DE69431212T2

DE69431212T2 - Behandlung von diabetes

Info

Publication number: DE69431212T2
Application number: DE69431212T
Authority: DE
Inventors: Stephen J. Brand; Ronald V. Nardi
Original assignee: Waratah Pharmaceuticals Inc; General Hospital Corp
Current assignee: Waratah Pharmaceuticals Inc; General Hospital Corp
Priority date: 1994-01-24
Filing date: 1994-01-24
Publication date: 2003-04-10
Anticipated expiration: 2014-01-25
Also published as: EP0752882A1; EP1466618B1; AU7628794A; CA2182034A1; JPH09511384A; EP1132091A1; DE69435212D1; DE69431212D1; EP1466618A1; EP1842552A1; EP0752882A4; CA2182034C; EP0752882B1; ES2185663T3; WO1995019785A1; ATE222503T1

Description

Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen, umfassend einen Gastrin/Cholezystokinin (CCK)-Rezeptorliganden, insbesondere Gastrin, und einen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptorliganden, insbesondere den transformierenden Wachstumsfaktor alpha (TGFα) für die Verwendung in einem Behandlungsverfahren für Diabetes mellitus durch Bewirken der Differenzierung von Pankreas-Inselvorläuferzellen zu reifen, Insulin erzeugenden Zellen.
Die Inseln der Pankreas entwickeln sich aus endodermalen Stammzellen, welche im fötalen Endothelialgang der Pankreas liegen, welche ebenfalls mehrfunktionale Stammzellen enthält, welche sich in der exokrinen Pankreas entwickeln. Teitelman, G. und J. K. Lee, Developmental Biology, 121: 454-466 (1987); Pictet, R. und W. J. Rutter, Development of the embryonic endocrine pancreas, in Endocrinology, Handbook of Physiology, Hrsg. R. O. Greep und E. B. Astwood (1972), American Physiology Society: Washington D. C., S. 25-66. Die Entwicklung der Inseln verläuft über diskrete Entwicklungsstadien während der fötalen Schwangerschaft, welche durch drastische Übergänge unterbrochen sind. Die Anfangsperiode besteht in einem protodifferenzierten Zustand, welcher durch Bindung dieser mehrfunktionellen Stammzellen an die Inselzelllinie gekennzeichnet ist, was in der Expression von Insulin und Glukagon zum Ausdruck kommt. Diese protodifferenzierten Zellen umfassen ein Population gebundener Inselvorläuferzellen, welche nur geringe Mengen spezifischer Insel-Genprodukte auspressen und weisen kein Zelldifferenzierungsvermögen für reife Inselzellen auf Pictet, R. und W. J. Rutter, supra. Bei der trächtigen Maus beginnt um den 16. Tag herum bei der protodifferenzierten Pankreas eine rapide Wachstums- und Differenzierungsphase, die durch eine Zelldifferenzierung von Inselzellen und eine Zunahme der Expression spezifischer Inselgene um das mehrere Hundertfache gekennzeichnet ist. Histologisch tritt die Inselbildung (Neogenese) als wuchernde Inselknospe aus den Pankreasgängen (Nesidioblastose) in Erscheinung. Unmittelbar vor der Geburt ist die Wachstumsgeschwindigkeit der Inseln gering, so dass die Neogenese und Nesidioblastose der Zellen viel weniger in Erscheinung tritt. Parallel hierzu erreichen die Inseln einen vollständig differenzierten Zustand mit Maximalwerten bei der Expression von Insulin-Genen. Die vollständige zelluläre Differenzierung ist daher, ähnlich der bei vielen Organen, mit einer verminderten Regenerationsfähigkeit verbunden.
Weil die Differenzierung protodifferenzierter Vorläufer während der späten fötalen Entwicklung der Pankreas erfolgt, treten die Einflüsse, welche die Differenzierung der Inseln steuern wahrscheinlich in der Pankreas während dieser Zeitspanne auf Eines während der Entwicklung der Inseln ausgepressten Gene enkodiert das gastrointestinale Peptid Gastrin. Obwohl Gastrin beim Erwachsenen als ein Magenhormon wirkt, das die Sekretion der Säure steuert, betrifft das Hauptgebiet der Gastrinexpression im Fötus die Pankreasinselzellen. Brand, S. J. und P. J. Fuller, J. Biol. Chem., 263: 5341-5347 (1988). Die Expression von Gastrin in Pankreasinselzellen ist vorübergehend. Sie ist auf den Zeitraum beschränkt, während dessen protodifferenzierte Inselvorläufer differenzierte Inseln bilden. Obwohl die Bedeutung von Pankreasgastrin bei der Entwicklung der Inseln unbekannt ist, lassen einige klinische Befunde vermuten, dass Gastrin bei dieser Entwicklung der Inseln folgende Rolle spielt. Zum Beispiel gehen durch Gastrin-auspressende Inselzelltumore verursachte Hypergastrinämie und atrophische Gastritis mit der Nesidioblastose einher, ähnlich der bei der Differenzierung fötaler Inselzellen beobachteten. Sacchi, T. B. et al., Virchows Archiv B, 48: 261-276 (1985); und Heitz, P. U. et al., Diabetes, 2: 632-642 (1977). Ferner wurde in einem Fall kindlicher Nesidioblastose ein anormal langes Auftreten von Paukreasgastrin nachgewiesen. Hollande, E. et al., Gastroenterology, 71: 255-262 (1976). Es konnte jedoch bei keiner Beobachtung ein ursächlicher Zusammenhang zwischen der Nesidioplastose und der Gastrinstimulation nachgewiesen werden.
Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein Ligandenpeptid des Gastrin/CCK-Rezeptors und ein Ligandenpeptid des EGF-Rezeptors, für die Verwendung in einem Behandlungsverfahren für Diabetes mellitus. Der Gastrin/CCK-Rezeptorligand ist typischerweise Gastrin. Der EGF-Rezeptorliand ist typischerweise TGFα. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Zusammensetzung in einer Menge verabreicht, welche ausreicht, um die Differenzierung von Pankreas-Inselvorläuferzellen zu reifen, Insulin sekretisierenden Zellen zu bewirken. Die Zusammensetzung kann systemisch verabreicht werden.
Es werden auch Verfahren zur Expression der Zusammensetzung in situ durch Zellen beschrieben, welche mit einer nukleinsauren Fusionskonstruktion in einem Expressionsvektor ergänzt sind. Die Fusionskonstruktion schließt eine Kodiersequenz für einen pre-pro-Gastrin- Peptidvorläufer ein und kann auch eine Kodiersequenz für einen EGF-Rezeptorliganden einschließen.
Zusammengefasst zeigen die Untersuchungen, über die nachstehend berichtet wird, dass die Gewebsneubildung von Inselzellen nunmehr in vivo in Säugetieren im Epithelialgang der ausgewachsenen Pankreas durch Stimulierung mit einem Gastrin/CCK-Rezeptor wie Gastrin und einen EGF-Ligandenrezeptor wie TGFα reaktiviert werden konnte. Die Untersuchungen zeigen und bestätigen, dass beide Arten von Wachstumsfaktoren benötigt werden, um das angestrebte Ziel zu erreichen und keiner von beiden allein dazu ausreicht. Über die Untersuchungen wird anhand der transgenen Überexpression von TGFα und Gastrin in der Pankreas berichtet, welche die Rolle der Gastrinexpression in der Pankreas bei der Entwicklung von Inselzellen erhellen und zeigen, dass sowohl TGFα als auch Gastrin eine Rolle bei der Steuerung der Entwicklung der Inselzellen spielen.
Die regenerative Differenzierung von verbliebenen mehrfunktionellen Pankreasgangzellen zu reifen, Insulin sekretisierenden Zellen durch die therapeutische Verabreichung dieser Kombination von Faktoren oder Zusammensetzungen, welche für ihre in situ Expression innerhalb der Pankreas sorgen, ist daher nunmehr eine echte klinische Alternative zur Behandlung von Diabetes mellitus geworden, insbesondere der jugendlichen Anfangsdiabetes.
Fig. 1A ist eine fotographische Darstellung, welche zahlreiche farbige Insulinzellen im metaplastischen Gang der transgenen TGFα-Pankreas nach Anfärbung mit Immunperoxidase zeigt.
Fig. 1B ist eine fotographische Darstellung, welche zeigt, dass die meisten Gangzellen sich weniger intensive auf Insulin anfärbten, während fallweise Gangzellen sich mit der gleiche Intensität wie die Insulinzellen wie die benachbarten Inseln anfärbten.
Fig. 2A zeigt schematisch die Struktur des schimärischen Insulin-Promotor- Gastrintransgens (INSGAS).
Fig. 2B zeigt, dass der Radioimmunotest des Pankreasextrakts aus transgenen INSGAS-Mäusen hohe Niveaus an Gastrin-Immunreaktivität ausweist, welche den aus den endogenen Genen der Maus ausgepressten Gastringehalt in der Magenhöhle überschreitet. Die transgenen INSGAS-Mäuse wiesen eine hohe Gastrinexpression in der Pankreas nach der Geburt auf.
Fig. 3A ist eine fotographische Darstellung des Pankreasgewebes der INSGAS/TGFα-Maus, die bei der in Beispiel 3 aufgeführten Untersuchung verwendet wurde. Die INSGAS/TGFα-Pankreas wies einige Bereiche mit erhöhten gangförmigen Komplexen und dazwischen einen leicht erhöhten zellartigen Aufbau auf. Der hier dargestellte Bereich wies die am stärksten anormale Gewebestruktur von den fünf verwendeten Tieren auf.
Fig. 3B ist eine fotographische Darstellung des Pankreasgewebes der Kontroll-Maus von Beispiel 3.
Fig. 3C ist eine fotographische Darstellung des Pankreasgewebes der TGFα-Maus von Beispiel 3. Dieser Bereich der TGFα-Maus der in Beispiel 3 aufgeführten Untersuchung war typisch und zeigte den dazwischen liegenden zellartigen Aufbau und das Bindegewebswachstum in Verbindung mit der floriden duktulären Gewebeumbildung und wurde von Jhappan et al., supra, beschrieben.
Fig. 4A ist ein Histogramm, welches die Ergebnisse der punktweisen Auszählung der Formmessung graphisch veranschaulicht, welche bestätigen, dass in der 17. Woche die Pankreas der INSGAS/TGFα-Mäuse eine geringere Gangmasse aufwies als die Pankreas der TGFα-Mäuse aus der in Beispiel 3 aufgeführten Untersuchung.
Fig. 4B ist ein Histogramm, welches die Ergebnisse der punktweisen morphometrischen Auszählung veranschaulicht, welche zeigen, dass die gemeinsame Expression von Gastrin und TGFα in der INSGAS/TGFα-Pankreas die Masse der Inseln, verglichen mit der Masse der Inseln der entsprechenden nicht-transgenen Kontroll-Mäuse, beträchtlich erhöhte. Des Weiteren erhöht die TGFα-Expression allein die Masse der Inseln nicht. Diese Ergebnisse beruhen auf den in Beispiel 3 aufgeführten Untersuchungen.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf Untersuchungen, welche zahlreiche farbige Insulinzellen im TGFα-induzierten metaplastischen Gang zeigen. Das niedrige Niveau der exokrinen und endokrinen Genexpression in den metaplastischen Gangzellen erinnert an die im frühen Stadium der fötalen Entwicklung der Pankreas beobachteten, protodifferenzierten Gangzellen. Die Inselneubildung (Neogenese) resultiert aus der Vermehrung und Differenzierung dieser protodifferenzierten Insulin auspressenden Zellen. Histologisch äußert sich dies in Form von Inseln, welche von den Pankreasgängen heraus keimen (Nesidioblastose). In transgenen MT-42 TGFα-Mäusen wird die Gewebeumbildung in den Gängen in der Periode unmittelbar nach der Geburt nicht beobachtet, sondern erst im Alter von 4 Wochen. Dies zeigt, dass die TGFα-Überexpression bevorzugt die Insulin-Expression im Epithelgang induziert und nicht die Wirkungsdauer der in fötalen Pankreasgängen beobachteten Inselvorläufer verlängert.
Obwohl der metaplastische Gang zahlreiche Insulin-positive Zellen enthält, wurde die Masse der Inseln von transgenen TGFα-Mäusen gegenüber der von Kontrolltieren nicht erhöht. Folglich kann eine TGFα-Überexpression allein keinen Übergang dieser protodifferenzierten Gangzellen zu vollständig differenzierten Inseln bewirken. Daraus ergibt sich, dass die Differenzierung der Inseln andere Faktoren erfordert, welche in der ausgewachsenen Pankreas von transgenen TGFα-Mäusen nicht vorliegen. Nachdem die Differenzierung von protodifferenzierten Inselvorläufern während der späten fötalen Entwicklung erfolgt, werden Faktoren, welche diesen Übergang steuern, wahrscheinlich während dieser Periode in den Inseln ausgepresst. Zu den Faktoren, welche in den sich entwickelnden Inseln ausgepresst werden, gehören die gastrointestinalen Peptide, die Gastrine. Klinische Beobachtungen haben die Gastrinexpression auch mit der Nesiodioblastose - Keimen sich vermehrender Inseln aus fötalen Pankreasgängen - in Verbindung gebracht. Vergl. Hollande et al., Gastroenterology, 71: 255-262 (1976) und Sacchi, T. B. et al., Virchows Archiv B, 48: 261-276 (1985).
Der hierin verwendete Ausdruck "Gastrin/CCK-Rezeptorligand" schließt Verbindungen ein, welche den Gastrin/CCK-Rezeptor in einer solchen Weise stimulieren, dass eine Neubildung von Insulin-produzierenden Pankreas-Inselzellen induziert wird, wenn EGF- Rezeptoren im gleichen oder benachbarten Gewebe oder im gleichen Lebewesen ebenfalls stimuliert werden. Beispiele solcher Gastrin/CCK-Rezeptorliganden schließen verschiedene Formen von Gastrin ein wie Gastrin 34 (großes Gastrin), Gastrin 17 (kleines Gastrin) und Gastrin 8 (Mini-Gastrin); verschiedene Formen von Cholezystokinin wie CCK 58, CCK 22, CCK 12 und CCK 8; sowie andere Gastrin/CCK-Rezeptorliganden, welche die gleiche synergistische Aktivität wie EGF-Rezeptorliganden besitzen und das Carboxyl-terminierte Peptid Trp-Met-Asp-Phe-amid aufweisen, das die Differenzierung von Zellen in der reifen Pankreas unter Bildung Insulin sekretisierender Inselzellen induzieren kann, wenn es mit einem EGF-Rezeptorliganden synergistisch wirkt. Vorgesehen sind auch aktive Analoge, Bruchstücke und andere Modifikationen der Vorstehenden. Solche Liganden schließen auch Verbindungen ein, welche die Sekretion von endogenen Gastrinen, Cholezytokininen oder ähnlichen aktiven Peptiden von Gewebedepots erhöhen. Solche Beispiele sind Emeprazot das die Magensäuresekretion inhibiert und der Trypsin-Inhibitor der Sojabohne, welcher die CCK-Stimulierung erhöht.
Der hierin verwendete Ausdruck "EGF-Rezeptorligand" beinhaltet Verbindungen, welche den EGF-Rezeptor in einer solchen Weise stimulieren, dass eine Neubildung von Insulin produzierenden Pankreas-Inselzellen induziert wird, wenn Gastrin/CCK-Rezeptoren im gleichen oder benachbarten Gewebe oder im gleichen Lebewesen ebenfalls stimuliert werden. Beispiele solcher EGF-Rezeptorliganden schließen ein EGF1-53, einschließend EGF1-48, EGF1-52, EGF1-49 sowie Fragmente und aktive Analoge davon. Andere Beispiele schließen sowohl TGFα-Rezeptorliganden (1-50) ein, einschließend 1-48, 1-47 und andere EGF-Rezeptorliganden wie Amphiregulin und den Pockenviruswachstumsfaktor als auch andere EGF-Rezeptorliganden, welche die gleiche synergistische Wirkung aufweisen wie die Gastrin/CCK-Rezeptorliganden. Dies schließt aktive Analoge, Fragmente und Modifikationen der Vorstehenden ein. Bezüglich weiterer Hintergrundinformationen vergl. Carpenter und Wahl, Kap. 4 in Peptide Growth Factors (Hrsg. Sporn und Roberts), Springer Verlag, 1990.
Ein Hauptgegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung, einschließend einen Gastrin/CCK-Rezeptorliganden und einen EGF-Rezeptorliganden in einer Menge, welche ausreicht, um eine Differenzierung von Pankreas-Inselvorläuferzellen zu reifen, Insulin sekretisierenden Zellen für die Verwendung in einem Behandlungsverfahren für Diabetes mellitus in einem Kranken bei Bedarf zu bewirken. Die differenzierten Zellen sind latente Reste von Inselvorläuferzellen im Pankreasgang. Die Zusammensetzungen dienen prinzipiell der Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung der jung einsetzenden Diabetes meflitus. Eine Ausführungsform umfasst Zusammensetzungen zur vorzugsweise systemischen Verabreichung einer durch Differenzierung regenerierbaren Gastrinmenge und eines EGF- Rezeptorliganden, vorzugsweise TGFα, an den Kranken.
Eine andere Ausführungsform umfasst eine ex vivo Methode um eine Differenzierung von Pankreas-Inselvorläuferzellen in einem Säuger zu reifen, Insulin sekretisierenden Zellen zu bewirken, welche die Stimulierung solcher Zellen mit einer Kombination aus einem Ligandenpeptid des Gastrin/CCK-Rezeptors und einem Ligandenpeptid des EGF-Rezeptors umfasst. Das auf diese Weise stimulierte Pankreasgewebe wird dann typischerweise wieder in den Säuger eingeführt. Hier besteht wiederum der Gastrin/CCK-Rezeptorligand vorzugsweise aus Gastrin und der EGF-Rezeptorligand vorzugsweise aus TGFα.
Es wird auch ein Verfahren beschrieben, bei dem die Stimulierung des Gastrin/CCK- Rezeptorliganden durch Expression einer schimärischen Promotor-Gastrin-IFusions- Genkonstruktion von Insulin transgenial in solchen Vorläuferzellen bewirkt wird. Eine typische Stimulierung des EGF-Rezeptorliganden wird durch Expression eines transgenial in einen Säuger eingeführten Gens des EGF-Rezeptorliganden bewirkt. Der EGF-Rezeptorligand ist vorzugsweise TGFα und das Gen des EGF-Rezeptorliganden ist ein TGFα-Gen.
Weiterhin wird ein Verfahren beschrieben, bei dem die Stimulierung durch einen Gastrin/CCK-Rezeptorliganden und einen EGF-Rezeptorliganden durch gemeinsame Expression von (i) eines Gens des pre-pro-Gastrin-Peptidvorläufers und (ii) eines Gens des EGF-Rezeptorliganden bewirkt wird, welche stabil in einen Säuger eingeführt wurden. Hier besteht der EGF-Rezeptorligand typischerweise wiederum aus TGFα und das Gen des EGF- Rezeptorliganden typischerweise aus einem TGFα-Gen.
Es wird auch ein Verfahren beschrieben, bei dem die Differenzierung von Pankreas- Inselvorläuferzellen eines Säugers durch Stimulierung solcher Zellen mit einer Kombination aus einem Gastrin/Rezeptorliganden, insbesondere Gastrin, und einem EGF-Rezeptorliganden, insbesondere TGFα, bewirkt wird. Bei diesem Verfahren wird die Gastrinstimulierung typischerweise durch Expression eines in den Säuger eingeführten Gens des prepro-Gastrin-Peptidvorläufers bewirkt. Die Expression steht unter der Kontrolle des Insulin- Promotors. Die Stimulierung des EGF-Rezeptorliganden, z. B. TGFα, wird durch Expression des transgen in den Säuger eingeführten Gens des EGF-Rezeptorliganden bewirkt. Zur Unterstützung des Vorstehenden wird die Stimulierung durch Gastrin und TGFα vorzugsweise durch die gemeinsame Express ion von (i) einem Gen des pre-pro-Gastrin-Peptidvorläufers und (ii) einem Gen des EGF-Rezeptorliganden, z. B. TGFα-Gen bewirkt wird, welche stabil in einen Säuger eingeführt wurden.
Beschrieben wird auch eine Nukleinsäurefusionskonstruktion. Diese Konstruktion schließt eine Nukleinsäuresequenz ein, die für ein pre-pro-Gastrin-Vorläuferpeptid und eine transkriptionale Insulinsteuerungssequenz kodiert, welche 5' entspricht und die wirksam ist, um die Transkription einer Sequenz zu unterstützen, die für das pre-pro-Gastrin-Vorläuferpeptid enkodiert. Typischerweise schließt die transkriptionale Insulinsteuerungssequenz mindestens den Insulin-Promotor ein. Die für den pre-pro-Gastrinvorläufer kodierende Nukleinsäuresequenz kann eine Polynuldeotidsequenz umfassen, welche die Exons 2 und 3 des menschlichen Gastrin-Gens und gegebenenfalls auch die Introns 1 und 2 enthält.
Es wird auch eine Zusammensetzung beschrieben, umfassend (i) eine Nukleinsäuresequenz, die für einen EGF-Rezeptorliganden eines Säugers, z. B. TGFα und eine transkriptionale Steuerungssequenz davon kodiert; und (ii) eine Nukleinsäuresequenz, die für das prepro-Gastrin-Vorläuferpeptid und eine transkriptionale Steuerungssequenz davon kodiert. Die transkriptionale Steuerungssequenz für den EGF-Rezeptorliganden ist typischerweise ein starker, nicht gewebespezifischer Promotor wie der Metallothionein-Promotor. Die transkriptionale Steuerungssequenz für das pre-pro-Gastrin-Vorläuferpeptid ist typischerweise der Insulin-Promotor. Die Nukldeinsäuresequenz kann für ein pre-pro-Gastrin-Vorläuferpeptid kodieren, welches eine Polynukleotidsequenz umfasst, welche die Introns 1 und 2 und die Exons 2 und 3 des menschlichen Gastrin-Gens enthält.
Es wird auch ein Vektor beschrieben, welcher die Fusionskonstruktion für das Gen enthält, umfassend die Kodiersequenz des pre-pro-Gastrin-Vorläuferpeptids. Dieser Vektor kann ein Plasmid wie pGeml oder ein Phage mit einer transkriptionalen Steuerungssequenz sein, welche den Insulinpromotor einschließt.
Beschrieben wird auch eine Zusammensetzung von Vektoren, von denen einer die Nukleinsäuresequenz einschließt, welche (i) für den EGF-Rezeptorliganden von Säugern, z. B. TGFα, unter der Kontrolle eins starken, nicht gewebespezifischen Promotors, z. B. dem Metallothionein-Promotor und (ii) einer Kodiersequenz des pre-pro-Gastrin-Vorläuferpeptids unter der Kontrolle des Insulin-Promotors kodiert. Unter diesem Gesichtspunkt kann jeder Vektor ein Plasmid sein, wie das Plasmid pGeml oder ein Phage.
Beschrieben wird auch ein nicht-menschlicher Säuger oder ein Gewebe, welches Zellen davon einschießt, welche ein integriertes Gen auspressen können, das für pre-pro- Gastrin enkodiert.

Therapeutische Verabreichung und Zusammensetzungen

Die Arten der Verabreichung schließen intramuskuläre; intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale und orale Wege ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Die Verbindungen können auf jedem beliebigen geeigneten Wege verabreicht werden, zum Beispiel durch Infusion oder Bolusinjektion, durch Absorption über die Epithelbekleidung oder über die Schleimhautauskleidung (z. B. Mundchleinihaut, Mastdarmschleimhaut und Darmschleimhaut) und kann zusammen mit anderen biologisch aktiven Mitteln verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise systemisch.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines Medikaments und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Streckmittel. Solche Träger schließen Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon ein, jedoch ohne Beschränkung darauf.
Die Zusammensetzung kann, wenn dies gewünscht wird, auch geringere Mengen an Netz- oder Emulgiermitteln, oder Mittel zur pH-Pufferung enthalten. Die Zusammensetzung kann eine flüssige Lösung, Suspension, Emulsion, Tablette, Pille, Kapsel, Formulierung mit verzögerter Freisetzung oder ein Pulver sein. Die Zusammensetzung kann mit herkömmlichen Bindemitteln und Trägern wie Triglyceriden als Zäpfchen formuliert sein. Orale Formulierungen können Standardträger einschließen, wie pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Saccharin-Natrium, Cellulose, Magnesiumcarbonat, etc.
Es sind verschiedene Verabreichungssystem bekannt und können zur Verabreichung eines erfindungsgemäßen Medikaments verwendet werden, z. B. die Einkapselung in Liposome, Mikropartikehu, Mikrokapseln und ähnliche.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung in Übereinstimmung mit Routineverfabren in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert, welche auf die intravenöse Verabreichung an Menschen ausgelegt ist. Typische Zusammensetzungen für die intravenöse Verabreichung sind Lösungen in sterilem, wässrigem, isotonischem Puffer. Die Zusammensetzung kann, wenn nötig, auch einen Lösungsvermittler und ein lokales Anästhetikum einschließen, um allfällige Schmerzen an der Injektionsstelle zu lindern. Die Bestandteile werden generell entweder einzeln oder zu einer Einzeldosis gemischt bereitgestellt, zum Beispiel in Form eines trockenen gefriergetrockneten Pulvers oder eines wasserfreien Konzentrats in einem hermetisch versiegelten Behälter wie einer Ampulle oder einem Kissen mit Angabe der Wirkstoffmenge. Soll die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden, kann sie über eine Infusionsflasche verabreicht werden, welche steriles Wasser oder Kochsalzlösung in pharmazeutischer Qualität enthält. Soll die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht werden, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser zur Injektion oder Kochsalzlösung bereitgestellt werden, so dass die Bestandteile vor der Verabreichung gemischt werden können.
Die erfindungsgemäßen Medikamente können in Form neutraler Salze formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen jene ein, welche mit freien Aminogruppen gebildet werden, wie sie sich von Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure etc. ableiten und jene, welche mit freien Carboxylgruppen gebildet werden sowie jene, die sich von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Eisen-III-hydroxid, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain etc. ableiten.
Die Menge an erfindungsgemäßem Medikament, welche bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines Zustandes wirksam ist, wird von der Art der Störung oder des Zustandes abhängen. Die genaue, in der Formulierung eingesetzte Dosis, wird auch vom Wege der Verabreichung und der Schwere oder Krankheit oder Störung abhängen und sollte nach dem Urteilung des Arztes und den Umständen des einzelnen Kranken festgelegt werden. Geeignete Dosierbereiche für die intravenöse Verabreichung sind jedoch im Allgemeinen etwa 20-500 ug aktive Verbindung pro kg Körpergewicht. Geeignete Dosierbereiche für die intranasale Verabreichung sind im Allgemeinen etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Die wirksamen Dosen können aus Dosis/Wirkungs-Kurven in vitro oder aus Prüfsystemen für Tiermodelle extrapoliert werden.
Suppositorien enthalten im Allgemeinen Wirkstoffe im Bereich von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%; orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10% bis 95% Wirkstoffe.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder ein Kit bereit, umfassend einen oder mehrere Behälter, der/die mit einem oder mehreren Inhaltsstoff(en) der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gefüllt ist/sind. Einem solchen Behälter(n) kann ein Merkblatt in einer von einer für die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf pharmazeutischer oder biologischer Produkte regelnden Regierungsstelle vorgeschriebenen Form beiliegen, wobei aus diesem Merkblatt die Zulassung durch die Behörde hervorgeht, welcher für die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf zur Verabreichung an den Menschen zuständig ist.

Materialien und Verfahren

Bei den Untersuchungen, über die nachstehend anhand der angegebenen Ausführungsbeispielen berichtet wird, wurden die folgenden Materialien und Verfahren verwendet, sofern nichts anderes angegeben ist.
Tiere: Mäuse, FVB- und CD-Stämme, wurden von Taconic Farms, Inc., Germantown, NY erhalten. Die verwendete trarisgene TGFα-Linie MT-42, welche hohe Niveaus an TGFα aus einem Metallothionein-Proniotor auspresst, ist in Jhappan et al., Cell, 61: 1137-1146 (1990) beschrieben.
INSGAS Transgenkonstruktion: Ein Pvull-Rsal-Fragment, das die Nukleotide -370 bis +38 des Insulin I Gens der Ratte umfasst (Cordell, B. G. et al., Cell, 18: 533-543 (1979)) wurde in pGeml (Promega Corp., Madison, WI) gebunden. Das A 4.4.kb Bam H1-EcoRl- Fragment, welches die 1.5 kb Introns 1 und 2 und die Exons 2 und 3 des menschlichen Gastrin-Gens enthält, welches für das pre-pro-Gastrin-Vorläuferpeptid enkodiert, wurde isoliert und stromab des Ratten-Insulin I-Fragments in pGeml (Promega) subklont. Das Fragment ist in Wiborg, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1067-1069 (1984) und Ito, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4662-4666 (1984) beschrieben. Die Insulin-Promotor prepro-Gastrin INSGAS-Transgenkonstruktion wurde aus einem 4.8 kb Xbal-EcoRl-Fragemnt herausgeschnitten.
Züchtung und Charakterisierung transgener Mäuse: Das wie vorstehend beschrieben hergestellte Fragment wurde wie folgt für die Mikroinjektion vorbereitet. Es wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert, durch CsCl-Gradientenreinigung gereinigt und ausgiebig gegen Injektionspuffer (5 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 5 mM Tris-HCl, pH = 7,4) dialysiert. Befruchtete Eizellen aus FVB-Inzuchtmäusen (Taconic Farms, Inc., supra) wurden im einzelligen Stadium unter Verwendung von Standardverfahren mikroinjiziert. Vergl. Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY (1986). Die überlebenden Embryos wurden dann in die Eileiter von CD1-Pflegemütter (Charles River Laboratories, Inc., Willmington, MA) gemäß den Verfahren in Hogan et al. implantiert. Die transgenen Pflegemäuse wurden durch DNA-Tüpfelverfahren unter Verwendung von DNA identifziert, welche aus den einzelnen Mäuseschwänzen isoliert wurden sowie einer menschliche n Gastrin Exon 2-Probe, die mit 32 dCTP durch ungeordnetes Primern markiert war. Fh-Mäuse und ihre Geschwister wurden auf ähnliche Weise identifiziert.
Homozygote MT-42 Mäuse, welche das aus einem CD-1-Stamm der Maus (Jhappan, supra) abgeleitete MT-TGFα-Transgen enthielten, wurden mit heterozygoten INSGAS- Mäusen gekreuzt. Nach der Entwöhnung wurden die Nachkommen, wie kürzlich beschrieben, in angesäuerte 50 mM ZnCl&sub2; plaziert, um den Metallothionein-Promotor zu induzieren (Jhappan, supra).

Northern Blot Hybridiserungsversuch

Für die Northern-Analyse wurde die gesamte RNA aus den Geweben nach dem Verfahren von Cathala et al., DNA, 2: 329-335 (1983) extrahiert. 20 ug-Proben Gesamt-RNA wurden auf einem 1% Agarose-Gel wieder gelöst und auf Nitrocellulose transferiert. Die RNA-Blots wurden mit ³²P-makrierten TGFα-Riboproben oder Exon 2 von menschlichem Gastrin hybridisiert welche sich nicht mit dem endogenen mRNA-Gastrin der Maus kreuzweise hybridisieren.

Peptid-Radioimmunotest von Gasstrin

Gewebe wurden extrahiert und mithilfe des Radioimmunotests auf die Gastrin- Immunreaktivität, wie früher beschrieben, unter Verwendung von Antikörper 2604 untersucht, welcher für die biologische Aktivität von S-terminiertem, amidiertem Gastrin beim Gastrin-Radioimmunotest spezifisch ist, wie in Rehfeld, J. F., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 30: 361-368 (1972) beschrieben. Bei allen Versuchen wurde mit Iod einfach markiertes Tyrosin des menschlichen Gastrin 17 als Markierungssubstanz und synthetisches menschliches Gastrin 17 als Standard verwendet.

Peptid-Radioimmunotest von TGFα

Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff gefroren, mit Mörser und Pistill zu Pulver gemahlen und mit Säure-Ethanol extrahiert, wie in Todaro, G. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5258-5262 (1980) beschrieben. Die Extrakte wurden mit Wasser rekonstituiert und die Proteinkonzentrationen mit hilfe eines Coomassieblau-Farbstoffbindungsversuchs (Bio- Rad Laboratories, Hercules, CA) bestimmt. Mit gleichen Teilen von Pancreasen erfolgte eine Doppelprüfung mithilfe des TGFα-Radioimmunotest, welcher die Konkurrenzreaktion von ¹²&sup5;I TGFα bezüglich der Bindung an einen Festphasen-Kaninchen-Antikörper gegenüber dem C-Terminus von Ratten-TGFα (Kit von BioTope, Seattle, WA) misst.

Histologische Analyse

Die Pancreasen wurden entfernt, gewogen, in Kassetten ähnlich ausgerichtet, in Bouin-Flüssigkeit fixiert und nach herkömmlichen Verfahren in Paraffin eingebettet.

Gewebepräparation und Immunohistochemie

Frisch entfernte Pankreasen wurden seziert, von Fett und Lymphknoten befreit, in Bouin-Fixativ fixiert und dann zum Schneiden in Paraffin eingebettet. Routineschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardverfahren angefärbt. Pankreasgewebe von 17 Wochen alten transgenen MT-TGFα-Mäusen (MT-42) wurden auf Insulin immunologisch angefärbt, um die Wirkung der TGFα-Überexpression auf die Inselentwicklung zu untersuchen Insulin-positive Zellen in TGFα-induzierten metaplastischen Gängen wurden unter Verwendung von Immunperoxidasearifärbung mit anti-human-Insulinseren von Meerschweinchen (Linco, Eureka, MO) angefärbt und ein Meerschweinchenserum vor der Immunisierung wurde als Kontrolle verwendet. Die Immunohistochemie erfolgte an 5 u-Schnitten nach dem Peroxidase/Antiperoxidase-Verfahren von Sternberg unter Verwendung monoklonaler anti- Gastrin-Antikörper von Kaninchen. Vergl. Sternberger, L. A., Immunocytochemistry, 2. Ausg., NY, Wiley, S. 104-170.

Formmessung durch Punktauszählung

Das relative Volumen von Inseln, Gängen, oder interstitiellen Zellen wurde mithilfe des in Weibel, E. R., Lab. Investig., 12: 131-155 (1963) beschriebenen Punkteauszählungsverfahrens mengenmäßig bestimmt. Bei 400facher Vergrößerung wurde an einem beliebigen Punkt in einer Ecke des Schnittes begonnen und jedes andere Feld unter Verwendung eines 25 Punkt Okularrasters ausgezählt. Es erfolgte eine freie aber systematische Auswahl der Felder mithilfe der Markierungen der Mikrometereinteilung. Zwischenflächen in Form von Blutgefäßen, Fett, Gängen, Lymphknoten oder lobulären Räume wurden subtrahiert, um die Pankreasgesamtfläche zu erhalten. Es wurden mindestens 5000 Punkte in 108 Feldern (mithilfe der Mikrometereinteilung systematisch gewählt) in jedem Block gezählt, wobei das relative Volumen der Inseln gleich der Anzahl der Zwischenflächen zwischen dem Inselgewebe, dividiert durch die Anzahl der Flächen des Pankreasgewebes ist. Die absolute Inselmasse oder der Inseln wurde als relatives Inselvolumen mal dem Pankreasgewicht berechnet. Vergl. Lee, H. C. et 4, Endocrinology, 124: 1571-1575 (1989).

Statistische Analise

Unterschiede zwischen Mittelwerten wurden bei beträchtlichen Unterschieden mithilfe des Student t-Tests für ungepaarte Werte ausgeglichen.

Beispiel 1

Untersuchung der Insulinproduktion in der transgenen TGF-Pankreas

Die Anfärbung mit Immunoperoxidase zeigte zahlreiche angefärbte Insulinzellen in den metaplastischen Gängen aus der transgenen TGFα-Pankreas (Figur Al), wohingegen aus den nicht-transgenen Gängen antgefärbte Insulinzellen so gut wie fehlten (weniger als 6,1%). Wurden bei einer 400fachen Endvergrößerung mindestens 600 Gangzellen/Tier ausgezählt, wurden in den metaplastischen Gängen von transgenen TGFα-Mäusen Insulin-postive Zellen mit einer Häufigkeit von 6,0 + 0,9% beobachtet. Gelegentlich waren Gangzellen mit der gleichen Intensität wie die Insulin-farbenen Nachbarinseln gefärbt, zeigten jedoch meistens eine weniger intensive Farbe (Fig. 1B). Der niedrige Grad der Insulinanfärbung von Gangzellen erinnert an protodifferenzierte Zellen in den Gängen der sich entwickelnden Pankreas, über die berichtet wurde. Pictet, R. und W. J. Rutter, Development of the embryonic endocrine pancreas, in Endocrinology, Handbook of Physiology, Hrsg. R. O. Greep und E. B. Astwood, 1972, American Physiological Society, Washington D. C., S. 25-66 und Alpert, S. et al., Cell, 53: 295-308 (1988).
Trotz der Insulin-positiven Zellen in den metaplastischen Gängen war jedoch die Inselmasse bei transgenen TGFα-Mäusen nicht erhöht. Die durch punktweise Auszählung der Formmessung mengenmäßig bestimmte Inselmasse betrug in der transgenen TGFα-Pankreas 2,14 ± 0,84 mg (Mittel ± se, n = 5) verglichen mit 1,93 ± 0,46 mg (n = 6) bei den nicht- transgenen Tieren aus dem Wurf
Eine Erklärung für diese Befunde besteht darin, dass eine TGFα-Überexpression eine Vermehrung von protodifferenzierten Vorläufern verursacht, jedoch die Umwandlung dieser protodifferenzierten Zellen zu differenzierten Inseln nicht allein bewirken kann, und die Differenzierung von anderen, in cLer ausgewachsenen Pankreas nicht vorhandenen Faktoren gesteuert wird.

Beispiel 2

Expression von Pankreas-Gastrin aus INSGAS-Transgenen

Um die mögliche Rolle von Gastrin bei der Steuerung der Differenzierung der Inseln zu untersuchen, wurden transgene Mäuse erzeugt, welche ein chimärisches Transgen des Insulin Promotor-Gastrins (INS GAS) auspressen, in dem der Insulin-Promotor die pankreasspezifische Auspressung des transgenen Gastrins steuert (Fig. 2A). Im Gegensatz zum Gastrin-Gen hört die Expression des Insulin-Gens nach der Geburt nicht auf. Folglich beruht das INSGAS-Transgen auf einer anhaltenden Gastrinexpression in der ausgewachsenen Pankreas.
Das INSGAS-Transgen umfasst 370 bp der 5'-flankierten DNA und das erste, nicht- kodierende Exon des Insluin I-Gens der Ratte. Cordell, B. et al., Cell, 18: 533-543 (1979). Es war an ein Bam HI-EcoRI-Fragment gebunden, das 1,5 kb Intron 1 und die Exons 2 und 3 des menschlichen Gastrin-Gens enthält, welches den pre-pro-Gastrin-Peptidvorläufer enkodiert. Wiborg, O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4662-4666 (1984). Es wurde ein 4,8 kb INSGAS-Fragment isoliert und in einzellige Mäuseembryos von Inzucht-FVBs mikroinjiziert. Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, 1986, NY, Cold Spring Harbor.
Die Gastrin-Immunreaktivität in Pankreas- und Magenextrakten von transgenen und nicht-transgenen Mäusen wurde mithilfe des Radioimmunotests unter Verwendung von Antiseren 2604 (Rehfeld, J. et aL, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 30: 361-368 (1972)) untersucht, die für den bioaktiven amidierten C-Terminus des Gastrins spezifisch sind.
Die beta-Zell-spezifische Gastrinexpression aus dem INSGAS-Transgen wurde anhand der Immunanfärbung von Pankreasgewebe mit einem monoklonalen Gastrin- Antikörper untersucht.
Northern Blots von RNA, welche aus unterschiedlichen Geweben 8 Wochen alter transgener 1NSGAS-Mäuse isoliert wurden, wurden mit einer Probe von menschlichem Gastrin Exon 2 hybridisiert. Es wurden hohe Konzentrationen an transgener Gastrin mRNA in der Pankreas beobachtet, aber h keinem anderen Gewebe. Diese Prüfung ist für das menschliche Gastrin-Gen spezifisch; Bei der antralen RNA von INSGAS wird keine Hybridisierung beobachtet und nicht-transgene FVB-Mäuse pressen hohe Konzentrationen an mRNA-Gastrin der Maus aus. Der Radioimmunotest von Pankreasextrakten aus transgenen INSGAS-Mäusen zeigt hohe Konzentrationen an Gastrin-Immunreaktivität an, welche den Gastringehalt in der Magenhöhle aus dem endogenen Maus-Gen übersteigt (Fig. 2B). In Pankreasextrakten von nicht-transgenen Kontrollmäusen wurde keine Immunreaktivität festgestellt. Der Radioimmunotest von Gastrin ist für carboxy-amidierte Vorläufer spezifisch, und zeigt an, dass der Gastrin-Peptidvorläufer nach der Übertragung wirksam in ein bioakives Peptid übergeführt wird. Die Immunohistochemie mit einem monoklonalen Antikörper zeigt eine für beta-Inselzellen der Pahkreas spezifische Expression von Gastrin (Fig. 2C).
Obwohl die transgenen INSGAS-Mäuse eine hohe Gastrinexpression in der Pankreas nach der Geburt aufwiesen (Fig. 2B), besaßen die transgenen INSGAS-Mäuse eine mit den Kontrollen identische Histologie. Die durch punktweise Auszählung der Formmessung (Weibel, E. R, Lab. Investig., 12: 131-155 (1963) quantitativ bestimmte Masse der Inseln war In 5-6 Wochen alten INSGAS-Mäusen (1,78 ± 0,21 mg, n = 1 l) und nicht-transgenen Kontrollen unterschiedlichen Alters (1,74 ± 0,19 mg, n = 1 l) identisch. Folglich stimuliert die verlängerte Freisetzung von Gastrin in der Pankreas nach der Geburt das Wachstum der Inselzellen nicht allein.

Beispiel 3

Histologische Untersuchung der TGFα- und TGFα/INSGAS-Pankreas

Die Stimulierung des Inselwachstums durch Gastrin kann die Stimulierung durch andere Wachstumsfaktoren erfordern, um eine reaktionsfähige Zellpopulation zu erzeugen. Es wurde daher die Wirkung der Gastrinstimulierung in transgenen Mäusen untersucht, welche metaplastische Gänge besitzen, die Insulin auspressende Zellen enthalten, welche protodifferenzierten Inselvorläufern ähnlich scheinen. Um die Wechselwirkung zwischen Gastrin und TGFα zu untersuchen wurden drei Gruppen von Mäusen mit gleichwertiger genetischen FVB/CD1-Abstammung gezüchtet: nicht-transgene Kontrollen, einfach transgene TGFα und doppelt transgene INSGAS/TGFα. Alle drei Gruppen von Mäusen wurden im Alter von 3 Wochen auf 50 mM ZnCl&sub2; gesetzt. Die Tiere wurden im Alter von 17 Wochen getötet und die Pankreas für die histologische Untersuchung entfernt. Die Pankreasen der TGFα- und INSGAS/TGFα-Mäuse wiesen eine ähnliche makroskopische Oberflächenbeschaffenheit auf elastisch, fest und kompakt, im Gegensatz zu den weichen, schwammigen Pankreasen der Kontrollen. Die TGFα-Expressicn war in den TGFα- und INSGAS/TGFα-Gruppen äquivalent, wenn sie mittels der Northern Blot Analyse (Werte nicht angegeben) und des Radioimmunotests gemessen wurden. Die Konzentrationen immunreaktiver TGFα-Pankreaspeptide betrugen 12,2 ± 1 und 18,9 ± 8 ng/mg Protein (Mittelwert ± SD) in TGFα- bzw. INSGAS/TGFα-Mäusen.
Es wurden lichtmikroskopische Aufrahmen von mit Hämatoxylin angefärbten Parat finschnitten der Pankreas von den drei untersuchten Gruppen von Mäusen gemacht; (A: INSGAS/TGFα; B: FVB/CD1-:Kontrollen; und C: TGFα). Die INSGASITGFα-Pankreas wies einige Bereiche mit erhöhten Gangkomplexen und eine leicht erhöhte interstitielle Zellularlität auf; Der dargestellte Bereich (Fig. 3A) wies die am stärksten anormale Morphologie bei den fünf Tieren beobachtete Tieren auf. Die meisten Pankreasen konnten von den Kontrollen nicht unterschieden werden (Fig. 3B). Im Gegensatz dazu war der Bereich der TGFα-Pankreasen (Fig. 3C) typisch und wies die von Jhappan et al., supra, beschriebenen, mit Gewebsumbildung in den Gängen verbundene interstitielle Zellularität und das Bindegewebswachstum auf.
Pankreas-Gastrin wirkt mit TGFα synergistisch, um die Inselmasse zu erhöhen und die durch Überexpression von TGFα induzierte Gewebsumbildung in den Gängen zu inhibieren. Die Kreuzung von homozygoten MT-TGFα-Mäusen (MT-42) (TGFα) mit heterozygoten INSGAS-Mäusen lieferte Junge, die entweder einfach transgen heterozygot TGFα oder doppelt transgen waren und sowohl INSGAS- als auch TGFα-Transgene enthielten (INSGAS/TGFα). Nachdem INSGAS ein FVB-Staxnm und TGFα ein CD1-Stamm war, wurden sowohl TGFα-Homozygoten als auch CD1-Kontrollen (CON) mit FVB gekreuzt, um für alle drei Gruppen von Mäusen einen FVB/CDl-Stamm als Basis zu erzeugen. Die Mäuse wurden von der 3. Woche an bis zu ihrer Tötung im Alter von 17 Wochen mit 50 mM ZnCl&sub2; behandelt. Die Pankreas wurde entfernt, gewogen, in Kassetten ähnlich ausgerichtet, mit Bouin's Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet. Von jedem Tier wurde ein wahllos ausgewählter Schnitt verwendet, um die relativen Volumina der Gänge und Inseln durch punktweise Auszählung der Formmessung quantitativ zu bestimmen (Weibel, E. R., Lab. Investig., 12: 131-155 (1963). Es wurden mindestens 2000 Punkte auf dem Gewebe abschnittsweise mit einen 50-Punkt Raster bei 170facher Vergrößerung ausgezählt; der gesamte Schnitt wurde ohne Überschneidung abgedeckt. Die Masse der Gänge und Inseln wurde durch Multiplikation des relativen Volumens mit dem Körpergewicht des Tiers berechnet. Zur Mittelwertbildung des durchschnittlichen Körpergewichts der Tiere wurde die Masse in ug/g Körpergewicht ausgedrückt. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte und Standardabweichungen für 5-6 Tiere pro Gruppe. * P < 0,05 (Student's t Test für ungepaarte Werte).
Die Expression von Gastrin aus dem INSGAS-Transgen verminderte die durch die TGFα-Überexpression verursachte Gewebsumbildung in den Gängen. In der 17. Woche ähnelte die Histology der Pankreas bei den INSGAS/TGFα-Mäusen (Fig. 3A) derjenigen der Pankreas bei den Kontrollen (Fig. 3B) stärker als derjenigen der TGFα-Mäuse (Fig. 3C). Dies wurde durch die quantitative Bestimmung der Pankreasmasse in den Gängen der TGFα- und der transgenen INSGAS/TGFα-Mäuse sowie den FVB1/CD1-Kontrollen durch punktweise Auszählung der Formmessung (Fig. 4A) bestätigt. Die gemeinsame Expression von Gastrin und TGFα in der INSGAS/TGFα-Pankreas erhöhte zudem die Inselmasse, verglichen mit den Kontrollen (Fig. 4B) beträchtlich, wohingegen die Masse durch Expression von TGFα- oder Gastrin-Transgenen allein nicht erhöht wurde. Die Glucosekonzentration im Blut unterschied sich zwischen den drei Gruppen von Mäusen nicht wesentlich.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend einen Peptidliganden bzw. ein Ligandenpeptid des Gastrin/CCK-Rezeptors und einen Peptidliganden bzw. ein Ligandenpeptid des EGF- Rezeptors, für die Verwendung in einem Behandlungsverfahren für Diabetes mellitus.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Peptidligand des Gastrin/CCK- Rezeptors ein Gastrin ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Gastrin Gastrin 8, 17 oder 34 ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Ligand des Gastrin/CCK-Rezeptors Cholezystokinin ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das Cholezystokinin CCK 8, 12, 22, 23 oder 58 ist.

6. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Ligand des EGF-Rezeptors TGFα ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Peptidligand des EGF-Rezeptors Amphiregulin oder der Pockenviruswachstumsfaktor ist.

8. Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des insulinabhängigen Diabetes mellitus.

9. Ex-vivo-Verfahren zur Bewirkung der Differenzierung von Pankreas-Inselvorläuferzellen eines Säugers zu reifen, Insulin sekretisierende Zellen, welches das Stimulieren solcher Zellen mit der Kombination aus einem Peptidliganden bzw. einem Ligandenpeptid des Gastrin/CCK-Rezeptors und einen Peptidliganden bzw. einem Ligandenpeptid des EGF-Rezeptors umfasst.

10. Zusammensetzung, umfassend einen Peptidliganden bzw. ein Ligadenpeptid des Gastrin/CCK-Rezeptors wird einen Peptidliganden bzw. ein Ligandenpeptid des EGF- Rezeptors, für die Verwendung in einem Verfahren zum Bewirken der Differenzierung von Pankreas-Inselvorläuferzellen eines Säugers zu reifen, Insulin sekretisierenden Zellen.