JP2008532544A - 活性ビタミンｋ依存性タンパク質を生産するための方法及び組成物 - Google Patents

活性ビタミンｋ依存性タンパク質を生産するための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出する工程であって、一塩基多型はワルファリンに対する高い又は低い感受性と関連付けられており、それによってワルファリンに対して高い又は低い感受性を有する被験者を特定する工程とを含む、ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有するヒト被験者を特定する方法を提供する。

Description

本発明は、一部には、国立衛生研究所より認可番号５Ｐ０１ ＨＬ０６３５０−４２及び５−Ｒ０１ ＨＬ４８３１８の助成を得て為された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、単離された核酸、前記単離された核酸を含む宿主細胞、及びそれらの使用方法、並びにビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）の特定及びワルファリンに対する感受性とのそれらの相関を対象とする方法及び組成物に関する。
数多くのタンパク質の機能は、複数のグルタミン酸残基のγ−カルボキシグルタミン酸塩への修飾を必要とする。これらのビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）凝固タンパク質の中で、ＦＩＸ（クリスマス因子）、ＦＶＩＩ及びプロトロンビンは最もよく知られている。マトリックスＧｌａタンパク質についての遺伝子のノックアウトがマウス動脈の石灰化を生じさせるという所見（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｔｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ＧＬＡ ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ ３８６：７８−８１）は、凝固以外の機能を有するタンパク質にとってのビタミンＫサイクルの重要性を強調する。さらに、Ｇａｓ６及び未知の機能の他のＧｌａタンパク質が神経組織において発現され、胎内でのワルファリン暴露は精神遅滞及び顔面異常を生じさせる。これは、Ｇｌａ修飾を実行する酵素、ＶＫＤカルボキシラーゼの発現が一時的に組織特異的に調節され、初期胚段階の間神経系において高発現されるという所見と一致する。カルボキシル化と同時に、反応の共基質である還元型ビタミンＫがビタミンＫエポキシドに変換される。ヒトの食事におけるビタミンＫの量は限られているので、その枯渇を防ぐためビタミンＫエポキシドはビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）によって再びビタミンＫに戻されねばならない。最も広く使用されている抗凝固薬、ワルファリンは、ＶＫＯＲを標的化し、ビタミンＫの再生を予防する。その結果は還元型ビタミンＫの濃度低下であり、これは、γグルタミルカルボキシラーゼによるカルボキシル化の割合の低下及び低カルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の産生を生じさせる。
米国だけで、ワルファリンは年間百万人を超える患者に処方されており、オランダでは、人口の約２％が長期的なワルファリン治療を受けていると報告された。抗凝固の治療のために必要なワルファリンの量は患者によって大きく異なるので、ワルファリンの使用は副作用の重大な危険性を伴う。例えばワルファリン治療の開始後、重大な出血の発症が患者の１〜２％で発生し、患者の０．１〜０．７％で死亡が起こったことが報告されている。その危険性にもかかわらず、ワルファリンの使用は、誘発される出血の発症１回につき２０回の発作を予防することができ、おそらく誘発出血の恐れのために過少利用されていると推定された。
本発明は、被験者における一塩基多型をワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関させ、それによって被験者への低い危険度でワルファリンの治療及び維持用量のより正確で迅速な決定を可能にするための方法及び組成物を提供することにより、当分野におけるこれまでの欠点を克服する。
本発明は、被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出し、一塩基多型をワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関させ、それによってワルファリンに対して高い又は低い感受性を有する被験者を特定することを含む、ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有するヒト被験者を特定する方法を提供する。
さらに、ａ）ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関させること；及びｂ）被験者において工程（ａ）の一塩基多型を検出し、それによってワルファリンに対して高い又は低い感受性を有する被験者を識別すること、を含む、ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有するヒト被験者を識別する方法が提供される。
さらなる実施形態では、本発明は、
ａ）ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有する被験者を識別する工程と、
ｂ）被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出する工程と、
ｃ）工程（ｂ）の一塩基多型の存在を、被験者におけるワルファリンへの高い又は低い感受性と相関させ、それによってワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関するＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を識別する工程と
を含む、ワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関するＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を識別する方法を提供する。
加えて、本発明は、ａ）ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有する被験者を識別する工程と、ｂ）（ａ）の被験者のＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定する工程と、ｃ）工程（ｂ）のヌクレオチド配列をＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較する工程と、ｄ）（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出する工程と、ｅ）（ｄ）の一塩基多型を、（ａ）の被験者におけるワルファリンへの高い又は低い感受性と相関させる工程とを含む、被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型をワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関させる方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）、特に哺乳動物（例えばヒト、ヒツジ、ウシ、サル等）ＶＫＯＲをコードする単離された核酸である。例は、（ａ）配列番号８又は配列番号９に示すヌクレオチド配列を有する単離された核酸などの、本明細書で開示する核酸；（ｂ）上記（ａ）の単離された核酸又はその相補物にハイブリダイズする（例えばストリンジェント条件下で）、及び／又は上記（ａ）の核酸と実質的な配列同一性を有する（例えば上記（ａ）の核酸と８０、８５、９０、９５又は９９％同一である）、及びＶＫＯＲをコードする核酸；及び（ｃ）遺伝暗号の縮重により上記（ａ）又は（ｂ）の核酸とは異なるが、上記（ａ）又は（ｂ）の核酸によってコードされるＶＫＯＲをコードする核酸を含む。
本明細書で使用する「ストリンジェント」という用語は、ハイブリダイゼーション手順の産物を定義するために当分野で一般的に理解されているハイブリダイゼーション条件を指す。ストリンジェンシー条件は、低、高又は中であり得、それらの用語は、当分野で一般的に知られ、当業者によって広く認識されている通りである。相同なヌクレオチド配列が本明細書で示すようなヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを許容する高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、当分野において周知である。一例として、本明細書で開示する核酸分子へのそのような配列のハイブリダイゼーションは、約６０％の相同性の配列のハイブリダイゼーションを可能にするために、２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、４２℃の洗浄条件を伴って、２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液及び５％硫酸デキストラン中で４２℃にて実施することができる。もう１つの例は、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、約４５℃のハイブリダイゼーション条件、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０〜６５℃の洗浄条件を含む。ストリンジェント条件のもう１つの例は、標準ハイブリダイゼーションアッセイ（引用することにより本明細書の一部をなすものとする、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＥＤＳ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）参照）を用いて、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、６０〜７０℃の洗浄ストリンジェンシーによって示される。様々な実施形態において、ストリンジェント条件は、例えば高度にストリンジェントな（すなわち高ストリンジェンシー）条件（例えば０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中６５℃でのろ過結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中６８℃での洗浄）、及び／又は中等度にストリンジェントな（すなわち中ストリンジェンシー）条件（例えば０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄）を含んでもよい。
本発明のさらなる態様は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本明細書で述べるビタミンＫエポキシドレダクターゼをコードする核酸を含む組換え核酸である。
本発明のさらなる態様は、上述した組換え核酸を含み及び発現する細胞である。適切な細胞は、植物、動物、哺乳動物、昆虫、酵母及び細菌細胞を含む。
本発明のさらなる態様は、本明細書で述べるＶＫＯＲをコードする単離された核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
本発明のさらなる態様は、本明細書で述べる核酸によってコードされる、単離され、及び精製されたＶＫＯＲ（例えば均質に精製されたＶＫＯＲ）である。例えば本発明のＶＫＯＲは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
本発明のさらなる態様は、ビタミンＫの存在下でビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を発現し、ビタミンＫ依存性タンパク質を生産する宿主細胞を培養する工程と、及びその後培養物からビタミンＫ依存性タンパク質を採集する工程とを含み、前記宿主細胞が、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする異種核酸を含み及び発現し、及び前記宿主細胞が、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする異種核酸をさらに含み及び発現し、及び本明細書で述べるＶＫＯＲを生産する、ビタミンＫ依存性タンパク質を産生する方法である。そのため、本発明はさらに、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする異種核酸及びビタミンＫエポキシドレダクターゼをコードする異種核酸を含む細胞を提供する。細胞は、核酸が細胞にとって異種であり得るか又は細胞にとって内在性であり得る、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。
本明細書で使用する、「ａ」、「ａｎ」又は「ｔｈｅ」は、１又は１より大きいことを意味し得る。例えば「ａ」ｃｅｌｌは、１個の細胞又は複数の細胞を意味し得る。
本発明を以下でより詳細に説明する。この説明は、本発明を実施し得る種々の方法の全て、又は本発明に追加し得る全ての特徴を詳細に列挙するものであることを意図しない。例えば１つの実施形態に関して説明する特徴が他の実施形態に組み込まれることが可能であり、特定の実施形態に関して説明する特徴がその実施形態から削除され得る。加えて、本発明から逸脱しない、本明細書で示唆する様々な実施形態に対する数多くの変形及び追加は、本開示に照らして当業者には明白である。そのため、以下の明細書は本発明の一部の特定の実施形態を説明するものであり、その全ての置換、組合せ及び変形を網羅的に特定することを意図しない。
本明細書に添付する「配列表」は、本明細書で完全に記述されているかのごとくに本明細書の一部をなすものとする。
本発明は、本開示に基づき、及びそれらの開示が本明細書で完全に記述されているかのごとくにその全体が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、ＳｔａｆｆｏｒｄとＷｕへの米国特許第５，２６８，２７５号及びＳｔａｆｆｏｒｄとＣｈａｎｇへの米国特許第６，５３１，２９８号に述べられているものを含むがそれらに限定されない、当分野で公知の方法、成分及び特徴をさらに利用して実施し得る。
本明細書で使用する、「核酸」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば化学合成された）ＤＮＡ及びＲＮＡとＤＮＡのキメラを含む、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を包含する。核酸は二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖である場合、核酸はセンス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体又は誘導体（例えばイノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成し得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば変化した塩基対合能力又はヌクレアーゼに対する高い抵抗性を有する核酸を産生するために使用できる。
「単離された核酸」は、それが由来する生物の天然に生じるゲノムにおいて直接隣接するコード配列の両方（一方は５’末端側及び一方は３’末端側）と直接隣接していないＤＮＡ又はＲＮＡである。１つの実施形態では、単離された核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例えばプロモーター）配列の一部又は全部を含む。この用語は、例えばベクター、自律複製プラスミド又はウイルス、又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは無関係に別の分子（例えばＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処理によって生産されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する、組換えＤＮＡを含む。またこの用語は、付加的なポリペプチド配列をコードする雑種遺伝子の一部である組換えＤＮＡも包含する。
「単離された」という用語は、細胞材料、ウイルス材料、又は培地（組換えＤＮＡ手法によって生産されるとき）、又は化学的前駆体又は他の化学物質（化学合成されるとき）を実質的に含まない核酸又はポリペプチドを表わし得る。さらに、「単離された核酸フラグメント」は、フラグメントとして天然では生じず、天然の状態では認められない核酸フラグメントである。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えばＰＣＲ増幅におけるプライマーとして又はハイブリダイゼーションアッセイ又はマイクロアレイにおけるプローブとして使用できる、少なくとも約６ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、例えば約１５から３０ヌクレオチド、又は約２０から２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。オリゴヌクレオチドは、天然又は合成であり得、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾された骨格等であり得る。
特定のヌクレオチド配列が標準ヌクレオチド配列に対して特定の同一性パーセントを有すると言われる場合、同一性パーセントは標準ヌクレオチド配列に対してである。例えば１００塩基長の標準ヌクレオチド配列に対して５０％、７５％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であるヌクレオチド配列は、標準ヌクレオチド配列の５０、７５、８５、９０、９５又は９９ヌクレオチドの配列と完全に同一である５０、７５、８５、９０、９５又は９９個の塩基を有し得る。前記ヌクレオチド配列はまた、その長さ全体にわたって標準ヌクレオチド配列と５０％、７５％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である１００塩基長のヌクレオチド配列であり得る。言うまでもなく、同じ判定基準に同様に合致する他のヌクレオチド配列が存在する。
ＶＫＯＲヌクレオチド配列と「実質的に同一」である核酸配列は、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である。核酸の比較のために、標準核酸配列の長さは一般に少なくとも４０ヌクレオチド、例えば少なくとも６０ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドである。配列同一性は、配列解析ソフトウエア（例えばｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いて測定することができる。
当分野で公知のように、核酸又はアミノ酸が公知の配列と配列同一性又は類似性を有するかどうかを識別するために多くの異なるプログラムが使用できる。配列同一性又は類似性は、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実施（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５（１９８４）によって記述されたＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムを含むが、これらに限定されない、当分野で公知の標準手法を用いて、好ましくはデフォルト設定を用いて、又は検査によって決定し得る。
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進・ペアワイズアラインメントを用いて関連配列の群から多重配列アラインメントを創りだす。また、アラインメントを創りだすために使用したクラスター化関係を示すツリーを描画することができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５，３５１−３６０（１９８７）の累進整列法の単純化を使用している。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）が述べた方法に類似する。
有用なアルゴリズムのもう１つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３−５７８７（１９９３）に述べられている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０−４８０（１９９６）から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、好ましくはデフォルト値に設定された、いくつかの検索パラメータを使用する。パラメータは動的な値であり、特定配列の組成物及びそれに対して関心ある配列を検索する特定データベースの組成物に依存して、プログラム自体によって確立される。しかし、その数値は感受性を高めるように調整し得る。さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２によって報告されたギャップＢＬＡＳＴである。
ＣＬＵＳＴＡＬプログラムも配列類似性を決定するために使用できる。このアルゴリズムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１５５−６５；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１によって記載されている。
加えて、本明細書で開示する核酸より多い又はより少ないヌクレオチドを含む配列に関しては、１つの実施形態では、配列同一性のパーセンテージはヌクレオチド塩基の総数に対する同一ヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。そのため、例えば本明細書で特定して開示する配列よりも短い配列の配列同一性は、１つの実施形態では、より短い配列のヌクレオチド塩基の数を用いて決定される。同一性パーセントの算定においては、挿入、欠失、置換等のような配列変化の様々な徴候（manifestations）には相対的な重みを割り当てない。
本発明のＶＫＯＲポリペプチドは、組換えポリペプチド、合成ペプチド及び天然ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。本発明はまた、天然に生じるアミノ酸配列が変化又は欠失しているＶＫＯＲポリペプチドの形態をコードする核酸配列も包含する。好ましい核酸は、通常の生理的条件下で可溶性であるポリペプチドをコードする。ＶＫＯＲの全部又は一部が、無関係なポリペプチド（例えばマーカーポリペプチド又は融合パートナー）に融合して創られている融合タンパク質をコードする核酸も、本発明の範囲内である。例えばポリペプチドは、細菌において発現されるポリペプチドの精製を容易にするためのヘキサヒスチジンタグ、又は真核細胞において発現されるポリペプチドの精製を容易にするための赤血球凝集素タグ、又はアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降法によるポリペプチドの精製を容易にするためのＨＰＣ４タグに融合することができる。本発明はまた、第一部分と第二部分を含む単離されたポリペプチド（及びこれらのポリペプチドをコードする核酸）を含む。第一部分は、例えばＶＫＯＲポリペプチドの全部又は一部を含み、第二部分は、例えば検出マーカーを含む。
融合パートナーは、例えば分泌を促進するポリペプチド、例えば分泌配列であり得る。そのような融合ポリペプチドは、典型的にはプレタンパク質と称される。分泌配列は、成熟タンパク質を形成するために細胞によって切断され得る。不活性なプレタンパク質を生産するためにポリペプチド配列に融合されたＶＫＯＲをコードする核酸も本発明の範囲内である。プレタンパク質は、不活性化配列の除去によって活性形態のタンパク質に変換され得る。
本発明はまた、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（本明細書で定義するような）、配列番号１〜６、配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列又はそれらの相補物の全部又は一部にハイブリダイズする核酸を含む。特定の実施形態では、ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、典型的には少なくとも１５（例えば２０、３０又は５０）ヌクレオチドの長さである。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、ＶＫＯＲポリペプチドをコードする核酸の一部又は全部の配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％同一である。本明細書に記載する種類のハイブリダイズ核酸は、例えばクローニングプローブ、プライマー（例えばＰＣＲプライマー）、又は診断プローブとして使用することができる。例えば本明細書に記載する及び当分野において公知である活性アッセイにおいて測定したとき、ＶＫＯＲの機能を阻害する阻害性低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び／又はアンチセンスＲＮＡも本発明の範囲内に含まれる。
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明の核酸を含む細胞、例えば形質転換細胞を特徴とする。「形質転換された細胞」は、組換え核酸手法によって、ＶＫＯＲポリペプチドの全部又は一部をコードする核酸、及び／又はアンチセンス核酸又はｓｉＲＮＡが導入されている（又はその祖先に導入されている）細胞である。原核細胞及び真核細胞の両方、例えば細菌、酵母、昆虫、マウス、ラット、ヒト、植物等が含まれる。
本発明はまた、発現を可能にするために転写及び／又は翻訳制御エレメントに作動可能に連結された本発明の核酸を含む核酸構築物（例えばベクター及びプラスミド）、例えば発現ベクターを特徴とする。「作動可能に連結された」とは、選択された核酸、例えばＶＫＯＲポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が、調節エレメントが選択された核酸の転写及び／又は翻訳を制御できるように配列の転写及び／又は翻訳を指令する、１以上の調節エレメント、例えばプロモーターに隣接して位置することを意味する。
本発明はさらに、プライマー又はプローブとして使用できる、本発明の核酸のフラグメント又はオリゴヌクレオチドを提供する。そのため、一部の実施形態では、本発明のフラグメント又はオリゴヌクレオチドは、配列番号８又は配列番号９に示すヌクレオチド配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、２５００又は３０００の隣接ヌクレオチドであるヌクレオチド配列である。本発明のオリゴヌクレオチドの例は、本明細書に含まれる配列表において提供される。そのようなフラグメント又はオリゴヌクレオチドは、例えば、増幅（例えばＰＣＲ）アッセイにおけるプライマーとして使用するとき、制限酵素切断部位を含むため及び／又は組み込むために、検出可能に標識又は修飾することができる。
本発明はまた、例えば配列番号１０のアミノ酸配列又はその生物活性フラグメント又はペプチドを含む、基本的にそれらからなる及び／又はそれらからなるポリペプチドのような、精製された又は単離されたＶＫＯＲポリペプチドを特徴とする。そのようなフラグメント又はペプチドは、典型的には配列番号１０のアミノ酸配列の少なくとも約１０アミノ酸（例えば配列番号１０のアミノ酸配列の１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８５、９５、１００、１２５又は１５０アミノ酸）であり、ＶＫＯＲタンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号１０に示す）に隣接するアミノ酸のペプチド又はフラグメントであり得る。本発明のフラグメント又はペプチドの生物活性は、本明細書で提供する方法に従って及びＶＫＯＲ活性を識別するために当分野において公知であるように測定することができる。本発明のＶＫＯＲタンパク質のフラグメント及びペプチドはまた、抗体の産生のための抗原として活性であり得る。本発明のフラグメント又はペプチド上のエピトープの特定は周知のプロトコールによって実施され、当業者の技術範囲内である。
本明細書で使用する、「タンパク質」及び「ポリペプチド」はどちらも、長さ又は翻訳後の修飾（例えばグリコシル化、リン酸化又はＮ−ミリスチル化）に関わりなく、アミノ酸の任意の鎖を意味する。そのため、「ＶＫＯＲポリペプチド」という用語は、それぞれ完全長の天然に生じるＶＫＯＲタンパク質、並びに完全長の天然に生じるＶＫＯＲタンパク質又は天然に生じる又は合成ＶＫＯＲポリペプチドの一部に対応する、組換え又は合成によって生産されるポリペプチドを含む。
「精製された」又は「単離された」化合物又はポリペプチドは、関心ある化合物、例えば天然に生じる生物又はウイルスのその他の成分の少なくとも一部、例えば細胞又はウイルス構造成分又はそのポリペプチドに関連して一般的に認められる他のポリペプチド又は核酸から分離されているか、又はそれらを実質的に含まないＶＫＯＲポリペプチド又は抗体の少なくとも６０重量％の組成物である。本明細書で使用する、「単離された」ポリペプチドは、少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上（ｗ／ｗ）純粋である。好ましくは、調製品は関心ある化合物の少なくとも７５重量％（例えば少なくとも９０重量％又は９９重量％）である。純度は、適切な標準的方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
好ましいＶＫＯＲポリペプチドは、天然に生じるＶＫＯＲポリペプチドの全部又は一部と実質的に同一の配列を含む。本明細書で述べるＶＫＯＲポリペプチド配列と「実質的に同一の」ポリペプチドは、配列番号１０のＶＫＯＲポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％又は８５％（例えば９０％、９５％又は９９％）同一であるアミノ酸配列を有する。比較のために、標準ＶＫＯＲポリペプチドの長さは、一般に少なくとも１６アミノ酸、例えば少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５又は１００アミノ酸である。
標準配列と１００％未満同一であるポリペプチドの場合、同一でない位置は、好ましくは、しかし必ずではないが、標準配列についての保存的置換である。保存的置換は、典型的には以下の群の中での置換を含むが、これらに限定されない：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びトレオニン；リシン及びアルギニン；及びフェニルアラニン及びチロシン。
特定ポリペプチドが、定義された長さの標準ポリペプチドと特定の同一性パーセントを有すると言われるとき、同一性パーセントは標準ポリペプチドに対してである。そのため、例えば１００アミノ酸長の標準ポリペプチドに対して５０％、７５％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一であるポリペプチドは、標準ポリペプチドの５０、７５、８５、９０、９５又は９９アミノ酸長部分と完全に同一である５０、７５、８５、９０、９５又は９９アミノ酸のポリペプチドであり得る。それはまた、その長さ全体にわたって標準ポリペプチドと５０％、７５％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一である１００アミノ酸長のポリペプチドであり得る。言うまでもなく、他のポリペプチドも同じ判定基準に同様に合致する。
本発明はまた、本発明のＶＫＯＲポリペプチド又はそのフラグメントに特異的に結合する精製された抗体又は単離された抗体を特徴とする。「特異的に結合する」とは、抗体が、特定抗原、例えばＶＫＯＲポリペプチド、又はＶＫＯＲポリペプチドのフラグメント又はペプチド上のエピトープを認識し、それに結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識せず、それに結合しないことを意味する。１つの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体であり、他の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント等を含む、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方の生産が当分野において周知である。
もう１つの態様では、本発明は、試料中のＶＫＯＲポリペプチドを検出するための方法を特徴とする。この方法は、試料を、ＶＫＯＲポリペプチド又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体と、抗体とＶＫＯＲとの間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程と、試料中のＶＫＯＲポリペプチド又はそのフラグメントの検出として、もし存在する場合は、複合体の形成を検出する工程とを含む。そのような免疫測定法は当分野において周知であり、免疫沈降法、免疫ブロット法、免疫標識アッセイ、ＥＬＩＳＡ等を含む。
本発明はさらに、試料を、ＶＫＯＲ又はそのフラグメントをコードする本発明の核酸、又はＶＫＯＲ又はそのフラグメントをコードする核酸の相補物と、ハイブリダイゼーション複合体が形成し得る条件下で接触させる工程と、ハイブリダイゼーション複合体の形成を検出し、それによって試料中のＶＫＯＲポリペプチドをコードする核酸を検出する工程とを含む、試料中のＶＫＯＲポリペプチドをコードする核酸を検出する方法を提供する。そのようなハイブリダイゼーションアッセイは当分野において周知であり、プローブ検出アッセイ及び核酸増幅アッセイを含む。
ＶＫＯＲ遺伝子に関連する遺伝子（すなわちＶＫＯＲ遺伝子の機能的ホモログ）を得る方法も、本発明に包含される。そのような方法は、ＶＫＯＲの全部又は一部をコードする単離された核酸又はそのホモログを含む検出可能に標識されたプローブを得る工程又は産生する工程と、核酸フラグメントライブラリーを、プローブがライブラリー内の核酸フラグメントにハイブリダイズすることを可能にする条件下にて、標識プローブでスクリーニングする工程と、それによって核酸二重鎖を形成する工程と、標識された二重鎖を、もし存在する場合は、単離する工程と、ＶＫＯＲ遺伝子に関連する遺伝子を得るために、標識された二重鎖内の核酸フラグメントから完全長遺伝子配列を産生する工程と、を伴う。
本発明のさらなる態様は、ビタミンＫの存在下で、ビタミンＫ依存性タンパク質を生産する、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を発現する細胞を培養する工程と、その後培地からビタミンＫ依存性タンパク質を採集する工程とを含み、前記細胞が、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする外来性核酸を含み及び発現し、それによってＶＫＯＲを生産する、及び一部の実施形態では、前記細胞がビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする外来性核酸を含み及び発現し、それによって本明細書で述べるようにビタミンＫ依存性カルボキシラーゼを生産する、ビタミンＫ依存性タンパク質を産生する方法である。一部の実施形態では、ＶＫＯＲをコードする核酸の発現及びＶＫＯＲの生産は、細胞に、ＶＫＯＲの非存在下で又はＶＫＯＲとカルボキシラーゼの非存在下で生産されるよりも高いレベルのビタミンＫ依存性タンパク質及び／又は高いレベルの活性（例えば完全カルボキシル化）ビタミンＫ依存性タンパク質を生産させる。
そのため、一部の実施形態では、本発明はまた、
ａ）ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を、核酸が発現され、ビタミンＫの存在下でビタミンＫ依存性タンパク質が生産される条件下で、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする異種核酸を含み、ビタミンＫエポキシドレダクターゼをコードする異種核酸をさらに含む細胞に導入する工程と、
ｂ）場合により細胞からビタミンＫ依存性タンパク質を収集する工程と
を含む、ビタミンＫ依存性タンパク質を生産する方法を提供する。
本発明はまた、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする第一の核酸を発現する細胞に、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする第二の異種核酸を、前記第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ発現されてビタミンＫ依存性タンパク質及びＶＫＯＲを生産する条件下で導入することを含む、細胞内のカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の量を増加させる方法を提供する。
ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする第一の核酸を発現する細胞に、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする第二の異種核酸を、前記第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ発現されてビタミンＫ依存性タンパク質及びＶＫＯＲを生産する条件下で導入することを含む、ビタミンＫ依存性タンパク質のカルボキシル化を増加させる方法が本明細書でさらに提供される。
加えて、本発明は、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする第一の核酸を発現する細胞に、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする第二の異種核酸を、前記第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ発現されてビタミンＫ依存性タンパク質及びＶＫＯＲを生産する条件下で導入することを含み、ＶＫＯＲの存在下で細胞において生産されるカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の量が、ＶＫＯＲの非存在下で細胞において生産されるカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の量に比べて増加している、細胞においてカルボキシル化（例えば完全カルボキシル化）ビタミンＫ依存性タンパク質を生産する方法を提供する。
さらに、本発明は、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする第一の核酸を発現する細胞に、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする第二の異種核酸を、前記第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ発現されてビタミンＫ依存性タンパク質及びＶＫＯＲを生産する条件下で導入することを含み、ＶＫＯＲの存在下で細胞において生産されるビタミンＫ依存性タンパク質の１００％、９０％、８０％、７０％又は６０％がカルボキシル化（例えば完全カルボキシル化）されている、細胞においてビタミンＫ依存性タンパク質を生産する方法を提供する。
また、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする第一の核酸を発現する細胞に、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする第二の異種核酸を、前記第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ発現されてビタミンＫ依存性タンパク質及びＶＫＯＲを生産する条件下で導入することを含む、細胞においてビタミンＫ依存性タンパク質を生産する方法も本明細書に含まれる。
上述した方法の一部の実施形態では、細胞は、ウシビタミンＫ依存性カルボキシラーゼであり得るが、これに限定されない、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする第三の核酸をさらに含み得る。特定の実施形態では、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼは、ビタミンＫγグルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）である。本発明の方法において用いられるＶＫＧＣは、当分野において公知である、ＶＫＧＣを生産する任意の脊椎動物又は無脊椎動物種からのＶＫＧＣであり得る。
ＶＫＯＲ及び／又はＶＫＧＣの存在下で細胞においてカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の量を増加させる本発明の方法では、ＶＫＯＲ及び／又はＶＫＧＣの存在下で細胞において生産されるカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質又は完全カルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の量は、ＶＫＯＲ及び／又はＶＫＧＣの非存在下で細胞において生産されるカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質又は完全カルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の量と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、２００％又は３００％増加し得る。
一部の実施形態において「完全カルボキシル化」とは、カルボキシル化を受けうるビタミンＫ依存性タンパク質上の全ての部位（又は一部の実施形態では、部位の大部分）がカルボキシル化されることを意味する。一部の実施形態では、完全カルボキシル化は、全てのビタミンＫ依存性タンパク質がある程度までカルボキシル化されること、及び／又は全てのビタミンＫ依存性タンパク質が全ての又は大部分のカルボキシル化部位でカルボキシル化されることを意味し得る。カルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質又は完全カルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質は、活性タンパク質である。「活性タンパク質」とは、ビタミンＫ依存性タンパク質が、その生物学的機能（例えば第ＩＸ因子又は第Ｘ因子についての酵素活性）を実施する上で活性を有する又は活性化できることを意味する。
本発明の方法に従って生産できるビタミンＫ依存性タンパク質は、任意の組合せの、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＡ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、活性化プロテインＣ、プロテインＳ、骨Ｇｌａタンパク質（オステオカルシン）、マトリックスＧｌａタンパク質及びプロトロンビン、及び本明細書で述べるそのようなタンパク質の修飾形態を含むが、これらに限定されない、現在公知の又は後日それ自体が特定される任意のビタミンＫ依存性タンパク質であり得る。
本明細書で述べる核酸で形質転換され得るいかなる細胞も、本明細書で述べるように使用することができるが、一部の実施形態では非ヒト又はさらに非哺乳動物細胞が使用できる。そのため、本発明の細胞又は細胞系は、例えばヒト細胞、動物細胞、植物細胞及び／又は昆虫細胞であり得る。本明細書で述べるビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする核酸及びビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸は当分野において周知であり、発現のための細胞へのそれらの導入は、常用のプロトコールに従って実施される。そのため、一部の実施形態では、本発明は、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸（細胞にとって内因性又は外来性）を含む細胞を提供する。ビタミンＫ依存性タンパク質は、ビタミンＫの存在下で細胞において生産される。細胞は、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）及び／又はビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする異種（すなわち外来性）核酸をさらに含む。細胞は、ＶＫＯＲ及び／又はビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする核酸が発現され、ＶＫＯＲ及び／又はカルボキシラーゼが細胞において生産される、当分野で公知の条件下に維持され得る。
本発明のある実施形態は、被験者の抗凝固治療のためのワルファリンの治療用量が、被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の１以上の一塩基多型の存在と相関し得るという発明者の発見に基づく。そのため、本発明はまた、被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の１以上の一塩基多型（ＳＮＰ）の存在を検出することを含み、一塩基多型がワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関付けられ、それによって被験者がワルファリンに対する高い又は低い感受性を有すると特定する、ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有するヒト被験者を特定する方法を提供する。
ワルファリンに対する高い感受性と相関するＳＮＰの一例は、配列番号８のゲノム配列及びこの配列の前後の約１０００ヌクレオチドを含む標準配列である、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２５８１（配列番号１２）におけるＧ→Ｃ変化（ＶＫＯＲ遺伝子のイントロン２内；引用することにより本明細書の一部をなすものとする、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ８０５０８９４）である。この配列は、ゲノム位置「ヒト染色体１６ｐ１１．２」を有する又はＮＣＢＩデータベースの物理的地図においてヒト１６番染色体：３１００９７００−３１０１３８００と位置付けることができる。
ワルファリンに対する低い感受性と相関するＳＮＰの例は、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３２９４（配列番号１３）におけるＴ→Ｃ変化（ＶＫＯＲ遺伝子のイントロン２内；引用することにより本明細書の一部をなすものとする、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ２３５９６１２）、及び配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４７６９（配列番号１４）におけるＧ→Ａ変化（ＶＫＯＲ遺伝子の３’ＵＴＲ内；引用することにより本明細書の一部をなすものとする、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ７２９４）である。
本明細書で使用する、「ワルファリンに対して高い感受性」を有する被験者は、ワルファリンの適切な治療又は維持用量が、正常被験者、すなわちワルファリンに対する高い感受性の表現型を与えるＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰを担持しない被験者にとって適切なワルファリンの治療又は維持用量よりも低い被験者である。逆に、本明細書で使用する、「ワルファリンに対して低い感受性」を有する被験者は、ワルファリンの適切な治療又は維持用量が、正常被験者、すなわちワルファリンに対する低い感受性の表現型を与えるＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰを担持しない被験者にとって適切なワルファリンの治療又は維持用量よりも高い被験者である。正常被験者にとってのワルファリンの典型的な治療用量の一例は１週当り３５ｍｇであるが、この量は異なってもよい（例えば１週当り３．５〜４２０ｍｇの用量範囲がＡｉｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５３：７１７−７１９に述べられている）。ワルファリンの典型的治療用量は、本明細書で述べる方法に従って所与の試験群に関して決定することができ、前記治療用量は、この用量より高い又は低い治療ワルファリン用量を有する被験者を特定するために使用でき、それによってワルファリンに対して低い又は高い感受性を有する被験者を特定する。
さらに、ａ）ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関させること；及びｂ）被験者において工程（ａ）の一塩基多型を検出し、それによってワルファリンに対して高い又は低い感受性を有する被験者を特定すること、を含む、ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有するヒト被験者を特定する方法が本明細書で提供される。
加えて、本発明は、ａ）ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有する被験者を特定する工程と、ｂ）被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出する工程と、ｃ）工程（ｂ）の一塩基多型の存在を、被験者におけるワルファリンへの高い又は低い感受性と相関させ、それによってワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関するＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を特定する工程とを含む、ワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関するＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を特定する方法を提供する。
また、ａ）ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有する被験者を特定する工程と、ｂ）（ａ）の被験者のＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定する工程と、ｃ）工程（ｂ）のヌクレオチド配列をＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較する工程と、ｄ）（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出する工程と、ｅ）（ｄ）の一塩基多型を、（ａ）の被験者におけるワルファリンへの高い又は低い感受性と相関させる工程とを含む、被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型をワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関させる方法も本発明において提供される。
被験者は、周知のプロトコールに従って、抗凝固治療のためのワルファリンの治療又は維持用量を確立することによって、及びその被験者についての治療又は維持用量を、ワルファリンの平均治療又は維持用量が算定される正常被験者（例えばワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関するＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰを持たない被験者）の集団の抗凝固治療のためのワルファリンの治療又は維持用量と比較することによって、ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有すると特定される。ワルファリンの平均治療又は維持用量（例えば治療的である又は野生型ＶＫＯＲ遺伝子を有する、すなわちワルファリン感受性に関連する一塩基多型を持たない被験者についての維持用量を提供するワルファリンの用量）よりも低いワルファリンの治療又は維持用量を有する被験者は、ワルファリンに対して高い感受性を有すると特定される被験者である。ワルファリンの平均治療又は維持用量より高いワルファリンの治療又は維持用量を有する被験者は、ワルファリンに対して低い感受性を有すると特定される被験者である。野生型のＶＫＯＲ遺伝子を有する被験者についてのワルファリンの平均治療又は維持用量は、当業者によって容易に測定される。
被験者のＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列は、当分野において標準的な方法に従って及び本明細書で提供する実施例で述べるように決定される。例えばゲノムＤＮＡを被験者の細胞から抽出し、公知のプロトコールに従ってＶＫＯＲ遺伝子を位置付け、配列決定する。ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型は、当分野で公知の野生型配列（例えば配列番号１１として本明細書で示す標準配列）と被験者の配列の比較によって特定される。
ＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰは、ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有する、すなわち平均用量より高い又は低いワルファリンの維持又は治療用量を有すると特定された被験者のＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰ又は複数のＳＮＰの存在を特定すること、及び統計分析の周知の方法に従って、ワルファリンに対する高い又は低い感受性とＳＮＰの関連性の統計分析を実施することにより、ワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関付けられる。ＳＮＰ（遺伝子型）と高い又は低いワルファリン感受性（表現型）の間の統計的関連性（例えば有意の関連性）を特定する分析は、被験者におけるＳＮＰの存在とその被験者におけるワルファリンへの高い又は低い感受性の間の相関を確立する。
被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の１以上のＳＮＰの存在を含む、因子の組合せは、その被験者におけるワルファリンへの高い又は低い感受性と相関付けることができると考えられる。そのような因子は、シトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴及び肝疾患を含み得るが、これらに限定されない。
そのため、さらなる実施形態では、本発明は、ＶＫＯＲ遺伝子の１以上の一塩基多型、１以上のシトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患及びこれらの因子の２以上の任意の組合せからなる群より選択される、ワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関する因子の組合せの存在を被験者において特定することを含み、因子の組合せがワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関付けられ、それによってワルファリンに対する高い又は低い感受性を有する被験者を特定する、ワルファリンに対する高い又は低い感受性を有するヒト被験者を特定する方法を提供する。
さらに、ａ）因子がＶＫＯＲ遺伝子の１以上の一塩基多型、１以上のシトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患及びこれらの因子の２以上の任意の組合せからなる群より選択される、因子の組合せの存在を、ワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関付ける工程と、ｂ）被験者において工程（ａ）の因子の組合せを検出し、それによってワルファリンに対する高い又は低い感受性を有する被験者を特定する工程とを含む、ワルファリンに対する高い又は低い感受性を有するヒト被験者を特定する方法が本明細書で提供される。
加えて、本発明は、ａ）ワルファリンに対する高い又は低い感受性を有する被験者を特定する工程と、ｂ）被験者において因子の組合せの存在を検出すること；及びｃ）工程（ｂ）の因子の組合せの存在を被験者におけるワルファリンへの高い又は低い感受性と相関させ、それによってワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関する因子の組合せを特定する工程とを含み、前記因子がＶＫＯＲ遺伝子の１以上の一塩基多型、１以上のシトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患及びこれらの因子の２以上の任意の組合せからなる群より選択される、ワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関する因子の組合せを特定する方法を提供する。
また、ａ）ワルファリンに対する高い又は低い感受性を有する被験者を特定する工程と、ｂ）被験者において因子の組合せの存在を特定する工程と、ｃ）（ｂ）の因子の組合せを（ａ）の被験者におけるワルファリンへの高い又は低い感受性と相関付ける工程とを含み、前記因子がＶＫＯＲ遺伝子の１以上の一塩基多型、１以上のシトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患及びこれらの因子の２以上の任意の組合せからなる群より選択される、因子の組合せをワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関付ける方法が本明細書で提供される。
本明細書で述べる因子の組合せは、ワルファリンに対して高い又は低い感受性を有すると特定された被験者において因子の組合せの存在を特定すること及び統計分析の周知の方法に従って、ワルファリンに対する高い又は低い感受性と因子の組合せの関連性の統計分析を実施することにより、ワルファリンに対する高い又は低い感受性と相関付けられる。因子の組合せと（高い又は低い）ワルファリン感受性表現型の間の統計的関連性（例えば有意の関連性）を特定する分析は、被験者における因子の組合せの存在とその被験者におけるワルファリンへの高い又は低い感受性の間の相関を確立する。
さらに、ＶＫＯＲをコードし、及び本明細書で述べる１以上のＳＮＰを含む核酸が本明細書で提供される。そのため、本発明はさらに、配列番号１２、１３、１４、１５及び１６に示すヌクレオチド配列を含む、基本的にそれらからなる及び／又はそれらからなる核酸を提供する。核酸はベクター内に存在することができ、ベクターは細胞内に存在し得る。さらに、配列番号１２、１３、１４、１５及び１６に示すヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるタンパク質、並びに配列番号１２、１３、１４、１５及び１６に示すヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体も包含される。その数多くの修正及び変形が当業者に明白であるので、例示だけを意図する以下の実施例において本発明をより詳細に説明する。
ＶＫＯＲ遺伝子におけるＳＮＰとワルファリンに対する高い又は低い感受性との間の相関
ＶＫＯＲ遺伝子の最も一般的なアイソフォームは、約４ｋｂの長さであり、３個のエクソンを有し、１８．４ｋＤａの質量を有する１６３アミノ酸の酵素をコードする。本研究では、ＳＮＰと特定された３つの突然変異、ｖｋ２５８１（Ｇ＞Ｃ）、ｖｋ３２９４（Ｔ＞Ｃ）及びｖｋ４７６９（Ｇ＞Ａ）（それぞれ４６．９％、４６．８％及び４６．３％のヘテロ接合率）を、被験者におけるそれらの存在と、治療的に有効な応答を達成するために必要なワルファリンの維持用量との間の相関に関して検討した。
１．被験者の選択
被験者は、Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ｃａｒｅ ＣｅｔｅｒのＵＮＣ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｃから得た。熟達した遺伝学カウンセラーによってインフォームドコンセントを得た。英語が堪能でない被験者は、通訳がいないことと同意の必要性のために除外した。試験に適格であるために、被験者は少なくとも６ヶ月間ワルファリンを服用しており、１８歳以上で、Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ｃａｒｅ ＣｌｉｎｉｃのＵＮＣ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｃによってフォローアップされた。
２．全血からのゲノムＤＮＡの抽出
ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮカタログ番号５１１０４）を用いて被験者の全血から抽出した。ＤＮＡ濃度を１０ｎｇ／μＬに調整した。
３．ゲノムＤＮＡ試料の配列決定
ＤＮＡ約１０ｎｇをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイのために使用した。ＶＫＯＲ遺伝子を増幅するために使用したプライマーは以下の通りであった：５’−ＵＴＲ及びエクソン１領域に関しては、エクソン１−５’ＣＣＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＴＣＡＧＡＧＧ（配列番号２９）及びエクソン１−３’ＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣＴ（配列番号３０）；エクソン２領域に関しては、エクソン２−５’ＡＧＧＧＧＡＧＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号３１）及びエクソン２−３’ＣＣＴＧＴＴＡＧＴＴＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡ（配列番号３２）；及びエクソン３及び３’−ＵＴＲ領域に関しては、エクソン３−５’ＡＴＡＣＧＴＧＣＧＴＡＡＧＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号３３）及びエクソン３−３’ＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣＣＣＣＣＴＴＡＧ（配列番号３４）。ＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰを検出するために自動化されたハイスループットキャピラリー電気泳動ＤＮＡ塩基配列決定法を使用した。
４．リアルタイムＰＣＲを用いた既知のＳＮＰの検出
ＳＮＰ遺伝子型決定のためのアッセイ試薬は、Ａｓｓａｙ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ（商標）サービス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、カタログ番号４３３２０７２）からであった。プライマー及びプローブ（ＦＡＭ（商標）及びＶＩＣ（商標）染料標識）は、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアを用いて設計し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシンセサイザーで合成した。各々のＳＮＰについてのプライマー対はＳＮＰ部位の上流／下流に位置し、ＰＣＲ反応において１００ｂｐ未満の長さのＤＮＡフラグメントを生成することができる。ＦＡＭ（商標）及びＶＩＣ（商標）染料標識プローブは、１５〜１６ヌクレオチドの長さを有するＳＮＰ部位をカバーするように設計した。各々のＶＫＯＲ ＳＮＰについてのプライマー及びプローブ配列を表２に示す。
２Ｘ ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２４０１８）をＰＣＲ反応において使用した。リアルタイムＰＣＲの４０サイクルをＯｐｔｉｃｏｎ ＩＩ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）装置において実施した。９５℃で１０分間の予備加熱、次いで９２℃で１５分間、６０℃で１分間処理し、その後プレートを読み取った。結果はＦＡＭ及びＶＩＣ染料のシグナル値に従って読み取った。
５．統計分析
種々の遺伝子型の間の平均用量の差を、ＳＡＳバージョン８．０（ＳＡＳ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって比較した。０．０５未満の両側ｐ値を有意とみなした。ＳＮＰ群における治療の平均用量についての分布及び残差の検討は、分散の均一性の仮定を満たすためには対数変換が必要であることを指示した。
６．ワルファリン用量とＳＮＰの相関
直接ゲノムＤＮＡ塩基配列決定及びＳＮＰリアルタイムＰＣＲ検出により、５個のＳＮＰをＶＫＯＲ遺伝子内で特定した：５’−ＵＴＲ内に１個、イントロンＩＩ内に２個、コード領域内に１個及び３’−ＵＴＲ内に１個（表１）。
これらのＳＮＰの中で、ｖｋ５６３及びｖｋ４５０１ ＳＮＰ対立遺伝子は試験の５８名の被験者のうち１名だけによって担持されていた（３’−ＵＴＲのＳＮＰ対立遺伝子も担持する、３重ヘテロ接合）が、その他のＳＮＰは１７〜２５名のヘテロ接合患者において特定された。
各々のマーカーを、最初は独立して分析した。図１Ａは、ｖｋ２５８１野生型対立遺伝子を有する患者についての平均ワルファリン用量は、週当たり、５０．１９±３．２０ｍｇ（ｎ＝２６）であったが、一方この多型に関してヘテロ接合及びホモ接合である患者はそれぞれ週当たり３５．１９±３．７３（ｎ＝１７）及び３１．１４±６．２ｍｇ（ｎ＝１５）であったことを示す。図１Ｂは、野生型ｖｋ３２９４対立遺伝子を有する患者についての平均ワルファリン用量は、週当たり、２５．２９±３．０５ｍｇ（ｎ＝１１）であったが、一方ヘテロ接合及びホモ接合対立遺伝子を担持する患者は、それぞれ週当たり、４１．６８±４．９２（ｎ＝２５）及び４７．７３±２．７５ｍｇ（ｎ＝２２）であったことを示す。図１Ｃは、ｖｋ４７６９ ＳＮＰ野生型を有する患者についての平均ワルファリン用量は、週当たり、３５．３５±４．０１ｍｇ（ｎ＝２７）であったが、一方ヘテロ接合及びホモ接合対立遺伝子を有する患者は、それぞれ週当たり、４４．４８±４．８０（ｎ＝１９）及び４７．５６±３．８６ｍｇ（ｎ＝１２）を必要としたことを示す。また、Ｐ４５０ ２Ｃ９*３は、先に報告されているように（Ｊｏｆｆｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）「Ｗａｒｆａｒｉｎ ｄｏｓｉｎｇ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｃ９ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」 Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ９１：１１２３−１１２８）、ワルファリン用量に有意な影響を及ぼすことが認められた（図１Ｄ）。Ｐ４５０ ２Ｃ９*１（野生型）を有する患者についての平均ワルファリン用量は、週当たり４３．８２±２．７５ｍｇ（ｎ＝５０）であったが、一方、この対立遺伝子に関してヘテロ接合である患者は週当たり２２．４±４．３４ｍｇ（ｎ＝８）を必要とした。
７．統計分析
ＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰとＬｏｇe（ワルファリン平均用量）（ＬｎＤｏｓｅ）の関連性を分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって検討した。ＶＫＯＲ ＳＮＰを除く、用量に影響を及ぼし得る因子を特定するために一連の因子（人種、性別、喫煙歴、肝疾患、シトクロムＰ４５０ ２Ｙ９遺伝子におけるＳＮＰ等）を検討する反復手順を行うため、最初にＳＡＳを使用した。Ｐ４５０ ２Ｃ９*３はワルファリンの平均用量と有意に関連した。そのため、これをさらなる分析のために共変量として含めた。分析は、この共変量を含めたとき、３個のＶＫＯＲ ＳＮＰがまだ週当たりのワルファリン用量と有意に関連することを指し示した（ｖｋ２５８１、Ｐ＜０．０００１；ｖｋ３２９４、Ｐ＜０．０００１；及びｖｋ４７６９、Ｐ＝０．００４４）。
ＶＫＯＲのこれら３個のＳＮＰがワルファリン用量と独立して関連するかどうかを詳細に試験するため、ＶＫＯＲ遺伝子内の２個のＳＮＰをその他のＳＮＰについての共変量として含まれる分析を反復した。３個のＶＫＯＲ ＳＮＰは互いに２ｋｂの距離に位置し、密接に結びつくと予想される。少なくともコーカサス人に関しては、１個のハプロタイプ（Ａ＝ｖｋ２５８１グアニン及びａ＝ｖｋ２５８１シトシン；Ｂ＝ｖｋ３２９４チミン及びｂ＝ｖｋ３９２４シトシン；Ｃ＝ｖｋ４７６９グアニン及びｃ＝ｖｋ４７６９アデニン）がＡＡｂｂｃｃであり、もう１個がａａＢＢＣＣであることが検査から明らかであった。患者における個々のＳＮＰの分布はその他の分布と有意に相関することが認められた（Ｒ＝０．６３〜０．８７、ｐ＜０．００１）。実際に、ハプロタイプＡＡｂｂｃｃを有する被験者（ｎ＝７）（ワルファリン用量＝４８．９８(３．９３）は、ハプロタイプａａＢＢＣＣを有する患者（２５．２９(３．０５；ｐ＜０．００１）に比べてワルファリンの有意に高い用量を必要とした。
ｓｉＲＮＡの設計と合成
合理的設計アルゴリズムの改良版（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）「Ｒａｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：３２６−３３０）を用いてｓｉＲＮＡｓを選択した。１３個の遺伝子の各々について、最も高いスコアを有する４個のｓｉＲＮＡｓ二本鎖を選択し、Ｈｕｍａｎ ＥＳＴデータベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を実施した。オフターゲットサイレンシング効果の潜在的可能性を最小限に抑えるため、無関係な配列に対して４個以上のミスマッチを有する配列標的だけを選択した（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１：６３５−７）。全ての二本鎖を、２’−ＡＣＥ化学の修正法（Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２０００）「Ａｄｖａｎｃｅｄ ５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３１７：３−１８）を用いてＵＵ突出末端を有する２１量体としてＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）で合成し、最大活性を確保するためにＡＳ鎖を化学的にリン酸化した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｉＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ＲＮＡｉ」Ｃｅｌｌ １１０：５６３−７４）。
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションは、わずかな修正を加えて基本的に先に述べられている通りであった（Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１４：４５５７−６５）。
ＶＫＯＲ活性アッセイ
ｓｉＲＮＡトランスフェクトしたＡ５４９細胞をトリプシン処理し、低温ＰＢＳで２回洗浄した。各々のＶＫＯＲアッセイのために、１．５×１０7細胞を採取した。緩衝液Ｄ（２５０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、５００ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール及び ０．７５％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．４）２００μＬを細胞ペレットに加え、次に細胞溶解産物を超音波処理した。可溶化したミクロソームのアッセイのために、記述されているように（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｐｅａｒｓ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２８５８４−９１）２×１０9細胞からミクロソームを調製した；可溶化したミクロソーム１０〜５０μＬを、各々のアッセイに使用した。ビタミンＫエポキシドを図の脚注に指示されている濃度まで添加し、反応を開始させるためにＤＴＴを４ｍＭまで添加した。反応混合物をイエローライト中３０℃で３０分間インキュベートし、０．０５Ｍ ＡｇＮＯ3：イソプロパノール（５：９）５００μＬを添加して停止させた。ヘキサン５００μＬを添加し、ビタミンＫ及びビタミンＫＯを抽出するために、混合物を１分間強くボルテックスした。５分間の遠心分離後、上部有機層を５ｍＬ褐色バイアルに移し、Ｎ2で乾燥した。ビタミンＫ及びビタミンＫＯを溶解するためにＨＰＬＣ緩衝液、アセトニトリル：イソプロパノール：水（１００：７：２）１５０μＬを添加し、試料をＡ Ｃ−１８カラム（Ｖｙｄａｃ、カタログ番号２１８ＴＰ５４）でのＨＰＬＣによって分析した。
ＲＴ−ｑＰＣＲ（逆転写酵素定量的ＰＣＲ）
１×１０6細胞をＰＢＳで２回洗い、全ＲＮＡを製造者のプロトコールに従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トリゾール試薬で単離した。ＲＮＡ１μｇをＲＱ１ ＤＮアーゼ１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によって消化し、熱不活化した。第一鎖ｃＤＮＡをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で作製した。ｃＤＮＡをＤｙＮＡｍｏ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｐｒｅ−ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）と混合し、Ｏｐｔｉｃｏｎ ＩＩ ＰＣＲサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でリアルタイムＰＣＲを実施した。以下のプライマーを使用した：
１３１２４７６９−５’（Ｆ）：（ＴＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＴＴＣＧＧＴＴＧＣ、配列番号１）；
１３１２４７６９−３（Ｒ）’：（ＴＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＴ、配列番号２）；
ＧＡＰＤＨ−Ｆ：（ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ、配列番号３）；
ＧＡＰＤＨ−Ｒ：（ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ、配列番号４）；
Ｌａｍｉｎ−ＲＴ−Ｆ：（ＣＴＡＧＧＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＡ、配列番号５）及び
Ｌａｍｉｎ−ＲＴ−Ｒ：（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣ、配列番号６）。
Ｓｆ９昆虫細胞系におけるＶＫＯＲの過剰発現
ｍＧＣ１１２７６コード領域についてのｃＤＮＡを、ＨＰＣ４タグ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ、配列番号７）と共にアミノ末端においてｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にクローニングし、記述されているように（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：１８２９１−６）Ｓｆ９細胞において発現させた。
遺伝子選択
ＶＫＯＲ遺伝子についての検索を、マーカーＤ１６Ｓ３１３１とＤ１６Ｓ４１９の間のヒト染色体１６番に関して集中的に実施した。この領域は、遺伝子地図上の５０ｃＭ〜６５ｃＭ及び物理的地図上の２６〜４６．３Ｍｂの染色体１６番に相当する。この領域内の１９０個の予測コード配列を、ＮＣＢＩ非重複タンパク質データベースのＢＬＡＳＴＸ検索によって分析した。それらのヒト遺伝子及び公知の機能を有する関連種からのオーソログを排除した。ＶＫＯＲは膜貫通タンパク質であると思われるので（Ｃａｒｌｉｓｌｅ ＆ Ｓｕｔｔｉｅ（１９８０）「Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９：１１６１−７）、残りの遺伝子をＮＣＢＩデータベース内のｃＤＮＡ配列に従って翻訳し、膜貫通ドメインを有するものを予測するためにプログラムＴＭＨＭＭ及びＴＭＡＰ（Ｂｉｏｌｏｇｙ ＷｏｒｋＢｅｎｃｈ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）で分析した。内在性膜タンパク質をコードすると予測される１３個の遺伝子をさらなる分析のために選択した。
ＶＫＯＲ活性に関する細胞系スクリーニング
戦略は、比較的高い量のＶＫＯＲ活性を発現する細胞系を特定し、１３個の候補遺伝子全てを体系的にノックダウンするためにｓｉＲＮＡを使用するというものであった。２１〜２３ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡは、細胞培養において特異的ＲＮＡ分解を引き起こすことが示された（Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｒａｐｔｏｒ，ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ （ＴＯＲ）， ｍｅｄｉａｔｅｓ ＴＯＲ ａｃｔｉｏｎ」Ｃｅｌｌ １１０：１７７−８９；Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ ＆ Ｋｏｓｉｋ（２００２）「ＲＮＡｉ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１９２６−９；Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｖｅｌ ｐ５３ Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅ Ｓｎｋ／Ｐｌｋ２ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｍｉｔｏｔｉｃ Ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ ｉｎ Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ）−Ｅｘｐｏｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２３：５５５６−７１）。しかし、哺乳動物細胞における大規模スクリーニングのためのｓｉＲＮＡの適用は、特定の哺乳動物細胞ｍＲＮＡについての機能的標的を特定することの困難さの故にこれまで報告されていなかった（Ｈｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｓｉｍｉｌａｒ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｓｉＲＮＡｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈｅｙ ａｃｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｃｏｍｍｏｎ ＲＮＡｉ ｐａｔｈｗａｙ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２４０１−７）。ｓｉＲＮＡ設計のための合理的選択アルゴリズム（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．）の開発は、特異的ｓｉＲＮＡが開発できる可能性を上昇させる。さらに、４個の合理的に選択されたｓｉＲＮＡｓをプールすることによって成功の確率を上昇させ得る。これまでに特定されていない遺伝子を検索するためにｓｉＲＮＡを使用することは、ＶＫＯＲ活性が活性のために２個以上の遺伝子の産物を必要とする場合でも、アッセイは酵素活性の損失を測定するのでスクリーニングはまだ有効なはずであるという利点を有する。
１５の細胞系をスクリーニングし、ヒト肺癌系、Ａ５４９が、容易な測定のために十分なワルファリン感受性ＶＫＯＲ活性を示すと特定された。ごくわずかなＶＫＯＲ活性を発現する、２番目のヒト結腸直腸腺癌細胞系、ＨＴ２９を標準として使用した。
Ａ５４９細胞におけるＶＫＯＲ活性のｓｉＲＮＡ阻害
ｓｉＲＮＡの１３のプールの各々を、三重に（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）Ａ５４９細胞にトランスフェクトし、７２時間後にＶＫＯＲ活性を検定した。遺伝子ｇｉ：１３１２４７６９に特異的な１つのｓｉＲＮＡプールは、８回の別々のアッセイにおいてＶＫＯＲ活性を６４％〜７０％低下させた（図２）。
ＶＫＯＲ活性が７２時間後にその初期活性のわずか約３５％に阻害されたことの１つの可能な理由は、哺乳動物タンパク質の半減期が大きく異なる（数分間から数日間）ことであり（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）「Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃａｌｐａｉｎ ｉｓｏｚｙｍｅｓ ａｒｅ ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｃａｌｐａｉｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：１８８２５−３０；Ｂｏｈｌｅｙ（１９９６）「Ｓｕｒｆａｃｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３７７：４２５−３５；Ｄｉｃｅ ＆ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ （１９７５）「Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７２：３８９３−７）、酵素活性ではなくｍＲＮＡ翻訳が阻害される。そのため、細胞を１１日間存続させ、それらのＶＫＯＲ活性を追跡した。図３は、ｇｉ：１３１２４７６９ ｍＲＮＡについてのｍＲＮＡのレベルが正常値の約２０％まで急速に低下し、一方ＶＫＯＲ活性はこの期間中持続的に低下したことを示す。ＶＫＤカルボキシラーゼ活性及びラミンＡ／Ｃ ｍＲＮＡのレベルは一定のままであったので、この活性の低下は、ｓｉＲＮＡの一般的作用又は細胞死の結果ではない。さらに、ｇｉ：１３２１２４７６９ ｍＲＮＡのレベルは、高いＶＫＯＲ活性を示すＡ５４９細胞におけるよりも、低いＶＫＯＲ活性を有するＨＴ−２９細胞において４倍低い。これらのデータは、ｇｉ：１３１２４７６９がＶＫＯＲ遺伝子に対応することを指し示す。
ＶＫＯＲをコードする遺伝子の特定
ＶＫＯＲをコードするとここで特定した、遺伝子ＩＭＡＧＥ ３４５５２００（ｇｉ：１３１２４７６９、配列番号８）は、ヒト染色体１６ｐ１１．２、マウス染色体７Ｆ３及びラット染色体１：１８０．８Ｍｂに位置付けられる。７つの異なるスプライシングパターンを示すＮＣＢＩデータベース内の３３８個のｃＤＮＡクローンが存在する（ＮＣＢＩ ＡｃｅＶｉｅｗプログラム）。これらは２〜４個のエクソンの全部又は一部からなる。これらの中で、最も一般的なアイソフォーム、ｍＧＣ１１２７６は３個のエクソンを有し、肺及び肝細胞において高レベルで発現される。この３個のエクソン転写産物（配列番号９）は、１８．２ｋＤａの質量を有する１６３アミノ酸の予測タンパク質（配列番号１０）をコードする。これは、予測のために使用するプログラムに依存して、１〜３個の膜貫通ドメインを有する推定上のＮ−ミリスチル化小胞体タンパク質である。７個のシステイン残基を有し、酵素活性がチオール試薬に依存するという所見と一致する（Ｔｈｉｊｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）「Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｌｉｐｏａｍｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９７：２７７−８０）。７個のシステイン残基のうち５個は、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ゼノパス属（アフリカツメガエル）及びアノフェレス属（ハマダラカ）の間で保存されている。
ＶＫＯＲ遺伝子が特定されたことを確認するため、酵素の最も一般的な形態（３個のエクソン）をスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、Ｓｆ９細胞において発現させた。Ｓｆ９細胞は測定可能なＶＫＯＲ活性を有さないが、ｍＧＣ１１２７６ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたときワルファリン感受性の活性を示す（図４）。ＶＫＯＲ活性は、エピトープタグを有する構築物から、それらのアミノ又はカルボキシル末端のいずれかで認められる。このタグはＶＫＯＲの精製を助けるはずである。
ＶＫＯＲはワルファリン感受性を示すはずであり、そのためＶＫＯＲを発現するＳｆ９細胞からミクロソームを作製し、ワルファリン感受性に関して試験した。ＶＫＯＲ活性はワルファリン感受性である（図５）。
要約すると、本発明は、未知の遺伝子を特定するために哺乳動物細胞においてｓｉＲＮＡを使用することの最初の例を提供する。ＶＫＯＲ遺伝子の同一性は、昆虫細胞におけるその発現によって確認された。ＶＫＯＲ遺伝子はいくつかのアイソフォームをコードする。各々のアイソフォームの活性と発現パターンを特性決定することが重要である。世界中で何百万もの人々が凝固を阻害するためにワルファリンを利用している。そのため、ＶＫＯＲをさらに特性決定することは、より正確な用量決定、又はより安全で、より有効な抗凝固薬の設計を導き得るので、重要である。
第Ｘ因子のカルボキシル化に関する試験
グルタミン酸からγカルボキシグルタミン酸への翻訳後修飾は多くのタンパク質の活性を必要とし、それらのタンパク質の大部分は凝固に関連する。これらのうちでいくつかは、様々な出血性疾患を治療するための有用なツールとなってきた。例えば組換えヒト第ＩＸ因子は現在、血友病Ｂ患者を治療するために使用される第ＩＸ因子の大部分を占める。加えて、第ＶＩＩａ因子は、第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子のいずれかに対する自己抗体（阻害因子）を有する患者を治療するため及び一般的外傷から生じる出血のために広く使用される。もう１つのＧｌａタンパク質、活性化プロテインＣは、敗血症の治療のために使用される。これらのビタミンＫ依存性タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）及びヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３）などの細胞を使用する細胞培養において生産することができる。これらの細胞系全てについて共通の問題は、顕著な過剰生産が達成された場合、生産される組換えタンパク質の有意な分画が低カルボキシル化される。最初は、カルボキシル化における制限因子はビタミンＫ依存性γグルタミルカルボキシラーゼであると考えられた。しかし、その精製及びクローニング後、第ＩＸ因子とカルボキシラーゼの共発現は、ヒト第ＩＸ因子を過剰発現するＣＨＯ細胞系において第ＩＸ因子のカルボキシル化の程度を改善することができなかった。ＨＥＫ２９３細胞系におけるカルボキシル化第Ｘ因子のパーセンテージは、第Ｘ因子のプロペプチドの親和性を低下させることによって上昇させ得る。しかし、プロトロンビンプロペプチドを担持する第Ｘ因子の発現レベルが十分に高い場合、発現のレベルは、まだ細胞が完全な翻訳後修飾を達成する能力を上回る。本研究は、第Ｘ因子を過剰発現する細胞系において第Ｘ因子の約５０％だけがカルボキシル化される程度にビタミンＫエポキシドレダクターゼを（プロトロンビンプロペプチドと）共発現することは、そのほぼ完全なカルボキシル化を生じさせることを明らかにする。
試験材料。全ての制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより入手した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼはＳｔｒａｔａｇｅｎｅより入手した。リポフェクタミン、ハイグロマイシンＢ及びｐｃＤＮＡ３．１／ＨｙｇｒｏベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからであった。トリプシン−ＥＤＴＡ、ウシ胎仔血清及びダルベッコリン酸緩衝食塩水はＳｉｇｍａからであった。抗生物質−抗真菌薬、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）及びＤＭＥＭ Ｆ−１２はＧＩＢＣＯ社からであった。ピューロマイシン及びｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ベクターはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社からであった。ヒト第Ｘ因子はＥｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからであった。ヤギ抗ヒト第Ｘ因子（アフィニティー精製ＩｇＧ）及びウサギ抗ヒト第Ｘ因子（ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ複合体）は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからであった。ペルオキシダーゼ複合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅウサギ抗ヤギＩｇＧはＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＩＮＣからであった。Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ ＦｌｏｗはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈより入手した。カルシウム依存性モノクローナルヒトＦＸ抗体［ＭｏＡｂ、４Ｇ３］はＤｒ．Ｈａｒｏｌｄ Ｊａｍｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ，Ｔｙｌｅｒ，ＴＸから得た。Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ５−ＩヒドロキシアパタイトはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからであった。
ＶＫＯＲを含む哺乳動物細胞発現ベクターの構築。ＶＫＯＲ ｃＤＮＡを増幅するために２個のプライマーを設計した。コザック配列（下線部）及び５’ＥｃｏＲＩ部位に導入したプライマー１：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧ（配列番号３５）。ｃＤＮＡの３’末端のＮｏｔＩ部位に導入したプライマー２：５’−ＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＡＧＣＣＴＴＧＣＣ（配列番号３６）。ＰＣＲ増幅とＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩでの消化後、ＰＣＲ産物を、ＣＭＶウイルス主要最初期プロモーター／エンハンサーを有し、形質転換細胞にピューロマイシン耐性を付与するｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３に挿入した。
ＨＧＣを含む哺乳動物細胞発現ベクターの構築。ＨＧＣ ｃＤＮＡを増幅するために２個のプライマーを設計した。Ｂａｍ Ｈ１部位及び５’末端のコザック配列（下線）に導入したプライマー３：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＣＧＧＡＣＣＴＣ ＧＣＣＣ（配列番号３７）及び３’末端のＮｏｔＩ部位に導入したプライマー４：５’−ＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＡＴＴＴＧＡＣＴＣ（配列番号３８）。Ｂａｍ ＨＩ及びＮｏｔＩでの消化後、ＰＣＲ産物を、ＣＭＶプロモーターを有し、形質転換細胞にハイグロマイシン耐性を付与するｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏに挿入した。
ヒトＶＫＯＲを発現する安定な細胞系。約１０〜１２ｍｇ／Ｌの第Ｘ因子（その半数が完全カルボキシル化されている）を生産する突然変異型第Ｘ因子（ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ）を発現する細胞系を使用した。ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌを記述されているように（Ｃａｍｉｒｅ，２０００）作製し、ネオマイシン類似体、Ｇ４１８で選択した。ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌを、製造者のプロトコールに従ってリポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用してプラスミドｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３−ＶＫＯＲでトランスフェクトした。選択は、Ｇ４１８ ４５０μｌ／ｍｌ及びピューロマイシン１．７５μｌ／ｍｌで実施した。耐性コロニーを採取し、ＶＫＯＲ活性に関してスクリーニングした。最も高いＶＫＯＲ活性を有するコロニーをさらなる分析のために選択した。
ヒトＧＧＣＸを発現する安定な細胞系。ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌを、リポフェクチンを用いて、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ−ＨＧＧＣＸでトランスフェクトした。形質転換コロニーをハイグロマイシン３００μｇ／ｍｌ及びＧ４１８ ４５０μｇ／ｍｌで選択し、１８クローンを、低分子ペプチド基質ＦＬＥＥＬ（配列番号３９）によるＧＧＣＸ活性の検定のために選択した。最も高いＧＧＣＸ活性を有するコロニーをさらなる試験のために選択した。
ヒトＶＫＯＲとＨＧＣを共発現する安定な細胞系。ＶＫＯＲとＧＧＣＸの両方を過剰発現するＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ細胞系を得るため、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲをプラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ−ＨＧＧＣＸでトランスフェクトし、１８個の耐性コロニーを分析のために選択した。ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＧＣＸもＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲでトランスフェクトし、この選択から、１個の耐性コロニーだけを得た。ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６ＬをｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３−ＶＫＯＲ及びｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ−ＨＧＣの両方でトランスフェクトし、１０個の耐性コロニーを生じた。次に、２９個の単離されたコロニーをＶＫＯＲ及びＧＧＣＸ活性の両方に関して検定した。両方の活性の最も高いレベルを有するクローンをさらなる分析のために選択した。
各々の細胞系によるＦＸＩ１６Ｌ生産のレベル。サンドイッチＥＬＩＳＡ抗体アッセイのために、ヤギ抗ヒト第Ｘ因子（アフィニティー精製ＩｇＧ）ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ複合体を捕獲抗体として使用し、及びウサギ抗ヒト第Ｘ因子を検出抗体として使用した。Ｐ−ＯＤを顕色のための基質として使用した。標準曲線を作成するためにヒト第Ｘ因子を使用した。ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＧＣＸ及びＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ−ＨＧＧＣＸをＴ２５フラスコにおいて集密まで増殖させ、その後培地を、ビタミンＫ１を含む無血清培地と交換した。無血清培地を１２時間目に交換し、２４時間後に馴化培地を収集して、ＦＸＩ１６Ｌの発現に関して分析した。
ローラーボトルにおける各々の細胞系からのＦＸＩ１６Ｌの発現。４つの安定細胞系、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＧＣＸ及びＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ−ＨＧＧＣＸをＴ−２２５フラスコにおいて集密まで増殖させ、ローラーボトルに移した。２４時間及び３６時間目に培地を、ビタミンＫ１を含む無血清培地と交換した。合計３リットルが得られるまで２４時間ごとに各々の細胞系から培地を収集した。
各々の細胞系からのＦＸＩ１６Ｌの精製。馴化培地を解凍し、０．４５μｍ ＨＶＬＰフィルターに通した。次にＥＤＴＡを５ｍＭまで添加し、馴化培地１リットルにつき１００×保存プロテアーゼ阻害剤カクテル０．２５ｍｌを添加した。馴化培地を、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．２）／６０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡで平衡させたＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに負荷し、基線が定常になるまでカラムを同じ緩衝液で洗った。カラムからＦＸＩ１６Ｌを溶出するために２０ｍＭトリス（ｐＨ７．２）／７００ｍＭ ＮａＣｌを使用した。タンパク質含有画分をプールし、８ｍＭトリス（ｐＨ７．４）／６０ｍＭ ＮａＣｌに透析した。各々の試料を２ｍＭ ＣａＣｌ2にし、８ｍＭトリス（ｐＨ７．４）／６０ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＣａＣｌ2で平衡させておいた免疫アフィニティー（４Ｇ３）カラムに適用した。同じ緩衝液で洗った後、溶出した第Ｘ因子を同じ緩衝液中０〜８ｍＭ ＥＤＴＡの直線勾配で溶出した。タンパク質を含む画分をプールし、１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．８）に一晩透析した。透析した試料を、出発緩衝液であらかじめ平衡させたＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ５−Ｉヒドロキシアパタイトカラムに適用した。カルボキシル化及び非カルボキシル化第Ｘ因子を分離するために１〜４００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．８）の直線勾配を使用した。
Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ後の試料のウエスタンブロット法及び４Ｇ３後の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗによる精製後、４つの細胞系（ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＣ及びＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ−ＨＧＣ）からの画分をウエスタンブロット法によって特定した。ヤギ抗ヒト第Ｘ因子（アフィニティー精製ＩｇＧ）を第一抗体として使用し、ペルオキシダーゼ複合ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅウサギ抗ヤギＩｇＧを第二抗体として使用して、ＥＣＬ基質を顕色のために使用した。アフィニティー抗体クロマトグラフィーによる精製後、一部の試料を純度に関して検査した。
リアルタイムＱ−ＰＣＲを使用した、各々の細胞系の間でのＶＫＯＲ、ＨＧＣ及びＦＸＩ１６ＬのｍＲＮＡ発現レベルの分析。各々の細胞系（ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＣ及びＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ−ＨＧＣ）について合計１×１０6細胞を１２穴プレートに接種した。全ＲＮＡを各細胞系から抽出した。
各々の細胞系（ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＣ及びＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ−ＨＧＣ）についてのＶＫＯＲ及びＨＧＣ活性。ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３−ＶＫＯＲをＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌにトランスフェクトし、１．７５μｇ／ｍｌピューロマイシン及び４５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８で選択した。１８個の単一クローンをＶＫＯＲ活性に関してスクリーニングした。非常に高いレベルのＶＫＯＲ活性を含む単一クローンを安定細胞系、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲとして保持した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ−ＨＧＣをＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌにトランスフェクトした後、トランスフェクタントを３００μｇ／ｍｌハイグロマイシン及び４５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８で選択することができる。合計１８個の単一クローンをＨＧＣ活性に関してスクリーニングした。非常に高いレベルのＨＧＣ活性を含む単一クローンを安定細胞系、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＣとして保持した。
ＶＫＯＲとＨＧＣの両方の高レベルの活性を含む安定細胞系を作製するために３つの方法を使用した。合計２９個の単一クローンをＶＫＯＲ及びＨＧＣ活性に関してスクリーニングした。ＶＫＯＲとＨＧＣの両方の高レベルを含む単一クローンを安定細胞系、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ−ＨＧＣとして保持した。
細胞系の各々におけるＦＸＩ１６Ｌの生産。ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＣ及びＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ−ＨＧＣは全て、少なくとも宿主細胞と同じ高さのレベルでＦＸＩ１６Ｌを発現した。この実験は比較のために２５ｍｌ Ｔフラスコにおいて実施し、発現のレベルは、タンパク質をローラーボトルで調製したときよりも低かった。これらの実験は、カルボキシラーゼ又はＶＫＯＲを過剰生産する細胞を選択することは第Ｘ因子発現の損失を生じさせなかったことを示す。
ローラーボトルで増殖させた細胞から培地３リットルを収集し、各々の細胞系からの第Ｘ因子を、上述したようにＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及び第Ｘ因子抗体アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用することによる、各々の細胞系の間でのｒＦＸＩ１６Ｌのカルボキシル化率の変化の分析。１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．８）に透析した後、４Ｇ３後の画分をＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ５−Ｉヒドロキシアパタイトカラムに適用した。４００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．８）の０〜１００％の直線勾配を使用してカラムを溶出した。各々の試料から合計２プールを得ることができる。第一プールは非カルボキシル化ヒトＦＸＩ１６Ｌから構成され、第二プールは完全γカルボキシル化ヒトＦＸＩ１６Ｌから構成される。各々の細胞系について、比率を得るために完全γカルボキシル化ヒトＦＸＩ１６Ｌの量をカルボキシル化ヒトＦＸＩ１６Ｌの総量で除する。宿主細胞系ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌに関するカルボキシル化率は５２％である［４．５ｍｇ／（４．１３ｍｇ＋４．５ｍｇ）＝５２％］。その他の３つの細胞系（ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ、ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＣ及びＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ−ＨＧＣ）に関するカルボキシル化率は、それぞれ９２％［１０．５ｍｇ／（０．９ｍｇ＋１０．５ｍｇ）＝９２％］、５７％［６．４ｍｇ／（４．７８ｍｇ＋６．４ｍｇ）＝５７％］及び〜１００％［２．４ｍｇ／２．４ｍｇ＝１００％］である。
細胞系ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６ＬとＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲの間でのカルボキシル化率の大きな差は、ＶＫＯＲがインビボでγカルボキシル化反応を劇的に改善することを指し示す。細胞系ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６ＬとＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＨＧＣの間でのカルボキシル化率のより小さな差は、ＨＧＣはカルボキシル化反応を触媒するが、インビボでのカルボキシル化反応の制限因子ではなく、インビボでわずかだけカルボキシル化反応を改善できることを示す。細胞系ＨＥＫ２９３−ＦＸＩ１６Ｌ−ＶＫＯＲ−ＨＧＣにおけるほぼ１００％のカルボキシル化率は、ＶＫＯＲがインビボでのカルボキシル化反応の制限因子であり得ることを指示する。ＶＫＯＲはビタミンＫエポキシド（ＫＯ）をビタミンＫに還元するだけでなく、ビタミンＫを還元型ビタミンＫ（ＫＨ2）にも還元する。ＫをＫＨ2に還元できる２番目の機能がなければ、ビタミンＫはインビボでカルボキシル化系において再利用されることができない。
要約すると、この試験は、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする核酸が、第Ｘ因子などのビタミンＫ依存性タンパク質でトランスフェクトされ、ビタミンＫ依存性タンパク質を生産する細胞にトランスフェクトされたとき、高いカルボキシル化率を有するビタミンＫ依存性タンパク質の生産を生じさせ、それによって細胞内の活性なビタミンＫ依存性タンパク質の量を増加させることを明らかにする。
これらの実験を実施するため、突然変異型第Ｘ因子約１２〜１４ｍｇ／Ｌを発現する（プロトロンビンプロペプチドと共に）ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞系を使用した。この第Ｘ因子は、そのプロペプチドをプロトロンビンのプロペプチドで置換することによってあらかじめ修飾されており（Ｃａｍｉｒｅ ｅｔ ａｌ．「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｘ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（４６）：１４３２２−９（２０００））、第Ｘ因子の〜５０％だけがカルボキシル化される程度まで第Ｘ血液凝固因子を過剰発現した。
約１２〜１４ｍｇ／Ｌの第Ｘ因子を生産するこの細胞系を出発細胞及びコントロール細胞のために使用した。この発現レベルで、ＨＥＫ細胞は、正常第Ｘ因子プロペプチドをプロトロンビンペプチドに置き換えても、第Ｘ因子を完全にカルボキシル化することができなかった。約１２〜１４ｍｇ／Ｌの第Ｘ因子を発現するＨＥＫ２９３細胞を、１）ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）、２）ビタミンＫγグルタミルカルボキシラーゼ、又は３）ビタミンＫエポキシドレダクターゼとビタミンＫγグルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）の両方、でトランスフェクトした。大量のカルボキシラーゼ、ＶＫＯＲ又はＶＫＯＲとカルボキシラーゼの両方を生産することを示したいくつかの細胞系を選択した。これらの選択細胞系の各々において、第Ｘ因子の発現レベルは少なくとも出発細胞系と同じ高さ（実験限界内）であった。これらの実験の結果を、図６Ａ〜Ｄに示す。全ての場合の比較は、約５０％カルボキシル化される第Ｘ因子を発現する、もとの第Ｘ因子発現細胞系に対してである。
実験細胞系の各々から培地３リットルを収集し、ＱＡＥ ｓｅｐｈａｄｅｘ、第Ｘ因子抗体カラム及び最後にヒドロキシルアパタイトカラムで第Ｘ因子を精製した。示されている図は、ヒドロキシルアパタイトカラムに関するものである。最初のピークは、非カルボキシル化第Ｘ因子であり、２番目のピークは完全カルボキシル化第Ｘ因子であることがこれまでに示されている（Ｃａｍｉｒｅ ｅｔ ａｌ．）。図６Ａは、外来性ＶＫＯＲ又はＶＫＧＣを含まないもとの細胞系における第Ｘ因子のカルボキシル化の結果を示す。２番目のピーク（画分２６付近に集中する）は完全カルボキシル化ピークである。面積にすると、第Ｘ因子の５２％が完全カルボキシル化される。図６Ｂは、第Ｘ因子を発現する細胞系へのカルボキシラーゼ単独の付加はカルボキシル化第Ｘ因子のパーセンテージを有意に上昇させなかったことを示す。完全カルボキシル化の程度は、かろうじて５７％完全カルボキシル化まで上昇する。この場合、完全カルボキシル化ピークは画分２５付近に集中する。図６Ｃは、ＶＫＯＲ単独でトランスフェクトした細胞が完全カルボキシル化第Ｘ因子の劇的に高いレベルを示したことを示す。この場合、完全カルボキシル化ピーク（画分２６付近に集中する）及び完全カルボキシル化の程度は、作製される第Ｘ因子全体の９２％まで上昇する。図６Ｄは、細胞をＶＫＯＲとＶＫＧＣでトランスフェクトするとき、第Ｘ因子の１００％が完全カルボキシル化されることを示す。この状況では、ＶＫＯＲ遺伝子の発現がビタミンＫ依存性タンパク質の完全カルボキシル化の主要決定因子である。基質の代謝回転がより低い他の状況では、すなわちプロペプチドが第Ｘ因子よりもはるかに密接にプロトロンビンプロペプチドと結合し、第Ｘ因子の過剰発現が非常に高いときには、カルボキシラーゼ遺伝子の発現も制限的であると考えられる。これらの結果は、第Ｘ因子に加えて、全てのビタミンＫ依存性タンパク質に拡大することができる。
これらの結果は、ＶＫＯＲ（及びおそらくＶＫＧＣ）が完全カルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の生産を促進することを明らかにする。これは、完全に活性な修飾タンパク質を生産する効率を上昇させる機構を提供する。
上記は本発明の説明であり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲、及びその中に含まれる請求項の等価物によって定義される。
本明細書で引用する全ての出版物、特許出願、特許、特許公開及び他の参考文献は、参考文献が提示する文及び／又は段落に関する教示の全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
Figure 2008532544
Figure 2008532544
野生型、ＳＮＰ ｖｋ２５８１、ｖｋ３２９４及びｖｋ４７６９についてヘテロ接合及びホモ接合の被験者におけるワルファリン用量の比較、並びに野生型とＰ４５０２Ｙ９についてヘテロ接合の被験者におけるワルファリン用量の比較。 １３のｓｉＲＮＡプールの各々に関して、Ａ５４９細胞を含む３つのＴ７フラスコをトランスフェクトし、７２時間後にＶＫＯＲ活性を測定した。ＶＫＯＲアッセイはビタミンＫエポキシド２５μＭを使用した。遺伝子ｇｉ：１３１２４７６９に特異的な１つのｓｉＲＮＡプールは、８回の反復でＶＫＯＲ活性を６４％〜７０％低下させた。 Ａ５４９細胞における遺伝子ｇｉ：１３１２４７６９に特異的なｓｉＲＮＡプールによるＶＫＯＲ活性の阻害の時間経過。ＶＫＯＲ活性はこの期間中持続的に低下したが、そのｍＲＮＡのレベルは正常値の約２０％まで急速に低下した。ビタミンＫエポキシド２５μＭをこのアッセイのために使用した。ｓｉＲＮＡは、ＶＫＤカルボキシラーゼの活性又はラミンＡ／ＣｍＲＮＡのレベルに影響を及ぼさなかった。 ｍＧＣ＿１１２７６がＳｆ９昆虫細胞において発現されたとき、ＶＫＯＲ活性が検出された。約１×１０5細胞をこのアッセイで使用した。反応は、緩衝液Ｄ中、ＫＯ３２μＭを使用して３０℃で３０分間実施した。ブランクＳｆ９細胞をネガティブコントロールとして使用し、Ａ５４９細胞を標準として使用した。 ワルファリンによるＶＫＯＲの阻害。緩衝液Ｄ中、ＶＫＯＲ＿Ｓｆ９細胞から作製したミクロソームタンパク質１．６ｍｇ、ＫＯ６０μＭ、及び様々な濃度のワルファリンを使用して３０℃で１５分間、反応を実施した。 ビタミンＫ依存性タンパク質、第Ｘ因子のカルボキシル化。Ａ：外来性ＶＫＯＲ又はＶＫＧＣを伴わずに第Ｘ因子を生産するコントロールＨＥＫ２９３細胞。Ｂ：第Ｘ因子及び外来性ＶＫＧＣだけを生産するＨＥＫ２９３細胞。Ｃ：第Ｘ因子及び外来性ＶＫＯＲだけを生産するＨＥＫ２９３細胞。Ｄ：第Ｘ因子及び外来性ＶＫＯＲとＣＫＧＣの両方を生産するＨＥＫ２９３細胞。

Claims (10)

  1. ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする第一の核酸を発現する細胞に、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする第二の異種核酸を、前記第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ発現されてビタミンＫ依存性タンパク質及びＶＫＯＲを生産する条件下で導入することを含む、細胞内のカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の量を増加させる方法。
  2. ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする第一の核酸を発現する細胞に、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする第二異種核酸を、前記第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ発現されてビタミンＫ依存性タンパク質及びＶＫＯＲを生産する条件下で導入することを含む、ビタミンＫ依存性タンパク質のカルボキシル化を増加させる方法。
  3. ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする第一の核酸を発現する細胞に、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ（ＶＫＯＲ）をコードする第二異種核酸を、前記第一の核酸及び第二の核酸がそれぞれ発現されてビタミンＫ依存性タンパク質及びＶＫＯＲを生産する条件下で導入することを含み、ＶＫＯＲの存在下で細胞において生産されるカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の量が、ＶＫＯＲの非存在下で細胞において生産されるカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の量に比べて増加している、細胞においてカルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質を生産する方法。
  4. 細胞が、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする第三の核酸をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記ビタミンＫ依存性タンパク質が、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロトロンビン及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記細胞が植物細胞である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記細胞が昆虫細胞である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  8. 前記細胞が動物細胞である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  9. 前記ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼが、ウシビタミンＫ依存性カルボキシラーゼである、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼが、ビタミンＫγグルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
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