ES2287952T3 - Proteinas de trebol intestinal. - Google Patents

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Abstract

SE PRESENTAN FACTORES TRIFOLIARES INTESTINALES Y ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LOS FACTORES TRIFOLIARES INTESTINALES. LOS FACTORES TRIFOLIARES INTESTINALES PRESENTADOS SON RESISTENTES A LA DESTRUCCION EN EL TRACTO DIGESTIVO Y PUEDEN UTILIZARSE PARA EL TRATAMIENTO DE UN ULCERA PEPTICA, COLON INFLAMATORIO Y OTRAS ENFERMEDADES.

Description

Proteínas de trébol intestinal.
Antecedentes
La presente invención se refiere a péptidos que resultan útiles para el diagnóstico, prevención o tratamiento de heridas, que incluyen las que están asociadas con un trastorno gastrointestinal.
Jergensen et al. (Regulatory Peptides 3:231,1982), describen un péptido pancreático porcino, péptido pancreático espasmolítico (PSP). Se encontró que el PSP inhibía la "motilidad gastrointestinal y la secreción ácida gástrica en animales de laboratorio, después de administración tanto parenteral como oral". Se sugirió que "si podían confirmarse en el hombre los resultados en los experimentos en animales, el PSP podría poseer una utilidad potencial en el tratamiento de las enfermedades ulcerosas gastrointestinales".
El documento WO 92/14837 da a conocer un factor trébol intestinal para el tratamiento y el diagnóstico del sistema digestivo y para la protección del tracto intestinal de las lesiones causadas por la infección bacteriana o la radiación.
Sumario de la invención
La invención muestra la utilización de un polipéptido que comprende un factor trébol intestinal para la producción de un medicamento destinado al tratamiento o a la inhibición de la formación de una lesión de la piel, una lesión de la superficie corneal ocular, una lesión del tracto respiratorio o una lesión del tracto génito-urinario en un paciente, en la que dicho factor trébol intestinal posee por lo menos una identidad secuencial del 90% con SEC ID nº 18 sobre por lo menos 35 residuos aminoácidos contiguos.
Otras formas de realización se definen en las reivindicaciones.
La expresión "Factor trébol intestinal" ("ITF") significa cualquier proteína que sea sustancialmente homóloga con el factor trébol intestinal de la rata (Fig. 2; SEC ID nº: 2) y que se exprese en el intestino grueso, intestino delgado, o colon, en un grado mayor que en los tejidos distintos al intestino grueso, intestino delgado o colon. Asimismo, se incluyen: variaciones alélicas; mutantes naturales; mutantes inducidos; proteínas codificadas por el ADN que se hibridiza bajo condiciones de alta o baja rigurosidad a ácidos nucleicos que codifican ITF que se recuperan a partir de material que se encuentra de forma natural; y polipéptidos o proteínas que se recuperan mediante antisueros para ITF, especialmente mediante antisueros para el sitio activo o el dominio de unión de ITF. El término incluye asimismo otros polipéptidos quiméricos que incluyen un ITF.
El término ITF incluye también análogos de polipéptidos ITF que se encuentran de modo natural. Los análogos pueden diferir de los ITF que se encuentran naturalmente por las diferencias secuenciales aminoácidas o por las modificaciones que no afecten a la secuencia, o por ambas. Los análogos de la invención mostrarán generalmente por lo menos un 90%, y más preferentemente un 95% o incluso un 99% de homología con la totalidad o parte de una secuencia ITF que se encuentre de forma natural. La longitud de las secuencias de comparación será generalmente mayor que 35 residuos aminoácidos. Las modificaciones incluyen derivatizaciones polipeptídicas in vivo o in vitro, por ejemplo, acetilación o carboxilación. También se incluyen modificaciones de glicosilación, por ejemplo, las realizadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en etapas ulteriores de éste, por ejemplo, exponiendo el polipéptido a enzimas que afecten a la glicosilación, derivadas de células que proporcionan normalmente dicho procesamiento, por ejemplo, las enzimas de glicosilación de los mamíferos. Asimismo, se incluyen versiones de la misma secuencia aminoácida primaria que tienen residuos aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina. Los análogos pueden diferir del ITF que se encuentra de forma natural por alteraciones de la secuencia primaria. Éstas incluyen variantes genéticas, tanto naturales como inducidas. Los mutantes inducidos pueden derivarse mediante varias técnicas, que incluyen la mutagénesis al azar de los ácidos nucleicos codificantes, utilizando la irradiación o la exposición al etanometilsulfato (EMS), o pueden incorporar cambios producidos por mutagénesis puntual u otras técnicas de la biología molecular. Véase, Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed), CSH Press, Cold Spring Harbor, New York. También se incluyen análogos que comprenden residuos distintos que los L-aminoácidos que se encuentra de forma natural, por ejemplo, D-aminoácidos, o aminoácidos sintéticos o que no se encuentran de forma natural, por ejemplo, \beta o \gamma aminoácidos.
Un polipéptido ITF o análogo, es activo biológicamente si muestra una actividad biológica de un ITF que se encuentra naturalmente, por ejemplo, la capacidad para alterar la motilidad gastrointestinal en un mamífero.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sustancialmente puro" describe un compuesto, por ejemplo, un ácido nucleico, proteína, o un polipéptido, por ejemplo, una proteína o polipéptido ITF, que está sustancialmente libre de los componentes que lo acompañan de forma natural. Típicamente, un compuesto es sustancialmente puro cuando, en una muestra, el compuesto de interés se encuentra, por lo menos, en un 60%, más preferentemente, por lo menos, en un 75%, más preferentemente, por lo menos, en un 90%, y muy preferentemente en, por lo menos, un 99%, del material total (en volumen, en peso húmedo o seco, o en porcentaje o en fracción molar). La pureza puede medirse mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, en le caso de polipéptidos, mediante cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis HPLC.
La expresión "ADN aislado" significa el ADN que está libre de los genes que, en el genoma que se encuentra de forma natural en el organismo del cual se deriva dicho ADN, franquean dicho ADN. El término "ADN aislado" abarca, pues, por ejemplo, cADN, ADN genómico clonado, y ADN sintético. Un "ácido nucleico purificado", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia ácido nucleica que está sustancialmente libre de otras macromoléculas (por ejemplo, de otros ácidos nucleicos y proteínas) con las que se encuentra naturalmente en el interior celular. En formas de realización preferidas, menos del 40% (y más preferentemente menos del 25%) de la preparación ácido nucleica purificada está formada por dicha otra macromolécula.
El término "Homóloga", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la similitud secuencial subunitaria entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo entre dos moléculas ácido nucleicas, por ejemplo, dos moléculas de ADN de dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición subunitaria en dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN, está ocupada por adenina, entonces, son homólogas en esta posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones de emparejamiento u homólogas, por ejemplo, si la mitad, por ejemplo, 5 de 10, de las posiciones en dos secuencias de compuestos, son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas en un 50%, si el 90% de las posiciones, por ejemplo, 9 de 10, están emparejadas o son homólogas, las dos secuencias comparten una homología del 90%. Por ejemplo, las secuencias 5'-ATTGCC-3' y 5'-TATGGC-2' son homólogas en un 50%. Por "sustancialmente homóloga", quiere significarse una homología amplia, pero no total.
Las proteínas ITF que pueden utilizarse según la invención, son resistentes a la destrucción en el tracto digestivo.
En general, las proteínas trébol, incluyendo ITF, pueden utilizarse, bien para tratar o bien para inhibir la formación de lesiones en la superficie externa de la piel, en la superficie corneal ocular, en el tracto respiratorio y en el tracto génito-urinario.
Otros tejidos que pueden ser protegidos o tratados por un ITF incluyen los que se han listado anteriormente, que se localizan por fuera del canal alimentario.
El término "idéntico", tal como se utiliza en la presente memoria respecto a secuencias polipeptídicas o del ADN, se refiere a la identidad secuencial subunitaria entre dos moléculas. En el caso de las secuencias aminoácidas que presentan una identidad menor del 100% respecto a una secuencia de referencia, las posiciones no idénticas son preferente, pero no necesariamente, sustituciones conservadoras para la secuencia de referencia. Las sustituciones conservadoras incluyen típicamente sustituciones dentro de los grupos siguientes: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico;asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. La identidad secuencial se mide típicamente utilizando un software de análisis secuencial como el "Conjunto de Programas de Análisis Secuencial" del "Grupo de Genética Computacional" en la Universidad de Wisconsin (Centro de Biotecnología, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705) y los parámetros por defecto que allí se
especifican.
Los tejidos que se localizan por fuera del canal alimentario, tal como se listan anteriormente, pueden ser asimismo tratados, administrando al paciente por lo menos un péptido trébol en el caso de que estos tejidos estén dañados por una lesión, o presenten el riesgo de ser agredidos (es decir, el procedimiento puede ser llevado a cabo profilácticamente).
El péptido que se administra es el péptido trébol intestinal (ITF). Para el tratamiento de los pacientes humanos se espera que el péptido será expresado por un gen humano. Se espera que la vía típica de administración sea la oral. La determinación de otras vías de administración y de la dosis efectiva forman parte de la destreza de los expertos en la técnica, y dependerán de muchos factores conocidos por dichos expertos. Las proteínas trébol pueden ser administradas de modo único, en combinación con otra, y/o en combinación con preparaciones de la glicoproteína mucina. "Tratamiento de las lesiones" abarca tanto la inhibición de la formación de la lesión, como la curación de las lesiones ya formadas.
Descripción breve de los dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia nucleótida del factor trébol de la rata (SEC. ID. nº: 1).
La Figura 2 muestra la secuencia aminoácida deducida del factor trébol de la rata (SEC. ID. nº: 2).
La Figura 3 muestra las secuencias aminoácidas del factor trébol de la rata, de la proteína pS2, y del polipéptido pancreático espasmolítico (SP). Las secuencias se alinean para ilustrar la homología secuencial aminoácida entre las proteínas. Los guiones (-) muestran la inserción de espacios que optimizan el alineamiento. Las barras indican la identidad secuencial.
La Figura 4 muestra la estructura de puente disulfuro propuesta para pS2 (SEC. ID. nº: 15; cuadro A) y PSP (SEC. ID. nº: 16, cuadro B).
La Figura 5 muestra la estructura de puente disulfuro propuesta para el factor trébol intestinal de la rata (SEC. ID. nº: 17).
La Figura 6 muestra la secuencia nucleótida del factor trébol intestinal humano cADN y de la secuencia aminoácida deducida correspondiente (SEC. ID. nº: 3).
La Figura 7 es un diagrama que muestra la estrategia utilizada para mutar el gen ITF en las células troncales embrionarias.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la supervivencia después de la administración de Dextrano Sulfato Sódico (DDS; 2,5% peso/vol en el agua de bebida durante 9 días seguidos), que se muestra como la transformación de la probabilidad Kaplan-Meier respecto a los días de tratamiento con DSS.
Descripción detallada Purificación y clonación de rITF
Se aisló un inhibidor de la formación de colonias en agar blando debida a las células BT-20 derivadas del carcinoma mamario humano (ATTC-HTB79), a partir de efusiones malignas humanas positivas a la citología (Podolsky et al., Cancer Res. 48:418, 1988). El factor inhibió asimismo la formación de colonias en agar blando debida a las células HCT15 derivadas del carcinoma de colon humano (ATCC-CCL225). La inhibición no se observó para las progenies de fibroblastos de roedores transformadas por el virus del sarcoma murino y el polioma. El factor que se aisló (TGIF o factor transformado inhibidor del crecimiento celular), presentaba un peso molecular aparente de 110.000 Da y pareció que estaba formado por dos subunidades de 55.000 Da unidas mediante enlaces sulfhidrilo.
La proteína purificada se secuenció parcialmente. La secuencia de los 14 aminoácidos terminales se utilizó para preparar un conjunto de sondas oligonucleótidas degeneradas para el rastreo de una biblioteca cADN de células epiteliales intestinales de rata.
Se preparó una biblioteca de cADN intestinal de rata (Lambda ZAP® II, Stratagene, La Jolla, CA), mediante técnicas estándar (Ausubel et al., Eds In Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, New York, 1989), utilizando células purificadas mediante el procedimiento de Weisner (J. Biol. Chem 248:2536, 1973). El rastreo de la biblioteca de cADN con la sonda oligonucleótida completamente degenerada que se ha descrito anteriormente, dio lugar a la selección de 21 clones. Uno de ellos (T3411) incluía una secuencia nuclear que codificaba un único marco abierto de lectura. La secuencia nucleótida del marco abierto de lectura y el ADN que la franqueaba se presenta en la Fig 1. (SEC. ID. nº: 1). Se desplazó la mella en la inserción que se encontraba en T3411 (Ausubel et al, supra), para producir una sonda marcada radioactivamente para el análisis de transferencia Northern del poly(A)^{+} de la rata. El análisis Northern demostró que el ARN que correspondía al fragmento clonado de cADN se expresó en el intestino delgado, intestino grueso y riñón, no detectándose la expresión en los pulmones, bazo, corazón, gónadas, músculos, estómago, páncreas o hígado. En los tejidos en los que se expresó el ARN, el nivel fue comparable al de la
actina.
El marco abierto de lectura del clon T3411 codificó un péptido de 81 aminoácidos (Fig. 2; SEC. ID. nº 2). La comparación de la secuencia del péptido codificado, al que se hizo referencia como factor trébol intestinal de la rata (rITF), con la secuencia de las proteínas en la base de datos Genbank, reveló una homología significativa con respecto al péptido asociado al cáncer de mama humano (pS2; Jakowley et al., Nucleic Res. 12:2861, 1984) y el péptido pancreático porcino espasmolítico (PSP, Thim et al., Biochem. Biophys. Acta. 827:410, 1985). La Figura 3 muestra la homología entre rITF, PSP, y pS2. Se cree que tanto el factor porcino pancreático espasmolítico (PSP) como pS2 se pliegan en una estructura característica a la que se hace referencia como "trébol". Una estructura de trébol está formada por tres asas formadas por tres enlaces disulfuro. Se cree que pS2 incluye un trébol (Fig 4A), y PSP dos tréboles (Fig 4B). La región de rITF (nucleótido 114 al nucleótido 230 que codifica cys a phe), que es muy similar a PSP y pS2, incluye seis cisteínas, odas las cuales se encuentran en la misma posición que las cisteínas que forman el trébol en PS2 (Fig 3). Cinco de estas seis cisteínas se encuentran en la misma posición que las cisteínas que forman el trébol amino terminal de PSP (Fig 3). La Figura 5 muestra la configuración propuesta del enlace disulfuro de rITF.
Basándose en la homología para PSP y pS2 (Mori et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 155-366, 1988, Jakowlew et al., Nucleic Acids Res. 12:2861,1984), rITF incluye una presunta pro-secuencia (met1 a ala22) en la que de 12 a 22 aminoácidos tienen cadenas laterales hidrofóbicas.
Producción de anticuerpos anti-rITF
Un péptido que corresponde a los 21 aminoácidos carboxi-terminales de rITF, se sintetizó y se unió a albúmina sérica bovina (BSA). Este conjugado (y el péptido no conjugado) se utilizaron para producir anticuerpos policlonales en conejos. Todos los procedimientos fueron protocolos estándar tales como los descritos en Ausubel et al (supra). Los anticuerpos anti-rITF se utilizaron en un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para la visualización de rITF en los tejidos de la rata. Los criocortes de los tejidos de la rata se prepararon utilizando técnicas estándar, y se utilizaron anticuerpos monoclonales anti-conejo de cabra marcados con fluoresceína (los anticuerpos marcados están disponibles en los suministradores Kirkegaard y Perry Laboratories, Gaithersberg, MD; y Bioproducts for Science Inc, Indianapolis, IN), para detectar la unión de los anticuerpos anti-rITF de conejo. Mediante este análisis rITF se encuentra presente en las células "cesta" del intestino delgado pero no en el estómago ni en el páncreas.
Clonación del Factor Trébol Intestinal Humano
El ADN que codifica el factor trébol intestinal de la rata, puede utilizarse para identificar un clon cADN que codifica el factor trébol intestinal humano (hITF). Esto puede llevarse a cabo rastreando una biblioteca de cADN del colon humano con una sonda derivada de rITF, o con una sonda derivada de parte del gen hITF. La última sonda puede obtenerse a partir de un cADN de un colon o intestino humano, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para aislar una parte del gen hITF. Esta sonda puede servir entonces como una sonda específica para la identificación de clones que codifiquen todo el gen hITF.
Construcción de una biblioteca cADN
Una biblioteca cADN del intestino o del colon humanos en \lambdagt10 o \lambdagt11, o en algunos otros vectores apropiados, es útil para el aislamiento de hITF. Dichas bibliotecas pueden obtenerse (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA; HLI034a, HLI0346b). Alternativamente, una biblioteca puede obtenerse utilizando raspados mucosos del colon o intestino humanos. Brevemente, se aisló el ARN a partir del tejido, tal como se describe esencialmente en Chirgwin et al (Biochemistry 18:5294, 1979, véase también Ausubel et al., supra). Se utiliza entonces una oligocolumna (dT) para aislar poly(A)+ ARN mediante el procedimiento de Aviv et al. (J. Mol. Biol.134:743, 1972, véase también Ausubel et al. supra). Se obtuvo entonces cADN bicatenario mediante transcripción inversa, utilizando iniciadores oligo(dT)_{12-8} o hexaméricos al azar (o ambos). Se utilizaron entonces ARNseH y ADN poll de E. coli para reemplazar la cadena de ARN con una segunda cadena de ADN. En una etapa siguiente, la ADN ligasa de E. coli y la T4 ADN polimerasa se utilizan para cerrar los huecos en la segunda cadena del ADN y crear extremos romos. Generalmente, el cADN creado se metila a continuación con la EcoRI metilasa, añadiéndose los engarces EcoRI (pueden utilizarse otros engarces dependiendo del vector que vaya a emplearse). En etapas siguientes los engarces en exceso son eliminados mediante digestión por restricción y los fragmentos de cADN se insertan en el vector deseado. Véase Ausubel et al, supra, y Sambrook et al. (in Molecular Cloning: A Laboratory Manual CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1990, para protocolos detallados.
Los vectores útiles incluyen el vector \lambdagt11, \lambdagt10, Lambda ZAPR II, vector Lambda Uni-ZAP^{TM} XR, todos disponibles en Stratagene (La Jolla, CA).
La biblioteca de cADN debe ser empaquetada en el fago; esto se lleva a cabo de la forma más fácil utilizando un equipo de empaquetamiento comercial in vitro, por ejemplo, Gigapack® II Gold o Gigapack® II Plus (Stratagene, La Jolla, CA). Véase Ausbel et al. (supra) para los protocolos de empaquetamiento y las cepas huéspedes apropiadas. La biblioteca se amplifica preferentemente pronto después del empaquetamiento; esta etapa genera clones suficientes para un rastreo múltiple de la biblioteca. Véase Ausubel et al supra o Sambrook et al, supra, para detalles de protocolos de amplificación y procedimientos para almacenar la biblioteca amplificada.
Rastreo de la biblioteca-cADN
Para rastrear la biblioteca debe situarse en una cepa huésped apropiada (por ejemplo, Y1090 o Y1088 para las bibliotecas \lambdagt10, C600hf1A para las bibliotecas \lambdagt10). Después de sembrar el fago, las placas se transfieren a filtros de nylon o de nitrocelulosa (Véase Ausubel et al., supra y Sambrook et al, supra). Los filtros se sondean entonces con sondas derivadas de rITF con desplazamiento de la mella y marcadas radioactivamente con \alpha^{32}P. La sonda se generó preferentemente utilizando una parte de la región del rITF ADN que codifica la estructura de trébol (nucleótidos 114 a 230 de SEC. ID. nº: 1), que codifica cys 32 a phe 71 de SEC. ID. nº: 2). Esta región se conserva entre rITF, pS2 y PSP, y es probable que esta región se conserve entre riTF y hITF. Una vez una placa es identificada, son necesarios varios ciclos de purificación de la placa para aislar un clon puro que codifique hITF. Se lleva a cabo el aislamiento del ADN del fago y la inserción del cADN puede subclonarse en un vector apropiado para llevar a cabo la elaboración de un mapa de restricción y una secuenciación. Si el vector fágico es Lambda ZAP® II, la confección con un fago auxiliador permite el rescate y la recircularización del vector pBluescript SK-fagémido (Stratagene, La Jolla, CA) que albergue el cADN; alternativamente, el clon del fago es purificado y la inserción de cADN se subclona en un vector apropiado para llevar a cabo la elaboración de un mapa de restricción y una secuenciación. Si el clon no contiene el gen hITF completo (según se evalúe mediante homología respecto con rITF y presencia de los codones de comienzo y detención), la biblioteca puede volver a rastrearse con la sonda rITF original o, preferentemente, con una sonda generada a partir del clon hITF obtenido. Si ninguno de los clones contiene el gen intacto, puede reconstruirse a partir de clones que transporten fragmentos de hITF que se solapen.
Aislamiento directo de una sonda hITF mediante PCR
Es posible aislar parte del gen hITF directamente a partir de la biblioteca empaquetada o del cADN. Para aislar directamente una parte del hITF, a partir de la biblioteca empaquetada, se utilizan un par de oligonucleótidos y una Taq polimerasa para amplificar el ADN que corresponde al gen hITF. Los iniciadores utilizados serán aproximadamente de 15-20 nucleótidos de largo y corresponden secuencialmente a la mayoría de las partes 5' y 3' de la secuencia codificante de rITF. Friedman et al (en PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Eds. Academic Press, San Diego, CA), da a conocer un procedimiento para dicha amplificación. Brevemente, las partículas fágicas se rompen mediante calor. Los iniciadores de Taq polimerasa (300 pmol de cada uno) dNTPs, y 1 ag de tampón de polimerasa se añaden, y la mezcla se cicla térmicamente para amplificar el ADN. El ADN amplificado se aísla mediante electroforesis en gel de agarosa. Los extremos del fragmento se preparan para la unión en un vector apropiado mediante lavado con la T4 polimerasa y, si se desea, añadiendo engarces. Alternativamente, un sitio de restricción puede establecerse mediante técnicas de ingeniería genética en el fragmento utilizando iniciadores que tienen una secuencia añadida a sus extremos 5', la cual secuencia generará un extremo cohesivo apropiado cuando se digiera. Por ejemplo, la secuencia 5'-GGGCGGCCGC-3' (SEC. ID. nº: 4) puede añadirse al extremo 5' de cada iniciador. Esta secuencia incluye el sitio de restricción NotI franqueado en el extremo 5' por la secuencia GG. Los nucleótidos añadidos protegen a los extremos 5' de la desnaturalización e interfieren con una subsiguiente digestión de la restricción con NotI. El ADN purificado en gel del tamaño apropiado se clona a continuación en un vector de clonación para llevar a cabo la secuenciación y la elaboración del mapa de restricción. Este clon no tendrá la secuencia hITF completa, sino que más bien será una combinación de hITF (la región entre las secuencias que corresponden a los iniciadores) y rITF (los extremos 5' y 3' que corresponden a las secuencias de los iniciadores). Sin embargo, este ADN puede utilizarse para generar una sonda marcada (producida por desplazamiento de la mella o marcaje al azar del iniciador), la cual, ya que es la correcta secuencia hITF, puede utilizarse en un rastreo de alta rigurosidad de la biblioteca a partir de la cual el cADN se aisló originariamente. En un enfoque alternativo, el cADN puede utilizarse en el procedimiento mencionado en vez de una biblioteca empaquetada. Este elimina las etapas de modificación del cADN para la inserción en un vector, así como el empaquetamiento del cADN y la amplificación de la biblioteca. Ausabel et al, supra, proporciona un protocolo para la amplificación de un fragmento particular de ADN directamente a partir del cADN y un protocolo para la amplificación a partir del poly(A)^{+} ARN.
Identificación de un clon presunto humano ITF
Una sonda con desplazamiento de la mella, derivada del rITF cADN (que corresponde a los nucleótidos 1 a 431 de SEC. ID. nº: 1) se utilizó para el análisis de transferencia Northern de poly(A)^{+} ARN derivado de los raspados mucosos intestinales humanos. La hibridización de la sonda y el lavado del borrón (para transferencia) se llevaron a cabo según procedimientos estándar. La sonda (5 x 10^{5} cpm/ml tampón de hibridización) se hibridizó al filtro a 45ºC en 5xSSC con formamida al 30%. Se lavó entonces el filtro a 60ºC en 5 x SSC con formamida al 40%. Utilizando este protocolo, se apreció claramente una banda después de una exposición nocturna del filtro con una pantalla de intensificación. Este resultado indicó que existe una homología suficiente entre rITF y hITF para permitir la utilización de sondas derivadas de la secuencia del gen rITF para la identificación del gen hITF.
Una biblioteca de cADN intestinal humano se obtuvo a partir de Clontech (Palo Alto, CA). Alternativamente, puede obtenerse una biblioteca de cADN intestinal humano a partir de raspados de la mucosa, tal como se ha descrito anteriormente. Se seleccionaron 4 sondas oligonucleótidas para rastrear el cADN de la biblioteca. Dos de las sondas corresponden a secuencias en el interior de la región de rITF que codifican el trébol y se hace referencia a ellas como sondas internas (5'-GTACATTCTGTCTCTTGCAGA-3' (SEC. ID. nº: 5) y 5'-TAACCCTGCTGCTGCTGGTCCTGG-3' (SEC. ID. nº: 6). Las otras dos sondas reconocen secuencias dentro rITF pero fuera de la región que codifica el trébol y a ellas se alude como sondas externas (5'-GTTTGCGTGCTGCCATGGAGA-3' (SEC. ID. nº: 7) y 5'-CCG
CAATTAGAACAGCCTTGT-3' (SEC. ID. nº: 8) Estas sondas se ensayaron respecto a su utilidad para emplearlas para rastrear la biblioteca cADN intestinal de la rata descrita anteriormente. Cada una de las cuatro sondas podría utilizarse para identificar un clon que albergue la totalidad o parte del gen rITF. Este resultado indica que estas sondas pueden utilizarse para rastrear la biblioteca intestinal humana respecto a la presencia de hITF.
Las sondas internas se utilizaron tal como se describe anteriormente para amplificar un fragmento de ADN del cADN de la biblioteca del colon humano (Clontech, Palo Alto, CA). Se añadieron engarces al fragmento aislado del ADN, que se insertó entonces en el vector pBluescript fagémido (Stratagene, La Jolla). La región de este clon que corresponde a la secuencia del cADN humano (es decir, que no incluye la secuencia que corresponde a las sondas internas), se utilizó para obtener una sonda marcada radioactivamente mediante síntesis llevada a cabo al azar por iniciadores oligonucleótidos (Ausbel et al., supra). Esta sonda se utilizó entonces para rastrear la biblioteca cADN del colon humano. Este rastreo condujo a la identificación de 29 clones. Uno de estos clones (HuPCR-ITF) se sometió a desplazamiento de la mella para generar una sonda para análisis Northern del poly(A)^{+}ARN aislado de los raspados de la mucosa del intestino humano. Se observó una única banda aproximadamente del mismo tamaño que el transcrito de la rata (aproximadamente 0,45 kDa).
El análisis Northern del poly(A)^{+} aislado de los tejidos humanos, indicó que el ARN correspondiente a esta sonda se expresó en el intestino delgado y en el grueso, pero no en el estómago o en el hígado. Estos resultados indican que el clon no codifica el homólogo humano del PSP porcino. El PSP porcino se expresa en el páncreas porcino y no se expresa significativamente en el intestino delgado o grueso. Estos resultados distinguen asimismo el gen clonado de pS2 que se expresa en el estómago.
La Figura 6 muestra información de la secuencia ácido nucleica para el ITF cADN humano, junto con la secuencia aminoácida deducida en el código de una letra (SEC. ID. nº: 3).
Este clon se obtuvo mediante los procedimientos anteriormente descritos.
Producción de hITF
El gen aislado hITF puede clonarse en un vector de expresión mamífero para la expresión proteica. Los vectores apropiados incluyen pMAMneo (Clontech, Palo Alto, Ca) que proporciona un potenciador RSV-LTR unido a un promotor MMTV-LTR inducible por la dexametasona, un origen SV40 de replicación (que permite la replicación en las células COS), un gen de la neomicina, y sitios de poliadenilación y de corte y empalme de SV40. Este vector puede utilizarse para expresar la proteína en las células COS, células CHO, o los fibroblastos de rata. El gen puede también clonarse en un vector para la expresión en las células de Drosophila utilizando el sistema de expresión de bacoluvirus.
Purificación del factor trébol intestinal
El factor trébol intestinal puede purificarse a partir de los raspados de la mucosa intestinal humana, de la rata o de cualquier otra especie que exprese ITF (los cerdos y las vacas pueden proporcionar una fuente de ITF). El procedimiento de purificación utilizado para PSP será útil para la purificación de ITF, ya que las proteínas es probable que sean homólogas. Jorgensen et al dan a conocer un procedimiento para la purificación de PSP (Regulatory peptides 3:207, 1982). El procedimiento preferido es el segundo enfoque descrito por Jorgensen et al (supra). Este procedimiento implica cromatografía de las columnas SP-Sephadex C-_{25} y QAE Sephadex A-25 (Sigma, St. Louis, MO) en tampón ácido.
Anticuerpos monoclonales antifactor trébol intestinal
Pueden producirse anticuerpos monoclonales antifactor trébol intestinal contra péptidos sintéticos cuyas secuencias se basen en la secuencia aminoácida deducida del hITF clonado (SEC. ID. nº: 3). Muy habitualmente, el péptido se basa en los 10-20 aminoácidos terminales amino o carboxílicos de la proteína de interés (aquí, hITF). El péptido se une cruzadamente de forma química a una molécula transportadora tal como la albúmina sérica bovina o la hemocianina de la lapa. El péptido se selecciona con el propósito de generar anticuerpos que reaccionarán cruzadamente con el hITF original. De acuerdo con esto, el péptido corresponderá a una región antigénica del péptido de interés. Esto se lleva a cabo escogiendo una región de la proteína que (1), esté expuesta a la superficie, por ejemplo, una región hidrofóbica, o (2) relativamente flexible, por ejemplo, una región en forma de bucle de una región de configuración \beta. En cualquier caso, si el péptido va a unirse a un transportador, debe tener un aminoácido con una cadena lateral capaz de participar en la reacción de acoplamiento. Véase Hopp et al (Mol. Immunol. 20:483,1983, J. Mol. Biol. 157:105, 1982) para un debate de los temas implicados en la selección de los péptidos antigénicos. Una segunda consideración es la presencia de una proteína homóloga a hITF en el animal que va a ser inmunizado. Si dicha proteína existe, es importante seleccionar una región del hITF que no sea altamente homóloga para este homólogo.
Para hITF, los péptidos que corresponden a los 15 aminoácidos amino o carboxi terminales son probablemente menos homólogos de una especie a otra y están expuestos a la superficie (y por tanto, son antigénicos). Por tanto, se prefieren para la producción de anticuerpos monoclonales. El hITF puede también utilizarse para la generación de anticuerpos.
La rotura genética de una proteína trébol afecta a la defensa de la mucosa intestinal
Como se ha establecido anteriormente, ITF es un miembro de la familia de las proteínas trébol que se expresan específica y abundantemente en la superficie mucosa del tracto gastrointestinal. Otros miembros de esta familia incluyen pS2, que se expresa casi exclusivamente por las células foveolares del estómago (Masiakowski et al., Nucl. Acids, Res. 10:7896, 1982; Jorgensen et al, Regulatory Peptides 3:231, 1982): y el péptido pancreático espasmolítico (SP), que se expresa por el páncreas y por el antro gástrico (Jongersen et al., supra). Tal como se ha descrito anteriormente, la expresión de estas proteínas es potenciada en la proximidad del intestino dañado. Para estudiar la función de ITF in vivo, el gen se volvió no funcional mediante la rotura dirigida en los ratones.
Aislamiento del gen murino ITF y generación de ratones deficientes en ITF
El gen murino ITF se aisló a partir de una biblioteca genómica fágica utilizando la secuencia ITF cADN de la rata como sonda, confirmándose su identidad mediante secuenciación nucleótida, utilizando técnicas estándar (Mashimo et al., Biochem. Biophys Res. Comm 210:31, 1995).
Se diseñó y construyó un vector dirigido para alterar el gen mediante recombinación homóloga en células troncales embrionarias (ES), tal como se muestra en la Figura 7. El segundo exon completo del gen ITF murino, que está contenido en el interior del fragmento XbaI-EcoRI que se muestra, se reemplazó con el cassette del gen de resistencia a la neomicina (neo). Como la secuencia eliminada codifica la mayoría del "dominio trébol", fue abolida la capacidad de cualesquiera péptidos resultantes para producir la estructura en bucle característica de las proteínas trébol. Una estrategia de selección positiva-negativa (Mansour et al., Nature 336:348,1988) se utilizó para enriquecer los eventos de recombinación homóloga en las células del tronco embrionario (ES) seleccionando neo dentro del ADN homólogo y respecto a un gen de la timidina quinasa del virus del herpes simplex (hsv-tk) situado en el extremo 3' del vector dirigido. El plásmido pPNT (Tybulewicz et al., Cell 65:1153, 1991), se utilizó para construir el vector dirigido. Éste se linearizó con el enzima de restricción NotI y se sometió a electroporación en células pluripotentes J1 ES (Li et al., Cell 69:915, 1992) bajo condiciones previamente descritas (Strittmatter et al., Cell 80:445, 1995). La rotura del gen ITF en las células ES después de recombinación homóloga, se distinguió de la integración al azar del vector dirigido mediante análisis de transferencia Southern del ADN genómico de clones individuales de células digeridas con el enzima de restricción XhoI. La sonda pITF2 identificaba un fragmento de "tipo salvaje" de 19 kb y un fragmento "manipulado" de 23 kb que se había creado introduciendo un sitio XhoI en la inserción homóloga del vector dirigido. Se encontró que, aproximadamente, el 10% de los clones ES resistentes a la neomicina habían experimentado recombinación homóloga de ITF utilizando este procedimiento.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó para confirmar la mutación dirigida de la forma siguiente. Una región de 200 pares de bases del ADN se amplificó utilizando iniciadores que extendieron el exon 2 de ITF (5'-GCAGTGTAACAACCGTGGTTGCTGC-3' (SEC. ID nº: 9) y 5'- TGACCCTGTGTCATCACCCTGGC-3' (SEC. ID nº: 10), y una región de 400 pares de bases del gen neo se amplificó con un segundo conjunto de iniciadores (5'-CGGCTGCTCTGATGGCCGCC-3') (SEC. ID. nº: 11) y 5'-GCCGGCCACAGTCGATGAATC-3' (SEC. ID nº: 12). La matriz del ADN para la reacción PCR se obtuvo del tejido de la cola. Aproximadamente, 0,5 cm de la cola se seccionaron en cada animal, y las muestras se sometieron a digestión con proteinasa-K (200 \mul a 0,5 mg/ml en 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 y Triton X-100 al 0,5%, Sigma, St. Louis, MO) a 55ºC durante la noche. Un \mul de esta mezcla se añadió directamente a una reacción PCR de 25 \mul (por Stratagene, Menosha, WI). La reacción empezó con un "inicio caliente" (incubación a 96ºC durante 10 minutos), repitiéndose el siguiente ciclo 30 veces: 72ºC durante 120 segundos (hibridización y alargamiento) y 96º durante 30 segundos (desnaturalización). Diez \mul de cada mezcla reactiva se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa al 2%. Los animales de tipo salvaje se identificaron por la presencia de un fragmento de 200 pares de bases, que correspondía a un gen ITF intacto, y los animales heterocigóticos se identificaron por la presencia de esta banda, y además, de un fragmento de 400 pares de bases, producido por la amplificación del gen neo, y los animales deficientes en ITF (manipulados) se identificaron por la presencia de sólo un fragmento w que correspondía al gen neo.
Dos clones ES, que surgieron independientemente, se utilizaron para derivatizar dos progenies de ratones a los que faltaba ITF. Estos ratones se rastrearon mediante análisis de transferencia genómica Southern, tal como se da a conocer para los clones ES, o mediante PCR.
Análisis de la expresión del péptido trébol en ratones mutantes y de tipo salvaje
Aunque la expresión de ITF está abolida en los ratones mutantes, la expresión de otros genes trébol está preservada. Se llevó a cabo el análisis de transferencia Northern utilizando sondas de cADN para ITF (Suemori et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11017, 1991), SP (Jeffrey et al. Gastroenterology 106:336, 1994), y, como un control positivo, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). La sonda de ácido nucleico para la pS2 murina se obtuvo mediante la reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR) utilizando los pares oligonucleótidos: 5'-GA
GAGGTTGCTGTTTTGATGACA-3' (SEC. ID. nº: 13) y 5'-GCCAAGTCTTGATGTAGCCAGTT-3'' (SEC. ID. nº: 14), que se sintetizaron basándose en la secuencia publicada del cADN pS2 del ratón (Número de registro de GenBan: Z21858). El equipo GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer) se utilizó según las instrucciones del fabricante, como lo fue el vector de clonación pCR^{TM} II (Invitrogen). El ARN se extrajo a partir de los siguientes tejidos de los ratones tanto de tipo salvaje como de los deficientes en ITF (manipulados): estómago, duodeno, íleo terminal, colon derecho, apéndice, colon transverso, colon izquierdo, y recto. Quince \mug del ARN total de cada muestra se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1%, transfiriéndose a papel de nitrocelulosa. Después de la hibridización, el lavado y la autoradiografía, los ratones de tipo salvaje mostraron un patrón de la expresión tisular considerado como normal: el ITF se expresó en el intestino delgado y en el colon, que es el mismo patrón de expresión que se aprecia para el ITF en la rata y en el hombre. El análisis de los ratones mutantes confirmó la falta de expresión de iTF en el tracto gastrointestinal. Contrariamente a esto, la expresión de las otras proteínas trébol, SP y pS2, se conserva inalterada en el tracto gastrointestinal de los ratones mutantes. SP se expresó en el estómago y, a niveles menores, en el duodeno de tanto los ratones de tipo salvaje como de los mutantes. De modo similar, pS2 se expresó en el estómago de tanto los ratones de tipo salvaje como de los deficientes en ITF.
La inmunocitoquímica revela que ITF no se expresa en el colon de los ratones deficientes en ITF
Para confirmar que la proteína ITF no se expresó por los ratones manipulados en su ITF, se llevó a cabo la inmunocitoquímica de la forma siguiente. Tejidos del colon y del intestino delgado se fijaron durante la perfusión, se sumergieron en paraformaldehído al 4% (McLean et al., J. Histochem. Cytochem, 22:1077-1974), incluyéndose en parafina. Se recogieron cortes y se tiñeron con un anticuerpo policlonal producido contra un péptido sintético de los 18 aminoácidos carboxi-terminales predichos de la ITF murina, o un anticuerpo monoclonal contra la mucina colónica (Podolsky et al, J. Clin. Invest. 77:1263, 1986). La unión del anticuerpo primario se visualizó con un anticuerpo secundario biotinilado, Avidina DH, la peroxidasa H de rábano biotinilada, y tetracloruro de diaminobencidina, reactivos según las instrucciones del fabricante (VectaStain ABC, Vector Laboratories, Bulingame, CA). Después de la inmunocitoquímica, los cortes se tiñeron con hematoxilina y se observaron. A las células "cesta" en el colon de los ratones deficientes en ITF les faltó ILT detectable, pero continuaron expresando mucina colónica.
Inducción de lesiones epiteliales colónicas moderadas con dextrano sulfato sódico
Los ratones deficientes en ITF derivados de cada clon ES parecen desarrollarse normalmente y son extremadamente indistinguibles de las camadas de tipo salvaje o heterocigóticas. Su desarrollo no sufre retardo y alcanzan la madurez sin diarreas evidentes o pérdida de sangre fecal oculta. Sin embargo, el colon de los ratones deficientes en iTF puede ser más propenso a las lesiones que el clon de los ratones de tipo salvaje. Para investigar esta hipótesis, a animales que bebían agua, se administró dextrano sulfato sódico (DSS), que crea de modo reproducible, en los ratones, lesiones epiteliales colónicas moderadas con ulceraciones (Kim et al., Scand. J. Gastroent. 27:529, 1992; Wells et al., J. Acquired Immune Deficiency Syndrome 3:361, 1990. Okayasu et al., Gastroenterology 98:694, 1990). Después de estandarización de los efectos del DSS en ratones comparables de tipo salvaje, un grupo de 20 ratones deficientes en ITF y de 20 animales de tipo salvaje y de 20 de ratones deficientes en ITF (camadas de cruzamientos heterocigóticos, que pesaban > 20 gramos cada uno), se trataron con DSS al 2,5% en agua de beber durante 9 días.
Aunque en un 85% de los ratones de tipo salvaje y en un 100% de los ratones deficientes en ITF tratados con DSS, se demostró sangre oculta (utilizando Hemoccult, Smith Kline Diagnostics, San José, CA) en sus heces durante el período de tratamiento, los ratones deficientes en ITF fueron marcadamente más sensibles a los efectos lesionales de DSS. El 50% de los ratones deficientes en ITF desarrollaron una franca diarrea sanguinolenta y murieron (Fig 8). Al contrario, sólo un 10% de los ratones de tipo salvaje tratados de modo similar mostraron diarrea sanguinolenta, muriendo sólo el 5%. La pérdida de peso fue también significativamente más pronunciada en los ratones deficientes en ITF que en los ratones de tipo salvaje que recibieron DSS.
Los ratones deficientes en ITF tratados con dextrano sulfato sódico (DSS) desarrollan erosiones colónicas graves
Después de siete días de tratamiento con DSS (2,5% peso/vol), los colones de los ratones deficientes en ITF y de tipo salvaje se examinaron histológicamente. Los cortes transversales del colon izquierdo se fijaron en paraformaldehído al 4%, se incluyeron en parafina, y se tiñeron con hematoxilina y eosina. En el colon de los ratones deficientes en ITF se encontraban múltiples sitios de clara ulceración y de hemorragias, mientras que los colones de la mayoría de los ratones de tipo salvaje eran extremadamente indistinguibles de los de los ratones no tratados. El examen histológico de los colones de los animales deficientes en ITF y tratados con DSS, confirmó la presencia de múltiples erosiones y cambios inflamatorios intensos que incluían abscesos crípticos. Las alteraciones fueron más pronunciados en el colon distal, en el colon descendente, en el colon sigmoide, y en el recto, que contenían áreas grandes de ulceración mucosa. Cuando se llevó a cabo una inspección similar, se pudieron apreciar erosiones mucosas en el tejido del 80% de los ratones de tipo salvaje tratados con DSS, pero la mayoría eran lesiones pequeñas que también parecían cicatrizarse, con una re-epitealización completa de la mayoría de las lesiones. No se evidenció re-epitealización en los colones de los ratones deficientes en ITF expuestos a DSS.
Durante el curso normal de crecimiento y desarrollo, las células epiteliales intestinales se originan de las células troncales en las criptas intestinales y escalan rápidamente éstas y las vellosidades para ser sometidas a extrusión a partir de la punta de dichas vellosidades en unos cinco días. Después de la lesión intestinal, la cubierta epitelial es vuelta a repoblar por las células que aparecen para generar señales que cicatricen la lesión mediante la modulación del crecimiento celular mesenquimático y epitelial y la formación de una matriz (Poulsom et al., J. Clin. Gastroenterol. 17.S78, 1993). La evidencia in vitro sugiere que las proteínas trébol juegan un papel clave en el restablecimiento de la integridad de la mucosa después del daño infringido. A pesar de la restricción normal de la expresión de SP y de pS2 en el tracto gastrointestinal proximal, estas proteínas trébol e ITF se expresan abundantemente en los sitios lesionales y de reparación colónica. El modelo DSS descrito anteriormente, proporciona un sistema para ensayar los efectos protectores de ITF, de otros pétpidos de tipo trébol, o de fragmentos polipeptídicos activos o de sus variantes. Se puede administrar una molécula para que sea ensayada en ratones tratados con DSS, bien ratones deficientes en ITF o de tipo salvaje, y determinarsi la molécula tiene efectos terapéuticos llevando a cabo los ensayos descritos anteriormente.
Además de la utilización del DSS, cualquier compuesto químico del que se sepa que dañe la mucosa que reviste el tracto digestivo, puede utilizarse para ensayar las proteínas de la invención. Estos compuestos incluye, pero no se limitan a: alcohol, indometacina, y metotrexato. Por ejemplo, el metotrexato (MTX), puede administrarse intraperitonealmente a los ratones a una dosis de 40 mg/kg. A un grupo de animales tratados con MTX, se les puede administrar, además, la proteína en cuestión. Varios parámetros, tales como el peso corporal, la presencia de lesiones en el tracto digestivo, y la mortalidad de estos animales, podrían entonces compararse con mediciones equivalentes tomadas en animales que no se hubieran tratado con la proteína.
Ensayo de unión in situ de H. pylori
Un procedimiento para determinar si una proteína dada (o fragmento proteico o variante) es útil para la prevención o el tratamiento de enfermedades asociadas con la infección por H. pylori, es examinarla en el contexto de un modelo animal establecido de la infección por H. pylori. Dicho modelo se desarrolló recientemente por Falk et al (Proc. Natl. Sci. USA 92:1515-1519, 1995). Este modelo implica la utilización de ratones transgénicos que expresen la enzima \alpha-1, 3/4 fucosiltransferasa y, como consecuencia, expresar Leb en la superficie de las células mucosas que se unen a los aislamientos clínicos de H. pylori. Si la adición a este sistema de una proteína, tal como ITF, reduce el nivel de la unión de H. pylori a la célula mucosa, la proteína podría considerarse como un inhibidor de H. pylori. Más específicamente, el ensayo podría llevarse a cabo de la forma siguiente: H. pylori se obtienen, por ejemplo, de pacientes con úlceras gástricas o gastritis crónica activa, haciéndose crecer hasta la fase estacionaria, y marcándose, por ejemplo, con digoxigenina o isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las bacterias marcadas se exponen entonces, conjuntamente con la proteína de interés, a cortes congelados preparados a partir del estómago, duodeno, íleo, y hígado de ratones adultos transgénicos (tal como se ha descrito anteriormente). Como control, el experimento puede realizarse en paralelo, utilizando tejidos de una camada de tipo salvaje. Los cortes se fijan con metanol enfriado en hielo durante 5 minutos, se enjuagan tres veces con tampón de lavado (TBS; 0,1 mM CaCl_{2}, 1 mM MnCl_{2}; 1 mM MgCl_{2;}10 minutos (ciclo), y se tratan con tampón bloqueante (Boehringer Mannheim, véase también Falk supra). Las bacterias se diluyen hasta una OD_{600} de 0,05 con tampón de dilución (TBS; 0,1 mM CaCl_{2}, 1 mM MnCl_{2}; 1 mM MgCl_{2} que contiene leupeptina (1 \mug/ml), aprotinina (1 \mug/ml), [(-1-p-tosilamido-2-feniletil clorometil cetona (100 \mug/ml), fluoruro fenilmetilsulfonilo (100 \mug/ml), y pepstatina A (1 \mug/ml)] y se depositan sobre los cortes durante 2 horas a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Los portas se lavan entonces seis veces en tampón de lavado en una plataforma giratoria (5 minutos/ciclo a temperatura ambiente). Las bacterias marcadas con digoxigenina se visualizan en portas lavados con inmunoglobulina anti-digoxigenina de oveja conjugada con FITC (Boehringer Mannheim), diluída 1:100 en un tampón hitobloqueante. Los núcleos se tiñeron con bisbenzimida (Sigma). Para los controles de bloqueo, las bacterias en la fase estacionaria conjugadas con la digoxigenina pueden suspenderse en tampón de dilución hasta una OD_{600} de 0,05 y agitarse con o sin Le^{b}-HSA o Le^{a}-HSA (concentración final, 50 \mug/ml; mezcla reactiva, 200 \mul durante 1 hora a temperatura ambiente. La suspensión se dispone entonces sobre cortes congelados fijados con metanol.
Utilización
En la práctica de la presente invención, ITF puede administrarse a la piel, la superficie corneal ocular, y los tejidos en el interior de los tractos respiratorio y génito-urinario. El modo de administración, la dosis y la formulación del ITF dependerán de la condición que se esté tratando. A continuación, se proporciona otra orientación con respecto a los regímenes de tratamiento. Además, el tratamiento puede empezar antes de que haya tenido lugar una lesión, a causa de que se cree que los polipéptidos y composiciones de la invención ejercen un efecto protector.
Administración de ITF para proteger o tratar los tejidos fuera del canal alimentario.
Los polipéptidos de la invención, incluyendo los análogos de iTF, pueden utilizarse para proteger o tratar los tejidos que no se encuentran dentro del canal alimentario. Los polipéptidos puede utilizarse, por ejemplo, para tratar cualquier tipo de herida, tal como una lesión, una úlcera, una quemadura o una abrasión en la piel, la superficie ocular (es decir, la córnea) o en el interior de los tractos respiratorio o génito-urinario. La naturaleza exacta de la lesión y la causa de ésta no requieren ser definidas de modo preciso.
A pesar de la localización de la lesión, (es decir, a pesar de si ésta se encuentra o no dentro del canal alimentario), la toxicidad y la eficacia terapéutica de un compuesto dado puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar, utilizando células en cultivo o animales experimentales para determinar la LD_{50} (dosis letal para el 50% de la población) y la ED_{50} (dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD_{50}/ED50. Se prefieren los compuestos que muestran grandes índices terapéuticos. Aunque pueden utilizarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, se debe ser cuidadoso en diseñar un sistema de suministro que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado, para minimizar una lesión potencial a las células no afectadas, y, por tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y de los estudios animales, pueden utilizarse para formular un conjunto de dosificaciones para la utilización en el hombre. Las dosis de dichos compuestos forman parte preferentemente de un conjunto de concentraciones circulantes que incluyen la ED_{50} con una toxicidad pequeña o ausente. La dosis puede variar dentro de este conjunto, dependiendo de la forma de dosificación utilizada y de la vía de administración empleada. Para cualquier compuesto utilizado en el procedimiento de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. En modelos animales, puede formularse una dosis para obtener un conjunto de concentraciones plasmáticas circulantes que incluyan la IC_{50} (que es la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición máxima media de los síntomas), tal como se determina en el cultivo celular. Dicha información puede utilizarse parar determinar de forma más precisa dosis útiles en el hombre. Por ejemplo, pueden medirse niveles en el plasma mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Las composiciones farmacéuticas para uso según la presente invención, puede formularse de forma convencional utilizando uno o más transportadores o excipientes fisiológicamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden también contener glicoproteínas de mucina.
De este modo, los compuestos y sus sales y solvatos fisiológicamente aceptables pueden formularse para la administración por inhalación o insuflación (a través de la boca o la nariz) administración oral, bucal, parenteral o rectal.
Como los polipéptidos trébol no se degradan en el interior del tracto digestivo, se espera que la vía de administración sea la oral. El polipéptido podrá ser administrado, por ejemplo, en forma de un comprimido, cápsula, o píldora, o podrán ser suspendidos en una solución, tal como un jarabe, que el paciente traga. Alternativamente, la solución que contiene el polipéptido puede administrarse como un lavado gástrico. El polipéptido puede, asimismo, ser incluido en una solución que se administra como una lavativa, o puede administrarse como un supositorio.
Para la administración oral, que puede utilizarse para tratar los tejidos dañados en el interior del canal alimentario, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparadas mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona, o hidroxipropil metilcelulosa);rellenos, (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato hidrógeno cálcico), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, talco patata o talco sódico glicolato); o agentes humectantes (por ejemplo, sulfato lauril sódico). Los comprimidos pueden revestirse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otros vehículos apropiados, antes de utilizarlas. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones pueden también contener sales tamponadas, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes, y lo que corresponda. Las preparaciones para la administración oral pueden formularse apropiadamente para dar lugar a la liberación controlada del compuesto activo.
Para la administración bucal, que puede también utilizarse para tratar tejidos dañados en el interior de la boca, garganta o esófago superior, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formulados de forma convencional.
Para la administración por inhalación, que puede utilizarse para tratar tejidos dañados en el interior del tracto respiratorio, los compuestos para uso según la presente invención se suministran convenientemente presentados en forma de un rociador aerosólico a partir de empaquetamientos presurizados o de un nebulizador, con la utilización de un propelente apropiado, por ejemplo diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono y otro gas apropiado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad dosificadora puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para utilización en un inhalador o insuflador, pueden formularse conteniendo una mezcla pulverulenta del compuesto y una base pulverulenta apropiada tal como lactosa o almidón.
Las composiciones que contienen los polipéptidos de la invención pueden formularse asimismo para la administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección intravenosa rápida o infusión contínua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en formas de dosificación unitarias, por ejemplo, en ampollas o en contenedores multi-dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos acuosos o aceitosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el principio activo puede estar en forma pulverulenta para la constitución con un vehículo apropiado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su empleo.
Las composiciones pueden también formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contengan bases convencionales para supositorios, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos pueden formularse asimismo como una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de actuación a largo plazo pueden administrarse mediante implante (por ejemplo, subcutáneo o intramuscular), o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos apropiados (por ejemplo, una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble.
Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un contenedor o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas unitarias de dosificación que contengan el principio activo. El contenedor puede, por ejemplo, contener láminas metálicas o de plástico, tales como un contenedor blister. El contenedor o dispositivo dispensador puede estar acompañado con instrucciones para la administración.
Las composiciones terapéuticas de la invención pueden contener también un transportador o excipiente, muchos de los cuales son conocidos para los expertos en la técnica. Los excipientes que pueden utilizarse incluyen tampones (por ejemplo, tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato, o tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos,proteínas (por ejemplo, albúmina sérica), EDTA, clururo sódico, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Los ácidos nucleicos, polipéptidos, anticuerpos, o compuestos moduladores de la invención, pueden administrarse mediante cualquier vía estándar de administración. Por ejemplo, la administración pueden ser parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, transmucosa u oral. El compuesto modulador puede formularse de varias maneras, según la vía correspondiente de administración. Por ejemplo, las soluciones líquidas pueden hacerse para ingestión o inyección, los geles o polvos lo pueden hacer para ingestión, inhalación, o aplicación tópica. Los procedimientos para llevar a cabo dichas formulaciones son bien conocidos, y pueden encontrarse, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences". Se espera que la vía preferida de administración sea la oral.
Es bien conocido en la práctica médica que las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, que incluyen el estado general de salud, sexo, peso, área de la superficie corporal, y edad del paciente, así como el compuesto particular que va a ser administrado, el tiempo y vía de administración, y otros medicamentos que vayan a administrarse a la vez.
Las dosis para los polipéptidos y anticuerpos de la invención variarán. Para la administración oral, el polipéptido puede administrarse a dosis de entre 10 y 500 mg aproximadamente. Por ejemplo, pueden administrarse 10, 50, 100, 200, 250, 300, 400 ó 500 mg. Estas dosis pueden administrarse de forma periódica.
Por ejemplo, se puede tomar una dosis de una a cuatro veces al día. Para la administración tópica, el polipéptido puede administrarse en dosis de alrededor de 1 a 10 mg/ml aproximadamente en el interior de una pomada o crema. Esta composición puede también administrarse periódicamente, si es necesario. Para otras vías de administración, la dosis también variará, por ejemplo, entre 0,1 y 1000 mg aproximadamente por aplicación. La determinación de la dosis correcta dentro de un régimen terapéutico dado, pertenece a las aptitudes del experto en la técnica de la farmacología.
Para determinar la eficacia de un polipéptido en el tratamiento de un trastorno particular, los expertos en la técnica pueden llevar a cabo estudios rutinarios utilizando cualquiera de los diversos modelos lesionales bien conocidos.
Por ejemplo, la eficacia de un polipéptido para tratar las lesiones en la córnea puede evaluarse utilizando el modelo in vitro para la cicatrización de las heridas corneales descrito por Collin et al (Current Eye Res. 14:331-339 (1995). En este sistema modelo, las córneas que no fueron apropiadas para trasplante, se obtuvieron de donadores humanos de órganos y se utilizaron durante 5 días después de la muerte. La punta de un cauterio se utilizó para crear a lo largo de la córnea, una quemadura térmica lineal no perforante 5 mm aproximadamente.
Las córneas heridas se sometieron inmediatamente a disección y se dispusieron en un sistema aire/líquido de cultivo de órganos (tal como se describe en Richard et al., Curr. Eye Res. 10:739-749 (1991), y Anderson et al., Ophthalmol. Vis. Sci. 3:442-449, 1993). De este modo, para determinar la eficacia de un polipéptido de la invención en el tratamiento de dicha lesión, se aplicará simplemente el polipéptido a la córnea herida, por ejemplo, situando el polipéptido en el medio de cultivo tisular, y evaluando el efecto del polipéptido sobre la cicatrización de la herida en las córneas heridas, con respecto a las córneas no lesionadas. Si es necesario un asesoramiento adicional para evaluar la herida, los expertos en la técnica pueden consultar otra vez Collin et al., (supra), quien describe asimismo el análisis histoquímico de las córneas heridas. Pueden utilizarse asimismo los protocolos para un modelo de cierre de la herida utilizando células cultivadas endoteliales corneales de conejo, (por ejemplo, véase Joyce et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 31:1816-1826, 1990). Alternativamente, para evaluar la eficacia de un polipéptido en el contexto de una herida física para la córnea, puede utilizarse la lesión inducida, tal como se describe por Kessler (Curr. Eye Res. 14:985-992, 1995). De modo similar, están disponibles numerosos modelos, en los cuales ensayar la eficacia de un polipéptido para prevenir o cicatrizar una herida en la epidermis.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: The General Hospital Corporation
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteínas de trébol intestinal
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Fisch & Richardson, P.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 225 Franklin Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: US
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 02110-2804
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: FastSEQ para Windows Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/- -
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-ABRIL-1997
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/631,469
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-ABRIL-1996
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/191,352
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 2-FEBRERO-1994
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/037,741
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 25-MARZO-1993
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/837,192
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 13-FEBRERO-1992
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 07/655,965
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-FEBRERO-1991
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Meiklejohn, Ph.D., Anita L.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 35,283
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: 00786/322W01
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 617-542-05070
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: 617-542-8906
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEFAX: 200154
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 431 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 18..260
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 81 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO FRAGMENTO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 403 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 101 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCGGCCGC 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTACATTCTG TCTCTTGCAG A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAACCCTGCT GCTGCTGGTC CTGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTTGCGTGC TGCCATGGAG A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGCAATTAG AACAGCCTTG T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGTGTAAC AACCGTGGTT GCTGC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGACCCTGTG TCATCACCCT GGC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGCTGCTCT GATGGCCGCC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCGGCCACA GTCGATGAAT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGAGGTTGC TGTTTTGATG ACA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCAAGTCTT GATGTAGCCA GTT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 62 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 59 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 74 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
7

Claims (7)

1. Utilización de un polipéptido que comprende un factor trébol intestinal para la producción de un medicamento destinado al tratamiento o a la inhibición de la formación de una lesión en la piel, una lesión en la superficie corneal ocular, una lesión en el tracto respiratorio o una lesión en el tracto génito-urinario en un paciente, presentando dicho factor trébol intestinal una identidad secuencial de por lo menos el 90% con SEC. ID. nº: 18 sobre más de 35 residuos aminoácidos contiguos.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho paciente recibe terapia de radiación para el tratamiento del cáncer.
3. Utilización según las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicho paciente recibe quimioterapia para el tratamiento del cáncer.
4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho polipéptido es apropiado para la administración oral.
5. Utilización según la reivindicación 4, en la que para la administración oral se utilizan entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 miligramos de dicho polipéptido.
6. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido es apropiado para la administración tópica.
7. Utilización según la reivindicación 6, en la que dicho polipéptido se encuentra en una pomada en una cantidad comprendida entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml.
ES97921148T 1996-04-12 1997-04-11 Proteinas de trebol intestinal. Expired - Lifetime ES2287952T3 (es)

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