JP2012516686A - Cftrを発現する細胞株およびそれらを使用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
activated cell sorter)を利用して、CFTRを発現する細胞を単離する。いくつかの実施形態において、本収集物の細胞または細胞株を並行して作製する。
chamberアッセイであり得る。いくつかの実施形態において、この検出ステップのアッセイを、タンパク質輸送補正物質がない状態で行う。本方法で使用する試験化合物は、小分子、化学成分、ポリペプチド、または抗体を含んでもよい。他の実施形態において、この試験化合物は、化合物のライブラリーであってもよい。このライブラリーは、小分子ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、ペプチドライブラリー、または抗体ライブラリーであってもよい。
a)CFTRをコードする(1つまたは複数の)mRNAを発現する多数の細胞を提供するステップと;
b)個々の培養容器の中でこれらの細胞を1つ1つ分散させ、それによって多数の別々の細胞培養物を提供するステップと;
c)培養条件が別々の細胞培養物の各々と実質的に同一であり、培養中、別々の細胞培養物あたりの細胞数を正規化し、これらの別々の培養物を同じスケジュールで継代するという点において特徴づけられる自動化細胞培養法を用いて、一連の所望の培養条件下でこれらの細胞を培養するステップと;
d)別々の細胞培養物をアッセイし、少なくとも2回このCFTRの発現を測定するステップと;
e)一貫したレベルでCFTRを発現する別々の細胞培養物を、両方のアッセイにおいて同定し、それによって前記細胞を取得するステップと
を含む方法によって、作製してもよい。
a)細胞の集団を提供するステップと;
b)CFTRの発現を検出する分子ビーコンをこれらの細胞に導入するステップと;
c)CFTRを発現する細胞を単離するステップと
を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、この細胞の集団は、CFTRを内在的に発現しない細胞を含む。いくつかの実施形態において、CFTRを発現する単離細胞は、前記単離に先立って、CFTRを発現することを知られていない。いくつかの実施形態において、本方法は、前記ステップCの単離に先立って、遺伝的可変性を増加させるステップをさらに含む。
Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1−6.3.6の中で見つけることができる。水性法および非水性法がこの参考文献に記載されており、いずれかを使用することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として、6×SSC中での約45℃におけるハイブリダイゼーション、続いて、0.2×SSC、0.1%SDS中での60℃における少なくとも1回の洗浄が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例として、6×SSC中での約45℃におけるハイブリダイゼーション、続いて、0.2×SSC、0.1%SDS中での65℃における少なくとも1回の洗浄が挙げられる。ストリンジェントな条件には、0.5Mリン酸ナトリウム、7%SDS中での65℃におけるハイブリダイゼーション、続いて、0.2×SSC、0.1%SDS中での65℃における少なくとも1回の洗浄が含まれる。
Local Alignment Tool(BLAST);Needlemanら((1970)J.MoL.BIoL.,48:444−453)のアルゴリズム;またはMeyersら((1988)Comput.Appl.Biosci.,4:11−17)のアルゴリズムによって決定することができる。一組のパラメーターは、ギャップペナルティが12、ギャップ伸長ペナルティが4、およびフレームシフトギャップペナルティが5であるBlosum
62スコア行列であってもよい。2種類のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、PAM120重量残基表(weight residue table)、12のギャップ長ペナルティおよび4のギャップペナルティを用いて、ALIGNプログラム(2.0版)に組込まれたE.MeyersおよびW.Miller((1989)CABIOS,4:11−17)のアルゴリズムを用いて決定することもできる。パーセント同一性を、通常、類似の長さの配列を比較することによって計算する。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を用いて類似配列を一致させる。例えば、GCGWisconsin
Package(Accelrys,Inc.)は、初期設定のパラメーターを用いて、異なる生物種由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間、または野生型タンパク質とその変異体との間の配列相同性を決定することができる「Gap」および「Bestfit」などのプログラムを含む。例えば、GCG6.1版を参照されたい。初期設定または推奨パラメーターを用いるFASTAを用いて、ポリペプチド配列も比較することができる。GCG6.1版のFASTA(例えば、FASTA2およびFASTA3)のプログラムは、問い合わせ配列と検索配列との間で、最高の重複領域の整列およびパーセント配列相同性を提供する(Pearson,Methods Enzymol.183:63−98(1990);Pearson,Methods Mol.Biol.132:185−219(2000))。同一性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸残基、通常少なくとも約20残基、さらに通常少なくとも約24残基、典型的に少なくとも約28残基、および好ましくは約35残基より多いであろう。同一性について比較されるDNA配列の長さは、一般に、少なくとも約48核酸残基、通常少なくとも約60核酸残基、さらに通常少なくとも約72核酸残基、典型的に少なくとも約84核酸残基、および好ましくは約105核酸残基より多いであろう。
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membrane)、核膜(nuclear envelope)、小胞(例えば、分泌小胞)、もしくは少なくとも1つの細胞小器官の膜を含むがこれらに限定されない少なくとも1つの細胞の小器官、区画もしくは膜の存在量、レベル、数、量または組成;肝臓、肺、皮膚、(心筋、骨格筋、線条筋を含むがこれらに限定されない)筋肉、膵臓、脳、精巣、卵巣、血液、免疫系、神経系、骨、心臓血管系、中枢神経系、胃腸管、胃、甲状腺、舌、胆嚢、腎臓、鼻、目、爪、髪、味蕾細胞もしくは味覚細胞、ニューロン、皮膚、膵臓、血液、免疫、赤血球、白血球、キラーT細胞、腸管内分泌細胞、分泌細胞、腎臓、上皮細胞、内皮細胞、ヒト細胞、動物細胞もしくは植物細胞のうちの1つを含む幹細胞、多能性細胞、全能性細胞もしくは特殊化細胞または組織特異的細胞を含むがこれらに限定されない、1つ以上の特異的細胞型または分化した細胞型、未分化の細胞型もしくは脱分化した細胞型によって共有される(1つ以上の遺伝子の)少なくとも1つの機能プロファイルもしくは遺伝子発現プロファイルを獲得する能力もしくは傾向を獲得したことまたは有すること;核酸、RNA、DNA、タンパク質、小分子、プローブ、色素、(修飾オリゴヌクレオチドを含む)オリゴヌクレオチドもしくは蛍光発生オリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない天然もしくは合成の化学物質または天然もしくは合成の分子を取り込む性能または能力;感染、薬物、化学物質、病原体、界面活性剤、UV、悪条件、寒さ、暑さ、極端な温度、振盪、動揺、ボルテックス、酸素不足もしくは低レベルの酸素、栄養不足もしくは低レベルの栄養、毒素、毒液、ウイルスもしくは化合物、細胞もしくは細胞増殖に悪影響を与える処理もしくは薬剤に対する抵抗性を含むがこれらに限定されない細胞の増殖、機能もしくは生存率に悪影響を与える化学物質または物質の悪影響もしくは有害効果に対する抵抗性または抵抗する能力;大規模細胞培養、小型化細胞培養、自動化細胞培養、ロボットによる細胞培養、標準化細胞培養、創薬、ハイスループットスクリーニング、細胞に基づくアッセイ、(膜電位アッセイ、カルシウムフラックスアッセイ、受容体アッセイ、Gタンパク質レポーターアッセイを含むがこれらに限定されない)機能細胞に基づくアッセイ、ELISA、インビトロアッセイ、インビボへの適用、二次試験、化合物試験、結合アッセイ、パニングアッセイ(panning assays)、抗体パニングアッセイ、ファージディスプレイ、画像研究、顕微鏡画像解析、免疫蛍光研究、RNAの、DNAの、タンパク質のもしくは生物学的な産生または精製、ワクチン開発、細胞療法、生物、動物、ヒトもしくは植物への移植、細胞が分泌する因子の単離、cDNAライブラリーの調製、または病原菌、ウイルスもしくは他の病原体による感染を含むがこれらに限定されないインビトロ試験、細胞に基づくアッセイ、生化学的もしくは生物学的試験、移植、細胞療法もしくは二次アッセイにおける使用に対する適合性;および少なくとも1種類の代謝産物、脂質、DNA、RNAもしくはタンパク質の生合成などの他の観察可能な、測定可能な、または検出可能な生理的特性;染色体のサイレンシング、活性化、ヘテロクロマチン化、ユークロマチン化または組換え;遺伝子発現、遺伝子サイレンシング、遺伝子スプライシング、遺伝子組換えまたは遺伝子活性化;RNAの産生、発現、転写、プロセシングスプライシング、輸送、局在化または修飾;タンパク質の産生、発現、分泌、折り畳み、構築、輸送、局在化、細胞表面提示、分泌または細胞膜もしくはオルガネラ膜への融合;翻訳後修飾、プロセシング、酵素修飾、プロテオリシス、グリコシル化、リン酸化反応、脱リン酸化反応を含むがこれらに限定されないタンパク質修飾;有糸分裂、減数分裂もしくは核分裂または細胞融合を含む細胞分裂;高レベルのRNAもしくはタンパク質の産生または高レベルのRNAもしくはタンパク質の収率。
Publishing Houseを通して入手可能である。これらの参考ガイドの中のプロトコールは、細胞の生理的特性を観察、検出または測定するために使用することができる例示的な方法である。当業者は、任意の1つ以上のこれらの方法を使用して、本明細書に開示される生理的特性を観察、検出または測定することが可能であることにすぐに気付くであろう。
et al.,Science 256:1443−45(1992)に開示されるPAM250対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中等度に保存的」な置換は、PAM250対数尤度行列において負でない値を有する任意の変化である。
domain containing 1))(70kDaのCFTR結合タンパク質(CAP70)とも呼ばれる)、これは、CFTR塩素イオン電流を高める;エンドサイトーシス複合体AP2、これはCFTRと相互作用し、CFTRのクラスリン被膜小胞への効率的移行を促進する;環状グアノシン一リン酸(cGMP)依存的タンパク質キナーゼ2(PRKG2)、これは、CFTRをリン酸化して活性化する上流のcGMP依存的キナーゼである;タンパク質キナーゼAおよびタンパク質キナーゼC;タンパク質脱リン酸化酵素2(PP2A);グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)、ベータポリペプチド2様1(RACK1);GTP加水分解酵素のRhoファミリー;Rab GTP加水分解酵素、SNAREタンパク質;カリウムチャネルタンパク質(例えば、ROMK1およびROMK2);グアニル酸シクラーゼc(GC−CまたはGUCY2C)、これはCFTRと相互作用する;塩素イオンチャネル2(CLCN2またはCLC2)、これはCLCN2およびCFTRの両方の共発現が、最大の流動流出を示すスクリーニングを可能にすることができるように腸の中で正味のCl−流出を引き起こすと提唱されている;ナトリウム摂取/塩素イオン流出のレオスタットバイオセンサーを構成するための溶質輸送体ファミリー9アイソフォームA3(NHE3−SLC9A3/ナトリウム−水素交換体)または溶質輸送体ファミリー26アイソフォームA3(DRA−SLC26A3/ナトリウム−水素交換体);環状ヌクレオチド感受性チャネル(cyclic
nucleotide gated channel)(CNGA2)、これは、カルシウム読み出し情報と共にHTS基盤として使用され得る;またはYFPハロゲン化物クエンチングアッセイにおける使用のための黄色蛍光タンパク質(YFPまたはYFP H148Q/I152Lなどのその変異体)。
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CRL−11268)、RBL(ATCC CRL−1378)、SH−SY5Y(ATCC CRL−2266)、MDCK(ATCC CCL−34)、SJ−RH30(ATCC
CRL−2061)、HepG2(ATCC HB−8065)、ND7/23(ECACC 92090903)、CHO(ECACC 85050302)、Vero(ATCC
CCL 81)、Caco−2(ATCC HTB 37)、K562(ATCC CCL 243)、Jurkat(ATCC TIB−152)、Per.C6(Crucell,Leiden,The
Netherlands)、Huvec(ATCC Human Primary PCS 100−010,Mouse
CRL 2514、CRL 2515,CRL 2516)、HuH−7D12(ECACC 01042712)、293(ATCC
CRL 10852)、A549(ATCC CCL 185)、IMR−90(ATCC CCL 186)、MCF−7(ATC HTB−22)、U−2 OS(ATCC
HTB−96)、T84(ATCC CCL 248)または(分極したもしくは分極していない)任意の株化細胞、またはアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC,10801 University Blvd.Manassas,Va.20110−2209 USA)もしくはヨーロッパ培養細胞コレクション(European
Collection of Cell Cultures)(ECACC,Salisbury Wiltshire SP4
0JG England)などの貯蔵所から入手可能な任意の細胞株。本発明の細胞または細胞株を作製するために使用される宿主細胞は、懸濁液中に存在してもよい。例えば、これらの宿主細胞は、懸濁液に適合する接着細胞であってもよい。
et al.,2000,Molecular and Cellular
Biology 20:990−1000およびSchleifman et al.,2008,Methods Molecular Biology 435:175−90を参照されたい。
Flexi(登録商標)、pFC14K(HaloTag(登録商標)7)CMV Flexi(登録商標)、pFN24A(HaloTag(登録商標)7)CMVd3 Flexi(登録商標)、pFN24K(HaloTag(登録商標)7)CMVd3
Flexi(登録商標)、HaloTag(商標)pHT2、pACT、pAdVAntage(商標)、pALTER(登録商標)−MAX、pBIND、pCAT(登録商標)3−Basic、pCAT(登録商標)3−Control、pCAT(登録商標)3−Enhancer、pCAT(登録商標)3−Promoter、pCI、pCMVTNT(商標)、pG5luc、pSI、pTARGET(商標)、pTNT(商標)、pF12A
RM Flexi(登録商標)、pF12K RM Flexi(登録商標)、pReg neo、pYES2/GS、pAd/CMV/V5−DEST Gateway(登録商標)ベクター、pAd/PL−DEST(商標)Gateway(登録商標)ベクター、Gateway(登録商標)pDEST(商標)27ベクター、Gateway(登録商標)pEF−DEST51ベクター、Gateway(登録商標)pcDNA(商標)−DEST47ベクター、pCMV/Bsdベクター、pEF6/His
A、B、&C、pcDNA(商標)6.2−DEST、pLenti6/TR、pLP−AcGFP1−C、pLPS−AcGFP1−N、pLP−IRESneo、pLP−TRE2、pLP−RevTRE、pLP−LNCX、pLP−CMV−HA、pLP−CMV−Myc、pLP−RetroQ、pLP−CMVneo、pCMV−Script、pcDNA3.1
Hygro、pcDNA3.1neo、pcDNA3.1puro、pSV2neo、pIRES puro、およびpSV2
zeoを含んでもよい。いくつかの実施形態において、これらのベクターは、構成的または条件的プロモーターなどの発現制御配列を含む。当業者はかかる配列を選択することができるであろう。例えば、適切なプロモーターにはCMV、TK、SV40、およびEF−1αが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、これらのプロモーターは、誘導性プロモーター、温度制御されるプロモーター、組織特異的プロモーター、抑制可能なプロモーター、ヒートショックプロモーター、発生のプロモーター、細胞系統別のプロモーター、真核生物のプロモーター、原核生物のプロモーターもしくは一時的なプロモーター、または上記のうちの任意の1つ以上の、修飾されないかまたは突然変異を起こさせた配列、ランダム化される配列、組換えられる配列の組み合わせもしくは組換えである。他の実施形態において、CFTRは、遺伝子活性化によって、またはCFTRをコードする遺伝子がエピソームである時に発現する。CFTRをコードする核酸を、好ましくは構成的に発現させてもよい。
JH,Chung TD,Oldenburg KR,“A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation
of High Throughput Screening Assays.”J.
Biomol.Screen.1999;4(2):67−73を参照されたい。Z’値は、細胞または細胞株がモジュレーターに対して一貫して反応する程度を反映するので、細胞または細胞株の質と関係がある。Z’は、マルチウェルプレートの全域の参照化合物に対する機能的反応のシグナル対ノイズの範囲およびシグナル変動(すなわち、ウェル間で)を考慮する統計的計算値である。Z’を、陽性対照を有するマルチウェルおよび陰性対照を有するマルチウェルから得られるデータを用いて計算する。以下の式に従って、それらの平均値の差に対する、それらの標準偏差に3倍をかけ合計した値の比を1から引くことで、Z’因子を得る。
et al.,Am J Physiol Cell Physiol.281(5):C1734−1742(2001)に開示され、CFTRを安定的に発現するフィッシャーラット甲状腺発現株におけるフォルスコリンのEC50は、250nM〜500nMの間の値である。
cell lines)を容易に単離することが可能である。
SHUTTLE、METAFECTENE、LYOVEC、LIPOTAXI、GENEERASER、GENEJUICE、CYTOPURE、JETSI、JETPEI、MEGAFECTIN、POLYFECT、TRANSMESSANGER、RNAiFECT、SUPERFECT、EFFECTENE、TF−PEI−KIT、CLONFECTIN、およびMETAFECTINEが挙げられる。
2000、FUGENE 6、FUGENE HD、TFX−10、TFX−20、TFX−50、OLIGOFECTAMINE、TRANSFAST、TRANSFECTAM、GENESHUTTLE、TROJENE、GENESILENCER、X−TREMEGENE、PERFECTIN、CYTOFECTIN、SIPORT、UNIFECTOR、SIFECTOR、TRANSIT−LT1、TRANSIT−LT2、TRANSIT−EXPRESS、IFECT、RNAI
SHUTTLE、METAFECTENE、LYOVEC、LIPOTAXI、GENEERASER、GENEJUICE、CYTOPURE、JETSI、JETPEI、MEGAFECTIN、POLYFECT、TRANSMESSANGER、RNAiFECT、SUPERFECT、EFFECTENE、TF−PEI−KIT、CLONFECTIN、およびMETAFECTINEが挙げられる。
a)CFTRをコードするmRNAを発現する多数の細胞を提供するステップと;
b)細胞を個々の培養容器に1つ1つ分散させ、それによって多数の別々の細胞培養を提供するステップと;
c)培養条件が別々の細胞培養物の各々と実質的に同一であり、その培養中、別々の各細胞培養物中の細胞数を正規化し、別々の培養物を同じスケジュールで継代することを特徴とする自動化細胞培養法を用いて一連の所望の培養条件下で細胞を培養するステップと;
d)CFTRの少なくとも1つ所望の特徴について別々の培養細胞物を少なくとも2回アッセイするステップと;
e)両方のアッセイにおいて所望の特徴を有する別々の細胞培養物を同定するステップと
を含む。
VECTORなどのこの目的のための市販のソフトウェアを用いて、集密度の日付から増殖速度を計算することができる。顕微鏡を用いた自動化プレートリーダーを用いるなどの自動化集密度測定が特に有用である。集密度を測定するプレートリーダーは商業的に入手可能であり、CLONE
SELECT IMAGER(Genetix)を含むがそれに限定されない。典型的には、増殖速度を計算する前に、細胞集密度を少なくとも2回測定する。増殖速度を決定するために使用する集密度の数値は、培養に都合のよいまたは適する任意の数値であり得る。例えば、集密度を、例えば、1週間、2週間、3週間にわたって、または望ましい任意の長さの時間および任意の頻度で複数回測定することができる。
STAR(商標)装置(Hamilton)を、本発明の方法において使用してもよい。この自動化システムは、様々な所望の細胞培養作業を実行することができなければならない。かかる作業を、当業者は知っているであろう。それらには、培地の除去、培地交換、試薬の添加、細胞洗浄、洗浄液の除去、分散剤の添加、培養容器からの細胞の除去、培養容器への細胞の添加などが含まれるが、これらに限定されない。
al.,J Histochem Cytochem.38(5):685−690(1990);Roepe et al.,Biochemistry.32(41):11042−11056(1993);Simon et al.,Proc Natl Acad
Sci U S A.91(3):1128−1132(1994))、リソソームおよびエンドソームpHを減少させる(Schindler
et al.,Biochemistry.35(9):2811−2817(1996);Altan
et al.,J Exp Med.187(10):1583−1598(1998))、細胞膜電位を減少させる(Roepe et al.,Biochemistry.32(41):11042−11056(1993))、塩素イオンに対する細胞膜コンダクタンスを増加させる(Gill et al.,Cell.71(1):23−32(1992))およびATPに対する細胞膜コンダクタンスを増加させる(Abraham
et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.90(1):312−316(1993))、小胞輸送速度を増加させる(Altan
et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.96(8):4432−4437(1999))ことができる。一般的に使用される非抗生物質選択マーカーであるGFPは、特定の細胞株において細胞死を引き起こすことができる(Hanazono et al.,Hum Gene Ther.8(11):1313−1319(1997))。したがって、本発明の細胞および細胞株は、選択薬またはマーカーによってもたらされる任意の人工産物が存在しないスクリーニングアッセイを可能にする。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の細胞および細胞株を、細胞選別前後に抗生物質などの選択薬と共に培養せず、その結果、濃縮細胞の集団を発端にせずとも、所望の特性を有する細胞および細胞株を選別により単離する。
Merck Manual,18th Edition(Hardcover),Mark
H.Beers(Author),Robert S.Porter(Editor),Thomas V.Jones(Editor)にまとめられている。精神の疾患および障害は、例えば、米国精神学会によるDiagnostic and
Statistical Manual of Mental Disorders(DSM−IV−TR)第4版(Text Revision)にまとめられている。
CR et al.,Cell Stress and Chaperones(1996)v1(2):117−125を参照されたい);2)DMSO(例えば、Brown CR et al.,Cell
Stress and Chaperones(1996)v1(2):117−125を参照されたい);3)重水素化水(D2O)(例えば、Brown
CR et al.,Cell Stress and Chaperones(1996)v1(2):117−125を参照されたい);4)トリメチルアミンオキシドなどのメチルアミン(例えば、Brown CR et al.,Cell Stress and Chaperones(1996)v1(2):117−125を参照されたい);5)アダマンチルスルホガラクトシルセラミド(Adamantyl sulfogalactosyl
ceramide)(adaSGC)(例えば、Park HJ et al.,Chemistry and Biology(2009)v16:461−470を参照されたい);6)血管作用性小腸ペプチド(VIP)(例えば、Journal of Biological
Chemistry(1999)v112:887−894を参照されたい);7)フェニル酪酸ナトリウム(S−PBA)(例えば、Singh OV et al.,Molecular
and Cellular Proteomics(2008)v7:1099−1110を参照されたい);8)VRT−325(例えば、Wang Y et al.,Journal of
Biological Chemistry(2007)v282(46):33247−33257を参照されたい);9)VRT−422(例えば、Van Goor F et al.,American
Journal of Physiology Lung Cell Molecular Physiology(2006)v290:L1117−1130を参照されたい);10)補正物質(Corrector)2b(例えば、Wang
Y et al.,Journal of Biological Chemistry(2007)v282(46):33247−33257を参照されたい);11)補正物質3a(例えば、Wang Y et al.,Journal
of Biological Chemistry(2007)v282(46):33247−33257を参照されたい);12)補正物質4a(例えば、Wang
Y et al.,Journal of Biological Chemistry(2007)v282(46):33247−33257を参照されたい);13)クルクミン(例えば、Robert R et al.,Molecular Pharmacology(2008)v73:478−489を参照されたい);14)シルデナフィル類似体(KM11060)(例えば、Robert R et al.,Molecular
Pharmacology(2008)v73:478−489を参照されたい);15)アラニン、グルタミン酸、プロリン、GABA、タルイン(Taruine)、スクロース、トレハロース、ミオイノシトール、アラビトール、マンニトール、マンノース、スクロース、ベタイン、グリセロホスホリルコリン、サルコシン(例えば、Welch
WJ et al.,Cell Stress and Chaperones(1996)v1(2):109−115を参照されたい);および16)式
CFTRを安定的に発現する発現細胞株の作製
発現コンストラクトの作製
pCMV−SCRIPT(Stratagene)に基づいて、合理的なクローニングを可能にするプラスミド発現ベクターを作製し、これに、CMVおよびSV40真核生物プロモーター;SV40およびHSV−TKポリアデニル化配列;マルチクローニング部位;コザック配列;ならびに薬物耐性カセット(すなわち、ピューロマイシン)含む、対象の遺伝子の転写および翻訳に必要な様々な構成要素を含めた。アンピシリンまたはネオマイシン耐性カセットを、ピューロマイシンと置換して使用することもできる。その後、タグ配列(配列番号8)を、このプラスミドのマルチクローニング部位に挿入した。その後、ヒトCFTRをコードするcDNAカセットを、Asc1およびPac1制限酵素を用いて、このタグ配列の上流のマルチクローニング部位にサブクローニングした。
ステップ1:トランスフェクション
標準的な技術を用いて、CHO細胞を、ヒトCFTR(配列番号1)をコードするプラスミドでトランスフェクトした。(宿主細胞に核酸を導入するために使用され得る試薬の例として、LIPOFECTAMINE(商標)、LIPOFECTAMINE(商標)2000、OLIGOFECTAMINE(商標)、TFX(商標)試薬、FUGENE(登録商標)6、DOTAP/DOPE、メタフェクチン(Metafectine)またはFECTURIN(商標)が挙げられるが、これらに限定されない。)
トランスフェクト細胞を、抗生物質を含まないHam’s F12−FBS培地(Sigma
Aldrich,St Louis,MO)中で2日間増殖させ、その後、12.5μg/mlのピューロマイシンを含むHam’s
F12−FBS培地中で10日間増殖させた。その後、残りの時間、これらの細胞を、抗生物質を含まないHam’s F12−FBS培地に移し、シグナルプローブを加えた。
抗生物質による濃縮後、抗生物質選択がない状態で細胞を5〜14回継代して、選択する期間にわたって安定的ではない発現の時間を低下させることができた。
標準的な技術を用いて、細胞を収集し、シグナルプローブ2(配列番号9)でトランスフェクトした。(宿主細胞に核酸を導入するために使用され得る試薬の例として、LIPOFECTAMINE(商標)、LIPOFECTAMINE(商標)2000、OLIGOFECTAMINE(商標)、TFX(商標)試薬、FUGENE(登録商標)6、DOTAP/DOPE、メタフェクチン(Metafectine)またはFECTURIN(商標)が挙げられるが、これらに限定されない。)シグナルプローブ2(配列番号9)を標的配列2(配列番号8)に結合させた。その後、これらの細胞を解析のために収集し、蛍光活性化細胞選別装置を用いて選別した。
標的配列2
5’−GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC−3’(配列番号8)
シグナルプローブ2(100μMストックとして供給される)
5’−CY5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ2−3’(配列番号9)
標的配列1
5’−GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC−3’(配列番号3)
シグナルプローブ1(100μMストックとして供給される)
5’−Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ2−3’(配列番号6)
蛍光活性化細胞選別装置(Beckman Coulter,Miami,FL)を用いる解析および選別のために、これらの細胞を解離させ、収集した。標準的な解析法を用いて、バックグラウンド以上に蛍光を発している細胞をゲーティングし、そのゲートの範囲に入る個々の細胞を、バーコード化した96ウェルプレートに単離した。以下のゲーティング階層を用いた:
一致のゲーティング→一重項ゲーティング→生存ゲーティング→FAM対Cy5.5のプロットにおける選別ゲーティング:本分野の標準的手順に従って、細胞の0.1〜0.4%。
ステップ1〜5および/または3〜5を繰り返し、より多くの細胞を取得した。ステップ1〜5を2ラウンド行い、これらのラウンドの各々について、ステップ3〜5の内部サイクルを2回行った。
これらのプレートをMicrolab Star(Hamilton
Robotics)に移した。100ユニット/mlのペニシリンおよび0.1mg/mlのストレプトマイシンを補完した、新鮮な完全増殖培地および2〜3日馴化した増殖培地の1:1の混合物100μl中で、細胞を9日間インキュベートした。その後、これらの細胞を1回または2回、トリプシン処理により分散させ、凝集塊を最小化し、その後、新しい96ウェルプレートに移した。プレートを画像化し、ウェルの集密度を決定した(Genetix)。プレート全体の信頼性のある画像収集のために、各プレートに焦点を合わせた。集密度が70%を超えると報告されたものは信頼しなかった。分散後1〜10日間の連続した日に、集密度の測定値を取得し、それを用いて増殖速度を計算した。
ステップ7の分散ステップ後2週間以内の増殖速度に従って、細胞をグループ分けした(独立してグループ化し、コホートとしてプレーティングした)。3つの増殖グループの各々を、個々の96ウェルプレートに分離した。いくつかの増殖グループは2つ以上の96ウェルプレートが必要になった。増殖速度の隔たりを考慮し、かつ細胞の集団の総数の高い割合を一まとめにすることによって、グループ分けを行った。増殖速度における12〜16時間の違いをまとめて、グループ分けを行った。
これらのプレートを、抗生物質を含まない標準化した一定条件(すなわち、Ham’s
F12−FBS培地、37℃/5%CO2)下でインキュベートした。これらの細胞のプレートを分割し、4セットの96ウェルプレート(凍結用に3セット、アッセイおよび継代用に1セット)を作り出した。これらのプレートのセットのそれぞれに対して、別々の独立した組織培養試薬、インキュベーター、担当者、および二酸化炭素源を用いた。品質管理ステップを設け、全組織培養試薬の適切な調製および品質を確実にした。一人の指定された人が、フードの中に調製用試薬のみを有する1つの指定されたフードの中で、使用するために調製した培地の各ボトルに各成分を加え、その間、第二の指定された人が監視をして間違いを避けた。液体処理に必要な条件を設定し、ウェル全域の相互汚染を排除した。全ステップについて新しいチップを用いるか、またはストリンジェントなチップ洗浄手順を用いた。正確な量を移すこと、効率的な細胞操作、洗浄サイクル、ピペッティングの速度および位置、細胞分散のためのピペッティングサイクル数、ならびにチップのプレートに対する相対的位置について、液体処理条件を設定した。
3セットのプレートを、−70〜−80℃で凍結させた。最初に、各セットのプレートを70〜100%の集密度に到達させた。培地を吸引し、90%FBSおよび10%DMSOを加えた。これらのプレートをそれぞれパラフィで密封し、それぞれ1〜5cmの発泡体で囲み、その後、−80℃の冷凍庫の中に入れた。
残りのセットのプレートを、ステップ9で記載した通りに維持した。培地除去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチングならびに細胞分散ステップを含む自動化液体処理ステップを用いて、全細胞をバラバラにした。
全細胞の集団について、細胞条件および培養条件の一貫性および標準化をコントロールした。プレート全域の細胞数の正規化により、増殖速度のわずかな違いによるプレート全域の違いをコントロールし、再配列後8継代ごとに正規化を行った。異常値である細胞の集団を検出し、排除した。
これらの細胞を、培養液中の再配列後6〜10週間維持した。この期間中、所定の内部品質管理の一部として、サイズ、形態、微小集密度(microconfluency)への傾向、ぜい弱性、トリプシン処理に対する反応およびトリプシン処理後の平均円形度、または培養プレート表面への接着および液体添加の際の吹き飛びに対する抵抗などの細胞維持の他の態様を観察し、頑強な細胞を同定した。その後、機能評価を目的として、かかるベンチマーク細胞を認めた。
機能基準を用いて、細胞の集団を試験した。製造元の取扱説明書に従って、膜電位染色キット(Molecular
Devices,MDS)を用いた。
少ない継代数および多い継代数で行った実験の機能的反応を比較して、所定の期間にわたって(例えば、3〜9週間)最も一貫性のある反応を有する細胞を同定する。時間とともに変化する細胞の他の特徴にも留意する。
機能的でかつ他の基準を満たす細胞の集団をさらに評価し、生存可能で、安定的でかつ機能的な細胞株の作製が最も可能な細胞の集団を見つけ出す。選択される細胞の集団を、より大きな組織培養容器の中で増やし、これらの条件下で、上記の特徴づけのステップを継続するか繰り返す。この時点で、一貫性があり、信頼できる継代を目的に、異なる細胞密度、プレーティング時間、細胞培養継代の長さ、細胞培養皿の形式およびコーディング、速度およびせん断力を含む流動性の最適化、継代期間、および洗浄ステップなどのさらなる標準化ステップを導入する。
最終的な細胞株および予備の細胞株に相当する継代数の少ない凍結ストックを37℃で解凍し、Ham’s
F12−FBSで2回洗浄し、その後Ham’s F12−FBS中でインキュベートする。その後、これらの細胞を2〜4週間増やす。各々の最終的でかつ予備の細胞株のクローンの細胞バンクを確立し、各クローン細胞の25バイアルを凍結保存する。
この細胞バンクから少なくとも1バイアルを解凍し、培養液中で増やす。得られた細胞を試験して、それらの細胞が最初に選択された特徴と同じ特徴を満たすかどうかを調べる。
天然のCFTR機能についての安定細胞株の特徴づけ
ハイスループット適合蛍光膜電位アッセイを用いて、作製された、CFTRを安定的に発現する細胞株における天然のCFTR機能を特徴づけた。
F12培地中の標準的細胞培養条件下で維持した。アッセイの前日に、ストックプレートからこれらの細胞を収集し、アッセイの日に90%集密度に達成するのに十分な密度で、黒色透明の底を有する384ウェルアッセイプレートにプレーティングした。これらのアッセイプレートを、5%CO2下の37℃の細胞培養インキュベーターの中で22〜24時間維持した。その後、この培地をこれらのアッセイプレートから除去し、ローディング緩衝液(137mM
NaCl、5mM KCl、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)で希釈した青色膜電位色素(Molecular
Devices Inc.)を加え、37℃で1時間インキュベートした。その後、これらのアッセイプレートを蛍光プレートリーダー(Hamamatsu
FDSS)に載せ、化合物緩衝液(137mM グルコン酸ナトリウム、5mM グルコン酸カリウム、1.25mM CaCl2、25mM
HEPES、10mM グルコース)に溶解させたフォルスコリンとIBMXの混合物を加えた。
et al.,Am J Physiol Cell Physiol.281(5):C1734−1742(2001))にフォルスコリンのEC50値を示し、このことは、このクローンの有効性を示す。
CFTR細胞に基づくアッセイに関するZ’値の決定
作製された、CFTRを安定的に発現する細胞株のZ’値を、ハイスループット適合蛍光膜電位アッセイを用いて計算した。この蛍光膜電位アッセイの手順を、実施例2の手順に実質的に従って行った。具体的には、Z’アッセイについて、(15,000細胞/ウェルの密度でプレーティングした)384ウェルアッセイプレート中の陽性対照の24ウェルを、CFTRを活性化するフォルスコリンとIBMXの混合物を用いて検証した。等しい数のウェルを、(活性化因子を含まない)溶媒のみ、およびDMSOを含む溶媒を用いて検証した。2つの条件における細胞反応を、蛍光プレートリーダー(Hamamatsu FDSS)を用いて監視した。2つの条件における平均値および標準偏差を計算し、Zhang
et al.,J Biomol
Screen,4(2):67−73,(1999)に開示される方法を用いてZ’を算出した。作製されたCFTRを安定的に発現する細胞株のZ’値が、0.82より高いかまたは0.82と等しいと決定した。
CFTRモジュレーターのハイスループットスクリーニングおよび同定
ハイスループット適合蛍光膜電位アッセイを用いて、CFTRモジュレーターをスクリーニングおよび同定する。アッセイの前日に、ストックプレートから抗生物質を含まない増殖培地にこれらの細胞を収集し、黒色透明の底を有する384ウェルアッセイプレートにプレーティングした。これらのアッセイプレートを、5%CO2下の37℃の細胞培養インキュベーターの中で19〜24時間維持する。その後、この培地をこれらのアッセイプレートから除去し、ローディング緩衝液(137mM
NaCl、5mM KCl、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)で希釈した青色膜電位色素(Molecular
Devices Inc.)を加え、これらの細胞を37℃で1時間インキュベートする。試験化合物をアッセイ緩衝液(137mM グルコン酸ナトリウム、5mM グルコン酸カリウム、1.25mM
CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)で希釈したジメチルスルホキシドに溶解させ、その後、384ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに供する。この細胞および化合物プレートを蛍光プレートリーダー(Hamamatsu
FDSS)に載せ、3分間稼働させ、試験化合物活性を同定する。この機器は、300nM〜1μMの濃度でフォルスコリン溶液をこれらの細胞に加え、事前に加えた化合物のモジュレーターまたは遮断薬活性のいずれか一方の観察を可能にする。試験化合物をこれらの細胞に添加した後および/またはそれに続くアゴニスト添加後に生成される蛍光の変化を測定することによって、この化合物の活性を決定する。
短絡回路電流測定を用いた天然CFTR機能についてのCFTRを安定的に発現する細胞株の特徴づけ
CFTRを発現する細胞(肺および腸を含むがこれらに限定されない初代上皮細胞または不死化上皮細胞)をカルチャーインサート(Snapwell,Corning Life Sciences)上にプレーティングした7〜14日後に、Ussingチャンバー実験を行う。カルチャーインサート上の細胞を軽くすすぎ、Ussing型装置(EasyMount
Chamber System,Physiologic Instruments)に載せ、120mM NaCl、25mM
NaHCO3、3.3mM KH2PO4、0.8mM K2HPO4、1.2mM
CaCl2、1.2mM MgCl2、および10mM グルコースを含み、連続的にガスが供給され、37℃で維持されるリンガー液(O2中5%CO2、pH7.4)に浸す。ヘミチャンバー(hemichamber)を、マルチチャネル電圧および電流固定(VCC−MC8
Physiologic Instruments)に接続する。電極[寒天架橋(1M KCl中4%)Ag−AgCl]を使用し、インサートを0mVに電圧固定する。経上皮の電流、電圧および抵抗を、実験期間中10秒ごとに測定する。200mΩ未満の抵抗を有する膜は廃棄する。
電気生理学的アッセイを用いた天然CFTR機能についてのCFTRを安定的に発現する細胞株の特徴づけ
手動の電気生理学的アッセイおよび自動化された電気生理学的アッセイの両方が開発され、両方とも天然CFTR機能をアッセイするのに適用することができ、以下に、手動のパッチクランプ実験の手順を記載する。
NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM グルコース、10mM マンニトール、および10mM TES、pH7.4が含まれる。ピペット溶液には、120mM
CsCl、1mM MgCl2、10mM TEA−Cl、0.5mM EGTA、1mM Mg−ATP、および10mM HEPES(pH7.3)が含まれる。−80mV〜−100mVの間に膜電位を変化させることによって、膜コンダクタンスを監視する。段階的に20mVずつ、−100mV〜+100mVの間の電圧パルスを加えることによって、電流−電圧曲線を作成する。
CFTR−ΔF508を安定的に発現する細胞株の作製
発現構築物の作製
pCMV−SCRIPT(Stratagene)に基づいて、合理的なクローニングを可能にするプラスミド発現ベクターを作製し、これには、CMVおよびSV40真核生物プロモーター;SV40およびHSV−TKポリアデニル化配列;マルチクローニング部位;コザック配列;ならびに薬物耐性カセット(すなわち、ピューロマイシン)含む、対象の遺伝子の転写および翻訳に必要な様々な構成要素が含まれた。アンピシリンまたはネオマイシン耐性カセットを、ピューロマイシンと置換して使用することもできる。その後、タグ配列(配列番号8)を、このプラスミドのマルチクローニング部位に挿入した。その後、ヒトCFTRをコードするcDNAカセットを、Asc1およびPac1制限酵素を用いて、このタグ配列の上流のマルチクローニング部位にサブクローニングした。その後、部位特異的変異誘発(Stratagene)を用いて、508番目の単一フェニルアラニンアミノ酸を除去し、ヒトCFTR−ΔF508(配列番号7)をコードするプラスミドを作製した。上記の変異誘発法は、任意の数の様々なCFTR対立遺伝子(現在知られているものか、または将来的に知られるようになるもののいずれか一方)の、ハイスループット作製に適合する。
ステップ1:トランスフェクション
標準的な方法を用いて、CHO細胞を、ヒトCFTR−ΔF508(配列番号7)をコードするプラスミドでトランスフェクトした。(宿主細胞に核酸を導入するために使用され得る試薬の例として、LIPOFECTAMINE(商標)、LIPOFECTAMINE(商標)2000、OLIGOFECTAMINE(商標)、TFX(商標)試薬、FUGENE(登録商標)6、DOTAP/DOPE、メタフェクチン(Metafectine)またはFECTURIN(商標)が挙げられるが、これらに限定されない。)
トランスフェクト細胞を、抗生物質を含まないHam’s F12−FBS培地(Sigma
Aldrich,St Louis,MO)中で2日間増殖させ、その後、12.5μg/mlのピューロマイシンを含むHam’s
F12−FBS培地中で10日間増殖させた。その後、残りの時間、これらの細胞を、抗生物質を含まないHam’s F12−FBS培地に移し、シグナルプローブを加えた。
抗生物質による濃縮後、抗生物質選択がない状態で細胞を5〜14回継代して、選択する期間にわたって安定的ではない発現の時間を低下させることができた。
標準的な技術を用いて、細胞を収集し、シグナルプローブ2(配列番号9)でトランスフェクトした。(宿主細胞に核酸を導入するために使用され得る試薬の例として、LIPOFECTAMINE(商標)、LIPOFECTAMINE(商標)2000、OLIGOFECTAMINE(商標)、TFX(商標)試薬、FUGENE(登録商標)6、DOTAP/DOPE、メタフェクチン(Metafectine)またはFECTURIN(商標)が挙げられるが、これらに限定されない。)シグナルプローブ2(配列番号9)を標的配列2(配列番号8)に結合させた。その後、これらの細胞を解析のために収集し、蛍光活性化細胞選別装置を用いて選別した。
標的配列2
5’−GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC−3’(配列番号8)
シグナルプローブ2(100μMストックとして供給される)
5’−CY5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ2−3’(配列番号9)
標的配列1
5’−GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGAC−3’(配列番号3)
シグナルプローブ1(100μMストックとして供給される)
5’−Cy5GCCAGTCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAACCTCGCBHQ2−3’(配列番号6)
蛍光活性化細胞選別装置(Beckman Coulter,Miami,FL)を用いる解析および選別のために、これらの細胞を解離させ、収集した。標準的な解析法を用いて、バックグラウンド以上に蛍光を発している細胞をゲーティングし、そのゲートの範囲に入る個々の細胞を、バーコード化した96ウェルプレートに単離した。以下のゲーティング階層を用いた:
一致のゲーティング→一重項ゲーティング→生存ゲーティング→FAM対Cy5.5のプロットにおける選別ゲーティング:本分野の標準的手順に従って、細胞の0.1〜0.5%。
ステップ1〜5および/または3〜5を繰り返し、より多くの細胞を取得した。ステップ1〜5を2ラウンド行い、これらのラウンドの各々について、ステップ3〜5の内部サイクルを2回行った。
これらのプレートをMicrolab Star(Hamilton
Robotics)に移した。100ユニット/mlのペニシリンおよび0.1mg/mlのストレプトマイシンを補完した、新鮮な完全増殖培地および2〜3日馴化した増殖培地の1:1の混合物100μl中で、細胞を9日間インキュベートした。その後、これらの細胞を1回または2回、トリプシン処理により分散させ、凝集塊を最小化し、その後、新しい96ウェルプレートに移した。プレートを画像化し、ウェルの集密度を測定した(Genetix)。プレート全体の信頼性のある画像収集のために、各プレートに焦点を合わせた。集密度が70%を超えると報告されたものは信頼しなかった。分散後1〜10日間の連続した日に、集密度の測定値を取得し、それを用いて増殖速度を計算した。
ステップ7の分散ステップ後2週間以内の増殖速度に従って、細胞をグループ分けした(独立してグループ化し、コホートとしてプレーティングした)。3つの増殖グループの各々を、個々の96ウェルプレートに分離した。いくつかの増殖グループは2つ以上の96ウェルプレートが必要になった。増殖速度の隔たりを考慮し、かつ細胞の集団の総数の高い割合を一まとめにすることによって、グループ分けを行った。増殖速度の12〜16時間の違いをまとめて、グループ分けを行った。
これらのプレートを、抗生物質を含まない標準化した一定条件(すなわち、Ham’s
F12−FBS培地、37℃/5%CO2)下でインキュベートした。これらの細胞のプレートを分割し、2セットの96ウェルプレート(凍結用に1セット、アッセイおよび継代用に1セット)を作り出した。これらのプレートのセットのそれぞれに対して、別々の独立した組織培養試薬、インキュベーター、担当者、および二酸化炭素源を用いた。品質管理ステップを設け、全組織培養試薬の適切な調製および品質を確実にした。一人の指定された人が、フードの中に調製用試薬のみを有する1つの指定されたフードの中で、使用するために調製した培地の各ボトルに各成分を加え、その間、第二の指定された人が監視をして間違いを避けた。液体処理に必要な条件を設定し、ウェル全域の相互汚染を排除した。全ステップについて新しいチップを用いるか、またはストリンジェントなチップ洗浄手順を用いた。正確な量を移すこと、効率的な細胞操作、洗浄サイクル、ピペッティングの速度および位置、細胞分散のためのピペッティングサイクル数、ならびにチップのプレートに対する相対的位置について、液体処理条件を設定した。
1セットのプレートを、−70〜−80℃で凍結させた。最初に、プレートを70〜100%の集密度に到達させた。培地を吸引し、90%FBSおよび10%DMSOを加えた。これらのプレートをそれぞれパラフィで密封し、それぞれ1〜5cmの発泡体で囲み、その後、−80℃の冷凍庫の中に置いた。
残りのセットのプレートを、ステップ9で記載した通りに維持した。培地除去、細胞洗浄、トリプシン添加およびインキュベーション、クエンチングならびに細胞分散ステップを含む自動化液体処理ステップを用いて、全細胞をバラバラにした。
細胞の全集団について、細胞条件および培養条件の一貫性および標準化をコントロールした。プレート全域の細胞数の正規化により、増殖速度のわずかな違いによるプレート全域の違いをコントロールし、再配列後8継代ごとに正規化を行った。異常値である細胞の集団を検出し、排除した。
これらの細胞を、培養液中の再配列後6〜10週間維持した。この期間中、所定の内部品質管理の一部として、サイズ、形態、微小集密度(microconfluency)への傾向、ぜい弱性、トリプシン処理に対する反応およびトリプシン処理後の平均円形度、または培養プレート表面への接着および液体添加の際の吹き飛びに対する抵抗などの細胞維持の他の態様を観察し、頑強な細胞を同定した。その後、機能評価を目的として、かかるベンチマーク細胞を認めた。
ハイスループット適合蛍光に基づく膜電位染色キット(Molecular
Devices,MDS)を用いて、製造元の取扱説明書に従って、受容体機能について細胞の集団を試験した。
F12培地中の標準的細胞培養条件下で維持した。アッセイの前日に、ストックプレートからこれらの細胞を収集した。アッセイの日に90%集密度に達するのに十分な密度で、タンパク質輸送補正物質であるChembridge社の化合物番号5932794(Chembridge,San Diego,CA)(Yoo et al.,(2008)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters;18(8):2610−2614)を含むまたは含まない、黒色透明の底を有する384ウェルアッセイプレートに、これらの細胞をプレーティングした。この化合物は、N−{2−[(2−メトキシフェニル)アミノ]−4’−メチル−4,5’−ビ−1,3−チアゾ−ル−2’−イル}ベンズアミド臭化水素酸であり、式
NaCl、5mM KCl、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)で希釈した膜電位色素(青色またはAnaSpec,Molecular Devices Inc.)を、膜電位色素のクエンチャーと共にまたはこのクエンチャーを含めないで加え、37℃で1時間インキュベートした。このクエンチャーは、当技術分野で知られる任意のクエンチャー、例えば、ジピクリルアミン(DPA)、アシッドバイオレット17(AV17)、ジアジンブラック(DB)、HLB30818、トリパンブルー、ブルモフェノールブルー、HLB30701、HLB30702、HLB30703、ニトラジンイエロー、ニトロレッド、DABCYL(Molecular
Probes)、QSY(Molecular Probes)、金属イオンクエンチャー(例えば、Co2+、Ni2+、Cu2+)、およびヨウ化物イオンであり得る。
FDSS)に載せ、化合物緩衝液(137mM グルコン酸ナトリウム、5mM グルコン酸カリウム、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)に溶解させたフォルスコリンとIBMXの混合物を加えた。
少ない継代数および多い継代数で行った実験の機能的反応を比較して、所定の期間にわたって(例えば、3〜9週間)最も一貫性のある反応を有する細胞を同定する。時間とともに変化する細胞の他の特徴にも留意する。
機能的でかつ他の基準を満たす細胞の集団をさらに評価し、生存可能で、安定的でかつ機能的な細胞株の作製が最も可能な細胞の集団を見つけ出す。選択される細胞の集団を、より大きな組織培養容器の中で増やし、これらの条件下で、上記の特徴づけのステップを継続するか繰り返えす。この時点で、一貫性があり、信頼できる継代を目的に、異なる細胞密度、プレーティング時間、細胞培養継代の長さ、細胞培養皿の形式(注釈:研究していない)、速度およびせん断力を含む流動性の最適化、継代期間、および洗浄ステップなどのさらなる標準化ステップを導入する。
最終的な細胞株および予備の細胞株に相当する継代数の少ない凍結ストックを37℃で解凍し、Ham’s
F12−FBSで1回洗浄し、その後Ham’s F12−FBS中でインキュベートする。その後、これらの細胞を2〜4週間増やす。各々の最終的でかつ予備の細胞株のクローンの細胞バンクを確立し、各クローン細胞の25バイアルを凍結保存する。
この細胞バンクの少なくとも1バイアルを解凍し、培養液中で増やす。得られた細胞を試験して、それらの細胞が最初に選択された特徴と同じ特徴を満たすかどうかを調べる。
CFTR−ΔF508機能についての安定細胞株の特徴づけ
ハイスループット適合蛍光膜電位アッセイを用いて、作製されたCFTR−ΔF508を安定的に発現する細胞株におけるCFTR−ΔF508の機能を特徴づける。
F12培地中、標準的細胞培養条件下で維持する。アッセイの前日に、ストックプレートからこれらの細胞を収集し、タンパク質輸送補正物質(例えば、Chembridge社の化合物番号5932794、N−{2−[(2−メトキシフェニル)アミノ]−4’−メチル−4,5’−ビ−1,3−チアゾ−ル−2’−イル}ベンズアミド臭化水素酸)が存在するかまたは存在しない状態で、黒色透明の底を有する384ウェルアッセイプレートにプレーティングする。これらのアッセイプレートを、5%CO2下の37℃の細胞培養インキュベーターの中で22〜24時間維持する。その後、この培地をこれらのアッセイプレートから除去し、ローディング緩衝液(137mM
NaCl、5mM KCl、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)で希釈した青色膜電位色素(Molecular
Devices Inc.)を加え、37℃で1時間インキュベートする。その後、これらのアッセイプレートを蛍光プレートリーダー(Hamamatsu
FDSS)に載せ、化合物緩衝液(137mM グルコン酸ナトリウム、5mM グルコン酸カリウム、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)に溶解させたフォルスコリンとIBMXの混合物を加える。アゴニスト混合物の添加後に生じる蛍光変化を測定することによって、CFTR−ΔF508タンパク質を発現する安定細胞株を同定する。
CFTR−ΔF508細胞に基づくアッセイに関するZ’値の測定
作製された、CFTR−ΔF508を安定的に発現する細胞株のZ’値を、ハイスループット適合蛍光膜電位アッセイを用いて計算する。この蛍光膜電位アッセイの手順を、実施例8の手順に実質的に従って行う。具体的には、Z’アッセイについて、(15,000細胞/ウェルの密度でプレーティングした)384ウェルアッセイプレート中の陽性対照の24ウェルを、CFTRを活性化するフォルスコリンとIBMXの混合物を用いて検証する。等しい数のウェルを、(活性化因子を含まない)溶媒のみ、およびDMSOを含む溶媒を用いて検証する。タンパク質輸送補正物質(例えば、Chembridge社の化合物番号5932794、N−{2−[(2−メトキシフェニル)アミノ]−4’−メチル−4,5’−ビ−1,3−チアゾ−ル−2’−イル}ベンズアミド臭化水素酸)が存在するかまたは存在しない状態で、このアッセイを行うことができる。2つの条件における細胞反応を、蛍光プレートリーダー(Hamamatsu FDSS)を用いて監視する。2つの条件における平均値および標準偏差を計算し、Zhang
et al.,J Biomol
Screen,4(2):67−73,(1999)に開示される方法を用いてZ’を算出した。
CFTR−ΔF508モジュレーターのハイスループットスクリーニングおよび同定
ハイスループット適合蛍光膜電位アッセイを用いて、1つまたは複数のCFTR−ΔF508モジュレーターをスクリーニングおよび同定する。修飾をする化合物は、アゴニスト活性を増強させるかまたは減少させることにより、細胞表面へのタンパク質輸送を高めるか、またはCFTR−ΔF508アゴニスト(例えば、フォルスコリン)を修飾するかのいずれか一方であり得る。アッセイの前日に、ストックプレートから抗生物質を含まない増殖培地にこれらの細胞を収集し、タンパク質輸送補正物質(例えば、Chembridge社の化合物番号5932794、N−{2−[(2−メトキシフェニル)アミノ]−4’−メチル−4,5’−ビ−1,3−チアゾ−ル−2’−イル}ベンズアミド臭化水素酸)が存在するかまたは存在しない状態で、黒色透明の底を有する384ウェルアッセイプレートにプレーティングした。これらのアッセイプレートを、5%CO2下の37℃の細胞培養インキュベーターの中で19〜24時間維持する。その後、培地をこれらのアッセイプレートから除去し、ローディング緩衝液(137mM
NaCl、5mM KCl、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)で希釈した青色膜電位色素(Molecular
Devices Inc.)を加え、これらの細胞を37℃で1時間インキュベートする。試験化合物をアッセイ緩衝液(137mM グルコン酸ナトリウム、5mM グルコン酸カリウム、1.25mM
CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)で希釈したジメチルスルホキシドに溶解し、その後、384ウェル ポリプロピレンマイクロタイタープレートに入れる。これらの細胞および化合物のプレートを蛍光プレートリーダー(Hamamatsu
FDSS)に載せ、3分間稼働させ、試験化合物活性を同定する。この機器は、300nM〜1μMの濃度でフォルスコリン溶液をこれらの細胞に加え、事前に加えた化合物のモジュレーターまたは遮断薬活性のいずれか一方の観察を可能にする。試験化合物をこれらの細胞に添加した後および/またはそれに続くアゴニスト添加後に生じる蛍光の変化を測定することによって、この化合物の活性を測定する。
NaCl、5mM KCl、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)で希釈した青色膜電位色素(Molecular
Devices Inc.)を加え、これらの細胞を37℃で1時間インキュベートする。その後、これらのアッセイプレートを蛍光プレートリーダー(Hamamatsu
FDSS)に載せ、化合物緩衝液(137mM グルコン酸ナトリウム、5mM グルコン酸カリウム、1.25mM CaCl2、25mM HEPES、10mM グルコース)に溶解させたフォルスコリンとIBMXの混合物を加える。アゴニスト混合物(すなわち、フォルスコリン+IBMX)の添加後に生じる蛍光の変化を測定することにより、試験化合物を調べる。
短絡回路電流測定を用いたCFTR−ΔF508機能についてのCFTR−ΔF508を安定的に発現する細胞株の特徴づけ
CFTR−ΔF508発現細胞(例えば、肺および腸を含むがこれらに限定されない初代上皮細胞または不死化上皮細胞)をカルチャーインサート(Snapwell,Corning Life Sciences)上にプレーティングした7〜14日後に、Ussingチャンバー実験を行う。カルチャーインサート上の細胞を軽くすすぎ、Ussing型装置(EasyMount
Chamber System,Physiologic Instruments)に載せ、120mM NaCl、25mM
NaHCO3、3.3mM KH2PO4、0.8mM K2HPO4、1.2mM
CaCl2、1.2mM MgCl2、および10mM グルコースを含み、連続的にガスが供給され、37℃で維持されるリンガー液(O2中5%CO2、pH7.4)に浸す。ヘミチャンバー(hemichamber)を、マルチチャネル電圧および電流固定(VCC−MC8
Physiologic Instruments)に接続する。電極[寒天架橋(1M KCl中4%)Ag−AgCl]を使用し、インサートを0mVに電圧固定する。経上皮の電流、電圧および抵抗を、実験期間中10秒ごとに測定する。200mΩ未満の抵抗を有する膜を廃棄する。
(実施例12)
電気生理学的アッセイを用いたCFTR−ΔF508機能についてのCFTR−ΔF508を安定的に発現する細胞株の特徴づけ
NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM グルコース、10mM マンニトール、および10mM TES、pH7.4が含まれる。ピペット溶液には、120mM
CsCl、1mM MgCl2、10mM TEA−Cl、0.5mM EGTA、1mM Mg−ATP、および10mM HEPES(pH7.3)が含まれる。−80mV〜−100mVの間に膜電位を変化させることによって、膜コンダクタンスを監視する。段階的に20mVずつ、−100mV〜+100mVの間の電圧パルスを加えることによって、電流−電圧曲線を作成する。
[配列リスト]
atgcagaggtcgcctctggaaaaggccagcgttgtctccaaactttttttcagctggaccagaccaattttgaggaaaggatacagacagcgcctggaattgtcagacatataccaaatcccttctgttgattctgctgacaatctatctgaaaaattggaaagagaatgggatagagagctggcttcaaagaaaaatcctaaactcattaatgcccttcggcgatgttttttctggagatttatgttctatggaatctttttatatttaggggaagtcaccaaagcagtacagcctctcttactgggaagaatcatagcttcctatgacccggataacaaggaggaacgctctatcgcgatttatctaggcataggcttatgccttctctttattgtgaggacactgctcctacacccagccatttttggccttcatcacattggaatgcagatgagaatagctatgtttagtttgatttataagaagactttaaagctgtcaagccgtgttctagataaaataagtattggacaacttgttagtctcctttccaacaacctgaacaaatttgatgaaggacttgcattggcacatttcgtgtggatcgctcctttgcaagtggcactcctcatggggctaatctgggagttgttacaggcgtctgccttctgtggacttggtttcctgatagtccttgccctttttcaggctgggctagggagaatgatgatgaagtacagagatcagagagctgggaagatcagtgaaagacttgtgattacctcagaaatgattgaaaatatccaatctgttaaggcatactgctgggaagaagcaatggaaaaaatgattgaaaacttaagacaaacagaactgaaactgactcggaaggcagcctatgtgagatacttcaatagctcagccttcttcttctcagggttctttgtggtgtttttatctgtgcttccctatgcactaatcaaaggaatcatcctccggaaaatattcaccaccatctcattctgcattgttctgcgcatggcggtcactcggcaatttccctgggctgtacaaacatggtatgactctcttggagcaataaacaaaatacaggatttcttacaaaagcaagaatataagacattggaatataacttaacgactacagaagtagtgatggagaatgtaacagccttctgggaggagggatttggggaattatttgagaaagcaaaacaaaacaataacaatagaaaaacttctaatggtgatgacagcctcttcttcagtaatttctcacttcttggtactcctgtcctgaaagatattaatttcaagatagaaagaggacagttgttggcggttgctggatccactggagcaggcaagacttcacttctaatggtgattatgggagaactggagccttcagagggtaaaattaagcacagtggaagaatttcattctgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcatctttggtgtttcctatgatgaatatagatacagaagcgtcatcaaagcatgccaactagaagaggacatctccaagtttgcagagaaagacaatatagttcttggagaaggtggaatcacactgagtggaggtcaacgagcaagaatttctttagcaagagcagtatacaaagatgctgatttgtatttattagactctccttttggatacctagatgttttaacagaaaaagaaatatttgaaagctgtgtctgtaaactgatggctaacaaaactaggattttggtcacttctaaaatggaacatttaaagaaagctgacaaaatattaattttgcatgaaggtagcagctatttttatgggacattttcagaactccaaaatctacagccagactttagctcaaaactcatgggatgtgattctttcgaccaatttagtgcagaaagaagaaattcaatcctaactgagaccttacaccgtttctcattagaaggagatgctcctgtctcctggacagaaacaaaaaaacaatcttttaaacagactggagagtttggggaaaaaaggaagaattctattctcaatccaatcaactctatacgaaaattttccattgtgcaaaagactcccttacaaatgaatggcatcgaagaggattctgatgagcctttagagagaaggctgtccttagtaccagattctgagcagggagaggcgatactgcctcgcatcagcgtgatcagcactggccccacgcttcaggcacgaaggaggcagtctgtcctgaacctgatgacacactcagttaaccaaggtcagaacattcaccgaaagacaacagcatccacacgaaaagtgtcactggcccctcaggcaaacttgactgaactggatatatattcaagaaggttatctcaagaaactggcttggaaataagtgaagaaattaacgaagaagacttaaaggagtgcttttttgatgatatggagagcataccagcagtgactacatggaacacataccttcgatatattactgtccacaagagcttaatttttgtgctaatttggtgcttagtaatttttctggcagaggtggctgcttctttggttgtgctgtggctccttggaaacactcctcttcaagacaaagggaatagtactcatagtagaaataacagctatgcagtgattatcaccagcaccagttcgtattatgtgttttacatttacgtgggagtagccgacactttgcttgctatgggattcttcagaggtctaccactggtgcatactctaatcacagtgtcgaaaattttacaccacaaaatgttacattctgttcttcaagcacctatgtcaaccctcaacacgttgaaagcaggtgggattcttaatagattctccaaagatatagcaattttggatgaccttctgcctcttaccatatttgacttcatccagttgttattaattgtgattggagctatagcagttgtcgcagttttacaaccctacatctttgttgcaacagtgccagtgatagtggcttttattatgttgagagcatatttcctccaaacctcacagcaactcaaacaactggaatctgaaggcaggagtccaattttcactcatcttgttacaagcttaaaaggactatggacacttcgtgccttcggacggcagccttactttgaaactctgttccacaaagctctgaatttacatactgccaactggttcttgtacctgtcaacactgcgctggttccaaatgagaatagaaatgatttttgtcatcttcttcattgctgttaccttcatttccattttaacaacaggagaaggagaaggaagagttggtattatcctgactttagccatgaatatcatgagtacattgcagtgggctgtaaactccagcatagatgtggatagcttgatgcgatctgtgagccgagtctttaagttcattgacatgccaacagaaggtaaacctaccaagtcaaccaaaccatacaagaatggccaactctcgaaagttatgattattgagaattcacacgtgaagaaagatgacatctggccctcagggggccaaatgactgtcaaagatctcacagcaaaatacacagaaggtggaaatgccatattagagaacatttccttctcaataagtcctggccagagggtgggcctcttgggaagaactggatcagggaagagtactttgttatcagcttttttgagactactgaacactgaaggagaaatccagatcgatggtgtgtcttgggattcaataactttgcaacagtggaggaaagcctttggagtgataccacagaaagtatttattttttctggaacatttagaaaaaacttggatccctatgaacagtggagtgatcaagaaatatggaaagttgcagatgaggttgggctcagatctgtgatagaacagtttcctgggaagcttgactttgtccttgtggatgggggctgtgtcctaagccatggccacaagcagttgatgtgcttggctagatctgttctcagtaaggcgaagatcttgctgcttgatgaacccagtgctcatttggatccagtaacataccaaataattagaagaactctaaaacaagcatttgctgattgcacagtaattctctgtgaacacaggatagaagcaatgctggaatgccaacaatttttggtcatagaagagaacaaagtgcggcagtacgattccatccagaaactgctgaacgagaggagcctcttccggcaagccatcagcccctccgacagggtgaagctctttccccaccggaactcaagcaagtgcaagtctaagccccagattgctgctctgaaagaggagacagaagaagaggtgcaagatacaaggctttga
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5’−GAAGTTAACCCTGTCGTTCTGCGAC−3’
5’−CY5.5GCGAGTCGCAGAACGACAGGGTTAACTTCCTCGCBHQ2−3’
配列表
本出願は、EFS−Webを介して提出された配列表を包含し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組込まれる。2010年3月16日に作製された前記ASCIIコピーは、002298WO.txtと名付けられ、そのサイズは40,540バイトである。
Claims (50)
- 嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)を安定的に発現するように遺伝子工学処理された細胞または細胞株。
- 前記CFTRが、前記CFTRをコードする導入核酸から発現する、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- 前記CFTRが、遺伝子工学処理された遺伝子活性によって活性化される内在性核酸から発現する、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- a)真核性であり、
b)哺乳類であり、
c)内在性のCFTRを発現しないか、または
d)(a)、(b)および(c)の任意の組み合わせである、請求項1に記載の細胞または細胞株。 - 1つまたは複数のCHO細胞である、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- 分極した単分子層を形成することができる、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- 前記CFTRが哺乳類CFTRまたはヒトCFTRである、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- アッセイにおいて、少なくとも0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、または0.85のZ’値をもたらす、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- 選択圧が存在しない状態で維持される、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- 前記CFTRが任意のポリペプチドタグを含まない、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- 自己蛍光タンパク質を発現しない、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- 前記自己蛍光タンパク質が黄色蛍光タンパク質(YFP)またはその変異型である、請求項11に記載の細胞または細胞株。
- 選択圧が存在しない状態で増殖する、請求項1に記載の細胞または細胞株。
- 前記細胞または細胞株が、選択圧が存在しない状態で、少なくとも15日間、30日間、45日間、60日間、75日間、100日間、120日間、または150日間、一貫したレベルで前記CFTRを発現する、請求項13に記載の細胞または細胞株。
- 前記CFTRが、
a)配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むCFTRポリペプチドと;
b)配列番号2と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むCFTRポリペプチドと;
c)ストリンジェントな条件下で、配列番号1とハイブリダイズする核酸によってコードされるCFTRポリペプチドと;
d)配列番号2の対立遺伝子変異型であるCFTRポリペプチドと
からなる群から選択される、請求項1に記載の細胞または細胞株。 - 前記CFTRが、配列番号7に記載の前記アミノ酸配列を含むポリペプチドかまたは、配列番号4に記載の核酸配列によってコードされるポリペプチドである、請求項15に記載の細胞または細胞株。
- 前記CFTRが、
a)配列番号1に記載の配列を含む核酸と;
b)ストリンジェントな条件下で、配列番号1のヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする核酸と;
c)配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸と;
d)配列番号1と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む核酸と;
e)配列番号1の対立遺伝子変異型である核酸と
からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求項1に記載の細胞または細胞株。 - 前記CFTRが、配列番号4に記載の配列を含む核酸によってコードされるかまたは、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸によってコードされる、請求項17に記載の細胞または細胞株。
- 収集物中の前記細胞または細胞株が、異なるCFTR型を発現する、請求項1に記載の細胞または細胞株の収集物。
- 前記収集物または前記細胞もしくは細胞株が、各々、表1または表2から選択される異なるCFTR変異体を発現する、請求項19に記載の収集物。
- 前記細胞または細胞株が同じ生理的特性を共有するように調和され、並行処理を可能にする、請求項19に記載の収集物。
- 前記生理的特性が増殖速度である、請求項19に記載の収集物。
- 前記生理的特性が組織培養表面への接着性である、請求項21に記載の収集物。
- 前記生理的特性がZ’因子である、請求項21に記載の収集物。
- 前記Z’因子が、タンパク質輸送補正物質が存在しない状態で決定される、請求項24に記載の収集物。
- 前記生理的特性がCFTRの発現レベルである、請求項21に記載の収集物。
- a)CFTRをコードする核酸を宿主細胞に導入するステップと;
b)前記CFTRの発現を検出する分子ビーコンを前記宿主細胞に導入するステップと;
c)CFTRを発現する細胞を単離するステップと
を含む、請求項1に記載の細胞または細胞株を作製する方法。 - a)内在性CFTRの発現を活性化する1つ以上の核酸配列を宿主細胞に導入するステップと;
b)前記活性化されたCFTRの発現を検出する分子ビーコンを前記宿主細胞に導入するステップと;
c)前記活性化されたCFTRを発現する細胞を単離するステップと
を含む、請求項1に記載の細胞または細胞株を作製する方法。 - ステップ(c)において単離される前記細胞から細胞株を作製するステップをさらに含む、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、
a)真核細胞であるか、
b)哺乳類細胞であるか、
c)内在性CFTRを内因的に発現しないか、または
d)(a)、(b)および(c)の任意の組み合わせである、
請求項27または請求項28に記載の方法。 - 前記CFTRが、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 前記CFTRが、配列番号1を含む核酸によってコードされる、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 前記CFTRが、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含む、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 前記CFTRが、配列番号4を含む核酸によってコードされる、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 前記単離が、蛍光活性化細胞選別装置を利用する、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 前記収集物の前記細胞または細胞株が同時に作製される、請求項27または請求項28に記載の方法。
- 請求項27または請求項28の方法によって作製される細胞または細胞株。
- 請求項1に記載の細胞もしくは細胞株または請求項19に記載の収集物を試験化合物に曝露するステップと;
前記試験化合物がCFTRモジュレーターであることを変化が示す、CFTR機能の変化を細胞において検出するステップと
を含むCFTR機能のモジュレーターを同定する方法。 - 前記検出ステップが、膜電位アッセイ、黄色蛍光タンパク質(YFP)クエンチングアッセイ、電気生理学的アッセイ、結合アッセイ、またはUssing
chamberアッセイを利用する、請求項38に記載の方法。 - 前記CFTRがヒトCFTRである、請求項38に記載の方法。
- 前記CFTRが、表1または表2から選択されるCFTR変異体である、請求項40に記載の方法。
- 前記検出ステップが、タンパク質輸送補正物質が存在しない状態で行われる、請求項38または41に記載の方法。
- 前記CFTRが配列番号4を含む核酸によってコードされるか、または配列番号7に記載のアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記試験化合物が、小分子、化学成分、ポリペプチド、または抗体である、請求項38に記載の方法。
- 前記試験化合物が化合物ライブラリーである、請求項38に記載の方法。
- 前記ライブラリーが小分子ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、ペプチドライブラリー、または抗体ライブラリーである、請求項45に記載の方法。
- 一貫したレベルで、長期にわたってCFTRを安定的に発現するように遺伝子工学処理された細胞であって、
a)前記CFTRをコードする1つまたは複数のmRNAを発現する多数の細胞を提供するステップと;
b)前記細胞を個々の培養容器の中で1つ1つ分散させ、それによって多数の別々の細胞培養物を提供するステップと;
c)培養条件が前記別々の細胞培養物の各々と実質的に同一であり、その培養中、別々の細胞培養物あたりの細胞数を正規化し、前記別々の培養物を同じスケジュールで継代するという点で特徴づけられる自動細胞培養法を用いて、一連の所望の培養条件下で前記細胞を培養するステップと;
d)前記別々の細胞培養物をアッセイし、少なくとも2回、前記CFTRの発現を測定するステップと;
e)両方のアッセイにおいて、一貫したレベルで前記CFTRを発現する別々の細胞培養物を同定し、それによって前記細胞を取得するステップと
を含む方法によって作製される細胞。 - a)細胞の集団を提供するステップと;
b)CFTRの発現を検出する分子ビーコンを前記細胞に導入するステップと;
c)CFTRを発現する細胞を単離するステップと
を含む、CFTRを内生的に発現する細胞を単離する方法。 - 前記細胞の集団が、CFTRを内生的に発現しない細胞を含む、請求項48に記載の方法。
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