMV/V5-DEST
Figure BPA000012142437002417
Vector，pAd/PL-DESTTM
Figure BPA000012142437002418
载体，
Figure BPA000012142437002419
pDESTTM27载体，pEF-DEST51载体，
Figure BPA000012142437002421
pcDNATM-DEST47载体，pCMV/Bsd载体，pEF6/His A、B和c，pcDNATM6.2-DEST，pLenti6/TR，pLP-AcGFP1-C，pLPS-AcGFP1-N，pLP-IRESneo，pLP-TRE2，pLP-RevTRE，pLP-LNCX，pLP-CMV-HA，pLP-CMV-Myc，pLP-RetroQ和pLP-CMVneo。
在某些实施方案中，载体包括表达控制序列例如组成型或条件启动子，优选地，使用组成型启动子。本领域普通技术人员将能够选择此类序列。例如，合适的启动子包括但不限于CMV、TK、SV40和EF-1α。在某些实施方案中，启动子是诱导型、温度调节型、组织特异性、阻遏型、热休克、发育、细胞谱系特异性、真核生物、原核生物或瞬时启动子，或上述任何一种或多种的未经修饰的或经诱变处理的、随机化的、经改组的序列的组合或重组。在其他实施方案中，目的蛋白质通过基因激活表达或附加地表达。
在某些实施方案中，载体缺乏可选标记或药物抗性基因。在其他实施方案中，载体任选包括编码可选标记的核酸，例如赋予药物或抗生素抗性的蛋白质、或更一般地对细胞施加选择压力的任何产物。当使用超过一种载体时，每种载体可以具有相同或不同的药物抗性或其他选择压力标记。如果超过一种药物抗性或选择压力标记是相同的，那么通过增加药物的水平可以实现同时选择。合适的标记是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于赋予针对下述任何一种的抗性的多肽产物：新霉素/G418、嘌呤霉素、潮霉素、Zeocin、氨甲蝶呤和杀稻瘟菌素。尽管药物选择(或使用任何其他合适选择标记的选择)不是产生本发明的细胞和细胞系中的所需步骤，但它可以用于就稳定转染的细胞富集经转染的细胞群体，前提是转染构建体设计为赋予药物抗性。如果使用信号传导探针完成表达目的蛋白质的细胞的后续选择，那么在转染后太快的选择可以导致可能仅是瞬时而不是稳定转染的某些阳性细胞。然而，通过允许足够的细胞传代以允许稀释经转染的细胞中的瞬时表达，可以将这种效应降到最低。
在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列进一步包括标签。此类标签可以编码例如HIS标签、myc标签、血凝素(HA)标签、蛋白质C、VSV-G、FLU、黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白、FLAG、BCCP、麦芽糖结合蛋白标签、Nus-标签、Softag-1、Softag-2、Strep-标签、S-标签、硫氧还蛋白、GST、V5、TAP或CBP。标签可以用作标记以测定蛋白质表达水平、细胞内定位、蛋白质-蛋白质相互作用、目的蛋白质的调节或蛋白质的功能。标签还可以用于纯化或分馏蛋白质。
在表达目的RNA的细胞和细胞系的情况下，RNA可以是任何类型，包括反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、转移RNA(tRNA)、结构RNA、核糖体RNA、核不均一RNA(hnRNA)和核小RNA(snRNA)。
在其中本发明的细胞和细胞系表达目的功能蛋白质的实施方案中，蛋白质可以是任何蛋白质，包括但不限于单链蛋白质、多链蛋白质、异源多聚体蛋白质。在多聚体蛋白质的情况下，在某些实施方案中，细胞表达组成天然蛋白质的所有亚单位。蛋白质可以具有“野生型”序列或可以是变体。在某些实施方案中，细胞表达包括一个或多个亚单位的变体的蛋白质，包括等位基因变体、剪接变体、截短形式、同种型、嵌合亚单位和突变形式，其包括氨基酸置换(保守或非保守的)、经修饰的氨基酸包括经化学修饰的氨基酸和非天然存在的氨基酸。由本发明的细胞或细胞系表达的异源多聚体蛋白质可以包括来自2个或更多个物种的亚单位，例如来自目的蛋白质的物种同系物。
在某些实施方案中，本发明的细胞表达2种或更多种目的功能蛋白质。根据本发明，此类表达可以来自编码全部或部分目的蛋白质的核酸的引入，来自激活来自内源序列的全部或部分目的蛋白质的转录的核酸的引入，或来自其任何组合。细胞可以表达任何所需数目的目的蛋白质。在多种实施方案中，细胞表达3、4、5、6或更多种目的蛋白质。例如，本发明考虑了这样的细胞和细胞系，其稳定表达目的途径中的功能蛋白质，来自交叉途径包括酶促途径、信号传导途径、调节途径等的蛋白质。
特别地，由方法中使用的细胞或细胞系表达的蛋白质是关于其的稳定功能细胞系先前未获得的蛋白质。不受理论束缚，认为此类细胞系迄今仍不可能的某些原因包括：蛋白质是高度复杂的并且如果不制备大量表达蛋白质的细胞，仍不可能鉴定其中蛋白质适当装配的细胞；或因为没有已知的蛋白质配体或调节剂用于鉴定表达功能形式的蛋白质的细胞或细胞系；或因为当在其天然背景外表达时，例如在未天然表达其的背景中，蛋白质是细胞毒性的。
可以制备一致地表达细胞内、表面或分泌的任何目的蛋白质的本发明的细胞和细胞系。此类蛋白质包括异源多聚体离子通道、配体门控的(例如GABA A受体)，离子通道(例如CFTR)，异源多聚体离子通道、电压门控的(例如NaV)，异源多聚体离子通道、非配体门控的(上皮钠通道，ENaC)，异源二聚体GPCR(例如阿片类受体、味觉受体包括甜、鲜和苦)，其他GPCR，孤儿GPCR，GCC，阿片类受体，生长激素受体，雌激素/hgh，核或膜结合的，TGF受体，PPAR核激素受体，烟碱/Ach和免疫受体例如B细胞/T细胞受体。
本发明的细胞和细胞系可以表达功能蛋白质，包括表2-13中列出的任何蛋白质或蛋白质的组合(哺乳动物G蛋白、人孤儿GPCR、人阿片类受体、人嗅觉感受器、犬嗅觉感受器、蚊子嗅觉感受器、其他异源多聚体受体和GABA受体。
本发明的细胞和细胞系具有使得它们对于这样的任何用途特别有利的许多属性，在所述任何用途中希望细胞随着时间的过去提供目的功能蛋白质的一致表达。术语“稳定的”或“一致的”当应用于蛋白质的表达和蛋白质的功能时，意欲使本发明的细胞和细胞系和具有瞬时表达或可变功能的细胞区分，如由本领域技术人员应当理解的术语“稳定表达”和“瞬时表达”。本发明的细胞或细胞系具有功能蛋白质的稳定或一致表达，其对于至少2-4天具有小于10％的变异。
在多种实施方案中，本发明的细胞或细胞系表达目的功能RNA或蛋白质，即在生长至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200天或超过200天后，细胞是一致地有功能的，其中一致表达或一致地有功能的指，经过2-4天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％9％或10％；经过5-15天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％或12％；经过16-20天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％；经过21-30天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％；经过30-40天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经过41-45天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经过45-50天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％；经过45-50天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经过50-55天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％或35％；经过50-55天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％或35％；经过55-75天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％；经过75-100天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过101-125天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过126-150天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过151-175天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过176-200天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％；经过超过200天连续细胞培养，表达水平改变不超过1％、2％、3％、4％、5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。
可以选择具有所需性质加上功能蛋白质的稳定表达的细胞。可以选择可以检测出的任何所需性质。本领域技术人员应知道此类特征。作为非限制性例子，此类性质包括：
脆性，形态和与固体表面的附着，通过胰蛋白酶或细胞解离试剂的单分散性，对自动化培养条件的适应性，在含血清条件下的表现，在无血清条件下的表现，对无血清悬浮条件的可转换性，形成凝块的倾向，在传代后形成单分散的细胞层的倾向，恢复力，在不同力量的流动添加步骤下保持与生长室表面附着的倾向，未破碎的核，细胞内空泡的缺乏，微生物污染的缺乏，支原体属的缺乏，病毒污染的缺乏，克隆形成能力，细胞在孔内的肉眼可见物理性质的一致性，关于在室温以下/室温/室温以上生长的倾向，关于耐受各种温度以各种时间段的倾向，细胞平衡摄取质粒/寡核苷酸/荧光探针/肽/蛋白质/化合物的倾向，细胞经受住与DMSO/EtOH/MeOH、有机溶剂/洗涤剂一起温育的倾向，细胞经受住维持的UPR诱导的倾向，细胞经受住暴露于DTT的倾向，细胞被病毒/慢病毒/粘粒载体感染的倾向，所需一种或多种RNA/一种或多种蛋白质的内源表达或其缺乏，染色体数目，染色体异常，顺应在5/6/7/8/9pH下生长，对UV/诱变剂/辐射的耐受性，在改变/人工/按比例增加的生长条件(即包括反应器)下维持上述特征的能力。
与通过常规方法制备的细胞和细胞系相比较，本发明的细胞和细胞系具有增强的性质。例如，本发明的细胞和细胞系具有增强的表达稳定性和/或表达水平(甚至在无选择压力的培养中维持时，所述选择压力包括例如抗生素和其他药物)。在其他实施方案中，本发明的细胞和细胞系在多种测定法中具有高Z′值。在另外其他的实施方案中，与更常规改造的细胞相比较，本发明的细胞和细胞系在其生理学相关的蛋白质活性的表达背景中得到改善。这些性质增强且改善本发明的细胞和细胞系用于任何用途的能力，无论在鉴定调节剂的测定法中、用于细胞疗法、用于蛋白质生产还是任何其他用途，并且改善经鉴定的调节剂的功能属性。
本发明的细胞和细胞系的进一步有利的性质是它们在不存在药物或其他选择压力的情况下稳定表达目的蛋白质。因此，在一个优选实施方案中，本发明的细胞和细胞系维持在无任何选择压力的培养中。在进一步的实施方案中，细胞和细胞系无需任何药物或抗生素而维持。如本文所使用的，细胞维持指在它们已如对于蛋白质表达所述进行选择后培养细胞。维持不指在细胞分选前在选择压力(例如抗生素)下生长细胞的可选步骤，在所述细胞分选中，引入细胞内的一种或多种标记允许富集混合群体中的稳定转染株。
本发明的细胞和细胞系无药物和无选择压力的细胞维持提供许多优点。例如，药物抗性细胞可能不以足够水平表达共转染的目的转基因，因为选择依赖于已摄取药物抗性基因、连同或不连同转基因的细胞的存活。此外，选择药物和其他选择压力因素通常是致诱变的或以其他方式干扰细胞的生理学，导致在基于细胞的测定法中的偏差结果。例如，选择药物可以降低对凋亡的敏感性(Robinson等人，Biochemistry，36(37)：11169-11178(1997))，增加DNA修复和药物代谢(Deffie等人，Cancer Res.48(13)：3595-3602(1988))，增加细胞pH(Thiebaut等人，J Histochem Cytochem.38(5)：685-690(1990)；Roepe等人，Biochemistry.32(41)：11042-11056(1993)；Simon等人，Proc Natl Acad Sci U S A.91(3)：1128-1132(1994))，降低溶酶体和胞内体pH(Schindler等人，Biochemistry.35(9)：2811-2817(1996)；Altan等人，J Exp Med.187(10)：1583-1598(1998))，降低质膜电位(Roepe等人，Biochemistry.32(41)：11042-11056(1993))，增加对氯化物(Gill等人，Cell.71(1)：23-32(1992))和ATP(Abraham等人，Proc Natl Acad Sci US A.90(1)：312-316(1993))的质膜电导，和增加囊泡转运的速率(Altan等人，Proc Natl Acad Sci U S A.96(8)：4432-4437(1999))。因此，本发明的细胞和细胞系允许不含由选择压力引起的假象的筛选测定法。在某些优选实施方案中，在细胞分选前或后，本发明的细胞和细胞系不与选择压力因素例如抗生素一起培养，从而使得即使当未从富集细胞群体开始时，也通过分选来分离具有所需性质的细胞和细胞系。
在表达和表达水平(RNA或蛋白质)的背景中，与通过常规方法产生的细胞和细胞系相比较，本发明的细胞和细胞系具有增强的稳定性。为了鉴定特征在于此类稳定表达的细胞和细胞系，经过时间过程测量细胞或细胞系的目的蛋白质表达，并且比较表达水平。稳定细胞系将在时间过程自始至终继续表达(RNA或蛋白质)。在本发明的某些方面，时间过程可以是至少1周、2周、3周等，或至少1个月、或至少2、3、4、5、6、7、8或9个月，或两者之间的任何时间长度。
经分离的细胞和细胞系可以例如通过PCR、RT-PCR、qRT-PCR和单终末点RT-PCR进行进一步表征，以测定被表达(RNA)的绝对量和相对量(在多亚单位蛋白质或多重目的蛋白质的情况下)。优选地，多亚单位蛋白质的亚单位的扩增水平在本发明的细胞和细胞系中基本上是相同的。
在其他实施方案中，随着时间的过去测定目的功能蛋白质的表达。在这些实施方案中，通过比较功能测定法经过时间过程的结果来测量稳定表达。基于功能测定法的细胞和细胞系的测定提供鉴定这样的细胞和细胞系的益处，所述细胞和细胞系不仅稳定表达蛋白质(RNA或蛋白质)，还稳定产生且适当加工(例如，翻译后修饰、亚单位装配和在细胞内的定位)蛋白质，以产生功能蛋白质。
本发明的细胞和细胞系具有提供具有高重现性的测定法的进一步有利性质，如由其Z′因子证明的。参见Zhang JH，Chung TD，Oldenburg KR，″A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluationand Validation of High Throughput Screening Assays.″J.Biomol.Screen.1999；4(2)：67-73，所述参考文献通过引用整体合并入本文。Z′值涉及细胞或细胞系的品质，因为它反映细胞或细胞系将一致地响应调节剂的程度。Z′是考虑到跨越多孔平板对参考化合物的功能应答的信噪比范围和信号变异性(即，从孔到孔之间)的统计计算。使用得自具有阳性对照的多个孔和具有阴性对照的多个孔的Z′数据计算Z′。根据下式其组合的标准差的比乘以3至差异因子，用1减去其平均值以得到Z′：
Z′因子＝1-((3σ阳性对照+3σ阴性对照)/(μ阳性对照-μ阴性对照))
如果因子是1.0，这将指示具有理论最大Z′的理想测定法，无变异性和无限的动态范围。如本文所使用的，“高Z′”指具有至少0.6、至少0.7、至少0.75或至少0.8、或0.6至1.0之间的任何小数的Z′因子。在复杂靶的情况下，高Z′意指至少0.4或更大的Z′。接近于0的得分是不希望的，因为它指示在阳性和阴性对照之间存在重叠。在工业中，对于简单的基于细胞的测定法，直到0.3的Z′得分被视为边缘得分，0.3至0.5的Z′得分表示为可接受的，并且超过0.5的Z′得分表示为极佳的。无细胞或生物化学测定法可以接近关于基于细胞的系统的得分，因为更高的Z′得分而趋于更低，但基于Z′细胞的系统是复杂的。
如本领域普通技术人员应认识到的，使用表达甚至单链蛋白质的常规细胞的基于细胞的测定法一般也未达到高于0.5至0.6的Z′。即使在本领域中得到报告，由于其添加的复杂性，具有多亚单位蛋白质的改造表达(来自所引入编码序列或基因激活)的细胞也将更低。此类细胞对于在测定法中的使用将是不可靠的，因为结果将不是可重现性的。另一方面，本发明的细胞和细胞系具有更高的Z′值，并且有利地在测定法中产生一致的结果。事实上，本发明的细胞和细胞系提供用于高通量筛选(HTS)相容测定法的基础，因为它们一般具有与常规产生的细胞不同的值。在本发明的某些方面，细胞和细胞系导致至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7或至少0.8的Z′。对于本发明的细胞和细胞系，甚至至少0.3-0.4的Z′值也是有利的，因为目的蛋白质是多基因靶。在本发明的其他方面，即使在细胞维持多次传代后，例如，在5-20代之间，包括在5和20之间的任何整数，本发明的细胞和细胞系也导致至少0.7、至少0.75或至少0.8的Z′。在本发明的某些方面，在维持1、2、3、4或5周或2、3、4、5、6、7、8或9个月的细胞和细胞系中，包括两者之间的任何时间段，细胞和细胞系导致至少0.7、至少0.75或至少0.8的Z′。
在一个进一步的方面，本发明提供了用于产生本发明的细胞和细胞系的方法。在一个实施方案中，该方法包括步骤：
a)提供表达编码目的蛋白质的mRNA的多个细胞；
b)将细胞单个分散到单个培养器皿内，从而产生多个分离的细胞培养物；
c)使用自动化细胞培养法在一组所需培养条件下培养细胞，所述自动化细胞培养法的特征在于所述条件对于分离的细胞培养物各自是基本上等同的，在这个培养过程中使细胞数目/分离的细胞培养物进行标准化，并且其中分离培养物根据相同时间表进行传代；
d)就目的蛋白质的至少一种所需特征测定分离的细胞培养物至少2次；和
e)鉴定在2种测定法中都具有所需特征的分离的细胞培养物。
根据该方法，细胞在所需培养条件组下进行培养。条件可以是任何所需条件。本领域技术人员应当了解在一组培养条件内包括何种参数。例如，培养条件包括但不限于：培养基(基础培养基(DMEM、MEM、RPMI、无血清、含血清、完全化学成分限定的、无动物衍生的组分)，单和二价离子(钠、钾、钙、镁)浓度，加入的另外组分(氨基酸、抗生素、谷氨酰胺、葡萄糖或其他碳源、HEPES、通道阻断剂、其他靶的调节剂，维生素，微量元素，重金属，辅因子，生长因子、抗凋亡试剂)，新鲜或条件培养基，具有HEPES，pH，特定营养素耗尽或限制性的(氨基酸、碳源))，在分裂/传代前允许细胞达到的汇合水平，细胞的饲养层，或γ辐射的细胞，CO2，三气系统(氧、氮、二氧化碳)，湿度，温度，静止或在振荡器上等，这将是本领域技术人员众所周知的。
细胞培养条件可以为了方便起见或为了细胞的特定所需用途而选择。有利地，本发明提供了最佳适合于特定所需用途的细胞和细胞系。即，在其中细胞在用于特定所需用途的条件下进行培养的本发明的实施方案中，选择在用于特定所需用途的条件下具有所需特征的细胞。
作为举例说明，如果细胞将在其中希望细胞是粘附的测定法中在平板中使用，那么可以选择在测定法的条件下显示粘附的细胞。类似地，如果细胞将用于蛋白质生产，那么细胞可以在适合于蛋白质生产的条件下进行培养，并且就关于这个用途的有利性质进行选择。
在某些实施方案中，该方法包括测量分离的细胞培养物的生长速率的另外步骤。可以使用技术人员众所周知的多种技术方法中的任何一种测定生长速率。此类技术包括但不限于测量ATP、细胞汇合、光散射、光密度(例如，OD 260用于DNA)。优选地，使用使培养物在所选择的培养条件外花费的时间量降到最低的方法测定生长速率。
在某些实施方案中，测量细胞汇合，并且根据汇合值计算生长速率。在某些实施方案中，在测量细胞汇合前使细胞分散并且去除凝块用于改善的准确度。用于使细胞单分散的方法是众所周知的，并且可以例如通过向待测量的培养物中加入分散剂来实现。分散剂是众所周知且容易获得的，并且包括但不限于，酶促分散剂例如胰蛋白酶，和基于EDTA的分散剂。使用用于这个用途的商购可得的软件例如HAMILTON VECTOR，根据汇合日期可以计算生长速率。例如使用自动化微板读取器的自动化汇合测量是特别有用的。测量汇合的平板读取器是商购可得的，并且包括但不限于，CLONE SELECT IMAGER(Genetix)。一般地，在计算生长速率前进行细胞汇合的至少2次测量。用于测定生长速率的汇合值的数目可以是方便的或适合于培养的任何数目。例如，汇合可以经过例如1周、2周、3周或任何时间段且以任何所需频率测量多次。
当生长速率是已知的时，根据该方法，通过生长速率的相似性将多个分离的细胞培养物分成组。通过将培养物分组到生长速率框内，可以一起处理组中的培养物，从而提供减少培养物之间的变异的另一个标准化水平。例如，框中的培养物可以同时进行传代，同时用所需试剂进行处理等等。此外，功能测定法结果一般依赖于测定孔中的细胞密度。单个克隆的真实比较仅通过使其铺平板且以相同密度进行测定来完成。分组成特定生长速率同期组群(cohorts)使得克隆能够以特定密度铺平板，这允许它们以高通量形式在功能上进行表征。
每个组中的生长速率范围可以是任何方便的范围。选择允许细胞同时被传代且避免细胞数目的频繁重新标准化的生长速率范围是特别有利的。生长速率组可以包括非常窄的范围用于紧密分组，例如，在彼此1小时内的平均倍增时间。但根据该方法，范围可以彼此直到2小时、直到3小时、直到4小时、直到5小时或直到10小时或甚至更广泛的范围。当框中的生长速率不相同，从而使得某些培养物中的细胞数目增加得比其他的快时，出现关于重新标准化的需要。为了维持用于框中的所有培养物的基本上等同的条件，必须定期取出细胞以重新标准化跨越框的数目。生长速率越不等，就需要越频繁地重新标准化。
在步骤d)中，细胞和细胞系可以就任何生理特性进行测试且选择，所述生理特性包括但不限于：由基因组编码的细胞过程中的改变；由基因组调节的细胞过程中的改变；染色体活性模式中的改变；染色体沉默模式中的改变；基因沉默模式中的改变；基因激活模式或效率中的改变；基因表达模式或效率中的改变；RNA表达模式或效率中的改变；RNAi表达模式或效率中的改变；RNA加工模式或效率中的改变；RNA转运模式或效率中的改变；蛋白质翻译模式或效率中的改变；蛋白质折叠模式或效率中的改变；蛋白质装配模式或效率中的改变；蛋白质修饰模式或效率中的改变；蛋白质转运模式或效率中的改变；使膜蛋白质转运至细胞表面的模式或效率中的改变；生长速率中的改变；细胞大小中的改变；细胞形状中的改变；细胞形态中的改变；RNA含量％中的改变；蛋白质含量％中的改变；含水量％中的改变；脂质含量％中的改变；核糖体含量中的改变；线粒体含量中的改变；ER质量中的改变；质膜表面积中的改变；细胞体积中的改变；质膜的脂质组成中的改变；核被膜的脂质组成中的改变；质膜的蛋白质组成中的改变；核被膜的蛋白质组成中的改变；分泌囊泡数目中的改变；溶酶体数目中的改变；空泡数目中的改变；细胞关于下述的能力或潜力中的改变：蛋白质生产，蛋白质分泌，蛋白质折叠，蛋白质装配，蛋白质修饰，蛋白质的酶促修饰，蛋白质糖基化，蛋白质磷酸化，蛋白质去磷酸化，代谢产物生物合成，脂质生物合成，DNA合成，RNA合成，蛋白质合成，营养素吸收，细胞生长，有丝分裂，减数分裂，细胞分裂，去分化，转化成干细胞，转化成多潜能细胞，转化成全能细胞，转化成任何器官(即，肝、肺、皮肤、肌肉、胰腺、脑、睾丸、卵巢、血液、免疫系统、神经系统、骨、心血管系统、中枢神经系统、胃肠道、胃、甲状腺、舌、胆囊、肾、鼻、眼、趾甲、毛发、味蕾)的干细胞类型，转化成分化的任何细胞类型(即，肌肉、心肌、神经元、皮肤、胰腺、血液、免疫、红血细胞、白血细胞、杀伤T细胞、肠内分泌细胞、味觉、分泌细胞、肾、上皮细胞、内皮细胞，还包括可以用于引入核酸序列的已列举的任何动物或人细胞类型)，摄取DNA，摄取小分子，摄取荧光探针，摄取RNA，与固体表面附着，适应无血清条件，适应无血清悬浮条件，适应按比例增加的细胞培养，用于大规模细胞培养的用途，用于在药物开发中使用，用于在高通量筛选中使用，用于在基于功能细胞的测定法中使用，用于在膜电位测定法中使用，用于在钙流测定法中使用，用于在G蛋白受体测定法中使用，用于在基于报道细胞的测定法中使用，用于在ELISA研究中使用，用于在体外测定法中使用，用于在体内应用中使用，用于在二次测试中使用，用于在化合物测试中使用，用于在结合测定法中使用，用于在淘选测定法中使用，用于在抗体淘选测定法中使用，用于在成像测定法中使用，用于在显微成像测定法中使用，用于在多孔平板中使用，用于适应自动化细胞培养，用于适应小型化自动化细胞培养，用于适应大规模自动化细胞培养，用于适应在多孔平板(6、12、24、48、96、384、1536或更高密度)中的细胞培养，用于在细胞芯片中使用，用于在载玻片上使用，用于在玻璃载玻片上使用，用于在载玻片或玻璃载玻片上的微阵列，用于免疫荧光研究，用于在蛋白质纯化中使用，用于在生物制品生产中使用，用于在工业酶生产中使用，用于在用于研究的试剂生产中使用，用于在疫苗开发中使用，用于在细胞疗法中使用，用于在植入动物或人内使用，用于在由细胞分泌的因子分离中使用，用于cDNA文库的制备，用于RNA的纯化，用于DNA的纯化，用于经由病原体、病毒或其他因子感染，用于对经由病原体、病毒或其他因子感染的抵抗力，用于对药物的抵抗力，用于在自动化小型化细胞培养条件下维持的适合性，用于在蛋白质生产中用于表征，包括：蛋白质晶体学、疫苗开发、免疫系统的刺激、抗体生产或抗体的产生或测试。本领域技术人员将容易认识到用于上文列出的特性中的任何一种的合适测试。
可以用于表征本发明的细胞和细胞系和/或本发明的相匹配实验对象组的测试包括但不限于：氨基酸分析、DNA测序、蛋白质测序、NMR、用于蛋白质转运的测试、用于核质转运的测试、用于蛋白质的亚细胞定位的测试、用于核酸的亚细胞定位的测试、显微分析、亚显微分析、荧光显微镜检查、电子显微镜检查、共焦显微镜检查、激光消融技术、细胞计数和透析。技术人员应当了解如何使用上文列出的测试中的任何一种。
当产生细胞或细胞系的集合或实验对象组例如用于药物筛选时，集合或实验对象组中的细胞或细胞系可以这样相匹配，使得它们就一种或多种选择的生理特性而言是相同的(包括基本上相同的)。在这个背景中的“相同生理特性”意指所选择的生理特性在集合或实验对象组中的成员当中是足够相似的，从而使得细胞集合或实验对象组可以在药物筛选测定法中产生可靠结果；例如，药物筛选测定法中的读数中的变异将是由于例如测试化合物对表达不同形式的蛋白质的细胞的不同生物活性，而不是由于细胞中的固有变异。例如，细胞或细胞系可以相匹配以具有相同生长速率，即在细胞集合或实验对象组的成员当中具有不超过1、2、3、4或5小时差异的生长速率。例如通过经由其生长速率将细胞框并成5、6、7、8、9或10个组，并且使用来自相同框并组的细胞产生实验对象组，可以实现这点。测定细胞生长速率的方法是本领域众所周知的。实验对象组中的细胞或细胞系还可以相匹配，以具有相同Z′因子(例如，相差不超过0.1的Z′因子)、蛋白质表达水平(例如，相差不超过5％、10％、15％、20％、25％或30％的CFTR表达水平)、RNA表达水平、与组织培养表面的附着等。相匹配的细胞和细胞系可以在通过例如自动化平行加工实现的等同条件下生长，以维持所选择的生理特性。
在一个实施方案中，实验对象组就在相同条件组下的生长速率相匹配。此类实验对象组在本文中也称为相匹配实验对象组，对于在广泛范围的基于细胞的研究中使用是高度希望的，在所述研究中希望跨越2种或更多种细胞系比较实验变量的效应。就生长速率相匹配的细胞系随着时间的过去维持大致相同的细胞数目/孔，从而减少生长条件例如实验对象组中的细胞系之间的营养素含量中的变异。
根据本发明，相匹配实验对象组可以具有在任何所需范围内的生长速率，依赖于许多因素，包括细胞的特征、实验对象组的预期用途、实验对象组的大小、培养条件等。此类因素将是本领域技术人员容易理解的。
生长速率可以通过任何合适和方便的方法进行测定，唯一要求是关于相匹配实验对象组的所有细胞系的生长速率通过相同方法进行测定。用于测定生长速率的众多方法是已知的，如本文所描述的。
本发明的相匹配实验对象组可以包括任何数目的克隆细胞系。在实验对象组中的克隆细胞系的最大数目对于每个用途和用户都不同，并且可以与可以维持的一样多。在多种实施方案中，实验对象组可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个克隆细胞系，例如至少12、至少15、至少20、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少48、至少50、至少75、至少96、至少100、至少200、至少300、至少384、至少400个或更多个克隆细胞系。
根据本发明，实验对象组包括多个克隆细胞系，即由不同的单一亲本细胞产生的多个细胞系。任何所需细胞类型都可以用于产生相匹配实验对象组。实验对象组可以包括所有相同类型的细胞系或不同细胞类型的细胞系。
实验对象组中的克隆细胞系稳定表达一种或多种目的蛋白质。稳定表达可以是任何时间段，其适合于实验对象组的所需用途，但最低限度地，足够长以允许在相匹配实验对象组中选择和使用。
在相匹配实验对象组中的克隆细胞系可以全部表达相同的一种或多种目的蛋白质，或实验对象组中的某些克隆细胞系可以表达不同目的蛋白质。
在某些实施方案中，相匹配实验对象组包括表达不同目的蛋白质的一个或多个克隆细胞系。即，实验对象组中的第一个克隆细胞系可以表达第一种目的蛋白质，实验对象组中的第二个克隆细胞系可以表达第二种目的蛋白质，实验对象组中的第三个克隆细胞系可以表达第三种目的蛋白质，等等，对于与需要的一样多的不同目的蛋白质。不同目的蛋白质可以是不同同种型、等位基因变体、剪接变体、或突变的(包括但不限于序列突变或截短的)、嵌合或化学包括酶促修饰形式的目的蛋白质。在某些实施方案中，不同蛋白质可以是功能上限定的蛋白质组的成员，例如苦味受体的实验对象组或激酶的实验对象组。在某些实施方案中，不同蛋白质可以是相同或相关的信号传导途径的部分。在涉及异源多聚体蛋白质(包括异源二聚体)的另外其他的实验对象组中，实验对象组可以包括亚单位的2种或更多种不同组合直到亚单位的所有可能组合。组合可以包括亚单位序列变体、亚单位同种型组合、亚单位的种间组合和亚单位类型的组合。
例如，γ-氨基丁酸(GABA)A受体一般包括2个α亚单位、2个β亚单位和1个γ亚单位。存在6种α同种型、5种β同种型、4种γ同种型，以及δ、π、θ和ε亚单位。本发明考虑了包括这些亚单位中的任何的2种或更多种组合的实验对象组，包括包含α、β、γ、δ、π、ε和θ亚单位的每一种可能组合的实验对象组。此外，GABA受体家族还包括GABAB和GABAC受体。本发明还考虑了包括GABAA、GABAB和GABAC亚单位的任何组合的实验对象组。在某些实施方案中，此类实验对象组包括人GABA亚单位，哺乳动物GABA受体实验对象组，例如非人灵长类动物(例如食蟹猴)GABA受体，小鼠、大鼠或人GABA受体实验对象组或其混合物。
在一个进一步的例子中，本发明考虑了一种或多种上皮钠通道(ENaC)实验对象组，包括任何哺乳动物ENaC实验对象组，例如非人灵长类动物(例如食蟹猴)ENaC，小鼠、大鼠或人ENaC实验对象组或其混合物。如同GABA受体，完整ENaC包括多个亚单位：α或δ、β和γ。本发明考虑了具有ENaC亚单位的至少2种不同组合的实验对象组，并且还考虑了ENaC亚单位的所有可能组合，包括来自不同物种的亚单位的组合，同种型、等位基因变体、SNP、嵌合亚单位、包括经修饰的和/或非天然氨基酸的形式和经化学修饰的例如经酶促修饰的亚单位的组合。本发明还考虑了包括国际申请PCT/US09/31936中所示的ENaC形式的实验对象组，所述国际申请的内容通过引用整体合并。
在一个进一步特别的实施方案中，25种苦味受体的相匹配实验对象组包括表达表10中列出的天然(无标签)功能苦味受体的细胞系。在某些实施方案中，实验对象组就生长速率相匹配。在某些实施方案中，实验对象组就生长速率和另外的目的生理特性相匹配。在某些实施方案中，实验对象组中的细胞系平行产生和/或平行筛选。
实验对象组及其用途的进一步示例性但非限制性例子是下述：有气味性受体(昆虫、犬、人、臭虫)的实验对象组，例如对于香味的概况分析或调节剂的发现；表达与测试肽融合的基因的细胞的实验对象组，即发现作用于使负荷(cargo)内在化到细胞内的肽，所述负荷例如蛋白质，包括单克隆抗体或非蛋白质药物(负荷可以是报道分子例如GFP或AP)。关于这个实施方案，来自这个实验对象组的细胞的上清液可以加入其他细胞中，用于评估内在化。在此类实施方案中，实验对象组可以包括不同细胞类型以评估细胞类型特异性递送。表达不同单克隆抗体重链/轻链组合的细胞系实验对象组以鉴定活性mAbs。抗体实验对象组还可以提供单克隆抗体的一系列衍生化形式，以鉴定具有改善特征的那种，例如在血清中的稳定性、结合亲和力等。另外一个实验对象组可以用于在多种信号传导分子例如不同G蛋白的存在下表达靶蛋白。另外一种类型的实验对象组可以用于就改善的活性/稳定性测试靶蛋白的变体。实验对象组可以包括单核苷酸多态性(SNP)或其他突变形式的靶蛋白，以选择作用于亚组、许多形式或所有形式的调节剂。其他实验对象组可以用于限定测试化合物对于蛋白质家族或蛋白质同种型(例如GABAA或其他CNS离子通道)的活性模式。差异作用的化合物随后可以用于进一步研究中，以测定相对应亚单位组合在体内的功能/作用/定位。测试化合物可以是在临床中失败的已知调节剂或具有不利的脱靶效应的那种，以测定可能与此类效应相关的亚单位组合。另外其他的实验对象组可以在HTS中用于平行筛选，用于可靠评估化合物对多重靶亚型的活性，以帮助发现对所需靶有活性的化合物和具有最低限度脱靶效应的化合物。
实验对象组可以包括任何所需蛋白质组，并且本发明考虑了所有此类实验对象组。
通过顺次、平行或两者的组合产生用于实验对象组的不同细胞系，可以产生本发明的相匹配实验对象组。例如，可以单独制备每个细胞系并且随后使它们相匹配。更优选地，为了使细胞系之间的差异降到最低，顺次产生的细胞系可以在相同阶段或传代数时冷冻，并且平行解冻。更加优选地，平行制备细胞系。
在一个优选实施方案中，实验对象组中的细胞系平行进行筛选或测定。
根据本发明，相匹配实验对象组的细胞系维持在相同细胞培养条件下，包括但不限于相同培养基、温度等。实验对象组中的所有细胞系以相同频率进行传代，所述相同频率可以是任何所需频率，依赖于许多因素，包括细胞类型、生长速率。如应理解的，为了维持从实验对象组的细胞系到细胞系之间大致相等的细胞数目，应定期标准化细胞数目。
根据该方法，细胞可以以任何细胞培养形式进行培养，只要细胞或细胞系在测量生长速率的步骤前在单个培养物中分散。例如，为了方便起见，细胞可以最初合并用于在所需条件下培养，并且随后单个细胞分离成1个/细胞或器皿。
细胞可以以任何方便的细胞数目在多孔组织培养平板中进行培养。此类平板是可容易地商购获得的，并且是本领域技术人员众所周知的。在某些实施方案中，细胞可以优选在小瓶中或以任何其他方便的形式培养，各种形式将是技术人员已知的，并且是可容易地商购获得的。
在包括测量生长速率的步骤的实施方案中，在测量生长速率前，使细胞培养足够长的时间，用于使它们适应培养条件。如技术人员应当理解的，时间的长度将依赖于许多因素而改变，所述因素例如细胞类型、所选择的条件、培养形式，并且可以是从1天到数天、1周或更长时间的任何时间量。
优选地，多个分离的细胞培养物中的每个单个培养物维持在下文讨论的基本上等同的条件下，包括标准化的维持时间表。该方法的另一个有利特征是可以同时维持大量单个培养物，从而使得可以鉴定具有所需性状组的细胞，即使非常罕见。由于这些及其他原因，根据本发明，使用自动化细胞培养方法培养多个分离的细胞培养物，从而使得条件对于每个孔基本上等同。自动化细胞培养防止了人工细胞培养固有的不可避免的变异性。
任何自动化细胞培养系统都可以在本发明的方法中使用。许多自动化细胞培养系统是商购可得的，并且是技术人员众所周知的。在某些实施方案中，自动化系统是机器人系统。优选地，系统包括独立移动的通道、多通道头(例如96-尖端头)和夹子或择优挑选臂(cherry-picking arm)、以及HEPA过滤装置以维持在操作过程中的无菌性。移液器中的通道数目应适合于培养形式。方便的移液器具有例如96或384个通道。此类系统是已知且商购可得的。例如，MICROLAB STARTM仪器(Hamilton)可以用于本发明的方法中。自动化系统应能够执行多种所需细胞培养任务。此类任务将是本领域技术人员已知的。它们包括但不限于：去除培养基、替换培养基、添加试剂、细胞洗涤、去除洗涤溶液、加入分散剂、从培养器皿中取出细胞、将细胞加入培养器皿中等等。
本发明的细胞或细胞系的产生可以包括任何数目的分离的细胞培养物。然而，由该方法提供的优点随着细胞数目的增加而增加。不存在可以在该方法中利用的细胞或分离的细胞培养物数目的理论上限。根据本发明，分离的细胞培养物的数目可以是2个或更多个，但更有利地是至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个分离的细胞培养物，例如至少12、至少15、至少20、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少48、至少50、至少75、至少96、至少100、至少200、至少300、至少384、至少400、至少500、至少1000、至少10,000、至少100,000、至少500,000个或更多个。
在某些实施方案中，如所述培养的本发明的细胞和细胞系是先前已对于目的核酸选择为阳性的细胞，所述目的核酸可以是编码全部或部分目的蛋白质的所引入核酸，或激活编码全部或部分目的蛋白质的序列的转录的所引入核酸。在某些实施方案中，如本文所述培养的细胞是已就编码目的蛋白质的mRNA选择为阳性的细胞。
为了制备本发明的细胞和细胞系，可以使用例如美国专利6,692,965和WO/2005/079462中描述的技术。这些文件都通过引用整体合并入本文。这个技术提供数百万细胞的实时评估，从而使得任何所需数目的克隆(从数百个到数千个克隆)。使用细胞分选技术，例如流式细胞术细胞分选(例如用FACS机器)或磁性细胞分选(例如用MACS机器)，1个细胞/孔可以以高统计可靠性自动地存放于培养器皿(例如96孔培养平板)中。技术的速度和自动化允许容易地分离多基因重组细胞系。
使用该技术，使用信号传导探针，也称为分子信标或荧光探针，可以检测出关于目的蛋白质的RNA序列。在某些实施方案中，包含编码序列的载体具有编码RNA标签序列的另外序列。“标签序列”指其为经表达的RNA或待通过信号传导探针检测的RNA的部分的核酸序列。信号传导探针可以检测出多种RNA序列，其中任何一种都可以用作标签，包括编码肽的那些和上文描述的蛋白质标签。通过将探针设计为包括与标签的序列互补的部分，信号传导探针可以针对标签。标签序列可以是质粒的3′非翻译区，其与目的蛋白质的转录物一起共转录，并且包括用于信号传导探针结合的靶序列。标签序列可以与基因的信使的蛋白质编码部分一起在框内或与其一起在框外，依赖于是否希望给产生的蛋白质加上标签。因此，标签序列不必被翻译用于通过信号传导探针检测。标签序列可以包括相同或不同的多重靶序列，其中一种信号传导探针与每种靶序列杂交。标签序列可以定位在编码目的基因的RNA内，或标签序列可以定位在5′或3′非翻译区内。标签序列可以是具有二级结构的RNA。结构可以是三臂连接结构。在某些实施方案中，信号传导探针检测在关于目的蛋白质的编码序列内的序列。
在DNA构建体转染到细胞内和后续药物选择(如果使用)后，或在基因激活后，其各自靶向不同的标签序列且差异标记的分子信标(例如荧光探针)可以引入细胞内，并且流式细胞术细胞分选器用于分离对于其信号阳性的细胞(可以执行多轮分选)。在一个实施方案中，流式细胞术细胞分选器是FACS机器。还可以使用MACS(磁性细胞分选)或使用激光激活的分析和加工的阴性细胞的激光消融。还可以使用其他荧光平板读取器，包括与高通量筛选相容的那些。信号阳性细胞摄取一种或多种所引入序列的至少一个拷贝，并且可以将它整合到其基因组内。随后鉴定引入关于目的蛋白质的信使的细胞。例如，编码序列可以整合到细胞中的基因组的不同位置处。所引入序列的表达水平可以基于拷贝数或整合位点而改变。此外，可以获得包括目的蛋白质的细胞，其中一种或多种所引入核酸是附加型(episomal)的或起因于基因激活。
在本发明中有用的信号传导探针是本领域已知的，并且一般是包括与靶序列互补的序列和信号发射系统的寡核苷酸，所述信号发射系统如此安排，使得当探针不与靶序列结合时，无信号发射，并且当探针与靶序列结合时，发射信号。作为非限制性举例说明，信号传导探针可以包括如此定位在探针中的荧光团和猝灭剂，使得猝灭剂和荧光团在未结合的探针中被放在一起。在探针和靶序列之间结合后，猝灭剂和荧光团分离，导致信号的发射。例如国际公开WO/2005/079462描述了许多信号传导探针，其可以在本文的细胞和细胞系的产生中使用。上文对于将核酸引入细胞内描述的方法可以用于引入信号传导探针。
当使用标签序列时，每种载体(当使用多重载体时)可以包括相同或不同的标签序列。无论标签序列是相同的还是不同的，信号传导探针都可以包括不同信号发射器，例如不同颜色的荧光团等，从而使得可以分开检测每个亚单位的表达。作为举例说明，特异性检测第一种目的mRNA的信号传导探针可以包括红色荧光团，检测第二种目的mRNA的探针可以包括绿色荧光团，并且检测第三种目的mRNA的探针可以包括蓝色荧光团。本领域技术人员应知道在三重转染的细胞中用信号传导探针差异检测3种亚单位的表达的其他方法。
在一个实施方案中，信号传导探针设计为与编码目的蛋白质的RNA的部分或5′或3′非翻译区的部分互补。即使设计为识别目的信使RNA的信号传导探针能够检测虚假地内源表达的靶序列，与由经转染的细胞产生的目的序列的比例相比较，这些的比例是这样的，使得分选器能够区分2种细胞类型。
目的蛋白质的表达水平可以从细胞到细胞之间或从细胞系到细胞系之间不等。由于后生事件例如DNA甲基化以及基因沉默和转基因拷贝的丧失，细胞或细胞系中的表达水平还可以随着时间的过去而下降。这些变异可以归于各种因素，例如由细胞摄取的转基因的拷贝数、转基因的基因组整合的位点、和在基因组整合后转基因的完整性。可以使用FACS或其他细胞分选方法(即MACS)评估表达水平。可以使用引入信号传导探针的另外轮次，例如以测定对于它们最初分离的任何一种或多种RNA，随着时间的过去细胞是否保持阳性且至何种程度。
任选地，可以制备用于一个或多个生长速率组的培养物的一个或多个复制组。在某些情况下，冷冻一个或多个生长框的复制组例如以充当冷冻原种可以是有利的。然而，根据该方法，冷冻细胞原种可以与所需的一样频繁且在其产生过程中的任何点和许多点上进行制备。用于冷冻细胞培养物的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，复制组可以在任何温度下冷冻，例如在-70℃至-80℃下。在一个实施方案中，使细胞温育直至达到70-100％汇合。接下来，抽吸培养基并且将90％FBS和10％培养基的溶液加入平板中，温育且冷冻。
本发明考虑了使用不同培养条件用任何数目的复制组执行该方法。即，该方法可以用在第一组培养条件下的第一个多个(组)分离的细胞培养物和用在第二组条件下培养的第二组分离的细胞培养物构成，所述第二组条件不同于第一种条件，对于任何所需数目的条件组依此类推。使用不同条件组的方法可以同时或顺次执行或两者的组合(例如同时2个组随后为2个更多的组，等等)。
用于选择具有目的蛋白质的一致功能表达的细胞的本文所述方法的一个优点是，细胞通过功能而不是通过特定核酸在细胞中的存在进行选择。包括编码目的蛋白质的核酸的细胞可能不表达它，或即使产生蛋白质，由于许多原因，蛋白质也可能不是有功能的，或与“天然”功能相比较具有改变的功能，所述“天然”功能即在天然表达蛋白质的其正常背景中在细胞中有功能的。通过基于功能选择细胞，本文描述的方法使得能够鉴定新型功能形式。例如，可以鉴定在相同测定法中具有多种程度功能的多种细胞，例如用相同测试化合物或用一系列化合物。差异功能提供了一系列功能“概况分析”。此类概况分析例如用于鉴定差异影响蛋白质的不同功能形式的化合物。此类化合物用于鉴定蛋白质在特定组织或疾病状态等中的功能形式。
用于制备本发明的细胞和细胞系的方法的进一步优点包括，表达复杂蛋白质或多重目的蛋白质的细胞是可以在比通过常规方法明显更少的时间内产生的细胞。例如，依赖于许多因素包括功能测定法所需的细胞数目，生长速率框并是否完成和其他因素，表达可证实的功能蛋白质的细胞可以在少至2天或1周内产生，但即使2周、3周、1个月、2个月、3个月或甚至6个月的生产时间也明显快于通过常规方法可以达到的，甚至对于复杂或多重蛋白质。
在另一个方面，本发明提供了使用本发明的细胞和细胞系的方法。本发明的细胞和细胞系可以用于对于其需要目的功能蛋白质的任何应用中。细胞和细胞系可以用于例如体外基于细胞的测定法或体内测定法中，在所述体内测定法中，将细胞植入动物(例如，非人动物)中，以例如筛选调节剂；产生蛋白质用于晶体学和结合研究；且研究化合物选择性和剂量、受体/化合物结合动力学和稳定性、和受体表达对细胞生理学(例如，电生理学、蛋白质运输、蛋白质折叠和蛋白质调节)的作用。本发明的细胞和细胞系可以在敲减(knock down)研究中用于检查目的蛋白质的作用。
本发明的细胞和细胞系还可以用于鉴定可溶性生物竞争剂，用于功能测定法，生物淘选(例如，使用噬菌体展示文库)，基因芯片研究以评估基因表达中所产生的改变，双杂交研究以鉴定蛋白质-蛋白质相互作用，特异性亚单位在细胞系中的敲减以评估其作用，电生理学，蛋白质运输的研究，蛋白质折叠的研究，蛋白质调节的研究，针对蛋白质的抗体的产生，针对蛋白质的探针的分离，针对蛋白质的荧光探针的分离，蛋白质的表达对总体基因表达/加工的作用的研究，蛋白质的表达对总体蛋白质表达和加工的作用的研究，和蛋白质的表达对细胞结构、性质、特征的作用的研究。
本发明的细胞和细胞系进一步用于表征目的蛋白质(DNA、RNA或蛋白质)，包括DNA、RNA或蛋白质化学计量学，蛋白质折叠，装配，膜整合或表面呈递，构象，活性状态，激活电位，应答，功能和基于细胞的测定法功能，其中目的蛋白质包括多基因系统、复合物或途径，无论这些的所有组分是由引入细胞内的一种或多种靶基因提供，还是由所引入和内源表达的序列的任何组合提供。
本发明使得能够产生表达目的蛋白质的多重细胞系。本发明的克隆细胞系将具有此种表达的不同绝对和相对水平。此类克隆的大型实验对象组可以用许多已知参考化合物就活性进行筛选。以这种方式，每个经分离的细胞系将具有对测试化合物的应答的“指纹(fingerprint)”，这代表蛋白质的差异功能表达的活性。细胞系随后可以基于对化合物的此类应答的相似性进行分组。可以选择代表每种功能上独特的表达谱的至少一个细胞系用于进一步研究。这些细胞系的集合随后可以用于筛选大量化合物。以这种方式，可以鉴定选择性调节蛋白质的一种或多种相对应独特功能形式的化合物。这些调节剂随后可以在次级测定法中或在体内模型中进行测试，以测定何种在这些测定法或模型中证实活性。在这种背景中，调节剂将用作参考化合物，以鉴定蛋白质的何种相对应功能形式可能存在或在所采用的次级测定法或模型系统中起作用。此类测试可以用于测定可能在体内存在的蛋白质的功能形式以及可能是生理学相关的那些。这些调节剂可以用于区分功能上独特形式中的何种涉及特定表型或生理功能例如疾病。
当制备细胞系用于仍未得到充分表征的蛋白质时，这种方法也是有用的。对于此类蛋白质，通常关于其对已知化合物的功能应答性质的信息很少。评估克隆活性的已确定的功能基准的此类缺乏可以是产生生理学相关细胞系中的一个挑战。上文描述的方法提供了获得生理学相关细胞系的途径，即使对于当存在此类信息的缺乏时，未得到充分表征的蛋白质。通过寻找代表许多或所有功能形式的克隆，其可以起因于包括蛋白质的基因的表达，可以获得包括蛋白质的生理学相关形式的细胞系。
基于其对各种调节剂的应答，通过使蛋白质的体内形式的身份与蛋白质的已知形式的身份相关联，本发明的细胞和细胞系可以用于鉴定目的蛋白质的不同形式在不同病理状态中的作用。这允许选择疾病或组织特异性调节剂用于与蛋白质相关的病理状态的高度靶向治疗。
为了鉴定调节剂，在其中蛋白质将预期是有功能的条件下，使本发明的细胞或细胞系暴露于测试化合物，并且随后检测与合适对照例如未暴露于测试化合物的细胞相比较，蛋白质活性中的统计学显著改变(例如，p＜0.05)。还可以使用采用已知激动剂或拮抗剂和/或表达目的蛋白质的细胞的阳性和/或阴性对照。本领域普通技术人员应当理解各种测定法参数例如信噪比可以得到最佳化。
在某些实施方案中，使本发明的一种或多种细胞或细胞系暴露于多种测试化合物，例如测试化合物的文库。使用本发明的细胞系可以筛选此类测试化合物文库，以鉴定目的蛋白质的一种或多种调节剂。测试化合物可以是化学部分，包括小分子、多肽、肽、肽模拟物、抗体或其抗原结合部分、天然化合物、合成化合物、提取物、脂质、洗涤剂等。在抗体的情况下，它们可以是非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。抗体可以是包括重链和轻链的完全互补体的完整抗体或任何抗体的抗原结合部分，包括抗体片段(例如Fab和Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb等)、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、重链或轻链可变区的全部或抗原结合部分。
在某些实施方案中，在暴露于测试化合物前，本发明的细胞或细胞系可以通过预处理例如酶进行修饰，所述酶包括哺乳动物或其他动物酶、植物酶、细菌酶、蛋白质修饰酶和脂质修饰酶。此类酶可以包括例如激酶，蛋白酶，磷酸酶，糖苷酶，氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，连接酶，细菌蛋白酶，来自肠的蛋白酶，来自GI道的蛋白酶，在唾液、口腔中的蛋白酶，来自lysol细胞/细菌的蛋白酶等。备选地，细胞和细胞系可以首先暴露于测试化合物，随后为酶处理，以鉴定通过处理改变蛋白质的修饰的化合物。
在某些实施方案中，在基于细胞的、功能性的高通量筛选(HTS)中，例如使用96孔、384孔、1536孔或更高密度的形式，就蛋白质调节活性测试大型化合物集合。在某些实施方案中，使用超过一种本发明的细胞或细胞系，可以筛选测试化合物或多重测试化合物，包括测试化合物文库。
在某些实施方案中，本发明的细胞和细胞系对于目的蛋白质的调节剂具有增加的敏感性。本发明的细胞和细胞系还响应对于蛋白质具有生理学范围EC50或IC50值的调节剂。如本文所使用的，EC50指在细胞或细胞系中诱导半最大激活应答所需的化合物或物质的浓度。如本文所使用的，IC50指在细胞或细胞系中诱导半最大抑制应答所需的化合物或物质的浓度。EC50和IC50值可以使用本领域众所周知的技术进行测定，例如使化合物或物质的浓度与表达蛋白质的细胞系的应答相关联的剂量应答曲线。
本发明的细胞和细胞系的进一步有利的性质是，使用那些细胞和细胞系在起始筛选中鉴定的调节剂在次级功能测定法中是有功能的。如本领域技术人员应认识到的，在起始筛选测定法中鉴定的化合物一般必须是例如通过组合化学、药物化学或合成化学进行修饰的，用于其衍生物或类似物在次级功能测定法中有功能。然而，由于本发明的细胞和细胞系的高生理学相关性，使用这些细胞和细胞系鉴定的许多化合物无需进一步修饰即是有功能的。在某些实施方案中，在起始测定法中鉴定的至少25％、30％、40％、50％或更多的调节剂在次级测定法中是有功能的。此外，本发明的细胞系在功能测定法中表现与“黄金标准”测定法相当。例如，表达GABA A受体的本发明的细胞系在膜电位测定法和电生理学中表现基本上相同。
本发明的这些和其他实施方案可以在下述非限制性实施例中进一步举例说明。
实施例
实施例1  产生稳定的表达GABAA的细胞系
产生表达载体
基于pCMV-SCRIPT(Stratagene)产生允许流水线克隆的质粒表达载体，并且包含关于目的基因转录和翻译的多种所需组分，包括CMV和SV40真核启动子；SV40和HSV-TK多腺苷酸化序列；多克隆位点；Kozak序列和新霉素/卡那霉素抗性盒。
步骤1-转染
转染293T和CHO细胞。该实施例聚焦在CHO细胞，其中CHO细胞用3种单独质粒以下述组合进行共转染：α1β3γ2s(α1)、α2β3γ2s(α2)、α3β3γ2s(α3)和α5β3γ2s(α5)，一种质粒编码人GABAα亚单位(SEQ ID NO：GABA1-GABA4)、一种质粒编码人GABAβ3亚单位(SEQ ID NO：GABA5)，并且另一种质粒编码人GABAγ2亚单位(SEQ ID NO：GABA6)。如本领域技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX试剂、Fugene 6、DOTAP/DOPE、Metafectine或Fecturin。
尽管药物选择在本发明的方法中是任选的，还是包括一种药物抗性标记/质粒。序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码标签的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的标签序列是GABA靶序列1(SEQ ID NO：GABA7)、GABA靶序列2(SEQ ID NO：GABA8)和GABA靶序列3(SEQ IDNO：GABA9)。在这些例子中，包含GABAα亚单位基因的载体包含GABA靶序列1，包含GABAβ亚单位基因的载体包含GABA靶序列2，并且包含GABAγ亚单位基因的载体包含GABA靶序列3。
步骤2-选择步骤
经转染的细胞在HAMF12-FBS中生长2天，随后为在含抗生素的HAMF12-FBS中14天。含抗生素的时期具有如下加入培养基中的抗生素：嘌呤霉素(3.5ug/ml)、潮霉素(150ug/ml)和G418/新霉素(300ug/ml)
步骤3-细胞传代
在抗生素选择后且在引入荧光探针前，使细胞在不存在抗生素的情况下传代6-18次，以允许经过所选择的时间段不稳定的表达以减退的时间。
步骤4-细胞暴露于荧光探针
收获细胞并且用GABA信号传导探针(SEQ ID NO：GABA10-GABA12)进行转染。如本领域技术人员应当理解的，适合于与所选择的宿主细胞一起使用的任何试剂都可以用于将核酸(例如质粒、寡核苷酸、经标记的寡核苷酸)引入具有合适最佳化的宿主细胞内。可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于Lipofectamine、Lipofectamine 2000、Oligofectamine、TFX试剂、Fugene 6、DOTAP/DOPE、Metafectine或Fecturin。
GABA信号传导探针1结合GABA靶序列1，GABA信号传导探针2结合GABA靶序列2并且GABA信号传导探针3结合GABA靶序列3。随后收集细胞用于分析且使用荧光激活细胞分选器分选(下文)。
通过信号传导探针检测的靶序列
GABA靶1
5’-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3’(SEQ IDNO：GABA7)(α亚单位)
GABA靶2
5’-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3’(SEQ ID NO：GABA8)(β亚单位)
GABA靶3
5’-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3’(SEQ ID NO：GABA9)(γ亚单位)
信号传导探针
作为100μM原液供应
在特定实验中使用具有与Cy5相似的谱性质的Quasar Dye(BioSearch)的相似探针。还应当指出在某些情况下使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。
GABA信号传导探针1-结合(GABA靶1)
5’-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ3猝灭-3’(SEQ ID NO：GABA10)
GABA信号传导探针2-结合(GABA靶2)
5’-Cy5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ3猝灭-3’(SEQ ID NO：GABA11)
应当指出BHQ3可以由探针1或探针2中的BHQ2或金颗粒置换。
GABA信号传导探针3-结合(GABA靶3)
5’-Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGCBHQ1猝灭-3”(SEQ ID NO：GABA12)
应当指出BHQ1可以由探针3中的BHQ2或Dabcyl置换。
步骤5-阳性细胞的分离
使细胞解离并收集用于分析和使用荧光激活细胞分选器进行分选。标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离到有条形码的96孔平板内。门控层次如下：门控层次：符合门(coincidence gate)＞单峰(singlets)门＞活门(live gate)＞分选门(Sort gate)。用这种门控策略，标记出三重阳性细胞的顶端0.04-0.4％用于分选到有条形码的96孔平板内。
步骤6-步骤1-5和/或3-5的另外循环
重复步骤1-5和/或3-5以获得更大数目的细胞。完成步骤1-5的2个独立循环，并且对于这些循环中的每一个，执行步骤3-5的至少3个内部循环用于独立循环的合计。
步骤7-关于细胞群体的生长速率的估计
将平板转移至Hamilton Microlabstar自动化液体处理器。使细胞在2-3天条件生长培养基：新鲜生长培养基(生长培养基是Ham’sF12/10％FBS)的1∶1混合物中温育5-7天，其中补充有100单位青霉素/ml加上0.1mg/ml链霉素，并且随后使用0.25％胰蛋白酶通过胰蛋白酶消化进行分散，以使凝块降到最低，并且转移至新96孔平板。在克隆分散后，使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依靠报告的超过70％的汇合。在经过9天(在分散后第1和10天之间)每3次的天数时获得汇合测量，并且用于计算生长速率。
步骤8-根据生长速率估计框并细胞群体
根据在步骤7中的分散步骤后10-11天之间的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期组群铺平板)。独立地收集框并且铺平板在个别96孔平板上用于下游处理，并且可以存在超过一块靶平板/特定框。通过考虑生长速率的扩展且将覆盖细胞群体总数目的高百分比的范围归为同类(bracket)来计算框。依赖于分选反复操作(iteration)(参见步骤5)，使用具有1-4天分隔的5-6个生长框。因此每个框相应于在12-14.4小时之间的生长速率或群体倍增时间，依赖于反复操作。
步骤9-重复铺平板以加快平行加工且提供严格QC
使平板在标准和固定条件(湿润的37℃、5％CO2/95％空气)下在不含抗生素的Ham’s F12培养基/10％FBS中温育。使细胞的平板分开，以产生4组(组由关于所有生长框的所有平板组成-这些步骤确保起始组的4个重复)靶平板。高达2块靶平板组提交用于低温保存(参见下文)，并且其余组按比例放大，并且进一步重复铺平板，用于传代和用于功能测定法实验。不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源用于每个独立执行的平板组。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质：加入到制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除跨越的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。
步骤10-冷冻细胞群体的早期传代原种
使至少2组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许每个组中的平板达到70-100％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和10％DMSO。平板用Parafilm密封，并且随后通过1-5cm泡沫材料分别围绕，并且放置到-80℃冷藏库中。
步骤11-用于产生VSF的起始转化步骤的方法和条件
其余平板组如步骤9中所述进行维持(上文)。所有细胞分开(splitting)使用自动化液体处理步骤来执行，包括培养基去除、细胞洗涤、胰蛋白酶添加和温育、猝灭和细胞分散步骤。
步骤12-校正生长速率的任何其余变异性的标准化方法
控制用于所有细胞群体的细胞和培养条件的一致性和标准化。通过跨越平板的细胞数目的定期标准化，可以控制由于生长速率中的轻微差异导致的跨越平板的任何差异。
步骤13-细胞群体的表征
使细胞维持6-8周的细胞培养，以允许其在这些条件下的体外进化。在这个时间过程中，观察大小、形态、脆性、对胰蛋白酶消化或解离的应答、解离后的圆形/平均圆形度、活力百分比、朝向微汇合(microconfluency)的趋势、或细胞维持的其他方面例如与培养平板表面的附着。
步骤14-细胞群体在VSF条件下的潜在功能性的评估
使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书使用膜电位测定试剂盒(Molecular Devices/MDS)。细胞在96或384孔平板中以多重不同密度进行测试并且分析应答。使用铺平板后的各个时间点，例如铺平板后12-48小时。还就测定应答差异测试不同的铺平板密度。
步骤15
使来自在低和较高传代数下执行的实验的功能应答相比较，以鉴定经过3-9周的限定时间段具有最一致应答的细胞。还指出注意随着时间的过去改变的其他细胞特征，包括形态、朝向微汇合的趋势、和铺平板后与培养基质附着前的时间。
步骤16
符合功能和其他标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些。所选择的细胞群体在更大的组织培养器皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤用于一致和可靠传代。这些包括不同的铺平板细胞密度、传代时间、培养皿大小/形式和包被、流体学最佳化、细胞解离最佳化(类型、所用体积和时间长度)、以及洗涤步骤。当经过培养中的4周过程每数天进行测试时，测定法Z′得分是稳定的。
此外，测定在每次传代时的细胞活力。增加人工干预，并且更紧密地观察且监控细胞。这个信息用于帮助鉴定并选择保留所需性质的最终细胞系。选择显示一致生长、合适附着以及功能应答的最终细胞系和备份细胞系。
步骤17-细胞库的建立
与最终细胞系和备份细胞系相对应的低传代冷冻平板(参见上文)在37℃下解冻，用Ham’s F12/10％FBS洗涤2次，并且在湿润的37℃/5％CO2条件下温育。细胞随后扩增2-3周的时间段。建立关于每个最终和备份细胞系的细胞库，由各具有10,000,000细胞的25个小瓶组成。
步骤18
使来自细胞库的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增。测试所得到的细胞，以证实它们符合它们最初就其进行选择的相同特征。
实施例2  GABAA细胞系响应GABA配体的验证
评估表达GABAA(α1β3γ2s(α1)、α2β3γ2s(α2)、α3β3γ2s(α3)和α5β3γ2s(α5)的亚单位组合)的CHO细胞系对GABA——内源GABAA配体的应答。使用下述方案，通过测量响应GABA的GABAA膜电位，评估细胞系与GABA的相互作用。
在测定前24小时，细胞在生长培养基(Ham’s F-12培养基加上FBS和谷氨酰胺)中在384孔平板中以10-25,000细胞/孔铺平板。去除培养基，随后为添加在装载缓冲液(137mM NaCl、5mMKCl、1.25mM CaCl、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释的膜电位染料。温育为1小时，随后为平板装载到高通量荧光平板读取器(HamamastuFDSS)上。使GABA配体在MP测定法缓冲液(137mM NaCl、5mMKGluconate、1.25mM CaCl、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释至所需浓度(需要时，产生GABA的连续稀释，所用浓度：3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1uM、3uM、10uM)，并且加入每个孔中。读取平板90秒。
表GABA1(下文)证实所产生的细胞系各自响应GABA配体。这些结果指示如预期的响应内源配体的所产生的GABAA细胞系，对于在高通量筛选测定法中使用是生理学相关的。此外，复制孔产生孔到孔之间的精确EC50值，指示GABAA细胞系的高重现性。使用膜电位测定法产生的Z′值是α1β3γ2s 0.58、α2β3γ2s 0.67、α3β3γ2s 0.69和α5β3γ2s 0.62。
实施例3  使用已知GABAA调节剂另外验证GABAA细胞系。
使用在荷包牡丹碱(已知拮抗剂)的测定法缓冲液中以30uM、10uM、3uM、1uM、300nM、100nM和30nM的系列稀释，通过实施例2中描述的方法验证GABAA细胞系和膜电位测定法。
发现在GABA的EC50浓度的存在下，荷包牡丹碱与所有4个GABAA细胞系相互作用。这些结果指示如预期的响应GABAA的这种已知调节剂的所产生的GABAA细胞系，对于在高通量筛选测定法中使用是生理学和药理学相关的。
实施例4使用膜电位测定法就天然GABAA功能表征表达GABAA的细胞系
评估表达GABAA(α1β3γ2s(α1)、α2β3γ2s(α2)、α3β3γ2s(α3)和α5β3γ2s(α5)的亚单位组合)的CHO细胞系与来自LOPAC 1280(Library of Pharmacologically Active Compounds)的1280种化合物的相互作用(Sigma-RBI产品编号LO1280)。LOPAC 1280文库包含具有充分证明的药理学活性的高纯度、小有机配体。使用下述方案，通过测量响应测试化合物的GABAA的膜电位，评估细胞系与测试化合物的相互作用。
在测定前24小时，细胞在生长培养基(Ham’s F-12培养基加上FBS和谷氨酰胺)中在384孔平板中以10-25,000细胞/孔铺平板。去除培养基，随后为添加在装载缓冲液(137mM NaCl、5mMKCl、1.25mM CaCl、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释的膜电位染料。温育为1小时，随后为平板装载到高通量荧光平板读取器(HamamastuFDSS)上。使测试化合物在MP测定法缓冲液(137mM NaCl、5mMKGluconate、1.25mM CaCl、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释至所需浓度(需要时，产生每种测试化合物的连续稀释，所用浓度：3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1uM、3uM、10uM)，并且加入每个孔中。读取平板90秒。
结果
测量每种化合物针对所产生的GABAA细胞系的活性，并且显示与GABA(内源配体)相似或更大活性的化合物评分为阳性命中。在筛选的1280种化合物中，34种激活至少一个细胞系(即，或者α1、α2、α3和α5)，以及如果不优于GABA。这些化合物中的17种与所产生的GABAA细胞系的相互作用在下述剂量应答研究中加以证实。需要GABA存在的调节剂、部分激动剂和低效力化合物不包括在列表中。
筛选测定法鉴定LOPAC文库中的每种GABAA激动剂：GABA(内源配体)、丙泊酚、异去甲槟榔次碱盐酸盐、蝇蕈醇氢溴化物、哌啶-4-磺酸、3-α，21-二羟基-5-α-孕烷-20-酮(神经类固醇)、5-α-孕烷-3α-醇-11，20-二酮(神经类固醇)、5-α-孕烷-3α-醇-20-酮(神经类固醇)和曲卡唑酯。结果指出所产生的GABAA细胞系以生理学相关方式响应(例如，它们响应内源受体的激动剂)。测定关于这8种激动剂的EC50值，并且包括在表GABA1(下文)中。
筛选测定法还鉴定了在LOPAC文库中未描述为GABA激动剂但已知具有与GABAA相关的其他活性的4种化合物，注意到它们是：依他唑酯(磷酸二酯酶抑制剂)、雄酮(类固醇激素)、氯美扎酮(肌肉松弛药)和伊维菌素(已知影响氯通道的抗寄生虫药)。测定关于这4种化合物的EC50值，并且概括于表GABA1(下文)中。
筛选测定法进一步鉴定了在LOPAC文库中迄今为止未知与GABAA相互作用的4种化合物。这些新型化合物包括：双嘧达莫(dipyridamole)(腺苷脱氨酶抑制剂)、氯硝柳胺(抗寄生虫药)、tyrphosin A9(PDGFR抑制剂)和I-Ome-Tyrphosin AG 538(IGF RTK抑制剂)。测定关于这4种化合物的EC50值，并且概括于表GABA1(下文)中。
筛选测定法的结果概括于表GABA1中：
Figure BPA00001214243700601
实施例5  使用电生理学测定法就天然GABAA功能表征GABAA-CHO细胞
使用下述电位钳法方案：将膜电位夹紧至-60mV的保持电位。通过增加浓度的GABA(0.10-100μM)的2秒应用激发电流，伴随用缓冲液的中间洗涤。
关于α2、α3和α5GABAA细胞系响应100uM GABA，以及α1GABAA细胞系响应增加浓度的GABA(以对数增量的0.10-100μM)的全细胞感受器电流跟踪，证实除上文描述的高通量筛选测定法外，GABAA细胞系还可以用于常规电生理学测定法中。这些电生理学测定法结果连同实施例2的膜电位测定法，证实本文产生的GABAA细胞系的生理学和药理学相关性。电生理学被公认为检测GABAA受体的调节剂的可靠方法。我们的数据指出使用膜电位测定法，本发明的细胞系可以产生相似的可靠结果。现有技术的细胞系不够可靠或不够灵敏，以有效利用比电生理学更便宜且快速的这种膜电位测定法。因此，本发明的细胞系允许在比使用电生理学可获得的大得多的规模上的筛选(与使用电生理学小于100次/天相比较，使用膜电位测定法10,000次测定/天)。
实施例6  使用卤化物敏感的meYFP就天然GABAA功能的细胞内读数测定法的表征
使用用于细胞内读数测定法的下述方案，评估本发明表达GABAA(α1β3γ2s(A1)、α2β3γ2s(A2)、α3β3γ2s(A3)和α5β3γ2s(A5)的亚单位组合)的CHO细胞系对测试化合物的应答。
在测定前24小时，细胞在生长培养基(Ham’s F-12培养基加上FBS和谷氨酰胺)中在384孔平板中以10-25,000细胞/孔铺平板。去除培养基，随后为添加装载缓冲液(135mM NaCl、5mM KCl、2mMCaCl2、1mM MgCl2、10mM HEPES、10mM葡萄糖)，并且温育1小时。随后将测定法平板装载到FDSS(Hamamatsu Corporation)上。使测试化合物(例如，GABA配体)在测定法缓冲液(150mM NaI、5mMKCl、1.25mM CaCl2、1mM MgCl2、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释至所需浓度(需要时，产生每种测试化合物的连续稀释，所用有效浓度：3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1uM、3uM、10uM)，并且加入每个孔中。读取平板90秒。
响应增加浓度的GABA配体，GABAA-meYFP-CHO细胞显示增加的meYFP信号猝灭。这种猝灭可以用于计算关于GABA激活的剂量应答曲线。通过细胞内读数测定法产生的GABA剂量应答曲线类似于通过实施例3中描述的膜电位蓝色测定法产生的曲线。这些数据证实本发明的细胞可以在细胞内读数测定法中用于测定GABAA的调节剂。
实施例8  产生稳定的表达GC-C的细胞系
使用标准技术用编码人GC-C基因(SEQ ID NO：GCC 3)的质粒转染293T细胞。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINETM、LIPOFECTAMINETM 2000、OLIGOFECTAMINETM、TFXTM试剂、
Figure BPA00001214243700631
6、DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURINTM。)
尽管药物选择在本发明的方法中是任选的，在编码人GC-C基因的质粒中包括一种药物抗性标记。GC-C序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码标签的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的标签序列是GC-C靶序列1(SEQ ID NO：GCC 1)。在这个实施例中，包含GC-C基因的载体包含GC-C靶序列1。
使经转染的细胞在DMEM-FBS中生长2天，随后为在包含500μg/ml潮霉素的DMEM-FBS中10天，随后对于其余时间在DMEM-FBS中，在加入信号传导探针前，在DMEM/10％FBS中总共4-5周(依赖于何种独立分离)。
在抗生素上富集后，细胞在不存在抗生素选择的情况下传代8-10次，以允许经过所选择的时间段不稳定的表达以减退的时间。
收获细胞并且用GC-C信号传导探针1(SEQ ID NO：GCC 2)转染，使用标准技术。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINETM、LIPOFECTAMINETM 2000、OLIGOFECTAMINETM、TFXTM试剂、
Figure BPA00001214243700632
6、DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURINTM。)随后使细胞解离且收集用于分析，并且使用荧光激活细胞分选器进行分选。
通过GC-C信号传导探针1检测的GC-C靶序列1
5’-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3’(SEQ ID NO：GCC 1)
GC-C信号传导探针1
(作为100μM原液供应)
5’-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ2-3’(SEQ ID NO：GCC 2)
此外，在特定实验中使用具有与Cy5相似的谱性质的
Figure BPA00001214243700641
Dye(BioSearch)的相似探针。在某些实验中，使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。
使细胞解离且收集用于分析和使用荧光激活细胞分选器进行分选。标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离到有条形码的96孔平板内。在小区FAM与Cy5相比较：0.3％活细胞中使用下述门控层次：
符合门→单峰门→活门→分选门。
重复上述步骤以获得更大数目的细胞。执行所有上述步骤的2个轮次。此外，对于独立转染轮次之一，细胞传代、暴露于信号传导探针和通过荧光激活细胞分选器分离阳性细胞的步骤顺序执行总共2次。
将平板转移至MICROLAB STARTM(Hamilton Robotics)。使细胞在新鲜完全生长培养基和2天条件生长培养基的100μl 1∶1混合物中温育9天，其中补充有100U青霉素和0.1mg/ml链霉素，通过胰蛋白酶消化分散2次，以使凝块降到最低，并且转移至新96孔平板。使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依靠报告的超过70％的汇合。在连续3天时获得汇合测量，并且用于计算生长速率。
根据在分散步骤后3天的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期群组铺平板)。4个生长框每一个分离到各自96孔平板内；某些生长框产生超过一块96孔平板。通过考虑生长速率的扩展且将覆盖细胞群体总数目的高百分比的范围归为同类来计算框。计算框以捕获生长速率中的12小时差异。
细胞可以具有小于1天到超过2周的倍增时间。为了加工同时可以根据生长速率合理框并的最分散的克隆，优选使用具有0.25-0.7天倍增时间/框的3-9个框。本领域技术人员应当理解，对于具体情况可以调整框的紧密度和框的数目，并且如果细胞就其细胞周期进行同步，那么可以进一步调整框的紧密度和数目。
使平板在标准和固定条件(DMEM/FBS、37℃、5％CO2)不含抗生素下温育。使细胞的平板分开，以产生5组96孔平板(3组用于冷冻，1组用于测定和1组用于传代)。对于平板组各自在工作流下游使用不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质：加入制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除孔之间的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。
使1组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许组中的平板达到70-100％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和10％DMSO。平板用Parafilm分别密封，通过1-5cm泡沫材料围绕，并且放置到冷藏库中。
其余2组平板在如上所述的标准和固定条件下维持。所有细胞分开使用自动化液体处理步骤来执行，包括培养基去除、细胞洗涤、胰蛋白酶添加和温育、猝灭和细胞分散步骤。
控制用于所有细胞群体的细胞和培养条件的一致性和标准化。通过跨越平板的细胞数目的标准化，控制由于生长速率中的轻微差异产生的跨越平板的差异，并且在重新排列后3次传代发生。检测并消除其为异常值的细胞群体。
使细胞维持3-6周，以允许其在这些条件下的体外进化。在这个时间过程中，观察大小、形态、朝向微汇合的趋势、脆性、对胰蛋白酶消化的应答和胰蛋白酶消化后的平均圆形度、或细胞维持的其他方面例如与培养平板表面的附着和对流体添加后的喷出的抵抗力。
使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书：(http://www.assaydesigns.com/objects/catalog//product/extras/900-014.pdf)使用Direct Cyclic GMP Enzyme Immunoassay Kit(目录900-014；AssayDesigns，Inc.)。细胞在96或384孔平板中以4种不同密度进行测试并且分析应答。下述条件用于本发明的表达GC-C的细胞系：
·克隆筛选：在测定前48小时汇合的96孔平板的1∶2和1∶3拆分，30分钟鸟苷蛋白处理。
·剂量应答研究：20,000、40,000、60,000、80,000、120,000和160,000/孔的密度，30分钟鸟苷蛋白处理(参见实施例9)。
·Z’研究：160,000和200,000/孔的密度，30分钟鸟苷蛋白处理(参见实施例10)。
使来自在低和较高传代数下执行的实验的功能应答相比较，以鉴定经过4-10周的限定时间段具有最一致应答的细胞。还注意随着时间的过去改变的其他细胞特征。
符合功能和其他标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些。所选择的细胞群体在更大的组织培养器皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤，例如不同的细胞密度；铺平板的时间、细胞培养传代的长度；细胞培养皿形式和包被；流体学最佳化，包括速度和剪力；传代时间；和洗涤步骤，用于一致和可靠传代。此外，测定在每次传代时的细胞活力。增加人工干预，并且更紧密地观察且监控细胞。这个信息用于帮助鉴定并选择保留所需性质的最终细胞系。选择这样的最终细胞系和备份细胞系(总共20个克隆)，当根据这个过程且在这些条件下产生时，其显示合适附着/粘稠度和生长速率和甚至铺平板(缺乏微汇合)。
通过经由24孔、6孔和10cm皿在DMEM/10％FBS/HEPES/L-Glu中扩增来自重新排列的96孔平板的非冷冻群体，产生所选择的20个克隆各自3个小瓶的起始冷冻原种。与最终细胞系和备份细胞系相对应的低传代冷冻原种在37℃下解冻，用包含FBS的DMEM洗涤2次，并且以相同方式温育。细胞随后扩增2-4周的时间段。选择2个最终克隆。
使来自起始冷冻的一个克隆的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增。测试所得到的细胞，以证实它们符合它们最初就其进行选择的相同特征。可以建立由20至超过100个小瓶组成的关于每个细胞系的细胞库。
还可以执行下述步骤以证实细胞系是活的、稳定的和有功能的：使来自细胞库的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增；测试所得到的细胞，以测定它们是否符合它们最初就其进行选择的相同特征。
实施例9  细胞系就GC-C天然功能的表征
用于检测cGMP的竞争性ELISA用于表征在所产生的表达GC-C的细胞系中的天然GC-C功能。表达GC-C的细胞维持在标准细胞培养条件下在达尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)中并且在T175cm烧瓶中生长，所述DMEM补充有10％胎牛血清、谷氨酰胺和HEPES。对于ELISA，将细胞铺平板到经包被的96孔平板(聚D-赖氨酸)内。
细胞处理和细胞裂解方案
细胞用无血清培养基洗涤2次，并且与1mM IBMX温育30分钟。随后将所需激活剂(即，鸟苷蛋白，0.001-40μM)加入细胞中，并且温育30-40分钟。去除上清液，并且用TBS缓冲液洗涤细胞。用0.1NHCl裂解细胞。这随后为用0.1N HCl的裂解和在-20℃/室温下的冻/融循环。使化冻的裂解物(使样品在Eppendorf管中在10,000rpm下旋转)离心，以使细胞碎片形成团块。随后将澄清的上清裂解物转移至ELISA平板。
ELISA方案
除非另有说明，否则所有下述步骤都在室温下执行。ELISA平板在包被缓冲液(Na-碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，0.1M最终，pH 9.6)中用抗IgG抗体在4℃下包被过夜。随后用洗涤缓冲液(TBS-Tween 20，0.05％)洗涤平板，随后为阻断试剂添加。在37℃下与阻断试剂温育1小时，随后为用洗涤缓冲液洗涤平板。随后加入兔抗cGMP多克隆抗体(Chemicon)，随后为1小时温育和用洗涤缓冲液的后续洗涤。随后加入细胞裂解物，并且在cGMP-生物素缀合物(1和10nM 8-生物素-AET-cGMP(Biolog))的后续添加前温育1小时。使平板温育2小时，并且随后用洗涤缓冲液洗涤。随后加入链霉亲和素-碱性磷酸盐并且温育1小时，随后用洗涤缓冲液洗涤。使平板与PNPP底物(Sigma)温育至少1小时(优选2-5小时)。随后在SAFIRE2TM平板读取器(Tecan)上读取在405nm处的吸光度。
当在ELISA中不使用细胞裂解物时(对照)，可见最大吸光度。用来自用100nM鸟苷蛋白处理的所产生的表达GC-C的细胞系的细胞裂解物观察到吸光度中的减少(相应于增加的cGMP水平)(克隆)。
使用Direct Cyclic GMP Enzyme Immunoassay Kit(目录900-014；AssayDesigns，Inc.)，还使在用100nM鸟苷蛋白处理的所产生的表达GC-C的细胞系中的cGMP水平与不表达GC-C的亲本细胞系对照样品的那种(未显示)相比较。与用鸟苷蛋白处理和未处理的亲本细胞相比较，表达GC-C的细胞系显示吸光度中更大的减少(相应于增加的cGMP水平)。
对于鸟苷蛋白剂量应答实验，在96孔平板中以20,000、40,000、60,000、80,000、120,000和160,000细胞/孔的密度铺平板的、所产生的表达GC-C的细胞系的细胞，用增加浓度的鸟苷蛋白攻击30分钟。使用SAFIRE2TM平板读取器(Tecan)，检测作为cGMP水平中改变的函数的细胞应答(即，吸光度)(如使用Direct Cyclic GMP EnzymeImmunoassay Kit(目录900-014；AssayDesigns，Inc.)测量的。随后作为鸟苷蛋白浓度的函数绘制数据，并且使用非线性回归分析使用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，产生1.1nM的EC50值。与在其他细胞系中先前报告的相比较(3.5pmol/ml)(Forte等人，Endocr.140(4)：1800-1806(1999))，当用低浓度的鸟苷蛋白处理时，所产生的表达GC-C的细胞系显示更高水平的cGMP(6pmol/ml)，指示克隆的效力。
实施例10表达GC-C的细胞系Z′值的产生
使用直接竞争性ELISA测定法计算关于所产生的表达GC-C的细胞系的Z′。使用Direct Cyclic GMP Enzyme Immunoassay Kit(目录900-014；AssayDesigns，Inc.)执行ELISA。具体地，对于Z′测定法，在96孔测定平板中的24个阳性对照孔(以160,000或200,000细胞/孔的密度铺平板)用40μM鸟苷蛋白和IBMX在DMEM培养基中的GC-C激活混合物(cocktail)攻击30分钟。考虑96孔测定平板的体积和表面积，鸟苷蛋白的这个量产生与由Forte等人(1999)Endocr.140(4)，1800-1806使用的10μM可比较的浓度。包含在DMEM/IMBX中的克隆细胞的相等数目的孔用单独的媒介物(在不存在激活剂的情况下)进行攻击。使用SAFIRE2TM平板读取器(Tecan)监控在2种条件中的吸光度(相应于cGMP水平)。计算在2种条件中的平均值和标准差，并且使用Zhang等人，J Biomol Screen，4(2)：67-73(1999))的方法计算Z′。所产生的表达GC-C的细胞系的Z′值测定为0.72。
实施例11短路电流测量
在培养嵌入物(inserts)(Snapwell，Corning Life Sciences)上铺平板表达GC-C的细胞系(原代或永生化上皮细胞，例如肺、肠、乳房、子宫或肾)后7-14天，执行尤斯室(Ussing chamber)实验。在培养嵌入物上的细胞进行冲洗，固定在尤斯型器械(EasyMountChamber System，Physiologic Instruments)上，并且用维持在37℃下的连续充气林格溶液(在O2中的5％CO2，pH 7.4)浸浴，所述林格溶液包含(以mM)120NaCl、25NaHCO3、3.3KH2PO4、0.8K2HPO4、1.2CaCl2、1.2MgCl2和10葡萄糖。使半室(hemichambers)与多通道电位和电流钳(VCC-MC8，Physiologic Instruments)连接。使用电极[琼脂桥接的(在1M KCl中的4％)Ag-AgCl]，并且使嵌入物电压夹紧至0mV。对于实验的持续时间，每10秒测量经上皮电流、电压和电阻。弃去具有＜200mOhms电阻的膜。这个次级测定法可以提供在合适细胞类型(即，形成紧密连接的细胞)中，所引入的GC-C改变CFTR活性并且调节经上皮电流的证实。
实施例12产生稳定的表达CFTR的细胞系
产生表达构建体
基于pCMV-SCRIPT(Stratagene)产生允许流水线克隆的质粒表达载体，并且包含关于目的基因转录和翻译的多种所需组分，包括：CMV和SV40真核启动子；SV40和HSV-TK多腺苷酸化序列；多克隆位点；Kozak序列和药物抗性盒。
产生细胞系
步骤1：转染
使用标准技术用编码人CFTR(SEQ ID NO：CFTR1)的质粒转染CHO细胞。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINETM、LIPOFECTAMINETM 2000、OLIGOFECTAMINETM、TFXTM试剂、
Figure BPA00001214243700701
6、DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURINTM。)
尽管药物选择对于产生本发明的细胞或细胞系是任选的，在质粒中包括一种药物抗性标记(即，嘌呤霉素)。CFTR序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码CFTR靶序列的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的靶序列是CFTR靶序列1(SEQ ID NO：CFTR2)，并且在这个实施例中，包含CFTR基因的载体包含CFTR靶序列1(SEQ ID NO：CFTR2)。
步骤2：选择
经转染的细胞在不含抗生素的Ham’s F12-FBS培养基中生长2天，随后为在含12.5μg/ml嘌呤霉素的Ham’s F12-FBS中10天。随后在加入信号传导探针前，对于其余时间，将细胞转移至不含抗生素的Ham’s F12-FBS培养基。
步骤3：细胞传代
在抗生素上富集后，细胞在不存在抗生素选择的情况下传代5-14次，以允许经过所选择的时间段不稳定的表达以减退的时间。
步骤4：细胞暴露于荧光探针
收获细胞并且用CFTR信号传导探针1(SEQ ID NO：CFTR3)进行转染，使用标准技术。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINETM、LIPOFECTAMINETM2000、OLIGOFE CTAMINETM、TFXTM试剂、
Figure BPA00001214243700711
6、DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURINTM。)CFTR信号传导探针1(SEQ ID NO：CFTR3)结合CFTR靶序列1(SEQ ID NO：CFTR2)。随后收集细胞用于分析和使用荧光激活细胞分选器分选。
通过信号传导探针检测靶序列
CFTR靶序列1
5’-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3’(SEQ ID NO：CFTR2)
信号传导探针
作为100μM原液供应
CFTR信号传导探针1
5’-Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ2-3’(SEQ ID NO：CFTR3)
此外，在特定实验中使用具有与Cy5相似的谱性质的
Figure BPA00001214243700712
Dye(BioSearch)的相似探针。在某些实验中，使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。非靶向的FAM标记的探针也用作装载对照。
步骤5：阳性细胞的分离
使细胞解离且收集用于分析和使用荧光激活细胞分选器分选。标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入门内的单个细胞分离到有条形码的96孔平板内。在小区FAM与Cy5相比较：0.1-0.4％活细胞中使用下述门控层次：
符合门→单峰门→活门→分选门。
步骤6：步骤1-5和/或3-5的另外循环
重复步骤1-5和/或3-5以获得更大数目的细胞。执行步骤1-5的2个轮次，并且对于这些轮次中的每一个，执行步骤3-5的2个内部循环。
步骤7：关于细胞群体的生长速率的估计
将平板转移至Microlab Star(Hamilton Robotics)。使细胞在新鲜完全生长培养基和2-3天条件生长培养基的100μl 1∶1混合物中温育9天，其中补充有100单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。随后通过胰蛋白酶消化1或2次分散细胞，以使凝块降到最低，并且随后转移至新96孔平板。使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依靠报告的超过70％的汇合。获得在分散后1-10天之间连续天数时的汇合测量，并且用于计算生长速率。
步骤8：根据生长速率估计框并细胞群体
根据在步骤7中的分散步骤后小于2周的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期群组铺平板)。3个生长框每一个分离到各自96孔平板内；某些生长框产生超过一块96孔平板。通过考虑生长速率的扩展且将细胞群体总数目的高百分比归为同类来计算框。计算框以捕获生长速率中的12-16小时差异。
细胞可以具有小于1天到超过2周的倍增时间。为了加工同时可以根据生长速率合理框并的最分散的克隆，优选使用具有0.25-0.7天倍增时间/框的3-9个框。本领域技术人员应当理解，对于具体情况可以调整框的紧密度和框的数目，并且如果细胞就其细胞周期进行同步，那么可以进一步调整框的紧密度和数目。
步骤9：重复铺平板以加快平行加工且提供严格质量控制
使平板在标准和固定条件(即，Ham’s F12-FBS培养基、37℃/5％CO2)不含抗生素下温育。使细胞的平板分开，以产生4组96孔平板(3组用于冷冻，1组用于测定和传代)。对于平板组各自使用不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质：加入制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除孔之间的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。
步骤10：冷冻细胞群体的早期传代原种
使3组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许组中的平板达到70-100％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和10％DMSO。平板用Parafilm分别密封，通过1-5cm泡沫材料个别围绕，并且随后放置到-80℃冷藏库中。
步骤11：用于产生活的、稳定的和有功能的(VSF)细胞系的起始转化步骤的方法和条件
其余平板组如步骤9中所述进行维持。所有细胞分开使用自动化液体处理步骤来执行，包括培养基去除、细胞洗涤、胰蛋白酶添加和温育、猝灭和细胞分散步骤。
步骤12：校正生长速率的任何其余变异性的标准化方法
控制用于所有细胞群体的细胞和培养条件的一致性和标准化。通过跨越平板的细胞数目的标准化，控制由于生长速率中的轻微差异产生的跨越平板的差异，并且在重新排列每8次传代后发生。检测且消除其为异常值的细胞群体。
步骤13：细胞群体的表征
在重新排列后使细胞在培养中维持6-10周，以允许其在这些条件下的体外进化。在这个时间过程中，观察大小、形态、朝向微汇合的趋势、脆性、对胰蛋白酶消化的应答和胰蛋白酶消化后的平均圆形度、或细胞维持的其他方面例如与培养平板表面的附着和对流体添加后的喷出的抵抗力。
步骤14：细胞群体在VSF条件下的潜在功能性的评估
使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书使用膜电位染料试剂盒(Molecular Devices，MDS)。
细胞在384孔平板中以各种密度(即，12.5x103至20x103细胞/孔)进行测试并且分析应答。测试在细胞铺平板和测定法读数之间的时间。还测试染料浓度。计算剂量应答曲线和Z′得分作为潜在功能性评估的部分。
还可以执行下述步骤(即，步骤15-18)以选择最终和备份活的、稳定的和有功能的细胞系。
步骤15：
使来自在低和较高传代数下执行的实验的功能应答相比较，以鉴定经过限定时间段(例如，3-9周)具有最一致应答的细胞。还注意随着时间的过去改变的其他细胞特征。
步骤16：
符合功能和其他标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些。所选择的细胞群体在更大的组织培养器皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤，例如不同的细胞密度；铺平板的时间、细胞培养传代的长度；细胞培养皿形式和包被；流体学最佳化，包括速度和剪力；传代时间；和洗涤步骤，用于一致和可靠传代。
此外，测定在每次传代时的细胞活力。增加人工干预，并且更紧密地观察且监控细胞。这个信息用于帮助鉴定并选择保留所需性质的最终细胞系。选择这样的最终细胞系和备份细胞系，当根据这个过程且在这些条件下产生时，其显示合适附着/粘稠度、生长速率和甚至铺平板(缺乏微汇合)。
步骤17：细胞库的建立
与最终细胞系和备份细胞系相对应的低传代冷冻原种在37℃下解冻，用Ham’s F12-FBS洗涤2次，并且随后在Ham′s F12-FBS中温育。细胞随后扩增2-4周的时间段。建立关于每个最终和备份细胞系的克隆的细胞库，对于低温保存的每个克隆细胞具有25个小瓶。
步骤18：
使来自细胞库的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增。测试所得到的细胞，以确定它们符合它们最初就其进行选择的相同特征。
实施例13就天然CFTR功能表征稳定的细胞系
使用高通量相容的荧光膜电位测定法，以表征在所产生的稳定的表达CFTR的细胞中的天然CFTR功能。
稳定表达CFTR的CHO细胞系维持在标准细胞培养条件下在Ham’s F12培养基中，所述Ham’s F12培养基补充有10％胎牛血清和谷氨酰胺。在测定前1天，从原种平板中收获细胞并且铺平板到黑色透明底部的384孔测定平板内。使测定平板维持在37℃细胞培养温箱中在5％CO2下22-24小时。随后从测定平板中去除培养基，并且加入在装载缓冲液(137mM NaCl、5mM KCl、1.25mM CaCl2、25mMHEPES、10mM葡萄糖)中稀释的蓝色膜电位染料(Molecular DevicesInc.)，并且允许在37℃下温育1小时。随后将测定平板装载到荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)上，并且加入在化合物缓冲液(137mM葡萄糖酸钠、5mM葡萄糖酸钾、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释的毛喉素和IBMX的混合物。
来自荧光膜电位测定法的代表性数据显示在稳定的表达CFTR的CHO细胞系(细胞系1、M11、J5、E15和O15)中可归于功能CFTR的离子流全部高于缺乏CFTR的对照细胞，如由测定法应答指出的。
在稳定的表达CFTR的CHO细胞系(细胞系1、M11、J5、E15和O15)中可归于功能CFTR的离子流也全部高于瞬时CFTR转染的CHO细胞。通过将CHO细胞以5-16,000,000/10cm组织培养皿铺平板且在转染前使其温育18-20小时，产生瞬时CFTR转染的CHO细胞。将由脂质转染试剂和编码CFTR的质粒组成的转染复合物直接加入每个皿中。随后使细胞在37℃下在CO2温箱中温育6-12小时。在温育后，将细胞提取，铺平板到黑色透明底部的384孔测定平板内，并且使用上述荧光膜电位测定法就功能进行测定。
对于毛喉素剂量应答实验，在384孔平板中以15,000细胞/孔的密度铺平板的，所产生的稳定的表达CFTR的细胞系，用增加浓度的毛喉素(已知的CFTR激动剂)进行攻击。通过荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)，随着时间的过去监控作为细胞荧光中改变的函数的细胞应答。随后作为毛喉素浓度的函数绘制数据，并且使用非线性回归分析使用GraphPad Prism 5.0软件分析，产生256nM的EC50值。所产生的表达CFTR的细胞系显示在其他细胞系中先前报告的毛喉素EC50范围内(250-500nM)(Galietta等人，Am J PhysiolCell Physiol.281(5)：C1734-1742(2001))的毛喉素的EC50值，指示克隆的效力。
实施例14关于CFTR基于细胞的测定法的Z′值的测定
使用高通量相容的荧光膜电位测定法计算关于所产生的稳定的表达CFTR的细胞系的Z′值。荧光膜电位测定法方案基本上根据实施例13中的方案来执行。具体地，对于Z′测定法，在384孔测定平板中的24个阳性对照孔(以15,000细胞/孔的密度铺平板)用毛喉素和IBMX的CFTR激活混合物进行攻击。相等数目的孔用单独且包含DMSO的媒介物(在不存在激活剂的情况下)进行攻击。使用荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)监控在2种条件中的细胞应答。计算在2种条件中的平均值和标准差，并且使用Zhang等人，J Biomol Screen，4(2)：67-73(1999)中公开的方法计算Z′。所产生的稳定的表达CFTR的细胞系的Z′值测定为高于或等于0.82。
实施例15CFTR调节剂的高通量筛选和鉴定
高通量相容的荧光膜电位测定法用于筛选且鉴定CFTR调节剂。在测定前1天，从原种平板中收获细胞到不含抗生素的生长培养基内，并且铺平板到黑色透明底部的384孔测定平板内。使测定平板维持在37℃细胞培养温箱中在5％CO2下19-24小时。随后从测定平板中去除培养基，并且加入在装载缓冲液(137mM NaCl、5mM KCl、1.25mMCaCl2、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释的蓝色膜电位染料(Molecular Devices Inc.)，并且允许在37℃下温育1小时。使测试化合物溶解于二甲亚砜中，在测定缓冲液(137mM葡萄糖酸钠、5mM葡萄糖酸钾、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释，随后装载到384孔聚丙烯微量滴定板内。将细胞和化合物平板装载到荧光平板读取器(Hamamatsu FDSS)上，并且运行3分钟以鉴定测试化合物活性。仪器随后将以300nM-1μM浓度的毛喉素溶液加入细胞中，以允许观察先前加入的化合物的调节剂或阻断剂活性。通过测量在测试化合物加入细胞后和/或在后续激动剂加入后产生的荧光中的改变，测定化合物的活性。
实施例16使用短路电流测量就天然CFTR功能表征稳定的表达CFTR的细胞系
在培养嵌入物(Snapwell，Corning Life Sciences)上铺平板表达CFTR的细胞系(原代或永生化上皮细胞，包括但不限于肺和肠)后7-14天，执行尤斯室实验。在培养嵌入物上的细胞进行冲洗，固定在尤斯型器械(EasyMount Chamber System，Physiologic Instruments)上，并且用维持在37℃下的连续充气林格溶液(在O2中的5％CO2，pH 7.4)浸浴，所述林格溶液包含120mM NaCl、25mM NaHCO3、3.3mM KH2PO4、0.8mM K2HPO4、1.2mM CaCl2、1.2mM MgCl2和10mM葡萄糖。使半室与多通道电位和电流钳(VCC-MC8，Physiologic Instruments)连接。使用电极[琼脂桥接的(在1M KCl中的4％)Ag-AgCl]，并且使嵌入物电压夹紧至0mV。对于实验的持续时间，每10秒测量经上皮电流、电压和电阻。弃去具有＜200mΩs电阻的膜。
实施例17使用电生理学测定法就天然CFTR功能表征稳定的表达CFTR的细胞系
虽然人工和自动化电生理学测定法都已得到开发，并且两者都可以应用于测定这种系统，但下文描述的是关于人工膜片钳实验的方案。
细胞以低密度进行种植，并且在铺平板后2-4天使用。硼硅玻璃移液管进行火抛光以获得2-4megaΩ的尖端电阻。对电流取样且滤过低通路。细胞外(浸浴)溶液包含：150mM NaCl、1mM CaCl2、1mMMgCl2、10mM葡萄糖、10mM甘露醇和10mM TES，pH 7.4。移液管溶液包含：120mM CsCl、1mM MgCl2、10mM TEA-Cl、0.5mMEGTA、1mM Mg-ATP和10mM HEPES(pH7.3)。通过使膜电位在-80mV和-100mV之间交替来监控膜电导。通过应用以20-mV步幅在-100mV和+100mV之间的电压脉冲产生电流-电压关系。
实施例18产生稳定的表达NaV 1.7异源三聚体的细胞系
产生表达构建体
基于pCMV-SCRIPT(Stratagene)产生允许流水线克隆的质粒表达载体，并且该质粒表达载体包含关于目的基因转录和翻译的各种所需组分，包括CMV和SV40真核启动子；SV40和HSV-TK多腺苷酸化序列；多克隆位点；Kozak序列和新霉素/卡那霉素抗性盒(或氨苄青霉素、潮霉素、嘌呤霉素、Zeocin抗性盒)。
细胞系的产生
步骤1：转染
293T细胞用3种单独质粒进行共转染，一种质粒编码人NaV 1.7α亚单位(SEQ ID NO：NAV-1)、一种质粒编码人NaV 1.7β1亚单位(SEQ ID NO：NAV-2)，并且一种质粒编码人NaV 1.7β2亚单位(SEQ ID NO：NAV-3)，使用标准技术。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINETM、LIPOFECTAMINETM 2000、OLIGOFECTAMINETM、TFXTM试剂、
Figure BPA00001214243700791
6、DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURINTM。)
尽管药物选择对于产生本发明的细胞或细胞系是任选的，还是包括一种药物抗性标记/质粒。序列在CMV启动子的控制下。用于通过信号传导探针检测的编码NaV靶序列的非翻译序列也连同编码药物抗性标记的序列一起存在。所利用的NaV靶序列是NaV靶序列1(SEQID NO：NAV-4)、NaV靶序列2(SEQ ID NO：NAV-5)和NaV靶序列3(SEQ ID NO：NAV-6)。在这个例子中，包含NAV 1.7α亚单位基因的载体包含NaV靶序列1(SEQ ID NO：NAV-4)；包含NAV 1.7β1亚单位基因的载体包含NaV靶序列2(SEQ ID NO：NAV-5)；并且包含NaV 1.7β2亚单位基因的载体包含NaV靶序列3(SEQ ID NO：NAV-6)。
步骤2：选择
经转染的细胞在DMEM-FBS培养基中生长2天，随后为在含抗生素的DMEM-FBS培养基中10天。在含抗生素的时期过程中，抗生素如下加入培养基中：嘌呤霉素(0.1μg/ml)、潮霉素(100μg/ml)和zeocin(200μg/ml)。
步骤3：细胞传代
在抗生素上富集后，使细胞在不存在抗生素的情况下传代6-18次，以允许经过所选择的时间段不稳定的表达以减退的时间。
步骤4：细胞暴露于荧光探针
收获细胞并且用信号传导探针(SEQ ID NOS：NaV-7、NaV-8、NaV-9)进行转染，使用标准技术。(可以用于将核酸引入宿主细胞内的试剂的例子包括但不限于，LIPOFECTAMINETM、LIPOFECTAMINETM 2000、OLIGOFECTAMINETM、TFXTM试剂、
Figure BPA00001214243700801
6、DOTAP/DOPE、Metafectine或FECTURINTM。)
NaV信号传导探针1(SEQ ID NO：NAV-7)结合NaV靶序列1(SEQ ID NO：NAV-4)；NaV信号传导探针2(SEQ ID NO：NAV-8)结合NaV靶序列2(SEQ ID NO：NAV-5)；和NaV信号传导探针3(SEQ ID NO：NAV-9)结合NaV靶序列3(SEQ ID NO：NAV-6)。随后使细胞解离且收集用于分析，并且使用荧光激活细胞分选器分选。
通过信号传导探针检测的靶序列
下述标签序列用于NaV 1.7亚单位转基因。
NaV靶序列1
5’-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3’(SEQ ID NO：NAV-4)(NaV 1.7α亚单位)
NaV靶序列2
5’-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3’(SEQ ID NO：NAV-5)(NaV 1.7β1亚单位)
NaV靶序列3
5’-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3’(SEQ ID NO：NAV-6)(NaV 1.7β2亚单位)
信号传导探针
作为100μM原液供应
NaV信号传导探针1-这种探针结合靶序列1。
5’-Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ3猝灭-3’(SEQ ID NO：NAV-7)
NaV信号传导探针2-这种探针结合靶序列2。
5’-Cy5.5 CGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ3猝灭-3’(SEQ ID NO：NAV-8)
NaV信号传导探针3-这种探针结合靶序列3。
5’-Fam CGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGCBHQ1猝灭-3’(SEQ ID NO：NAV-9)
NaV信号传导探针1和2中的BHQ3可以由BHQ2或金颗粒置换。NaV信号传导探针3中的BHQ1可以由BHQ2、金颗粒或DABCYL置换。
此外，在特定实验中使用具有与Cy5相似的谱性质的
Figure BPA00001214243700811
Dye(BioSearch)的相似探针。在某些实验中，使用5-MedC和2-氨基dA mixmer探针而不是DNA探针。
步骤5：阳性细胞的分离
标准分析方法用于门控发荧光超过本底的细胞，并且将归入限定门内的细胞直接分离到96孔平板内。流式细胞术细胞分选这样进行操作，使得每个孔存放单个细胞。在选择后，细胞在缺乏药物的培养基中进行扩增。
在小区FAM与Cy5相比较：0.1-1.0％活细胞中使用下述门控层次：
符合门→单峰门→活门→分选门。
步骤6：步骤1-5和/或3-5的另外循环
重复步骤1-5和/或3-5以获得更大数目的细胞。执行步骤1-5的至少4个独立轮次，并且对于这些循环中的每一个，执行步骤3-5的至少2个内部循环用于每个独立轮次。
步骤7：关于细胞群体的生长速率的估计
将平板转移至Microlabstar自动化液体处理器(HamiltonRobotics)。使细胞在新鲜完全生长培养基(DMEM/10％FBS)和2-3天条件生长培养基的1∶1混合物中温育5-7天，其中补充有100单位/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素。随后通过胰蛋白酶消化分散细胞，以使凝块降到最低，并且转移至新96孔平板。在克隆分散后，使平板成像以测定孔的汇合(Genetix)。使每块平板聚焦用于跨越平板的可靠图像采集。不依靠报告的超过70％的汇合。在经过9天(在分散后第1和10天之间)每3次的天数时获得汇合测量，并且用于计算生长速率。
步骤8：根据生长速率估计框并细胞群体
根据在步骤7中的分散步骤后10-11天之间的生长速率，使细胞框并(独立地分组且作为同期群组铺平板)。独立地收集框并且铺平板在个别96孔平板上用于下游处理；某些生长框产生超过一块96孔平板。通过考虑生长速率的扩展且将细胞群体总数目的高百分比归为同类来计算框。依赖于步骤5中描述的分选反复操作，使用具有1-4天分隔的5-9个生长框。因此，每个框相应于在8-14.4小时之间的生长速率或群体倍增时间，依赖于反复操作。
细胞可以具有小于1天到超过2周的倍增时间。为了加工同时可以根据生长速率合理框并的最分散的克隆，优选使用具有0.25-0.7天倍增时间/框的3-9个框。本领域技术人员应当理解，对于具体情况可以调整框的紧密度和框的数目，并且如果细胞就其细胞周期进行同步，那么可以进一步调整框的紧密度和数目。
步骤9：重复铺平板以加快平行加工且提供严格质量控制
使平板在标准和固定条件(湿润的37℃、5％CO2)下在不含抗生素的DMEM-10％FBS培养基中温育。使细胞的平板分开，以产生4组靶平板。这4组平板包括具有所有生长框的所有平板，以确保存在起始组的4个重复。高达3块靶平板组提交用于低温保存(在步骤10中描述)，并且其余组按比例增加，并且进一步重复铺平板，用于传代和用于功能测定法实验。不同和独立的组织培养试剂、温箱、人员和二氧化碳来源用于下游重复平板。采取质量控制步骤以确保所有组织培养试剂的适当产生和品质：加入制备用于使用的每瓶培养基中的每种组分通过一个指定人员在一个指定通风橱中加入，其中通风橱中仅有那种试剂，同时第二个指定人员进行监督以避免错误。设定用于液体处理的条件以消除孔之间的交叉污染。新鲜尖端用于所有步骤，或使用严格的尖端洗涤方案。设定液体处理条件用于准确体积转移、有效细胞处理、洗涤循环、移液速度和定位、用于细胞分散的移液循环数目、和尖端与平板的相对位置。
步骤10：冷冻细胞群体的早期传代原种
使3组平板在-70至-80℃下冷冻。首先允许组中的平板达到70-80％的汇合。抽吸培养基并且加入90％FBS和5％-10％DMSO。平板用Parafilm密封，通过1-5cm泡沫材料个别围绕，并且随后放置到-80℃冷藏库中。
步骤11：用于产生活的、稳定的和有功能的(VSF)细胞系的起始转化步骤的方法和条件
其余平板组如步骤9中所述进行维持。所有细胞分开使用自动化液体处理步骤来执行，包括培养基去除、细胞洗涤、胰蛋白酶添加和温育、猝灭和细胞分散步骤。对于某些测定法铺平板步骤，用细胞解离缓冲液(例如，CDB，Invitrogen或CellStripper，CellGro)而不是胰蛋白酶使细胞解离。
步骤12：校正生长速率的任何其余变异性的标准化方法
控制用于所有细胞群体的细胞和培养条件的一致性和标准化。通过每2-8次传代跨越平板的细胞数目的定期标准化，控制由于生长速率中的轻微差异产生的跨越平板的差异。检测且消除其为异常值的细胞群体。
步骤13：细胞群体的表征
使细胞维持3-8周的细胞培养，以允许其在这些条件下的体外进化。在这个时间过程中，观察大小、形态、脆性、对胰蛋白酶消化或解离的应答、解离后的圆形/平均圆形度、活力百分比、朝向微汇合的趋势、或细胞维持的其他方面例如与培养平板表面的附着。
步骤14：细胞群体在VSF条件下的潜在功能性的评估
使用功能标准测试细胞群体。根据制造商的说明书使用膜电位测定试剂盒(Molecular Devices/MDS)。细胞在96或384孔平板中以多重不同密度进行测试并且分析应答。使用铺平板后的各个时间点，例如铺平板后12-48小时。还就测定应答差异测试不同的铺平板密度。
步骤15：
使来自在低和较高传代数下执行的实验的功能应答相比较，以鉴定经过3-9周的限定时间段具有最一致应答的细胞。还注意随着时间的过去改变的其他细胞特征。
步骤16：
符合功能和其他标准的细胞群体进行进一步评估，以确定最顺应以产生活的、稳定的和有功能的细胞系的那些。所选择的细胞群体在更大的组织培养器皿中进行扩增，并且在这些条件下继续或重复上文描述的表征步骤。在这点上，引入另外的标准化步骤，例如不同的铺平板细胞密度；传代时间；培养皿大小/形式和包被)；流体学最佳化；细胞解离最佳化(例如，类型；所用体积和时间长度)；以及洗涤步骤，用于一致和可靠传代。温度差异也用于标准化(例如30℃与37℃相比较)。
此外，测定在每次传代时的细胞活力。增加人工干预，并且更紧密地观察且监控细胞。这个信息用于帮助鉴定并选择保留所需性质的最终细胞系。选择显示一致生长、合适附着以及功能应答的最终细胞系和备份细胞系。
步骤17：细胞库的建立
与最终细胞系和备份细胞系相对应的上文描述的低传代冷冻平板在37℃下解冻，用DMEM-10％FBS洗涤2次，并且在湿润的37℃/5％CO2条件下温育。细胞随后扩增2-3周的时间段。建立关于每个最终和备份细胞系的细胞库，由15-20个小瓶组成。
步骤18：
还可以执行下述步骤以证实细胞系是活的、稳定的和有功能的。使来自细胞库的至少一个小瓶解冻，并且在培养中扩增。测试所得到的细胞，以测定它们是否符合它们最初就其进行选择的相同特征。
实施例19表征在稳定的表达NaV 1.7的细胞系中异源NaV 1.7 亚单位的相对表达
定量RT-PCR(qRT-PCR)用于测定在所产生的稳定的表达NaV1.7的细胞系中异源人NaV 1.7α、β1和β2亚单位的相对表达。使用RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen)纯化来自1-3x106哺乳动物细胞的总RNA。根据严格的DNA酶处理方案(TURBO DNA-freeKit，Ambion)完成DNA酶处理。使用逆转录试剂盒(SuperScript III，Invitrogen)，在具有1μg无DNA总RNA和250ng随机引物(Invitrogen)的20μL反应体积中执行第一链cDNA合成。不含逆转录酶的样品和不含RNA的样品用作阴性对照用于这个反应。合成在热循环仪(Mastercycler，Eppendorf)中在下述条件下完成：于25℃5分钟，于50℃60分钟；反应终止在70℃下执行15分钟。
对于基因表达的分析，用于qRT-PCR的引物和探针(MGBTaqMan探针，Applied Biosystems)设计为对靶序列(SEQ ID NOS：NaV-4、NaV-5、NaV-6)特异性退火。对于样品标准化，使用对照(甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH))Pre-Developed Assay试剂(TaqMaN，Applied Biosystems)。一式三份地设置包括阴性对照和阳性对照(质粒DNA)的反应，使用在50μL反应体积中的40ng cDNA。测定被表达的3个NaV 1.7亚单位各自的相对量。所有3个亚单位都在所产生的稳定的表达NaV 1.7的细胞系中成功表达。
实施例20  使用电生理学测定法就天然NaV功能表征稳定的表 达NaV 1.7的细胞系
自动化膜片钳系统用于记录来自所产生的稳定的表达NaV 1.7α、β1和β2亚单位的HEK293T细胞系的钠电流。下述举例说明性方案也可以用于QPatch、Sophion或Patchliner、Nanion系统。细胞外林格溶液包含140mM NaCl、4.7mM KCl、2.6mM MgCl2、11mM葡萄糖和5mM HEPES，pH 7.4在室温下。细胞内林格溶液包含120mMCsF、20mM Cs-EGTA、1mM CaCl2、1mM MgCl2和10mM HEPES，pH 7.2。实验在室温下进行。
稳定表达NaV 1.7α、β1和β2亚单位的细胞在如实施例18中所述的标准培养方案下生长。收获细胞且用连续搅拌保持悬浮高达4小时，在膜片的品质或能力方面无明显改变。使用标准膜片平板执行电生理学实验(全细胞)。膜片钳孔(芯片中微蚀刻的)直径约1μm，并且具有～2MΩ的电阻。使膜电位夹紧至-100mV的保持电位。
表征在HEK293T细胞中稳定表达的电压门控的人NaV 1.7钠通道的电流-电压关系和失活特征。测量响应从-80mV到+50mV的20ms去极化脉冲的钠电流，具有-100mV的保持电位。表征对于峰钠通道电流所得到的电流-电压(I-V)关系。激活阈值是-35mV(激活的中点，Va＝-24.9mV+/-3.7mV))，并且在-10mV下获得最大电流幅度。绘制关于钠通道的失活图。使膜电位保持在-100mV的保持电位，随后转变成从-110mV到的+10mV条件电位共1000ms，并且最后在至0mV的步幅后测量电流。所得到的电流幅度指示处于灭活状态的钠通道的部分。在比-85mV更负的电位下，通道占优势地处于关闭状态，而在超过-50mV的电位下，它们占优势地处于灭活状态。曲线代表Boltzmann拟合，根据其关于稳态失活的V1/2估计为-74mV。关于所产生的稳定的表达NaV 1.7的细胞系的电流-电压谱与先前报告的电流-电压谱(Va＝-28.0mV±1.1mV；V1/2＝-71.3mV±0.8mV)(Sheets等人，J Physiol.581(Pt 3)：1019-1031.(2007))一致。
实施例21  使用膜电位测定法就天然NaV功能表征稳定的表达 NaV 1.7的细胞系
所产生的稳定的表达NaV 1.7α、β1和β2亚单位的细胞维持在标准细胞培养条件下在达尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)中，所述DMEM补充有10％胎牛血清、谷氨酰胺和HEPES。在测定前1天，使用细胞解离缓冲液例如CDB(GIBCO)或细胞剥离器(Mediatech)从原种平板中收获细胞，并且以10,000-25,000细胞/孔铺平板到384孔测定平板中的生长培养基中。使测定平板维持在37℃细胞培养温箱中在5％CO2下22-24小时。随后从测定平板中去除培养基，并且加入在装载缓冲液(137mM NaCl、5mM KCl、1.25mMCaCl2、25mM HEPES、10mM葡萄糖)中稀释的蓝色荧光膜电位染料(Molecular Devices Inc.)。使细胞与蓝色膜电位染料在37℃下温育1小时。随后将测定平板装载到高通量荧光平板读取器(HamamastuFDSS)上。荧光平板读取器测量每秒获得一次的细胞平板的图像中的细胞荧光，并且将数据显示为相对荧光单位。
测量稳定的表达NaV 1.7的细胞和对照细胞(即HEK293T亲本细胞)对缓冲液和通道激活剂(即，藜芦定和蝎子毒(SV))添加的测定应答。在第一个添加步骤(即，添加1)中，仅加入缓冲液，不加入测试化合物。需要时，测试化合物可以在这个步骤中加入。在第二个添加步骤中，其为钠通道激活剂的藜芦定和蝎子毒在测定缓冲液中稀释至所需浓度(即，25μM藜芦定和5-25μg/ml蝎子毒)，并且加入384孔聚丙烯微量滴定板内。结合后，藜芦定和蝎子毒蛋白质通过机制的组合调节电压门控的钠通道的活性，包括激活和失活动力学的改变。在稳定的表达NaV 1.7的细胞中所得到的钠通道的激活改变细胞膜电位，并且荧光信号增加。上述功能测定法还可以用于表征测试化合物对于NaV 1.7离子通道的相对效力。
实施例22  表征NaV 1.7α亚单位通过β亚单位的调节
α亚单位基因表达通过β亚单位的调节
通过处理独立质粒DNA或α和对照质粒的摩尔比(例如α∶β1∶β2＝1∶1∶1)，改造HEK293T细胞的储库，以表达多种比例的α和β亚单位。在药物选择后，如实施例19中所述，用qRT-PCR评估6个不同细胞储库中的亚单位表达。比较qRT-PCR指出与仅转染α亚单位和对照质粒相比较，当所有3个人NaV 1.7亚单位(即α、β1和β2)共转染时，在药物选择的细胞检测中的α亚单位表达增加。β亚单位转录物的存在影响α亚单位基因表达，证实共表达所有3个NaV 1.7亚单位对于生理学相关功能测定法的重要性。
药理性质通过β亚单位的调节
基于细胞的膜电位测定法用于测量稳定共表达所有3个NaV 1.7亚单位(即，α、β1和β2)的细胞，和仅稳定表达NaV 1.7α亚单位的对照细胞，对测试化合物的应答。2种化合物(即，C18和K21)在根据实施例21中的方案同时执行的膜电位测定法中进行测试。特别地，对于这个实施例，测试化合物在第一个添加步骤中加入。
C18和K21增强克隆C44(表达NaV 1.7α、β1和β2亚单位)的应答，并且阻断克隆C60(仅表达NaV 1.7α亚单位)的应答。对于2个克隆中的每一个，2种测试化合物的测定应答针对单独的缓冲液的应答进行标准化。
表2哺乳动物G蛋白、其家族和描述
Figure BPA00001214243700901
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表3人孤儿GPCR包括其基因符号和NCBI基因ID号
Figure BPA00001214243700951
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表4人阿片类受体、其基因符号、NCBI基因ID号和相关同义词
Figure BPA00001214243700982
Figure BPA00001214243700991
表5人嗅觉感受器、其基因符号和通用名
Figure BPA00001214243700992
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表6犬嗅觉感受器、其基因名称
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表7蚊子嗅觉感受器、基因符号
Figure BPA00001214243701572
Figure BPA00001214243701581
表8其他异源多聚体受体、基因名称、NCBI基因ID号和相关同义词
Figure BPA00001214243701582
Figure BPA00001214243701591
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Figure BPA00001214243701841
表9来自多个物种的GABA亚单位。
Figure BPA00001214243701842
Figure BPA00001214243701851
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Figure BPA00001214243701881
Figure BPA00001214243701891
表10.人苦味受体
  编码   受体
  F1   hTAS2R1
  F5   hTAS2R3
  F25   hTAS2R4
  F11   hTAS2R5
  F4   hTAS2R7
  F2   hTAS2R8
  F24   hTAS2R9
  F16   hTAS2R10
  F3   hTAS2R13
  F15   hTAS2R14
  F14   hTAS2R16
  F7   hTAS2R38
  F23   hTAS2R39
  F19   hTAS2R40
  F18   hTAS2R41
  F6   hTAS2R43
  F12   hTAS2R44
  F8   hTAS2R45
  F9   hTAS2R46
  F22   hTAS2R47
  F17   hTAS2R48
  F21   hTAS2R49
  F10   hTAS2R50
  F13   hTAS2R55
  F20   hTAS2R60
在制备苦味受体细胞系中优选的G蛋白
 小鼠Gα15
 人GNA15
表11甜味和鲜味受体
Figure BPA00001214243701901
表12囊性纤维化跨膜传导调节剂
Figure BPA00001214243701902
表13.鸟苷酸环化酶
Figure BPA00001214243701903
序列表
人GABAA受体α1亚单位cDNA(SEQ ID NO：GABA1)
ATGAGGAAAAGTCCAGGTCTGTCTGACTGTCTTTGGGCCTGGATCCTCCTTC
TGAGCACACTGACTGGAAGAAGCTATGGACAGCCGTCATTACAAGATGAACT
TAAAGACAATACCACTGTCTTCACCAGGATTTTGGACAGACTCCTAGATGGT
TATGACAATCGCCTGAGACCAGGATTGGGAGAGCGTGTAACCGAAGTGAAG
ACTGATATCTTCGTCACCAGTTTCGGACCCGTTTCAGACCATGATATGGAAT
ATACAATAGATGTATTTTTCCGTCAAAGCTGGAAGGATGAAAGGTTAAAATT
TAAAGGACCTATGACAGTCCTCCGGTTAAATAACCTAATGGCAAGTAAAATC
TGGACTCCGGACACATTTTTCCACAATGGAAAGAAGTCAGTGGCCCACAACA
TGACCATGCCCAACAAACTCCTGCGGATCACAGAGGATGGCACCTTGCTGTA
CACCATGAGGCTGACAGTGAGAGCTGAATGTCCGATGCATTTGGAGGACTTC
CCTATGGATGCCCATGCTTGCCCACTAAAATTTGGAAGTTATGCTTATACAA
GAGCAGAAGTTGTTTATGAATGGACCAGAGAGCCAGCACGCTCAGTGGTTGT
AGCAGAAGATGGATCACGTCTAAACCAGTATGACCTTCTTGGACAAACAGTA
GACTCTGGAATTGTCCAGTCAAGTACAGGAGAATATGTTGTTATGACCACTC
ATTTCCACTTGAAGAGAAAGATTGGCTACTTTGTTATTCAAACATACCTGCCA
TGCATAATGACAGTGATTCTCTCACAAGTCTCCTTCTGGCTCAACAGAGAGT
CTGTACCAGCAAGAACTGTCTTTGGAGTAACAACTGTGCTCACCATGACAAC
ATTGAGCATCAGTGCCAGAAACTCCCTCCCTAAGGTGGCTTATGCAACAGCT
ATGGATTGGTTTATTGCCGTGTGCTATGCCTTTGTGTTCTCAGCTCTGATTGA
GTTTGCCACAGTAAACTATTTCACTAAGAGAGGTTATGCATGGGATGGCAAA
AGTGTGGTTCCAGAAAAGCCAAAGAAAGTAAAGGATCCTCTTATTAAGAAAA
ACAACACTTACGCTCCAACAGCAACCAGCTACACCCCTAATTTGGCCAGGGG
CGACCCGGGCTTAGCCACCATTGCTAAAAGTGCAACCATAGAACCTAAAGAG
GTCAAGCCCGAAACAAAACCACCAGAACCCAAGAAAACCTTTAACAGTGTCA
GCAAAATTGACCGACTGTCAAGAATAGCCTTCCCGCTGCTATTTGGAATCTT
TAACTTAGTCTACTGGGCTACGTATTTAAACAGAGAGCCTCAGCTAAAAGCC
CCCACACCACATCAATAG
人GABAA受体α2亚单位cDNA(SEQ ID NO：GABA2)
ATGAAGACAAAATTGAACATCTACAACATGCAGTTCCTGCTTTTTGTTTTCTT
GGTGTGGGACCCTGCCAGGTTGGTGCTGGCTAACATCCAAGAAGATGAGGC
TAAAAATAACATTACCATCTTTACGAGAATTCTTGACAGACTTCTGGATGGTT
ACGATAATCGGCTTAGACCAGGACTGGGAGACAGTATTACTGAAGTCTTCAC
TAACATCTACGTGACCAGTTTTGGCCCTGTCTCAGATACAGATATGGAATAT
ACAATTGATGTTTTCTTTCGACAAAAATGGAAAGATGAACGTTTAAAATTTAA
AGGTCCTATGAATATCCTTCGACTAAACAATTTAATGGCTAGCAAAATCTGG
ACTCCAGATACCTTTTTTCACAATGGGAAAAAATCAGTAGCTCATAATATGAC
AATGCCAAATAAGTTGCTTCGAATTCAGGATGATGGGACTCTGCTGTATACC
ATGAGGCTTACAGTTCAAGCTGAATGCCCAATGCACTTGGAGGATTTCCCAA
TGGATGCTCATTCATGTCCTCTGAAATTTGGCAGCTATGCATATACAACTTCA
GAGGTCACTTATATTTGGACTTACAATGCATCTGATTCAGTACAGGTTGCTCC
TGATGGCTCTAGGTTAAATCAATATGACCTGCTGGGCCAATCAATCGGAAAG
GAGACAATTAAATCCAGTACAGGTGAATATACTGTAATGACAGCTCATTTCC
ACCTGAAAAGAAAAATTGGGTATTTTGTGATTCAAACCTATCTGCCTTGCATC
ATGACTGTCATTCTCTCCCAAGTTTCATTCTGGCTTAACAGAGAATCTGTGCC
TGCAAGAACTGTGTTTGGAGTAACAACTGTCCTAACAATGACAACTCTAAGC
ATCAGTGCTCGGAATTCTCTCCCCAAAGTGGCTTATGCAACTGCCATGGACT
GGTTTATTGCTGTTTGTTATGCATTTGTGTTCTCTGCCCTAATTGAATTTGCA
ACTGTTAATTACTTCACCAAAAGAGGATGGACTTGGGATGGGAAGAGTGTAG
TAAATGACAAGAAAAAAGAAAAGGCTTCCGTTATGATACAGAACAACGCTTA
TGCAGTGGCTGTTGCCAATTATGCCCCGAATCTTTCAAAAGATCCAGTTCTCT
CCACCATCTCCAAGAGTGCAACCACGCCAGAACCCAACAAGAAGCCAGAAAA
CAAGCCAGCTGAAGCAAAGAAAACTTTCAACAGTGTTAGCAAAATTGACAGA
ATGTCCAGAATAGTTTTTCCAGTTTTGTTTGGTACCTTTAATTTAGTTTACTG
GGCTACATATTTAAACAGAGAACCTGTATTAGGGGTCAGTCCTTGA
人GABAA受体α3亚单位cDNA(SEQ ID NO：GABA3)
ATGATAATCACACAAACAAGTCACTGTTACATGACCAGCCTTGGGATTCTTTT
CCTGATTAATATTCTCCCTGGAACCACTGGTCAAGGGGAATCAAGACGACAA
GAACCCGGGGACTTTGTGAAGCAGGACATTGGCGGGCTGTCTCCTAAGCAT
GCCCCAGATATTCCTGATGACAGCACTGACAACATCACTATCTTCACCAGAA
TCTTGGATCGTCTTCTGGACGGCTATGACAACCGGCTGCGACCTGGGCTTGG
AGATGCAGTGACTGAAGTGAAGACTGACATCTACGTGACCAGTTTTGGCCCT
GTGTCAGACACTGACATGGAGTACACTATTGATGTATTTTTTCGGCAGACAT
GGCATGATGAAAGACTGAAATTTGATGGCCCCATGAAGATCCTTCCACTGAA
CAATCTCCTGGCTAGTAAGATCTGGACACCGGACACCTTCTTCCACAATGGC
AAGAAATCAGTGGCTCATAACATGACCACGCCCAACAAGCTGCTCAGATTGG
TGGACAACGGAACCCTCCTCTATACAATGAGGTTAACAATTCATGCTGAGTG
TCCCATGCATTTGGAAGATTTTCCCATGGATGTGCATGCCTGCCCACTGAAG
TTTGGAAGCTATGCCTATACAACAGCTGAAGTGGTTTATTCTTGGACTCTCG
GAAAGAACAAATCCGTGGAAGTGGCACAGGATGGTTCTCGCTTGAACCAGTA
TGACCTTTTGGGCCATGTTGTTGGGACAGAGATAATCCGGTCTAGTACAGGA
GAATATGTCGTCATGACAACCCACTTCCATCTCAAGCGAAAAATTGGCTACT
TTGTGATCCAGACCTACTTGCCATGTATCATGACTGTCATTCTGTCACAAGTG
TCGTTCTGGCTCAACAGAGAGTCTGTTCCTGCCCGTACAGTCTTTGGTGTCA
CCACTGTGCTTACCATGACCACCTTGAGTATCAGTGCCAGAAATTCCTTACCT
AAAGTGGCATATGCGACGGCCATGGACTGGTTCATAGCCGTCTGTTATGCCT
TTGTATTTTCTGCACTGATTGAATTTGCCACTGTCAACTATTTCACCAAGCGG
AGTTGGGCTTGGGAAGGCAAGAAGGTGCCAGAGGCCCTGGAGATGAAGAAG
AAAACACCAGCAGCCCCAGCAAAGAAAACCAGCACTACCTTCAACATCGTGG
GGACCACCTATCCCATCAACCTGGCCAAGGACACTGAATTTTCCACCATCTC
CAAGGGCGCTGCTCCCAGTGCCTCCTCAACCCCAACAATCATTGCTTCACCC
AAGGCCACCTACGTGCAGGACAGCCCGACTGAGACCAAGACCTACAACAGT
GTCAGCAAGGTTGACAAAATTTCCCGCATCATCTTTCCTGTGCTCTTTGCCAT
ATTCAATCTGGTCTATTGGGCCACATATGTCAACCGGGAGTCAGCTATCAAG
GGCATGATCCGCAAACAGTAG
人GABAA受体α5亚单位cDNA(SEQ ID NO：GABA4)
ATGGACAATGGAATGTTCTCTGGTTTTATCATGATCAAAAACCTCCTTCTCTT
TTGTATTTCCATGAACTTATCCAGTCACTTTGGCTTTTCACAGATGCCAACCA
GTTCAGTGAAAGATGAGACCAATGACAACATCACGATATTTACCAGGATCTT
GGATGGGCTCTTGGATGGCTACGACAACAGACTTCGGCCCGGGCTGGGAGA
GCGCATCACTCAGGTGAGGACCGACATCTACGTCACCAGCTTCGGCCCGGTG
TCCGACACGGAAATGGAGTACACCATAGACGTGTTTTTCCGACAAAGCTGGA
AAGATGAAAGGCTTCGGTTTAAGGGGCCCATGCAGCGCCTCCCTCTCAACAA
CCTCCTTGCCAGCAAGATCTGGACCCCAGACACGTTCTTCCACAACGGGAAG
AAGTCCATCGCTCACAACATGACCACGCCCAACAAGCTGCTGCGGCTGGAGG
ACGACGGCACCCTGCTCTACACCATGCGCTTGACCATCTCTGCAGAGTGCCC
CATGCAGCTTGAGGACTTCCCGATGGATGCGCACGCTTGCCCTCTGAAATTT
GGCAGCTATGCGTACCCTAATTCTGAAGTCGTCTACGTCTGGACCAACGGCT
CCACCAAGTCGGTGGTGGTGGCGGAAGATGGCTCCAGACTGAACCAGTACC
ACCTGATGGGGCAGACGGTGGGCACTGAGAACATCAGCACCAGCACAGGCG
AATACACAATCATGACAGCTCACTTCCACCTGAAAAGGAAGATTGGCTACTT
TGTCATCCAGACCTACCTTCCCTGCATAATGACCGTGATCTTATCACAGGTGT
CCTTTTGGCTGAACCGGGAATCAGTCCCAGCCAGGACAGTTTTTGGGGTCAC
CACGGTGCTGACCATGACGACCCTCAGCATCAGCGCCAGGAACTCTCTGCCC
AAAGTGGCCTACGCCACCGCCATGGACTGGTTCATAGCCGTGTGCTATGCCT
TCGTCTTCTCGGCGCTGATAGAGTTTGCCACGGTCAATTACTTTACCAAGAG
AGGCTGGGCCTGGGATGGCAAAAAAGCCTTGGAAGCAGCCAAGATCAAGAA
AAAGCGTGAAGTCATACTAAATAAGTCAACAAACGCTTTTACAACTGGGAAG
ATGTCTCACCCCCCAAACATTCCGAAGGAACAGACCCCAGCAGGGACGTCGA
ATACAACCTCAGTCTCAGTAAAACCCTCTGAAGAGAAGACTTCTGAAAGCAA
AAAGACTTACAACAGTATCAGCAAAATTGACAAAATGTCCCGAATCGTATTC
CCAGTCTTGTTCGGCACTTTCAACTTAGTTTACTGGGCAACGTATTTGAATAG
GGAGCCGGTGATAAAAGGAGCCGCCTCTCCAAAATAA
人GABAA受体β3变体1亚单位cDNA(SEQ ID NO：GABA5)
ATGTGGGGCCTTGCGGGAGGAAGGCTTTTCGGCATCTTCTCGGCCCCGGTG
CTGGTGGCTGTGGTGTGCTGCGCCCAGAGTGTGAACGATCCCGGGAACATG
TCCTTTGTGAAGGAGACGGTGGACAAGCTGTTGAAAGGCTACGACATTCGCC
TAAGACCCGACTTCGGGGGTCCCCCGGTCTGCGTGGGGATGAACATCGACA
TCGCCAGCATCGACATGGTTTCCGAAGTCAACATGGATTATACCTTAACCAT
GTATTTTCAACAATATTGGAGAGATAAAAGGCTCGCCTATTCTGGGATCCCT
CTCAACCTCACGCTTGACAATCGAGTGGCTGACCAGCTATGGGTGCCCGACA
CATATTTCTTAAATGACAAAAAGTCATTTGTGCATGGAGTGACAGTGAAAAA
CCGCATGATCCGTCTTCACCCTGATGGGACAGTGCTGTATGGGCTCAGAATC
ACCACGACAGCAGCATGCATGATGGACCTCAGGAGATACCCCCTGGACGAG
CAGAACTGCACTCTGGAAATTGAAAGCTATGGCTACACCACGGATGACATTG
AGTTTTACTGGCGAGGCGGGGACAAGGCTGTTACCGGAGTGGAAAGGATTG
AGCTCCCGCAGTTCTCCATCGTGGAGCACCGTCTGGTCTCGAGGAATGTTGT
CTTCGCCACAGGTGCCTATCCTCGACTGTCACTGAGCTTTCGGTTGAAGAGG
AACATTGGATACTTCATTCTTCAGACTTATATGCCCTCTATACTGATAACGAT
TCTGTCGTGGGTGTCCTTCTGGATCAATTATGATGCATCTGCTGCTAGAGTT
GCCCTCGGGATCACAACTGTGCTGACAATGACAACCATCAACACCCACCTTC
GGGAGACCTTGCCCAAAATCCCCTATGTCAAAGCCATTGACATGTACCTTAT
GGGCTGCTTCGTCTTTGTGTTCCTGGCCCTTCTGGAGTATGCCTTTGTCAACT
ACATTTTCTTTGGAAGAGGCCCTCAAAGGCAGAAGAAGCTTGCAGAAAAGAC
AGCCAAGGCAAAGAATGACCGTTCAAAGAGCGAAAGCAACCGGGTGGATGC
TCATGGAAATATTCTGTTGACATCGCTGGAAGTTCACAATGAAATGAATGAG
GTCTCAGGCGGCATTGGCGATACCAGGAATTCAGCAATATCCTTTGACAACT
CAGGAATCCAGTACAGGAAACAGAGCATGCCTCGAGAAGGGCATGGGCGAT
TCCTGGGGGACAGAAGCCTCCCGCACAAGAAGACCCATCTACGGAGGAGGT
CTTCACAGCTCAAAATTAAAATACCTGATCTAACCGATGTGAATGCCATAGA
CAGATGGTCCAGGATCGTGTTTCCATTCACTTTTTCTCTTTTCAACTTAGTTT
ACTGGCTGTACTATGTTAACTGA
人GABAA受体γ2转录变体1(短)亚单位cDNA(SEQ ID NO：GABA6)
ATGAGTTCGCCAAATATATGGAGCACAGGAAGCTCAGTCTACTCGACTCCTG
TATTTTCACAGAAAATGACGGTGTGGATTCTGCTCCTGCTGTCGCTCTACCCT
GGCTTCACTAGCCAGAAATCTGATGATGACTATGAAGATTATGCTTCTAACA
AAACATGGGTCTTGACTCCAAAAGTTCCTGAGGGTGATGTCACTGTCATCTT
AAACAACCTGCTGGAAGGATATGACAATAAACTTCGGCCTGATATAGGAGTG
AAGCCAACGTTAATTCACACAGACATGTATGTGAATAGCATTGGTCCAGTGA
ACGCTATCAATATGGAATACACTATTGATATATTTTTTGCGCAAACGTGGTAT
GACAGACGTTTGAAATTTAACAGCACCATTAAAGTCCTCCGATTGAACAGCA
ACATGGTGGGGAAAATCTGGATTCCAGACACTTTCTTCAGAAATTCCAAAAA
AGCTGATGCACACTGGATCACCACCCCCAACAGGATGCTGAGAATTTGGAAT
GATGGTCGAGTGCTCTACACCCTAAGGTTGACAATTGATGCTGAGTGCCAAT
TACAATTGCACAACTTTCCAATGGATGAACACTCCTGCCCCTTGGAGTTCTCA
AGTTATGGCTATCCACGTGAAGAAATTGTTTATCAATGGAAGCGAAGTTCTG
TTGAAGTGGGCGACACAAGATCCTGGAGGCTTTATCAATTCTCATTTGTTGG
TCTAAGAAATACCACCGAAGTAGTGAAGACAACTTCCGGAGATTATGTGGTC
ATGTCTGTCTACTTTGATCTGAGCAGAAGAATGGGATACTTTACCATCCAGA
CCTATATCCCCTGCACACTCATTGTCGTCCTATCCTGGGTGTCTTTCTGGATC
AATAAGGATGCTGTTCCAGCCAGAACATCTTTAGGTATCACCACTGTCCTGA
CAATGACCACCCTCAGCACCATTGCCCGGAAATCGCTCCCCAAGGTCTCCTA
TGTCACAGCGATGGATCTCTTTGTATCTGTTTGTTTCATCTTTGTCTTCTCTG
CTCTGGTGGAGTATGGCACCTTGCATTATTTTGTCAGCAACCGGAAACCAAG
CAAGGACAAAGATAAAAAGAAGAAAAACCCTGCCCCTACCATTGATATCCGC
CCAAGATCAGCAACCATTCAAATGAATAATGCTACACACCTTCAAGAGAGAG
ATGAAGAGTACGGCTATGAGTGTCTGGACGGCAAGGACTGTGCCAGTTTTTT
CTGCTGTTTTGAAGATTGTCGAACAGGAGCTTGGAGACATGGGAGGATACAT
ATCCGCATTGCCAAAATGGACTCCTATGCTCGGATCTTCTTCCCCACTGCCTT
CTGCCTGTTTAATCTGGTCTATTGGGTCTCCTACCTCTACCTGTGA
GABA靶1(SEQ ID NO：GABA7)
5’-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3’
GABA靶2(SEQ ID NO：GABA8)
5’-GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC-3’
GABA靶3(SEQ ID NO：GABA9)
5’-GTTCTATAGGGTCTGCTTGTCGCTC-3’
GABA信号探针1(SEQ ID NO：GABA10)
5’-Cy5 GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ3猝灭-3’
GABA信号探针2(SEQ ID NO：GABA11)
5’-Cy5.5 GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGC BHQ3猝灭-3’
GABA信号探针3(SEQ ID NO：GABA12)
5’-Fam GCGAGAGCGACAAGCAGACCCTATAGAACCTCGC BHQ1猝灭-3”
SEQ ID NO：GCC1
5’-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3’
SEQ ID NO：GCC 2
5’-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ2-3’
SEQ ID NO：GCC 3(GUCY2C(鸟苷酸环化酶2C)核苷酸序列)
ATGAAGACGTTGCTGTTGGACTTGGCTTTGTGGTCACTGCTCTTCCAGCCCG
GGTGGCTGTCCTTTAGTTCCCAGGTGAGTCAGAACTGCCACAATGGCAGCTA
TGAAATCAGCGTCCTGATGATGGGCAACTCAGCCTTTGCAGAGCCCCTGAAA
AACTTGGAAGATGCGGTGAATGAGGGGCTGGAAATAGTGAGAGGACGTCTG
CAAAATGCTGGCCTAAATGTGACTGTGAACGCTACTTTCATGTATTCGGATG
GTCTGATTCATAACTCAGGCGACTGCCGGAGTAGCACCTGTGAAGGCCTCGA
CCTACTCAGGAAAATTTCAAATGCACAACGGATGGGCTGTGTCCTCATAGGG
CCCTCATGTACATACTCCACCTTCCAGATGTACCTTGACACAGAATTGAGCTA
CCCCATGATCTCAGCTGGAAGTTTTGGATTGTCATGTGACTATAAAGAAACC
TTAACCAGGCTGATGTCTCCAGCTAGAAAGTTGATGTACTTCTTGGTTAACTT
TTGGAAAACCAACGATCTGCCCTTCAAAACTTATTCCTGGAGCACTTCGTAT
GTTTACAAGAATGGTACAGAAACTGAGGACTGTTTCTGGTACCTTAATGCTC
TGGAGGCTAGCGTTTCCTATTTCTCCCACGAACTCGGCTTTAAGGTGGTGTT
AAGACAAGATAAGGAGTTTCAGGATATCTTAATGGACCACAACAGGAAAAGC
AATGTGATTATTATGTGTGGTGGTCCAGAGTTCCTCTACAAGCTGAAGGGTG
ACCGAGCAGTGGCTGAAGACATTGTCATTATTCTAGTGGATCTTTTCAATGA
CCAGTACTTGGAGGACAATGTCACAGCCCCTGACTATATGAAAAATGTCCTT
GTTCTGACGCTGTCTCCTGGGAATTCCCTTCTAAATAGCTCTTTCTCCAGGAA
TCTATCACCAACAAAACGAGACTTTGCTCTTGCCTATTTGAATGGAATCCTGC
TCTTTGGACATATGCTGAAGATATTTCTTGAAAATGGAGAAAATATTACCACC
CCCAAATTTGCTCATGCTTTCAGGAATCTCACTTTTGAAGGGTATGACGGTC
CAGTGACCTTGGATGACTGGGGGGATGTTGACAGTACCATGGTGCTTCTGTA
TACCTCTGTGGACACCAAGAAATACAAGGTTCTTTTGACCTATGATACCCAC
GTAAATAAGACCTATCCTGTGGATATGAGCCCCACATTCACTTGGAAGAACT
CTAAACTTCCTAATGATATTACAGGCCGGGGCCCTCAGATCCTGATGATTGC
AGTCTTCACCCTCACTGGAGCTGTGGTGCTGCTCCTGCTCGTCGCTCTCCTG
ATGCTCAGAAAATATAGAAAAGATTATGAACTTCGTCAGAAAAAATGGTCCC
ACATTCCTCCTGAAAATATCTTTCCTCTGGAGACCAATGAGACCAATCATGTT
AGCCTCAAGATCGATGATGACAAAAGACGAGATACAATCCAGAGACTACGAC
AGTGCAAATACGACAAAAAGCGAGTGATTCTCAAAGATCTCAAGCACAATGA
TGGTAATTTCACTGAAAAACAGAAGATAGAATTGAACAAGTTGCTTCAGATT
GACTATTACAACCTGACCAAGTTCTACGGCACAGTGAAACTTGATACCATGA
TCTTCGGGGTGATAGAATACTGTGAGAGAGGATCCCTCCGGGAAGTTTTAAA
TGACACAATTTCCTACCCTGATGGCACATTCATGGATTGGGAGTTTAAGATC
TCTGTCTTGTATGACATTGCTAAGGGAATGTCATATCTGCACTCCAGTAAGA
CAGAAGTCCATGGTCGTCTGAAATCTACCAACTGCGTAGTGGACAGTAGAAT
GGTGGTGAAGATCACTGATTTTGGCTGCAATTCCATTTTACCTCCAAAAAAG
GACCTGTGGACAGCTCCAGAGCACCTCCGCCAAGCCAACATCTCTCAGAAAG
GAGATGTGTACAGCTATGGGATCATCGCACAGGAGATCATTCTGCGGAAAGA
AACCTTCTACACTTTGAGCTGTCGGGACCGGAATGAGAAGATTTTCAGAGTG
GAAAATTCCAATGGAATGAAACCCTTCCGCCCAGATTTATTCTTGGAAACAG
CAGAGGAAAAAGAGCTAGAAGTGTACCTACTTGTAAAAAACTGTTGGGAGGA
AGATCCAGAAAAGAGACCAGATTTCAAAAAAATTGAGACTACACTTGCCAAG
ATATTTGGACTTTTTCATGACCAAAAAAATGAAAGCTATATGGATACCTTGAT
CCGACGTCTACAGCTATATTCTCGAAACCTGGAACATCTGGTAGAGGAAAGG
ACACAGCTGTACAAGGCAGAGAGGGACAGGGCTGACAGACTTAACTTTATGT
TGCTTCCAAGGCTAGTGGTAAAGTCTCTGAAGGAGAAAGGCTTTGTGGAGCC
GGAACTATATGAGGAAGTTACAATCTACTTCAGTGACATTGTAGGTTTCACT
ACTATCTGCAAATACAGCACCCCCATGGAAGTGGTGGACATGCTTAATGACA
TCTATAAGAGTTTTGACCACATTGTTGATCATCATGATGTCTACAAGGTGGAA
ACCATCGGTGATGCGTACATGGTGGCTAGTGGTTTGCCTAAGAGAAATGGCA
ATCGGCATGCAATAGACATTGCCAAGATGGCCTTGGAAATCCTCAGCTTCAT
GGGGACCTTTGAGCTGGAGCATCTTCCTGGCCTCCCAATATGGATTCGCATT
GGAGTTCACTCTGGTCCCTGTGCTGCTGGAGTTGTGGGAATCAAGATGCCTC
GTTATTGTCTATTTGGAGATACGGTCAACACAGCCTCTAGGATGGAATCCAC
TGGCCTCCCTTTGAGAATTCACGTGAGTGGCTCCACCATAGCCATCCTGAAG
AGAACTGAGTGCCAGTTCCTTTATGAAGTGAGAGGAGAAACATACTTAAAGG
GAAGAGGAAATGAGACTACCTACTGGCTGACTGGGATGAAGGACCAGAAAT
TCAACCTGCCAACCCCTCCTACTGTGGAGAATCAACAGCGTTTGCAAGCAGA
ATTTTCAGACATGATTGCCAACTCTTTACAGAAAAGACAGGCAGCAGGGATA
AGAAGCCAAAAACCCAGACGGGTAGCCAGCTATAAAAAAGGCACTCTGGAAT
ACTTGCAGCTGAATACCACAGACAAGGAGAGCACCTATTTTTAA
智人(H.s.)囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)核苷酸序列(SEQ ID NO：CFTR1)：
atgcagaggtcgcctctggaaaaggccagcgttgtctccaaactttttttcagctggaccagaccaattttgaggaaaggata
cagacagcgcctggaattgtcagacatataccaaatcccttctgttgattctgctgacaatctatctgaaaaattggaaagag
aatgggatagagagctggcttcaaagaaaaatcctaaactcattaatgcccttcggcgatgttttttctggagatttatgttcta
tggaatctttttatatttaggggaagtcaccaaagcagtacagcctctcttactgggaagaatcatagcttcctatgacccgga
taacaaggaggaacgctctatcgcgatttatctaggcataggcttatgccttctctttattgtgaggacactgctcctacaccca
gccatttttggccttcatcacattggaatgcagatgagaatagctatgtttagtttgatttataagaagactttaaagctgtcaa
gccgtgttctagataaaataagtattggacaacttgttagtctcctttccaacaacctgaacaaatttgatgaaggacttgcatt
ggcacatttcgtgtggatcgctcctttgcaagtggcactcctcatggggctaatctgggagttgttacaggcgtctgccttctgt
ggacttggtttcctgatagtccttgccctttttcaggctgggctagggagaatgatgatgaagtacagagatcagagagctgg
gaagatcagtgaaagacttgtgattacctcagaaatgattgaaaatatccaatctgttaaggcatactgctgggaagaagca
atggaaaaaatgattgaaaacttaagacaaacagaactgaaactgactcggaaggcagcctatgtgagatacttcaatagc
tcagccttcttcttctcagggttctttgtggtgtttttatctgtgcttccctatgcactaatcaaaggaatcatcctccggaaaata
ttcaccaccatctcattctgcattgttctgcgcatggcggtcactcggcaatttccctgggctgtacaaacatggtatgactctct
tggagcaataaacaaaatacaggatttcttacaaaagcaagaatataagacattggaatataacttaacgactacagaagt
agtgatggagaatgtaacagccttctgggaggagggatttggggaattatttgagaaagcaaaacaaaacaataacaata
gaaaaacttctaatggtgatgacagcctcttcttcagtaatttctcacttcttggtactcctgtcctgaaagatattaatttcaag
atagaaagaggacagttgttggcggttgctggatccactggagcaggcaagacttcacttctaatggtgattatgggagaac
tggagccttcagagggtaaaattaagcacagtggaagaatttcattctgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaa
agaaaatatcatctttggtgtttcctatgatgaatatagatacagaagcgtcatcaaagcatgccaactagaagaggacatct
ccaagtttgcagagaaagacaatatagttcttggagaaggtggaatcacactgagtggaggtcaacgagcaagaatttcttt
agcaagagcagtatacaaagatgctgatttgtatttattagactctccttttggatacctagatgttttaacagaaaaagaaat
atttgaaagctgtgtctgtaaactgatggctaacaaaactaggattttggtcacttctaaaatggaacatttaaagaaagctg
acaaaatattaattttgcatgaaggtagcagctatttttatgggacattttcagaactccaaaatctacagccagactttagctc
aaaactcatgggatgtgattctttcgaccaatttagtgcagaaagaagaaattcaatcctaactgagaccttacaccgtttctc
attagaaggagatgctcctgtctcctggacagaaacaaaaaaacaatcttttaaacagactggagagtttggggaaaaaag
gaagaattctattctcaatccaatcaactctatacgaaaattttccattgtgcaaaagactcccttacaaatgaatggcatcga
agaggattctgatgagcctttagagagaaggctgtccttagtaccagattctgagcagggagaggcgatactgcctcgcatc
agcgtgatcagcactggccccacgcttcaggcacgaaggaggcagtctgtcctgaacctgatgacacactcagttaaccaa
ggtcagaacattcaccgaaagacaacagcatccacacgaaaagtgtcactggcccctcaggcaaacttgactgaactggat
atatattcaagaaggttatctcaagaaactggcttggaaataagtgaagaaattaacgaagaagacttaaaggagtgctttt
ttgatgatatggagagcataccagcagtgactacatggaacacataccttcgatatattactgtccacaagagcttaatttttg
tgctaatttggtgcttagtaatttttctggcagaggtggctgcttctttggttgtgctgtggctccttggaaacactcctcttcaag
acaaagggaatagtactcatagtagaaataacagctatgcagtgattatcaccagcaccagttcgtattatgtgttttacattt
acgtgggagtagccgacactttgcttgctatgggattcttcagaggtctaccactggtgcatactctaatcacagtgtcgaaaa
ttttacaccacaaaatgttacattctgttcttcaagcacctatgtcaaccctcaacacgttgaaagcaggtgggattcttaatag
attctccaaagatatagcaattttggatgaccttctgcctcttaccatatttgacttcatccagttgttattaattgtgattggagc
tatagcagttgtcgcagttttacaaccctacatctttgttgcaacagtgccagtgatagtggcttttattatgttgagagcatatt
tcctccaaacctcacagcaactcaaacaactggaatctgaaggcaggagtccaattttcactcatcttgttacaagcttaaaa
ggactatggacacttcgtgccttcggacggcagccttactttgaaactctgttccacaaagctctgaatttacatactgccaac
tggttcttgtacctgtcaacactgcgctggttccaaatgagaatagaaatgatttttgtcatcttcttcattgctgttaccttcattt
ccattttaacaacaggagaaggagaaggaagagttggtattatcctgactttagccatgaatatcatgagtacattgcagtg
ggctgtaaactccagcatagatgtggatagcttgatgcgatctgtgagccgagtctttaagttcattgacatgccaacagaag
gtaaacctaccaagtcaaccaaaccatacaagaatggccaactctcgaaagttatgattattgagaattcacacgtgaagaa
agatgacatctggccctcagggggccaaatgactgtcaaagatctcacagcaaaatacacagaaggtggaaatgccatatt
agagaacatttccttctcaataagtcctggccagagggtgggcctcttgggaagaactggatcagggaagagtactttgttat
cagcttttttgagactactgaacactgaaggagaaatccagatcgatggtgtgtcttgggattcaataactttgcaacagtgg
aggaaagcctttggagtgataccacagaaagtatttattttttctggaacatttagaaaaaacttggatccctatgaacagtg
gagtgatcaagaaatatggaaagttgcagatgaggttgggctcagatctgtgatagaacagtttcctgggaagcttgactttg
tccttgtggatgggggctgtgtcctaagccatggccacaagcagttgatgtgcttggctagatctgttctcagtaaggcgaag
atcttgctgcttgatgaacccagtgctcatttggatccagtaacataccaaataattagaagaactctaaaacaagcatttgct
gattgcacagtaattctctgtgaacacaggatagaagcaatgctggaatgccaacaatttttggtcatagaagagaacaaag
tgcggcagtacgattccatccagaaactgctgaacgagaggagcctcttccggcaagccatcagcccctccgacagggtga
agctctttccccaccggaactcaagcaagtgcaagtctaagccccagattgctgctctgaaagaggagacagaagaagagg
tgcaagatacaaggctttga
CFTR靶序列1(SEQ ID NO：CFTR2)：
5’-GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC-3’
CFTR信号传导探针1(SEQ ID NO：CFTR3)：
5’-Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGC BHQ2-3’
H.s.SCN9A(SEQ ID NO：NAV-1)
atggcaatgttgcctcccccaggacctcagagctttgtccatttcacaaaacagtctcttgccctcattgaacaacgcattgct
gaaagaaaatcaaaggaacccaaagaagaaaagaaagatgatgatgaagaagccccaaagccaagcagtgacttggaa
gctggcaaacaactgcccttcatctatggggacattcctcccggcatggtgtcagagcccctggaggacttggacccctacta
tgcagacaaaaagactttcatagtattgaacaaagggaaaacaatcttccgtttcaatgccacacctgctttatatatgctttc
tcctttcagtcctctaagaagaatatctattaagattttagtacactccttattcagcatgctcatcatgtgcactattctgacaa
actgcatatttatgaccatgaataacccgccggactggaccaaaaatgtcgagtacacttttactggaatatatacttttgaat
cacttgtaaaaatccttgcaagaggcttctgtgtaggagaattcacttttcttcgtgacccgtggaactggctggattttgtcgt
cattgtttttgcgtatttaacagaatttgtaaacctaggcaatgtttcagctcttcgaactttcagagtattgagagctttgaaaa
ctatttctgtaatcccaggcctgaagacaattgtaggggctttgatccagtcagtgaagaagctttctgatgtcatgatcctga
ctgtgttctgtctgagtgtgtttgcactaattggactacagctgttcatgggaaacctgaagcataaatgttttcgaaattcactt
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NaV靶序列1(SEQ ID NO：NAV-4)
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NaV靶序列2(SEQ ID NO：NAV-5)
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NaV信号传导探针2-(结合靶2)(SEQ ID NO：NAV-8)
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NaV信号传导探针3-(结合靶3)(SEQ ID NO：NAV-9)
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Claims (44)

1.克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系具有相同细胞类型，并且其中所述实验对象组中的每个细胞系表达目的RNA或目的蛋白质，并且其中所述实验对象组中的所述克隆细胞系相匹配，以共享相同生理特性，其中所述生理特性选自生长速率、Z′因子、目的RNA的表达水平、编码所述目的蛋白质的RNA的表达水平、所述目的蛋白质的表达水平、与组织培养表面附着和功能应答。
2.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述生理特性是生长速率。
3.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述生理特性是与组织培养表面附着。
4.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述生理特性是Z′因子。
5.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述生理特性是目的RNA的表达水平或编码所述目的蛋白质的RNA的表达水平。
6.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述生理特性是所述目的蛋白质的表达水平。
7.权利要求2的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组中的克隆细胞系中细胞的增倍时间在彼此的1、2、3、4或5小时内。
8.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述培养条件对于所述实验对象组中的所有克隆细胞系都是相同的。
9.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述克隆细胞系是真核细胞系。
10.权利要求9的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述真核细胞系是哺乳动物细胞系。
11.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系细胞选自：原代细胞和永生化细胞。
12.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系细胞是原核生物。
13.权利要求9的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系细胞选自：真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、藻类、甲壳类动物细胞、节肢动物细胞、禽类细胞、爬行动物细胞、两栖动物细胞和植物细胞。
14.权利要求10的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系细胞选自：人、非人灵长类动物、牛、猪、猫、大鼠、有袋动物、鼠类、犬、绵羊、山羊、兔、豚鼠、仓鼠。
15.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系中的细胞进行改造以表达所述目的RNA或蛋白质。
16.权利要求15的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞系中的细胞表达来自所引入核酸的所述目的RNA或蛋白质，所述所引入核酸编码蛋白质，或在多聚体蛋白质的情况下，编码蛋白质的亚单位。
17.权利要求15的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述细胞表达来自内源核酸的所述目的RNA或蛋白质，并且其中所述细胞进行改造以激活内源蛋白质的转录，或在多聚体蛋白质的情况下，激活蛋白质的亚单位的转录。
18.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组包括至少4个克隆细胞系。
19.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组包括至少6个克隆细胞系。
20.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组包括至少25个克隆细胞系。
21.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组中的克隆细胞系的2个或更多个表达相同目的RNA或蛋白质。
22.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组中的克隆细胞系的2个或更多个表达不同目的RNA或蛋白质。
23.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组中的细胞系表达不同形式的目的蛋白质，其中所述形式选自：同种型、氨基酸序列变体、剪接变体、截短形式、融合蛋白、嵌合体或其组合。
24.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组中的细胞系表达一组目的蛋白质中的不同蛋白质，其中所述目的蛋白质组选自：在相同信号途径中的蛋白质、相似蛋白质的表达文库、单克隆抗体重链文库、单克隆抗体轻链文库和蛋白质的突变形式。
25.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述目的蛋白质是单链蛋白质。
26.权利要求25的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述单链蛋白质是G蛋白偶联受体。
27.权利要求26的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述G蛋白偶联受体是味觉受体。
28.权利要求27的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述味觉受体选自：苦味受体、甜味受体和鲜味受体。
29.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述蛋白质是多聚体蛋白质。
30.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述蛋白质是异源二聚体或异源多聚体。
31.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述蛋白质选自：离子通道、G蛋白偶联受体GPCR、酪氨酸受体激酶、细胞因子受体、核类固醇激素受体和免疫受体。
32.权利要求31的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述蛋白质是上皮钠通道ENaC。
33.权利要求32的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述ENaC包括α亚单位、β亚单位和γ亚单位。
34.权利要求32的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组中的细胞系表达不同ENaC同种型。
35.权利要求32的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组中的细胞系包括ENaC的不同蛋白水解同种型。
36.权利要求32-34中任一项的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述ENaC是人ENaC。
37.权利要求31的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述蛋白质是电压门控的钠通道NaV。
38.权利要求37的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述NaV包括α亚单位和2个β亚单位。
39.权利要求37的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述NaV是人NaV。
40.权利要求31的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述蛋白质选自：γ-氨基丁酸A受体GABAA受体、γ-氨基丁酸B受体GABAB受体和γ-氨基丁酸C受体GABAC受体。
41.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述蛋白质是GABAA受体。
42.权利要求41的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述GABAA受体包括2个α亚单位、2个β亚单位和γ或δ亚单位。
43.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述实验对象组中的克隆细胞系同时或在彼此不超过4周内产生。
44.权利要求1的克隆细胞系的相匹配实验对象组，其中所述目的蛋白质是咸味受体。
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