DE19625049A1 - Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthält - Google Patents
Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthältInfo
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Description
Die Erfindung beschreibt ein transgenes, nicht-menschliches
Säugetier (speziell eine Maus), dessen Körper- und
Geschlechtszellen ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthalten,
das dem Ursprungstier auf parasexuellem Wege im 1- bis 8-
Zellstadium der Embryonalentwicklung übertragen wurde.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, insbesondere
die Prophylaxe und die Therapie maligner Erkrankungen, und die
pharmazeutische Industrie.
Transgene Tiere stellen für die biomedizinische Forschung sehr
wertvolle Modelle dar, mit denen es gelingt, durch das
Hinzufügen, Verstärken oder den experimentell erzeugten Ausfall
von Genfunktionen die Rolle bestimmter zelleigener Faktoren bei
ortho- oder pathogenetischen Prozessen in vivo, also im
Gesamtorganismus aufzuklären. Insbesondere in der Krebs
forschung bieten transgene Tiermodelle die Möglichkeit, in
Cancerogenese-Mechanismen experimentell einzugreifen. Die
Krebsentstehung ist ein Mehrstufen-Prozeß, der mit der
Initiation beginnt und sich über mehrere Stadien der
Tumorpromotion und malignen Progression fortsetzt, bis ein
klinisch diagnostizierbares Carcinom entstanden ist. Diesem
Gesamtprozeß liegen verschiedene genetische und epigenetische
Ereignisse zugrunde, die entweder spontan erfolgen oder durch
chemische und physikalische Noxen induziert werden können; in
jedem Falle handelt es sich um einen außerordentlich
langwierigen Prozeß. Durch transgene Tiermodelle ist man in der
Lage, bestimmte Ereignisse, die zur Generierung einer
Krebserkrankung notwendig sind, experimentell zu verstärken
bzw. die transgenen Tiere bereits mit Eigenschaften
auszustatten, die sie entweder tumorresistenter oder
tumoranfälliger machen, wobei sich in wesentlich kürzeren
Zeiträumen Neoplasmen entwickeln können.
Derartige Modelle
(z. B. US-Patent 4 736 866 der Harvard-Universität "Transgenic
non-human mammals") können eingesetzt werden, um carcinogen
verdächtige Substanzen (z. B. Arzneimittel) auf ihre
krebsauslösende Wirkung zu untersuchen bzw. bestimmte
Substanzklassen auf ihre eventuellen antineoplastischen Effekte
zu untersuchen.
Es gibt bereits Tiermodelle, die zusätzlich Reparaturgene
enthalten (S. Gerson et al., Mutat. Res. 307: 541-555, 94
Die Reparaturgene dieser Modelle wirken jeweils nur in
bestimmten Organen (Leber bzw. Thymus) und sind damit nur
bedingt in der Lage, die einzelnen Schritte der Cancerogenese
(Initiation, Promotion, Progression) einer experimentellen
Analyse zugänglich zu machen.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein transgenes Tier zur
Verfügung zu stellen, welches geeignet ist, detaillierte
Untersuchungen zur Bedeutung zellulärer Schutzmechanismen und
spezifischer DNA-Schäden im Prozeß der Tumorentstehung
durchzuführen. Damit sollen neue Impulse für die Prophylaxe und
die Therapie maligner Erkrankungen ermöglicht werden.
Dieses Ziel wird erfindungsgemäß mit einem transgenen Tier
gemäß den Ansprüchen 1-16 erreicht. Dieses Tier wird
bevorzugt folgendermaßen erhalten:
Die Übertragung des Transgenes erfolgt vornehmlich im Stadium der Zygote, so daß das Transgen, nachdem es in das Ergut (Genom) des sich entwickelnden Organismus integriert wurde, in allen seinen somatischen und generativen Zellen gleichermaßen vorhanden ist. Das Vorhandensein des Transgenes in den Keimzellen des auf diesem Wege hergestellten transgenen Tieres hat zur Folge, daß auch die Nachkommen dieses Tieres das zusätzliche Gen im Genom aller ihrer Zellen enthalten.
Die Übertragung des Transgenes erfolgt vornehmlich im Stadium der Zygote, so daß das Transgen, nachdem es in das Ergut (Genom) des sich entwickelnden Organismus integriert wurde, in allen seinen somatischen und generativen Zellen gleichermaßen vorhanden ist. Das Vorhandensein des Transgenes in den Keimzellen des auf diesem Wege hergestellten transgenen Tieres hat zur Folge, daß auch die Nachkommen dieses Tieres das zusätzliche Gen im Genom aller ihrer Zellen enthalten.
Das für die Genübertragung verwendete DNA-Reparaturgen codiert
ein Protein, das in der Lage ist, spezifische DNA-
Primärschäden, die durch chemische oder physikalische
Substanzen oder endogen in der Erbsubstanz (DNA) hervorgerufen
werden, effizient zu entfernen und somit die Integrität der
Erbsubstanz wieder herzustellen. DNA-Primärläsionen, die nicht
oder falsch repariert werden, können zu Mutationen führen, die
wiederum Erbkrankheiten hervorrufen oder die Ursache für die
Entstehung von Tumoren sein können. Somit wird durch die
Übertragung und Expression des zusätzlichen DNA-Reparaturgenes
die Kapazität des betreffenden gentechnisch veränderten
Säugetieres zur DNA-Schadenskorrektur erhöht und seine Tumor-
Suszeptibilität verringert.
Die beanspruchten Tiere sind geeignete Modelle, die Bedeutung
bestimmter DNA-Reparaturproteine als zelluläre Schutz
mechanismen gegenüber der tumorinduzierenden Wirkung von
exogenen und endogenen Noxen zu bestimmen. Eine signifikante
Reduktion von Mutationen bzw. Tumoren in den beschriebenen
transgenen Tieren nach Behandlung mit mutagenen/cancerogenen
Substanzen ist der entscheidende Beweis dafür, daß es sich bei
dem in diesem Tier exprimierten transgenen DNA-Reparaturprotein
um einen entscheidenden protektiven Faktor des Säugers zur
Verhinderung von Erbgutschäden bzw. Krebs handelt.
Da bestimmte DNA-Reparaturproteine zumeist nur ganz spezifische
DNA-Primärschäden erkennen und reparieren, lassen sich aus der
verminderten Mutations-/Tumorinzidenz ebenfalls wichtige
Rückschlüsse auf die zur Mutations-/Tumorauslösung
entscheidenden DNA-Primärschäden ziehen.
Eine besonders bevorzugte Ausführung der Erfindung besteht
darin, ein zusätzliches rekombinantes Reparaturgen einzufügen,
das in der Epidermis des beanspruchten Säugetiers exprimiert
wird. Durch das Expressions-Targeting der genannten DNA-
Reparaturgene in der Haut der beanspruchten Tiere kann man
durch die Anwendung des Mehrphasen-Hautcarcinogenese-Modells
die Bedeutung bestimmter Typen von chemisch oder physikalisch
induzierten DNA-Primärschäden und von zellulären
Schutzfunktionen während der Tumorinitiation, Tumorkonversion
und -promotion sowie der malignen Progression feststellen.
Diese Erkenntnisse sind von großer Bedeutung für die Ableitung
möglicher präventiver und therapeutischer Maßnahmen bei
verschiedenen Krebserkrankungen des Menschen.
Das Kreuzen der beschriebenen transgenen Säugetiere
(vornehmlich Mäuse), die ein zusätzliches DNA-Reparaturgen
exprimieren, mit anderen transgenen Säugetieren (vornehmlich
Mäuse), die z. B. bestimmte Markergene als Mutationstarget
enthalten und als in vivo-Mutationsdetektions-Modelle für die
Genotoxizitätsprüfung in der chemischen und pharmazeutischen
Industrie verwendet werden, läßt Aussagen darüber zu, inwieweit
ein solcher artifizieller Mutationsmarker im Genom eines
Säugetieres der Prozessierung von DNA-Schäden durch die Zelle
zugänglich und damit der Mutabilität des Säugergenoms
vergleichbar ist.
Damit läßt sich das beanspruchte transgene Modell, bei dem die
Expression eines zusätzlichen DNA-Reparaturgenes gezielt in
bestimmten Geweben, beispielsweise der Haut, erfolgt, exzellent
einsetzen zur Abschätzung der Bedeutung spezifischer DNA-
Primärschäden für die Entstehung von bestimmten Tumortypen, die
durch verschiedene chemische oder physikalische Noxen,
beispielsweise UV-Strahlung, induziert werden können. Darüber
hinaus erlaubt dieses beanspruchte transgene Modell, die Rolle
von Proteinen, die in die Reparatur von DNA-Primärschäden
involviert sind, bei der Prävention von malignen
Entartungsprozessen zu charakterisieren.
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel
näher erläutert werden.
Der hautspezifische Expressionsvektor pCkMGMT wurde konstruiert
durch das Einklonieren der cDNA-Sequenz des menschlichen
O⁶Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT)-Gens, die als 835
bp langes EcoRI-Fragment aus dem Vektor pKT 100 (Tano et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 686-690, 1990) isoliert wurde,
in das 22kb CkIII/IV*-Minilocus-Plasmid (Blessing et al.,
Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis, 15: 11-21,
1993), das den bovinen Cytokeratin III- und Cytokeratin IV-
Promoter sowie die entsprechenden Polyadenylierungssequenzen
enthält. Mit Hilfe geeigneter Adapter wurde jeweils eine MGMT-
cDNA-Kopie in den unikalen SalI-Ort hinter den CkIII-Promoter
und in den unikalen ClaI-Ort hinter den CkIV-Promoter
eingefügt. Die hierzu angewandten gentechnischen Methoden sind
beschrieben bei Maniatis et al., "Molecular Cloning, a
Laboratory manual" , 1989.
Das 22 kb SfiI-Fragment des Expressionsvektors pCkMGMT, das die
menschliche MGMT-cDNA jeweils unter der Kontrolle des CkIII und
des CkIV-Promoters enthält, wurde elektrophoretisch separiert
von der prokaryotischen Vektorsequenz, aus dem Gel eluiert,
über QIAex (Quiagen, USA) gereinigt und zur Abtrennung von
QIAex-Partikeln zentrifugiert. Das aufgereinigte Fragment wurde
in einer Konzentration von 2.5 µg/ml TE in den leichter
zugänglichen der beiden Pronuklei der Zygote mikroinjiziert.
Die Isolation der Zygoten, die Mikroinjektion und der
Retransfer der manipulierten Zygoten in den Eileiter von
Ammenmüttern wurden entsprechend den in Hogan et al.,
(Manipulatig the Mouse Embryo, A Laboratory Manual. 2nd Ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1994)
beschriebenen Methoden durchgeführt.
Im Alter von 4-6 Wochen wurde den aus der Mikroinjektion
hervorgegangenen Tieren ein Stück der Schwanzspitze entnommen
und aus diesem Bioptat hochmolekulare DNA nach der bei Hogan et
al. (s. oben) beschriebenen Methode isoliert. Jeweils 1 µg der
hochmolekularen Maus-DNA wurde verwendet, um mittels der
Polymerase Chain Reaction (PCR) das Transgen im Genom der Tiere
nachzuweisen. Der verwendete 5′-Primer bindet an den Positionen
-142 bis -117 des Cytokeratin III-Promoters, der 3′-Primer
bindet an der menschlichen MGMT-cDNA (Positionen +727 bis
+748), wodurch ein 890 bp Fragment amplifiziert wurde, das nach
elektrophoretischer Separation per Southern Blot-Analyse
detektiert wurde. Die Transgen-Integration in das Mausgenom
wurde durch genomische Southern Blot-Analysen unter Verwendung
von 25 µg DNA, die zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Bam
HI, Sal I, Cla I, Kpn I und Aat II gespalten wurde,
verifiziert. Als radioaktiv markierte DNA-Sonde diente in
beiden Fällen das 835 bp Eco RI-Fragment der MGMTcDNA.
Die transgenen Tiere wurden mit nicht-transgenen Mäusen des
gleichen Stammes verpaart und die Transmission des Transgenes
mit den für die Identifizierung der Founder-Tiere beschriebenen
Techniken geprüft. Die positiven G1-Nachkommen wurden
untereinander verpaart und die homozygoten Tiere mittels
quantitativer Phosphor-Imaging-Analyse selektiert.
Zum Nachweis der gewebespezifischen Expression des Transgenes
wurde Gesamt-RNA aus verschiedenen Organen und Geweben der
transgenen Tiere nach der Guanidiniumthiocyanat/Phenol-Methode
(Chomczynski et al, Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987)
extrahiert und mittels Oligo-dT-Cellulose aufgereinigt. Die so
erhaltene Poly(A)⁺-RNA wurde in einem 1.4%igen Agarosegel unter
denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch separiert. Das
Transgen spezifische Transkript wurde durch Northern Blot-
Analyse mittels einer 835 bp Probe der menschlichen MGMTcDNA
nachgewiesen. Die Existenz des funktionsfähigen menschlichen
MGMT-Reparaturproteins wurde wie folgt geprüft. Gewebeproben
der transgenen Tiere wurden in Extraktionspuffer (20 mM Tris-Cl,
pH 8,5, 1 mM EDTA, 1 mM β-Mercaptoethanol, 10 mg/ml Aprotinin,
10 mM Bestatin, 10 mM Leupeptin, 0,1 mM PMSF) homogenisiert, einer
Ultraschallbehandlung unterzogen und anschließend
zentrifugiert. Jeweils 40 µg der aus den Zellextrakten
isolierten Proteine wurden in einem 12,5%igen Polyacryamidgel
aufgetrennt, auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert und
mit Hilfe polyklonaler Kaninchen-Antikörper, die spezifisch die
menschliche MGMT erkennen, detektiert. Zur Lokalisierung des
transgenen MGMT-Proteins in den basalen und suprabasalen
Epidermiszellen und den Zellen der Haarfollikel wurden
immunohistochemische Nachweistechniken unter Verwendung der
obengenannten Antikörper benutzt. Die Aktivität des transgenen
Reparaturproteins in den epidermalen Zellen wurde durch den
Transfer ³H-markierter Methylgruppen von der O⁶-Position des
Guanins ³H-MNU-behandelter Kalbsthymus DNA quantitativ
bestimmt (Preuss et al., Int. J. Cancer, 61: 321-326, 1995).
Die transgene Mauslinie CkMGMT-Tg3 exprimierte das in ihr Genom
integrierte rekombinante DNA-Reparaturgen gewebespezifisch in
der Haut, wobei das menschliche MGMT-Protein sich als
biologisch aktiv erwies und in der interfollikulären Epidermis
und den äußeren Zellen der Haarfollikel nachweisbar war.
In Zweiphasen-Hautcarcinogenese-Experimenten konnte nach
gewiesen werden, daß die Expression des zusätzlichen
rekombinanten DNA-Reparaturgenes in der Epidermis der
beschriebenen transgenen Tiere die Suszeptibilität dieser
Tiere gegenüber der hautcarcinogenen Wirkung bestimmter
Substanzgruppen signifikant verringert. Im einzelnen wurde die
Tumorinitiation durch eine einmalige dermale "sub-threshold"-
Dosis N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff (MNU), einer methylierenden
N-Nitrosoverbindung, herbeigeführt. 1 Woche nach der Initiation
wurde die Tumorpromotion durchgeführt, indem zweimal
wöchentlich über einen Zeitraum von 22 Wochen der Phorbolester
TPA topikal appliziert wurde. Im Vergleich zu den nicht-trans
genen Tieren des gleichen Stammes war die
Hauttumorinzidenz bei den beschriebenen CkMGMT-transgenen
Mäusen drastisch reduziert (Abb. 2). Wurde den CkMGMT-trans
genen Tieren jedoch 7,12-Dimethylbenz(a)anthracen (DMBA),
das andere cancerogene DNA-Schäden als O⁶-Alkylguanin
induziert, als Initiator verabreicht und nachfolgend TPA
topikal appliziert, so war die Häufigkeit von Hauttumoren bei
beiden Gruppen von Tieren gleich. Dies zeigt, daß
- - das O⁶-Methylguanin die wichtigste präcarcinogene DNA- Primärläsion bei der MNU-induzierten Hautcarcinogenese darstellt,
- - das MGMT-Reparaturprotein den entscheidenden protektiven Mechanismus der Zelle zur Prävention von Mutationen, die durch Alkylantien induziert werden und Ursprung für die Entstehung von Tumoren sein können, darstellt,
- - eine gewebespezifische Erhöhung des MGMT-Gehaltes, wie durch die hautspezifische Expression des zusätzlichen rekombinanten MGMT-Reparaturproteins in transgenen Mäusen gezeigt wurde, der Zelle einen effizienten Schutz gegenüber der tumorbildenden Wirkung alkylierender Substanzen verleiht,
- - die Schutzfunktion auf der schadensspezifischen Reparatur von präcarcinogenen DNA-Läsionen beruht,
- - die protektive Wirkung des MGMT-Proteines gegenüber der hautcarcinogenen Wirkung von Alkylantien auf der Prävention der Tumorinitiation beruht und nicht durch eine Beeinflussung von Mechanismen der Tumorpromotion oder durch eine generelle Beeinträchtigung der Tumorsuszeptibiliät zustande gekommen ist.
Claims (16)
1. Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, dessen
somatische und Keimzellen ein zusätzliches rekombinantes DNA-
Reparaturgen enthalten, das dem genannten Säugetier oder seinen
Vorfahren auf parasexuellem Wege im frühen embryonalen Stadium
übertragen wurde.
2. Säugetier gemäß Anspruch 1, das ein rekombinantes DNA-
Reparaturgen in seinem Genom an einem anderen chromosomalen Ort
als die ebenfalls im Genom des genannten Säugetieres vorhandene
endogene, zum genannten DNA-Reparaturgen homologe DNA-Sequenz
integriert hat.
3. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA-
Reparaturgen eine Funktion kodiert, die der Entfernung von
alkylierten DNA-Läsionen dient.
4. Säugetier gemäß Anspruch 3, dessen transgenes DNA-
Reparaturgen eine O⁶-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT)
kodiert.
5. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen rekombinantes DNA-
Reparaturgen eine Funktion kodiert, die die Korrektur von UV-in
duzierten DNA-Schäden bewerkstelligt.
6. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA-
Reparaturgen von einem Säugetier stammt.
7. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA-
Reparaturgen von einem Nicht-Säuger stammt.
8. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA-
Reparaturgen von einem Bakterium stammt.
9. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA-
Reparaturgen synthetisiert worden ist.
10. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen genanntes rekombinantes
DNA-Reparaturgen unter der transkriptionellen Kontrolle eines
vom endogenen Promoter verschiedenen Regulatorelementes steht.
11. Säugetier gemäß Anspruch 10, dessen genanntes
rekombinantes DNA- Reparaturgen von einem gewebespezifisch
regulierten Promoter kontrolliert wird.
12. Säugetier gemäß Anspruch 10, wobei der genannte Promoter
induzierbar ist.
13. Säugetier gemäß Anspruch 11, wobei der genannte Promoter
ein Kontrollelement der Keratingenfamilie ist.
14. Säugetier gemäß Anspruch 11, dessen rekombinantes DNA-
Reparaturgen in der Epidermis des genannten Säugetieres
exprimiert wird.
15. Säugetier gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Säugetier
ein Nagetier ist.
16. Säugetier gemäß Anspruch 15, wobei das genannte Säugetier
eine Maus ist.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1996125049 DE19625049A1 (de) | 1996-06-22 | 1996-06-22 | Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthält |
| PCT/DE1997/001254 WO1997049802A1 (de) | 1996-06-22 | 1997-06-19 | Transgenes, nicht-menschliches säugetier, das ein zusätzliches dna-reparaturgen enthält |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| DE1996125049 DE19625049A1 (de) | 1996-06-22 | 1996-06-22 | Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthält |
Publications (1)
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|---|---|---|---|
| DE1996125049 Withdrawn DE19625049A1 (de) | 1996-06-22 | 1996-06-22 | Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthält |
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