DE69837221T2

DE69837221T2 - Methode zur bewertung von verbindungen in bezug auf ihres effektes auf die haut

Info

Publication number: DE69837221T2
Application number: DE69837221T
Authority: DE
Inventors: Robert E. Boston BURGESON; Satoshi Amano; Jiro Kishimoto; Toshio Nishiyama; Ritsuko Ehama
Original assignee: Shiseido Co Ltd; General Hospital Corp
Current assignee: Shiseido Co Ltd; General Hospital Corp
Priority date: 1997-12-17
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2018-05-01
Also published as: JP2002508339A; EP1067968B1; EP1067968A4; EP1067968A1; JP4125486B2; DE69837221D1; AU7172498A; WO1999030743A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft transgene Tiere, die Reportergene exprimieren, die an die Promoter, wie z.B. den Versican-Promoter, von Genen gekoppelt sind, die in die Gesundheit, das Altern oder das Aussehen der Haut verwickelt sind, und Verfahren zur Benutzung solcher Tiere zur Bewertung der Wirkung auf die Haut von Behandlungen, z.B. von Verbindungen.
EP 0633315 beschreibt eine transgene Maus, die den menschlichen K6-Keratinpromoter umfasst, der mit einem Reportergen verbunden ist, und empfiehlt die Benutzung dieser Maus für die Bewertung der Wirkung von topischen Behandlungen auf die Haut. Bernstein et al. (Journal of the American Academy of dermatology, November 1997, Seiten 725-729) beschreiben die Beurteilung von Sonnenschutzmitteln mit verschiedenen Sonnenschutzfaktoren bei transgenen Mausmodellen, bei dem die Maus den menschlichen Elastasepromoter aufweist, der an ein Reportergen gebunden ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben entdeckt, dass transgene Tiere, die ein oder mehrere Konstrukte aufweisen, die einen Hautmetabolismus-Promoter, der an ein Reportergen gekoppelt ist, umfassen, dazu benutzt werden können, eine Behandlung wie z.B. das Entfernen von Haaren, z.B. durch Zupfen oder Rasieren oder die Verabreichung einer Verbindung zur Benutzung bei der Gesundheitsförderung oder Schönheitsförderung der Haut zu bewerten.
Die Erfindung kennzeichnet entsprechend ein nichtmenschliches Tier mit einem an einen Versican- Promoter gekoppelten Reportergen; und Verfahren zur Bewertung von Behandlungen nach irgendeinem der Ansprüche 11, 12 oder 13. Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung einer Behandlung wie z.B. das Entfernen von Haaren, z.B. durch Zupfen oder Rasieren oder die Verabreichung einer Verbindung bezüglich ihrer Wirkung auf die Haut. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellung eines transgenen Tiers, das ein Reportergen, das an einen auf den Hautmetabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist, bevorzugt einen menschlichen Reporter, aufweist;
Verabreichung der Behandlung an das transgene Tier oder ein Gewebe davon, und
Bewertung der Expression des Reportergens; wobei die Behandlung auf ihre Wirkung auf die Haut untersucht wird.
Die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung kann bei einem lebenden Tier vorgenommen werden. In anderen Ausführungsformen wird die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, bei einem Gewebe vorgenommen, eine Zelle wird z.B. einem transgenen Tier entnommen.
Die Wirkung der Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, kann bei einem lebenden transgenen Tier, einem toten transgenen Tier oder einem Gewebe, das einem lebenden oder toten transgenen Säugetier entnommen worden ist, vorgenommen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bewertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenssignals mit einem konfokalen Mikroskop.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Bewertung der Expression des Reportergenschritts mindestens einmal während des Tierlebens wiederholt. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung des Schritts können durch 1, 10, 30, 60, 90, 180, 365 oder 700 Tage getrennt sein. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung können an einem lebenden Tier, z.B. unter Benutzung eines konfokalen Mikroskops, ausgeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und die Verbindung wird folgendermaßen verabreicht: Auftragen der Verbindung auf die Haut des transgenen Tiers; systemische Verabreichung der Verbindung; orale Verabreichung der Verbindung; oder bevorzugt dermale oder subkutane Injizierung. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung unter Benutzung eines geeigneten Vektoren, wie z.B. eines Tensids oder eines Wirkstoffs, der die Permeabilität in der Haut erhöht, wie z.B. eine SDS oder DMSO enthaltende Rezeptur, verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter heterolog in Bezug auf das transgene Tier, d.h. der Promoter stammt von einer anderen Spezies. In anderen bevorzugten Ausführungsformen stammt der Promoter von derselben Spezies wie das transgene Tier. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Hautmetabolismus – bezogene Promoter ein menschlicher Hautmetabolismus – bezogener Promoter.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der auf den Hautmetabolismus bezogene Promoter ein Versican-Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Behandlung vor der Bewertung der Reportergenbewertung wiederholt verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und das Verfahren umfasst außerdem eine oder mehrere aufeinanderfolgende Verabreichungen der Verbindung an das transgene Tier. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier während einer Periode von einer, zwei, drei oder vier Wochen verabreicht. Die Verbindung kann mit einem konstanten Niveau oder einem Bereich verschiedener Niveaus verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier vor, während oder nach einer UV-Bestrahlung oder anderen die Haut beschädigenden Behandlungen verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren den Vergleich der Expression des Reportergens mit einem Kontrollwert, z.B. dem Niveau der Expression des in einem unbehandelten transgenen Tier festgestellten Gens.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das transgene Tier außerdem ein zweites Reportergen, das an einen zweiten Hautmetabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist, wobei der zweite Hautmetabolismus bezogene Promoter sich vom ersten Hautmetabolismus bezogenen Promoter unterscheidet. Das an den ersten Promoter gekoppelte Reportergen kann gleich oder unterschiedlich vom an den zweiten Promoter gekoppelten Reportergen sein. Das transgene Tier kann ein erstes an den Versican-Promoter gekoppeltes Reportergen und ein zweites an den Promoter des vaskularen endothialen Wachstumfaktors (VEGF) gekoppeltes Reportergen und ein erstes an den Versican-Promoter gekoppeltes Reportergen und ein zweites an den Hyaluronansynthase-Promoter gekoppeltes Reportergen umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen kann das transgene Tier zwei Konstrukte umfassen, die beide hochreguliert sind. In bevorzugten Ausführungsformen kann das transgene Tier zwei Konstrukte umfassen, die beide herabreguliert sind.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das transgene Tier außerdem die Bewertung der Expression des Reportergens, das an einen zweiten Hautmetabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ein Kosmetikum, eine nicht toxische Substanz, eine Substanz, die in einer oder mehr Gesetzgebungen als humanes Medikament oder für die kosmetische Benutzung zugelassen ist; ein Retinoid oder ein Derivat davon; TGFα oder TGFβ.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren außerdem die Verabreichung einer zweiten Behandlung an das transgene Tier. Die zweite Behandlung kann die Haut verletzen oder beschädigen, Hautzellen abtöten, das Entfernen von Haaren z.B. durch Zupfen, Rasieren oder Auftragen von Enthaarungsmitteln umfassen, oder erzeugt allgemein unerwünschte Hautzustände. Die zweite Behandlung kann das Auftragen von Wasser, von einem Trockenmittel, einem Reizmittel, einem eine Entzündung hervorrufenden Wirkstoff, Licht- oder UV-Bestrahlung sein. Die Reaktion der Reportergen- Expression auf die Behandlung kann bei Anwesenheit der zweiten Behandlung bestimmt werden und wahlweise mit der Reaktion bei Abwesenheit der zweiten Behandlung verglichen werden.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein Verfahren zur Bewertung einer Behandlung z.B. das Entfernen von Haaren, z.B. durch Zupfen oder Rasieren oder die Verabreichung einer Verbindung bezüglich ihrer Wirkung auf die Haut. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellung eines transgenen Tiers, z.B. eine Maus, das ein Reportergen aufweist, das bevorzugt an einen menschlichen Versicanpromoter gekoppelt ist,
Verabreichung einer Behandlung z.B. die Entfernung von Haaren, z.B. durch Zupfen oder Rzsieren, oder die Verabreichung einer Verbindung an das transgene Tier oder an ein Gewebe das daraus entnommen worden ist, und
Bewertung der Expression des Reportergens; wobei die Behandlung auf ihre Wirkung auf die Alterung der Haut untersucht wird.
Die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung kann bei einem lebenden Tier vorgenommen werden. In anderen Ausführungsformen wird die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, bei einem Gewebe vorgenommen, eine Zelle wird z.B. einem transgenen Tier entnommen.
Die Wirkung der Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, kann bei einem lebenden transgenen Tier, einem toten transgenen Tier oder einem Gewebe, das einem lebenden oder toten transgenen Säugetier entnommen worden ist, vorgenommen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bewertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenssignals mit einem konfokalen Mikroskop.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Bewertung der Expression des Reportergenschritts mindestens einmal während des Tierlebens wiederholt. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung des Schritts können durch 1, 10, 30, 60, 90, 180, 365 oder 700 Tage getrennt sein. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung können an einem lebenden Tier, z.B. unter Benutzung eines konfokalen Mikroskops ausgeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und die Verbindung wird folgendermaßen verabreicht: Auftragen der Verbindung auf die Haut des transgenen Tiers; systemische Verabreichung der Verbindung; orale Verabreichung der Verbindung; oder bevorzugt dermale oder subkutane Injizierung. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung unter Benutzung eines geeigneten Vektors, wie z.B. eines Tensids oder eines Wirkstoffs, der die Permeabilität in der Haut erhöht, wie z.B. eine SDS oder DMSO enthaltende Rezeptur, verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Versicanpromoter ein menschlicher Versicanpromoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Behandlung vor der Bewertung der Reportergenbewertung wiederholt verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und das Verfahren umfasst außerdem eine oder mehrere aufeinanderfolgende Verabreichungen der Verbindung an das transgene Tier. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier während einer Periode von eins, zwei, drei oder vier Wochen verabreicht. Die Verbindung kann mit einem konstanten Niveau oder einem Bereich verschiedener Niveaus verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier vor, während oder nach einer UV-Bestrahlung oder anderen die Haut beschädigenden Behandlungen verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren den Vergleich der Expression des Reportergens mit einem Kontrollwert, z.B. dem Niveau der Expression des in einem unbehandelten transgenen Tier festgestellten Gens.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das transgene Tier außerdem die Bewertung der Expression des Reportergens, das an einen zweiten Hautmetabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ein Kosmetikum, ein nicht toxische Substanz, eine Substanz, die in einer oder mehr Gesetzgebungen als menschliches Medikament oder für die kosmetische Benutzung zugelassen ist; ein Retinoid oder ein Derivat davon TGFα oder TGFβ.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren außerdem die Verabreichung einer zweiten Behandlung an das transgene Tier. Die zweite Behandlung kann die Haut verletzen oder beschädigen, Hautzellen abtöten, das Entfernen von Haaren z.B. durch Zupfen, Rasieren oder Auftragen von Enthaarungsmitteln umfassen, oder erzeugt allgemein unerwünschte Hautzustände. Die zweite Behandlung kann das Auftragen von Wasser, von einem Trockenmittel, einem Reizmittel, einem eine Entzündung hervorrufenden Wirkstoff, Licht- oder UV-Bestrahlung sein. Die Reaktion der Reportergen-Expression auf die Behandlung kann bei Anwesenheit der zweiten Behandlung bestimmt werden und wahlweise mit der Reaktion bei Abwesenheit der zweiten Behandlung verglichen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Matrix-Metalloproteinase-Promoter ein menschlicher Matrix-Metalloproteinase-Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Behandlung vor der Bewertung der Reportergenbewertung wiederholt verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und das Verfahren umfasst außerdem eine oder mehrere aufeinanderfolgende Verabreichungen der Verbindung an das transgene Tier. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier während einer Periode von eins, zwei, drei oder vier Wochen verabreicht. Die Verbindung kann mit einem konstanten Niveau oder einem Bereich verschiedener Niveaus verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier vor, während oder nach einer UV-Bestrahlung oder anderen die Haut beschädigenden Behandlungen verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren den Vergleich der Expression des Reportergens mit einen Kontrollwert, z.B. dem Niveau der Expression des in einem unbehandelten transgenen Tier festgestellten Gens.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das transgene Tier außerdem die Bewertung der Expression des Reportergens, das an einen zweiten Hautmetabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ein Kosmetikum, ein nicht toxische Substanz, eine Substanz, die in einer oder mehr Gesetzgebungen als menschliches Medikament oder für die kosmetische Benutzung zugelassen ist; ein Retinoid oder ein Derivat davon TGFα oder TGFβ.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren außerdem die Verabreichung einer zweiten Behandlung an das transgene Tier. Die zweite Behandlung kann die Haut verletzen oder beschädigen, Hautzellen abtöten, das Entfernen von Haaren z.B. durch Zupfen, Rasieren oder Auftragen von Enthaarungsmitteln umfassen, oder erzeugt allgemein unerwünschte Hautzustände. Die zweite Behandlung kann das Auftragen von Wasser, von einem Trockenmittel, einem Reizmittel, einem eine Entzündung hervorrufenden Wirkstoff, Licht- oder UV-Bestrahlung sein. Die Reaktion der Reportergen-Expression auf die Behandlung kann bei Anwesenheit der zweiten Behandlung bestimmt werden und wahlweise mit der Reaktion bei Abwesenheit der zweiten Behandlung verglichen werden.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein Verfahren, zur Bewertung einer Behandlung z.B. das Entfernen von Haaren, z.B. durch Zupfen oder Rasieren oder die Verabreichung einer Verbindung bezüglich ihrer Wirkung auf die Haut. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellung eines transgenen Tiers, z.B. eine Maus, das ein Reportergen, aufweist, das bevorzugt an einen Promoter des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors gekoppelt ist,
Verabreichung der Behandlung an das transgene Tier, und
Bewertung der Expression des Reportergens; wobei die Behandlung auf ihre Wirkung auf die Alterung der Haut untersucht wird.
Die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung kann bei einem lebenden Tier vorgenommen werden. In anderen Ausführungsformen wird die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, bei einem Gewebe vorgenommen, eine Zelle wird z.B. einem transgenen Tier entnommen.
Die Wirkung der Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, kann bei einem lebenden transgenen Tier, einem toten transgenen Tier oder einem Gewebe, das einem lebenden oder toten transgenen Säugetier entnommen worden ist, vorgenommen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bewertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenssignals mit einem konfokalen Mikroskop.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Bewertung der Expression des Reportergenschritts mindestens einmal während des Tierlebens wiederholt. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung des Schritts können durch 1, 10, 30, 60, 90, 180, 365 oder 700 Tage getrennt sein. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung können an einem lebenden Tier, z.B. unter Benutzung eines konfokalen Mikroskops ausgeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und die Verbindung wird folgendermaßen verabreicht: Auftragen der Verbindung auf die Haut des transgenen Tiers; systemische Verabreichung der Verbindung; orale Verabreichung der Verbindung; oder bevorzugt dermale oder subkutane Injizierung. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung unter Benutzung eines geeigneten Vektors, wie z.B. eines Tensids oder eines Wirkstoffs, der die Permeabilität in der Haut erhöht, wie z.B. eine SDS oder DMSO enthaltende Rezeptur.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors ein Promoter des menschlichen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Behandlung vor der Bewertung der Reportergenbewertung wiederholt verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und das Verfahren umfasst außerdem eine oder mehrere aufeinanderfolgende Verabreichungen der Verbindung an das transgene Tier. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier während einer Periode von eins, zwei, drei oder vier Wochen verabreicht. Die Verbindung kann mit einem konstanten Niveau oder einem Bereich verschiedener Niveaus verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier vor, während oder nach einer UV-Bestrahlung oder anderen die Haut beschädigenden Behandlungen verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren den Vergleich der Expression des Reportergens mit einem Kontrollwert, z.B. dem Niveau der Expression des in einem unbehandelten transgenen Tier festgestellten Gens.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das transgene Tier außerdem die Bewertung der Expression des Reportergens, das an einen zweiten Hautmetabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ein Kosmetikum, eine nicht toxische Substanz, eine Substanz, die in einer oder mehr Gesetzgebungen als menschliches Medikament oder für die kosmetische Benutzung zugelassen ist; ein Retinoid oder ein Derivat davon TGFα oder TGFβ.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren außerdem die Verabreichung einer zweiten Behandlung an das transgene Tier. Die zweite Behandlung kann die Haut verletzen oder beschädigen, Hautzellen abtöten, das Entfernen von Haaren z.B. durch Zupfen, Rasieren oder Auftragen von Enthaarungsmitteln umfassen, oder erzeugt allgemein unerwünschte Hautzustände. Die zweite Behandlung kann das Auftragen von Wasser, von einem Trockenmittel, einem Reizmittel, einem eine Entzündung hervorrufenden Wirkstoff, Licht- oder UV-Bestrahlung sein. Die Reaktion der Reportergen-Expression auf die Behandlung kann bei Anwesenheit der zweiten Behandlung bestimmt werden und wahlweise mit der Reaktion bei Abwesenheit der zweiten Behandlung verglichen werden.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein Verfahren, zur Bewertung einer Behandlung z.B. das Entfernen von Haaren, z.B. durch Zupfen oder Rasieren oder die Verabreichung einer Verbindung bezüglich ihrer Wirkung auf die Haut. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellung eines transgenen Tiers, z.B. eine Maus, das ein Reportergen aufweist, das bevorzugt an einen, bevorzugt menschlichen, Hyaluronansynthase-Promoter gekoppelt ist,
Verabreichung der Behandlung an das transgene Tier oder an ein daraus entnommenes Gewebe, und
Bewertung der Expression des Reportergens; wobei die Behandlung auf ihre Wirkung auf die Alterung der Haut untersucht wird.
Die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung kann bei einem lebenden Tier vorgenommen werden. In anderen Ausführungsformen wird die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, bei einem Gewebe vorgenommen, eine Zelle wird z.B. einem transgenen Tier entnommen.
Die Wirkung der Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, kann bei einem lebenden transgenen Tier, einem toten transgenen Tier oder einem Gewebe, das einem lebenden oder toten transgenen Säugetier entnommen worden ist, vorgenommen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bewertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenssignals mit einem konfokalen Mikroskop.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Bewertung der Expression des Reportergenschritts mindestens einmal während des Tierlebens wiederholt. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung des Schritts können durch 1, 10, 30, 60, 90, 180, 365 oder 700 Tage getrennt sein. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung können an einem lebenden Tier, z.B. unter Benutzung eines konfokalen Mikroskops ausgeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und die Verbindung wird folgendermaßen verabreicht: Auftragen der Verbindung auf die Haut des transgenen Tiers; systemische Verabreichung der Verbindung; orale Verabreichung der Verbindung; oder bevorzugt dermale oder subkutane Injizierung. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung unter Benutzung eines geeigneten Vektors, wie z.B. eines Tensids oder eines Wirkstoffs, der die Permeabilität in der Haut erhöht, wie z.B. eine SDS oder DMSO enthaltende Rezeptur, verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Hyaluronansynthese-Promoter ein menschlicher Hyaluronansynthase-Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Behandlung bevorzugt vor der Bewertung der Reportergenbewertung wiederholt verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und das Verfahren umfasst außerdem eine oder mehrere aufeinanderfolgende Verabreichungen der Verbindung an das transgene Tier. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier während einer Periode von eins, zwei, drei oder vier Wochen verabreicht. Die Verbindung kann mit einem konstanten Niveau oder einem Bereich verschiedener Niveaus verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier vor, während oder nach einer UV-Bestrahlung oder anderen die Haut beschädigenden Behandlungen verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren den Vergleich der Expression des Reportergens mit einem Kontrollwert, z.B. dem Niveau der Expression des in einem unbehandelten transgenen Tier festgestellten Gens.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das transgene Tier außerdem die Bewertung der Expression des Reportergens, das an einen zweiten Hautmetabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ein Kosmetikum, ein nicht toxische Substanz, eine Substanz, die in einer oder mehreren Gesetzgebungen als menschliches Medikament oder für die kosmetische Benutzung zugelassen ist; ein Retinoid oder ein Derivat davon TGFα oder TGFβ.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren außerdem die Verabreichung einer zweiten Behandlung an das transgene Tier. Die zweite Behandlung kann die Haut verletzen oder beschädigen, Hautzellen abtöten, das Entfernen von Haaren z.B. durch Zupfen, Rasieren oder Auftragen von Enthaarungsmitteln umfassen, oder erzeugt allgemein unerwünschte Hautzustände. Die zweite Behandlung kann das Auftragen von Wasser, von einen Trockenmittel, einem Reizmittel, einen eine Entzündung hervorrufenden Wirkstoff, Licht- oder UV-Bestrahlung sein. Die Reaktion der Reportergen-Expression auf die Behandlung kann bei Anwesenheit der zweiten Behandlung bestimmt werden und wahlweise mit der Reaktion bei Abwesenheit der zweiten Behandlung verglichen werden.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein Verfahren, zur Bewertung einer Behandlung z.B. das Entfernen von Haaren, z.B. durch Zupfen oder Rasieren oder die Verabreichung einer Verbindung bezüglich ihrer Wirkung auf die Haut. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellung eines transgenen Tiers, z.B. eine Maus, das ein Reportergen, aufweist, das bevorzugt an einen, bevorzugt menschlichen, MMP2- oder MMP9-, bevorzugt MMP9-Promoter gekoppelt ist,
Verabreichung der Behandlung an das transgene Tier oder an ein daraus entnommenes Gewebe, und
Bewertung der Expression des Reportergens; wobei die Behandlung auf ihre Wirkung auf die Alterung der Haut untersucht wird.
Die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung kann bei einem lebenden Tier vorgenommen werden. In anderen Ausführungsformen wird die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, bei einem Gewebe vorgenommen, eine Zelle wird z.B. einem transgenen Tier entnommen.
Die Wirkung der Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, kann bei einem lebenden transgenen Tier, einem toten transgenen Tier oder einem Gewebe, das einem lebenden oder toten transgenen Säugetier entnommen worden ist, vorgenommen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bewertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenssignals mit einem konfokalen Mikroskop.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Bewertung der Expression des Reportergenschritts mindestens einmal während des Tierlebens wiederholt. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung des Schritts können durch 1, 10, 30, 60, 90, 180, 365 oder 700 Tage getrennt sein. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung können an einem lebenden Tier, z.B. unter Benutzung eines konfokalen Mikroskops ausgeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und die Verbindung wird folgendermaßen verabreicht: Auftragen der Verbindung auf die Haut des transgenen Tiers; systemische Verabreichung der Verbindung; orale Verabreichung der Verbindung; oder bevorzugt dermale oder subkutane Injizierung. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung unter Benutzung eines geeigneten Vektors, wie z.B. eines Tensids oder eines Wirkstoffs, der die Permeabilität in der Haut erhöht, wie z.B. eine SDS oder DMSO enthaltende Rezeptur.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist ein MMP2- oder MMP9-, bevorzugt MMP9-Promoter, bevorzugt ein menschlicher MMP2- oder MMP9-, bevorzugt ein MMP9-Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Behandlung vor der Bewertung der Reportergenbewertung wiederholt verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und das Verfahren umfasst außerdem eine oder mehrere aufeinanderfolgende Verabreichungen der Verbindung an das transgene Tier. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier während einer Periode von eins, zwei, drei oder vier Wochen verabreicht. Die Verbindung kann mit einem konstanten Niveau oder einem Bereich verschiedener Niveaus verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier vor, während oder nach einer UV-Bestrahlung oder anderen die Haut beschädigenden Behandlungen verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren den Vergleich der Expression des Reportergens mit einem Kontrollwert, z.B. dem Niveau der Expression des in einem unbehandelten transgenen Tier festgestellten Gens.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das transgene Tier außerdem die Bewertung der Expression des Reportergens, das an einen zweiten Hautmetabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ein Kosmetikum, ein nicht toxische Substanz, eine Substanz, die in einer oder mehr Gesetzgebungen als menschliches Medikament oder für die kosmetische Benutzung zugelassen ist; ein Retinoid oder ein Derivat davon TGFα oder TGFβ.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren außerdem die Verabreichung einer zweiten Behandlung an das transgene Tier. Die zweite Behandlung kann die Haut verletzen oder beschädigen, Hautzellen abtöten, das Entfernen von Haaren z.B. durch Zupfen, Rasieren oder Auftragen von Enthaarungsmitteln umfassen, oder erzeugt allgemein unerwünschte Hautzustände. Die zweite Behandlung kann das Auftragen von Wasser, von einem Trockenmittel, einem Reizmittel, einem eine Entzündung hervorrufenden Wirkstoff, Licht- oder UV-Bestrahlung sein. Die Reaktion der Reportergen-Expression auf die Behandlung kann bei Anwesenheit der zweiten Behandlung bestimmt werden und wahlweise mit der Reaktion bei Abwesenheit der zweiten Behandlung verglichen werden.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein Verfahren, zur Bewertung einer Behandlung z.B. das Entfernen von Haaren, z.B. durch Zupfen oder Rasieren oder die Verabreichung einer Verbindung bezüglich ihrer Wirkung auf die Haut. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellung eines transgenen Tiers, z.B. eine Maus, das ein Reportergen, aufweist, das bevorzugt an einen, bevorzugt menschlichen, neutrophilen Elastasepromoter gekoppelt ist,
Verabreichung der Behandlung an das transgene Tier oder an ein daraus entnommenes Gewebe, und
Bewertung der Expression des Reportergens; wobei die Behandlung auf ihre Wirkung auf die Alterung der Haut untersucht wird.
Die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung kann bei einen lebenden Tier vorgenommen werden. In anderen Ausführungsformen wird die Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, bei einem Gewebe vorgenommen, eine Zelle wird z.B. einem transgenen Tier entnommen.
Die Wirkung der Behandlung, z.B. die Verabreichung einer Verbindung, kann bei einem lebenden transgenen Tier, einem toten transgenen Tier oder einem Gewebe, das einem lebenden oder toten transgenen Säugetier entnommen worden ist, vorgenommen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bewertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenssignals mit einem konfokalen Mikroskop.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Bewertung der Expression des Reportergenschritts mindestens einmal während des Tierlebens wiederholt. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung des Schritts können durch 1, 10, 30, 60, 90, 180, 365 oder 700 Tage getrennt sein. Der erste Schritt und eine folgende Wiederholung können an einem lebenden Tier, z.B. unter Benutzung eines konfokalen Mikroskops ausgeführt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und die Verbindung wird folgendermaßen verabreicht: Auftragen der Verbindung auf die Haut des transgenen Tiers; systemische Verabreichung der Verbindung; orale Verabreichung der Verbindung; oder bevorzugt dermale oder subkutane Injizierung. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung unter Benutzung eines geeigneten Vektors, wie z.B. eines Tensids oder eines Wirkstoffs, der die Permeabilität in der Haut erhöht, wie z.B. eine SDS oder DMSO enthaltende Rezeptur.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der neutrophile Elastasepromoter ein menschlicher neutrophiler Elastasepromoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Behandlung vor der Bewertung der Reportergenbewertung wiederholt verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Behandlung die Verabreichung einer Verbindung und das Verfahren umfasst außerdem eine oder mehrere aufeinanderfolgende Verabreichungen der Verbindung an das transgene Tier. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier während einer Periode von eins, zwei, drei oder vier Wochen verabreicht. Die Verbindung kann mit einem konstanten Niveau oder einem Bereich verschiedener Niveaus verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung dem transgenen Tier vor, während oder nach einer UV-Bestrahlung oder anderen die Haut beschädigenden Behandlungen verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren den Vergleich der Expression des Reportergens mit einem Kontrollwert, z.B. dem Niveau der Expression des in einem unbehandelten transgenen Tier festgestellten Gens.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das transgene Tier außerdem die Bewertung der Expression des Reportergens, das an einen zweiten Hautmetabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung ein Kosmetikum, ein nicht toxische Substanz, eine Substanz, die in einer oder mehr Gesetzgebungen als menschliches Medikament oder für die kosmetische Benutzung zugelassen ist; ein Retinoid oder ein Derivat davon TGFα oder TGFβ.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren außerdem die Verabreichung einer Behandlung (unterschiedlich von der Verbindung) an das transgene Tier. Die zweite Behandlung kann die Haut verletzen oder beschädigen, Hautzellen abtöten, oder erzeugt allgemein unerwünschte Hautzustände. Die Behandlung kann das Auftragen von Wasser, von einem Trockenmittel, einem Reizmittel, einem eine Entzündung hervorrufenden Wirkstoff, Licht- oder UV-Bestrahlung sein. Die Reaktion der Reportergen-Expression auf die Behandlung kann bei Anwesenheit der Behandlung bestimmt werden und wahlweise mit der Reaktion bei Abwesenheit der zweiten Behandlung verglichen werden.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein hierin beschriebenes nichtmenschliches transgenes Tier, z.B. ein transgenes Tier, das ein Reportergen aufweist, das an einen Versicanpromoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Versican-Promoter ein menschlicher Versican-Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein hierin beschriebenes nichtmenschliches transgenes Tier, z.B. eine Maus, oder ein daraus entnommenes Gewebe, das ein Reportergen aufweist, das an einen Promoter des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors ein menschlicher Promoter des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In einen anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein hierin beschriebenes nichtmenschliches transgenes Tier, z.B. eine Maus, oder ein daraus entnommenes Gewebe, das ein Reportergen aufweist, das an einen Hyaluronansynthase-Promoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Hyaluronansynthase-Promoter ein menschlicher Hyaluronansynthase-Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein hierin beschriebenes nichtmenschliches transgenes Tier, z.B. eine Maus, oder ein daraus entnommenes Gewebe, das ein Reportergen aufweist, das an einen Typ IV-Collagenasepromoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist ein MMP2- oder MMP9-, bevorzugt MMP9-Promoter, bevorzugt ein menschlicher MMP2- oder MMP9-, bevorzugt ein MMP9-Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein hierin beschriebenes nichtmenschliches transgenes Tier, z.B. eine Maus, oder ein daraus entnommenes Gewebe, das ein Reportergen aufweist, das an einen neutrophilen Elastasepromoter gekoppelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das transgene Tier ein nichtmenschliches transgenes Tier. Das transgene Tier kann z.B. ein transgenes Minischwein, ein transgenes Meerschweinchen, eine transgene Ratte oder eine transgene Maus, z.B. eine haarlose Maus, eine nackte Maus, eine Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. eine SAM-Maus, siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt, sein. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der neutrophile Elastasepromoter ein menschlicher neutrophiler Elastasepromoter.
In bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Reportergen ein Produkt, wie z.B. ein Enzym, z.B. ein Enzym, das ein farbiges oder lumineszierendes Produkt herstellt, das verhältnismäßig leicht zu erfassen ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Reportergen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferase-Gen, ein grün fluoreszierendes Eiweiß-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerretich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Transferase-Gen sein.
In einem anderen Aspekt beschreiben wir hierin auch ein Promoterreporter-Genkonstrukt.
In einem anderen Aspekt beschreiben wir auch ein Verfahren zur Analyse der Anwesenheit oder Verteilung von GFP in einen Gewebe. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellung einer Gewebeprobe, z.B. eines GFP umfassenden Gewebeschnitts;
Auswertung oder Erfassung einer Fluoreszenzemission oder des Fehlens einer Fluoreszenzemission, wobei der besagte Erfassungsschritt vor dem Waschen oder Fixieren mit einer wässrigen Lösung ausgeführt wird;
wobei GFP in einem Gewebe analysiert wird.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Gewebe vor dem Erfassungsschritt eingefroren. Die Probe wird vor der Erfassung nicht mit einem Fixiermittel in Kontakt gebracht.
In bevorzugten Ausführungsformen stammt das Gewebe von einem transgenen Tier, z.B. einem transgenen Minischwein, einem transgenen Meerschweinchen, einer transgenen Ratte oder einer transgenen Maus, z.B. einer haarlosen Maus, einer nackten Maus, einer Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. einer SAM-Maus; siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt; das grün fluoreszierende Protein (GFP) wird von einer transgenen Sequenz, die GFP kodiert, oder unter der Kontrolle eines transgenen Kontrollelements, z.B. einem transgenen Promoter oder Enhancer exprimiert.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter ein menschlicher Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Erfassung die Untersuchung der Probe mit einem Mikroskop, z.B. einem Fluoreszenz- oder Epifluoreszenz-Mikroskop.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bewertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenzsignals mit einem konfokalen Mikroskop.
Hier beschriebene Tiere können in diesem Verfahren benutzt werden.
In einem anderen Aspekt beschreiben wir auch ein Verfahren zur Bestimmung des Stadiums des Haarzyklus bei einem Tier das ein Reportermolekül in Haarfollikeln, z.B. die äußere Wurzelhülle des Haarfollikels exprimiert. Das Verfahren umfasst die Bewertung oder Erfassung der Anwesenheit oder der Abwesenheit der Reporterexpression, wobei die Anwesenheit mit einer Wachstumsphase des Haarzyklus (anagene Phase) und die Abwesenheit mit einer Ruhephase des Haarzyklus (telegene und katogene Phase) verbunden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Reportermolekül unter der Kontrolle eines Promoters, der im Haarfollikel, z.B. dem äußeren Wurzelschaft exprimiert ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter ein menschlicher Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Reportermolekül GFP.
In bevorzugten Ausführungsformen stammt das Gewebe von einem transgenen Tier, z.B. einem transgenen Minischwein, einem transgenen Meerschweinchen, einer transgenen Ratte oder einer transgenen Maus, z.B. einer haarlosen Maus, einer nackten Maus, einer Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. einer SAM-Maus; siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt.
Hier beschriebene Tiere können in diesem Verfahren benutzt werden.
In besonderen Ausführungsformen ist der Promoter ein VEGF-Promoter, ein Versican-Promoter oder ein anderer hierin beschriebener Promoter.
In einem anderen Aspekt beschreiben wir auch ein Verfahren zur Analyse der Heilung von Wunden. Das Verfahren umfasst: die Bereitstellung eines Tiers das ein Reportermolekül unter der Kontrolle eines VEGF-Promoters exprimiert, die Erfassung der Anwesenheit oder Abwesenheit des Reportermoleküls in einer Wunde, wobei die Heilung der Wunde analysiert wird.
In bevorzugten Ausführungsformen wird der Erfassungsschritt beschrieben.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Tier, das Gewebe des Tiers einer Behandlung wie z.B. der Verabreichung einer Verbindung unterzogen. In solchen Ausführungsformen kann das Verfahren benutzt werden, um die Wirkung der Behandlung auf die Heilung der Wunde auszuwerten. Es kann wünschenswert sein, die Ergebnisse von einem behandelten Subjekt oder Gewebe mit einem unbehandelten Subjekt oder Gewebe zu vergleichen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Reportermolekül ein GFP.
In bevorzugten Ausführungsformen stammt das Gewebe von einem transgenen Tier, z.B. einem transgenen Minischwein, einem transgenen Meerschweinchen, einer transgenen Ratte oder einer transgenen Maus, z.B. einer haarlosen Maus, einer nackten Maus, einer Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. einer SAM-Maus; siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt.
Hier beschriebene Tiere können in diesem Verfahren benutzt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter ein menschlicher Promoter.
In einem anderen Aspekt beschreiben wir auch ein Verfahren zur Analyse der GFP-Expression in einem transgenen Tier, das ein GFP-Transgen aufweist. Das Verfahren umfasst:
einen ersten Schritt zur Bewertung und Erfassung der Anwesenheit oder Abwesenheit von GFP in dem Tier oder in einem Gewebe des Tiers; und (wahlweise)
einen zweiten Schritt zur Bewertung und Erfassung der Anwesenheit oder Abwesenheit von GFP in dem Tier oder in einem Gewebe des Tiers; und
dabei eine Analyse der GFP-Expression.
In bevorzugten Ausführungsformen (in diesem Verfahren und in anderen hierin offenbarten Verfahren) ist das GFP ein rotverschobenes GFP.
In bevorzugten Ausführungsformen stammt das Gewebe von einem transgenen Tier, z.B. einem transgenen Minischwein, einem transgenen Meerschweinchen, einer transgenen Ratte oder einer transgenen Maus, z.B. einer haarlosen Maus, einer nackten Maus, einer Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. einer SAM-Maus; siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen gibt es mindestens 1, 5, 10, 20, 30 oder 60, 180, 365 Tage zwischen dem ersten und dem zweiten Schritt.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Gewebe ein Hautgewebe.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Erfassungsschritte an einem lebenden Tier ausgeführt.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter ein menschlicher Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bewertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenzsignals mit einem konfokalen Mikroskop.
In einem anderen Aspekt beschreiben wir auch ein Verfahren zur Analyse der Expression eines Transgens bei einem transgenen Tier, z.B. einer transgenen Maus oder einem transgenen Schwein. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellen eines lebenden transgenen Tiers;
Bewertung und Erfassung der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Reportergens, z.B. GFP das von einer transgenen Sequenz oder unter der Kontrolle eines transgenen Kontrollelements, z.B. einem transgenen Promoter oder Enhancer exprimiert wird.
und dabei Analyse des Expression eines Transgens.
In bevorzugten Ausführungsformen stammt das Gewebe von einem transgenen Tier, z.B. einem transgenen Minischwein, einem transgenen Meerschweinchen, einer transgenen Ratte oder einer transgenen Maus, z.B. einer haarlosen Maus, einer nackten Maus, einer Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. einer SAM-Maus; siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt. In diesem Text beschriebene Tiere können in den Verfahren benutzt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Reporter unter der Kontrolle eine VEGF-Promoters.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter ein menschlicher Promoter.
In bevorzugten Ausführungsformen wird der Promoter auf der Haut exprimiert.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Bewertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenzsignals mit einem konfokalen Mikroskop.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Gewebe ein Hautgewebe.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Erfassungsschritte an einem lebenden Tier ausgeführt.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren mindestens einmal während des Lebens des Tieres wiederholt. Die erste und die folgende Wiederholung des Verfahrens können durch 1, 10, 30, 60, 90, 180, 365 oder 700 Tage getrennt sein.
In einem anderen Aspekt beschreiben wir ein Verfahren zur Auswertung der Genexpression bei einem lebenden Tier. Das Verfahren umfasst:
Bereitstellen eines lebenden transgenen Tiers, das ein Transgen aufweist, das ein Reportergen, z.B. GFP, z.B. ein rotverschobenes GFP umfasst,
Auswertung oder Erfassung der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Reportermoleküls, z.B. GFP, in einem lebenden transgenen Tier, wobei die Genexpression in dem lebenden Tier ausgewertet wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Sequenz, die ein Reportergen kodiert unter der Kontrolle eines vorher ausgewählten Promoters, z.B. eines menschlichen Promoters. Der vorher ausgewählte Promoter kann ein Hautmetabolismus – bezogener Promoter, z.B.: ein Promoter von einem Gen sein, das ein Transmembranprotein oder eine Komponente der extrazellulären Matrix, wie ein Proteoglycan-Promoter oder ein Versican-Promoter kodiert; ein Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Promoter, z.B. ein MMP1, MMP2, MMP3, MMP4, MMP5, MMP6, MMP7, MMP8 oder ein MMP9- Promoter sein; ein Promoter von einem Gen, das die vaskuläre Funktion beeinflusst, z.B. ein Promoter des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors; ein Hyaluronan-Synthase-Promoter, ein Hyaluronan-Synthase-Promoter 1, ein Hyaluronan-Synthase-Promoter 2 oder ein Hyaluronan-Synthase-Promoter 3 sein; ein Promoter für eine in der Haut exprimierte Collagenase, z.B. ein MMP2 oder MMP9, bevorzugt ein MMP9-Promoter; oder ein neutrophiler Elastasepromoter sein.
Der VEGF-Promoter ist ein bevorzugter Promoter. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Promoter einer, der bei der inflammatorischen Angiogenese oder dem neoplastischen Wachstum herauf- oder herabgeregelt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen stammt das Gewebe von einem transgenen Tier, z.B. einem transgenen Minischwein, einem transgenen Meerschweinchen, einer transgenen Ratte oder einer transgenen Maus, z.B. einer haarlosen Maus, einer nackten Maus, einer Maus mit beschleunigter Seneszenz, z.B. einer SAM-Maus; siehe Takeda et al.; 1991, L. Am. Geriatr. 39:911-919 oder eine transgene mutante Maus, die einen Phänotyp mit beschleunigter Alterung zeigt. Die meistbevorzugten Tiere sind Mäuse.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Behandlung jedem Tier vor, währen oder nach der Bewertung der REportergenewpression verabreicht. Die Behandlung kann die Verabreichung einer Verbindung sein. Die Verbindung kann folgendermaßen verabreicht werden: Auftragen der Verbindung auf der Haut des transgenen Tiers; systemische Verabreichung der Verbindung; orale Verabreichung der Verbindung; oder bevorzugt dermale oder subkutane Injizierung. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Verbindung unter Benutzung eines geeigneten Vektors, wie z.B. eines Tensids oder eines Wirkstoffs, der die Permeabilität in der Haut erhöht, wie z.B. eine SDS oder DMSO enthaltende Rezeptur, verabreicht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Auswertung die Erfassung eines Signals, z.B. eines Fluoreszenzsignals mit einem konfokalen Mikroskop.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Bewertung der Expression mindestens einmal während des Lebens des Tieres wiederholt. Die erste und eine folgende Wiederholung des Schritts können durch 1, 10, 30, 60, 90, 180, 365 oder 700 Tage getrennt sein. Die erste und eine folgende Wiederholung können an einem lebenden Tier z.B. unter Benutzung eines konfokalen Mikroskops ausgeführt werden.
Die Verfahren können in vivo mit vollständigen Tieren oder in vitro, d.h; mit Gewebe, z.B. der Haut oder Zellen, die von einem hierin beschriebenen transgenen Tier abgeleitet sind oder mit Zellen, bevorzugt Hautzellen oder Hautgewebe, von Zellen, die mit einem Hautmetabolismus – bezogenen Promoter / Reportergenkonstrukt transformiert sind, durchgeführt werden.
Wie in diesem Text benutzt, ist ein „transgenes Tier" ein Tier, z.B. ein nichtmenschliches Säugetier, z.B. ein Minischwein, ein Meerschweinchen oder ein Nagetier, z.B. eine Maus oder eine Ratte, bei denen eine oder mehr, bevorzugt alle Zellen des Tiers ein Transgen umfassen. Das Transgen kann in die Zelle direkt oder indirekt durch Einführung eines Vorläufers der Zelle z.B. durch Mikroinjizierung, Transfektion oder Infektion, z.B. Infektion mit einem rekombinanten Virus eingeführt werden. Der Ausdruck genetische Manipulation bezieht sich auf die Einführung eines rekombinanten ADN-Moleküls. Dieses Molekül kann in ein Chromosom integriert werden oder es kann eine außerhalb der Chromosomen replizierte ADN sein.
Transgene Tiere können z.B. heterozygotisch oder homozygotisch für ein Transgen sein.
Wie hierin benutzt, bezeichnet der Ausdruck „Nagetier" alle Mitglieder der phylogenetischen Art Rodentia.
Wie hierin benutzt, bezeichnet der Ausdruck „Reportergen" eine Nukleinsäuresequenz, welche dem Hautmetabolismus bezogenen Promoter nachgeordnet denaturiert („geschmolzen") ist, so dass deren Expression unter der Kontrolle des Promoters ist. Reportergene kodieren normalerweise ein Protein, dessen Aktivität leicht messbar ist. Das Reportergen kann z.B. ein Gen sein, das ein Untersuchungs-Enzym kodiert, das in der Zelle in der Natur nicht existiert, wie z.B. ein Beta-Galactosidase-Gen, elf Luziferasegen, elf GFP-Gen, ein Alkalin-Phosphatase-Gen, ein Meerrettich-Peroxidase-Gen, ein Chloramphenicol-Acetyl-Transferase-Gen, Luziferase und etwas ähnliches.
Wie hierin benutzt, bezeichnet der Ausdruck „Hautmetabolismus bezogenen Promoter" einen Promoter, der in der Haut transkriptionnel aktiv ist. Er braucht nicht hautspezifisch zu sein. Das Gen in dem der Promoter normalerweise gefunden wird, kann ein Gen sein, das bei der Pflege oder den hauteigenen Funktionen der Haut mitwirkt. Das Gen kann z.B. elf Gen, das elf Protein kodiert, das zur extrazellulären Matrix gehört, ein Protein, das bei der Pflege oder Schwächung der extrazellulären Matrix mitwirkt oder elf das bei der Ernährung der Haut mitwirkt, sein.
Wie hierin benutzt, bezeichnet „Verabreichung einer Verbindung an ein Tier" die Abgabe oder Aufbringen einer Behandlung an ein Tier oder eine Zelle. Die Verabreichung kann eine topische Verabreichung auf parenteralem oder oralem Weg, eine intrazelluläre Injektion, eine Subkutane/intradermale Injektion, eine intravenöse Injektion, eine bukkale Verabreichung, transdermale Abgabe oder Verabreichung über den Weg des intranasalen Trakt oder den Atmungstrakt sein. Die meistbevorzugten Verabreichungen sind die topische Applizierung oder die subkutane oder intradermale Injektion.
Die Verfahren der Erfindung erlauben eine schnelle und wirksame Auswertung der Wirkung der Verbindungen auf die Haut.
Andere Kennzeichen und Vorteile der Erfindung werden deutlich aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Patentansprüchen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Zuerst werden die Zeichnungen ausführlich beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung der menschlichen Versican-Lac-Z-Transgen-Konstruktion.
2 ist eine schematische Darstellung des transgenen Konstrukts vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor – grün fluoreszierendes Protein [VEGF-GFP].
3 ist eine Darstellung der Nukleotid-Sequenz des Konstrukts 5069 pb MMP9-Promoter-GFP.
4 ist eine Darstellung der Nukleotid-Sequenz des Konstrukts 7383 pb MMP9-Promoter-Beta-Gal
PROMOTER
Verfahren der Erfindung erlauben die Auswertung der Wirkung einer Verbindung auf die Haut. Verfahren der Erfindung können benutzt werden, um die Wirkung einer Verbindung auf die Gesundheit oder das Aussehen der Haut z.B. als Kosmetikum zu benutzen. Die Wirkung auf die Haut wird gewöhnlich als Wirkung auf die Expression eines Gens unter der Kontrolle eines Hautmetabolismus – bezogenen Promoters bestimmt. Solche Promoter umfassen die, die die Expression kontrollieren von: einem Produkt, das eine Komponente der Haut, wie z.B. die Dermis oder die Epidermis ist; ein Produkt, das die Hydratation oder Ernährung der Haut beeinflusst; ein Produkt, das die Synthese oder Zersetzung der Komponenten der Haut fördert; ein Produkt, das den Blutkreislauf der Haut beeinflusst; ein Produkt, das die Hautdrüsen-Strukturen beeinflusst; ein Produkt, das die subkutane Muskulatur beeinflusst; ein Produkt, das das adipöse Gewebe beeinflusst; oder ein Produkt, das die Hautnerven beeinflusst.
Verfahren der Erfindung sind nützlich zur Bewertung der Wirkung einer Verbindung auf einen Parameter der sich auf das Aussehen der Haut, z.B. die Elastizität der Haut, die Neigung der Haut Falten zu bilden, die Fähigkeit der Haut Fluide, wie z.B. Wasser oder Öl zurückzuhalten, die Fähigkeit der Haut, Schäden wie z.B. durch Licht oder UV induzierte Schäden zu widerstehen oder sie zu reparieren, den Metabolismus der Haarfollikel einschließlich der Wachstumszyklen oder der Pigmentablagerung, den subkutanen Muskeltonus und -Funktion, oder die Neurotransmission durch subkutane Nerven bezieht. Allgemein werden die Wirkungen auf diese Parameter indirekt z.B. durch die Wirkung auf die Expression des Reportergens unter der Kontrolle eines Promoters der normalerweise an ein Gen gekoppelt ist, das ein Produkt kodiert, welches jeden dieser Parameter beeinflusst, bewertet.
Beispiele solcher Hautmetabolismus – bezogener Promoter umfassen: einen Versican-Promoter; einen Matrix metalloproteinase-Promoter; einen Promoter des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors; einen Hyaluronan-Synthase-Promoter; einen MMP2 oder MMP9; bevorzugt einen MMP9-Promoter und einen neutrophilen Elastasepromoter.
Der Versican-Promoter reguliert die in Naso M.F. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (52): 32999-33008, beschriebenen Expression des Versican-Gens, wobei der Inhalt dieses Artikels durch Referenzierung in diesen Text inkorporiert ist. Versican ist ein großes modulares Chondroitin-Sulfat-Proteoglycan, das in der Dermis und Epidermis der Haut exprimiert wird. Versican kann große Mengen von Wasser binden, wobei es an der extrazellulären Matrix befestigt bleibt und deshalb die Haut hydratieren und füllen kann. Deshalb werden Verbindungen, die die Heraufregulierung dieses Gens zur Folge haben, bevorzugt.
Ein Matrix-Metalloproteinase-Promoter reguliert ein Matrix-Metalloproteinase-Gen. Die Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) gehören zu einer Familie von extrazellulären Matrixproteasen, die in Mauch C. et al. (1994) Arch. Dermatol. Res. 287: 107-114 beschrieben sind. Wie es der Name nahelegt, sind die Matrix-Metalloproteinasen in die Zersetzung der extrazellulären Matrix z.B. in der Dermis und der Epidermis der Haut verwickelt. Deshalb werden Verbindungen, die die Herabregulierung dieses Gens zur Folge haben, bevorzugt.
Der Promoter des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors reguliert die z.B. in Tischer E. (1991) J. Biol. Chem. 266 (18): 11947-11954 beschriebene Expression des Gens des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors, wobei der Inhalt dieses Artikels durch Referenzierung in diesen Text inkorporiert ist. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor ist ein Mitogen für vaskulare endotheliale Zellen und als Ergebnis kann es zu der Proliferation des Blutkreislaufs unter der Haut und zu erhöhter vaskulärer Permeabilität führen. Ein verstärkter Blutkreislauf und eine vaskuläre Permeabilität erlauben eine bessere Ernährung (z.B. bessere Ernährungsabgabe an die Dermis und Epidermis) und Hydratation der Haut. Deshalb werden Verbindungen, die die Heraufregulierung dieses Gens zur Folge haben, bevorzugt.
Die Hyaluronan-Synthase (HAS1-3)-Promoter regulieren die Expression der Hyaluronan-Synthase (HAS1-3)-Gene, die jeweils in Italo N. et al. (1996) BBRC 222:816-820; Watanabe K. (1996) J. Biol. Chem. 271 (38):22945-22948; und Spicer A.P. (1997) J. Biol. Chem. 272(14):8957-8961, beschrieben werden, wobei der Inhalt dieser Artikel durch Referenzierung in diesen Text inkorporiert ist. Hyaluronansynthasen sind, wie es der Name nahelegt, Enzyme, die bei der Synthese von Hyaluronan, einem unverzweigten Glycosaminoglycan mitwirken. Hyaluronan bindet Versican und wirkt allgemein als Anker für andere Proteoglycan, was zu einer Stabilisierung des Proteoglycan – „Netzwerks" führt. Als Ergebnis kann Hyaluronan (wie Versican) bei der Hydratation und Füllung der Haut mitwirken. Deshalb werden Verbindungen, die die Heraufregulierung dieses Gens zur Folge haben, bevorzugt.
Der Typ IV-Collagenase-Promoter reguliert die in Huhtala P. (1991) J. Biol. Chem. 266(25):16485-16490 beschriebene Expression des Typ IV-Collagenase-Gens, wobei der Inhalt dieses Artikels durch Referenzierung in diesen Text inkorporiert ist. Die Typ IV-Collagenase ist ein anderes Mitglied der Protease-Familie der extrazellulären Matrix und ist in die Zersetzung verschiedener Komponenten der extrazellulären Matrix z.B. in der Dermis und der Epidermis der Haut verwickelt. Deshalb werden Verbindungen, die die Herabregulierung dieses Gens zur Folge haben, bevorzugt.
Der neutrophile Elastasepromoter reguliert die in Takashi H. (1988) J. Biol. Chem. 263(29):14739-14747 beschriebene Expression des neutrophilen Elastasegens, wobei der Inhalt dieser Artikel durch Referenzierung in diesen Text inkorporiert ist. Eine neutrophile Elastase ist eine starke Serinprotease, die in der Lage ist, die meisten Proteinkomponenten der extrazellulären Matrix (einschließlich Elastin) z.B. in der Dermis und der Epidermis der Haut zu spalten. Deshalb werden Verbindungen, die die Herabregulierung dieses Gens zur Folge haben, bevorzugt.
TRANSGENE TIERE
Transgene Tiere, die in den Verfahren der Erfindung benutzt werden können, umfassen nichtmenschliche Säugetiere wie z.B. Schweine, z.B. Minischweine wie Meerschweinchen; oder Nager z.B. Ratten oder Mäuse, z.B. haarlose Mäuse (z.B. beschrieben in Begona M. et. al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7717-7721), nackte Mäuse, Seneszenz – beschleunigte Mäuse (beschrieben z.B. in Takeda et al. (1991) L. Am. Geriatr. Soc. 39:911-919), oder transgene mutante Mäuse, die einen Phänotyp beschleunigten Alters zeigen; wobei eine oder mehr und bevorzugt im wesentlichen alle Zellen des Tiers ein Transgen umfassen. Transgene Tiere können z.B. heterozygotisch oder homozygotisch für ein Transgen sein. Mäuse sind ein bevorzugtes Subjekt-Tier.
KONSTRUKTION VON TRANSGENEN TIEREN
Verfahren zur Herstellung transgener Tiere, z.B. von Mäusen ist aus dem Stand der Technik bekannt. Ein Ansatz wird weiter unten beschrieben.
Injektion/Implantation von Embryos
Prozeduren zur Embryo-Manipulation oder -Embryo-Mikroinjektion werden z.B. in Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1986, wobei der Inhalt dieses Artikels durch Referenzierung in diesen Text inkorporiert ist) beschrieben. Mauszygoten können von sechs Wochen alten Weibchen kollektiert werden, die mit einem Serum von schwangeren Stuten superovuliert worden sind, worauf nach 48 Stunden menschliches chorionisches Gonadotropin hinzugefügt worden ist. Präparierte Weibchen sind mit Männchen zusammengebracht worden und sind auf vaginale Pfropfen am folgenden Morgen untersucht worden. Pseudoschwangere Weibchen sind je nach Brunst ausgesucht worden und mit nachgewiesen sterilen vasektomierten Männchen zusammengebracht worden und als Empfänger benutzt worden. Zygoten wurden kollektiert und Cumulus-Zellen wurden entfernt. Außerdem konnten Blastozyten geerntet werden. Pronukleare Embryos wurden von mit Männchen gepaarten weiblichen Mäusen erhalten. Die Weibchen wurden mit Serum von schwangeren Stuten (PMS) behandelt, um Follikelwachstum hervorzurufen und mit menschlichem chorionischen Gonadotropin (hCG) behandelt, um eine Ovulation hervorzurufen. Embryos wurden in einer modifizierten phosphatgepufferten Saline von Dulbecco erhalten und in einem modifizierten essentiellen Milieu von Dulbecco (DMEM) gehalten, wozu 10% fötales Rinderserum hinzugefügt wurden.
Es können Mikroinjektionen eines transgenen Konstrukts unter Benutzung eines am Mikroskop befestigten Standard-Mikromanipulators hergestellt werden. Typischerweise werden z.B. Embryos in 100 Mikrolitertropfen DPBS unter Öl während der Mikroinjektion gehalten. Es wird eine ADN-Lösung in den männlichen Pronukleus mikroinjiziert. Eine erfolgreiche Injektion wird durch ein Anschwellen des Pronukleus nachgewiesen. Es können rekombinante ES-Zellen unter Benutzung ähnlicher Techniken in die Blastozyten injiziert werden. Unmittelbar nach der Injektion werden die Embryos in weibliche Empfänger, z.B. reife mit vasektomisierten männlichen Mäusen gepaarte Mäuse transferiert. Im allgemeinen Protokoll werden die weiblichen Empfänger betäubt, es werden paralumbare Inzisionen vorgenommen, um die Ovidukte freizulegen, und die Embryos werden im Ampullenbereich der Ovidukte transformiert. Die Körperwände werden zugenäht und die Haut wird mit Wundenclips verschlossen.
Anwesenheitscreening von Zielkonstrukten
Transgene Tiere können nach der Geburt durch Standardprotokolle identifiziert werden. Auf die ADN vom Schwanzgewebe wird ein Anwesenheitsscreening des Zielkonstrukts unter Benutzung des Souther-Blot- und/oder PCR-Verfahrens angewendet. Die Nachkommenschaft die als Mosaike erscheint, wird dann untereinander gekreuzt, wenn angenommen wird, dass sie das Zielkonstrukt in ihrer Keimlinie enthalten, um homozygote transgene Tiere zu erzeugen. Wenn es unklar ist, ob die Nachkommenschaft eine Keimlinientransmission haben wird, kann sie mit einem parenteralen oder anderen Stamm gekreuzt werden und die Nachkommenschaft kann nach Heterzygosität durchsucht werden. Die Heterozygoten werden durch Souther-Blot- und/oder PCR-Amplifikation der ADN identifiziert.
Die Heterozygoten können dann untereinander gekreuzt werden, um eine homozygote Nachkommenschaft zu erzeugen. Homozygoten können durch Souther-Blotting äquivalenter Mengen von genomischer ADN von Mäusen, die das Produkt dieser Kreuzung sind, ebenso wie Mäuse, die als Heterozygoten bekannt sind und Wildtype-Mäuse identifiziert werden. Sonden zum Screenen der Southern Blots können wie oben beschrieben konstruiert werden.
Andere Mittel der Identifizierung und Kennzeichnung der transgenen Nachkommenschaft sind aus dem Stand der Technik bekannt. Northern Blots können z.B. benutzt werden, um die mARN auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von dem Reportergen kodierende Transkripte auszusondieren. Außerdem können die Western Blots benutzt werden, um das Niveau der Expression des Transgens in verschiedenen Geweben dieser Nachkommenschaft durch Aussondieren des Western Blots mit einem Antikörper gegen das durch das Transgen kodierte Protein oder Antikörper gegen das Markergenprodukt, wo dieses Gen exprimiert ist, zu beurteilen. Endlich kann die in situ-Analyse (wie die Fixierung der Zellen und die Markierung mit dem Antikörper) und/oder FACS (Fluoreszens-aktivierte Zellsortierung)-Analyse von verschieden Zellen aus der Nachkommenschaft unter Benutzung von geeigneten Antikörpern ausgeführt werden, um nach der Anwesenheit oder Abwesenheit des transgenen Produkts zu sehen.
Andere transgene Tiere
Es können andere transgene Tiere in den Verfahren der Erfindung benutzt werden. Verfahren zur Präparierung einer Vielzahl von Tieren ist aus dem Stand der Technik bekannt. Ein Protokoll zur Herstellung eines transgenen Schweins kann gefunden werden in White und Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64. Forum der Immunologie, Seiten 88 bis 94; US-Patent Nr. 5523226; US-Patent Nr. 5573933; PCT-Anmeldung WO93/25071; und PCT-Anmeldung WO95/04744. Ein Protokoll der Herstellung einer transgenen Ratte kann gefunden werden in Bader und Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3:S81-S87, 1996. Ein Protokoll für die Herstellung einer transgenen Kuh kann gefunden werden in Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, Herausgeber Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc. Ein Protokoll für die Herstellung eines transgenen Schafs kann gefunden werden in Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, Herausgeber Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc. Alle Patente und Referenzen sind in diesen Text durch Referenzierung inkorporiert.
REPORTERGENE
Die Verfahren dieser Erfindung sind mindestens teilweise auf die Kopplung von Reportergenen an die Promoter von Genen, die in den Hautmetabolismus impliziert sind, basiert. Das Reportergen kann jedes beliebige Gen sein, das ein erfassbares, insbesondere ein verhältnismäßig leicht zu erfassendes Produkt, z.B. ein fluoreszierendes Genprodukt oder ein Genprodukt, das eine Reaktion, die durch die Bildung eines farbigen Produkts bestimmt werden kann, katalysiert, kodiert. Reportergene sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen ein Beta-Galactosidase-Gen, ein Luziferasegen, ein GFP-Gen, ein Alkalin-Phosphatrase-Gen, ein Meerettich-Peroxidase-Gen oder ein Chloramphenicol-Acetyl-Transferase-Gen. Reportergene werden z.B. beschrieben in: Sambrock, J., Fritsh, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: KONSTRUKTION DES TRANSGENS
Um das Transgen zu konstruieren, wurde ein Fragment des menschlichen Versican-Promoters (Nucleotide -559 bis +280; wobei der Transkriptionsstartort +1 ist) aus der menschlichen genomischen ADN unter Benutzung der aus dem Stand der Technik bekannten PCR-basierten Techniken erhalten. Das Versican-Promoter-Fragment wurde in den pNASS2β-Vektor (Clontech), der durch Restriktion mit XhoI-EcoRI, wie es in 1 gezeigt ist, linearisiert worden ist, eingeführt Dieser Vektor enthält das β-Galactosidase-Reporter-Gen (LacZ) ebenso wie ein Polyadenylation-Signal. Dieser Vektor umfasst auch eine ARN-Splice Donor- und Akzeptor-Sequenz um die Chance eines hohen Transgenexpressions-Niveaus zu optimieren. Um das linearisierte Transgen-ADN-Fragment für die Pronuklear-Injektion zu erhalten, wurde der Vektor mit einem EcoRI- und einem XbaI-Enzym gespalten. Das linearisierte transgene ADN-Fragment hat eine Länge von 4732 bp.
BEISPIEL 2: ERZEUGUNG TRANSGENER MÄUSE
Das linearisierte transgene ADN-Fragment wurde in befruchtete Oozyten von DBA2xC57BL6 (DBF1)-Mäusen (Charles River, Boston) injiziert und die Eier wurden in pseudoschwangere Pflegemütter implantiert. Die Nachkommenschaft (F0) wurde auf Chromosomenintegration des menschlichen Versikan-Promoter-Fragments durch Southern-Blotting getestet. Kurz, die genomische ADN wurde von den Schwänzen von drei Wochen alten Mäusen isoliert und entweder mit der BamHI- oder der PstI-Restriktionsendonuklease verdaut. Die ADN-Fragmente wurden auf einem Gel separiert und dann auf eine Nylon-Membran transferiert. Die Membranen wurden mit einem 1,3 BPBamHI-EcoRV-Fragment des menschlichen Versican-Transgens hybridisiert, das benutzt wurde, um die transgenen Mäuse zu erzeugen. Sieben unabhängige Linien zeigten Transgeninsertion mit Hilfe der Southern-Analyse. Die Anzahl der Kopien des Transgens variierte von einem bis mehr als zehn.
BEISPIEL 3: β-GALAKTOSIDASE-HISTOCHEMIE
Aus verschiedenen Phasen (von E11.5d bis E17.5d) der Entwicklung gesammelte Mäusembryos wurden mit 0,5% Glutaraldehyd in PBS während 30 Minuten bis 12 Stunden in Abhängigkeit von der Embryophase fixiert, in 30%ige Saccharose transferiert, und dann in einer OCT (Tissue Tek, CA)-Verbindung eingefroren. Es wurden 15μm dicke Schnitte präpariert und auf Objektträgern aufgebracht. Die Schnitte wurden wieder in demselben Fixiermittel während 5 Minuten fixiert und einmal mit PBS gewaschen, worauf eine Waschung mit einer Detergenz-Waschlösung während 10 Minuten folgte. Die Färbung wurde im Reaktionspuffer ausgeführt, der 1mg/ml X-gal (Sigma), 10mM Ferrocyanid und 10mM Ferricyanid enthielt. Die Inkubation wurde während 3 bis 6 Stunden bei 37°C ausgeführt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte entweder befestigt oder mit Eosin gegengefärbt. Für erwachsenes Gewebe wurden die Mäuse mit demselben Fixiermittel durchschwemmt und die gewünschten Organe wurde seziert und postfixiert, mit Saccharose durchschwemmt und dann mit der OCT-Verbindung eingefroren. Von dem Hautgewebe wurden 5mm Streifen des Hinterhaut-Gewebeblocks während 15 Minuten bis 1 Stunde fixiert und mit X-Gal während 3 bis 6 Stunden gefärbt, wie es oben beschrieben ist. Nach dem Waschen wurden die Hautgewebestreifen in Paraffin eingebettet und in 8μm-Schnitte unter Benutzung eines Mikrotoms geschnitten.
BEISPIEL 4: IN SITU-HYBRIDISIERUNG
Eine radioaktive in situ-Hybridisierung mit 3'-Ende-markierten Oligonucleotid-Sonden wurden unter Benutzung von Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt waren durchgeführt. Die Spezifizität des in situ-Signals wurde durch die Hybridisierung einiger Schnitte mit markierten Oligonucleotiden in Gegenwart eines Überschusses von unmarkierten Oligonucleotiden getestet.
Das Expressionsmuster des Transgens wurde durch in situ-Hybridisierung der transgenen embryonischen Schnitte (E13.5) unter Benutzung von LacZ und endogener Maus-Versican-Sonden überprüft. Unter Benutzung jeder Sonde wurde die Expression in den sich entwickelnden Enden der Gliedmassen, der Niere, dem Gehirn und dem Knorpel beobachtet. Die LacZ-Expression wurde auch durch die β-Galaktosidase Histochemie in E13.5-, E15.5-, E17.5-Embryos durch Schnitte von neugeborenen bis 7 Tage, 40 Tage und 4 Monate (erwachsen) alte transgenen Mäusen überprüft. Starke mesenchymale Expression wurde bei Nieren, Gehirn, Knorpel und Enden von Gliedmassen so früh wie E13.5d beobachtet. Das Niveau der Expression blieb bis zur Geburt konstant. Bei 7 Tage alten Mäusen nahm die β-Galaktosidase-Färbung verglichen mit embryonischem Gewebe ab und es wurde fast keine Expression in erwachsenem Gewebe beobachtet. Im Gegensatz zu anderem Gewebe zeigte dermale Papilla (anagener Haarzyklus) von 30 Tage alten Mäusen wieder eine intensive β-Galaktosidase-Färbung und fuhr fort, dasselbe β-Galaktosidase-Niveau während des zweiten Harrzyklus zu exprimieren.
Im Hautgewebe exprimierten die Haarenden (zukünftige dermale Papilla in Haarfollikeln) eine starke Galaktosidase-Aktivität bei E15.5d und fuhr so bis 7 Tage nach der Geburt fort (während des ersten Haarzyklus). Eine gelegentliche β-Galaktosidase-Färbung in dermalen Fibroblasten wurde auch bei der Haut von E15.5d-Neugeborenen beobachtet. Die β-Galaktosidase-Färbung wurde jedoch bei 7 Tage altem Hautgewebe gesenkt.
BEISPIEL 5: UV-BESTRAHLUNG
Die Bestrahlung mit UVA wurde unter Benutzung eines eng beabstandeten Arrays von fünf PUVA-Lampen ausgeführt. Der Energie-Ausgang bei 30cm vom Array wurde mit einen UVA-Detektor gemessen.
4 Tage alte transgene Versican-Mäuse werden auf der Hinterhaut mit 30J/cm² UVA bestrahlt. Biopsieproben von Gewebe der Hinterhaut wurden 24 Stunden später für eine β-Galactosidase-Färbung behandelt und mit unbehandelter Kontrollhaut von transgenen Mäusen verglichen. Die β-Galactosidase-Biochemie zeigte eine stärkere β-Galactosidase-Färbung auf der oberen Dermis der mit UVA bestrahlten Haut verglichen mit der Kontrolle.
BEISPIEL 6: TRANSGENE MÄUSE VEGF-GFP
Um in vivo die Regulationsmechanismen der menschlichen VEGF-Genexpression aufzuklären, sind transgene Mäuse, die ein GFP-Reporterkonstrukt enthalten, das von einem 3kbp-Fragment der Promoterregion des menschlichen VEGF gesteuert worden sind, präpariert worden (siehe 2). Die Funktionalität dieses Konstrukts wurde in vitro durch Transfektions-Assays in kultivierten menschlichen Keratinozyten bestätigt. Es wurden drei unabhängige transgene Linien für VEGF-GFP erhalten und durch eine PCR-Analyse bestätigt. Um die konstitutive endotheliale Expression und die Keratinozyten induzierbare VEGF-Expression in verwundeter Haut zu überprüfen, wurden 2mm Haut-Ausstanzungen in der Hinterhaut ausgeführt und nach 48 Stunden wurden Biopsieproben kollektiert. Die Gewebe wurden sofort mit 4%igem Paraformadehyd fixiert und Cryostat-Schnitte wurden durch Fluoreszenz- und konfokale Mikroskopie examiniert. Transgene VEGF-GFP-Linien zeigten eine helle GFP-Fluoreszenz in neuen mikrovaskularen Netzen unter der Epidermis und der oberen Dermis und gelegentlich in der tieferen Dermis. Haarfollikel zeigten in einigen Geweben auch positive Ergebnisse. In verwundetem Gewebe wurde eine kontinuierliche GFP-Expression am verwundeten Rand der Epidermis beobachtet, aber es war keine Keratinozyten-Expression in nicht verwundeten Regionen zu sehen, was die Induzierbarkeit der VEGF-Expression in heilenden Wunden bestätigte. Nach 3 Tagen in der Kultur zeigten aus transgenen VEGF-GFP-Linien hergestellte Primäre Keratinozyten-Kulturen Fluoreszenz. Wenn man diese Ergebnisse zusammen nimmt, zeigen diese, dass GFP ein potentiell nützliches Werkzeug ist, um die VEGF-Expression in vitro und in vivo zu examinieren. Diese Arbeit wird ausführlicher weiter unten beschrieben.
Vom Promoter des menschlichen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors bei transgenen Mäusen gesteuerte dynamische Wechsel in der Expression des GFP wurden folgendermaßen analysiert.
Die Genexpression untersucht bei der Benutzung von transgenen Mäusen oft einen von drei klassischen Reportergenen: LacZ (β-Galactosidase), Luziferase oder CAT (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase). Die Erfassung der Reportergenaktivität erfordert, dass das Gewebe vom Tier für die histochemische Färbung im Fall von LacZ, oder für komplizierte Assays für Luziferase und CAT entfernt wird, wodurch die Möglichkeit einen Wechsel in der Genregulation bei dem lebenden Tier zu sehen eliminiert oder zumindest kompliziert wird.
Seit kurzem sind ein alternatives fluoreszierendes Reportermolekül, ein GFP (Chalfee M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW und Prasher DC: Grün fluoreszierendes Protein als Marker für die Genexpression. Science 263:802-5, 1994) oder modifizierte GFP (EGFP), (Zhang G. Gurtu V und Kain SR: Ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein erlaubt die empfindliche Erfassung des Gentransfers in Säugetierzellen. Biochem Biophys Res Commun 227:707-11, 1996) entwickelt worden. Da GFP inhärent fluoresziert, ist das Signal ohne Verarbeitung sichtbar. (Mistelli T und Spector DL: Anwendungen des grün fluoreszierenden Proteins in der Zellbiologie und der Biotechnologie. Nat Biotechnol 15:961-4, 1997). Wenn GFP in die Epidermis induziert ist, ist es möglich, Änderungen in der Genexpression zu beobachten ohne dass die Tieren zur Benutzung in einem konfokalen Laser-Mikroskop geopfert werden. Der Promoter des menschlichen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), was ein angiogener Faktor ist, der in vivo eine Angiogenese und eine vaskuläre Permeabilität bei malignem Tumorgewebe erzeugt, wird hier benutzt, um GFP als ein Reportergen in der Haut von transgenen Mäusen zu exprimieren. Es wurde gezeigt, dass die Expression von VEGF in epidermischen Keratinozyten am Rand einer heilenden epidermischen Wunde heraufreguliert wird und auch ein topisches Applizieren von Phorbolester wie TPA heraufreguliert wird.
Die Expression und Reaktivität von GTP bei Signaländerungen in der Genaktivität von menschlichem VEGF-GFP bei transgenen Mäusen wird weiter unten gezeigt. Die Expressionsmuster sind im Einklang mit dem des endogenen VEGF und zeigen, dass GFP-derivierte Fluoreszenz unter Benutzung der konfokalen Mikroskopie bei intaktem Gewebe ohne jede Behandlung nach den Exzisionen lokalisiert und visualisiert werden kann
Transgenkonstrukt
Da die PCR-basierte Amplifikation des GC-VEGF-Promoters oft schwierig ist, wurde ein 5.0 kb-Fragment des genomischen VEGF-Klons, der die 5'-flankierende ADN des menschlichen VEGF umfasst, aus der Bibliothek des menschhlichen Genoms (Clontech, CA) isoliert, indem das durch RT-PCR erhaltene 500 bp-cADN-Fragments als Sonde benutzt wird. Der identifizierte Klon wurde durch Restriktionsverdauung analysiert, und dann wurde ein 2453 bp EcoRI-Agel-Fragment (-2271 bis +91) (Tischer E, Mitchell R, Harman T, Silva M, Gospodarowicz D, Fiddes JC und Abraham JA: Das menschliche Gen für den vaskularen endothelialen Wachstumsfaktor. Mehrere Proteinformen werden durch alternatives Exon-Splicing kodiert J. Biol Chem 266:11947-54, 1991) aus dem Agarosegel exidiert. Dieses Promoterfragment wurde in einen GFP-Vektor (pEGFP-1 Schnitt EcoRI und XmaI) eingeführt. Um die Wirksamkeit der Expression zu maximieren, wurden die 16s/19s-Soluce-Donor- und Akzeptorsignale auch zwischen dem Promoter und dem GFP-Gen eingeführt.
In vitro-Expression des GFP-Vektors
Das sich ergebende Transgen im Säugetier-Expressionsvektor wurde zuerst in die kultivierten menschlichen Keratinozyten transfektiert, um zu bestätigen, dass die ausgewählte Genregion die VEGF-Expression gefördert hat. Primäre menschliche Keratinozyten wurden mit dem BEGF-GFP-Vektor oder einem vom CMV-Promoter-gesteuerten GFP-Kontrollvektor (pEGFP-N1; Clontech) transfektiert. Ein Polybren- und DMSO-Verfahren wurde für alle Transfektionen benutzt.
Erzeugung transgener Mäuse
Das linearisierte Fragment für die pronukleare Injektion wurde mit EcoRI und AflII exzidiert, was auch eine Polyadenylation-Signalsequenz umfasst. Das transgene Fragment wurde dann in befruchtete Oozyten von DBA2xC57B16 (DBF1)-Mäusen (Charles River Laborstories, Boston, MA) injiziert und die Eier wurden in pseudoschwangere Pflegemütter eingepflanzt. Die Nachkommenschaft (F0) wurde auf chromosomale Integration des Transgens durch Genom-PCR getestet. Alle Experimente wurden mit F1-oder F2-Nachkommenschaft-Mäusen ausgeführt.
Zur Beobachtung des intakten Hautgewebes durch ein konfokalen Mikroskops wurden transgene VEGF-GFP-Mäuse wurden im haarlosen genetischen Hintergrund durch Reproduktion des primär transgenen Tiers mit haarlosen SKH-1-Mäusen (Charles River Laborstories) erzeugt. So wurden männliche hemizygote Mäuse (v/-HH) mit weiblichen haarlosen Mäusen (-/-hh) gepaart, um die F2-Erzeugung der haarlosen VEGF-GFP-Mäuse (v/-hh) zu erhalten, die leicht durch eine PCR-Erfassung und ihren haarlosen Phänotyp ausgewählt werden können.
Die Gewebepräparierung für die GFP-Erfassung und die epimikroskopischen Beobachtungslösungen wurden ausgewaschen oder wurden durch GFP-derivierte Fluoreszenz vorn Ort der GFP-Expression verbreitet.
Letztlich wurde ein frisch sezierter, unfixierter Gewebeblock direkt in 12μm dicke gefrorene Schnitte unter der Benutzung eines Kryostaten geschnitten. Eine epifluoreszenzmikroskopische Beobachtung wurde unmittelbar nach dem Schneiden ohne Befestigungsmedium oder erweiterte Objektträger-Lagerung unter Benutzung einer doppelten FITC/TRITC-Erregung und eines Chroms-Emissionsfilters ausgeführt, um das GFP-derivierte Fluoreszenz-Signal von der Gewebeautofluoreszenz zu unterscheiden.
Verwundung und TPA-Behandlungsprozedur
Hautwunden wurden mit einem 2mm Biopsiestanzen auf der rasierten Hinterhaut von jungen erwachsenen transgenen 4 bis 6 Wochen alten Mäusen hergestellt. Nach 48 Stunden wurden normale und verwundete Gewebe kollektiert und unmittelbar auf trockenem Eis eingefroren.
Zur Induzierung von VEGF mARN durch TPA wurde eine einzige Dosis von 5μg TPA in Aceton topisch auf die Hinterhaut von transgenen Mäusen aufgetragen und Hautbiopsie-Proben wurden nach 12 Stunden kollektiert.
Alle Tierprozeduren wurden von der „MGH Animal Care and Use Committee" zugelassen.
Anti-VEGF und Anti-GFP-Immunohistochemie
Cryostat-Schnitte von der Haut transgener Mäuse wurden mit 4%igem Paraformaldehyd in PBS (pH7.2) bei Raumtemperatur während 5 Minuten fixiert. Es wurde eine immunohistochemische Färbung auf Objektträgerbefestigungs-Schnitten unter Benutzung des ABC-Verfahrens, wie es vom Hersteller (Vector Labs UK) beschrieben wird durchgeführt und unter Benutzung von DAB als Farbsubstrat durch eine Peroxidasereaktion visualisiert. Anti-GFP-Antiserum wurde von Clontech erworben.
Konfokale Mikroskopie
Für die Beobachtungen mit der konfokalen Mikroskopie wurde ein Deckglas direkt auf dem Gewebe platziert. Schnitte oder intakte Hautproben wurden unter Benutzung des konfokalen Leica-Mikroskopsystems TCS NT4D mit einem Bandpassfilter 530/30nm analysiert, wobei die Emission bei Wellenlängen zwischen 515 und 545 nm detektiert wurde. Um die Kerne zu visualisieren, wurden die Schnitte mit 5μg/ml 7-Aminoactinomycin D (Sigma, USA)-Lösung während 20 Minuten bei Raumtemperatur gegengefärbt, mit PBS gewaschen und mit Fluoromount-G (Southern Biotechnologie, AL) befestigt.
Durch einen VEGF-Promoter gesteuerte GFP-Expression in humanden Keratinozyten
Da die Region der funktionellen Promoteraktivität für endogene VEGF nicht gut gekennzeichnet war, wurden 2,5kb der 5'-flankierenden ADN des menschlichen VEGF zuerst in einen GFP-Säugetier-Vektor eingeführt und in transfektierten menschlichen primären Keratinozyten-Kulturen kontrolliert. Kontrollkulturen wurden mit einem durch einen CMV-Promoter gesteuerten GFP-Vektor transfektiert, 48 Stunden nach der Transfektion war die VEGF-GFP-Fluoreszenz das erste Mal und nur in einem kleinen Prozentsatz der Zellen zu sehen. Die CMV-GFP-Fluoreszenz war während 24 Stunden sichtbar und fast alle Zellen waren positiv. Die Intensität des VEGF-GFP-Signals war ähnlich wie die der CMV-GFP-Kontrolle, wodurch bestätigt wurde, dass dieses Konstrukt funktionell im in vitro-Kultursystem ist. 48 Stunden nach der Transfektion wurde Fluoreszenz in kultivierten mit durch Cytomegalovirus-Immediate-Early-Promoter gesteuerte menschliche (CMV) GFP als positive Kontrolle und mit VEGF-GFP beobachtet.
Expression von GFP in transgenen Mäusen
Bei 30 primären Mäusen wurden vier für die transgene chromosomale Einführung positive Linien durch die PCR-Analyse detektiert. Drei dieser Linien zeigten verglichen mit den negativen Wildtype-Mäusen ein detektierbares GFP-deriviertes Fluoreszenz-Signal in der Epidermis, wie es durch die Epifluoreszenz-Mikroskopie des Schwanzgewebes nachgewiesen wurde. Die GFP-Expression in einer neugeborenen transgenen Maus (Fluoreszenz) wurde in frischem, unfixierten Gewebe aus dem Schwanz einer transgenen VEGF-GFP-Maus und einem ähnlichen Gewebe von einen negativen Wildtype-Paarungswurf bestimmt. Die Fluoreszenz wurde auch in Geweben bestimmt, die von negativen neugeborenen transgenen VEGF-GFP-Mäusen entnommen wurden: einschließlich Lunge (Fluoreszenz SEEM in Alveolen); seitliche Ventrikel des Gehirns (Fluoreszenz wurde im lateralen Epithelium beobachtet); und Wirbelknorpel; (Herzepithelium). Das Expressionsmuster des VEGF-Promoters wurde in neugeborenen F1-Jungtieren dieser drei Linien ausgewertet. Die Lunge, Niere und das Gehirn, die vorher gezeigt worden sind, um VEGF durch in situ-Hybridisierungsstudien zu exprimieren, wurden ausgewählt, um die GFP-Fluoreszenz zu examinieren. Wie erwartet wurde GFP-Expression in Lungenalveolen und in der lateralen Ventrikelwand im Gehirn beobachtet. Es war schwierig, ein GFP-Signal im Flomerulus der Niere zu erfassen. GFP-Fluoreszenz war auch in den Chondrozyten von sich entwickelndem Knorpelgewebe (z.B. Wirbelknorpel) detektierbar.
GFP wird am Rand von heilenden Wunden exprimiert
Da die nicht stimulierte normale epidermale Keratinozyten nur eine schwache Fluoreszenz zeigten, testeten wir die Induzierbarkeit von VEGF-gesteuerte GFP während der Wundenheilung. 48 Stunden nach der Entnahme der Hautbiopsie zeigte die Epidermis der heilenden Wunde unter der Kruste ein sehr starkes und eindeutiges Fluoreszenz-Signal verglichen mit der angrenzenden unverwundeten Epidermis. Dieses Fluoreszenz-Signal korrelierte mit der durch die Anti-GFP und Anti-VEGF-Immunochemie in angrenzenden Schnitten detektierten VEGF / GFP-Expression. Durch Wundenheilung der Haut induzierte Genexpression (Transgene VEGF-GFP-Mäuse wurden durch Stanz-Biopsie verwundet. Es wurde Gewebe der Wunde für die Auswertung durch die Fluoreszenz-Mikroskopie genommen. (a) 48 Stunden nach der Biopsie wurde am heilenden Wundenrand eine starke Fluoreszenz im Epithel unter dem Schorf beobachtet. (b) Ein angrenzender Schnitt wurde mit Anti-GFP-Antikörpern zur Reaktion gebracht. (c) Ein angrenzender Schnitt wurde mit Antimaus-VAGF-Antikörpern immungefärbt. Ein Kontrollschnitt wurde mit normalem Gänzeserum behandelt. Nichtspezifische, in dem Schorf beobachtete Peroxidase-Färbung ist auch bei b und c zu sehen.)
Induktion von GFP durch TPA-Behandlung
Induktion von epidermaler GFP durch Aufragen von Phorbolester wurde auch examiniert. 12 Stunden nachdem TPA auf die transgene Haut aufgetragen war, wurde eine Summierung eines Fluoreszenzsignals beobachtet, wähend Acetone alleine nur basale Niveaus von GFP-Expression zeigte. Dieses Signal schien auf der basoplateralen Oberfläche des Epitheliums eher als im Cytosol oder dem Kern des Keratinozyten gelegen zu sein. Die Anti-GFP-Immunfärbung produzierte ein Signal im basalen Zellcytosol, wodurch angegeben wurde, dass GFP seinen Ursprung in den Basalzellen hatte, und mindestens ein Teil des GFP-Proteins blieb in der Zelle.
Direkte Erfassung von GFP durch konfokale Mikroskopie
Um das GFP-Fluoreszenzsignal genauer zu lokalisieren, wurden frische Cryostat-Schnitte fixiert und mit 7-AAD für die Kerngegenfärbung inkubiert und unter einem konfokalen Laser-Mikroskop examiniert. Wie erwartet wurde das meiste diffusierbare GFP während der Prozedur verloren obwohl wundheilungsinduzierte epidermische Expression unbeeinflusst blieb. Gelegentliche Fluoreszenz war in der unverwundeten Epidermis detektierbar, wobei die Fluoreszenz auftrat, um die äußeren Basalzellen zu lokalisieren wie es beobachtet wurde. Sogar nach der Fixierung und intensivem Waschen blieb die GFP-derivierte Fluoreszenz in der äußeren Wurzelhülle des Haarfollikels unverändert. Bei einer stärkeren Vergrößerung der Haarfollikel kann gesehen werden, dass das GFP-Fluoreszenzsignal vollständig mit einem Kernmarker colokalisiert war, wodurch angegeben wurde, dass das Haarfollikel-GFP im Kern stabil bleibt. Das war auch der Fall für die Chondrocyten im Wirbelknorpel.
Die direkte Erfassung von GFP in der Epidermis von intakter Haut durch konfokale Mikroskopie
Um die Möglichkeit zu testen ob GFP in der Haut einer transgenen GFP-Maus detektiert werden kann, wurde sezierte haarlose Haut direkt durch eine konfokale Aufnahme examiniert. Horizontale optische Schnitte der lebenden Epidermis offenbarten eine helle Fluoreszenz. Äquivalente Cryostat-Schnitte zeigten, dass diese Fluoreszenz von den Basalzellen abgeleitet ist. Eine stärkere Vergrößerung offenbarte, dass GFP im extrazellulären Raum um die Keratinozyten lokalisiert war. Eine konfokale X-Z-Aufnahme bestätigte, dass dieses Signal in der Basalschicht der Epidermis lag. Die Erfassung der GFP-Expression in der intakten Haut durch konfokale Mikroskopie. Frische, unfixierte transgene Maushaut wurde biopsiert und unmittelbar durch ein konfokales Laserscan-Mikroskop untersucht. Horizontale optische Schnitte der Epidermis zeigen Fluoreszenz um die individuellen Epithelzellen. Cryostat-Schnitte einer äquivalenten Hautregion, die mit 7-AAD gegengefärbt war, um die Kerne anzugeben, zeigte Fluoreszenz an der dermal-epidermalen Verbindung. Das konfokale X-Z-Bild gibt die Fluoreszenz nahe den basalen Keratinozyten an.
Diese Arbeit zeigt, dass das Expressionsmuster von einen durch einen menschlichen VEGF-Promoter gesteuertes GFP räumlich und zeitlich äquivalent zu dem der in der mARN-Erfassung zu sehenden war.
Es wurden Jungtiere von der Reproduktionen von transgenen Mäusen die GFP in der Hautepidermis exprimieren, leicht durch einfache Epifluoreszenzmikroskopie ohne die mühsameren Prozeduren des Southern Blotting oder die genomische PCR ausgewählt.
Es gab eine anfägliche Schwierigkeit, die GFP-derivierte Fluoreszenz in den Schnitten zu erfassen, sogar wenn frische unbehandelte Gewebeblöcke Fluoreszenz aussendeten. Nach dem Testen einer Vielzahl von Prozeduren wurde gefunden, dass eine Behandlung mit wässriger Lösung unmittelbar die GFP-Fluoreszenz auswusch. Das wurde teilweise überwunden, indem der Gewebeblock vor dem Cryostatschnitt fixiert wurde, obwohl die Fluoreszenz an einigen Orten wie dem der anfänglich in epidermalen Keratinozyten anwesenden verloren ging oder das Färbungsmuster verändert war. Die fixationsinduzierte Fluoreszenz war nicht zu unterscheiden von der, die von der GFP in der Haut-Mikrovasculatir produziert wurde. Die Fluoreszenz an diesem Ort war nicht in unfixiertem Gewebe zu sehen und die VEGF-Expression wurde in den Untersuchungen nicht für die Mikrovasculatur gefunden, die in situ-Hybridisierungsverfahren benutzten. So besteht das wirksamste Verfahren, das ursprüngliche GFP-Signal zu erhalten, darin, ummittelbar den Schnitt der frisch sezierten Haut ohne OCT-Verbindung im Kryostaten anzuordnen und ihn dann sofort mit Hilfe der Fluoreszenz-Mikroskopie zu untersuchen. Diese unerwartete Schwierigkeit kann erklären, warum es bis jetzt so wenige Berichte über erfolgreiche transgene GFP-Mäuse gibt.
Es wurde über eine bedeutende VEGF-Expression in der Lunge und in der lateralen Ventrikel des Gehirns durch in situ-Hybridisierung berichtet. Die Auswertung der Gewebe der VRGF-GFP-Mäuse bestätigt diese Ergebnisse. Der Fehlschlag dass die Nieren-Glomerie zum Fluoreszieren zu bringen, kann auf das Fehlen eines gewebespezifischen Reaktionselements der 2.2 kb der 5'-flankierenden Region der VEGF-ADN, die hier zur Erzeugung dieser transgenen Mäuse benutzt wurde, oder auf ein Signal, das unter der Erfassungsschwelle lag, zurückzuführen sein.
Die von 1 Woche alten Jungtieren zeigten normale epidermale Keratozyten Basalniveaus der GFP-Expression, während eine helle Fluoreszenz in der äußeren Wurzelhülle des Haarfollikels beobachtet wurde. Die Haut älterer Mäuse zeigte keine äquivalente GFP-Expression in Haarfollikeln und deshalb kann die VEGF-Expression in den Follikeln vom Haarzyklus abhängig sein. Fluoreszenz in der Haarfollikel und in den Chondrozyten, wie sie im Wirbel zu sehen ist und über die kürzlich berichtet worden ist war besonders beeindruckend. Diese Signale waren sogar stärker als die bei der Lunge oder dem Gehirn beobachteten konfokalen Laserbeobachtungen und offenbarten, dass GFP an diesen Orten auf die Kerne begrenzt ist. Diese Kernlokalisierung kann das deutliche Signal verstärken, da die Kernlokalisierung dazu geeignet ist, die Diffusion des Fluoreszenzprodukts während der Gewebeverarbeitung zu reduzieren. Der Grund für die Lokalisierung auf die Kerne von einigen Geweben und nicht bei anderen bleibt unerklärlich, aber legt nahe, dass die Inklusion einer Konsensussequenz der Kernlokalisierung mit dem Transgen nützlich sein kann.
Die Induzierbarkeit des GFP-Proteins während des Wundheilungsmodells und nach der TPA-Behandlung wird hierin gezeigt, wobei bestätigt wird, dass das Reporter-GFP-Expressionsmuster sehr stark von dem VEGF-Promoter abhängt. Diese Daten beseitigten auch die Zweifel an einer möglichen Verzögerung der Fluoreszenzsignalproduktion wegen der langsamen Chromophorenbildung wie es für die Drosophila-Embryos beschrieben worden ist. (Davis I, Girdham CH, O'Farrell PH „Eine nukleare GFP die Kerne in lebenden Drosophila-Embryos markiert; eine mütterliche Ernährung überwindet eine Verzögerung im Auftreten von zygotischer Fluoreszenz „Dev. Biol. 170:726-9(1995)). Als Antizipierung dieser Schwierigkeit wurde die rotverschobene Variante von GFP für diese Studien ausgewählt und die korrekte Faltung des Chromophoren scheint in der Haut ebenso wie in tiefer liegenden Geweben aufzutreten. Es wurde auch in Anbetracht gezogen, dass GFP eine längere Halbwertzeit in der Haut hat, was mit der Fähigkeit interferiert, den Reporter zu benutzen, um die langfristige Genexpression zu kontrollieren. Das Verschwinden der Fluoreszenz in Haarfollikeln der Haut von älteren transgenen Mäusen gibt an, dass das GFP-Protein eine angemessene Halbwertzeit hat.
Die Auswertung der konfokalen Lasermikroskopie der intakten Haut für die Erfassung des GFP-Signals gibt an, dass GFP leicht in der Epidermis zu erfassen ist. Diese Ergebnisse legen die potentielle Benutzung von transgenen GFP-Mäusen für die nicht invasive Überwachung von langfristiger Genexpression in vivo nahe. Die Technologie für die mikroskopische Auswertung der Haut von lebenden Mäusen wird schon benutzt. Wenn das mit der Benutzung von transgenen GFP-Reportergenen kombiniert wird, hat das System einen großen Vorteil gegenüber konventionellen Verfahren mit transgenen Reportergentieren, da es die Anzahl von benutzten Tieren reduziert, ein einfaches Kontrollsystelm benutzt und eine Langzeitüberwachung von Änderungen in der Genexpression am selben Individuum ermöglicht. Unser Erfolg bei der in vivo Expression von GFP in der Haut transgener Tiere sollte das Verständnis der VEGF-Genexpression in der Haut erleichtern, indem eine nützliche Überwachung und ein nützliches Screening-Tool bereitgestellt werden. Die Benutzung ist besonders attraktiv für die Einpflanzung in eine Maus mit einem Phänotyp, der eine VEGF-Expression mit sich bringen soll. Dieses Modell ist auch vorteilhaft für die Forschung, die sich auf Hauthomeostasen während des Alterungsprozesses konzentriert.
BEISPIEL 7: ENTWICKLUNGS- UND ALTERSBEZOGENE ÄNDERUNGEN DER AKTIVITÄT DES MENSCHLICHEN VERSICAN-PROMOTERS IN DER HAUT TRANSGENER MÄUSE UND IN DERMALEN PAPILLEN VON HAAREN
Um das zeitliche und räumliche Expressionsmuster für den menschlichen Versican insbesondere in dem Hautgewebe weiter zu untersuchen, wurden transgene Mäuse erzeugt, die ein LacZ-Reporter-Konstrukt enthalten, das vom funktionellen Promoter für das Kernprotein des menschlichen Versican gesteuert wird und es wurden Gewebeschnitte von transgenen Mäusen von Embryos, Neugeborenen bis Erwachsenen mit Hilfe der Beta-Galaktosidase-Histochemie untersucht.
Konstruktion des Transgens
Das 839bp-Fragment des funktionellen menschlichen Versicanpromoters (von -559 bis +280 je nach dem Transkriptionsstartort mit +1) einschließlich dem Exon 1; (Naso MF, Zimmermann DR und Iozzo RV, „Kennzeichnung der kompletten Genomstruktur des menschlichen Versicangens und funktionelle Analyse seines Promoters", J. Biol. Chem. 269:32999-3008 (1994)) wurde aus dem menschlichen genomischen ADN durch PCR-basierte Technik erhalten und die korrekten Sequenzen wurde durch Direktsequenzierung bestätigt. Der pNASS2β-Vektor (Clontech) wurde als Quelle eines β-Galaktosidase-Reportergens (IacZ) mit einem Polyadenylation-Signal benutzt. Dieser Vektor umfasste auch eine ARN-Splice-Donor- oder Akzeptorsequenz um die Möglichkeit zu verbessern, ein hohes Transgenexpressionsniveau zu erreichen. Das Versican-Promoter-Fragment wurde vor der Slice Donor- /Akzeptorsequenz unter Benutzung des Xhol-EcoRI-Restriktionsorts eingeführt. Es wurde eine linearisierte transgene ADN für eine pronukleare Injektion als EcoRI-Xbal-4732bp-Fragment erhalten.
Erzeugung von transgenen Mäusen
Das linearisierte Konstrukt wurde in befruchtete Oozyten von DBA2xC57BL6(DBF1)-Mäusen (Charles River, Boston) injiziert und die Eier wurden in pseudoschwangere Pflegemütter eingepflanzt. Die Nachkommenschaft (F0) wurde auf die Chromosomenintegration des menschlichen Versicanpromoter-Konstrukts durch Souther Hybridisierung getestet. So wurde genomische ADN aus den Schwänzen von 3 Wochen alten Mäuse isoliert und entweder durch BamHI- oder PstI-Restriktionsendonuklease verdaut. Das fraktionierte ADN-Fragment auf den Nylonmembranen, das mit dem 1,3kbp BamHI-EcoRV-Fragment des menschlichen Versican-Transgens hybridisiert wurde, wurde benutzt, um die transgenen Mäuse zu erzeugen. Sieben unabhängige Linien zeigen die transgene Insertion durch die Southern Analyse mit einer unterschiedlichen Anzahl von Kopien mit einer einzigen Insertion bis zu mehr als zehn.
B-Galaktosidase-Histochemie
Aus der frühen bis mittleren Entwicklungsphase (von E11.5d bis E15.5d) kollektierte Mäuseembryos wurden während 30 Minuten bis 15 Stunden in Anhängigkeit von der Phase mit 0,5%igem Glutaraldehyd in PBS fixiert und in 30%ige Saccharose transferiert und dann in einer OCT-Verbindung eingefroren. Die Schnitte wurde in einer Dicke von 15 μm geschnitten und auf Objektträger aufgebracht. Die Schnitte wurden wieder in demselben Fixiermittel während 5 Minuten und einmal mit PBS fixiert, worauf eine Waschung in einer Detergenzienlösung während 10 Minuten folgte. Die Färbungsreaktion wurde in einem Reaktionspuffer, der 1mg/ml X-gal (Sigma), 10mM Ferrocyanid und 10mM Ferricyanid enthielt, ausgeführt. Die Inkubierung wurde während 3 bis 6 Stunden bei 37°C ausgeführt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte entweder befestigt oder mit Eosin gegengefärbt. Für das alte Gewebe wurden die Mäuse mit demselben Fixiermittel durchschwemmt und die gewünschten Organe wurde seziert und postfixiert, mit Saccharose überschwemmt und dann mit einer OCT-Verbindung eingefroren. Um eine bessere Morphologie beizubehalten, wurden die Embryos der ersten bis mittleren Phase (von E11.5d bis E15.5d) für einen Parafinschnitt behandelt. Für das Hautgewebe wurden 5mm Streifen eines Hinterhautgewebeblocks während 15 Minuten bis 1 Stunde fixiert und es wurde eine Färbung mit X-gal während 3 bis 6 Stunden ausgeführt. Nach dem Waschen wurden die Schnitte für eine Paraffineinbettung behandelt und es wurde ein 8μm-Schnitt mit einem Mikrotom ausgeführt.
In situ-Hybridisierung
Die Embryogewebe wurden für eine in situ-Hybridisierung mit frisch hergestelltem 4%igen Paraformaldehyd in DEPC behandeltem PBS fixiert, dehydratisiert und nach einem standardisierten Einbettungsprotokoll mit Paraffin unter ARNase-freien Bedingungen behandelt. Es wurde eine mit Digoxigenin markierte nicht radioaktive in situ-Hybridisierung auf 8μm Paraffinschnitten des E13.5d-Embryos durchgeführt, wie es vorher beschrieben worden ist (Kishimoto J, Cox H, Derverne EB und Emson PC „Zelluläre Lokalisierung von putativ duftenden Rezeptormessanger-ARNs in olfaktorischen und chemosensorische Neuronen-Eine nicht radioaktive in situ-Hybridisierungsstudie „Molekular Brain Research 23:33-39 (1994)). Es wurde CDNA für LacZ und eine Mäuseantisense-Versican-Sonde durch PCR hergestellt und in pBluesriptII(Stratagen) subkloniert. Es wurden mit Digoxigenin markierte ARN-Sonden unter Benutzung eines ARN-Markierungs-Kits (Boehringer) nach den Vorschriften des Herstellers hergestellt. Die Paraffinschnitte auf den Objektträgern wurden schnell in Xylen entwachst, durch 100%iges, 90%iges 70%iges Ethanol dehydratisiert, mit 0,1M PBS (pH7,5) gewaschen und dann mit 0,2N Salzsäure während 10 Minuten behandelt. Die Schnitte wurden mit 0,02%igem Pepsin (in 0,2N HCL) während 30 Minuten bei 37°C behandelt, wonach das Enzym durch 4%iges Paraformaldehyd entaktiviert wurde. Nach dem dreimaligen Spülen in 0,2%iger Glycinlösung (in PBS) wurden die Objektträger in 0,25%igem Essigsäureanhydrid in 0,1M Triethanolamin/0,9%igem NaCl während 10 Minuten bei Raumtemperatur azetyliert und teilweise mit 100%iges, 90%iges 70%iges Ethanol dehydratisiert und kurz getrocknet. Es wurden ungefähr 0,1μg/ml mit Digoxigenin markierte ARN-Sonden (vor der Benutzung durch Kochen dehydratisiert ) zum Hybridisierungspuffer (50%iges deionisiertes Formamid, 4 × SSC, 10%iges Dextransulfat), 1X Denhard's Lösung) hinzugefügt und die Objektträger wurden bei 55°C unter Deckgläsern während 16 bis 18 Stunden inkubiert. Die Deckgläser wurden sorgfältig entfernt und die Schnitte wurden während 30 Minuten in 2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur gewaschen und zweimal aufeinanderfolgend in 0,1 × SSC/0,1% SDS während 30 Minuten bei 60°C gewaschen. Die immunhistochemischen Prozeduren zur Visualisierung der hybridisierten Sonden benutzte Alkalinphosphatase nach den Herstellervorschriften. Die kolorimetrische Reaktion begann durch die Zugabe von Nitroblau-Tetrazolium (Boehringer) und 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat (Boehringer) und wurde während 6 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden mit Glyceringelatine befestigt und bei 4°C gehalten.
Eine radioaktive in situ-Hybridisierung mit den am 3' Ende markierten Oligonucleotid-Sonden wurde wie vorher beschrieben ausgeführt (Kishimoto J, Keverne EB, Hardwick J, Emson PC „Lokalisierung von Stickstoffoxyd-Synthase im olfaktorischen und vomeronasalen System von Mäusen: eine histochemische, immunologische und in situ Hybridisierungsstudie" European J of Neuroscience 5:1684-1694(1993)). Die Sequenzen der Mäuse-Versican-Antisense-Oligonucleotid-Sonden waren
5'-CCGTTCTGGGCCACCAAGACAGTCGTCTCC-3',
5'-TGACCGCCCCGATATCCAAACAAGCCTGTT-3'(SEQ ID NO__),
5'-TCCGACAGCCAGCCGTAATCGCATTGGTCA-3'(SEQ ID NO:__). Einige Schnitte wurden mit markierten Oligonucleotiden in Gegenwart eines Überschusses an denselben unmarkierten Oligonucleotiden hybridisiert, um die Spezifizität des in situ-Signals zu prüfen.
Zellkultur
Für eine primäre Fibroblasten-Kultur von der Haut transgener Mäuse wurde die Haut transgener Mäuse abgepellt und in 0,25%igel Trypsin während 18 Stunden inkubiert. Alte epidermale Haut und Dermis wurden außerdem durch Collagenase während 1 Sunde verdaut. Die Zellen wurden im MEDM-Milieu verteilt (GIBC) und 10% FCS-Zellen wurden alle drei Tage später einer Trypsin-Behandlung unterzogen. Für die B-Galaktosidase-Histochemie wurden gezüchtete Fibroblast-Zellen während 2 Minuten mit 0,2%igem Glutaraldehyd in PBS fixiert, und darauf während 5 Minuten in einer Deterenzien-Waschlösung gewaschen und es wurde anschließend eine Färbungsreaktion bei 30°C während 18 Stunden ausgeführt. Nach der Reaktion wurden die Zellen einer Zellkerngegenfärbung in einer 5μg/ml 7-Aminoactinomycin D Lösung (SIGMA, USA) während 20 Minuten bei Raumtemperatur unterzogen und dann mit PBS gewaschen und mit Fluoromount-G (Southern Biotechnology, AL) befestigt.
Erzeugung haarloser Versican-LacZ-transgener Mäuse
Um die von den Haarfollikeln derivierte LacZ-Expression zu entfernen, um eine altersbedingte Änderung der Versican-Promoter-Aktivität zu prüfen, wurde der haarlose genetische Hintergrund der transgenen Versican-LacZ-Mäuse erhalten, indem primäre haarlose SKH Mäuse mit SKH-1 (Charles River, Boston) reproduziert wurden. So wurden männliche hemizygote Mäuse (v/-HH) mit weiblichen haarlosen Mäusen (-/-hh) gepaart und durch genomische PCR ausgewählte positive Jungtiere (v/Hh) wurden dann in haarlose Mäuse zurückgepaart, um die F2-Generierung der haarlosen Versican-LacZ-Mäuse (v/-hh) zu erhalten, die leicht durch eine PCR-Erfassung und ihren haarlosen Phänotyp ausgewählt werden können.
Erzeugung von transgenen Versican-LacZ-Mäusen
Es wurden durch PCR und Souther Blotting Analyse sechs positive Linien aus einer Gesamtheit von 27 primären Mäusen für die transgene Insertion erfasst. Die Anzahl der Transgenkopien belief sich auf 1 bis mehr als 20 Kopien pro Zelle. Diese wurden durch die Benutzung der histochemischen X-gal-Reaktion auf der Schwanzhaut nach einer LacZ-Färbung ausgescreent. Die Intensität der LacZ-Färbung am Schwanz korrelierte nicht mit der Kopienanzahl der Transgene für beide Linien. A4681 (1 bis 2 Kopien) und A4688 (über 20 Kopien) zeigten eine ähnlich starke LacZ-Färbung in den Schwanzhaaren, wobei A4679, die ebenfalls mehr als 20 Kopien aufwies, eine schwache Färbung im Schwanz aufwies. Die transgene Linie A4681 wurde für eine weitere Studie ausgewählt, da die Färbung der Schwanzhaut am intensivsten war und ein guten Reproduktionsverhalten aufwies. Alle weiteren Analysen wurden an der F1-F3-Nachkommenschaft ausgeführt, die durch Paarung mit dem DBA/2-Stamm abgeleitet wurde.
Verteilung der LacZ-Expression in Embryogewebe
Es wurde eine intensive LacZ-Färbung bei der Entwicklung der Vorder- und Hintergliedmassen (E13.5) in einem Bereich der mesenchymalen Kondensation und auch im Ektoderm beobachtet. Die ektodermale Expression war an den Enden der Gliedmassen vermindert. Eine in situ-Hybridisierung mit radiomarkierten Antisense-Oligonucleotiden zeigte eine ähnliche endogene Mäuse-Versican-mARN-Expression im kondensierten Mesenchym in den Enden der Gliedmassen.
Es wurde auch eine starke LacZ-Färbung bei E13.5-Embryos im Mesenchym der Glomerulen der Nieren, im olfaktorischen Epithelium, im Mesenchym und den Muskeln der Zunge, und der submandibularen Drüse beobachtet. Auch die den Perichondrozyten umgebenden Knorpel, die Blutgefässe, der sich entwickelnde Rand des hinteren und vorderen Gehirns und die glatten Muskeln waren positiv.
Das erwartete Expressionsmuster außer den Gliedmassen wurde durch die nicht radioaktiv mit Dioxigenin markierte in situ Hybridisierung mit LacZ und die endogenen Versicanmaus-Sonden an transgenen Embryonschnitten (E13.5) ebenso wie durch Kontrollsensesonden bestätigt. Die mARN-Expression wurde in der Niere, dem olfaktorischen Epithelium, den Oberarmknochenknorpel, und den Wirbelknorpeln beobachtet, wodurch das sinnvolle Expressionsmuster und das Expressionstiming dieser trangenen Mäuse bestätigt wurde.
Menschliche Versican-Aktivität in der Embryohaut
Die LacZ-Expression wurde durch X-gal-Histochemie auf sich entwickelnder Haut von E13.5, E14.5, E15.5 und E17.5-Embryos untersucht. Bei E13.5d wurde im Prinzip keine Färbung auf dem Körper des Ektoderms außer auf den Vorder- und Hintergliedmassen beobachtet und es wurde nur in wenigen Fällen Spuren von LacZ-Färbung in einzelnen Mesenchymzellen gefunden, was die früheste Phase der Kondensation zu sein schien. Der Haarkeim des Barthaars zeigte schon in dieser Phase eine Färbung. Bei E14.5 kondensierte Mesenchymzellen, die unter der ektodermalen Plakode (Haarpfropfen) befestigt waren, waren deutlich positiv und das stand in starker Kontrast gegenüber der vollständig negativen in der Umgebung verstreuten Mesenchymzellen. Die Anzahl dieser positiven Orte belief sich auf 4 bis 5 pro mittlerem sagitalem-Embryoschnitt des gesamten Embryogewebes. Bei E15.5 wurde dieses positiv kondensierte Mesenchym unter dem Haarpfropf intensiver und nahm an Volumen zu (d.h. Anzahl der Zellen). Bei E17.5 nahm die Anzahl und Intensität der positiven dermalen LacZ Papilla stark zu. Eine paar epidermale Plakoden (d.h. epitheliale Keratinozyten) selbst zeigten LacZ-Färbung obwohl die Mehrzahl in den Mesenchymzellen schwächer war.
Vom Haarzyklus abhängende menschliche Versican-Aktivität bei der Haut transgener Mäuse
Die LacZ-Färbung wurde bei Hautschnitten von neugeborenen, 7 Tage, 14 Tage, 28 Tage, 40 Tage bis 4 Monate alten transgenen Mäusen untersucht. Eine starke LacZ-Färbung in den dermalen Papillazellen des Haares in der späten embryonischen Haut wurden in einer Neugeborenenhaut vorgenommen und dauerte während des ersten anagenen Haarzyklus an. Die starke Färbung wurde auf dermalen Papillazellen begrenzt. Man hat interessanterweise im Alter von 7 Tagen bei der mittleren bis späten anagenen Phase eine relativ starke Färbung in der inneren Wurzelhülle beobachtet. In der späten anagenen Phase wurde die LacZ-Färbung wieder nur auf die dermalen Papillazelen beschränkt. Auch später wurde im telogenen Haar keine LacZ-Färbung im Keulenhaar beobachtet. Im zweiten Haarzyklus zeigten die wachsenden dermalen Papilla (zweiter anagener Haarzyklus) wieder eine intensive LacZ-Färbung und nach dem zweiten anagenen Haarzyklus nahm die LacZ-Aktivität in den dermalen Haarpapilla fast völlig über einen langen telogenen Haarzyklus ab.
Menschliche Versicanaktivität in Fibroblast-Kulturen
Eine primäre Kultur von dermalen Fibroblasten, die von dermalen Fibroblastzellen der transgenen Linie von Neugeborenen abgeleitet waren, zeigten eine LacZ-Färbung nur in einer gewissen Zellpopulation und im Zentrum der Haarklammer, offenkundig dermalen Papilla. Da alle stark gefärbten Zellen eine runde Foren hatten, scheint das das abgeleitete dermale Haarpapilla zu sein. Nach der ersten Passage ändert sich die Foren der positiven Zellen und ist nicht auf eine runde Form begrenzt, umfassend typische den Fibroblasten ähnelnde Zellen mit einen dendritischen Prozess in der 2. Passage. Wir züchteten diese nach der ersten Passage bis zu mindestens 6 Passagen beibehaltenen Populationen von positiven Zellen, wobei eine gewissen Anzahl von Zellen vollständig ungefärbt während der Passagen blieb, wobei die Färbung mit einer Gegenfärbung des Zellkerns bestimmt wurde, wodurch die Gesamtanzahl der Zellen klar angegeben werden konnte. Die ungefähre Anzahl der positiven Zellen überstieg nicht die 50%. Die Färbungsintensität nahm stufenweise während der Passagen ab.
Altersbezogene Änderung der menschlichen Versicanaktivität in der Haut transgener Mäuse
Die zunehmende Reaktionszeit für die X-gal-Färbung bis zu 18 Stunden offenbarte eine stärkere Färbung in der von der dermalen Haarpapilla unterschiedlichen oberen Dermis in der jungen bis erwachsenen Haut der transgenen Maus. In der Haut neugeborener Mäuse zeigen die meisten Dermis einschließlich der Haarfollikel (eine haarlose Maus hat nur im ersten Zyklus normales Haar) eine mittelmäßig erfassbare Färbung. Die Haut junger Mäuse zeigte nur eine isolierte von den Fibroblasten abgeleitete diffuse Färbung und zwar bevorzugt in der oberen Dermis und ältere Mäuse zeigten nur eine schwache Färbung, wodurch eine alterbezogene Abnahme der menschlichen Versicanpromoteraktivität in der Haut transgener Mäuse gekennzeichnet wurde.
BEISPIEL 8: AUSWERTUNG DER REPORTERGENEXPRESSION BEI EINEM LEBENDEN TIER VERFAHREN:
Konfokale Mikroskopie
Um die ganze intakte Haut bei einer lebenden transgenen Maus mit einem konfokalen Mikroskop zu untersuchhen, wurden die haarlosen transgenen VEGF-GFP-Mäuse mit Avertin durch eine intraperitoneale Injektion betäubt. Sie wurden direkt in dorsaler Position auf der Petrischale platziert. Es wurde eine TPA- oder Acetonbehandlung auf derselben Hinterhaut durchgeführt, wobei der behandelte Bereich mit einer Tinte markiert wurde, um die Orientierung der Haut zu vereinfachen. Schnitte oder die intakte Haut der Maus wurden unter Benutzung des Inversionsmikroskops Leica DM IRRE und des konfokalen Mikroskopsystems Leica TCS NT4D mit einem Bandpassfilter 530/30nm analysiert, wobei die Emission bei Wellenlängen zwischen 515 bis 545 erfasst wurde.
Direkte Erfassung von GFP in der Epidermis der intakten Haut von lebenden transgenen haarlosen Mäusen durch die konfokale Mikroskopie
Um zu testen, ob die Induktion von GFP direkt in der Haut der lebenden transgenen VEGF-GFP-Maus erfasst wird, wurde die mit Aceton oder TPA behandelte Haut der transgenen haarlosen Maus (dasselbe Individuum) direkt durch eine konfokale Aufnahme unter Betäubungsbedingungen untersucht. Horizontale optische Schnitte durch die normale lebende Epidermis offenbarte eine erfassbare Fluoreszenz und die mit TPA nach 12 Stunden behandelte Haut zeigte die Zunahme des positiven Fluoreszenzbereichs. Ein nicht transgener Wildtype-Wurf zeigte keine erfassbare spezifische Fluoreszenz. Eine stärkere Vergrößerung der mit TPA behandelten Haut offenbarte, dass GFP im extrazellulären Bereich um die Keratinozyten lokalisiert ist. Die konfokale X-Z-Aufnahme bestätigte, dass dieses Signal sich in der Basalschicht der Epidermis befand.
Eine Auswertung mit Hilfe eines konfokalen Lasermikroskops der intakten Haut der lebenden transgenen Maus zur Erfassung des GFP-Signals gab an, dass GFP leicht in der Epidermis erfasst werden kann. Diese Ergebnisse legen eine potentielle Benutzung der transgenen GFP-Maus für eine nicht invasive in vivo Überwachung der langfristigen Genexpression nahe. Wenn das transgene GFP-Reportergen mit der Technologie für die mikroskopische Auswertung wie die konfokale Mikrokopie kombiniert wird, hat das System einen größeren Vorteil gegenüber den herkömmlichen Reportergen-Tier-Verfahren, da es die Anzahl der benutzten Tiere reduziert, ein einfaches Überwachungssystem benutzt und eine Langzeitüberwachung der Änderungen in der Genexepression am selben Individuum ermöglicht.
Eine erfolgreiche in vivo Expression von GFP in der Haut transgener Mäuse trägt zum Verständnis der Regulation der VEGF-Expression wie Entzündungs- und neoplastische Hautkrankheiten bei, indem ein nützliches Überwachungs- und Screening-Werkzug zur Verfügung gestellt wird. Es ist besonders attraktiv, wenn eine Reproduktion mit einer Maus stattfindet, die einen Phänotyp hat, der eine VEGF-Expression umfasst. Dieses GFP-Reportersystem bei einem transgenem Tier ist auch vorteilhaft in der Forschung, die sich auf die Hauthomeostasen während des Alterungsprozesses konzentriert.
BEISPIEL 9: MENSCHLICHE TRANSGENE MMP9-MÄUSE
MMP9 (Gelatinase B, 92-kDa-Typ IV-Collagenase) ist eines der Elemente der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die in der Lage sind, extrazelluläre Matrix (ECM)-Komponenten zu zersetzen. Dieses System (MMP9) ist dafür bekannt, dass es Typ IV und TypV-Collagene, Gelatine und Elastin zersetzt. Es wird auch gezeigt wie die Induzierung durch UVB stattfindet, die die Photoalterung hervorruft. (Fisher, G.J., Nature 379, 335, 1996). Die 5'-flankierende Region dieses Gens von der – 670 Sequenzposition bis zum +1 Transkriptionsstartort reicht aus, um die Expression eines Reportergens (CAT) in HT1080-Zellen. (Sato, H. Oncogene 8, 395, 1993) zu steuern.
Konstrukt des Transgens
Um das Transgen zu konstruieren, wurde ein 733 bp-Fragment des menschlichen MMP9-Promoters (Nucleotide -714 bis +19; wobei der Transkriptionsstartort +1 ist) aus der menschlichen genomischen ADN mit Hilfe der aus dem Stand der Technik bekannten PCR-basierten Techniken erhalten. Es wurden zwei verschiedene Reportergene, das Beta-Galaktosidase-Reportergen (LacZ) und das grün fluoreszierende Proteingen (GFP) für die Konstruktion benutzt.
Für die Konstruktion mit dem Beta-Galaktosidase-Reportergen (LacZ) wurde das MMP9-Promoterfragment in einen modifizierten pNASSbeta-Vektor (Clontech) eingeführt, der in den neutrophilen Elastasepromoter eingeführt ist und einen Bgl II-Ort hat und durch Restriktion mit Bgl II-Xho I linearisiert ist. Um ein transgenes ADN-Fragment für die pronukleare Induktion zu erhalten, wurde der Vektor mit Bgl II und Hind III gespalten. Die Länge der linearisierten ADN war 4630bp.
Für die Konstruktion mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-Gen wurde dasselbe ein MMP9-Promoterfragment in den pEGFP-1-SV eingeführt, was ein modifizierter Vektor war, der einen Splice Donor/Akzeptor hat, der auf den pEGFP-1-Vektor (Clontech) basiert und durch eine Restriktion mit Hind III-Kpn I linearisiert ist. Um eine transgenes ADN-Fragment für die pronukleare Induktion zu erhalten, wurde der Vektor mit Hind III und Afl II gespalten. Die Länge der linearisierten ADN war 1928bp.
Erzeugung von transgenen Mäusen
Das linearisierte transgene ADN-Fragment wurde in befruchtete Oozyten von haarlosen Mäusen (SKH1; Charles River, Boston) injiziert. Die Eier wurden in pseudoschwangere Pflegemütter implantiert. Die Nachkommenschaft (F0) wurde auf Chromosomenintegration von LacZ oder des GFP-Fragments durch Southern-Blotting getestet. Für die Erfassung des LacZ-Transgens wurde das aus dem Schwanz extrahierte genomische ADN mit Nci I verdaut und auf einen Gel separiert und dann auf eine Nylonmembran übertragen. Das mit Nci verdaute transgene ADN-Fragment wurde für die Sonde benutzt. Zwei unabhängige Linien zeigten eine transgene Insertion. Für die Erfassung des GFP-Transgens wurde die genomische Schwanz-ADN mit Hinc II verdaut. Zwei unabhängige Linien zeigten eine transgene Insertion.
Beta-Galaktosidase-Histochemie
Von primären Tieren (F0) erhaltene F1-Mäuse wurden für die Beta-Galaktosidase-Biochemie benutzt. Die Knochen der Hintergliedmassen von 2 Wochen alten Mäusen wurden mit 0,5%igem Glutaraldehyd in BPS während 30 Minuten fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit BPS und einmaligem Waschen mit einem Detergenz wurde das Gewebe mit einem Reaktionspuffer, der 1mg/ml X-gal (Sigma), 10mM Ferrozyanid und 10 mM Ferrizyanid enthält, bei 37°C inkubiert. Nach 2 Stunden Inkubation wurde eine blaue Färbung in einer ein Transgen aufweisenden F1-Maus beobachtet, während keine Färbung im Geschwisterteil ohne Transgen beobachtet wurde. Das stimmt mit einem Bericht überein in dem gezeigt wurde, dass MMP9 an einem Knochen eines Gliedmassens einer 2 Wochen alten Maus durch in situ-Expression exprimiert wird (Reponen, P., Journal of CEll Biologie 124, 1091, 1994).
BEISPIEL 10: TRANSGENE MÄUSE MIT MENSCHLICHER NEUTROPHILER ELASTASE
Neutrophile Elastase ist eine starke Serinproteinase, die in der Lage ist, eine breite Spanne von Proteinen zu zersetzen. Haarlose Mäuse bei denen dieses Enzym im Defizit ist, leiden nicht an Elastose, die eine der Anzeichen der durch die UVB-Strahlung erzeugten Photoalterung ist (Starcher, B. Connective Tissue Resuerch, 31, 133, 1995). Deshalb glaubt man, dass die neutrophile Elastase eine wichtige Rolle bei der Photoalterung spielt.
Konstruktion des Transgens
Um das Transgen zu konstruieren, wurde ein 1299 bp-Fragment des menschlichen neutrophilen Elastase-Promoters (Nucleotide -1280 bis +19; wobei der Transkriptionsstartort +1 ist) aus dem menschlichen genomischen ADN unter Benutzung der aus dem Stand der Technik bekannten PCR-basierten Techniken erhalten. Dieses neutrophile Elastasepromoter-Fragment wurde in den pNASSbata-Vektor (Clontech) eingeführt, der durch Restriktion mit Eco TI-Xho I linearisert wurde. Um das transgene ADN-Fragment für die pronukleare Injektion zu erhalten, wurde der Vektor mit EcoR I und Xba I gespalten. Die Länge des linearisierten ADN-Transgens war 5171 bp.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein nicht menschliches transgenes Tier mit einem an einen Versican-Promotor gekoppelten Reportergen.
Das nicht menschliche transgene Tier nach Anspruch 1, wobei der Versican-Promotor ein menschlicher Versican-Promoter ist.
Das transgene Tier nach Anspruch 1, wobei das Reportergen aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den Genen besteht, die Beta-Galactosidase, Alkalinphosphatase, Meerrettich-Peroxidase und Chloramphenicol-Acetyltransferase kodieren.
Das nicht menschliche transgene Tier nach Anspruch 1, wobei das Reportergen ein Genprodukt herstellt, das fluoreszierend ist, oder das eine Reaktion katalysiert, die durch die Bildung eines farbigen Produkts bestimmt wird.
Das transgene Tier nach Anspruch 4, wobei das Reportergen ein Genprodukt herstellt, das fluoreszierend ist.
Das transgene Tier nach Anspruch 4, wobei das Reportergen ein grün fluoreszierendes Protein ist.
Das transgene Tier nach Anspruch 1, wobei das transgene Tier eine Maus ist.
Das transgene Tier nach Anspruch 7, wobei die Maus eine haarlose Maus ist.
Das transgene Tier nach Anspruch 7, wobei die Maus eine Maus ist, bei der die Vergreisung beschleunigt ist.
Das transgene Tier nach Anspruch 1, wobei das transgene Tier außerdem ein zweites Reportergen umfasst, das an einen auf den Haut-Metabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist, der sich vom Versican-Promoter unterscheidet.
Ein Verfahren zur Auswertung der Wirkung einer Behandlung auf die Haut, umfassend: a. Bereitstellung von aus dem transgenen Tier nach dem Patentanspruch 1 oder 10 entnommenen Geweben; b. Verabreichung der Behandlung an die Gewebe; und c. Auswertung der Expression des Reportergens; wobei die Behandlung auf ihre Wirkung auf die Haut untersucht wird.
Ein Verfahren zur Auswertung der Wirkung einer Behandlung auf die Haut, umfassend: a. Bereitstellung des transgenen Tiers nach dem Patentanspruch 1 oder 10, oder von Geweben davon; b. Verabreichung der Behandlung an das transgene Tier oder Gewebe davon; und c. Auswertung der Expression des Reportergens; wobei die Behandlung auf ihre Wirkung auf die Haut untersucht wird; wobei das transgene Tier eine Maus ist, und die Behandlung dem Tier verabreicht wird; oder wobei das transgene Tier eine Ratte ist; oder wobei das transgene Tier ein Meerschweinchen ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Behandlung auf die Haut des transgenen Tiers angewandt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Versican-Promotor ein menschlicher Versican-Promoter ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Reportergen aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den Genen besteht, die Beta-Galactosidase, Alkalinphosphatase, Meerrettich-Peroxidase und Chloramphenicol-Acetyltransferase kodieren.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Reportergen ein Genprodukt herstellt, das fluoreszierend ist, oder das eine Reaktion katalysiert, die durch die Bildung eines farbigen Produkts bestimmt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Reportergen ein Genprodukt herstellt, das fluoreszierend ist.
Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Reportergen ein grün fluoreszierendes Protein ist.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Maus eine haarlose Maus ist.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Maus eine Maus ist, bei der die Vergreisung beschleunigt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das transgene Tier eine Ratte ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das transgene Tier ein Meerschweinchen ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das transgene Tier außerdem ein zweites Reportergen umfasst, das an einen Haut-Metabolismus bezogenen Promoter gekoppelt ist, der sich vom Versican-Promoter unterscheidet.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Behandlung dem Tier verabreicht wird, und außerdem eine nachfolgende Verabreichung der Behandlung umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, umfassend außerdem den Vergleich der Expression des Reportergens mit einem Kontrollwert.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Behandlung dem Tier verabreicht wird, und die Auswertung der Expression des Reportergenschritts mindestens einmal im Leben des Tiers wiederholt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 26, wobei der erste Schritt und eine folgende Wiederholung des Schritts durch 10 Tage getrennt sein können.
Das Verfahren nach Anspruch 26, wobei der erste Schritt und eine folgende Wiederholung des Schritts an einem lebenden Tier ausgeführt werden.
Das Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Auswertung der Expression des Reportergens im transgenen Tier die Auswertung der Expression des Reportergens in der Haut des transgenen Tiers ohne Entnahme einer Hautprobe vom transgenen Tier umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Auswertung der Expression des Reportergens die Entnahme einer Hautprobe vom transgenen Tier umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Hautprobe während der Auswertung der Expression des Reportergens am Leben bleibt.