DE69737816T2

DE69737816T2 - Darmprotein mit dreiblättriger struktur

Info

Publication number: DE69737816T2
Application number: DE69737816T
Authority: DE
Inventors: Daniel K. Wellesley Hills PODOLSKY
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2017-04-12
Also published as: DE69737816D1; AU729564B2; EP1875922A3; US20100184657A1; ES2287952T3; WO1997038712A1; JP2009149687A; ATE364394T1; DK0954330T3; US20030225250A1; BR9710654A; EP0954330A1; JP2008037866A; EP0954330B1; EP1875922A2; PT954330E; AU2726897A; US20020052483A1; JP2000508900A; EP0954330A4

Description

Hintergrund
Das Gebiet der Erfindung betrifft Peptide, welche für die Diagnose, Vorbeugung oder die Behandlung von Wunden nützlich sind, einschließlich solcher, die mit einer gastrointestinalen Funktionsstörung in Zusammenhang stehen.
Jørgensen et al. (Regulatory Peptides 3:231, 1982) beschreiben ein Schweinepankreaspeptid, ein spasmolytisches Pankreaspeptid (PSP). Für PSP wurde gefunden dass es die „gastrointestinale Beweglichkeit und Magensäuresekretion nach parenteraler sowie oraler Verabreichung in einem Versuchstier" inhibiert. Es wurde vorgeschlagen, dass, „wenn die Ergebnisse in Tierversuchen im Mensch bestätigt werden können, könnte PSP einen möglichen Nutzen für die Behandlung gastroduodenaler Ulkuskrankheiten aufweisen".
WO 92/14837 offenbart einen intestinalen Kleeblattfaktor für die Behandlung und Diagnose des Verdauungssystems und für den Schutz des Darmtraktes vor einer durch eine bakterielle Infektion oder Bestrahlung verursachten Verletzung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt die Verwendung eines Polypeptids umfassend einen intestinalen Kleeblattfaktor zur Herstellung eines Medikamentes bereit, um die Bildung einer Läsion der Haut, einer Läsion der Hornhautoberfläche des Auges, einer Läsion der Atemwege oder einer Läsion des Urogenitaltraktes in einem Patienten zu behandeln oder zu hemmen, wobei der besagte intestinale Kleeblattfaktor mindestens 90% Sequenzidentität zu der SEQ ID NO: 18 über mindestens 35 zusammenhängende Aminosäurereste aufweist. Weitere Ausführungsformen werden in den Ansprüchen definiert.
Mit „intestinalem Kleeblattfaktor" („ITF") ist ein Protein gemeint, das zu Ratten-intestinalem Kleeblattfaktor im Wesentlichen homolog ist (2; SEQ ID NO: 2) und welches in dem Dickdarm, Dünndarm oder Kolon in größerem Umfang exprimiert wird, als es in anderen Geweben als im Dünndarm, Dickdarm oder Kolon exprimiert wird. Auch umfasst sind: allelische Änderungen; natürliche Mutanten; erzeugte Mutanten; Proteine, die durch DNA kodiert werden, die unter hoch- oder niedrig stringenten Bedingungen an ITF kodierende Nukleinsäuren hybridisieren, die aus natürlich vorkommendem Material gewonnen wurden; und Polypeptide oder Proteine, die mit Antiseren gegen ITF gewonnen werden, insbesondere durch Antiseren gegen die aktive Stelle oder Bindedomäne des ITFs. Der Begriff umfasst auch andere chimäre Polypeptide, die ein ITF umfassen.
Der Begriff ITF umfasst auch Analoga natürlich vorkommender ITF-Polypeptide. Analoga können sich auch von natürlich vorkommendem ITF durch Aminosäuresequenzunterschiede oder Veränderungen, welche die Sequenz nicht betreffen, oder durch beides unterscheiden. Analoga der Erfindung werden im Allgemeinen mindestens 90% und am meisten bevorzugt 95% oder sogar 99% Homologie mit allen oder einem Teil der natürlich vorkommenden ITF-Sequenz aufweisen. Die Länge der Vergleichssequenzen wird im Allgemeinen mehr als 35 Aminosäurereste umfassen. Änderungen umfassen in vivo oder in vitro chemische Derivatbildung der Polypeptide, z. B. Acetylierung oder Carboxylierung. Auch umfasst sind Veränderungen der Glykosylierung, z. B. solche, die aus einer Veränderung der Glykosylierungsmuster eines Polypeptids während seiner Synthese und Prozessierung oder aus weiteren Prozessierungsschritten hervorgehen, z. B. indem das Polypeptid Glykosylierung bewirkenden Enzymen ausgesetzt wird, die von Zellen abstammen, welche normalerweise solch eine Prozessierung zur Verfügung stellen, z. B., Säugetierglykosylierungsenzyme. Auch umfasst sind Varianten derselben primären Aminosäuresequenz, die phosphorylierte Aminosäurereste, z. B. Phosphortyrosin, Phosphorserin oder Phosphorthreonin aufweisen. Analoga können sich von natürlich vorkommendem ITF durch Veränderungen ihrer Primärsequenz unterscheiden. Diese umfassen genetische Varianten, sowohl natürliche als auch erzeugte. Erzeugte Mutanten können durch verschiedene Techniken, einschließlich zufälliger Mutagenese der kodierenden Nukleinsäuren unter Verwendung von Bestrahlung oder Einwirkung von Ethanmethylsulfat (EMS) abgeleitet werden oder können Veränderungen enthalten, die durch ortspezifische Mutagenese oder durch andere molekularbiologische Techniken erzeugt wurden. Siehe, Sambrook, Fritsch und Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe), CSH Press, Cold Spring Harbor, New York). Auch umfasst sind Analoga, die andere Reste als die natürlich vorkommenden L-Aminosäuren umfassen, z. B. D-Aminosäuren oder nicht natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren, z. B. β- oder γ-Aminosäuren.
Ein ITF-Polypeptid oder Analogon ist biologisch aktiv, wenn es eine biologische Aktivität eines natürlich vorkommenden ITFs aufweist, z. B. die Fähigkeit, gastrointestinale Beweglichkeit in einem Säugetier zu verändern. Die Bezeichnung „im Wesentlichen rein", wie sie hierin verwendet wird, beschreibt einen Stoff, z. B. eine Nukleinsäure, ein Protein, oder ein Polypeptid, z. B. ein ITF-Protein oder Polypeptid, das von Bestandteilen, die es normalerweise begleiten, im Wesentlichen frei ist. Typischerweise ist ein Stoff im Wesentlichen rein, wenn er mindestens 60%, mehr bevorzugt mindestens 75%, mehr bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 99% des gesamten Materials (nach Volumen, Nass- oder Trockengewicht oder nach Mol-% oder Mol-Anteilen) in einer Probe den interessierenden Stoff darstellt. Die Reinheit kann mit jedem angemessenen Verfahren gemessen werden, z. B. in dem Fall von Polypeptiden durch Säulenchromatographie, Polyacrylamidgelelektrophorese oder HPLC-Analyse.
Mit „isolierter DNA" wird DNA gemeint, die von Genen frei ist, welche in dem natürlich vorkommenden Genom des Organismuses, von welchem die bestimmte DNA abstammt, an die DNA angrenzen. Der Begriff „isolierte DNA" umfasst deshalb z. B. cDNA, klonierte genomische DNA und synthetische DNA. Eine „gereinigte Nukleinsäure", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die im Wesentlichen frei von anderen Makromolekülen (z. B. andere Nukleinsäuren und Proteinen) ist, mit denen es auf natürliche Weise innerhalb einer Zelle vorkommt. In bevorzugten Ausführungsformen besteht weniger als 40% (und noch bevorzugter weniger als 25%) des gereinigten Nukleinsäurepräparats aus solch anderen Makromolekülen.
„Homolog", wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Untereinheitsequenzähnlichkeit zwischen zwei polymeren Molekülen, z. B. zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen, z. B. zwei DNA-Molekülen, oder zwei Polypeptidmolekülen. Wenn eine Untereinheitsposition in beiden Molekülen durch dieselbe monomere Untereinheit belegt wird, z. B. wenn eine Position in jedem der zwei DNA-Moleküle durch Adenin belegt ist, dann sind diese an dieser Position homolog. Die Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine direkte Funktion der Anzahl übereinstimmender oder homologer Positionen, z. B. wenn die Hälfte, z. B. 5 von 10, der Positionen in zwei Stoffsequenzen homolog sind, dann sind diese zwei Sequenzen 50% homolog; wenn 90% der Stellen, z. B. 9 von 10 übereinstimmen oder homolog sind, teilen die zwei Sequenzen 90% Homologie. Als Beispiel teilen die DNA-Sequenzen 5'-ATTGCC-3' und 5'-TATGCC-3' 50% Homologie. Mit „im Wesentlichen homolog" wird größtenteils aber nicht gänzlich homolog gemeint.
Die gemäß der Erfindung verwendbaren ITF-Proteine sind gegen die Zerstörung in dem Verdauungstrakt resistent.
Im Allgemeinen können Kleeblattproteine, umfassend ITF, entweder zur Behandlung oder zur Hemmung der Bildung von Läsionen der äußeren Oberfläche der Haut der Hornhautoberfläche des Auges und der Atemwege und des Urogenitaltraktes verwendet werden.
Zusätzliche Gewebe, die durch ein ITF geschützt oder behandelt werden können, umfassen die, die oben aufgeführt sind, die außerhalb des Verdauungstrakts liegen.
Der Begriff „identisch", wie er hierin in Bezug auf Polypeptide oder DNA-Sequenzen verwendet wird, bezieht sich auf die Untereinheitsequenzidentität zwischen zwei Molekülen. In dem Fall von Aminosäuresequenzen, die zu einer Bezugssequenz weniger als 100% identisch sind, stellen die nicht identischen Positionen vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, konservative Austausche für die Bezugsequenz dar. Konservative Austausche umfassen typischerweise Austausche innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Die Sequenzidentität wird typischerweise unter Verwendung von Sequenzanalysesoftware wie z. B. das Sequenzanalysesoftwarepaket der Genetics Computer Group an der Universität von Wisconsin (Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705), und der darin angegebenen, voreingestellten Parameter gemessen.
Gewebe, die, wie oben aufgeführt, außerhalb des Verdauungstraktes liegen, können auch behandelt werden, indem dem Patienten mindestens ein Kleeblattpeptid verabreicht wird, falls solche Gewebe durch eine Läsion beschädigt sind oder gefährdet sind, auf die Art verletzt zu werden (d.h. die Methode kann prophylaktisch ausgeführt werden).
Das Peptid, das verabreicht wird, stellt intestinales Kleeblattpeptid (ITF) dar. Zur Behandlung menschlicher Patienten wird es erwartet, dass das Peptid durch ein humanes Gen exprimiert wird. Es wird erwartet, dass der normale Weg der Verabreichung oral sein wird. Andere Verabreichungswege und die wirksame Dosis zu ermitteln, befindet sich leicht innerhalb der Fähigkeiten eines durchschnittlichen Fachmanns, und wird von vielen Faktoren abhangen, die diesen Fachmännern bekannt sind. Die Kleeblattproteine können einzeln, in Verbindung miteinander und/oder in Kombination mit Mucinglykoproteinzubereitungen verabreicht werden. Eine „Behandlung von Läsionen" umfasst sowohl die Hemmung der Bildung einer Läsion als auch die Heilung schon bestehender Läsionen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Abbildung der Nukleotidsequenz des Rattenkleeblattfaktors (SEQ ID NO: 1).
2 ist eine Abbildung der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Rattenkleeblattfaktors (SEQ ID NO: 2).
3 ist eine Abbildung der Aminosäuresequenzen des Rattenkleeblattfaktors, pS2-Proteins, und des Pankreas-spasmolytischen Polypeptids (PSP). Die Sequenzen sind abgeglichen, um die Aminosäuresequenz-Homologie zwischen den Proteinen darzustellen. Gedankenstriche (-) bezeichnen die Einfügung von Zwischenräumen, die den Abgleich verbessern. Balken bezeichnen Sequenzidentität.
4 stellt die Disulfidbindungsstruktur, welche für pS2 vorgeschlagen wird (SEQ ID NO: 15; Panel A) und PSP (SEQ ID NO: 16, Panel B) dar.
5 ist eine Darstellung der vorgeschlagenen Disulfidbrückenstruktur des rattenintestinalen Kleeblattfaktors (SEQ ID NO: 17).
6 ist eine Darstellung der Nukleotidsequenz der humanen intestinalen Kleeblattfaktor-cDNA und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 3).
7 ist ein Diagramm, welches die Strategie beschreibt, die verwendet wurde, um das ITF-Gen in embryonalen Stammzellen zu mutieren.
8 ist ein Diagramm, das das Überleben nach einer Verabreichung von Dextransulfatnatrium (DSS; 2,5% w/v in Trinkwasser für 9 aufeinander folgende Tage) gezeigt als Kaplan-Meier-Transformation der Wahrscheinlichkeit versus Tage der DSS-Behandlung darstellt.
Ausführliche Beschreibung
Aufreinigung und Klonierung der rITF
Ein Hemmstoff der Softagarkoloniebildung von aus humanen Brustkrebs stammenden BT-20-Zellen (ATTC HTB79) wurde aus Zytologie-positiven humanen bösartigen Ergüssen (Podolsky et al., Cancer Res. 48:418, 1988) isoliert. Der Faktor inhibierte auch Softagarkoloniebildung von aus humanem Kolonkarzinom stammenden HOT 15-Zellen (ATTC-CCL225). Bei Polyoma und Maussarcomavirus transformierten Nagerfibroblastenlinien wurde eine Hemmung nicht beobachtet. Der isolierte Faktor (transformierter Zellwachstums-hemmender Faktor oder TGIF) wies ein scheinbares Molekulargewicht von 110,000 Da auf und schien zwei 55,000 Da Untereinheiten, welche durch Sulfhydrylbindungen verknüpft sind, zu umfassen.
Das aufgereinigte Protein wurde teilweise sequenziert. Die Sequenz der aminoterminalen 14 Aminosäuren wurde verwendet, um einen Satz degenerierter Oligonukleotidproben für das Screenen einer rattenintestinalen Epithelzell-cDNA-Bibliothek zu erzeugen.
Eine rattenintestinale cDNA-Bibliothek (Lambda ZAP° II, Stratagene, La Jolla, CA) wurde mit üblichen Techniken (Ausubel et al., Hrsg., In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989) unter Verwendung von Zellen, welche nach einem Verfahren von Weisner (J. Biol. Chem. 248:2536, 1973) aufgereinigt wurden, hergestellt. Das Screenen der cDNA-Bibliothek mit der oben beschriebenen, völlig degenerierten Oligonukleotidsonde führte zu der Auswahl von 21 Klonen. Einer der Klone (T3411) umfasste eine Kernsequenz, die für einen einzelnen offenen Leserahmen kodierte. Die Nukleotidsequenz des offenen Leserahmens und der angrenzenden DNA ist in 1 (SEQ ID NO: 1) dargestellt. Das Insert, welches in T3411 anwesend ist, wurde Nick-translatiert (Ausubel et al., supra), um eine radioaktiv markierte Sonde für eine Northern Blot-Analyse von Rattenpoly(A)⁺-RNA herzustellen. Die Northern Analyse zeigte, dass RNA die dem klonierten cDNA-Fragment entspricht, im Dünndarm, im Dickdarm und Niere exprimiert wird; keine Expression wurde in der Lunge, Milz, Herz, Hoden, Muskel, Magen, Pankreas oder Leber nachgewiesen. In den Geweben, in welchen die RNA exprimiert war, war das Niveau vergleichbar mit dem von Aktin.
Der offene Leserahmen des Klons T3411 kodierte ein 81 Aminosäurenpeptid (2; SEQ ID NO: 2). Ein Vergleich der Sequenz des kodierten Peptids, genannt rattenintestinaler Kleeblattfaktor (rITF), mit der Sequenz der Proteine in der GenBank-Datenbank offenbarte eine wesentliche Homologie zu dem humanen Brustkrebsassoziierten Peptid (pS2; Jakowlev et al., Nucleic Acids Res. 12:2861, 1984) und dem Schweinepankreas-spasmolytischen Peptid (PSP; Thim et al., Biochem. Biophys. Acta. 827:410, 1985). Die 3 stellt die Homologie zwischen rITF, PSP und pS2 dar. Von sowohl Schweinepankreas-spasmolytischem Faktor (PSP) als auch von pS2 wird angenommen, dass sie sich in eine charakteristische Struktur, genannt Kleeblatt, falten. Eine Kleeblattstruktur besteht aus drei Schleifen, welche durch drei Disulfidbrücken gebildet werden. Man denkt, dass pS2 ein Kleeblatt umfasst (4A) und man denkt, dass PSP zwei Kleeblätter umfasst (4B). Die Region des rITF (Nukleotid 114 bis Nukleotid 230, welche cys bis phe kodieren), die zu PSP und pS2 höchst ähnlich ist, umfasst sechs Cysteine, die insgesamt an der gleichen Stelle liegen wie die Cysteine, die das Kleeblatt in pS2 bilden (3). Fünf dieser sechs Cysteine befinden sich an der gleichen Stelle wie die Cysteine, die das aminoterminale Kleeblatt des PSPs (3) bilden. 5 stellt die vorgeschlagene Disulfidbrückenkonfiguration des rITF dar.
Basierend auf der Homologie zu PSP und pS2 (Mori et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 155:366, 1988; Jakowlev et al., Nucleic Acids Res. 12:2861, 1984) umfasst rITF eine mutmaßliche Prosequenz (Met1 bis Ala22), in welcher 12 der 22 Aminosäuren hydrophobe Seitenketten aufweisen.
Herstellung von Anti-rITF-Antikörpern
Ein Peptid, das den carboxyterminalen 21 Aminosäuren des rITFs entspricht, wurde synthetisiert und mit Rinderserumalbumin (BSA) verbunden. Dieses Konjugat (und das nicht-konjugierte Peptid) wurde verwendet, um in Kaninchen polyklonale Antikörper zu erzeugen. Alle Verfahren stellten Standardprotokolle wie z. B. solche, die in Ausubel et al. (supra) beschrieben sind, dar. Die Anti-rITF-Antikörper wurden in einem indirekten Immunfluoreszenzassay zur Sichtbarmachung von rITF in Rattengeweben verwendet. Cryoschnitte von Rattengeweben wurden unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt und ein Fluorescein-markierter, Ziege-anti-Kaninchen monoklonaler Antikörper (markierte Antikörper sind von solchen Anbietern erhältlich wie Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersberg, MD; und Bioproducts for Science, Inc., Indianapolis, IN) wurde verwendet, um die Bindung der Kaninchen-Anti-rITF-Antikörper nachzuweisen. Nach dieser Analyse scheint rITF in den Becherzellen des Dünndarms aber nicht im Magen oder der Bauchspeicheldrüse vorhanden zu sein.
Klonierung des humanen intestinalen Kleeblattfaktors
DNA, welche für den rattenintestinalen Kleeblattfaktor kodiert, kann verwendet werden, um einen cDNA-Klon, der für den humanen intestinalen Kleeblattfaktor (hITF) kodiert, zu ermitteln. Dies kann durch ein Screenen der humanen Kolon-cDNA-Bibliothek mit einer Sonde, die von rITF stammt, oder mit einer Sonde, die von einem Teil des hITF-Gens stammt, erreicht werden. Die letztere Sonde kann aus einer humanen Kolon- oder intestinalen cDNA unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion um einen Teil des hITF-Gens zu isolieren, erhalten werden. Diese Sonde kann dann als spezifische Sonde zur Erkennung von Klonen dienen, die für das gesamte hITF-Gen kodieren.
Herstellung einer cDNA-Bibliothek
Eine humane Kolon- oder intestinale cDNA-Bibliothek in λgt10 oder λgt11 oder einem anderen geeigneten Vektor ist für die Isolierung von hITF nützlich. Solche Bibliotheken können gekauft werden (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA: HLI034a, HLI0346b). Andernfalls kann eine Bibliothek unter Verwendung von Schleimhautabschabungen von humanem Kolon oder Darm hergestellt werden. In Kürze, Gesamt-RNA wird aus dem Gewebe im Wesentlichen wie von Chirgwin et al. beschrieben (Biochemistry 18:5294, 1979; siehe auch Ausubel et al., supra) gewonnen. Eine Oligo (dT)-Säule wird dann verwendet, um Poly(A)⁺-RNA nach dem Verfahren von Aviv et al. (J. Mol. Biol. 134:743, 1972; siehe auch Ausubel et al., supra) zu isolieren. Doppelstrang-cDNA wird dann durch reverse Transkription unter Verwendung von Oligo (dT)_12-18 oder zufälligen Hexamer-Primern (oder beidem) hergestellt. RNase H und E. coli-DNA-polI werden dann verwendet, um den RNA-Strang mit einem zweiten DNA-Strang zu ersetzen. In einem anschließenden Schritt werden E. coli-DNA-Ligase und T4-DNA-Polymerase verwendet, um Lücken in dem zweiten DNA-Strang zu schließen und stumpfe Enden zu erzeugen. Im Allgemeinen wird die erzeugte cDNA als nächstes mit EcoRI-Methylase methyliert und es werden EcoRI-Linker hinzugefügt (andere Linker können abhängig von dem verwendeten Vektor verwendet werden). In nachfolgenden Schritten werden die überschüssigen Linker durch Restriktionsverdau entfernt und die cDNA-Fragmente werden in den gewünschten Vektor eingesetzt. Siehe Ausubel et al., supra und Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1990) für detaillierte Protokolle.
Nützliche Vektoren umfassen: λgt11, λgt10, Lambda ZAP^® II-Vektor, Lambda Uni-ZAP^TM XR-Vektor, alle verfügbar von Stratagene (La Jolla, CA).
Die cDNA-Bibliothek muss in Phagen verpackt werden; dies ist am leichtesten durch die Verwendung eines kommerziellen in vitro-Verpackungskits, z. B. Gigapack^® II Gold oder Gigapack^® II Plus (Stratagene, La Jolla, CA) zu erreichen. Siehe Ausubel et al. (supra) für Verpackungsprotokolle und geeignete Wirtsstämme. Die Bibliothek wird vorzugsweise bald nach der Verpackung vervielfältigt; dieser Schritt erzeugt ausreichend Klone für mehrfaches Screenen der Bibliothek. Siehe Ausubel et al., supra oder Sambrook et al., supra für Einzelheiten der Vervielfältigungsprotokolle und Verfahren für das Lager der Vervielfältigten Bibliothek.
Screenen der cDNA-Bibliothek
Um die Bibliothek zu screenen, muss sie in einen geeigneten Wirtsstamm (z. B. Y1090 oder Y1088 für λgt10-Bibliotheken, C600hf1A für λgt10-Bibliotheken) untergebracht werden. Nach dem Ausplattieren des Phagen werden Plaques auf Nitrocellulose oder Nylonfilter überführt (siehe Ausubel et al., supra und Sambrook et al., supra). Die Filter werden dann mit einer α³²-P-markierten Nick-translatierten Sonde, die von rITF abgeleitet ist, untersucht. Die Sonde wird vorzugsweise unter Verwendung eines Teils der rITF-DNA-Region, die für die Kleeblattstruktur (Nukleotide 114 bis 230 der SEQ ID NO: 1, welche für Cys32 bis Phe71 der SEQ ID NO: 2 kodieren) kodiert, hergestellt. Diese Region ist zwischen rITF, pS2 und PSP konserviert und es ist wahrscheinlich, dass diese Region zwischen rITF und hITF konserviert ist. Sobald ein Plaque identifiziert wurde, sind mehrere Zyklen der Plaque-Aufreinigung nötig, um einen reinen Klon, der für hITF kodiert, zu isolieren. Eine Phagen-DNA-Isolierung wird durchgeführt und das cDNA-Insert kann in einen geeigneten Vektor für eine Restriktionskartierung und Sequenzierung subkloniert werden. Wenn der Phagenvektor Lambda ZAP^® II ist, ermöglicht eine Koinfektion mit einem Helferphagen die Rettung und Rezirkularisierung des pBluescript SK-Phagemid-Vektors (Stratagene, La Jolla, CA), der die cDNA beherbergt; alternativ wird der Phagenklon aufgereinigt und das cDNA-Insert wird in einen geeigneten Vektor, der für eine Restriktionskartierung und Sequenzierung geeignet ist, subkloniert. Wenn der Klon nicht das gesamte hITF-Gen (festgestellt durch die Homologie zu rITF und das Vorhandensein von Start- und Stoppcodons) umfasst, kann die Bibliothek mit der ursprünglichen rITF-Sonde oder, vorzugsweise mit einer Sonde, die von dem hITF Klon erzeugt wurde, erneut gescreent werden. Wenn keiner der Klone das intakte Gen enthält, kann es aus Klonen, die sich überlappende Fragmente des hITFs tragen, wieder hergestellt werden.
Unmittelbare Isolierung einer hITF-Sonde mittels PCR
Es ist möglich, einen Teil des hITF-Gens direkt aus der verpackten Bibliothek oder cDNA zu isolieren. Um einen Teil des hITFs unmittelbar aus der verpackten Bibliothek zu isolieren, wird ein Oligonukleotidprimerpaar und Taq-Polymerase verwendet, um die DNA, die dem hITF-Gen entspricht, zu vervielfältigen. Die verwendeten Primer wären ungefähr 15 bis 20 Nukleotide lang und entsprechen in Sequenz den äußersten 5'- und 3'-Teilen der rITF-Kodierungssequenz. Friedman et al. (In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Inns et al., Hrsg., Academic Press, San Diego, CA) beschreiben ein Verfahren für eine solche Vervielfältigung. In Kürze, Phagenpartikel werden durch Erhitzung zerstört; Taq-Polymerase-Primer (300 pmol von jedem), dNTPs, und Taq-Polymerase-Puffer werden hinzugefügt; und die Mischung wird thermisch Zyklen unterworfen, um DNA zu vervielfältigen. Die vervielfältigte DNA wird durch Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert. Die Enden des Fragmentes werden für die Ligation in einen geeigneten Vektor vorbereitet, indem sie mit T4-Polymerase glatt gemacht werden und, wenn erwünscht, indem Linker hinzugefügt werden. Wahlweise kann eine Restriktionsstelle in das Fragment eingebaut werden, indem Primer verwendet werden, an welche an ihre 5'-Enden eine Sequenz hinzugefügt wurde, welche Sequenz ein geeignetes überhängendes Ende nach Verdau erzeugt. Es kann z. B. die Sequenz: 5'-GGGCGGCCGC-3' (SEQ ID NO: 4) an das 5'-Ende jedes Primers hinzugefügt werden. Diese Sequenz beinhaltet die NotI-Restriktionsstelle, die an dem 5'-Ende durch die Sequenz: GG flankiert wird. Die zusätzlichen Nukleotide verhindern, dass die 5'-Enden abgebaut werden, und den nachfolgenden Restriktionsverdau mit NotI behindern. Als nächstes wird die Gel-gereinigte DNA von geeigneter Größe in einen Klonierungsvektor zur Sequenzierung und Restriktionskartierung kloniert. Dieser Klon wird nicht die gesamte hITF-Sequenz umfassen, sondern er wird eine Kombination von hITF (die Region zwischen den Sequenzen, die den Primern entspricht) und rITF (die 5'- und 3'-Enden, die den Primersequenzen entsprechen) darstellen. Dennoch kann diese DNA dazu verwendet werden, eine markierte Probe zu erzeugen (herstellbar durch Nick-Translation oder zufällige Primermarkierung), welche, da sie die korrekte hITF-Sequenz darstellt, in einem hochstringenten Screen der Bibliothek, aus welcher die cDNA ursprünglich isoliert wurde, verwendet werden kann. In einem alternativen Ansatz kann die cDNA in dem obigen Verfahren anstelle der verpackten Bibliothek verwendet werden. Dies vermeidet die Schritte, die cDNA für die Einführung in einen Vektor zu verändern, sowie die cDNA-Verpackung und die Bibliotheksvervielfältigung. Ausubel et al., supra, stellt ein Protokoll für die Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Fragmentes direkt aus cDNA und ein Protokoll zur Vervielfältigung von Poly(A)⁺-RNA zur Verfügung.
Identifizierung eines mutmaßlichen humanen ITF-Klons
Eine Nick-translatierte Sonde, die von rITF-cDNA stammt (die den Nukleotiden 1 bis 431 von SEQ ID NO: 1 entspricht), wurde für eine Northern Blot-Analyse einer Po1y(A)⁺-RNA verwendet, welche aus humanen intestinalen Schleimhautschabungen stammt. Die Sondenhybridisierung und das Blotwaschen wurden gemäß Standardverfahren durchgeführt. Die Sonde (5 × 10⁵ cpm/ml Hybridisierungspuffer) wurde bei 45°C in 5X SSC mit 30% Formamid an den Filter hybridisiert. Der Filter wurde dann bei 60°C in 5X SSC mit 40% Formamid gewaschen. Unter Verwendung dieses Protokolls war eine Bande nach einer Übernachtentwicklung des Filters mit einem Verstärkungsscreen klar sichtbar. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass zwischen rITF und hITF ausreichend Homologie besteht, sodass die Verwendung von Proben, welche von Sequenzen des rITF-Gens stammen, den Nachweis des hITF-Gens ermöglicht.
Eine menschliche intestinale cDNA-Bibliothek wurde von Clontech (Palo Alto, CA) bezogen. Alternativ kann eine humane intestinale cDNA-Bibliothek aus Schleimhautabschabungen wie oben beschrieben hergestellt werden. Vier Oligonukleotidsonden wurden für das Screenen der Bibliotheks-cDNA ausgewählt. Zwei der Sonden entsprechen den Sequenzen innerhalb der Region des rITF, die das Kleeblatt kodieren und werden als interne Sonden (5'-GTACATTCTGTCTCTTGCAGA-3' (SEQ ID NO: 5) und 5'-TAACCCTGCTGCTGCTGGTCCTGG-3' (SEQ ID NO: 6)) bezeichnet.
Die andern zwei Sonden erkennen Sequenzen innerhalb von rITF aber außerhalb der Kleeblatt-kodierenden Region und werden als externe Sonden (5'-GTTTGCGTGCTGCCATGGAGA-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-CCGCAATTAGAACAGCCTTGT-3' (SEQ ID NO: 8)) bezeichnet. Diese Sonden wurden auf ihre Nützlichkeit überprüft, indem sie benutzt wurden, die rattenintestinale cDNA-Bibliothek, die oben beschrieben wird, zu screenen. Jede der vier Sonden konnte verwendet werden, um einen Klon, der das gesamte oder einen Teil des rITF-Gens beherbergt, zu identifizieren. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass diese Sonden verwendet werden können, um die humane intestinale Bibliothek auf das Vorhandensein von hITF zu screenen.
Die internen Sonden wurden wie oben beschrieben verwendet, um ein DNA-Fragment von humaner Kolon-Bibliotheks-cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) zu vervielfältigen. Zu dem isolierten DNA-Fragment, welches dann in pBluescript-Phagemin-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) eingefügt wurde, wurden Linker hinzugefügt. Der Bereich dieses Klons, der der Sequenz der humanen cDNA entspricht (d.h. nicht die Sequenz, die den internen Sonden entspricht, umfassend), wurde verwendet, um eine radioaktiv markierte Sonde mit zufällig Oligonukleotid-geprimter Synthese (Ausubel et al., supra) herzustellen. Diese Sonde wurde dann verwendet, um die humane Kolon-cDNA-Bibliothek zu screenen. Dieses Screenen führte zu der Identifizierung von 29 Klonen. Einer dieser Klone (HuPCR-ITF) wurde Nicktranslatiert, um eine Sonde für Northern Analyse von Poly(A)⁺-RNA, welche aus humanen intestinalen Schleimhautschabungen isoliert wurde, herzustellen. Es wurde eine einzelne Bande von ungefähr derselben Größe wie das Rattentranskript (ungefähr 0,45 kD) beobachtet.
Die Northern Analyse der Poly(A)⁺, die aus humanen Geweben isoliert war, wies darauf hin, dass RNA, die dieser Sonde entspricht, im Dünndarm und Dickdarm aber nicht im Magen oder der Leber exprimiert wurde. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Klon nicht für das humane Homolog des Schweine-PSP kodiert. Schweine-PSP wird in Schweinepankreas exprimiert und wird nicht bedeutsam in Dünn- oder Dickdarm exprimiert. Diese Ergebnisse unterscheiden auch das klonierte Gen von pS2, was im Magen exprimiert wird.
6 zeigt die Nukleinsäuresequenzinformation für humane ITF-cDNA zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz im Einbuchstabencode (SEQ ID NO: 3). Dieser Klon wurde durch die Verfahren, welche oben beschrieben sind, erhalten.
Herstellung von hITF
Das isolierte hITF-Gen kann in einen Säugetierexpressionsvektor für Proteinexpression kloniert werden. Geeignete Vektoren umfassen pMAMneo (Clontech, Palo Alto, CA), welcher einen RSV-LTR-Enhancer, der mit einem Dexamethason-induzierbaren MMTV-LTR-Promotor, einem SV40-Replikationsursprung (ermöglicht die Vermehrung in COS-Zellen), ein Neomycin-Gen und SV40 Splice- und Polyadenylierungsstellen zur Verfügung stellt. Dieser Vektor kann verwendet werden, um das Protein in COS-Zellen, CHO-Zellen, oder Mausfibroblasten zu exprimieren. Das Gen kann auch in einen Vektor für die Expression in Drosophilazellen unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems kloniert werden.
Aufreinigung des intestinalen Kleeblattfaktors
Intestinaler Kleeblattfaktor kann aus intestinalen Schleimhautschabungen vom Menschen, Ratten oder jeder anderen Spezies aufgereinigt werden, die ITF exprimiert (Schweine und Kühe können eine Quelle von ITF bieten). Das Reinigungsverfahren, welches für PSP verwendet wurde, wird für die Aufreinigung von ITF nützlich sein, da die Proteine voraussichtlich homolog sind. Jorgensen et al. beschreibt ein Verfahren zur Aufreinigung von PSP (Regulatory Peptides 3:207, 1982). Das bevorzugte Verfahren ist der zweite Ansatz der von Jorgensen et al (supra) beschrieben wird. Dieses Verfahren umfasst Chromatographie von SP-Sephadex C-25- und QAE Sephadex A-25-Säulen (Sigma, St. Louis, MO) in saurem Puffer.
Anti-intestinale Kleeblattfaktor monoklonale Antikörper
Anti-intestinale Kleeblattfaktor-monoklonale Antikörper können gegen synthetische Peptide erzeugt werden, deren Sequenzen auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz des klonierten hITFs (SEQ ID NO: 3) basieren. Am üblichsten basiert das Peptid auf den amino- oder carboxyterminalen 10-20 Aminosäuren des interessierenden Proteins (hier hITF). Das Peptid wird normalerweise chemisch mit einem Trägermolekül wie z. B. Rinderserumalbumin oder Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin quervernetzt. Das Peptid wird mit dem Ziel ausgewählt, Antikörper zu erzeugen, die mit dem nativen hITF kreuzreagieren werden. Folglich sollte das Peptid einem antigenen Bereich des interessierenden Peptids entsprechen. Dies wird erreicht, indem ein Bereich des Proteins gewählt wird, welcher (1) Oberflächen-exponiert, z. B. ein hydrophober Bereich oder (2) relativ flexibel ist, z. B. ein Schleifenbereich oder ein β-Schleifen-Bereich. Auf jeden Fall muss das Peptid, wenn es an einen Träger gekoppelt werden soll, eine Aminosäure mit einer Seitenkette besitzen, die fähig ist, an der Kopplungsreaktion teilzunehmen. Für eine Diskussion über die Probleme, die die Auswahl antigener Peptide mit sich bringt siehe Hopp et al. (Mol. Immunol. 20:483, 1983; J. Mol. Biol. 157:105, 1982). Ein zweiter Gesichtspunkt ist das Vorhandensein eines zu hITF homologen Proteins in dem Tier, das immunisiert werden soll. Wenn solch ein Protein existiert, ist es wichtig, einen Bereich des hITF zu wählen, welcher nicht sehr homolog zu diesem Homolog ist.
Für hITF sind Peptide, die dem aminoterminalen oder carboxyterminalen 15 Aminosäuren entsprechen, voraussichtlich weniger homolog über die Arten und sind der Oberfläche ausgesetzt (und deswegen antigen). Deshalb sind sie für die Herstellung monoklonaler Antikörper bevorzugt. Aufgereinigtes hITF kann auch für die Erzeugung von Antikörpern verwendet werden.
Die genetische Unterbrechung eines Kleeblattproteins beeinträchtigt die Abwehrkraft der intestinalen Schleimhaut.
Wie oben angegeben, ist ITF ein Mitglied der Familie der Kleeblattproteine, die besonders und reichlich auf der Schleimhautoberfläche des Verdauungstraktes exprimiert werden. Andere Mitglieder dieser Familie umfassen pS2, das fast ausschließlich von Foveolarzellen des Magens exprimiert wird (Masiakowski et al., Nucl. Acids. Res. 10:7896, 1982; Jorgensen et al., Regulatory Peptides 3:231, 1982) und Pankreas-spasmolytisches Peptid (SP), welches von dem Pankreas und dem Magenantrum exprimiert wird (Jørgensen et al., supra). Wie oben beschrieben ist die Expression dieser Proteine in der Nähe des verletzten Darmes verstärkt. Um die Aufgabe des ITFs in vivo zu untersuchen, wurde dieses Gen durch gezielte Unterbrechung in Mäusen nicht funktionsfähig gemacht.
Isolierung des Maus-ITF-Gens und Erzeugung ITF-defizienter Mäuse
Das Maus-ITF-Gen wurde, unter Verwendung der Ratten ITF cDNA Sequenz als Sonde, aus einer Phagengenombibliothek isoliert und seine Identität wurde durch Nukleotidsequenzierung unter Verwendung von Standardtechniken bestätigt (Mashimo et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 210:31, 1995).
Es wurde ein Targetingvektor für die Unterbrechung des Gens durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen (ES) entworfen und erstellt wie in 7 gezeigt. Das gesamte zweite Exon (Ex2) des Maus-ITF-Gens, welches in dem gezeigten XbaI-EcoRI-Fragment enthalten ist, wurde mit der Neomycinresistenz (neo)-Genkassette ersetzt. Da die deletierte Sequenz für den größten Teil der „Kleeblattdomäne" kodiert, wird die Fähigkeit aller resultierenden Peptide, die schleifenartige Struktur zu erzeugen, die für Kleeblattproteine charakteristisch ist, vernichtet. Eine Positiv-Negativ-Auswahlstrategie (Mansour et al., Nature 336:348, 1988) wurde verwendet, um in den embryonalen Stamm (ES)-Zellen homologe Rekombinationsereignisse anzureichern, indem innerhalb der homologen DNA für neo und gegen ein Herpes simplex-Virus Thymidinkinase-Gen (hsv-tk), welches an das 3'-Ende des Targetingvektors gesetzt wurde, selektiert wurde. Das pPNT-Plasmid (Tybulewicz et al., Cell 65:1153, 1991) wurde verwendet, um den Targetingvektor zu erstellen. Der Targetingvektor wurde mit dem Restriktionsenzym NotI linearisiert und unter zuvor beschriebenen Bedingungen (Strittmatter et al., Cell 80:445, 1995) in pluripotente J1 ES-Zellen elektroporiert (Li et al., Cell 69:915, 1992). Die auf die homologe Rekombination folgende Unterbrechung des ITF-Gens in ES-Zellen wurde von einer zufälligen Integration des Targetvektors durch Southern Blot-Analyse der genomischen DNA von einzelnen Zellklonen, die mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut waren, unterschieden. Die pITF2-Sonde identifizierte ein 19 kb „Wildtyp"-Fragment und ein 23 kb „knock out"-Fragment, welches durch die Einführung einer XhoI-Stelle nach homologer Einführung des Targetvektors erzeugt worden war. Es wurde herausgefunden, dass unter Verwendung dieser Methode ungefähr 10% der Neomycin-resistenten ES-Klone eine homologe ITF-Rekombination durchgemacht hatten.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde verwendet, die Targetmutation wie folgt zu bestätigen. Ein 200 bp DNA Bereich wurde unter Verwendung der Primer, die Exon 2 des ITF umspannen (5'-GCAGTGTAACAACCGTGGTTGCTGC-3' (SEQ ID NO: 9) und 5'-TGACCCTGTGTCATCACCCTGGC-3' (SEQ ID NO: 10)) vervielfältigt; und ein 400 bp-Bereich des neo-Gens wurde mit einem zweiten Primersatz (5'-CGGCTGCTCTGATGGCCGCC-3' (SEQ ID NO: 11) und 5'-GCCGGCCACAGTCGATGAATC-3' (SEQ ID NO: 12)) vervielfältigt. Die DNA-Matrize für die PCR-Reaktion wurde aus Schwanzgewebe erhalten. Jedem Tier wurde ungefähr 0,5 cm des Schwanzes abgetrennt und die Proben wurden mit Proteinase K (200 μl zu 0,5 mg/ml in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und 0,5% Triton X-100; Sigma, St. Louis, MO) bei 55°C über Nacht verdaut. Ein μl dieser Mischung wurde direkt zu einer 25 μl PCR-Reaktion (gemäß Stratagene, Menosha, WI) hinzugegeben. Die Reaktion wurde mit einen „Heißstart" (Inkubation bei 96°C für 10 Minuten) begonnen und der folgende Zyklus wurde 30 mal wiederholt: 72°C für 120 Sekunden (Hybridisierung und Verlängerung) und 96°C für 30 Sekunden (Denaturierung). Zehn μl jeder Reaktionsmischung wurde auf einem 2% Agarose-Gel einer Elektrophorese unterworfen. Wildtyp-Tiere wurden durch die Anwesenheit eines 200 bp-Fragmentes, welches einem intakten ITF-Gen entspricht, identifiziert, heterozygote Tiere wurden durch die Anwesenheit dieser Bande und zusätzlich eines 400 bp-Fragments, das durch die Vervielfältigung des neo-Gens erzeugt wurde, identifiziert und ITF defiziente (knock out) Tiere wurden durch die Anwesenheit des Fragmentes alleine, das dem neo-Gen entspricht, identifiziert.
Zwei ES-Klone, welche unabhängig voneinander auftraten, wurden verwendet, um zwei Mäuselinien zu erlangen, denen ITF fehlt. Diese Mäuse wurden wie für ES-Klone beschrieben durch Southern genomische Blot-Analyse oder mit PCR gescreent.
Analyse der Kleeblattpeptidexpression in wildtyp- und mutanten Mäusen
Obwohl die ITF Expression in den mutanten Mäusen aufgehoben wurde, ist die Expression anderer Kleeblattgene erhalten geblieben. Northern Blot-Analyse wurde unter Verwendung von cDNA-Sonden für ITF (Suemori et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11017, 1991), SP (Jeffrey et al. Gastroenterology 106:336, 1994) und als Positivkontrolle, Glyceraldehyd 3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) durchgeführt. Die Nukleinsäuresonde für Maus-pS2 wurde durch reverse transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung des Oligonukleotidpaares durchgeführt: 5'-GAGAGGTTGCTGTTTTGATGACA-3' (SEQ ID NO: 13) und 5'-GCCAAGTCTTGATGTAGCCAGTT-3' (SEQ ID NO: 14), die aufgrund der publizierten Maus pS2 cDNA Sequenz (GenBank Zugangsnummer: 221858) synthetisiert wurden. Das GeneAmp RNA-PCR-Kit (Perkin Elmer) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, genauso wie der pCR^TM II (Invitrogen) Klonierungsvektor. RNA wurde aus den folgenden Geweben von sowohl Wildtyp als auch ITF-defizienten (knock out) Mäusen extrahiert: Magen, Duodenum, terminales Ileum, rechter Kolon, Blinddarm, querverlaufender Kolon, linker Kolon und Rektum. Von jeder Probe wurden 15 μg Gesamt-RNA auf einem 1% Agarose-Gel der Elektrophorese unterworfen und auf Nitrocellulosepapier transferiert. Nach der Hybridisierung, Waschen und der Autoradiographie wiesen Wildtypmäuse ein als normal angesehenes Gewebeexpressionsmuster auf: ITF wurde im Dünndarm und Kolon exprimiert, was dasselbe Expressionsmuster darstellt, welches für ITF in der Ratte und im Mensch beobachtet wurde. Die Analyse mutanter Mäuse bestätigte das Fehlen der ITF-Expression im Verdauungstrakt. Demgegenüber blieb die Expression der anderen Kleeblattproteine SP und pS2 in dem Verdauungstrakt der mutanten Mäuse unverändert. SP wurde im Magen und in geringerer Menge in dem Zwölffingerdarm von sowohl Wildtyp als auch mutanten Mäusen exprimiert. Ebenso wurde pS2 in dem Magen von sowohl Wildtyp als auch ITF defizienter Mäuse exprimiert.
Immunocytochemie offenbart, dass ITF nicht im Kolon ITF-defizienter Mäuse exprimiert wird
Um zu bestätigen, dass ITF-Protein nicht von ITF knock-out Mäusen exprimiert wird, wurde Immunocytochemie wie folgt durchgeführt. Gewebe des Kolons und des Dünndarms wurde im Verlauf der Perfusion fixiert, in 4% Paraformaldehyd (McLean et al., J. Histochem. Cytochem. 22:1077, 1974) getaucht und in Paraffin eingebettet. Es wurden Schnitte gesammelt und entweder mit einem polyklonalen Antikörper, der für ein synthetisches Peptid der vorhergesagten 18 carboxyterminalen Aminosäuren des Maus-ITFs erzeugt worden war oder einem monoklonalen Antikörper für Kolon-Mucin (Podolsky et al., J. Clin. Inwest. 77:1263, 1986) gefärbt. Primäre Antikörperbindung wurde mit einem biotinylierten Zweitantikörper, Avidin DH, biotinylierter Meerrettichperoxidase H, und Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers (VectaStain ABC, Vector Laboratories, Bulingame, CA) sichtbar gemacht. Nach der Immunocytochemie wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt und betrachtet. Becherzellen in dem Kolon der Wildtyp-Mäuse waren mit beiden Antikörpern immunoreaktiv und färbten positiv für ITF und Mucin. Demgegenüber fehlten den Becherzellen in dem Kolon ITF-defizienter Mäuse nachweisbares ITF aber sie exprimierten weiterhin Kolon-Mucin.
Erzeugung einer gelinden Kolon-Epithelverletzung mit Dextransulfatnatrium
ITF-defiziente Mäuse, die von jedem ES-Klon stammten, schienen sich normal zu entwickeln und sind oberflächlich betrachtet nicht von Heterozygoten und Wildtypwurfgeschwistern zu unterscheiden. Ihr Wachstum ist nicht verlangsamt und sie gelangen ohne offensichtlichen Durchfall oder verborgenen fäkalen Blutverlust zur Reife. Jedoch kann der Kolon ITF-defizienter Mäuse für eine Verletzung anfälliger sein als der Kolon von Wildtyp-Mäusen. Um diese Hypothese zu prüfen, wurde Dextransulfatnatrium (DSS), welches in Mäusen reproduzierbar eine milde Kolonepithelverletzung mit Geschwürbildung erzeugt (Kim et al., Scand. J. Gastroent. 27:529, 1992; Wells et al., J. Acquired Immune Deficiency Syndrome 3:361, 1990; Okayasu et al., Gastroenterology 98:694, 1990), mit dem Trinkwasser der Tiere verabreicht. Nach einem Abgleich der DSS-Effekte in vergleichbaren Wildtyp-Mäusen wurde eine Gruppe von 20 Wildtyp- und 20 ITF-defizienter Mäuse (Wurfgeschwister von heterozygoten Kreuzungen, von denen jeder > 20 g wiegt) mit 2,5% DSS in ihrem Trinkwasser für 9 Tage behandelt.
Obwohl 85% der Wildtyp-Mäuse und 100% der ITF-defizienten Mäuse, die mit DSS behandelt worden waren, während der Behandlungszeit in ihrem Stuhl verborgenes Blut (unter Verwendung von Hemoccult, Smith Kline Diagnostics, San Jose, CA) zeigten, waren die ITF-defizienten Mäuse weitaus sensibler gegenüber den schädlichen Wirkungen des DSS. 50% der ITF-defizienten Mäuse entwickelten einen offenen Blutdurchfall und starben (8). Demgegenüber wiesen nur 10% der Wildtyp-Mäuse, die ähnlich behandelt worden waren, Blutdurchfall auf und nur 5% starben. Auch der Gewichtsverlust war in ITF-defizienten Mäusen wesentlich ausgeprägter als in Wildtyp-Mäusen, die DSS erhielten.
ITF-defiziente Mäuse, die mit Dextransulfatnatrium (DSS) behandelt werden, entwickeln schweren Kolon-Erosion
Nach sieben tägiger Behandlung mit DSS (2,5% w/v) wurden die Kolons von Wildtyp- und ITF-defizienten Mäusen histologisch untersucht. Linke Kolonschnitte wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin gebettet und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Es waren in dem Kolon ITF defizienter Mäuse mehrere Bereiche offensichtlicher Geschwüre und Blutung vorhanden, während die Kolons der meisten wildtyp Mäuse von denen der unbehandelten Mäuse oberflächlich betrachtet nicht unterscheidbar waren. Eine histologische Untersuchung des DSS-behandelten ITF-defizienten Kolons bestätigte die Anwesenheit mehrfacher Erosionen und starken entzündlichen Veränderungen, die Kryptengeschwüre umfassen. Der Schaden war im distalen Kolon, d.h. dem absteigenden Kolon, S-förmig verlaufendem Kolon und Rektum, der große, weite Gebiete von Schleimhautgeschwürbildung umfasste, stärker ausgebildet. Während einer ähnlichen Betrachtung konnten Schleimhauterosionen in dem Gewebe von 80% der DSS-behandelten Wildtyp-Mäusen beobachtet werden, aber die meisten stellen kleine Läsionen dar, die mit einer kompletten Reepitheliarisierung der meisten Läsionen zu heilen schienen. In den Kolons ITF-defizienter Mäuse, die DSS ausgesetzt waren, gab es kein Anzeichen einer Reepitheliarisierung.
Im normalen Verlauf von Wachstum und Entwicklung entstehen intestinale Epithelzellen aus Stammzellen in den intestinalen Krypten und schreiten schnell die Krypte und den Villus hoch, um innerhalb von 5 Tagen von der Villus-Spitze ausgestoßen zu werden. Nach einer intestinalen Verletzung wird die Epithelbeschichtung von Zellen erneut besiedelt, die Signale zu erzeugen scheinen, um die Läsionen durch eine Anpassung des epithelialen und mesenchymalen Zellwachstums und der Matrixbildung (Poulsom et al., J. Clin. Gastroenterol. 17:S78, 1993) zu heilen. Ein in vitro Nachweis weist darauf hin, dass Kleeblattproteine eine Schlüsselrolle in der Wiederherstellung der Schleimhautintegrität nach Verletzungen spielen. Trotz der normalen Begrenzung der SP- und pS2-Expression auf den proximalen Verdauungstrakt werden diese Kleeblattproteine und ITF im Überfluss an Stellen von Kolonverletzung und Reparatur exprimiert. Das DSS-Modell, welches oben beschrieben wurde, bietet ein System, die schützenden Wirkungen von ITF, anderen Kleeblattpeptiden, oder aktiven Polypeptidfragmenten oder Varianten davon zu untersuchen. Man kann ein zu testendes Molekül DSS-behandelten Mäusen, entweder Wildtyp- oder ITF-defizienten Mäusen, verabreichen und ermitteln, ob das Molekül therapeutische Wirkungen aufweist, indem die oben beschriebenen Untersuchungen durchgeführt werden.
Außer der Verwendung von DSS kann jede chemische Verbindung, von der bekannt ist, dass sie die Schleimhaut schädigt, die den Verdauungstrakt säumt, verwendet werden, um die Proteine der Erfindung zu untersuchen. Diese Verbindungen umfassen sind aber nicht beschränkt auf Alkohol, Indomethazin und Methotrexat. Zum Beispiel kann Mäusen intraperitoneal Methotrexat (MTX) mit einer Dosierung von 40 mg/kg verabreicht werden. Einer Gruppe MTX-behandelter Tiere kann zusätzlich das fragliche Protein gegeben werden. Verschiedene Parameter wie Körpergewicht, das Vorhandensein von Läsionen im Verdauungstrakt und die Mortalität dieser Tiere können dann mit entsprechenden Messungen verglichen werden, die von Tieren enthalten wurden, die nicht mit dem Protein behandelt worden waren.
In situ H. pylori-Bindeuntersuchung
Ein Verfahren, um festzustellen, ob ein bestimmtes Protein (oder ein Proteinfragment oder Variante) für die Prävention oder Behandlung von Krankheiten nützlich ist, die mit einer H. pylori-Infektion in Zusammenhang stehen, ist es, es im Zusammenhang mit einem etablierten Tiermodell einer H. pylori-Infektion zu untersuchen. Ein solches Modell wurde kürzlich von Falk et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1515-1519, 1995) entwickelt. Dieses Modell umfasst die Verwendung transgener Mäuse, welche das Enzym α-1,3/4-Fucosyltransferase exprimieren und die als Folge auf der Oberfläche von Mucosazellen Le^b exprimieren, die klinische Isolate des H. pylori gebunden haben. Falls die Zugabe eines Proteins wie z. B. ITF zu diesem System den Grad der H. pylori-Bindung an die Mukosazelle verringert, würde das Protein als Inhibitor von H. pylori angesehen werden. Noch spezifischer könnte die Untersuchung wie folgt durchgeführt werden. H. pylori werden z. B. aus Patienten mit Magengeschwüren oder chronisch aktiver Gastritis erhalten, bis zur stationären Phase angezogen und beispielsweise mit Digoxigenin oder Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiert. Die markierten Bakterien werden dann zusammen mit dem interessierenden Protein gefrorenen Schnitten ausgesetzt, die aus Magen, Zwölffingerdarm, Ileum oder Leber erwachsener transgener Mäuse (wie oben beschrieben) hergestellt worden waren. Als Kontrolle könnte das Experiment gleichzeitig unter Verwendung von Gewebe aus einem Wurfgeschwister durchgeführt werden. Die Schnitte werden für 5 Minuten mit eiskaltem Methanol fixiert, dreimal mit Waschpuffer (TBS; 0,1 mM CaC12, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂; 10 Minuten/Zyklus) gespült und mit Blockierpuffer (Boehringer Mannheim; siehe auch Falk, supra) behandelt. Die Bakterien werden mit Verdünnungspuffer [TBS; 0,1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM MgCl₂, welches Leupeptin (1 μg/ml), Aprotinin (1 μg/ml), [-1-p-Tosylamido-2-phenylethylchlormethylketon (100 μg/ml), Phenylmethylsulfonylfluorid (100 μg/ml) und Pepstatin A (1 μg/ml) enthält] zu einer OD₆₀₀ von 0,05 verdünnt und werden bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer für zwei Stunden über die Schnitte gelegt. Die Schnitte werden dann sechsmal in Waschpuffer auf einer rotierenden Plattform (5 Minuten/Zyklus bei Raumtemperatur) gewaschen. Digoxigenin-markierte Bakterien werden auf gewaschenen Schnitten mit FITC konjugiertem Schaf-anti-Digoxigenin-Immunoglobulin (Boehringer Mannheim), das zu 1:100 in Histoblockingpuffer verdünnt ist, sichtbar gemacht. Die Nuklei wurden mit Bisbenzimid (Sigma) gefärbt. Als Blockierungskontrollen können Digoxigenin-konjugierte stationäre-Phase-Bakterien in Verdünnungspuffer zu einem OD₆₀₀ von 0,05 suspendiert und mit oder ohne Le^b-HSA oder Le^a-HSA (Endkonzentration 50 μg/ml; Reaktionsgemisch, 200 μl) für eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt werden. Die spension vird dann über Methanol-fixierte gefrorene Schnitte gelegt.
Verwendung
In der Anwendung der vorliegenden Erfindung kann ITF auf die Haut, die Hornhautoberfläche des Auges, und die Gewebe innerhalb des Atems und Urogenitaltraktes appliziert werden. Die Art der Verabreichung, die Dosierung und die Rezeptur des ITF wird von den Bedingungen abhängen, die behandelt werden. Weitere Anleitungen hinsichtlich der Behandlungssysteme werden unten angegeben. Des Weiteren kann die Behandlung anfangen, bevor eine Verletzung aufgetreten ist, da angenommen wird, dass die Polypeptide und Verbindungen der Erfindung eine schützende Wirkung ausüben.
Verabreichung des ITFs, um Gewebe außerhalb des Verdauungstraktes zu schützen oder zu behandeln
Die Polypeptide der Erfindung, die ITF, Analoge umfassen, können verwendet werden, um Gewebe, welche nicht innerhalb des Verdauungstraktes zu finden sind, zu schützen oder zu behandeln. Die Polypeptide können beispielsweise verwendet werden, um jede Art Wunde, wie z. B. eine Läsion, ein Geschwür, eine Verbrennung oder eine Hautabschürfung, die Oberfläche des Auges (d.h. die Cornea) oder innerhalb der Atemwege oder des Urogenitaltraktes zu behandeln. Die genaue Art der Verletzung und die Ursache der Verletzung muss nicht klar definiert werden.
Ungeachtet des Ortes der Verletzung (d.h. ungeachtet, ob die Verletzung innerhalb des Verdauungstraktes liegt oder nicht) kann die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit einer bestimmten Verbindung durch normale pharmazeutische Verfahren ermittelt werden, indem entweder Zellen in Kultur oder Versuchstiere verwendet werden, um die LD₅₀ (die letale Dosis für 50% der Population) und die ED₅₀ (die therapeutische Dosis, die für 50% der Population wirksam ist) zu ermitteln. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und dieser kann als Verhältnis von LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden. Verbindungen, die große therapeutische Indexe aufweisen, sind bevorzugt. Wenn Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen aufweisen, verwendet werden, sollte darauf geachtet werden, ein Zuführungssystem zu entwickeln, das solche Verbindungen genau zu der Stelle des betroffenen Gewebes bringt, um einen möglichen Schaden für nicht-betroffene Zellen zu minimieren und dadurch Nebenwirkungen zu verringern.
Die Daten, welche aus Zellkulturuntersuchungen und Tierstudien erhalten wurden, können dazu verwendet werden, einen Dosisbereich für die Verwendung in Menschen zu entwerfen. Die Dosis solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereiches zirkulierender Konzentrationen, die die ED₅₀ mit geringer oder keiner Toxizität umfassen. Die Dosis kann innerhalb dieses Bereiches abhängig von der angewandten Dosisart und dem verwendeten Verabreichungsweg variieren. Für eine Verbindung, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich durch Zellkulturuntersuchungen abgeschätzt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen entworfen werden, um einen zirkulierenden Plasmakonzentrationsbereich, der die IC₅₀ (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Inhibition der Symptome erzielt) wie in der Zellkultur ermittelt, erreicht werden. Solche Information kann dazu verwendet werden, eine nützliche Dosierung für Menschen genauer zu bestimmen. Die Pegel im Plasma können z. B. durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen werden.
Pharmazeutische Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können nach herkömmlicher Weise unter Verwendung einer oder mehrerer physiologisch annehmbarer Träger oder Hilfsstoffe formuliert werden. Die pharmazeutischen Verbindungen können auch Mucin Glykoproteine enthalten.
Deshalb können die Verbindungen und ihre physiologisch annehmbaren Salze und Solvate für die Verabreichung von Inhalation oder Insufflation (entweder durch den Mund oder die Nase) oder oraler, bukkaler, parenteraler oder rektaler Verabreichung formuliert werden.
Da Kleeblattpolypeptide innerhalb des Verdauungstraktes nicht abgebaut werden, ist es zu erwarten, dass die Art der Verabreichung oral sein wird. Das Polypeptid könnte z. B. in Form einer Tablette, Kapsel oder Pille verabreicht werden oder könnte in einer Lösung suspendiert werden, wie z. B. einem Sirup, den der Patient schluckt.
Alternativ dazu kann die Lösung, die das Polypeptid umfässt, als Magenspülung verabreicht werden. Das Polypeptid kann auch in einer Lösung eingesetzt werden, die als Einlauf verabreicht wird, oder es kann als Zäpfchen verabreicht werden.
Für eine orale Verabreichung, die verwendet werden kann, um verletztes Gewebe innerhalb des Verdauungstraktes zu behandeln, kann die pharmazeutische Zusammensetzung die Gestalt von z. B. Tabletten oder Kapseln einnehmen, die auf herkömmliche Weise mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmitteln wie z. B. Bindemitteln (z. B. vor-gelatinisierter Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z. B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talkum oder Kieselerde); Sprengmittel (z. B. Kartoffenstärke oder Natriumstärkeglykolat); oder Benetzungsmittel (z. B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden. Die Tabletten können durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren beschichtet werden. Flüssige Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung können die Form von beispielsweise Lösungen, Sirupen oder Suspensionen annehmen oder sie können als ein Trockenprodukt für eine Zusammensetzung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor Verwendung dargereicht werden. Solche flüssigen Zusammensetzungen können auf herkömmliche Weise mit pharmazeutisch annehmbaren Zusätzen wie z. B. Trägermitteln (z. B. Sorbitolsirup, Cellulosederivate oder hydrierte essbare Fette); Emulgierungsmittel (z. B. Lecithin oder Acacia); nichtwässrigen Trägern (z. B. Mandelöl, ölige Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle); und Konservierungsmitteln (z. B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure) zubereitet werden. Die Zusammensetzungen können auch Puffersalze, Aromastoffe, Farbstoffe und Süßungsmittel soweit erforderlich umfassen. Präparate zur oralen Verabreichung können entsprechend formuliert werden, um eine kontrollierte Abgabe der aktiven Verbindung zu geben.
Für eine bukkale Verabreichung, die dazu verwendet werden kann, um verletztes Gewebe innerhalb des Mundes, Halses oder der oberen Speiseröhre zu behandeln, können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen einnehmen, die auf herkömmliche Weise formuliert werden.
Für die Verabreichung durch Inhalation, die dazu verwendet werden kann, um verletztes Gewebe innerhalb der Atemwege zu behandeln, werden die Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung in Form einer Aerosolspraygestaltung aus unter Druck gesetzten Packungen oder einem Vernebler unter Verwen dung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder einem anderen geeigneten Gas zweckdienlich abgegeben werden. In dem Fall eines unter Druck gesetzten Aerosols kann die Dosiseinheit ermittelt werden, indem ein Ventil zur Verfügung gestellt wird, um eine abgemessene Menge abzugeben. Kapseln und Patronen für z. B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert werden, die eine Pulvermischung der Verbindung und eine geeignete Pulverbasis, wie z. B. Lactose oder Stärke, umfassen.
Zusammensetzungen, die die Polypeptide der Erfindung umfassen, können auch zur parenteralen Verabreichung durch Injektion formuliert werden, z. B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion. Formulierungen für eine Injektion können in einheitlicher Dosisform, z. B. in Ampullen oder Multidosisbehältern mit einem zugefügten Konservierungsstoff dargestellt werden. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern annehmen und können Formulierungsmittel wie z. B. Träger, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel umfassen. Alternativ kann der aktive Bestandteil für die Verbindung mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilem Pyrogen-freiem Wasser, vor Verwendung in Pulverform vorliegen.
Die Zusammensetzungen können auch in rektalen Zusammensetzungen formuliert werden, wie z. B. Zäpfchen oder Retentionseinläufen, die gebräuchliche Hilfsgrundstoffe wie z. B. Kokosbutter oder andere Glyceride umfassen.
Zusätzlich zu den vorher beschriebenen Formulierungen können die Zusammensetzungen auch als Depotpräparate formuliert werden. Solche lange wirkenden Formulierungen können durch Implantierung verabreicht werden (z. B. subkutan oder intramuskulär) oder durch eine intramuskuläre Injektion. Deshalb können z. B. die Zusammensetzungen mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwer lösliche Derivate z. B. als schwer lösliches Salz formuliert werden.
Die Zusammensetzungen können, wenn erwünscht, in einer Verpackung oder einem Spenderapparat vorhanden sein, der eine oder mehrere Einheitsdosisformen umfasst, die den aktiven Bestandteil umfassen. Die Verpackung kann z. B. Metall-oder Plastikfolie umfassen, wie z. B. eine Blisterverpackung. Der Verpackung oder dem Verteilerapparat können Anweisungen für die Verabreichung beiliegen.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können auch einen Träger oder Hilfsstoff umfassen, von denen viele dem erfahrenen Fachmann bekannt sind. Hilfsstoffe, die verwendet werden können, umfassen Puffer (z. B. Citratpuffer, Phosphatpuffer, Acetatpuffer und Bicarbonatpuffer), Aminosäuren, Harnstoff, Alkohole, Ascorbinsäure, Phospholipide, Proteine (z. B. Serumalbumin), EDTA, Natriumchlorid, Liposome, Mannitol, Sorbitol und Glycerol. Die Nukleinsäuren, Polypeptide, Antikörper oder regulierenden Verbindungen der Erfindung können auf jeder gewöhnlichen Art der Verabreichung verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Verabreichung parenteral, intravenös, subkutan, intramuskulär, intrakraneal, intraorbital, ophthalmisch, intraventrikulär, intrakapsulär, intraspinal, intrazisternal, intraperitoneal, transmukosal oder oral sein. Die regulatorische Verbindung kann auf viele Arten gemäß dem entsprechenden Weg der Verabreichung formuliert werden. Zum Beispiel können flüssige Lösungen für die Nahrungsaufnahme oder Injektion gemacht werden, Gele und Pulver können für Nahrungsmittelaufnahme, Inhalation oder oberflächliche Anwendung hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind wohl bekannt und können z. B. in „Remington's Pharmaceutical Sciences" gefunden werden. Es ist zu erwarten, dass der bevorzugte Weg der Verabreichung oral sein wird.
Es ist im medizinischen Bereich wohlbekannt, dass Dosen für jeweils einen Patienten von vielen Faktoren abhängen, die die allgemeine Gesundheit, Geschlecht, Gewicht, Körperoberfläche und Alter des Patienten sowie die bestimmte Verbindung, die verabreicht werden soll, den Zeitpunkt und Weg der Verabreichung und andere Arzneimittel, die zeitgleich verabreicht werden, umfassen.
Die Dosierungen für die Polypeptide und Antikörper der Erfindung werden unterschiedlich sein. Für eine orale Verabreichung kann das Polypeptid in Dosierungen von ungefähr 10 mg bis ungefähr 500 mg verabreicht werden. Es können zum Beispiel 10, 50, 100, 200, 250, 300, 400 oder 500 mg verabreicht werden. Diese Dosierungen können auf regelmäßiger Basis verabreicht werden. Zum Beispiel kann eine Dosis 1- bis 4-mal täglich genommen werden. Für eine oberflächliche Verabreichung kann das Polypeptid in Dosierungen von ungefähr 1 bis ungefähr 10 mg/ml in einer Salbe oder Creme verabreicht werden. Diese Zusammensetzung kann auch regelmäßig verabreicht werden, falls nötig. Für andere Wege der Verabreichung wird die Dosierung auch unterschiedlich sein, z. B. von ungefähr 0,1 bis 1000 mg pro Anwendung. Die Ermittlung der richtigen Dosierung innerhalb eines bestimmten therapeutischen Behandlungsschemas ist gut innerhalb der Fähigkeiten von jemandem von durchschnittlichem Können in der Kunst der Pharmakologie.
Um die Wirksamkeit eines Polypeptids für die Behandlung einer bestimmten Funktionsstörung zu bestimmen, können die Fachmänner Routinestudien unter Verwendung jedes der mehreren wohlbekannten Verletzungsmodellen durchführen. Zum Beispiel kann die Wirksamkeit eines Polypeptids für die Behandlung von Verletzungen an der Cornea unter Verwendung des in vitro-Modells für Cornea-Wundheilung, welches von Collin et al. beschrieben wurde (Current Eye Res. 14:331-339, 1995), durchgeführt werden. In diesem Modellsystem wurden Corneas, die für eine Transplantation ungeeignet waren, von menschlichen Organspendern erhalten und innerhalb von fünf Tagen nach dem Tod verwendet. Die Spitze eines Brenneisens wurde verwendet, um eine nicht perforierende thermale Verbrennung von ungefähr 5 mm Länge auf der Cornea zu erzeugen. Die verwundeten Hornhäute wurden sofort präpariert und in ein Luft/Flüssigkeit Organkultursystem (wie beschrieben in Richard et al., Curr. Eye Res. 10:739-749, 1991; und Anderson et al., Ophthalmol. Vis. Sci. 3:442-449, 1993) gelegt. Deshalb würde man, um die Wirksamkeit eines Polypeptids der Erfindung für die Behandlung solch einer Verletzung zu ermitteln, einfach das Polypeptid auf die verwundete Cornea auftragen, z. B. indem man das Polypeptid in das Gewebekulturmedium einbringt und die Wirkung des Polypeptids auf die Wundheilung von verletzten vs. nicht verletzten Hornhäuten bewertet. Wenn zusätzliche Leitungen bei der Beurteilung der Wunde nötig ist, können erfahrene Fachmänner wieder Collin et al. (supra) konsultieren, der auch eine histochemische Analyse verwundeter Hornhäute beschreibt. Protokolle für ein Wundschlielungsmodell unter Verwendung von kultivierten Kaninchen-Cornea-Endothelzellen kann auch verwendet werden (z. B. siehe Joyce et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31:1816-1826, 1990). Alternativ kann, um die Wirksamkeit eines Polypeptids im Zusammenhang mit einer physischen Wunde an der Cornea zu ermitteln, die Verletzung, die wie von Kessler (Curr. Eye Res. 14:985-992, 1995) beschrieben herbeigeführt wird, verwendet werden. Ebenso stehen zahlreiche Modelle zur Verfügung, in denen die Wirksamkeit eines Polypeptids zur Verhinderung oder Heilung einer Wunde in der Epidermis getestet wird. SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung eines Polypeptids, das einen intestinalen Kleeblattfaktor ("intestinal trefoil factor") umfasst, zur Herstellung eines Medikaments, um die Bildung einer Läsion der Haut, einer Läsion der Hornhautoberfläche des Auges, einer Läsion der Atemwege oder einer Läsion des Urogenitaltrakts in einem Patienten zu behandeln oder zu hemmen, wobei der intestinale Kleeblattfaktor über mehr als 35 zusammenhängende Aminosäurereste mindestens 90% Sequenzidentität zu der SEQ ID NO: 18 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Patient eine Bestrahlungstherapie zur Behandlung von Krebs erhält.
Verwendung nach Anspruch 1 bis 2, wobei der Patient eine Chemotherapie für die Behandlung von Krebs erhält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polypeptid für die orale Verabreichung geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei für die orale Verabreichung etwa 10 Milligramm bis etwa 100 Milligramm des Polypeptids verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid für die topische Verabreichung geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Polypeptid in einer Salbe mit etwa 1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml vorhanden ist.