JP5796962B2 - 細胞系、ならびにそれらを作製および使用するための方法 - Google Patents
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Description
a)対象とするタンパク質をコードするmRNAを発現する複数の細胞を提供するステップと、
b)細胞を個々の培養容器中に個々に分散させ、それによって複数の別々の細胞培養物を提供するステップと、
c)自動化細胞培養方法を使用して一組の望ましい培養条件下で細胞を培養するステップであって、条件が別々の細胞培養物のそれぞれについて実質的に同一であり、その培養中、別々の細胞培養物当たりの細胞数を培養物毎に正規化し、別々の培養物を同じスケジュールで継代することを特徴とするステップと、
d)対象とするタンパク質の少なくとも1つの望ましい特徴について別々の細胞培養物を少なくとも2回アッセイするステップと、
e)両方のアッセイで望ましい特徴を有する別々の細胞培養物を同定するステップと
を含む方法を提供する。
b)a)の拡大増殖させた細胞培養物が望ましい特徴を有するかどうかを決定するステップと
をさらに含む。
対象とするタンパク質のモジュレーターを同定するための方法であって、
a)前に記載した細胞の実施形態のいずれか1つに記載の細胞を試験化合物と接触させるステップと、
b)試験化合物と接触させなかった細胞におけるタンパク質の活性と比較した、試験化合物と接触させた細胞における対象とするタンパク質の活性の変化を検出するステップと
を含み、不在下と比較して存在下で活性の差を生じる化合物が対象とするタンパク質のモジュレーターである方法を提供する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
対象とするヘテロ二量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする導入核酸から該対象とするヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするヘテロ二量体タンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目2)
対象とするヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、該対象とするヘテロ二量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするヘテロ二量体タンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目3)
対象とするヘテロ二量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする導入核酸から該対象とするヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、選択圧の不在下で培養される、細胞。
(項目4)
対象とするヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、該対象とするヘテロ二量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、選択圧の不在下で培養される、細胞。
(項目5)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質の第2サブユニットをコードする核酸が内因性である、項目1から4のいずれか一項に記載の細胞。
(項目6)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質の第2サブユニットをコードする核酸が導入されている、項目2または4に記載の細胞。
(項目7)
上記対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まない、項目1から6のいずれか一項に記載の細胞。
(項目8)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体および免疫学的受容体からなる群より選択される、項目1から7のいずれか一項に記載の細胞。
(項目9)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が、甘味受容体およびうま味受容体からなる群より選択される、項目8に記載の細胞。
(項目10)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が公知のリガンドを有さない、項目1から8のいずれか一項に記載の細胞。
(項目11)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が同じ型の細胞中で発現されない、項目1から10のいずれか一項に記載の細胞。
(項目12)
哺乳動物細胞である、項目1から11のいずれか一項に記載の細胞。
(項目13)
1を超えるシグナル対ノイズ比、時間をわたって安定であること、発現の消失を伴わない選択圧なしでの増殖、生理的なEC50値、および生理的なIC50値からなる群より選択される追加の望ましい特性を有することをさらに特徴とする、項目1から12のいずれか一項に記載の細胞。
(項目14)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、および少なくとも9ヶ月から選択される期間1つの形で一貫して再現性よく産生される、項目1、2および5から13のいずれか一項に記載の細胞。
(項目15)
上記機能アッセイが細胞ベースアッセイ、蛍光細胞ベースアッセイ、高スループットスクリーニングアッセイ、受容体細胞ベースアッセイ、Gタンパク質媒介細胞ベースアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースアッセイからなる群より選択される、項目1、2および5から13のいずれか一項に記載の細胞。
(項目16)
上記細胞が細胞ベースの高スループットスクリーニングでの利用に適している、項目1、2および5から13のいずれか一項に記載の細胞。
(項目17)
上記選択圧が抗生物質である、項目3から13のいずれか一項に記載の細胞。
(項目18)
少なくとも15日間、30日間、45日間、60日間、75日間、100日間、120日間、または150日間、選択圧の不在下で上記ヘテロ二量体タンパク質を発現する、項目3から13および17のいずれか一項に記載の細胞。
(項目19)
対象とするヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞であって、該ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも3つのサブユニットを含み、該対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットが導入核酸によってコードされており、該細胞は、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするヘテロ二量体タンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目20)
対象とするヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞であって、該ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも3つのサブユニットを含み、該細胞は、該対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするヘテロ二量体タンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目21)
対象とするヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞であって、該ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも3つのサブユニットを含み、該対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットが導入核酸によってコードされており、該細胞が生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とする、細胞。
(項目22)
対象とするヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞であって、該ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも3つのサブユニットを含み、該細胞が該対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、該細胞が生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とする細胞。
(項目23)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする上記核酸が内因性である、項目19から22のいずれか一項に記載の細胞。
(項目24)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする上記核酸が導入されている、項目20または22に記載の細胞。
(項目25)
上記対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まない、項目19から24のいずれか一項に記載の細胞。
(項目26)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質が、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体および免疫学的受容体からなる群より選択される、項目19から25のいずれか一項に記載の細胞。
(項目27)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質が、GABA、ENaCおよびNaVからなる群より選択される、項目26に記載の細胞。
(項目28)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質が公知のリガンドを有さない、項目19から26のいずれか一項に記載の細胞。
(項目29)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が同じ型の細胞中で発現されない、項目19から28のいずれか一項に記載の細胞。
(項目30)
哺乳動物細胞である、項目19から29のいずれか一項に記載の細胞。
(項目31)
1を超えるシグナル対ノイズ比、時間をわたって安定であること、発現の消失を伴わない選択圧なしでの増殖、生理的なEC50値、および生理的なIC50値からなる群より選択される追加の望ましい特性を有することをさらに特徴とする、項目19から30のいずれか一項に記載の細胞。
(項目32)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質が少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、および少なくとも9ヶ月から選択される期間1つの形で一貫して再現性よく産生される、項目19、20および23から31のいずれか一項に記載の細胞。
(項目33)
上記機能アッセイが細胞ベースアッセイ、蛍光細胞ベースアッセイ、高スループットスクリーニングアッセイ、受容体細胞ベースアッセイ、Gタンパク質媒介細胞ベースアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースアッセイからなる群より選択される、項目19、20および23から31のいずれか一項に記載の細胞。
(項目34)
細胞ベースの高スループットスクリーニングでの利用に適している、項目19、20および23から31のいずれか一項に記載の細胞。
(項目35)
選択圧の不在下で培養される、項目21から31のいずれか一項に記載の細胞。
(項目36)
上記選択圧が抗生物質である、項目35に記載の細胞。
(項目37)
少なくとも15日間、30日間、45日間、60日間、75日間、100日間、120日間、または150日間、選択圧の不在下で上記ヘテロ多量体タンパク質を発現する、項目35または36に記載の細胞。
(項目38)
対象とするタンパク質の少なくとも1つをコードする導入核酸から2つ以上の該対象とするタンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目39)
2つ以上の対象とするタンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、該対象とするタンパク質の少なくとも1つをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目40)
対象とするタンパク質の少なくとも1つをコードする導入核酸から2つ以上の該対象とするタンパク質を発現する細胞であって、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とする細胞。
(項目41)
2つ以上の対象とするタンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、該対象とするタンパク質の少なくとも1つをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とする細胞。
(項目42)
対象とする少なくとも1つのタンパク質が二量体タンパク質である、項目38から41のいずれか一項に記載の細胞。
(項目43)
上記対象とする二量体タンパク質がホモ二量体タンパク質である、項目42に記載の細胞。
(項目44)
上記対象とする二量体タンパク質がヘテロ二量体タンパク質である、項目42に記載の細胞。
(項目45)
対象とする少なくとも1つのタンパク質が多量体タンパク質である、項目38から41のいずれか一項に記載の細胞。
(項目46)
上記対象とする多量体タンパク質がホモ多量体タンパク質である、項目45に記載の細胞。
(項目47)
上記対象とする多量体タンパク質がヘテロ多量体タンパク質である、項目45に記載の細胞。
(項目48)
上記タンパク質の1つが内因性核酸によってコードされている、項目38から47のいずれか一項に記載の細胞。
(項目49)
上記タンパク質の1つが導入核酸によってコードされている、項目39または41に記載の細胞。
(項目50)
上記対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まない、項目38から49のいずれか一項に記載の細胞。
(項目51)
上記対象とするタンパク質の1つが、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体および免疫学的受容体からなる群より選択される、項目38から49のいずれか一項に記載の細胞。
(項目52)
上記対象とするタンパク質の1つが公知のリガンドを有さない、項目38から51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目53)
上記対象とするタンパク質の1つが同じ型の細胞中で発現されない、項目38から52のいずれか一項に記載の細胞。
(項目54)
哺乳動物細胞である、項目38から53のいずれか一項に記載の細胞。
(項目55)
1を超えるシグナル対ノイズ比、時間をわたって安定であること、発現の消失を伴わない選択圧なしでの増殖、生理的なEC50値、および生理的なIC50値からなる群より選択される追加の望ましい特性を有することをさらに特徴とする、項目38から54のいずれか一項に記載の細胞。
(項目56)
上記対象とする2つ以上のタンパク質が少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、および少なくとも9ヶ月から選択される期間1つの形で一貫して再現性よく産生される、項目38、39および42から55のいずれか一項に記載の細胞。
(項目57)
上記機能アッセイが細胞ベースアッセイ、蛍光細胞ベースアッセイ、高スループットスクリーニングアッセイ、受容体細胞ベースアッセイ、Gタンパク質媒介細胞ベースアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースアッセイからなる群より選択される、項目38、39および42から55のいずれか一項に記載の細胞。
(項目58)
細胞ベースの高スループットスクリーニングでの利用に適している、項目38、39および42から55のいずれか一項に記載の細胞。
(項目59)
選択圧の不在下で培養される、項目40から55のいずれか一項に記載の細胞。
(項目60)
上記選択圧が抗生物質である、項目59に記載の細胞。
(項目61)
少なくとも15日間、30日間、45日間、60日間、75日間、100日間、120日間、または150日間、選択圧の不在下で上記2つ以上のタンパク質を発現する、項目59または60に記載の細胞。
(項目62)
対象とする少なくとも1つのRNAを発現する細胞であって、該対象とするRNAが導入核酸によってコードされており、該細胞が機能アッセイでの使用に適した形で該対象とする少なくとも1つのRNAを産生することを特徴とし、該対象とするRNAがタグを含まず、または該RNAが、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目63)
対象とする少なくとも1つのRNAを発現する細胞であって、該細胞は、該対象とする少なくとも1つのRNAをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とする少なくとも1つのRNAを産生することを特徴とし、該対象とするRNAがタグを含まず、または該RNAが、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目64)
対象とする少なくとも2つのRNAを発現する、項目62または63に記載の細胞。
(項目65)
対象とする少なくとも3つのRNAを発現する、項目62または63に記載の細胞。
(項目66)
導入核酸によってコードされるRNAをさらに発現する、項目64から65のいずれか一項に記載の細胞。
(項目67)
上記対象とするRNAが、イオンチャネルをコードするRNA、Gタンパク質共役受容体(GPCR)をコードするRNA、チロシン受容体キナーゼをコードするRNA、サイトカイン受容体をコードするRNA、核ステロイドホルモン受容体をコードするRNAおよび免疫学的受容体をコードするRNAからなる群より選択される、項目62から66のいずれか一項に記載の細胞。
(項目68)
上記対象とするRNAが同じ型の細胞中で発現されない、項目62から67のいずれか一項に記載の細胞。
(項目69)
哺乳動物細胞である、項目62から68のいずれか一項に記載の細胞。
(項目70)
1を超えるシグナル対ノイズ比、時間をわたって安定であること、発現の消失を伴わない選択圧なしでの増殖、生理的なEC50値、および生理的なIC50値からなる群より選択される追加の望ましい特性を有することをさらに特徴とする、項目62から69のいずれか一項に記載の細胞。
(項目71)
上記対象とするRNAが少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、および少なくとも9ヶ月から選択される期間1つの形で一貫して再現性よく産生される、項目62から70のいずれか一項に記載の細胞。
(項目72)
上記機能アッセイが細胞ベースアッセイ、蛍光細胞ベースアッセイ、高スループットスクリーニングアッセイ、受容体細胞ベースアッセイ、Gタンパク質媒介細胞ベースアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースアッセイからなる群より選択される、項目62から71のいずれか一項に記載の細胞。
(項目73)
細胞ベースの高スループットスクリーニングでの利用に適している、項目61から72のいずれか一項に記載の細胞。
(項目74)
項目1から73のいずれか一項に記載の細胞から作製された細胞系。
(項目75)
対象とするタンパク質を発現する細胞を作製するための方法であって、該細胞が時間をわたって一貫する少なくとも1つの望ましい特性を有し、
a)該対象とするタンパク質をコードするmRNAを発現する複数の細胞を提供するステップと、
b)細胞を個々の培養容器中に個々に分散させ、それによって複数の別々の細胞培養物を提供するステップと、
c)自動化細胞培養方法を使用して一組の望ましい培養条件下で該細胞を培養するステップであって、該条件が該別々の細胞培養物のそれぞれについて実質的に同一であり、該培養中、別々の細胞培養物当たりの細胞数を培養物毎に正規化し、該別々の培養物を同じスケジュールで継代することを特徴とする、ステップと、
d)該対象とするタンパク質の少なくとも1つの望ましい特徴について該別々の細胞培養物を少なくとも2回アッセイするステップと、
e)両方のアッセイで該望ましい特徴を有する別々の細胞培養物を同定するステップであって、該細胞がその細胞(a cell that)であるステップ、と
を含む、方法。
(項目76)
ステップa)における複数の細胞を、ステップb)の分散させることの前に、ある程度の期間培養する、項目75に記載の方法。
(項目77)
上記個々の培養容器がマルチウエルプレートの個々のウエルおよびバイアルからなる群より選択される、項目75に記載の方法。
(項目78)
複数の上記別々の細胞培養物の増殖速度を決定するステップ、および任意の群中で最も速い増殖速度と最も遅い増殖速度との差がステップb)とc)の間で1、2、3、4、または5日を超えないように、その増殖速度によって該別々の細胞培養物を群に分けるステップをさらに含む、項目75に記載の方法。
(項目79)
1つまたは複数の上記別々の培養物の保存ストックを調製するステップをさらに含む、項目75または項目78に記載の方法。
(項目80)
上記別々の細胞培養物の1つまたは複数の複製セットのステップ、および供給源である上記別々の細胞培養物由来の該1つまたは複数の複製セットを別々に培養するステップをさらに含む、項目75に記載の方法。
(項目81)
ステップd)でのアッセイが上記タンパク質の機能アッセイである、項目75に記載の方法。
(項目82)
ステップe)で一定のままである上記少なくとも1つの特徴がタンパク質機能である、項目75に記載の方法。
(項目83)
ステップc)での上記培養がロボット細胞培養装置におけるものである、項目75に記載の方法。
(項目84)
上記ロボット細胞培養装置がマルチチャネルロボットピペッターを含む、項目83に記載の方法。
(項目85)
上記マルチチャネルロボットピペッターが少なくとも96チャネルを含む、項目84に記載の方法。
(項目86)
上記ロボット細胞培養装置がチェリーピッキングアームをさらに含む、項目84に記載の方法。
(項目87)
上記自動化方法が培地除去、培地交換、細胞洗浄、試薬添加、細胞の除去、細胞分散、および細胞継代の1つまたは複数を含む、項目75に記載の方法。
(項目88)
複数の上記別々の細胞培養物が少なくとも50個の培養物である、項目75に記載の方法。
(項目89)
複数の上記別々の細胞培養物が少なくとも100個の培養物である、項目75に記載の方法。
(項目90)
複数の上記別々の細胞培養物が少なくとも500個の培養物である、項目75に記載の方法。
(項目91)
複数の上記別々の細胞培養物が少なくとも1000個の培養物である、項目75に記載の方法。
(項目92)
ATPの測定、細胞集密度の測定、光散乱、光学濃度測定からなる群より選択される方法によって上記増殖速度を決定する、項目78に記載の方法。
(項目93)
上記群中で最も速い増殖速度と最も遅い増殖速度との差が1、2、3、4、または5時間を超えない、項目78に記載の方法。
(項目94)
ステップc)での培養が少なくとも2日間である、項目75に記載の方法。
(項目95)
複数の上記別々の細胞培養物の増殖速度を上記細胞を分散させることおよび細胞集密度を測定することによって決定する、項目78に記載の方法。
(項目96)
上記それぞれ別々の細胞培養物中の細胞を細胞集密度の測定前に分散させる、項目95に記載の方法。
(項目97)
上記分散ステップがトリプシンを上記ウエルに加えて塊を除去することを含む、項目95または96に記載の方法。
(項目98)
複数の上記別々の細胞培養物の細胞集密度を、自動化マイクロプレートリーダーを使用して測定する、項目95に記載の方法。
(項目99)
少なくとも2回の集密度測定を、増殖速度を計算する前に実施する、項目95に記載の方法。
(項目100)
上記細胞集密度を自動化プレートリーダーによって測定し、かつ増殖速度を計算するソフトウェアプログラムと共に該集密度値を使用する、項目98に記載の方法。
(項目101)
ステップd)での別々の細胞培養物が、脆弱性、形態、固体表面との接着性、固体表面との接着性の欠如およびタンパク質機能の1つまたは複数から選択される望ましい特質を特徴とする、項目75に記載の方法。
(項目102)
上記細胞が真核細胞である、項目75に記載の方法。
(項目103)
上記真核細胞が哺乳動物細胞である、項目75に記載の方法。
(項目104)
上記哺乳動物細胞系がNS0細胞、CHO細胞、COS細胞、HEK−293細胞、HUVEC、3T3細胞およびHeLa細胞からなる群より選択される、項目75に記載の方法。
(項目105)
上記対象とするタンパク質がヒトタンパク質である、項目75に記載の方法。
(項目106)
上記対象とするタンパク質がヘテロ多量体である、項目75に記載の方法。
(項目107)
上記対象とするタンパク質がGタンパク質共役受容体である、項目75に記載の方法。
(項目108)
上記タンパク質が公知のリガンドを有さない、項目75に記載の方法。
(項目109)
上記同定ステップの後に、
a)望ましい培養条件下においてステップe)で同定した細胞培養物の保存アリコートを拡大増殖させるステップと、
b)該a)の拡大増殖させた細胞培養物が望ましい特徴を有するかどうかを決定するステップと
をさらに含む、項目75に記載の方法。
(項目110)
クローン細胞系の適合パネルであって、該クローン細胞系が同じ細胞型であり、該パネル中のそれぞれの細胞系が対象とするタンパク質を発現し、該パネル中のクローン細胞系が同じ生理学的特徴を共有するように適合されていることにより並行処理が可能となる、クローン細胞系の適合パネル。
(項目111)
上記生理学的特徴が増殖速度である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目112)
上記生理学的特徴が組織培養物表面との接着性である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目113)
上記生理学的特徴がZ’係数である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目114)
上記生理学的特徴が上記対象とするタンパク質をコードするRNAの発現レベルである、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目115)
上記生理学的特徴が上記対象とするタンパク質の発現レベルである、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目116)
上記パネル中のクローン細胞系の増殖速度が互いに1、2、3、4、または5時間の範囲内にある、項目111に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目117)
上記培養条件が上記パネル中の全てのクローン細胞系で同じである、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目118)
上記クローン細胞系が真核細胞系である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目119)
上記真核細胞系が哺乳動物細胞系である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目120)
上記細胞系の細胞が初代細胞および不死化細胞からなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目121)
上記細胞系の細胞が原核細胞または真核細胞である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目122)
上記細胞系の細胞が真核細胞であり、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、藻類、甲殻類細胞、節足動物細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞および植物細胞からなる群より選択される、項目121に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目123)
上記細胞系の細胞が哺乳動物細胞であり、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ネコ、ラット、有袋動物、ネズミ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ハムスターからなる群より選択される、項目122に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目124)
上記細胞系の細胞が上記対象とするタンパク質を発現するように操作されている、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目125)
上記細胞系の細胞が、上記対象とするタンパク質をコードする、または多量体タンパク質の場合では該タンパク質のサブユニットをコードする導入核酸から該タンパク質を発現する、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目126)
上記細胞が内因性核酸から上記対象とするタンパク質を発現し、該細胞が内因性タンパク質の転写を活性化する、または多量体タンパク質の場合では該タンパク質のサブユニットの転写を活性化するように操作されている、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目127)
上記パネルが少なくとも4個のクローン細胞系を含む、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目128)
上記パネルが少なくとも6個のクローン細胞系を含む、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目129)
上記パネルが少なくとも25個のクローン細胞系を含む、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目130)
上記パネル中の2つ以上のクローン細胞系が対象とする同じタンパク質を発現する、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目131)
上記パネル中の2つ以上のクローン細胞系が対象とする異なるタンパク質を発現する、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目132)
上記パネル中の細胞系が異なる形態の対象とするタンパク質を発現し、該形態がアイソフォーム、アミノ酸配列変異体、スプライス変異体、切断型、融合タンパク質、キメラ、またはそれらの組合せからなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目133)
上記パネル中の細胞系が対象とするタンパク質の群中の異なるタンパク質を発現し、該対象とするタンパク質の群が同じシグナル伝達経路中のタンパク質、類似したタンパク質の発現ライブラリー、モノクローナル抗体重鎖ライブラリー、モノクローナル抗体軽鎖ライブラリーおよびSNPからなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目134)
上記対象とするタンパク質が単鎖タンパク質である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目135)
上記単鎖タンパク質がGタンパク質共役受容体である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目136)
上記Gタンパク質共役受容体が味覚受容体である、項目135に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目137)
上記味覚受容体が苦味受容体、甘味受容体、塩味受容体およびうま味受容体からなる群より選択される、項目136に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目138)
上記タンパク質が多量体タンパク質である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目139)
上記タンパク質がヘテロ二量体またはヘテロ多量体である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目140)
上記タンパク質が、イオンチャネル、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体および免疫学的受容体からなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目141)
上記タンパク質が上皮ナトリウムチャネル(ENaC)である、項目140に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目142)
上記ENaCがαサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットを含む、項目140に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目143)
上記パネル中の細胞系が異なるENaCアイソフォームを発現する、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目144)
上記パネル中の細胞系がENaCの異なるタンパク質分解アイソフォームを含む、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目145)
上記ENaCがヒトENaCである、項目141から143のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目146)
上記タンパク質が電位依存性ナトリウムチャネル(NaV)である、項目140に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目147)
上記NaVが1つのαサブユニットおよび2つのβサブユニットを含む、項目146に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目148)
上記NaVがヒトNaVである、項目140に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目149)
上記タンパク質がγ−アミノ酪酸A受容体(GABA A 受容体)、γ−アミノ酪酸B受容体(GABA B 受容体)およびγ−アミノ酪酸C受容体(GABA C 受容体)からなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目150)
上記タンパク質がGABA A 受容体である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目151)
上記GABA A 受容体が2つのαサブユニット、2つのβサブユニットおよび1つのγまたはδサブユニットを含む、項目150に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目152)
上記パネル中のクローン細胞系が同時に、または互いに4週間を超えない内に作製された、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目153)
対象とする単量体タンパク質をコードする導入核酸から該対象とする単量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、該細胞は選択圧の不在下で培養され、かつ該タンパク質の発現が3ヶ月にわたって30%を超えて変化しない、細胞。
(項目154)
上記タンパク質の発現が6ヶ月にわたって30%を超えて変化しない、項目153に記載の細胞。
(項目155)
上記対象とするタンパク質が公知のリガンドを有さない、項目153または154に記載の細胞。
(項目156)
対象とするタンパク質のモジュレーターを同定するための方法であって、該細胞は:
a)項目1から74のいずれか一項に記載の細胞を試験化合物と接触させるステップと、
b)該試験化合物と接触させなかった細胞における該タンパク質の活性と比較した、該試験化合物と接触させた細胞における該対象とするタンパク質の活性の変化を検出するステップと
を含み、不在下と比較して存在下で活性の差を生じる化合物が該対象とするタンパク質のモジュレーターである、方法。
(項目157)
項目156に記載の方法によって同定されたモジュレーター。
(項目158)
項目156に記載の方法によって同定されたモジュレーター。
(項目159)
上記対象とするRNAがsiRNAまたはアンチセンスRNAである、項目63に記載の細胞。
(項目160)
対象とする少なくとも1つのタンパク質を発現する細胞であって、該対象とするタンパク質が公知のリガンドを有さないか、または該対象とするタンパク質の機能的発現を検出する公知のアッセイが存在せず、かつ該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まない細胞。
(項目161)
上記対象とするタンパク質が少なくとも2、3、4、5、または6つのサブユニットを含む、項目159に記載の細胞。
(項目162)
上記対象とするタンパク質が
(項目163)
上記対象とするタンパク質の少なくとも1つのサブユニットが遺伝子活性化によって発現される、項目159に記載の細胞。
(項目164)
上記対象とするタンパク質の少なくとも1つのサブユニットが導入核酸から発現される、項目159に記載の細胞。
(項目165)
上記対象とするタンパク質が公知のリガンドを有さない、項目159に記載の細胞。
(項目166)
上記対象とするタンパク質が公知の機能を有さない、項目159に記載の細胞。
(項目167)
上記対象とするタンパク質が公知のリガンドを有さず、公知の機能も有さない、項目159に記載の細胞。
(項目168)
上記タンパク質の発現が3ヶ月にわたって5%を超えて変化しない、項目153に記載の細胞。
(項目169)
細胞系を生成するための方法であって、同一培養条件下で複数の並行培養物中の複数の細胞系を培養するステップ、および時間をわたって一貫した状態のままである少なくとも1つの特徴を有する細胞系を同定するステップを含む、方法。
(項目170)
上記複数の並行培養物が少なくとも50個の細胞培養物を含む、項目168に記載の方法。
(項目171)
上記複数の並行培養物が少なくとも100個の細胞培養物を含む、項目168に記載の方法。
(項目172)
上記複数の並行培養物が少なくとも200個の細胞培養物を含む、項目168に記載の方法。
などの貯蔵施設から入手可能な任意の細胞系もあるが、これらだけには限られない。
Z’係数=1−((3σ陽性対照+3σ陰性対照)/(μ陽性対照−μ陰性対照))
係数が1.0である場合、それは理想的なアッセイを示す可能性があり、理論上最大のZ’は変動がなくダイナミックレンジが無限である。本明細書で使用する「高Z’’’」は、少なくとも0.6、少なくとも0.7、少なくとも0.75または少なくとも0.8、または0.6と1.0の間の任意の小数のZ’のZ’係数を指す。複合標的の場合、高Z’は少なくとも0.4以上のZ’を意味する。0に近い値は、陽性対照と陰性対照の間に重複があることをそれが示すので望ましくない。当業界では、簡潔な細胞ベースアッセイのために、0.3までのZ’値は最低限度の値であると考え、0.3と0.5の間のZ’値は許容可能であると考え、かつ0.5を超えるZ’値は優れていると考える。高いZ’値、ただしZ’細胞ベースの系は複雑であるので、無細胞または生化学アッセイは低い傾向がある細胞ベースの系の値に近づく可能性がある。
a)対象とするタンパク質をコードするmRNAを発現する複数の細胞を提供するステップと、
b)細胞を個々の培養容器中に個々に分散させ、それによって複数の別々の細胞培養物を提供するステップと、
c)自動化細胞培養方法を使用して一組の望ましい培養条件下で細胞を培養するステップであって、条件が別々の細胞培養物のそれぞれについて実質的に同一であり、その培養中、別々の細胞培養物当たりの細胞数を培養物毎に正規化し、別々の培養物を同じスケジュールで継代することを特徴とするステップと、
d)対象とするタンパク質の少なくとも1つの望ましい特徴について別々の細胞培養物を少なくとも2回アッセイするステップと、
e)両方のアッセイで望ましい特徴を有する別々の細胞培養物を同定するステップと
を含む。
安定なGABAA発現細胞系の作製
発現ベクターの作製
pCMV−SCRIPT(Stratagene)に基づいて、合理的なクローニングを可能にするプラスミド発現ベクターを作製し、CMVおよびSV40真核生物プロモーター;SV40およびHSV−TKポリアデニル化配列;マルチクローニング部位;Kozak配列;ならびにネオマイシン/カナマイシン耐性カセットを含む、対象とする遺伝子の転写および翻訳に必要な様々な構成要素を含めた。
本発明者らは、293T細胞およびCHO細胞の両方をトランスフェクトした。実施例ではCHO細胞に着目し、このCHO細胞を、1つはヒトGABAαサブユニット(配列番号GABA1−GABA4)をコードしており、1つはヒトGABAβ3サブユニット(配列番号GABA5)をコードしており、もう1つはヒトGABAγ2サブユニット(配列番号GABA6)をコードしている3つの別個のプラスミドで、以下のα1β3γ2s(α1)、α2β3γ2s(α2)、α3β3γ2s(α3)およびα5β3γ2s(α5)の組合せで同時トランスフェクトした。当業者に理解されるように、選択された宿主細胞と一緒に使用するのに適当な任意の試薬を使用して、適切な最適化によって宿主細胞中に核酸、例えば、プラスミド、オリゴヌクレオチド、標識オリゴヌクレオチドを誘導することができる。宿主細胞中に核酸を誘導するために使用することができる試薬の例は、Lipofectamine、Lipofectamine2000、Oligofectamine、TFX試薬、Fugene6、DOTAP/DOPE、Metafectine、またはFecturinを含むがこれらに限定されない。
トランスフェクトした細胞を、HAMF12−FBS中で2日間、続いて抗生物質含有HAMF12−FBS中で14日間増殖させた。抗生物質含有期間は、以下の通り抗生物質を培地に添加した:ピューロマイシン(3μg/ml)、ハイグロマイシン(150μg/ml)、およびG418/ネオマイシン(300μg/ml)。
抗生物質選択に続いて蛍光プローブの誘導前に、抗生物質の不在下で細胞を6〜18回継代培養して、治まるまでの選択期間にわたって、不安定な発現のための時間を与えた。
細胞を回収し、GABAシグナルリングプローブ(配列番号GABA10〜GABA12)でトランスフェクトした。当業者に理解されるように、選択された宿主細胞と一緒に使用するのに適当な任意の試薬を使用して、適切な最適化によって宿主細胞中に核酸、例えば、プラスミド、オリゴヌクレオチド、標識オリゴヌクレオチドを誘導することができる。宿主細胞中に核酸を誘導するために使用することができる試薬の例は、Lipofectamine、Lipofectamine2000、Oligofectamine、TFX試薬、Fugene6、DOTAP/DOPE、Metafectine、またはFecturinを含むがこれらに限定されない。
100μMストックとして供給
Cy5と同様のスペクトル特性を有するQuasar Dye(BioSearch)を使用した同様のプローブを、ある特定の実験において使用した。場合によっては、DNAプローブではなく5−MedCおよび2−アミノdAミックスマープローブを使用したことも留意されたい。
蛍光活性化セルソーターを使用した分析および選別のために、細胞を解離させ、回収した。標準的な分析方法を使用して、バックグラウンドを超える蛍光を発している細胞にゲートをかけ、バーコード付き96ウェルプレート中のゲートに入った個々の細胞を単離した。ゲートの階層は以下の通りであった:ゲートの階層:コインシデンスゲート>シングレットゲート>ライブゲート>ソートゲート。このゲーティング方法で、バーコード付き96ウェルプレート中への選別用に上位0.04〜0.4%のトリプル陽性細胞をマークした。
より多くの細胞を得るために、ステップ1〜5および/または3〜5を繰り返した。ステップ1〜5の独立した2回のラウンドを終了させ、これらの各サイクルについて、独立したラウンドで合計して少なくとも3回のステップ3〜5の内部サイクルを行った。
プレートを、Hamilton Microlabstar自動化液体ハンドラーへ移した。細胞を、2〜3日馴化した増殖培地:100単位/mlのペニシリンに加えて0.1mg/mlのストレプトマイシンを添加した新しい増殖培地(増殖培地はハムF12/10%FBS)の1:1の混合物中で5〜7日間インキュベートし、次いで0.25%トリプシンを用いてトリプシン化により分散させて塊を最小化し、新しい96ウェルプレートに移した。クローンを分散させた後、プレートを画像化してウェルの集密度を決定した(Genetix)。プレート全体での信頼性の高い画像取得のために、各プレートに焦点を合わせた。記録された集密度が70%を超えるものは、信頼性なしとした。集密度の測定値は、9日間(分散後1〜10日)にわたって3日間毎に取得し、増殖速度を計算するために使用した。
ステップ7における分散ステップ後10〜11日間の増殖速度によって細胞を区分した(独立して群に分け、コホートとしてプレーティングした)。下流のハンドリングのために区分を独立して回収し、個々の96ウェルプレート上にプレーティングしたが、特定の1区分当たりに複数の標的プレートが存在したはずである。増殖速度の隔たりを考慮することおよび細胞集団の総数の高い割合が含まれている範囲を一括して扱うことによって、区分を計算した。選別の繰返し(ステップ5を参照されたい)に応じて、5〜6個の増殖区分を1〜4日の区画とともに使用した。したがって各区分は、繰返しに応じて12〜14.4時間の増殖速度または集団倍加時間に対応していた。
標準的な一定条件(加湿された37℃の、5%CO2/95%空気)下で、抗生物質を含まないハムF12培地/10%FBS中で、プレートをインキュベートした。細胞のプレートを、4セットの標的プレートを生じるように分割した(セットは全増殖区分を有する全プレートからなり、これらのステップによって確実に最初のセットの4個の複製が存在する)。2個までの標的プレートセットを、低温保存に付し(下記参照)、継代のためおよび機能アッセイ実験のために残りのセットを拡大し、さらにレプリカをプレーティングした。各独立して行われたプレートのセットについて、異なる別の組織培養試薬、インキュベーター、担当者および二酸化炭素発生源を使用した。全ての組織培養試薬の適切な作製および品質を確実にするために、品質管理ステップを行った:使用するために調製された培地の各ボトルに添加された各成分培地は、1つの指定されたフードにおいて1人の指定された個人が、このフードにおいてはその試薬だけを用いて添加し、第2の指定された個人がミスを回避するためにモニターした。液体ハンドリングの条件は、ウェル間のクロスコンタミネーションを除去するように設定した。全てのステップについて新しいチップを使用するか、またはストリンジェントなチップ洗浄プロトコールを使用した。正確な容量の移し替え、効率的な細胞操作、洗浄サイクル、ピペッティング速度および配置、細胞分散のためのピペッティングサイクル数、ならびにチップのプレートに対する相対的位置のために、液体ハンドリング条件を設定した。
少なくとも2個のプレートのセットを、−70〜−80℃で凍結した。各セットのプレートを、まず70〜100%の集密度に到達させた。培地を吸引し、90%FBSおよび10%DMSOを添加した。プレートをパラフィルムでシールし、次いで個々に1〜5cmの発泡体で囲み、−80℃の冷凍庫中に置いた。
残りのプレートのセットを、ステップ9(上記)に記載の通り維持した。全ての細胞分割は、培地除去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチングならびに細胞分散ステップを含む自動化液体ハンドリングステップを使用して行った。
全ての細胞集団について、細胞および培養条件の一貫性および基準化を照合した。増殖速度のわずかな差によるプレート間のいかなる差も、プレート全体の細胞数の定期的な正規化によって照合されたはずである。
細胞を6〜8週間の細胞培養に維持して、これらの条件下でin vitro進化させた。この期間中、本発明者らは大きさ、形態、脆弱性、トリプシン化もしくは解離に対する応答、解離後の円形度/平均円形度、生存百分率、微小集密傾向、または培養プレート表面への接着性などの細胞維持の他の特徴を観察した。
機能的基準を使用して細胞集団を試験した。膜電位アッセイキット(Molecular Devices/MDS)を、製造業者の使用説明書に従って使用した。細胞を、多数の異なる密度で96または384ウェルプレートにおいて試験し、応答を分析した。プレーティング後の様々な時点、例えば、プレーティング後12〜48時間を使用した。異なる密度のプレーティングについてもまた、アッセイ応答の違いについて試験した。
低い継代数およびより高い継代数で行った実験の機能的応答を比較して、3〜9週間の範囲の所定の期間にわたって最も一貫した応答を有する細胞を同定した。形態、微小集密傾向、およびプレーティング後に培養基質に付着するまでの時間を含む、時間をわたって変化した細胞の他の特徴もまた書き留める。
機能的なおよび他の基準を満たす細胞集団をさらに評価して、生存可能で、安定かつ機能的な細胞系を作製するのに最も扱いやすい細胞集団を決定した。選択した細胞集団を、より大きい組織培養容器において拡大増殖させ、上記の特徴付けステップをこれらの条件下で継続または反復した。この時点で、一貫した信頼性のある継代のために、追加の基準化ステップを導入した。これらのステップは、種々のプレーティング細胞密度、継代時間、培養皿のサイズ/フォーマットおよびコーティング、フルイディクス最適化、細胞解離の最適化(型、使用する量、および時間の長さ)、ならびに洗浄ステップを含んでいた。培養下で4週間にわたって数日毎に試験した場合、アッセイZ’スコアは安定であった。
最終的な細胞系および予備の細胞系に対応する低継代の凍結プレート(上記参照)を37℃で融解し、ハムF12/10%FBSで2回洗浄し、加湿した37℃/5%CO2条件においてインキュベートした。次いで細胞を2〜3週間拡大増殖させた。それぞれ1000万個の細胞を有する25個のバイアルからなる各最終および予備細胞系の細胞バンクを確立した。
細胞バンクの少なくとも1つのバイアルを融解し、培養下で拡大増殖させた。得られた細胞を、それらがもともと選択された理由となった同じ特徴を満たすことを確認するために試験した。
GABAリガンドに対するGABAA細胞系の応答の検証
GABAA(α1β3γ2s(α1)、α2β3γ2s(α2)、α3β3γ2s(α3)およびα5β3γ2s(α5)のサブユニットの組合せ)GABA、内因性GABAAリガンドを発現しているCHO細胞系の応答を評価した。細胞系のGABAとの相互作用を、以下のプロトコールを使用して、GABAに対する応答においてGABAAの膜電位を測定することによって評価した。
公知のGABAAモジュレーターを使用したGABAA細胞系のさらなる検証
GABAA細胞系および膜電位アッセイを、実施例2に記載の方法によって、30μM、10μM、3μM、1μM、300nM、100nMおよび30nMのビククリン(公知のアンタゴニスト)のアッセイバッファーにおける段階希釈液を使用して検証した。
膜電位アッセイを使用した天然のGABAA機能についてのGABAA発現細胞系の特徴付け
GABAA(α1β3γ2s(α1)、α2β3γ2s(α2)、α3β3γ2s(α3)およびα5β3γ2s(α5)のサブユニットの組合せ)発現CHO細胞系の、LOPAC1280(Library of Pharmacologically Active Compounds)由来の1280種の化合物との相互作用を評価した(Sigma−RBI Prod.No.LO1280)。LOPAC1280ライブラリーは、文書により十分に立証された薬理学的活性を有する高純度の小有機リガンドを含む。細胞系の試験化合物との相互作用を、以下のプロトコールを使用して、試験化合物に対する応答においてGABAAの膜電位を測定することによって評価した。
作製したGABAA細胞系に対する各化合物の活性を測定し、GABA(内因性リガンド)以上の活性を示す化合物を陽性ヒットとしてスコアを付けた。スクリーニングした1280種の化合物のうち34種が、GABAより良いとは言わないが同程度に少なくとも1つの細胞系(すなわち、α1、α2、α3およびα5のいずれか)を活性化した。これらの化合物のうち17種の、作製したGABAA細胞系との相互作用を以下の用量反応試験において確認した。GABAが存在する必要があるモジュレーター、部分的アゴニストおよび低力価化合物は一覧表に含めなかった。
電気生理学的アッセイを使用した天然のGABAA機能についてのGABAA−CHO細胞の特徴付け
以下の電圧固定プロトコールを使用した:膜電位を−60mVの保持電位に固定した。バッファーで中間洗浄をしてGABA濃度を増加させながら(0.10〜100μM)2秒の印加によって、電流を誘発した。
ハロゲン化物感受性meYFPを使用した天然のGABAA機能についての細胞内リードアウトアッセイの特徴付け
GABAA(α1β3γ2s(A1)、α2β3γ2s(A2)、α3β3γ2s(A3)およびα5β3γ2s(A5)のサブユニットの組合せ)を発現している本発明のCHO細胞の、試験化合物に対する応答を、細胞内リードアウトアッセイのための以下のプロトコールを使用して評価した。
安定なGC−C発現細胞系の作製
293T細胞を、標準的な技術を使用してヒトGC−C遺伝子(配列番号GCC3)をコードするプラスミドでトランスフェクトした。(宿主細胞中に核酸を誘導するために使用することができる試薬の例は、LIPOFECTAMINE(商標)、LIPOFECTAMINE(商標)2000、OLIGOFECTAMINE(商標)、TFX(商標)試薬、FUGENE(登録商標)6、DOTAP/DOPE,MetafectineまたはFECTURIN(商標)を含むがこれらに限定されない。)
本発明の方法において薬剤選択は任意であるが、本発明者らはヒトGC−C遺伝子をコードするプラスミド中に1つの薬剤耐性マーカーを含めた。GC−C配列は、CMVプロモーターの制御下にあった。シグナルリングプローブによる検出用のタグをコードしている非翻訳配列もまた、薬剤耐性マーカーをコードしている配列に加えて存在していた。利用した標的配列は、GC−C標的配列1(配列番号GCC1)であった。この実施例において、GC−C遺伝子含有ベクターはGC−C標的配列1を含んでいた。
クローンスクリーニング:アッセイ48時間前に集密96ウェルプレートの1:2および1:3分割、30分のグアニリン処理。
天然のGC−C機能についての細胞系の特徴付け
cGMP検出のための競合的ELISAを使用して、作製したGC−C発現細胞系における天然のGC−C機能を特徴付けした。GC−C発現細胞を、10%ウシ胎仔血清、グルタミンおよびHEPESを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で標準的な細胞培養条件下に維持し、T175cmフラスコにおいて増殖させた。ELISAのために、細胞をコート96ウェルプレート(ポリ−D−リシン)にプレーティングした。
細胞を無血清培地で2回洗浄し、1mMのIBMXとともに30分間インキュベートした。次いで望ましい活性化剤(すなわち、グアニリン、0.001〜40μM)を細胞に添加し、30〜40分間インキュベートした。上清を除去し、細胞をTBSバッファーで洗浄した。細胞を0.1NのHClで溶解した。これに続いて0.1NのHClで溶解し、−20℃/室温で凍結/融解サイクルを行った。解凍した溶解物(試料をエッペンドルフチューブ中で10000rpmでスピンした)を遠心分離にかけて、細胞破片をペレット化した。次いで、透明になった上清溶解物をELISAプレートに移した。
別途指定のない限り、室温で以下のステップの全てを行った。ELISAプレートを、コーティングバッファー(炭酸/重炭酸Naバッファー、0.1M最終、pH9.6)において抗IgG抗体により4℃で一晩コートした。次いでプレートを洗浄バッファー(TBS−Tween20、0.05%)で洗浄し、その後ブロッキング試薬を添加した。ブロッキング試薬とともに37℃で1時間インキュベーション後、プレートを洗浄バッファーで洗浄した。次いでウサギ抗cGMPポリクローナル抗体(Chemicon)を加え、その後1時間インキュベーションし、続いて洗浄バッファーで洗浄した。次いで細胞溶解物を加え、1時間インキュベートした後に続いてcGMP−ビオチンコンジュゲート(1および10nMの8−ビオチン−AET−cGMP(Biolog))を添加した。プレートを2時間インキュベートし、次いで洗浄バッファーで洗浄した。ストレプトアビジン−アルカリホスフェートを次いで添加し、1時間インキュベートし、次いで洗浄バッファーで洗浄した。プレートを、PNPP基質(Sigma)と少なくとも1時間(好ましくは2〜5時間)インキュベートした。次いで吸光度をSAFIRE2(商標)プレートリーダー(Tecan)において405nmで読み取った。
GC−C発現細胞系Z’値の生成
作製したGC−C発現細胞系のZ’を、直接競合ELISAアッセイを使用して計算した。ELISAはDirect Cyclic GMP Enzyme Immunoassay Kit(Cat.900〜014;AssayDesigns,Inc.)を使用して行った。特に、Z’アッセイでは、96ウェルアッセイプレート中の24個の陽性対照ウェル(160000または200000細胞/ウェルの密度でプレーティングした)を、DMEM培地において40μMグアニリンのGC−C活性化カクテルおよびIBMXで30分間試験した。96ウェルアッセイプレートの体積および表面積を考慮すると、この量のグアニリンは、Forteら(1999年)Endocr.140(4)、1800〜1806頁によって使用された10μMに匹敵する濃度をもたらす。DMEM/IMBXにおいてクローン細胞を含有する同数のウェルを、ビヒクル単独で(アクチベーターの不在下で)試験した。2つの条件における吸光度(cGMPレベルに対応)を、SAFIRE2(商標)プレートリーダー(Tecan)を使用して監視した。2つの条件における平均および標準偏差を計算し、Zhangら、J Biomol Screen、4(2):67〜73頁(1999年))の方法を使用してZ’をコンピューターで計算した。作製したGC−C発現細胞系のZ’値を0.72と決定した。
短絡電流測定
GC−C発現細胞(初代または不死化上皮細胞、例えば、肺、腸、乳房、子宮、または腎臓の)を培養インサート(Snapwell、Corning Life Sciences)上にプレーティングして7〜14日後に、ウッシングチャンバー実験を行った。培養インサート上の細胞をすすぎ、ウッシング型装置(EasyMount Chamber System、Physiologic Instruments)中にマウントし、(mMで)120NaCl、25NaHCO3、3.3KH2PO4、0.8K2HPO4、1.2CaCl2、1.2MgCl2、および10グルコースを含む、連続的にガスが供給され37℃に維持されているリンゲル液(O2中5%CO2、pH7.4)に浸した。ヘミチャンバーをマルチチャネル電圧電流クランプ(VCC−MC8、Physiologic Instruments)に接続する。電極[寒天橋(1M KCl中4%)Ag−AgCl]を使用し、インサートを0mVに電圧固定する。経上皮電流、電圧および抵抗を、実験継続中10秒毎に測定する。200mOhm未満の抵抗を有する膜を廃棄する。この第2のアッセイは、適切な細胞型(すなわち、緊密な連結を形成する細胞)において導入されたGC−CはCFTR活性を変化させ、また経上皮電流を調節しているという確証を与え得る。
安定なCFTR発現細胞系の作製
発現構築体の作製
pCMV−SCRIPT(Stratagene)に基づいて、合理的なクローニングを可能にするプラスミド発現ベクターを作製し、CMVおよびSV40真核生物プロモーター;SV40およびHSV−TKポリアデニル化配列;マルチクローニング部位;Kozak配列;ならびに薬剤耐性カセットを含む、対象とする遺伝子の転写および翻訳に必要な様々な構成要素を含めた。
ステップ1:トランスフェクション
CHO細胞を、標準的な技術を使用してヒトCFTR(配列番号CFTR1)をコードするプラスミドでトランスフェクトした。(宿主細胞中に核酸を誘導するために使用することができる試薬の例は、LIPOFECTAMINE(商標)、LIPOFECTAMINE(商標)2000、OLIGOFECTAMINE(商標)、TFX(商標)試薬、FUGENE(登録商標)6、DOTAP/DOPE,MetafectineまたはFECTURIN(商標)を含むがこれらに限定されない。)
本発明の細胞または細胞系を作製するために薬剤選択は任意であるが、本発明者らはプラスミド中に1つの薬剤耐性マーカーを含めた(すなわち、ピューロマイシン)。CFTR配列は、CMVプロモーターの制御下にあった。シグナルリングプローブによる検出用のCFTR標的配列をコードしている非翻訳配列もまた、薬剤耐性マーカーをコードしている配列に加えて存在していた。利用された標的配列はCFTR標的配列1(配列番号CFTR2)であり、この実施例において、CFTR遺伝子含有ベクターはCFTR標的配列1(配列番号CFTR2)を含んでいた。
トランスフェクトした細胞を、抗生物質を含まないハムF12−FBS培地中で2日間、続いて12.5μg/mlのピューロマイシン含有ハムF12−FBS培地中で10日間増殖させた。次いで細胞を残りの時間、シグナルリングプローブ添加の前に、抗生物質を含まないハムF12−FBS培地に移した。
抗生物質での集積に続いて、抗生物質選択の不在下で細胞を5〜14回継代培養し、治まるまでの選択期間にわたって、不安定な発現のための時間を与えた。
細胞を回収し、標準的な技術を使用してCFTRシグナルリングプローブ1(配列番号CFTR3)でトランスフェクトした。(宿主細胞中に核酸を誘導するために使用することができる試薬の例は、LIPOFECTAMINE(商標)、LIPOFECTAMINE(商標)2000、OLIGOFECTAMINE(商標)、TFX(商標)試薬、FUGENE(登録商標)6、DOTAP/DOPE,MetafectineまたはFECTURIN(商標)を含むがこれらに限定されない。)CFTRシグナルリングプローブ1(配列番号CFTR3)は、CFTR標的配列1(配列番号CFTR2)に結合した。次いで細胞を分析のために回収し、蛍光活性化セルソーターを使用して選別した。
蛍光活性化セルソーターを使用した分析および選別のために、細胞を解離させ、回収した。標準的な分析方法を使用して、バックグラウンドを超える蛍光を発している細胞を通過させ、バーコード付き96ウェルプレート中のゲートに入った個々の細胞を単離した。以下のゲートの階層を使用した:プロットFAM対Cy5においてコインシデンスゲート→シングレットゲート→ライブゲート→ソートゲート:0.1〜0.4%の細胞。
より多くの細胞を得るために、ステップ1〜5および/または3〜5を繰り返した。ステップ1〜5の2回のラウンドを行い、これらの各ラウンドについて、2回のステップ3〜5の内部サイクルを行った。
プレートを、Microlab Star(Hamilton Robotics)へ移した。細胞を、100単位/mlのペニシリンおよび0.1mg/mlのストレプトマイシンを添加した、新しい完全増殖増殖培地および2〜3日馴化した増殖培地の1:1の混合物100μl中で9日間インキュベートした。次いで1回または2回のトリプシン化により分散させて塊を最小化し、その後新しい96ウェルプレートに移した。プレートを画像化してウェルの集密度を決定した(Genetix)。プレート全体での確実な画像取得のために、各プレートに焦点を合わせた。記録された集密度が70%を超えるものは、信頼性なしとした。集密度の測定値は、分散後1〜10日の連続した日に取得し、増殖速度を計算するために使用した。
ステップ7における分散ステップ後2週間未満の増殖速度によって細胞を区分した(独立して群に分け、コホートとしてプレーティングした)。それぞれの3つの増殖区分を個々の96ウェルプレートに分けたが、いくつかの増殖区分は複数の96ウェルプレートになった。増殖速度の隔たりを考慮することおよび細胞集団の総数の高い割合を一括して扱うことによって、区分を計算した。区分を計算して、増殖速度の12〜16時間での差をコンピューターに取り込んだ。
正規化した一定条件(すなわち、ハムF12−FBS培地、37℃/5%CO2)下で、抗生物質なしでプレートをインキュベートした。細胞のプレートを、4セットの96ウェルプレート(3セットは凍結用、1セットはアッセイおよび継代用)を生じるように分割した。それぞれのプレートのセットについて、異なる別の組織培養試薬、インキュベーター、担当者および二酸化炭素発生源を使用した。全ての組織培養試薬の適切な作製および品質を確実にするために、品質管理ステップを行った:使用するために調製された培地の各ボトルに添加された各成分培地は、1つの指定されたフードにおいて1人の指定された個人が、このフードにおいてはその試薬だけを用いて添加し、第2の指定された個人がミスを回避するために監視した。液体ハンドリングの条件は、ウェル間のクロスコンタミネーションを除去するように設定した。全てのステップについて新しいチップを使用するか、またはストリンジェントなチップ洗浄プロトコールを使用した。正確な容量の移し替え、効率的な細胞操作、洗浄サイクル、ピペッティング速度および配置、細胞分散のためのピペッティングサイクル数、ならびにチップのプレートに対する相対的位置のために、液体ハンドリング条件を設定した。
3セットのプレートを−70〜−80℃で凍結した。セットのプレートを、まず70〜100%の集密度に到達させた。培地を吸引し、90%FBSおよび10%DMSOを添加した。プレートをパラフィルムで個々にシールし、1〜5cmの発泡体で個々に囲み、その後−80℃の冷凍庫中に置いた。
残りのプレートのセットを、ステップ9に記載の通り維持した。全ての細胞分割は、培地除去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチングならびに細胞分散ステップを含む自動化液体ハンドリングステップを使用して行った。
全ての細胞集団について、細胞および培養条件の一貫性および基準化を照合した。増殖速度のわずかな差によるプレート間の差は、プレート全体の細胞数の定期的な正規化によって照合され、リアレイ後8継代毎に生じた。アウトライアーである細胞集団を検出して排除した。
細胞をリアレイ後6〜10週間培養下に維持して、これらの条件下でin vitro進化させた。この期間中、本発明者らは大きさ、形態、微小集密度傾向、脆弱性、トリプシン化に対する応答およびトリプシン化後の平均円形度、または培養プレート表面への接着性および液体添加時のブローオフ耐性などの細胞維持の他の特徴を観察した。
機能的基準を使用して細胞集団を試験した。膜電位色素キット(Molecular Devices、MDS)を、製造業者の使用説明書に従って使用した。
低い継代数およびより高い継代数で行った実験の機能的反応を比較して、所定の期間(例えば、3〜9週間)にわたって最も一貫した反応を有する細胞を同定する。時間をわたって変化する他の細胞の特徴もまた書き留める。
機能的なおよび他の基準を満たす細胞集団をさらに評価して、生存可能で、安定かつ機能的な細胞系を作製するのに最も扱いやすい細胞集団を決定する。選択した細胞集団を、より大きい組織培養容器において拡大増殖させ、上記の特徴付けステップをこれらの条件下で継続または反復する。この時点で、一貫した信頼性のある継代のために、種々の細胞密度;プレーティング時間;細胞培養継代の長さ;細胞培養皿フォーマットおよびコーティング;速度およびせん断力を含むフルイディクス最適化;継代時間;および洗浄ステップなどのさらなる基準化ステップを導入する。
最終的な細胞系および予備の細胞系に対応する低継代の凍結ストックを37℃で融解し、ハムF12−FBSで2回洗浄し、次いでハムF12−FBS中でインキュベートする。次いで細胞を2〜4週間拡大増殖させる。各最終および予備細胞系のクローンの細胞バンクを確立し、各クローン細胞について25個のバイアルを低温保存する。
細胞バンクの少なくとも1つのバイアルを融解し、培養下で拡大増殖させる。得られた細胞を、それらがもともと選択される理由となる同じ特徴を満たすかどうかを判定するために試験する。
天然のCFTR機能についての安定な細胞系の特徴付け
作製した安定なCFTR発現細胞系における天然のCFTR機能を特徴付けるために、本発明者らは、高スループット適合性蛍光膜電位アッセイを使用した。
CFTR細胞ベースアッセイのZ’値の決定
作製した安定なCFTR発現細胞系についてのZ’値を、高スループット適合性蛍光膜電位アッセイを使用して計算した。実施例13のプロトコールに実質的に従って、蛍光膜電位アッセイプロトコールを行った。特に、Z’アッセイでは、384ウェルアッセイプレート中の24個の陽性対照ウェル(15000細胞/ウェルの密度でプレーティングした)を、フォルスコリンのCFTR活性化カクテルおよびIBMXで試験した。同数のウェルを、ビヒクル単独でおよびDMSOを含有して(アクチベーターの不在下で)試験した。2つの条件における細胞応答を、蛍光プレートリーダー(Hamamatsu FDSS)を使用して監視した。2つの条件における平均および標準偏差を計算し、Zhangら、J Biomol Screen、4(2):67〜73頁(1999年)に開示されている方法を使用してZ’をコンピューターで計算した。作製した安定なCFTR発現細胞系のZ’値を0.82以上と決定した。
CFTRモジュレーターの高スループットスクリーニングおよび同定
高スループット適合性蛍光膜電位アッセイを使用して、CFTRモジュレーターをスクリーニングおよび同定する。アッセイの前日に、細胞をストックプレートから抗生物質を含まない増殖培地中に回収し、黒色透明底384ウェルアッセイプレート中にプレーティングする。アッセイプレートを、37℃の細胞培養インキュベーター中に5%CO2下で19〜24時間維持する。次いで培地をアッセイプレートから除去し、ロードバッファー(137mMのNaCl、5mMのKCl、1.25mMのCaCl2、25 mMのHEPES、10mMのグルコース)中で希釈した青色膜電位色素(Molecular Devices Inc.)を添加し、細胞を37℃で1時間インキュベートする。試験化合物を、ジメチルスルホキシドにおいて可溶化し、アッセイバッファー(137mMのグルコン酸ナトリウム、5mMのグルコン酸カリウム、1.25mMのCaCl2、25mMのHEPES、10mMのグルコース)中に希釈し、次いで384ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに載せる。細胞および化合物プレートを蛍光プレートリーダー(Hamamatsu FDSS)に載せ、3分間運転して試験化合物活性を同定する。次いで機器は、300nM〜1μMの濃度のフォルスコリン溶液を細胞に添加して、事前に添加された化合物のモジュレーターまたはブロッカー活性を観察できるようにする。化合物の活性を、試験化合物の細胞への添加後および/またはその後のアゴニスト添加後に生じた蛍光の変化を測定することによって決定する。
短絡電流測定を使用した天然のCFTR機能についての安定なCFTR発現細胞系の特徴付け
CFTR発現細胞(肺および腸を含むがこれらに限定されない初代または不死化上皮細胞)を培養インサート(Snapwell、Corning Life Sciences)上にプレーティングして7〜14日後に、ウッシングチャンバー実験を行った。培養インサート上の細胞をすすぎ、ウッシング型装置(EasyMount Chamber System、Physiologic Instruments)中にマウントし、120mMのNaCl、25mMのNaHCO3、3.3mMのKH2PO4、0.8mMのK2HPO4、1.2mMのCaCl2、1.2mMのMgCl2、および10mMのグルコースを含む、連続的にガスが供給され37℃に維持されているリンゲル液(O2中5%CO2、pH7.4)に浸す。ヘミチャンバーをマルチチャネル電圧電流クランプ(VCC−MC8 Physiologic Instruments)に接続する。電極[寒天橋(1M KCl中4%)Ag−AgCl]を使用し、インサートを0mVに電圧固定する。経上皮電流、電圧および抵抗を、実験継続中10秒毎に測定する。200mΩ未満の抵抗を有する膜を廃棄する。
電気生理学的アッセイを使用した天然のCFTR機能についての安定なCFTR発現細胞系の特徴付け
手作業による、および自動化された電気生理学アッセイがともに開発されており、両方ともこの系をアッセイするために適用することができるが、下記が手作業によるパッチクランプ実験のためのプロトコールである。
安定なNaV1.7ヘテロ三量体発現細胞系の作製
発現構築体の作製
pCMV−SCRIPT(Stratagene)に基づいて、合理的なクローニングを可能にするプラスミド発現ベクターを作製し、CMVおよびSV40真核生物プロモーター;SV40およびHSV−TKポリアデニル化配列;マルチクローニング部位;Kozak配列;ならびにネオマイシン/カナマイシン耐性カセット(またはアンピシリン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン耐性カセット)を含む、対象とする遺伝子の転写および翻訳に必要な様々な構成要素を含めた。
ステップ1:トランスフェクション
標準的な技術を使用して、293T細胞を、1つはヒトNaV1.7αサブユニット(配列番号NAV−1)をコードしており、1つはヒトNaV1.7β1サブユニット(配列番号NAV−2)をコードしており、もう1つはヒトNaV1.7β2サブユニット(配列番号NAV−3)をコードしている3つの別個のプラスミドで同時トランスフェクトした。(宿主細胞中に核酸を誘導するために使用することができる試薬の例は、LIPOFECTAMINE(商標)、LIPOFECTAMINE(商標)2000、OLIGOFECTAMINE(商標)、TFX(商標)試薬、FUGENE(登録商標)6、DOTAP/DOPE,MetafectineまたはFECTURIN(商標)を含むがこれらに限定されない。)
本発明の細胞または細胞系を作製するために薬剤選択は任意であるが、本発明者らはプラスミド当たり1つの薬剤耐性マーカーを含めた。配列は、CMVプロモーターの制御下にあった。シグナルリングプローブによる検出用のNaV標的配列をコードしている非翻訳配列もまた、薬剤耐性マーカーをコードしている配列に加えて存在していた。利用されたNaV標的配列は、NaV標的配列1(配列番号NAV−4)、NaV標的配列2(配列番号NAV−5)およびNaV標的配列3(配列番号NAV−6)であった。この実施例において、NaV1.7αサブユニット遺伝子含有ベクターはNaV標的配列1(配列番号NAV−4)を含み、NaV1.7β1サブユニット遺伝子含有ベクターはNaV標的配列2(配列番号NAV−5)を含み、NaV1.7β2サブユニット遺伝子含有ベクターはNaV標的配列3(配列番号NAV−6)を含んでいた。
トランスフェクトした細胞を、DMEM−FBS培地中で2日間、続いて抗生物質含有DMEM−FBS培地中で10日間増殖させた。抗生物質含有期間は、以下の通り抗生物質を培地に添加した:ピューロマイシン(0.1μg/ml)、ハイグロマイシン(100μg/ml)、およびゼオシン(200μg/ml)。
抗生物質での集積に続いて、抗生物質選択の不在下で細胞を6〜18回継代培養し、治まるまでの選択期間にわたって、不安定な発現のための時間を与えた。
細胞を回収し、標準的な技術を使用してシグナルリングプローブ(配列番号NAV−7、NAV−8、NAV−9)でトランスフェクトした。(宿主細胞中に核酸を誘導するために使用することができる試薬の例は、LIPOFECTAMINE(商標)、LIPOFECTAMINE(商標)2000、OLIGOFECTAMINE(商標)、TFX(商標)試薬、FUGENE(登録商標)6、DOTAP/DOPE,MetafectineまたはFECTURIN(商標)を含むがこれらに限定されない。)
NaVシグナルリングプローブ1(配列番号NAV−7)はNaV標的配列1(配列番号NAV−4)に結合し、NaVシグナルリングプローブ2(配列番号NAV−8)はNaV標的配列2(配列番号NAV−5)に結合し、NaVシグナルリングプローブ3(配列番号NAV−9)はNaV標的配列3(配列番号NAV−6)に結合した。次いで分析のために細胞を解離させ、回収し、蛍光活性化セルソーターを使用して選別した。
NaV1.7サブユニット遺伝子導入には、以下のタグ配列を使用した。
標準的な分析方法を使用して、バックグラウンドを超える蛍光を発している細胞を通過させ、96ウェルプレートの所定のゲートに直接入った細胞を単離した。フローサイトメトリーによる細胞選別は、1ウェル当たり1個の細胞が入るように操作した。選択後、細胞を薬剤を含まない培地中で拡大増殖させた。以下のゲートの階層を使用した:プロットFAM対Cy5においてコインシデンスゲート→シングレットゲート→ライブゲート→ソートゲート:0.1〜1.0%の生細胞。
より多くの細胞を得るために、ステップ1〜5および/または3〜5を繰り返した。ステップ1〜5の独立した少なくとも4回のラウンドを終了させ、これらの各サイクルについて、各独立したラウンドについて少なくとも2回のステップ3〜5の内部サイクルを行った。
プレートを、Microlabstar自動化液体ハンドラー(Hamilton Robotics)へ移した。細胞を、100単位/mlのペニシリンおよび0.1mg/mlのストレプトマイシンを添加した、新しい完全増殖培地(DMEM/10%FBS)および2〜3日馴化した増殖培地の1:1の混合物中で5〜7日間インキュベートした。次いでトリプシン化により分散させて塊を最小化し、新しい96ウェルプレートに移した。クローンを分散させた後、プレートを画像化してウェルの集密度を決定した(Genetix)。プレート全体での確実な画像取得のために、各プレートに焦点を合わせた。記録された集密度が70%を超えるものは、信頼性なしとした。集密度の測定値は、9日間(すなわち、分散後1〜10日)にわたって3日間毎に取得し、増殖速度を計算するために使用した。
ステップ7における分散ステップ後10〜11日間の増殖速度によって細胞を区分した(独立して群に分け、コホートとしてプレーティングした)。下流のハンドリングのために区分を独立して回収し、個々の96ウェルプレート上にプレーティングしたが、いくつかの増殖区分は複数の96ウェルプレートを生じた。増殖速度の隔たりを考慮することおよび細胞集団の総数の高い割合を一括して扱うことによって、区分を計算した。ステップ5に記載の選別の反復に応じて、5〜9個の増殖区分を1〜4日の区画とともに使用した。したがって各区分は、繰返しに応じて8〜14.4時間の増殖速度または集団倍加時間に対応していた。
標準的な一定条件(加湿された37℃の、5%CO2)下で、抗生物質を含まないDMEM−10%FBS培地中でプレートをインキュベートした。細胞のプレートを、4セットの標的プレートを生じるように分割した。これらの4セットのプレートは、全増殖区分を有する全プレートを含んでいたため、最初のセットの4個の複製が確実に存在していた。3個までの標的プレートセットを低温保存に付し(ステップ10に記載)、継代および機能アッセイ実験のために残りのセットを拡大し、さらにレプリカをプレーティングした。下流のレプリカプレートについて、異なる別の組織培養試薬、インキュベーター、担当者および二酸化炭素発生源を使用した。全ての組織培養試薬の適切な作製および品質を確実にするために、品質管理ステップを行った:使用するために調製された培地の各ボトルに添加された各成分培地は、1つの指定されたフードにおいて1人の指定された個人が、このフードにおいてはその試薬だけを用いて添加し、第2の指定された個人がミスを回避するために監視した。液体ハンドリングの条件は、ウェル間のクロスコンタミネーションを除去するように設定した。全てのステップについて新しいチップを使用するか、またはストリンジェントなチップ洗浄プロトコールを使用した。正確な容量の移し替え、効率的な細胞操作、洗浄サイクル、ピペッティング速度および配置、細胞分散のためのピペッティングサイクル数、ならびにチップのプレートに対する相対的位置のために、液体ハンドリング条件を設定した。
3セットのプレートを−70〜−80℃で凍結した。各セットのプレートを、まず70〜80%の集密度に到達させた。培地を吸引し、90%FBSおよび5%〜10%のDMSOを添加した。プレートをパラフィルムでシールし、1〜5cmの発泡体で個々に囲み、その後−80℃冷凍庫中に置いた。
残りのプレートのセットを、ステップ9に記載の通り維持した。全ての細胞分割は、培地除去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチングならびに細胞分散ステップを含む自動化液体ハンドリングステップを使用して行った。いくつかのアッセイプレーティングステップでは、細胞をトリプシンではなく細胞解離バッファー(例えば、CDB、InvitrogenまたはCellStripper、CellGro)で解離させた。
全ての細胞集団について、細胞および培養条件の一貫性および基準化を照合した。増殖速度のわずかな差によるプレート間の差を、2〜8継代毎にプレート全体の細胞数の定期的な正規化によって照合した。アウトライアーである細胞集団を検出して排除した。
細胞を3〜8週間維持して、これらの条件下でin vitro進化させた。この期間中、本発明者らは大きさ、形態、脆弱性、トリプシン化もしくは解離に対する反応、解離後の円形度/平均円形度、生存百分率、微小集密度傾向、または培養プレート表面への接着性などの細胞維持の他の特徴を観察した。
機能的基準を使用して細胞集団を試験した。膜電位アッセイキット(Molecular Devices/MDS)を、製造業者の使用説明書に従って使用した。細胞を、多数の異なる密度で96または384ウェルプレートにおいて試験し、反応を分析した。プレーティング後の様々な時点、例えば、プレーティング後12〜48時間を使用した。異なる密度のプレーティングもまた、アッセイ反応の違いについて試験した。
低い継代数およびより高い継代数で行った実験の機能的反応を比較して、3〜9週間の範囲の所定の期間にわたって最も一貫した反応を有する細胞を同定した。時間をわたって変化した他の細胞の特徴もまた書き留めた。
機能的なおよび他の基準を満たす細胞集団をさらに評価して、生存可能で、安定かつ機能的な細胞系を作製するのに最も扱いやすい細胞集団を決定した。選択した細胞集団を、より大きい組織培養容器において拡大増殖させ、上記の特徴付けステップをこれらの条件下で継続または反復した。この時点で、一貫した信頼性のある継代のために、種々のプレーティング細胞密度;継代時間;培養皿のサイズ/フォーマットおよびコーティング);フルイディクス最適化;細胞解離の最適化(例えば、型、使用する量、および時間の長さ);および洗浄ステップなどのさらなる基準化ステップを導入した。基準化のために温度差もまた使用した(すなわち、30℃対37℃)。
最終的な細胞系および予備の細胞系に対応する上述した低継代の凍結プレートを37℃で融解し、DMEM−10%FBSで2回洗浄し、加湿した37℃/5%CO2条件においてインキュベートした。次いで細胞を2〜3週間拡大増殖させた。15〜20個のバイアルからなる各最終および予備細胞系の細胞バンクを確立した。
以下のステップもまた、細胞系が生存可能で安定かつ機能的であることを確認するために実施することができる。細胞バンクの少なくとも1つのバイアルを融解し、培養下で拡大増殖させる。得られた細胞を、それらがもともと選択される理由となった同じ特徴を満たすかどうかを判定するために試験した。
安定なNaV1.7発現細胞系における異種NaV1.7サブユニットの相対的発現の特徴付け
定量的RT−PCR(qRT−PCR)を使用して、作製した安定なNaV1.7発現細胞系における異種ヒトNaV1.7α、β1、およびβ2サブユニットの相対的発現を決定した。RNA抽出キット(RNeasy Mini Kit、Qiagen)を使用して、1〜3×106個の哺乳動物細胞から全RNAを精製した。厳密なDNase処理プロトコール(TURBO DNA−free Kit、Ambion)に従ってDNase処理を行った。逆転写酵素キット(SuperScript III、Invitrogen)を使用して、20μLの反応量で1μgのDNAフリー全RNAおよび250ngのランダムプライマー(Invitrogen)を用いて最初のcDNA鎖合成を行った。逆転写酵素を含まない試料およびRNAを含まない試料を、この反応の陰性対照として使用した。サーマルサイクラー(Mastercycler、Eppendorf)において以下の条件で合成を行った:25℃で5分、50℃で60分;反応停止は70℃で15分間行った。
電気生理学的アッセイを使用した天然のNaV機能についての安定なNaV1.7発現細胞系の特徴付け
自動化パッチ−クランプシステムを使用して、作製した安定なNaV1.7α、β1およびβ2サブユニット発現HEK293T細胞系からのナトリウム電流を記録した。以下に説明したプロトコールもまた、QPatch、SophionまたはPatchliner、Nanion systemsに使用することができる。細胞外リンゲル液は、室温で140mMのNaCl、4.7mMのKCl、2.6mMのMgCl2、11mMのグルコースおよび5mMのHEPES、pH7.4を含有していた。細胞内リンゲル液は、120mMのCsF、20mMのCs−EGTA、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2、および10mMのHEPES、pH7.2を含有していた。実験は室温で実施した。
膜電位アッセイを使用した天然のNaV機能についての安定なNaV1.7発現細胞系の特徴付け
作製した安定なNaV1.7α、β1およびβ2サブユニット発現細胞を、10%ウシ胎仔血清、グルタミンおよびHEPESを添加したダルベッコ改変イーグル培地中で標準的な細胞培養条件下に維持した。アッセイ前日に、細胞解離バッファー、例えば、CDB(GIBCO)または細胞剥離剤(Mediatech)を使用して細胞をストックプレートから回収し、増殖培地中384ウェルプレートに10000〜25000細胞/ウェルでプレーティングした。アッセイプレートを、37℃の細胞培養インキュベーター中に5%CO2下で22〜24時間維持した。次いで培地をアッセイプレートから除去し、ロードバッファー(137mMのNaCl、5mMのKCl、1.25mMのCaCl2、25 mMのHEPES、10mMのグルコース)中で希釈した青色蛍光膜電位色素(Molecular Devices Inc.)を添加した。細胞を青色膜電位色素とともに37℃で1時間インキュベートした。次いでアッセイプレートを高スループット蛍光プレートリーダー(Hamamastu FDSS)に載せた。蛍光プレートリーダーは、1秒に1回撮られた細胞プレートの画像中の細胞蛍光を測定し、相対蛍光単位としてデータを表示する。
NaV1.7のβサブユニットによるαサブユニットの制御の特徴付け
βサブユニットによるαサブユニット遺伝子発現の制御
HEK293T細胞のプールを操作して、それぞれのプラスミドDNAまたはαおよび対照プラスミドのモル比(例えば、α:β1:β2=1:1:1)を操作することによって、様々な比のαおよびβサブユニットを発現させた。薬剤選択後、6個の異なる細胞プールにおけるサブユニット発現を、実施例19に記載のqRT−PCRによって評価した。比較qRT−PCRは、3つ全てのヒトNaV1.7サブユニット(すなわち、α、β1、およびβ2)を同時トランスフェクトした場合に、αサブユニットおよび対照プラスミドのみをトランスフェクトした場合と比較して、薬剤選択された細胞検出におけるαサブユニット発現が増加することを示した。βサブユニット転写産物の存在はαサブユニット遺伝子発現に影響を及ぼし、生理学的に適切な機能アッセイで3つ全てのNaV1.7サブユニットを同時発現することの重要性を示している。
膜電位細胞ベースアッセイを使用して、3つ全てのNaV1.7サブユニット(すなわち、α、β1、およびβ2)を安定に同時発現している細胞およびNaV1.7αサブユニットのみを安定に発現している対照細胞の、試験化合物に対する応答を測定した。実施例21のプロトコールに実質的に従って行った膜電位アッセイにおいて、2つの化合物(すなわち、C18およびK21)を試験した。特にこの実施例では、試験化合物を最初の添加ステップにおいて添加した。
対象とするヘテロ二量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする導入核酸から該対象とするヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするヘテロ二量体タンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目2)
対象とするヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、該対象とするヘテロ二量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするヘテロ二量体タンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目3)
対象とするヘテロ二量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする導入核酸から該対象とするヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、選択圧の不在下で培養される、細胞。
(項目4)
対象とするヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、該対象とするヘテロ二量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、選択圧の不在下で培養される、細胞。
(項目5)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質の第2サブユニットをコードする核酸が内因性である、項目1から4のいずれか一項に記載の細胞。
(項目6)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質の第2サブユニットをコードする核酸が導入されている、項目2または4に記載の細胞。
(項目7)
上記対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まない、項目1から6のいずれか一項に記載の細胞。
(項目8)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体および免疫学的受容体からなる群より選択される、項目1から7のいずれか一項に記載の細胞。
(項目9)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が、甘味受容体およびうま味受容体からなる群より選択される、項目8に記載の細胞。
(項目10)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が公知のリガンドを有さない、項目1から8のいずれか一項に記載の細胞。
(項目11)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が同じ型の細胞中で発現されない、項目1から10のいずれか一項に記載の細胞。
(項目12)
哺乳動物細胞である、項目1から11のいずれか一項に記載の細胞。
(項目13)
1を超えるシグナル対ノイズ比、時間をわたって安定であること、発現の消失を伴わない選択圧なしでの増殖、生理的なEC50値、および生理的なIC50値からなる群より選択される追加の望ましい特性を有することをさらに特徴とする、項目1から12のいずれか一項に記載の細胞。
(項目14)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、および少なくとも9ヶ月から選択される期間1つの形で一貫して再現性よく産生される、項目1、2および5から13のいずれか一項に記載の細胞。
(項目15)
上記機能アッセイが細胞ベースアッセイ、蛍光細胞ベースアッセイ、高スループットスクリーニングアッセイ、受容体細胞ベースアッセイ、Gタンパク質媒介細胞ベースアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースアッセイからなる群より選択される、項目1、2および5から13のいずれか一項に記載の細胞。
(項目16)
上記細胞が細胞ベースの高スループットスクリーニングでの利用に適している、項目1、2および5から13のいずれか一項に記載の細胞。
(項目17)
上記選択圧が抗生物質である、項目3から13のいずれか一項に記載の細胞。
(項目18)
少なくとも15日間、30日間、45日間、60日間、75日間、100日間、120日間、または150日間、選択圧の不在下で上記ヘテロ二量体タンパク質を発現する、項目3から13および17のいずれか一項に記載の細胞。
(項目19)
対象とするヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞であって、該ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも3つのサブユニットを含み、該対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットが導入核酸によってコードされており、該細胞は、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするヘテロ二量体タンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目20)
対象とするヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞であって、該ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも3つのサブユニットを含み、該細胞は、該対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするヘテロ二量体タンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目21)
対象とするヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞であって、該ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも3つのサブユニットを含み、該対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットが導入核酸によってコードされており、該細胞が生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とする、細胞。
(項目22)
対象とするヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞であって、該ヘテロ多量体タンパク質が少なくとも3つのサブユニットを含み、該細胞が該対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、該細胞が生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とする細胞。
(項目23)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする上記核酸が内因性である、項目19から22のいずれか一項に記載の細胞。
(項目24)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする上記核酸が導入されている、項目20または22に記載の細胞。
(項目25)
上記対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まない、項目19から24のいずれか一項に記載の細胞。
(項目26)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質が、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体および免疫学的受容体からなる群より選択される、項目19から25のいずれか一項に記載の細胞。
(項目27)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質が、GABA、ENaCおよびNaVからなる群より選択される、項目26に記載の細胞。
(項目28)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質が公知のリガンドを有さない、項目19から26のいずれか一項に記載の細胞。
(項目29)
上記対象とするヘテロ二量体タンパク質が同じ型の細胞中で発現されない、項目19から28のいずれか一項に記載の細胞。
(項目30)
哺乳動物細胞である、項目19から29のいずれか一項に記載の細胞。
(項目31)
1を超えるシグナル対ノイズ比、時間をわたって安定であること、発現の消失を伴わない選択圧なしでの増殖、生理的なEC50値、および生理的なIC50値からなる群より選択される追加の望ましい特性を有することをさらに特徴とする、項目19から30のいずれか一項に記載の細胞。
(項目32)
上記対象とするヘテロ多量体タンパク質が少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、および少なくとも9ヶ月から選択される期間1つの形で一貫して再現性よく産生される、項目19、20および23から31のいずれか一項に記載の細胞。
(項目33)
上記機能アッセイが細胞ベースアッセイ、蛍光細胞ベースアッセイ、高スループットスクリーニングアッセイ、受容体細胞ベースアッセイ、Gタンパク質媒介細胞ベースアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースアッセイからなる群より選択される、項目19、20および23から31のいずれか一項に記載の細胞。
(項目34)
細胞ベースの高スループットスクリーニングでの利用に適している、項目19、20および23から31のいずれか一項に記載の細胞。
(項目35)
選択圧の不在下で培養される、項目21から31のいずれか一項に記載の細胞。
(項目36)
上記選択圧が抗生物質である、項目35に記載の細胞。
(項目37)
少なくとも15日間、30日間、45日間、60日間、75日間、100日間、120日間、または150日間、選択圧の不在下で上記ヘテロ多量体タンパク質を発現する、項目35または36に記載の細胞。
(項目38)
対象とするタンパク質の少なくとも1つをコードする導入核酸から2つ以上の該対象とするタンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目39)
2つ以上の対象とするタンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、該対象とするタンパク質の少なくとも1つをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、該対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まないか、または該タンパク質が、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目40)
対象とするタンパク質の少なくとも1つをコードする導入核酸から2つ以上の該対象とするタンパク質を発現する細胞であって、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とする細胞。
(項目41)
2つ以上の対象とするタンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、該対象とするタンパク質の少なくとも1つをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とする細胞。
(項目42)
対象とする少なくとも1つのタンパク質が二量体タンパク質である、項目38から41のいずれか一項に記載の細胞。
(項目43)
上記対象とする二量体タンパク質がホモ二量体タンパク質である、項目42に記載の細胞。
(項目44)
上記対象とする二量体タンパク質がヘテロ二量体タンパク質である、項目42に記載の細胞。
(項目45)
対象とする少なくとも1つのタンパク質が多量体タンパク質である、項目38から41のいずれか一項に記載の細胞。
(項目46)
上記対象とする多量体タンパク質がホモ多量体タンパク質である、項目45に記載の細胞。
(項目47)
上記対象とする多量体タンパク質がヘテロ多量体タンパク質である、項目45に記載の細胞。
(項目48)
上記タンパク質の1つが内因性核酸によってコードされている、項目38から47のいずれか一項に記載の細胞。
(項目49)
上記タンパク質の1つが導入核酸によってコードされている、項目39または41に記載の細胞。
(項目50)
上記対象とするタンパク質がタンパク質タグを含まない、項目38から49のいずれか一項に記載の細胞。
(項目51)
上記対象とするタンパク質の1つが、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体および免疫学的受容体からなる群より選択される、項目38から49のいずれか一項に記載の細胞。
(項目52)
上記対象とするタンパク質の1つが公知のリガンドを有さない、項目38から51のいずれか一項に記載の細胞。
(項目53)
上記対象とするタンパク質の1つが同じ型の細胞中で発現されない、項目38から52のいずれか一項に記載の細胞。
(項目54)
哺乳動物細胞である、項目38から53のいずれか一項に記載の細胞。
(項目55)
1を超えるシグナル対ノイズ比、時間をわたって安定であること、発現の消失を伴わない選択圧なしでの増殖、生理的なEC50値、および生理的なIC50値からなる群より選択される追加の望ましい特性を有することをさらに特徴とする、項目38から54のいずれか一項に記載の細胞。
(項目56)
上記対象とする2つ以上のタンパク質が少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、および少なくとも9ヶ月から選択される期間1つの形で一貫して再現性よく産生される、項目38、39および42から55のいずれか一項に記載の細胞。
(項目57)
上記機能アッセイが細胞ベースアッセイ、蛍光細胞ベースアッセイ、高スループットスクリーニングアッセイ、受容体細胞ベースアッセイ、Gタンパク質媒介細胞ベースアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースアッセイからなる群より選択される、項目38、39および42から55のいずれか一項に記載の細胞。
(項目58)
細胞ベースの高スループットスクリーニングでの利用に適している、項目38、39および42から55のいずれか一項に記載の細胞。
(項目59)
選択圧の不在下で培養される、項目40から55のいずれか一項に記載の細胞。
(項目60)
上記選択圧が抗生物質である、項目59に記載の細胞。
(項目61)
少なくとも15日間、30日間、45日間、60日間、75日間、100日間、120日間、または150日間、選択圧の不在下で上記2つ以上のタンパク質を発現する、項目59または60に記載の細胞。
(項目62)
対象とする少なくとも1つのRNAを発現する細胞であって、該対象とするRNAが導入核酸によってコードされており、該細胞が機能アッセイでの使用に適した形で該対象とする少なくとも1つのRNAを産生することを特徴とし、該対象とするRNAがタグを含まず、または該RNAが、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目63)
対象とする少なくとも1つのRNAを発現する細胞であって、該細胞は、該対象とする少なくとも1つのRNAをコードする内因性核酸の転写を活性化するように操作されており、機能アッセイでの使用に適した形で該対象とする少なくとも1つのRNAを産生することを特徴とし、該対象とするRNAがタグを含まず、または該RNAが、該細胞が該機能アッセイ中で少なくとも0.4のZ’係数を有するようにその形で一貫して再現性よく産生されるか、または該細胞が選択圧の不在下で培養されるか、またはそれらの任意の組合せである、細胞。
(項目64)
対象とする少なくとも2つのRNAを発現する、項目62または63に記載の細胞。
(項目65)
対象とする少なくとも3つのRNAを発現する、項目62または63に記載の細胞。
(項目66)
導入核酸によってコードされるRNAをさらに発現する、項目64から65のいずれか一項に記載の細胞。
(項目67)
上記対象とするRNAが、イオンチャネルをコードするRNA、Gタンパク質共役受容体(GPCR)をコードするRNA、チロシン受容体キナーゼをコードするRNA、サイトカイン受容体をコードするRNA、核ステロイドホルモン受容体をコードするRNAおよび免疫学的受容体をコードするRNAからなる群より選択される、項目62から66のいずれか一項に記載の細胞。
(項目68)
上記対象とするRNAが同じ型の細胞中で発現されない、項目62から67のいずれか一項に記載の細胞。
(項目69)
哺乳動物細胞である、項目62から68のいずれか一項に記載の細胞。
(項目70)
1を超えるシグナル対ノイズ比、時間をわたって安定であること、発現の消失を伴わない選択圧なしでの増殖、生理的なEC50値、および生理的なIC50値からなる群より選択される追加の望ましい特性を有することをさらに特徴とする、項目62から69のいずれか一項に記載の細胞。
(項目71)
上記対象とするRNAが少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも5ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも7ヶ月、少なくとも8ヶ月、および少なくとも9ヶ月から選択される期間1つの形で一貫して再現性よく産生される、項目62から70のいずれか一項に記載の細胞。
(項目72)
上記機能アッセイが細胞ベースアッセイ、蛍光細胞ベースアッセイ、高スループットスクリーニングアッセイ、受容体細胞ベースアッセイ、Gタンパク質媒介細胞ベースアッセイ、およびカルシウムフラックス細胞ベースアッセイからなる群より選択される、項目62から71のいずれか一項に記載の細胞。
(項目73)
細胞ベースの高スループットスクリーニングでの利用に適している、項目61から72のいずれか一項に記載の細胞。
(項目74)
項目1から73のいずれか一項に記載の細胞から作製された細胞系。
(項目75)
対象とするタンパク質を発現する細胞を作製するための方法であって、該細胞が時間をわたって一貫する少なくとも1つの望ましい特性を有し、
a)該対象とするタンパク質をコードするmRNAを発現する複数の細胞を提供するステップと、
b)細胞を個々の培養容器中に個々に分散させ、それによって複数の別々の細胞培養物を提供するステップと、
c)自動化細胞培養方法を使用して一組の望ましい培養条件下で該細胞を培養するステップであって、該条件が該別々の細胞培養物のそれぞれについて実質的に同一であり、該培養中、別々の細胞培養物当たりの細胞数を培養物毎に正規化し、該別々の培養物を同じスケジュールで継代することを特徴とする、ステップと、
d)該対象とするタンパク質の少なくとも1つの望ましい特徴について該別々の細胞培養物を少なくとも2回アッセイするステップと、
e)両方のアッセイで該望ましい特徴を有する別々の細胞培養物を同定するステップであって、該細胞がその細胞(a cell that)であるステップ、と
を含む、方法。
(項目76)
ステップa)における複数の細胞を、ステップb)の分散させることの前に、ある程度の期間培養する、項目75に記載の方法。
(項目77)
上記個々の培養容器がマルチウエルプレートの個々のウエルおよびバイアルからなる群より選択される、項目75に記載の方法。
(項目78)
複数の上記別々の細胞培養物の増殖速度を決定するステップ、および任意の群中で最も速い増殖速度と最も遅い増殖速度との差がステップb)とc)の間で1、2、3、4、または5日を超えないように、その増殖速度によって該別々の細胞培養物を群に分けるステップをさらに含む、項目75に記載の方法。
(項目79)
1つまたは複数の上記別々の培養物の保存ストックを調製するステップをさらに含む、項目75または項目78に記載の方法。
(項目80)
上記別々の細胞培養物の1つまたは複数の複製セットのステップ、および供給源である上記別々の細胞培養物由来の該1つまたは複数の複製セットを別々に培養するステップをさらに含む、項目75に記載の方法。
(項目81)
ステップd)でのアッセイが上記タンパク質の機能アッセイである、項目75に記載の方法。
(項目82)
ステップe)で一定のままである上記少なくとも1つの特徴がタンパク質機能である、項目75に記載の方法。
(項目83)
ステップc)での上記培養がロボット細胞培養装置におけるものである、項目75に記載の方法。
(項目84)
上記ロボット細胞培養装置がマルチチャネルロボットピペッターを含む、項目83に記載の方法。
(項目85)
上記マルチチャネルロボットピペッターが少なくとも96チャネルを含む、項目84に記載の方法。
(項目86)
上記ロボット細胞培養装置がチェリーピッキングアームをさらに含む、項目84に記載の方法。
(項目87)
上記自動化方法が培地除去、培地交換、細胞洗浄、試薬添加、細胞の除去、細胞分散、および細胞継代の1つまたは複数を含む、項目75に記載の方法。
(項目88)
複数の上記別々の細胞培養物が少なくとも50個の培養物である、項目75に記載の方法。
(項目89)
複数の上記別々の細胞培養物が少なくとも100個の培養物である、項目75に記載の方法。
(項目90)
複数の上記別々の細胞培養物が少なくとも500個の培養物である、項目75に記載の方法。
(項目91)
複数の上記別々の細胞培養物が少なくとも1000個の培養物である、項目75に記載の方法。
(項目92)
ATPの測定、細胞集密度の測定、光散乱、光学濃度測定からなる群より選択される方法によって上記増殖速度を決定する、項目78に記載の方法。
(項目93)
上記群中で最も速い増殖速度と最も遅い増殖速度との差が1、2、3、4、または5時間を超えない、項目78に記載の方法。
(項目94)
ステップc)での培養が少なくとも2日間である、項目75に記載の方法。
(項目95)
複数の上記別々の細胞培養物の増殖速度を上記細胞を分散させることおよび細胞集密度を測定することによって決定する、項目78に記載の方法。
(項目96)
上記それぞれ別々の細胞培養物中の細胞を細胞集密度の測定前に分散させる、項目95に記載の方法。
(項目97)
上記分散ステップがトリプシンを上記ウエルに加えて塊を除去することを含む、項目95または96に記載の方法。
(項目98)
複数の上記別々の細胞培養物の細胞集密度を、自動化マイクロプレートリーダーを使用して測定する、項目95に記載の方法。
(項目99)
少なくとも2回の集密度測定を、増殖速度を計算する前に実施する、項目95に記載の方法。
(項目100)
上記細胞集密度を自動化プレートリーダーによって測定し、かつ増殖速度を計算するソフトウェアプログラムと共に該集密度値を使用する、項目98に記載の方法。
(項目101)
ステップd)での別々の細胞培養物が、脆弱性、形態、固体表面との接着性、固体表面との接着性の欠如およびタンパク質機能の1つまたは複数から選択される望ましい特質を特徴とする、項目75に記載の方法。
(項目102)
上記細胞が真核細胞である、項目75に記載の方法。
(項目103)
上記真核細胞が哺乳動物細胞である、項目75に記載の方法。
(項目104)
上記哺乳動物細胞系がNS0細胞、CHO細胞、COS細胞、HEK−293細胞、HUVEC、3T3細胞およびHeLa細胞からなる群より選択される、項目75に記載の方法。
(項目105)
上記対象とするタンパク質がヒトタンパク質である、項目75に記載の方法。
(項目106)
上記対象とするタンパク質がヘテロ多量体である、項目75に記載の方法。
(項目107)
上記対象とするタンパク質がGタンパク質共役受容体である、項目75に記載の方法。
(項目108)
上記タンパク質が公知のリガンドを有さない、項目75に記載の方法。
(項目109)
上記同定ステップの後に、
a)望ましい培養条件下においてステップe)で同定した細胞培養物の保存アリコートを拡大増殖させるステップと、
b)該a)の拡大増殖させた細胞培養物が望ましい特徴を有するかどうかを決定するステップと
をさらに含む、項目75に記載の方法。
(項目110)
クローン細胞系の適合パネルであって、該クローン細胞系が同じ細胞型であり、該パネル中のそれぞれの細胞系が対象とするタンパク質を発現し、該パネル中のクローン細胞系が同じ生理学的特徴を共有するように適合されていることにより並行処理が可能となる、クローン細胞系の適合パネル。
(項目111)
上記生理学的特徴が増殖速度である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目112)
上記生理学的特徴が組織培養物表面との接着性である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目113)
上記生理学的特徴がZ’係数である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目114)
上記生理学的特徴が上記対象とするタンパク質をコードするRNAの発現レベルである、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目115)
上記生理学的特徴が上記対象とするタンパク質の発現レベルである、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目116)
上記パネル中のクローン細胞系の増殖速度が互いに1、2、3、4、または5時間の範囲内にある、項目111に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目117)
上記培養条件が上記パネル中の全てのクローン細胞系で同じである、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目118)
上記クローン細胞系が真核細胞系である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目119)
上記真核細胞系が哺乳動物細胞系である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目120)
上記細胞系の細胞が初代細胞および不死化細胞からなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目121)
上記細胞系の細胞が原核細胞または真核細胞である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目122)
上記細胞系の細胞が真核細胞であり、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、藻類、甲殻類細胞、節足動物細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞および植物細胞からなる群より選択される、項目121に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目123)
上記細胞系の細胞が哺乳動物細胞であり、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ネコ、ラット、有袋動物、ネズミ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ハムスターからなる群より選択される、項目122に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目124)
上記細胞系の細胞が上記対象とするタンパク質を発現するように操作されている、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目125)
上記細胞系の細胞が、上記対象とするタンパク質をコードする、または多量体タンパク質の場合では該タンパク質のサブユニットをコードする導入核酸から該タンパク質を発現する、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目126)
上記細胞が内因性核酸から上記対象とするタンパク質を発現し、該細胞が内因性タンパク質の転写を活性化する、または多量体タンパク質の場合では該タンパク質のサブユニットの転写を活性化するように操作されている、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目127)
上記パネルが少なくとも4個のクローン細胞系を含む、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目128)
上記パネルが少なくとも6個のクローン細胞系を含む、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(請求パネル129)
上記パネルが少なくとも25個のクローン細胞系を含む、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目130)
上記パネル中の2つ以上のクローン細胞系が対象とする同じタンパク質を発現する、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目131)
上記パネル中の2つ以上のクローン細胞系が対象とする異なるタンパク質を発現する、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目132)
上記パネル中の細胞系が異なる形態の対象とするタンパク質を発現し、該形態がアイソフォーム、アミノ酸配列変異体、スプライス変異体、切断型、融合タンパク質、キメラ、またはそれらの組合せからなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目133)
上記パネル中の細胞系が対象とするタンパク質の群中の異なるタンパク質を発現し、該対象とするタンパク質の群が同じシグナル伝達経路中のタンパク質、類似したタンパク質の発現ライブラリー、モノクローナル抗体重鎖ライブラリー、モノクローナル抗体軽鎖ライブラリーおよびSNPからなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目134)
上記対象とするタンパク質が単鎖タンパク質である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目135)
上記単鎖タンパク質がGタンパク質共役受容体である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目136)
上記Gタンパク質共役受容体が味覚受容体である、項目135に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目137)
上記味覚受容体が苦味受容体、甘味受容体、塩味受容体およびうま味受容体からなる群より選択される、項目136に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目138)
上記タンパク質が多量体タンパク質である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目139)
上記タンパク質がヘテロ二量体またはヘテロ多量体である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目140)
上記タンパク質が、イオンチャネル、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体および免疫学的受容体からなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目141)
上記タンパク質が上皮ナトリウムチャネル(ENaC)である、項目140に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目142)
上記ENaCがαサブユニット、βサブユニットおよびγサブユニットを含む、項目140に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目143)
上記パネル中の細胞系が異なるENaCアイソフォームを発現する、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目144)
上記パネル中の細胞系がENaCの異なるタンパク質分解アイソフォームを含む、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目145)
上記ENaCがヒトENaCである、項目141から143のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目146)
上記タンパク質が電位依存性ナトリウムチャネル(NaV)である、項目140に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目147)
上記NaVが1つのαサブユニットおよび2つのβサブユニットを含む、項目146に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目148)
上記NaVがヒトNaVである、項目140に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目149)
上記タンパク質がγ−アミノ酪酸A受容体(GABAA受容体)、γ−アミノ酪酸B受容体(GABAB受容体)およびγ−アミノ酪酸C受容体(GABAC受容体)からなる群より選択される、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目150)
上記タンパク質がGABAA受容体である、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目151)
上記GABAA受容体が2つのαサブユニット、2つのβサブユニットおよび1つのγまたはδサブユニットを含む、項目150に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目152)
上記パネル中のクローン細胞系が同時に、または互いに4週間を超えない内に作製された、項目110に記載のクローン細胞系の適合パネル。
(項目153)
対象とする単量体タンパク質をコードする導入核酸から該対象とする単量体タンパク質を発現する細胞であって、該細胞は、生物学的に活性な形もしくは生物学的に活性になることができる形で該対象とするタンパク質を産生することを特徴とし、該細胞は選択圧の不在下で培養され、かつ該タンパク質の発現が3ヶ月にわたって30%を超えて変化しない、細胞。
(項目154)
上記タンパク質の発現が6ヶ月にわたって30%を超えて変化しない、項目153に記載の細胞。
(項目155)
上記対象とするタンパク質が公知のリガンドを有さない、項目153または154に記載の細胞。
(項目156)
対象とするタンパク質のモジュレーターを同定するための方法であって、該細胞は:
a)項目1から74のいずれか一項に記載の細胞を試験化合物と接触させるステップと、
b)該試験化合物と接触させなかった細胞における該タンパク質の活性と比較した、該試験化合物と接触させた細胞における該対象とするタンパク質の活性の変化を検出するステップと
を含み、不在下と比較して存在下で活性の差を生じる化合物が該対象とするタンパク質のモジュレーターである、方法。
(項目157)
項目156に記載の方法によって同定されたモジュレーター。
Claims (25)
- クローン細胞系の適合パネルであって、該クローン細胞系が同じ細胞型から作製されたものであり、該適合パネルが少なくとも6個のクローン細胞系を含み、該パネル中のそれぞれの細胞系が対象とするRNAまたは対象とするタンパク質を発現し、該パネル中のクローン細胞系が生理学的特徴に関して適合されており、該生理学的特徴が、
a)倍加時間で測定される増殖速度であって、該パネルにおける最も早い増殖速度と最も遅い増殖速度との間の差が5時間を超えない、増殖速度;
b)Z’係数であって、該パネルにおける該クローン細胞系の各々の該Z’係数は、該パネルにおける細胞系ごとに、0.1を超えて異ならない、Z’係数;
c)該対象とするタンパク質をコードするRNAの発現レベルであって、該パネルにおける該クローン細胞系の各々の該発現レベルは、該パネルにおける細胞系ごとに、30%を超えて異ならない、発現レベル;
d)該対象とするRNAの発現レベルであって、該パネルにおける該クローン細胞系の各々の該発現レベルは、該パネルにおける細胞系ごとに、30%を超えて異ならない、発現レベル;
e)該対象とするタンパク質の発現レベルであって、該パネルにおける細胞系ごとに、30%を超えて異ならない、発現レベル、または
f)生理学的特性a)〜e)の組み合わせ
である、クローン細胞系の適合パネル。 - 前記生理学的特性が、増殖速度である、請求項1に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 培養条件が前記パネル中の全てのクローン細胞系で同じである、請求項1または2に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記クローン細胞系が、
a)真核細胞系、または
b)原核細胞系
である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。 - 前記真核細胞系が哺乳動物細胞系である、請求項4に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記クローン細胞系が
a)初代細胞の細胞系;または
b)不死化細胞の細胞系
である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。 - 前記細胞系の細胞が前記対象とするRNAまたは前記対象とするタンパク質を発現するように操作されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- a)前記細胞系の細胞が、導入核酸から前記対象とするRNAもしくは前記タンパク質を発現する、または
b)該対象とするタンパク質が多量体タンパク質であり、該細胞系の細胞が、該多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットをコードする少なくとも1つの導入核酸から該少なくとも1つのサブユニットを発現する、
請求項1〜7のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。 - a)前記細胞が内因性核酸から前記対象とするRNAもしくは前記対象とするタンパク質を発現し、該細胞が内因性核酸の転写を活性化するように操作されている;または
b)該対象とするタンパク質が多量体タンパク質であり、該細胞系の細胞が、内因性核酸から該多量体タンパク質の少なくとも1つのサブユニットを発現し、かつ該細胞が該少なくとも1つのサブユニットの転写を活性化するように操作されている、
請求項1〜7のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。 - 前記パネルが、少なくとも25個のクローン細胞系を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記パネル中の2つ以上のクローン細胞系が対象とする同じRNAまたはタンパク質を発現する、請求項1〜10のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記パネル中の2つ以上のクローン細胞系が対象とする異なるRNAまたはタンパク質を発現する、請求項1〜11のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記パネル中の細胞系が異なる形態の対象とするタンパク質を発現し、該形態がアイソフォーム、アミノ酸配列変異体、スプライス変異体、切断型、融合タンパク質、キメラ、またはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記パネル中の細胞系が対象とするタンパク質の群中の異なるタンパク質を発現し、該対象とするタンパク質の群が同じシグナル伝達経路中のタンパク質、類似したタンパク質の発現ライブラリー、モノクローナル抗体重鎖ライブラリー、モノクローナル抗体軽鎖ライブラリーおよびタンパク質の変異した形態からなる群より選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記対象とするタンパク質が単鎖タンパク質である、請求項1〜14のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記単鎖タンパク質がGタンパク質共役受容体である、請求項15に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記Gタンパク質共役受容体が味覚受容体である、請求項16に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記味覚受容体が苦味受容体、甘味受容体、およびうま味受容体からなる群より選択される、請求項17に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記タンパク質が多量体タンパク質である、請求項1〜14のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記タンパク質がヘテロ二量体またはヘテロ多量体である、請求項19に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記タンパク質が、イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、チロシン受容体キナーゼ、サイトカイン受容体、核ステロイドホルモン受容体および免疫学的受容体からなる群より選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記タンパク質が、
a)上皮ナトリウムチャネル(ENaC)、または
b)電位依存性ナトリウムチャネル(NaV)
である、請求項21に記載のクローン細胞系の適合パネル。 - 前記タンパク質がγ−アミノ酪酸A受容体(GABAA受容体)、γ−アミノ酪酸B受容体(GABAB受容体)およびγ−アミノ酪酸C受容体(GABAC受容体)からなる群より選択される、請求項21に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記パネル中のクローン細胞系が同時に、または互いに4週間を超えない内に作製された、請求項1〜23のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
- 前記対象とするタンパク質が、塩味受容体である、請求項1〜14のいずれか一項に記載のクローン細胞系の適合パネル。
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