WO1997049802A1 - Transgenes, nicht-menschliches säugetier, das ein zusätzliches dna-reparaturgen enthält - Google Patents
Transgenes, nicht-menschliches säugetier, das ein zusätzliches dna-reparaturgen enthält Download PDFInfo
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-
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- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
Definitions
- the invention describes a transgenic, non-human mammal (especially a mouse), the body and sex cells of which contain an additional DNA repair gene which was transferred to the animal of origin by parasexual route in the 1-8 cell stage of embryonic development.
- Areas of application of the invention are medicine, in particular prophylaxis and therapy of malignant diseases, and the pharmaceutical industry.
- Transgenic animals are very valuable models for biomedical research, with which the role of certain cell-specific factors in ortho- or pathogenetic processes in vivo, i.e. in the whole organism, can be elucidated by adding, amplifying or experimentally generating failure of gene functions.
- transgenic animal models offer the opportunity to experimentally intervene in cancerogenesis mechanisms.
- Cancer development is a multi-stage process that begins with initiation and continues over several stages of tumor promotion and malignant progression until a clinically diagnosable carcinoma has developed. This overall process is based on various genetic and epigenetic events, which either take place spontaneously or can be induced by chemical and physical noxae; in any case, it is an extremely lengthy process.
- transgenic animal models one is able to experimentally amplify certain events that are necessary to generate a cancer, or to equip the transgenic animals with properties that make them either more tumor-resistant or more susceptible to tumors, with significantly shorter ones Periods of time can develop neoplasms.
- Such models eg US Pat. No. 4,736,866 from the Harvard University Transgenic non-human mammals **
- substances suspected of carcinogen eg pharmaceuticals
- the aim of the invention is to provide a transgenic animal which is suitable for carrying out detailed studies on the importance of cellular protective mechanisms and specific DNA damage in the process of tumor development. This should provide new impulses for the prophylaxis and therapy of malignant diseases.
- transgenic animal according to claims 1-16.
- This animal is preferably obtained as follows:
- the transgene is transmitted primarily in the zygote stage, so that the transgene, after it has been integrated into the genome of the developing organism, is present in all of its somatic and generative cells.
- the presence of the transgene in the germ cells of the transgenic animal produced in this way means that the descendants of this animal also contain the additional gene in the genome of all of their cells.
- the DNA repair gene used for gene transfer encodes a protein that is able to efficiently remove specific primary DNA damage caused by chemical or physical substances or endogenously in the genetic material (DNA) and thus the integrity of the genetic material to manufacture.
- Primary DNA lesions that are not repaired or repaired incorrectly can lead to mutations, which in turn can cause hereditary diseases or can be the cause of the development of tumors.
- the transmission and expression of the additional DNA repair gene thus increases the capacity of the genetically modified mammal in question to correct DNA damage and reduces its tumor susceptibility.
- the animals claimed are suitable models for determining the importance of certain DNA repair proteins as cellular protective mechanisms against the tumor-inducing effect of exogenous and endogenous noxae.
- a significant reduction in mutations or tumors in the described transgenic animals after treatment with mutagenic / carcinogenic substances is the decisive evidence that the transgenic DNA repair protein expressed in this animal is a decisive protective factor of the mammal for preventing genetic damage or cancer.
- a particularly preferred embodiment of the invention consists in inserting an additional recombinant repair gene which is expressed in the epidermis of the claimed mammal.
- the DNA repair genes mentioned in the skin of the animals claimed can be determined by the application of the multi-phase skin carcinogenesis model, the importance of certain types of chemically or physically induced DNA primary damage and of cellular protective functions during tumor initiation, tumor conversion and tumor promotion and malignant progression .
- Crossing the described transgenic mammals primarily mice
- other transgenic mammals primarily mice
- Crossing the described transgenic mammals primarily mice
- other transgenic mammals primarily mice
- Containing certain marker genes as mutation targets and used as in vivo mutation detection models for genotoxicity testing in the chemical and pharmaceutical industries allows statements to be made about the extent to which such an artificial mutation roarker in the genome of a mammal is amenable to the processing of DNA damage by the cell and so that the mutability of the mammalian genome is comparable.
- the claimed transgenic model in which the expression of an additional DNA repair gene is specifically targeted in certain tissues, for example the skin, can thus be used excellently to estimate the importance of specific DNA primary damage for the development of certain tumor types caused by different chemical or physical pollutants, for example UV radiation, can be induced.
- this claimed transgenic model allows the role of proteins involved in the repair of DNA primary damage to be characterized in the prevention of malignant processes. The invention will be explained in more detail below using an exemplary embodiment
- the skin-specific expression vector pCkMGMT was constructed by cloning the cDNA sequence of the human O ⁇ methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) gene, which as an 835 bp EcoRI fragment from the vector pKT 100 (Tano et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, Q ⁇ : 686-690, 1990) was isolated into the 22kb CkIII / IV * minilocus plasmid (Blessing et al., Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis, 15: 11-21, 1993 ), which contains the bovine cytokeratin III and cytokeratin IV promoters and the corresponding polyadenylation sequences.
- MGMT human O ⁇ methylguanine DNA methyltransferase
- MGMT cDNA copy was inserted into the unique Sal site behind the CklII promoter and into the unique Clal site behind the CkIV promoter.
- the genetic engineering methods used for this are described in Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory manual ", 1989.
- the 22 kb Sfil fragment of the expression vector pCkMGMT which contains the human MGMT cDNA in each case under the control of the CklII and the CkIV promoter, was electrophoretically separated from the prokaryotic vector sequence, eluted from the gel, purified by QIAex (Quiagen, USA) and centrifuged to separate QIAex particles.
- the purified fragment was micro-injected in a concentration of 2.5 ⁇ g / ml TE into the more accessible of the two pronuclei of the zygote.
- the transgene integration into the mouse genome was verified by genomic Southern blot analyzes using 25 ⁇ g DNA which had previously been digested with the restriction endonucleases Barn HI, Sal I, Cla I, Kpn I and Aat II. In both cases, the 835 bp Eco RI fragment of the MGMTcDNA served as the radiolabelled DNA probe.
- the transgenic animals were mated to non-transgenic mice of the same strain and the transmission of the transgene was checked using the techniques described for the identification of the founder animals.
- the positive GI progeny were mated and the homozygous animals were selected using quantitative phosphor imaging analysis.
- RNA from various organs and tissues of the transgenic animals was processed according to the guanidinium thiocyanate / phenol Method (Chomczynski et al, Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987) extracted and purified by means of oligo-dT cellulose.
- the poly (A) * RNA thus obtained was electrophoretically separated in a 1.4% agarose gel under denaturing conditions.
- the transgene-specific transcript was detected by Northern blot analysis using an 835 bp sample of the human MGMTcDNA. The existence of the functional human MGMT repair protein was checked as follows.
- Tissue samples from the transgenic animals were homogenized in extraction buffer (20mM Tris-Cl, pH 8.5, ImM EDTA, ImM ß-mercaptoethanol, 10mg / ml aprotinin, 10raM bestatin, 10mm Leupeptin, 0.1mm PMSF), subjected to an ultrasound treatment and then centrifuged . 40 ⁇ g each of the proteins isolated from the cell extracts were separated in a 12.5% polyacryamide gel, transferred to a nitrocellulose membrane and detected with the aid of polyclonal rabbit antibodies, which specifically recognize the human MGMT.
- extraction buffer 20mM Tris-Cl, pH 8.5, ImM EDTA, ImM ß-mercaptoethanol, 10mg / ml aprotinin, 10raM bestatin, 10mm Leupeptin, 0.1mm PMSF
- the transgenic mouse line CkMGMT-Tg3 expressed the recombinant DNA repair gene integrated into its genome in a tissue-specific manner in the skin, the human MGMT protein being biologically active and being detectable in the interfollicular epidermis and the outer cells of the hair follicles. 5. Carcinogenesis studies:
- CkMGMT transgenic animals were 7.12- Dimethylbenz (a) anthracene (DMBA), which induces carcinogenic DNA damage other than 0 6 -alkylguanine, administered as an initiator and subsequently topically applied TPA, the incidence of skin tumors was the same in both groups of animals
- 0 6 -methylguanine is the most important precarcinogenic DNA primary lesion in MNU-induced skin carcinogenesis
- the MGMT repair protein represents the crucial protective mechanism of the cell for the prevention of mutations which are induced by alkylating agents and which can be the origin for the development of tumors, - a tissue-specific increase in the MGMT content, as by the skin-specific expression of the additional recombinant MGMT repair protein has been shown in transgenic mice, which gives the cell efficient protection against the tumor-forming activity of alkylating substances, - the protective function is based on the damage-specific repair of pre-arcinogenic DNA lesions, - The protective effect of the MGMT protein against the skin carcinogenic effect of alkylating agents is based on the prevention of tumor initiation and was not brought about by influencing mechanisms of tumor promotion or by a general impairment of tumor susceptibility.
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Abstract
Die Erfindung beschreibt ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier (speziell eine Maus), dessen Körper- und Geschlechtszellen ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthalten, das dem Ursprungstier auf parasexuellem Wege im 1- bis 8-Zellstadium der Embryonalentwicklung übertragen wurde. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, insbesondere die Prophylaxe und die Therapie maligner Erkrankungen, und die pharmazeutische Industrie. Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein transgenes Tier zur Verfügung zu stellen, welches geeignet ist, detaillierte Untersuchungen zur Bedeutung zellulärer Schutzmechanismen und spezifischer DNA-Schäden im Prozeß der Tumorentstehung durchzuführen. Damit sollen neue Impulse für die Prophylaxe und die Therapie maligner Erkrankungen ermöglicht werden. Dieses Ziel wird gemäß der Erfindung mit einem transgenen, nicht-menschlichen Säugetier erreicht, welches ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthält, welches eine Funktion kodiert, die der Entfernung von alkylierten DNA-Läsionen dient, wobei die kodierte Funktion eine O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist, oder die eine Korrektur von UV-induzierten Schäden bewerkstelligt. Eine besonders bevorzugte Ausführung der Erfindung besteht darin, ein zusätzliches rekombinantes Reparaturgen einzufügen, das in der Epidermis des beanspruchten Säugetiers exprimiert wird.
Description
Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, das ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthält
Beschreibung
Die Erfindung beschreibt ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier (speziell eine Maus), dessen Körper- und Geschlechtszellen ein zusätzliches DNA-Reparaturgen enthalten, das dem ürsprungstier auf parasexuellem Wege im 1- bis 8-Zellstadium der Embryonalentwicklung übertragen wurde.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, insbesondere die Prophylaxe und die Therapie maligner Erkrankungen, und die pharmazeutische Industrie.
Transgene Tiere stellen für die biomedizinische Forschung sehr wertvolle Modelle dar, mit denen es gelingt, durch das Hinzufügen, Verstärken oder den experimentell erzeugten Ausfall von Genfunktionen die Rolle bestimmter zelleigener Faktoren bei ortho- oder pathogenetisehen Prozessen in vivo, also im Gesamtorganismus aufzuklären. Insbesondere in der Krebs-forschung bieten transgene Tiermodelle die Möglichkeit, in Cancerogenese-Mechanismen experimentell einzugreifen. Die Krebsentstehung ist ein Mehrstufen-Prozeß, der mit der Initiation beginnt und sich über mehrere Stadien der Tumorpromotion und malignen Progression fortsetzt, bis ein klinisch diagnostizierbares Carcinom entstanden ist. Diesem Gesamtprozeß liegen verschiedene genetische und epigenetische Ereignisse zugrunde, die entweder spontan erfolgen oder durch chemische und physikalische Noxen induziert werden können; in jedem Falle handelt es sich um einen außerordentlich langwierigen Prozeß. Durch transgene Tiermodelle ist man in der Lage, bestimmte Ereignisse, die zur Generierung einer Krebserkrankung notwendig sind, experimentell zu verstärken bzw. die transgenen Tiere bereits mit Eigenschaften auszustatten, die sie entweder tumorresistenter oder tumoranfälliger machen, wobei sich in wesentlich kürzeren
Zeiträumen Neoplasmen entwickeln können. Derartige Modelle (z.B. US-Patent 4 736 866 der Harvard-Universität Transgenic non-human mammals**) können eingesetzt werden, um carcinogen-verdächtige Substanzen (z. B. Arzneimittel) auf ihre krebsauslösende Wirkung zu untersuchen bzw. bestimmte Substanzklassen auf ihre eventullen antineoplastischen Effekte zu untersuchen.
Es gibt bereits Tiermodelle, die zusätzlich Reparaturgene enthalten (S. Gerson et al., Mutat. Reε. 307: 541-555, 1994). Die Reparaturgene dieser Modelle wirken jeweils nur in bestimmten Organen (Leber bzw. Thymus) und sind damit nur bedingt in der Lage, die einzelnen Schritte der Cancerogenese (Initiation, Promotion, Progression) einer experimentellen Analyse zugänglich zu machen.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein transgenes Tier zur Verfügung zu stellen, welches geeignet ist, detaillierte Untersuchungen zur Bedeutung zellulärer Schutzmechanismen und spezifischer DNA-Schäden im Prozeß der Tumorentstehung durchzuführen. Damit sollen neue Impulse für die Prophylaxe und die Therapie maligner Erkrankungen ermöglicht werden.
Dieses Ziel wird erfindungsgemäß mit einem transgenen Tier gemäß den Ansprüchen 1 - 16 erreicht. Dieses Tier wird bevorzugt folgendermaßen erhalten:
Die Übertragung des Transgenes erfolgt vornehmlich im Stadium der Zygote, so daß das Transgen, nachdem es in das Ergut (Genom) des sich entwickelnden Organismus integriert wurde, in allen seinen somatischen und generativen Zellen gleichermaßen vorhanden ist. Das Vorhandensein des Transgenes in den Keimzellen des auf diesem Wege hergestellten transgenen Tieres hat zur Folge, daß auch die Nachkommen dieses Tieres das zusätzliche Gen im Genom aller ihrer Zellen enthalten.
Das für die Genübertragung verwendete DNA-Reparaturgen codiert ein Protein, das in der Lage ist, spezifische DNA- Primärschäden, die durch chemische oder physikalische Substanzen oder endogen in der Erbsubstanz (DNA) hervorgerufen werden, effizient zu entfernen und somit die Integrität der Erbsubstanz wieder herzustellen. DNA- Primärläsionen, die nicht oder falsch repariert werden, können zu Mutationen führen, die wiederum Erbkrankheiten hervorrufen oder die Ursache für die Entstehung von Tumoren sein können. Somit wird durch die Übertragung und Expression des zusätzlichen DNA-Reparaturgenes die Kapazität des betreffenden gentechnisch veränderten Säugetieres zur DNA- Schadenskorrektur erhöht und seine Tumor-Suszeptibilität verringert.
Die beanspruchten Tiere sind geeignete Modelle, die Bedeutung bestimmter DNA-Reparaturproteine als zelluläre Schutz¬ mechanismen gegenüber der tumorinduzierenden Wirkung von exogenen und endogenen Noxen zu bestimmen. Eine signifikante Reduktion von Mutationen bzw. Tumoren in den beschriebenen transgenen Tieren nach Behandlung mit mutagenen / cancerogenen Substanzen ist der entscheidende Beweis dafür, daß es sich bei dem in diesem Tier exprimierten transgenen DNA-Reparaturprotein um einen entscheidenden protektiven Faktor des Säugers zur Verhinderung von Erbgutschäden bzw. Krebs handelt.
Da bestimmte DNA-Reparaturproteine zumeist nur ganz spezifische DNA-Primärschäden erkennen und reparieren, lassen sich aus der verminderten Mutations-/Tumorinzidenz ebenfalls wichtige Rückschlüsse auf die zur Mutations-/Tumorauslösung entscheidenden DNA-Primärschäden ziehen.
Eine besonders bevorzugte Ausführung der Erfindung besteht darin, ein zusätzliches rekombinantes Reparaturgen einzufügen, das in der Epidermis des beanspruchten Säugetiers exprimiert wird. Durch das Expressions-Targeting der
genannten DNA-Reparaturgene in der Haut der beanspruchten Tiere kann man durch die Anwendung des Mehrphasen- Hautcarcinogenese-Modells die Bedeutung bestimmter Typen von chemisch oder physikalisch induzierten DNA-Primärschäden und von zellulären Schutzfunktionen während der Tumorinitiation, Tumorkonversion und -promotion sowie der malignen Progression feststellen.
Diese Erkenntnisse sind von großer Bedeutung für die Ableitung möglicher präventiver und therapeutischer Maßnahmen bei verschiedenen Krebserkrankungen des Menschen.
Das Kreuzen der beschriebenen transgenen Säugetiere (vornehmlich Mäuse), die ein zusätzliches DNA-Reparaturgen exprimieren, mit anderen transgenen Säugetieren (vornehmlich Mäuse), die z.B. bestimmte Markergene als Mutationstarget enthalten und als in vivo-Mutationsdetektions-Modelle für die Genotoxizitätsprüfung in der chemischen und pharmazeutischen Industrie verwendet werden, läßt Aussagen darüber zu, inwieweit ein solcher artifizieller Mutationsroarker im Genom eines Säugetieres der Prozessierung von DNA-Schäden durch die Zelle zugänglich und damit der Mutabilität des Säugergenoms vergleichbar ist.
Damit läßt sich das beanspruchte transgene Modell, bei dem die Expression eines zusätzlichen DNA-Reparaturgenes gezielt in bestimmten Geweben, beispielsweise der Haut, erfolgt, exzellent einsetzen zur Abschätzung der Bedeutung spezifischer DNA-Primärschäden für die Entstehung von bestimmten Tumortypen, die durch verschiedene chemische oder physikalische Noxen, beispielsweise UV-Strahlung, induziert werden können. Darüber hinaus erlaubt dieses beanspruchte transgene Modell, die Rolle von Proteinen, die in die Reparatur von DNA-Primärschaden involviert sind, bei der Prävention von malignen Entartungsprozessen zu charakterisieren.
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden
1. Herstellung des rekombinanten Transσenkonstruktes pCkMGMT (Abb. 1):
Der hautspezifische Expressionsvektor pCkMGMT wurde konstruiert durch das Einklonieren der cDNA-Sequenz des menschlichen OβMethylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT)- Gens, die als 835 bp langes EcoRI-Fragment aus dem Vektor pKT 100 (Tano et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Q∑: 686-690, 1990) isoliert wurde, in das 22kb CkIII/IV*-Minilocus-Plasmid (Blessing et al., Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis, 15: 11-21, 1993), das den bovinen Cytokeratin III- und Cytokeratin IV-Promoter sowie die entsprechenden Polyadenylierungssequenzen enthält. Mit Hilfe geigneter Adapter wurde jeweils eine MGMT-cDNA-Kopie in den unikalen Sall-Ort hinter den CklII-Promoter und in den unikalen Clal- Ort hinter den CkIV-Promoter eingefügt. Die hierzu angewandten gentechnischen Methoden sind beschrieben bei Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory manual" , 1989.
2. Herstellung der transgenen Mauslinie, die das rekombinante CkMGMT-Reparaturgen enthält:
Das 22 kb Sfil-Fragment des Expressionsvektors pCkMGMT, das die menschliche MGMT-cDNA jeweils unter der Kontrolle des Cklll und des CkIV-Promoters enthält, wurde elektrophoretisch separiert von der prokaryotischen Vektorsequenz, aus dem Gel eluiert, über QIAex (Quiagen, USA) gereinigt und zur Abtrennung von QIAex-Partikeln zentrifugiert. Das aufgereinigte Fragment wurde in einer Konzentration von 2.5 μg/ml TE in den leichter zugänglichen der beiden Pronuklei der Zygote mikroinjiziert. Die Isolation der Zygoten, die Mikroinjektion und der Retransfer der manipulierten Zygoten in den Eileiter von Ammenmüttern wurden entsprechend den in
Hogan et al., (Manipulatig the Mouse Embryo, A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1994) beschriebenen Methoden durchgeführt.
3, Identifizierung fler ςKMGMT-transgenen Tiere;
Im Alter von 4-6 Wochen wurde den aus der Mikroinjektion hervorgegangenen Tieren ein Stück der Schwanzspitze entnommen und aus diesem Bioptat hochmolekulare DNA nach der bei Hogan et al. (s. oben) beschriebenen Methode isoliert. Jeweils 1 μg der hochmolekularen Maus-DNA wurde verwendet, um mittels der Polymerase Chain Reaction (PCR) das Transgen im Genom der Tiere nachzuweisen. Der verwendete 5'-Primer bindet an den Positionen -142 bis -117 des Cytokeratin III-Promoters, der 3'-Primer bindet an der menschlichen MGMT-cDNA (Positionen +727 bis +748), wodurch ein 890 bp Fragment amplifiziert wurde, das nach elektrophoretischer Separation per Southern Blot-Analyse detektiert wurde. Die Transgen-Integration in das Mausgenom wurde duch genomische Southern Blot-Analysen unter Verwendung von 25μg DNA, die zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Barn HI, Sal I, Cla I, Kpn I und Aat II gespalten wurde, verifiziert. Als radioaktiv markierte DNA-Sonde diente in beiden Fällen das 835 bp Eco RI-Fragment der MGMTcDNA.
Die transgenen Tiere wurden mit nicht-transgenen Mäusen des gleichen Stammes verpaart und die Transmission des Transgenes mit den für die Identifizierung der Founder-Tiere beschriebenen Techniken geprüft. Die positiven Gl-Nachkommen wurden untereinander verpaart und die homozygoten Tiere mittels quantitativer Phosphor- Imaging- Analyse selektiert.
4. Charakterisierung der transgenen Mauslinie:
Zum Nachweis der gewebespezifischen Expression des Transgenes wurde Gesamt-RNA aus verschiedenen Organen und Geweben der transgenen Tiere nach der Guanidiniumthiocyanat/Phenol-
Methode (Chomczynski et al, Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987) extrahiert und mittels Oligo-dT-Cellulose aufgereinigt. Die so erhaltene Poly(A)*-RNA wurde in einem 1.4%igen Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch separiert. Das Transgen spezifische Transkript wurde durch Northern Blot-Analyse mittels einer 835 bp Probe der menschlichen MGMTcDNA nachgewiesen. Die Existenz des funktionsfähigen menschlichen MGMT- Reparaturproteins wurde wie folgt geprüft. Gewebeproben der transgenen Tiere wurden in Extraktionspuffer (20mM Tris-Cl, pH 8,5, ImM EDTA, ImM ß-Mercaptoethanol, lOmg/ml Aprotinin, lOraM Bestatin, lOmM Leupeptin, 0,lmM PMSF) homogenisiert, einer Ultraschallbehandlung unterzogen und anschließend zentrifugiert. Jeweils 40 μg der aus den Zellextrakten isolierten Proteine wurden in einem 12,5%igen Polyacryamidgel aufgetrennt, auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert und mit Hilfe polyklonaler Kaninchen-Antikörper, die spezifisch die menschliche MGMT erkennen, detektiert. Zur Lokalisierung des transgenen MGMT-Proteins in den basalen und suprabasalen Epidermiszellen und den Zellen der Haarfollikel wurden immunohistochemische Nachweistechniken unter Verwendung der obengenannten Antikörper benutzt. Die Aktivität des transgenen Reparaturproteins in den epidermalen Zellen wurde durch den Transfer 3H-markierter Methylgruppen von der Oe- Position des Guanins 3H-MNU-behandelter Kalbsthymus DNA quantitativ bestimmt (Preuss et al., Int. J. Cancer, 6_1: 321- 326, 1995).
Die transgene Mauslinie CkMGMT-Tg3 exprimierte das in ihr Genom integrierte rekombinante DNA-Reparaturgen gewebespezifisch in der Haut, wobei das menschliche MGMT- Protein sich als biologisch aktiv erwies und in der interfollikulären Epidermiε und den äußeren Zellen der Haarfollikel nachweisbar war.
5. Carcinogenese-Untersuchungen:
In Zweiphasen-Hautcarcinogenese-Experimenten konnte nach¬ gewiesen werden, daß die Expression des zusätzlichen rekorabinanten DNA-Reparaturgenes in der Epidermis der beschriebenen transgenen Tiere die Suszeptibilität dieser Tiere gegenüber der hautcarcinogenen Wirkung bestimmter Substanzgruppen signifikant verringert. Im einzelnen wurde die Tumorinitiation durch eine einmalige dermale sub- threshold"-Dosis N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff (MNU), einer methylierenden N-Nitrosoverbindung, herbeigeführt. 1 Woche nach der Initiation wurde die Tumorpromotion durchgeführt, indem zweimal wöchentlich über einen Zeitraum von 22 Wochen der Phorbolester TPA topikal appliziert wurde. Im Vergleich zu den nicht-transgenen Tieren des gleichen Stammes war die Hauttumorinzidenz bei den beschriebenen CkMGMT-transgenen Mäusen drastisch reduziert (Abb. 2). Wurde den CkMGMT- transgenen Tieren jedoch 7,12-Dimethylbenz(a)anthracen (DMBA) , das andere cancerogene DNA-Schäden als 06-Alkylguanin induziert, als Initiator verabreicht und nachfolgend TPA topikal appliziert, so war die Häufigkeit von Hauttumoren bei beiden Gruppen von Tieren gleich. Dies zeigt, daß
- das 06-Methylguanin die wichtigste präcarcinogene DNA- Primärläsion bei der MNU-induzierten Hautcarcinogenese darstellt,
- das MGMT-Reparaturprotein den entscheidenden protektiven Mechanismus der Zelle zur Prävention von Mutationen, die durch Alkylantien induziert werden und Ursprung für die Entstehung von Tumoren sein können, darstellt, - eine gewebespezifische Erhöhung des MGMT-Gehaltes, wie durch die hautspezifische Expression des zusätzlichen rekorabinanten MGMT-Reparaturproteins in transgenen Mäusen gezeigt wurde, der Zelle einen effizienten Schutz gegenüber der tumorbildenden Wirkung alkylierender Substanzen verleiht, - die Schutzfunktion auf der schadensspezifischen Reparatur von präσarcinogenen DNA-Läsionen beruht,
- die protektive Wirkung des MGMT-Proteines gegenüber der hautcarcinogenen Wirkung von Alkylantien auf der Prävention der Tumorinitiation beruht und nicht durch eine Beeinflussung von Mechanismen der Tumorpromotion oder durch eine generelle Beeinträchtigung der Tumorsuszeptibiliät zustande gekommen ist.
Claims
1. Transgenes, nicht-menschliches Säugetier, dessen somatische und Keimzellen ein zusätzliches rekombinantes DNA-Reparaturgen enthalten, das dem genannten Säugetier oder seinen Vorfahren auf parasexuellem Wege im frühen embryonalen Stadium übertragen wurde.
2. Säugetier gemäß Anspruch 1, das ein rekombinantes DNA- Reparaturgen in seinem Genom an einem anderen chromosomalen
Ort als die ebenfalls im Genom des genannten Säugetieres vorhandene endogene, zum genannten DNA-Reparaturgen homologe DNA- Sequenz integriert hat.
3. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA- Reparaturgen eine Funktion kodiert, die der Entfernung von alkylierten DNA-Läsionen dient.
4. Säugetier gemäß Anspruch 3, dessen transgenes DNA- Reparaturgen eine Oe-Methylguanin- DNA-Methyltransferase
(MGMT) kodiert.
5. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen rekombinantes DNA- Reparaturgen eine Funktion kodiert, die die Korrektur von UV- induzierten DNA-Schäden bewerkstelligt.
6. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA- Reparaturgen von einem Säugetier stammt.
7. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA- Reparaturgen von einem Nicht-Säuger stammt.
8. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA- Reparaturgen von einem Bakterium stammt.
9. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen transgenes DNA- Reparaturgen synthetisiert worden ist.
10. Säugetier gemäß Anspruch 1, dessen genanntes rekombinantes DNA-Reparaturgen unter der transkriptionellen Kontrolle eines vom endogenen Promoter verschiedenen Regulatorelementes steht.
11. Säugetier gemäß Anspruch 10, dessen genanntes rekombinantes DNA- Reparaturgen von einem gewebespezifisch regulierten Promoter kontrolliert wird.
12. Säugetier gemäß Anspruch 10, wobei der genannte Promoter induzierbar ist.
13. Säugetier gemäß Anspruch 11, wobei der genannte Promoter ein Kontrollelement der Keratingenfamilie ist.
14. Säugetier gemäß Anspruch 11, dessen rekombinantes DNA- Reparaturgen in der Epidermis des genannten Säugetieres exprimiert wird.
15. Säugetier gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Säugetier ein Nagetier ist.
16. Säugetier gemäß Anspruch 15, wobei das genannte Säugetier eine Maus ist.
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