PT954330E - Proteínas trevo intestinais - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Proteínas trevo intestinais" ANTECEDENTES DO INVENTO O campo do presente invento é o de péptidos que são úteis para o diagnóstico, a prevenção ou o tratamento de feridas, incluindo as que estão associadas a um distúrbio gastrointestinal.

Jorgensen et al. (Regulatory peptides 3: 231, 1982) descrevem um péptido pancreático suíno, um péptido espasmolítico pancreático (PSP). Verificou-se que PSP inibe a "motilidade gastrointestinal e a secreção de ácido gástrico em animais de laboratório após administração parentérica bem como oral". Foi sugerido que "se os resultados em experiências animais puderem ser confirmados no homem, PSP pode possuir uma potencial utilidade no tratamento de doenças de úlcera gastroduodenal". WO 92/14837 divulga um factor trevo intestinal para tratamento e diagnóstico do sistema digestivo e para protecção do tracto intestinal de ferimentos causados por infecção bacteriana ou radiação.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona a utilização de um polipéptido compreendendo um factor trevo intestinal para a produção de um medicamento para tratar ou inibir a formação de uma lesão da pele, uma lesão da superfície da córnea do olho, uma lesão do tracto respiratório ou uma lesão do tracto genito-urinário num paciente, em que o referido factor trevo intestinal tem uma identidade de sequência de pelo menos 90% com SEQ ID NO: 18 ao longo de pelo menos 35 resíduos de aminoácidos contíguos.

Outras concretizações são definidas nas reivindicações.

Por "factor trevo intestinal" ("ITF") entenda-se qualquer proteína que seja substancialmente homóloga ao 2 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ factor trevo intestinal de rato (Fig. 2; SEQ ID NO:2) e que seja expresso no intestino grosso, intestino delgado ou cólon numa maior extensão em que é expresso noutros tecidos que não o intestino delgado, intestino grosso ou cólon. Estão também incluídos: variações alélicas; mutantes naturais; mutantes induzidos; proteínas codificadas por adn que hibrida sob condições de elevado ou baixo rigor com ácidos nucleicos codificando ITF proveniente de material de ocorrência natural; e polipéptidos ou proteínas obtidos através de anti-soros para ITF, especialmente através de anti-soros para o local activo ou domínio de ligação de ITF. 0 termo inclui também outros polipéptidos quiméricos que incluem um ITF. 0 termo ITF inclui também análogos de polipéptidos ITF de ocorrência natural. Os análogos podem diferir de ITF de ocorrência natural através de diferenças nas sequências de aminoácidos ou através de modificações que não afectem a sequência, ou através de ambas. Os análogos do presente invento exibirão geralmente pelo menos 90%, de preferência 95% ou mesmo 99% de homologia com toda ou parte de uma sequência de ITF de ocorrência natural. O comprimento das sequências em comparação será geralmente de mais de 35 resíduos de aminoácidos. As modificações incluem derivação química in vivo ou in vitro de polipéptidos, p. ex., acetilação ou carboxilação. Estão também incluídas modificações de glicosilação, p. ex., as feitas através de modificação dos padrões de glicosilação de um polipéptido durante a sua síntese e processamento ou noutros passos do processamento, p. ex., através de exposição do polipéptido a enzimas que afectem a glicosilação derivadas de células que proporcionam normalmente tal processamento, p. ex., enzimas de glicosilação de mamífero. Estão também englobadas versões da mesma sequência de aminoácidos primária que possuem resíduos de aminoácidos fosforilados, p. ex., fosfotirosina, fosfosserina ou fosfotreonina. Os análogos podem diferir do ITF de ocorrência natural através de alterações na sua sequência primária. Estas incluem variantes genéticas, tanto naturais como induzidas. Os mutantes induzidos podem ser derivados através de várias técnicas, incluindo mutagénese aleatória dos ácidos nucleicos codificantes utilizando irradiação ou exposição a etanometilsulfato (EMS), ou podem incorporar alterações produzidas através de mutagénese 3 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ específica do local ou outras técnicas de biologia molecular. Ver, Sambrook, Fritsch e Maniatis, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Estão também incluídos análogos gue incluem resíduos diferentes dos L-aminoácidos de ocorrência natural, p. ex., D-aminoácidos ou aminoácidos de ocorrência não natural ou sintéticos, p. ex., β- ou γ-aminoácidos.

Um polipéptido ITF ou análogo é biologicamente activo se exibir uma actividade biológica de um ITF de ocorrência natural, p. ex., a capacidade para alterar a motilidade gastrointestinal num mamífero.

Tal como aqui se utiliza, o termo "substancialmente puro" descreve um composto, p. ex., um ácido nucleico, uma proteína ou um polipéptido, p. ex., uma proteína ou polipéptido ITF, que é substancialmente isento dos componentes que naturalmente o acompanham. Tipicamente, um composto é substancialmente puro quando pelo menos 60%, de preferência pelo menos 75%, de maior preferência pelo menos 90% e ainda de maior preferência pelo menos 99%, do material total (por volume, por peso líquido ou seco ou por percentagem molar ou fracção molar) numa amostra é o composto de interesse. A pureza pode ser medida através de qualquer método apropriado, p. ex., no caso dos polipéptidos, através de cromatografia em coluna, electroforese em gel de poliacrilamida ou análise de HPLC.

Por "ADN isolado" entenda-se ADN que está livre dos genes que, no genoma de ocorrência natural do organismo do qual o dado ADN é derivado, flanqueiam o ADN. O termo "ADN isolado" engloba assim, por exemplo, ADNc, ADN genómico clonado, e ADN sintético. Um "ácido nucleico purificado", tal como aqui se utiliza, refere-se a uma sequência de ácido nucleico que está substancialmente livre de outras macromoléculas (p. ex., outros ácidos nucleicos e proteínas) com os quais ocorre naturalmente dentro de uma célula. Em concretizações preferidas, menos de 40% (e de preferência menos de 25%) da preparação de ácido nucleico purificada consiste nessas outras macromoléculas. 4 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ "Homóloga", tal como aqui se utiliza, refere-se à semelhança de sequência de subunidade entre duas moléculas poliméricas, p. ex., entre duas moléculas de ácido nucleico, p. ex., duas moléculas de ADN, ou duas moléculas polipeptidicas. Quando uma posição de subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica, p. ex., se uma posição em cada uma das duas moléculas de ADN estiver ocupada por adenina, então elas são homólogas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função directa do número de posições coincidentes ou homólogas, p. ex., se metade, p. ex., 5 de 10, das posições nas sequências de dois compostos foram homólogas então as duas sequências são 50% homólogas; se 90% das posições, p. ex., 9 de 10, forem coincidentes ou homólogas as duas sequências partilham 90% de homologia. Por exemplo, as sequências de ADN 5'-ATTGCC-3' e 5'-TATGGC-3' partilham 50% de homologia. Por "substancialmente homóloga" entenda-se grandemente mas não totalmente homóloga.

As proteínas ITF utilizáveis de acordo com o presente invento são resistentes à destruição no tracto digestivo.

Em geral, as proteínas trevo, incluindo ITF, podem ser utilizadas para tratar ou para inibir a formação de lesões da superfície externa da pele, da superfície da córnea do olho e do tracto respiratório e do tracto genito-urinário.

Os tecidos adicionais que podem ser protegidos ou tratados através de um ITF incluem os listados acima, que residem fora do canal alimentar. O termo "idêntico", tal como aqui se utiliza em referência a sequências polipeptidicas ou de ADN, refere-se à identidade de sequência de subunidade entre duas moléculas. No caso, de sequências de aminoácidos que são menos de 100% idênticas a uma sequência de referência, as posições não idênticas são de preferência, mas não necessariamente, substituições conservativas para a sequência de referência. As substituições conservativas incluem tipicamente substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, 5 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ arginina; e fenilalanina, tirosina. A identidade de sequência é tipicamente medida utilizando suporte lógico de análise de sequências tal como o Sequence Analysis Software Package do Genetics Computer Group na University of Wisconsin (Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705), e os parâmetros por defeito ai especificados.

Os tecidos que residem foram do canal alimentar tal como listados acima podem também ser tratados através da administração ao paciente de pelo menos um péptido trevo no caso de tais tecidos estarem danificados por uma lesão, ou estarem em risco de ser danificados (i.e., o método pode ser realizado profilacticamente). 0 péptido que é administrado é o péptido trevo intestinal (ITF). Para o tratamento de pacientes humanos espera-se que o péptido seja expresso por um gene humano. Espera-se que a via tipica de administração seja a oral. A determinação de outras vias de administração e da dosagem eficaz está bem dentro da perícia na arte e dependerá de muitos factores conhecidos destes peritos. As proteínas trevo podem ser administradas individualmente, em combinação umas com as outras e/ou em combinação com preparações de glicoproteínas mucina. O "tratamento de lesões" engloba tanto a inibição da formação da lesão como a cicatrização de lesões já formadas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma representação da sequência nucleotídica do factor trevo de rato (SEQ ID NO:l). A Figura 2 é uma representação da sequência de aminoácidos deduzida do factor trevo de rato (SEQ ID NO:2). A Figura 3 é uma representação das sequências de aminoácidos do factor trevo de rato, da proteína S2 e do polipéptido espasmolítico pancreático (SP). As sequências estão alinhadas para ilustrar a homologia da sequência de aminoácidos entre as proteínas. Os traços (-) indicam a inserção de espaços que optimizam o alinhamento. As barras indicam a identidade de sequência. 6 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ A Figura 4 representa a estrutura de ligação dissulfureto proposta para a pS2 (SEQ ID NO:15; painel A) e PSP (SEQ ID NO:16; painel B). A Figura 5 é uma representação da estrutura de ligação dissulfureto proposta do factor trevo intestinal de rato (SEQ ID NO:17). A Figura 6 é uma representação da sequência nucleotidica do ADNc do factor trevo intestinal humano e da correspondente sequência de aminoácidos deduzida (SEQ ID N0:3). A Figura 7 é um diagrama representando a estratégia utilizada para mutar o gene de ITF em células estaminais embrionárias. A Figura 8 é um gráfico que representa a sobrevivência após administração de Sulfato de Dextrano Sódico (DSS; 2,5% p/v na água de beber durante 9 dias consecutivos), mostrada como a transformação de Kaplan-Meier da probabilidade versus os dias de tratamento com DSS.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Purificação e clonagem de rITF

Um inibidor da formação de colónias em ágar mole por células BT-20 derivadas de carcinoma da mama humano (ATCC HTB79) foi isolado a partir de efusões malignas humanas positivas na citologia (Podolsky et al., Câncer Res. 48: 418, 1988) . O factor também inibia a formação de colónias em ágar mole por células HCT15 derivadas de carcinoma do cólon humano (ATCC-CCL225). A inibição não foi observada para linhas de fibroblastos de roedor transformadas com virus de polioma e de sarcoma de murideo. 0 factor isolado (factor inibidor do crescimento de células transformadas ou TGIF) tinha um peso molecular aparente de 110 000 Da e parecia consistir em duas subunidades de 55 000 Da ligadas através de ligações sulfidrilo. 7 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ A proteína purificada foi parcialmente sequenciada. A sequência dos 14 aminoácidos amino-terminais foi utilizada para produzir um conjunto de sondas oligonucleotídicas degeneradas para pesquisa de uma biblioteca de ADNc de células epiteliais intestinais de rato.

Uma biblioteca de ADNc intestinal de rato (Lambda ΖΑΡ II, Stratagene, La Jolla, CA) foi produzida através de técnicas padrão (Ausubel et al., Eds., em "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1989) utilizando células purificadas através do método de Weisner (J. Biol. Chem. 248: 2536, 1973). A pesquisa da biblioteca de ADNc com a sonda oligonucleotídica completamente degenerada descrita acima resultou na selecção de 21 clones. Um dos clones (T3411) incluía uma sequência central que codificava um único enquadramento de leitura aberto. A sequência nucleotídica do enquadramento de leitura aberto e do ADN flanqueador é apresentada na Fig. 1 (SEQ ID N0:1). A inserção presente em T3411 foi traduzida por cortes (Ausubel et al., supra) para produzir uma sonda radioactivamente marcada para análise "Northern blot" do ARN poli(A)+ de rato. A análise de Northern demonstrou que o ARN correspondente ao fragmento de ADNc clonado era expresso no intestino delgado, no intestino grosso e no rim; não foi detectada expressão no pulmão, baço, coração, testículos, músculo, estômago, pâncreas ou fígado. Nos tecidos nos quais o ARN era expresso, o nível era comparável ao da actina. 0 enquadramento de leitura aberto do clone T3411 codificava um péptido de 81 aminoácidos (Fig. 2; SEQ ID N0:2). A comparação da sequência do péptido codificado, referido como factor trevo intestinal de rato (rlTF), com a sequência de proteínas na base de dados GenBank revelou uma homologia significativa com o péptido associado a cancro da mama humano (pS2; Jakowlev et al., Nucleic Acids Res. 12: 2861, 1984) e o péptido espasmolítico pancreático suíno (PSP; Thim et al., Biochem. Biophys. Acta 827: 410, 1985). A Figura 3 ilustra a homologia entre rlTF, PSP e pS2. Pensa-se que o factor espasmolítico pancreático suíno (PSP) e pS2 se dobram numa estrutura característica referida como trevo. Uma estrutura em trevo consiste em três voltas formadas por três ligações dissulfureto. Pensa-se que pS2 inclui um trevo 8 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ (Fig. 4Α) e pensa-se que PSP inclui dois trevos (Fig. 4B). A região do rITF (nucleótido 114 ao nucleótido 230 que codifica Cys a Phe), que é mais semelhante a PSP e pS2, inclui seis cisteinas, todas as quais estão na mesma posição que as cisteinas que constituem o trevo em pS2 (Fig. 3) . Cinco destas seis cisteinas estão na mesma posição que as cisteinas que formam o trevo amino-terminal de PSP (Fig. 3). A Figura 5 representa a configuração da ligação dissulfureto proposta de rITF .

Com base na homologia com PSP e pS2 (Mori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 155: 366, 1988; Jakowlew et al., Nucleic Acids Res. 12: 2861, 1984), rITF inclui uma presumível pró-sequência (meti a ala22) na qual 12 dos 22 aminoácidos possuem cadeias laterais hidrófobas.

Produção de Anticorpos Anti-rITF

Um péptido correspondendo aos 21 aminoácidos carboxi-terminais de rITF foi sintetizado e conjugado com albumina de soro bovino (BSA). Este conjugado (e o péptido não conjugado) foi utilizado para criar anticorpos policlonais em coelhos. Todos os procedimentos foram protocolos padrão tais como os descritos em Ausubel et al. {supra). Os anticorpos anti-rlTF foram utilizados num ensaio de imunofluorescência indirecto para visualização de rITF em tecidos de rato. Foram preparadas crio-secções de tecidos de rato utilizando técnicas padrão e foi utilizado anticorpo monoclonal de cabra anti-coelho marcado com fluoresceina (anticorpos marcados estão disponíveis em fornecedores tais como Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersberg, MD; e Bioproducts for Science, Inc., Indianapolis, IN) para detectar a ligação dos anticorpos de coelho anti-rlTF. Através desta análise o rITF parece estar presente nas células caliciformes do intestino delgado mas não no estômago nem no pâncreas.

Clonagem do Factor Trevo Intestinal Humano O ADN codificando o factor trevo intestinal de rato pode ser utilizado para identificar um clone de ADNc codificando o factor trevo intestinal humano (hlTF). Isto pode ser alcançado através de pesquisa de uma biblioteca de ADNc de 9 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ cólon humano com uma sonda derivada do rlTF ou com uma sonda derivada de parte do gene de hlTF. A última sonda pode ser obtida a partir de um ADNc de cólon ou intestinal humano utilizando a reacção em cadeia da polimerase para isolar uma parte do gene de hlTF. Esta sonda pode servir como sonda especifica para a identificação de clones codificando todo o gene de hlTF.

Construção de uma Biblioteca de ADNc

Uma biblioteca de ADNc de cólon ou intestinal humana em ÀgtlO ou Àgtll, ou nalgum outro vector adequado é útil para o isolamento de hlTF. Tais bibliotecas podem ser adquiridas (Clontech Laboratories, Paio Alto, CA: HLl034a, HLl0346b). Alternativamente, pode ser produzida uma biblioteca utilizando raspagens de mucosa de cólon ou intestino humano. Resumidamente, o ARN total é isolado do tecido essencialmente tal como descrito por Chirgwin et al. (Biochemistry 18: 5294, 1979; ver também Ausubel et al., supra). É então utilizada uma coluna de oligo (dT) para isolar o ARN poli(A)+ através do método de Aviv et al. (J. Mol. Biol. 134: 743, 1972; ver também Ausubel et al., supra). 0 ADNc de cadeia dupla é então produzido através de transcrição reversa utilizando oligo (dT) i2-8 ou iniciadores hexaméricos aleatórios (ou ambos). São então utilizadas ARNase H e ADN-polimerase I de E. coll para substituir a cadeia de ARN por uma segunda cadeia de ADN. Num passo subsequente, ADN-ligase de E. coll e a ADN-polimerase T4 são utilizadas para fechar intervalos na segunda cadeia de ADN e criar extremidades cegas. Geralmente, o ADNc criado é a seguir metilado com metilase de EcoRI e são adicionados ligantes EcoRI (podem ser utilizados outros ligantes dependendo do vector a utilizar). Em passos subsequentes os ligantes em excesso são removidos através de digestão de restrição e os fragmentos de ADNc são inseridos no vector desejado. Ver Ausubel et al., supra e Sambrook et al. (em "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1990) para protocolos detalhados.

Os vectores úteis incluem: Àgtll, ÀgtlO, vector Lambda ΖΑΡ® II, vector Lambda Uni-ZAP™ XR, todos disponíveis em Stratagene (La Jolla, CA). 10 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ A biblioteca de ADNc tem de ser empacotada nos fagos; isto é mais facilmente alcançado através da utilização de um estojo de empacotamento in vitro comercial, p. ex., Gigapack® II Gold ou Gigapack® II Plus (Stratagene, La Jolla, CA). Ver Ausubel et al. (supra) para protocolos de empacotamento e estirpes hospedeiras adeguadas. A biblioteca é de preferência amplificada logo após o empacotamento; este passo gera clones suficientes para múltiplas pesguisas da biblioteca. Ver, Ausubel et al., supra, ou Sambrook et al., supra, para detalhes sobre os protocolos de amplificação e procedimentos para armazenamento da biblioteca amplificada.

Pesquisa da biblioteca de ADNc

Para pesquisar a biblioteca esta tem de ser colocada numa estirpe hospedeira apropriada (p. ex., Y1090 ou Y1088 para bibliotecas de ÀgtlO, C600hflA para bibliotecas de XgtlO). Após plaqueamento do fago, as placas são transferidas para filtros de nitrocelulose ou nylon (ver Ausubel et al., supra e Sambrook et al., supra). Os filtros são então sondados com uma sonda traduzida por cortes marcada com a32P derivada de rITF. A sonda é de preferência gerada utilizando uma porção da região do adn de rITF que codifica para a estrutura em trevo (nucleótidos 114 a 230 de SEQ ID NO:l, que codificam Cys32 a Phe71 de SEQ ID NO:2). Esta região é conservada entre rITF, pS2 e PSP e é provável que esta região seja conservada entre rITF e hlTF. Uma vez identificada uma placa fágica, são necessários vários ciclos de purificação de placas fágicas para isolar um clone puro codificando hlTF. É efectuado um isolamento de ADN fágico e a inserção de ADNc pode ser subclonada num vector apropriado para mapeamento de restrição e sequenciação. Se o vector fágico for Lambda ΖΑΡ® II, a co-infecção com um fago auxiliar permite a recuperação e recircularização do vector fagemidico pBluescript SK“ (Stratagene, La Jolla, CA) ancorando o ADNc; alternativamente, o clone fágico é purificado e a inserção de ADNc é subclonada num vector adequado para mapeamento de restrição e sequenciação. Se o clone não contiver o gene de hlTF inteiro (avaliado através da homologia com rITF e a presença de codões de inicio e stop), a biblioteca pode ser novamente pesquisada com a sonda de rITF original ou, de 11 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ preferência, com uma sonda gerada a partir do clone de rITF obtido. Se nenhum dos clones contiver o gene intacto, este pode ser reconstruído a partir de clones que possuem fragmentos sobreponíveis de hlTF.

isolamento Directo de uma Sonda de hlTF através de PCR É possível isolar parte do gene de hlTF directamente a partir da biblioteca empacotada ou do ADNc. Para isolar uma porção de hlTF directamente a partir da biblioteca empacotada, um par de iniciadores oligonucleotídicos e polimerase Taq são utilizados para amplificar o ADN correspondente ao gene de hlTF. Os iniciadores utilizados terão aproximadamente 15-20 nucleótidos de comprimento e correspondem em sequência às porções mais 5' e mais 3' da sequência de codificação de rITF. Friedman et al. (em "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA) descrevem um procedimento para tal amplificação. Resumidamente, são quebradas partículas fágicas através de aquecimento; são adicionados polimerase Taq, iniciadores (300 pmol de cada), dNTP e tampão de polimerase Taq; e a mistura é sujeita a ciclos térmicos para amplificar o ADN. O ADN amplificado é isolado através de electroforese em gel de agarose. As extremidades do fragmento são preparadas para ligação num vector apropriado tornando-as niveladas com polimerase T4 e, se desejado, adicionando ligantes. Alternativamente, pode ser modificado um local de restrição no fragmento através da utilização de iniciadores que possuam uma sequência adicionada às suas extremidades 5' que irá gerar uma extremidade coesiva apropriada quando digerida. Por exemplo a sequência: 5'-GGGCGGCCGC-3' (SEQ ID NO:4) pode ser adicionada à extremidade 5' de cada iniciador. Esta sequência inclui o local de restrição NotI flanqueado na extremidade 5' pela sequência: GG. Os nucleótidos adicionais impedem que as extremidades 5' se desnaturem e interfiram com a subsequente digestão de restrição com NotI. O ADN purificado em gel com o tamanho apropriado é depois clonado num vector de clonagem para sequenciação e mapeamento de restrição. Este clone não possuirá a sequência de rITF inteira, em vez disso será uma combinação de hlTF (a região entre as sequências correspondentes aos iniciadores) e rITF (as extremidades 5' 12 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ e 3' que correspondem às sequências iniciadoras). Contudo, este ADN pode ser utilizado para gerar uma sonda marcada (produzida através de tradução por cortes ou marcação aleatória por iniciadores) que, uma vez sendo a sequência de hlTF correcta, pode ser utilizada numa pesquisa de elevado rigor da biblioteca da qual o adnc foi originalmente isolado. Numa abordagem alternativa, pode ser utilizado no procedimento de cima o ADNc, em vez de uma biblioteca empacotada. Isto elimina os passos de modificação do ADNc para inserção num vector bem como o empacotamento do ADNc e a amplificação da biblioteca. Ausubel et al., supra proporcionam um protocolo para a amplificação de um determinado fragmento de ADN directamente a partir de ADNc e um protocolo para amplificação a partir de ARN poli(A)+.

Identificação de um Presumível Clone de ITF Humano

Uma sonda traduzida por cortes derivada de ADNc de rITF (correspondente aos nucleótidos 1 a 431 de SEQ id NO:l) foi utilizada para análise "Northern blot" de ARN poli(A)+ derivado de raspagens da mucosa intestinal humana. A hibridação com a sonda e a lavagem dos filtros foram realizadas de acordo com procedimentos padrão. A sonda (5χ105 cpm/ml de tampão de hibridação) foi hibridada com o filtro a 45°C em SSC 5x com formamida a 30%. O filtro foi então lavado a 60°C em SSC 5x com formamida a 40%. Utilizando este protocolo, era claramente visível uma banda após exposição de um dia para o outro do filtro com um ecrã intensificador. Este resultado indicou que existe homologia suficiente entre rITF e hlTF para permitir a utilização de sondas derivadas da sequência do gene de rITF para identificação do gene de hlTF.

Uma biblioteca de ADNc intestinal humana foi obtida em Clontech (Paio Alto, CA) . Alternativamente, pode ser produzida uma biblioteca de ADNc intestinal humana a partir de raspagens da mucosa tal como descrito acima. Foram seleccionadas quatro sondas oligonucleotídicas para pesquisar a biblioteca de ADNc. Duas das sondas correspondem a sequências dentro da região de rITF codificando o trevo e são referidas como sondas internas (5'-GTACATTCTGTCTCTTGCAGA-3') (SEQ ID NO:5) e 5'-TAACCCTGCTGCTGCTGGTCCTGG-3' (SEQ ID NO:6). 13 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ

As outras duas sondas reconhecem sequências dentro de rITF mas fora da região de codificação do trevo e são referidas como sondas externas (5'-GTTTGCGTGCTGCCATGGAGA-3') (SEQ ID NO: 7) e 5'-CCGCAATTAGAACAGCCTTGT-3' (SEQ ID NO:8). Estas sondas foram testadas quanto à sua utilidade através da sua utilização para pesquisar a biblioteca de ADNc intestinal de rato descrita acima. Cada uma das quatro sondas pôde ser utilizada para identificar um clone ancorando todo ou parte do gene de rITF. Este resultado indica que estas sondas podem ser utilizadas para pesquisar a biblioteca intestinal humana quanto à presença de hlTF.

As sondas internas foram utilizadas tal como descrito acima para amplificar um fragmento de ADN a partir do ADNc da biblioteca de cólon humano (Clontech, Paio Alto, CA) . Foram adicionados ligantes ao fragmento de ADN isolado que foi então inserido no vector fagemidico pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . A região deste clone correspondente à sequência do ADNc humano (i.e., não incluindo a sequência correspondente às sondas internas) foi utilizada para produzir uma sonda marcada radioactivamente através de síntese iniciada por oligonucleótidos aleatórios (Ausubel et al., supra). Esta sonda foi então utilizada para pesquisar a biblioteca de ADNc de cólon humano. Esta pesquisa conduziu à identificação de 29 clones. Um destes clones (HuPCR-ITF) foi traduzido por cortes para gerar uma sonda para análise de "Northern" de ARN poli(A)+ isolado a partir de raspagens da mucosa intestinal humana. Foi observada uma única banda de aproximadamente o mesmo tamanho que o transcrito de rato (aproximadamente 0,45 kDa). A análise de "Northern" do poli(A)+ isolado a partir de tecidos humanos indicou que o ARN correspondente a esta sonda era expresso no intestino delgado e no intestino grosso mas não no estômago nem no fígado. Estes resultados indicam que o clone não codifica o homólogo do PSP suíno. O PSP suíno é expresso no pâncreas suíno e não é significativamente expresso no intestino delgado nem no grosso. Estes resultados distinguem também o gene clonado de pS2 que é expresso no estômago. 14 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ A Figura 6 mostra a informação da sequência de ácido nucleico para o ADNc de ITF humano, juntamente com a sequência de aminoácidos deduzida no código de uma letra (SEQ ID NO:3). Este clone foi obtido através dos métodos descritos acima.

Produção de hlTF O gene de hlTF isolado pode ser clonado num vector de expressão de mamífero para expressão proteica. Os vectores apropriados incluem pMAMneo (Clontech, Paio Alto, CA) que proporciona um estimulador RSV-LTR ligado a um promotor MMTV-LTR indutível com dexametasona, uma origem de replicação de SV40 (permite a replicação em células COS), um gene de neomicina e locais de processamento e poliadenilação de SV40. Este vector pode ser utilizado para expressar a proteína em células COS, células CHO ou fibroblastos de ratinho. 0 gene pode também ser clonado num vector para expressão em células de Drosophila utilizando o sistema de expressão de baculovírus.

Purificação do Factor Trevo Intestinal 0 factor trevo intestinal pode ser purificado a partir de raspagens da mucosa intestinal de seres humanos, ratos ou qualquer outra espécie que expresse ITF (porcos e vacas podem proporcionar uma fonte de ITF). O procedimento de purificação utilizado para PSP será útil para a purificação de ITF uma vez que é provável que as proteínas sejam homólogas. J0rgensen et al. descrevem um método para a purificação de PSP (Regulatory Peptides 3: 207, 1982). O método preferido é a segunda abordagem descrita por J0rgensen et al. (supra). Este método envolve cromatografia em colunas SP-Sephadex C-25 e QAE Sephadex A-25 (Sigma, St. Louis, MO) em tampão ácido.

Anticorpos Monoclonais Anti-Factor Trevo Intestinal

Os anticorpos monoclonais anti-factor trevo intestinal podem ser criados contra péptidos sintéticos cujas sequências sejam baseadas na sequência de aminoácidos deduzida do hlTF clonado (SEQ ID NO:3). Muito vulgarmente o péptido baseia-se nos 10-20 aminoácidos amino- ou carboxi-terminais da proteína 15 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ de interesse (aqui, ITF). O péptido é normalmente quimicamente ligado de modo cruzado a uma molécula transportadora tal como albumina de soro bovino ou hemocianina da lapa. O péptido é seleccionado com o objectivo de gerar anticorpos que reagirão de modo cruzado com o hlTF nativo. Concordantemente, o péptido deve corresponder a uma região antigénica do péptido de interesse. Isto é alcançado através da escolha de uma região da proteina que (1) esteja exposta à superfície, p. ex., uma região hidrófoba ou (2) seja relativamente flexível, p. ex., uma região de volta ou uma região de volta β. Em qualquer caso, se o péptido for para ser conjugado com um transportador, tem de possuir um aminoácido com uma cadeia lateral capaz de participar na reacção de conjugação. Ver Hopp et al. (Mol. immunol. 20: 483, 1983; J. Mol. Biol. 157: 105, 1982) para uma discussão dos tecidos envolvidos na selecção de péptidos antigénicos. Uma segunda consideração é a presença de uma proteína homóloga ao hlTF no animal a imunizar. Se uma tal proteína existir, é importante seleccionar uma região de hlTF que não seja altamente homóloga a esse homólogo.

Para hlTF, é provável que os péptidos que correspondem aos 15 aminoácidos amino-terminais ou carboxi-terminais sejam menos homólogos entre espécies e expostos à superfície (e assim antigénicos). Assim, são preferidos para a produção de anticorpos monoclonais. O hlTF purificado pode também ser utilizado para a criação de anticorpos. A Destruição Genética de uma Proteína Trevo Impede a Defesa da Mucosa Intestinal

Tal como afirmado acima, ITF é um membro da família das proteínas trevo que são expressas especificamente e abundantemente na superfície da mucosa do tracto gastrointestinal. Outros membros desta família incluem pS2, que é expressa quase exclusivamente por células foveolares do estômago (Masiakowski et al., Nuc. Acids Res. 10: 7896, 1982; J0rgensen et al., Regulatory Peptides 3: 231, 1982) e o péptido espasmolítico pancreático (SP), que é expresso pelo pâncreas e pelo antro gástrico (J0rgensen et al., supra). Tal como descrito acima, a expressão destas proteínas é estimulada na proximidade do intestino danificado. Para 16 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ estudar ο papel de ITF in vivo, o gene foi tornado não funcional através de destruição direccionada em ratinhos.

Isolamento do Gene de ITF de Murídeo e Criação de Ratinhos Deficientes em ITF 0 gene ITF de murideo foi isolado a partir de uma biblioteca genómica fágica utilizando a sequência de ADNc de ITF de rato como sonda e a sua identidade foi confirmada através de sequenciação dos nucleótidos utilizando técnicas padrão (Mashimo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210: 31, 1995).

Um vector direccionador para destruição do gene através de recombinação homóloga em células estaminais embrionárias (ES) foi desenhado e construído, tal como mostrado na Figura 7. O segundo exão inteiro (Ex2) do gene de ITF de murídeo, que está contido dentro do fragmento Xbal-EcoRI mostrado, foi substituído pela cassete do gene de resistência à neomicina (neo). Uma vez que a sequência suprimida codifica a maior parte do "domínio em trevo", a capacidade de qualquer um dos péptidos resultantes para produzir a estrutura em voltas característica das proteínas trevo fica abolida. Uma estratégia de selecção de positivos-negativos (Mansour et al., Nature 336: 348, 1988) foi utilizada para enriquecer em acontecimentos de recombinação homóloga as células estaminais embrionárias (ES) através de selecção de neo dentro do ADN homólogo e contra um gene da timidina-quinase do vírus de herpes simples {hsv-tk) colocado na extremidade 3' do vector direccionador. O plasmídeo pPNT (Tybulewicz et al., Cell 65: 1153, 1991) foi utilizado para construir o vector direccionador. O vector direccionador foi linearizado com a enzima de restrição NotI e sujeito a electroporação em células ES Jl pluripotentes (Li et al., Cell 69: 915, 1992) sob as condições anteriormente descritas (Strittmatter et al., Cell 80: 445, 1995). A destruição do gene de ITF em células ES após recombinação homóloga foi distinguida da integração aleatória do vector direccionador através de análise "Southern blot" do ADN genómico de cada clone das células digerido com a enzima de restrição Xhol. A sonda pITF2 identificou um fragmento "de tipo selvagem" de 19 kb e um fragmento "knockout" de 23 kb criado através da introdução 17 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ de um local Xhol após inserção homóloga do vector direccionador. Verificou-se que aproximadamente 10% dos clones de ES resistentes à neomicina sofreram recombinação homóloga de ITF utilizando este método.

Foi utilizada reacção em cadeia da polimerase (PCR) para confirmar a mutação direccionada como se segue. Uma região do ADN de 200 pb foi amplificada utilizando iniciadores que abrangem o exão 2 de ITF (5'-GCAGTGTAACAACCGTGGTTGCTGC-3' (SEQ ID NO:9) e 5'-TGACCCTGTGTCATCACCCTGGC-3' (SEQ ID NO:10)); e foi amplificada uma região de 400 pb do gene neo com um segundo conjunto de iniciadores (5'-CGGCTGCTCTGATGGCCGCC-3' (SEQ ID NO:11) e 5'-GCCGGCCACAGTCGATGAATC-3' (SEQ ID NO:12)). O ADN molde para a reacção de PCR foi obtido a partir de tecido da cauda. Foram cortados aproximadamente 0,5 cm da cauda de cada animal e as amostras foram digeridas com proteinase K (200 μΐ a 0,5 mg/ml em Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 e Triton X-100 a 0,5%; Sigma, St. Louis, MO) a 55°C de um dia para o outro. Foi adicionado 1 μΐ desta mistura directamente a uma reacção de PCR de 25 μΐ (por Stratagene, Menosha, WI) . A reacção foi iniciada com um "inicio quente" (incubação a 96°C durante 10 minutos), e o ciclo seguinte foi repetido 30 vezes: 72°C durante 120 segundos (hibridação e alongamento) e 96°C durante 30 segundos (desnaturação). Dez μΐ de cada mistura reaccional foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 2%. Os animais de tipo selvagem foram identificados através da presença de um fragmento de 200 pb, correspondendo a um gene de ITF intacto, os animais heterozigóticos foram identificados através da presença desta banda e, adicionalmente, de um fragmento de 400 pb produzido através da amplificação do gene neo, e os animais deficientes em ITF ("knockout") foram identificados através da presença apenas do fragmento w correspondendo ao gene neo.

Dois clones de ES, que surgiram independentemente, foram utilizados para derivar duas linhas de ratinhos sem ITF. Estes ratinhos foram pesquisados através de análise genómica "Southern blot" tal como descrito para clones de ES ou através de PCR. 18 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ

Análise da Expressão do Péptido Trevo em Ratinhos de Tipo Selvagem e Mutantes

Embora a expressão de ITF esteja abolida nos ratinhos mutantes, a expressão de outros genes de trevo está conservada. A análise "Northern blot" foi efectuada utilizando sondas de ADNc para ITF (Suemori et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 11017, 1991), SP (Jeffrey et al., Gastroenterology 106: 336, 1994), e, como controlo positivo, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH). A sonda de ácido nucleico para pS2 de murideo foi produzida através de transcrição inversa-reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) utilizando os pares de oligonucleótidos: 5'-GAGAGGTTGCTGTTTTG ATGACA-3' (SEQ ID NO:13) e 5'-GCCAAGTCTTGATGTAGCCAGTT-3' (SEQ ID NO:14), que foram sintetizados com base na sequência de ADNc de pS2 de ratinho publicada (Número de Acesso GenBank: Z21858) . O GeneAmp RNA PCR Kit (Perkin-Elmer) foi utilizado de acordo com a instruções do fabricante, tal como o vector de clonagem pCR II (invitrogen). O arn foi extraído a partir dos seguintes tecidos tanto de ratinhos de tipo selvagem como deficientes em ITF ("knockout"): estômago, duodeno, ileo terminal, cólon ascendente, apêndice, cólon transverso, cólon descendente e recto. Quinze pg de ARN total de cada amostra foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 1% e transferidos para papel de nitrocelulose. Após hibridação, lavagem e autorradiografia, os ratinhos de tipo selvagem exibiam um padrão de expressão tecidual considerado normal: o ITF era expresso no intestino delgado e no cólon, o que é o mesmo padrão de expressão observado para ITF no rato e no homem. A análise dos ratinhos mutantes confirmou a falta de expressão de ITF no tracto gastrointestinal. Em contraste, a expressão de outras proteínas trevo, SP e pS2, é inalterada no tracto gastrointestinal dos ratinhos mutantes. SP era expressa no estômago e, a níveis menores, no duodeno tanto de ratinhos de tipo selvagem como mutantes. De forma semelhante, pS2 era expressa no estômago tanto de ratinhos de tipo selvagem como deficientes em ITF. 19 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ

A Imunocitoquímica Revela que ITF não é Expresso no Cólon de Ratinhos Deficientes em IFT

Para confirmar que a proteína ITF não era expressa por ratinhos "knockout" de ITF, foi efectuada imunocitoquímica como se segue. O tecido do cólon e do intestino delgado foi fixado no decurso da perfusão, imerso em paraformaldeído a 4% (McLean et al., J. Eistochem. Cytochem. 22: 1077, 1974) e impregnado em parafina. As secções foram recolhidas e coradas com um anticorpo policlonal criado contra um péptido sintético dos 18 aminoácidos carboxi-terminais previstos de ITF de murídeo ou um anticorpo monoclonal criado contra a mucina do cólon (Podolsky et al., J. Clin. Invest. 77: 1263, 1986). A ligação do anticorpo primário foi visualizada com um anticorpo secundário biotinilado e os reagentes Avidina DH, peroxidase de rábano H biotinilada e tetracloridrato de diaminobenzidina de acordo com as instruções do fabricante (VectaStain ABC, Vector Laboratories, Bulingame, CA), Após imunocitoquímica, as secções foram contrastadas com hematoxilina e observadas. As células caliciformes no cólon dos ratinhos de tipo selvagem eram imunorreactivas com ambos os anticorpos, corando positivamente para ITF e mucina. Em contraste, as células caliciformes no cólon de ratinhos deficientes em itf não tinham ITF detectável mas continuaram a expressar mucina do cólon.

Indução de Danos Suaves no Epitélio do Cólon com Sulfato Sódico de Dextrano

Os ratinhos deficientes em ITF derivados de cada clone de ES parecem desenvolver-se normalmente e são grosseiramente indistinguíveis dos irmãos heterozigóticos e de tipo selvagem. O seu crescimento não é atrasado e alcançam a maturidade sem diarreias evidentes ou perda de sangue fecal oculto. Contudo, o cólon de ratinhos deficientes em ITF pode tender mais para danos que o cólon de ratinhos de tipo selvagem. Para investigar esta hipótese, sulfato sódico de dextrano (DSS), que cria reprodutivelmente danos epiteliais suaves no cólon com ulceração em ratinhos (Kim et al., Scand. J. Gastroent. 27: 529, 1992; Wells et al., J. Acquired Immune Deficiency Syndrome 3: 361, 1990; Okayasu et al., Gastroenterology 98: 694, 1990) foi administrado na água de 20 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ beber dos animais. Após padronização dos efeitos do DSS em ratinhos de tipo selvagem comparáveis, um grupo de 20 ratinhos de tipo selvagem e 20 deficientes em ITF (irmãos de cruzamentos heterozigóticos, pesando >20 gramas cada) foram tratados com DSS a 2,5% na sua água de beber durante nove dias.

Apesar de 85% dos ratinhos de tipo selvagem e 100% dos ratinhos deficientes em ITF tratados com DSS demonstrarem sangue oculto (utilizando Hemoccult, Smith Kline Diagnostics, San Jose, CA) nas suas fezes durante o periodo de tratamento, os ratinhos deficientes em ITF foram marcadamente mais sensíveis aos efeitos danosos do DSS. Quinze porcento dos ratinhos deficientes em ITF desenvolveram diarreia francamente ensanguentada e morreram (Fig. 8). Em contraste, apenas 10% dos ratinhos de tipo selvagem tratados de modo semelhante exibiram diarreia ensanguentada e apenas 5% morreram. A perda de peso foi também significativamente mais pronunciada em ratinhos deficientes em ITF que em ratinhos de tipo selvagem recebendo DSS.

Ratinhos Deficientes em ITF Tratados com Sulfato Sódico de Dextrano (DSS) Desenvolvem Erosões Graves no Cólon

Após sete dias de tratamento com DSS (2,5% p/v), os cólon de ratinhos de tipo selvagem e deficientes em ITF foram examinados histologicamente. Secções transversais de cólon descendente foram fixadas em paraformaldeído a 4%, montadas em parafina e coradas com hematoxilina e eosina. Múltiplos locais de óbvia ulceração e hemorragia estavam presentes no cólon de ratinhos deficientes em itf, enquanto que o cólon da maioria dos ratinhos de tipo selvagem era indistinguível do de ratinhos não tratados. O exame histológico do cólon deficiente em ITF tratado com DSS confirmou a presença de múltiplas erosões e intensas alterações inflamatórias incluindo abcessos na cripta. Os danos eram mais pronunciados no cólon distai, i.e., o cólon descendente, o cólon sigmóide e o recto, que continha áreas grandes e amplas de ulceração da mucosa. Quando inspeccionado de modo semelhante pôde-se observar erosões da mucosa no tecido de 80% dos ratinhos de tipo selvagem tratados com DSS, mas a maioria eram pequenas lesões que também pareciam estar a cicatrizar, com completa 21 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ re-epitelização das maioria das lesões. Não houve provas de re-epitelização nos cólon de ratinhos deficientes em ITF expostos a DSS.

Durante o curso normal de crescimento e desenvolvimento, as células epiteliais intestinais originam-se a partir de células estaminais nas criptas intestinais e rapidamente progridem para a cripta e vilosidade para serem extrudidas da ponta da vilosidade em cinco dias. Após danos intestinais, o revestimento epitelial é repovoado por células que parecem gerar sinais para cicatrizar a lesão através da modulação do crescimento de células epiteliais e mesenquimatosas e formação de matriz (Poulsom et al., J. Clin. Gastroenterol. 17: S78, 1993). Provas in vitro sugerem que as proteínas trevo têm um papel no re-estabelecimento da integridade da mucosa após danos. Apesar da restrição normal da expressão de SP e pS2 ao tracto gastrointestinal proximal, estas proteínas trevo e ITF são abundantemente expressas em locais de danos e reparação no cólon. 0 modelo de DSS descrito acima proporciona um sistema de teste dos efeitos protectores de ITF, outros péptidos trevo ou fragmentos polipeptidicos activos, ou variantes destes. Pode-se administrar uma molécula a testar a ratinhos tratados com DSS, ratinhos de tipo selvagem ou deficientes em ITF, e determinar se a molécula possui efeitos terapêuticos através da realização dos ensaios descritos acima.

Para além da utilização de DSS, qualquer composto químico que se saiba danificar a mucosa que forra o tracto digestivo pode ser utilizado para ensaiar as proteínas do presente invento. Estes compostos incluem, mas não se limitam a, álcool, indometacina e metotrexato. Por exemplo, o metotrexato (MTX) pode ser administrado intraperitonealmente a ratinhos a uma dose de 40 mg/kg. A um grupo de animais tratados com MTX pode ser dada adicionalmente a proteína em questão. Vários parâmetros, tais como o peso corporal, a presença de lesões no tracto digestivo e a mortalidade destes animais podem ser comparados com medições equivalentes tomadas de animais que não foram tratados com a proteína. 22 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ

Ensaio de Ligação de H. pylori in situ

Um método para determinar se uma dada proteína (ou fragmento ou variante proteica) é útil na prevenção ou tratamento de doenças associadas a infecção de H. pylori é examiná-la no contexto de um modelo animal estabelecido de infecção de H. pylori. Um tal modelo foi recentemente desenvolvido por Falk et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1515-1519, 1995). Este modelo envolve a utilização de ratinhos transgénicos que expressam a enzima a-1,3/4-fucosiltransferase e, em consequência, expressam Leb à superfície das células da mucosa que se ligam a isolados clínicos de H. pylori. Se a adição de uma proteína, tal como ITF, a este sistema reduzir o nível de ligação de H. pylori às células da mucosa, a proteína será considerada um inibidor de H. pylori. Mais especificamente, o ensaio pode ser realizado como se segue. São obtidas H. pylori, por exemplo, de pacientes com úlceras gástricas ou gastrite crónica activa, criadas até à fase estacionária e marcadas, por exemplo, com digoxigenina ou isotiocianato de fluoresceína (FITC). As bactérias marcadas são então expostas, juntamente com a proteína de interesse, a secções congeladas preparadas a partir do estômago, duodeno, íleo ou fígado de ratinhos transgénicos adultos (tal como descrito acima). Como controlo, a experiência pode ser efectuada em paralelo utilizando tecido de um irmão de tipo selvagem. As secções são fixadas com metanol gelado durante 5 minutos, enxaguadas três vezes com tampão de lavagem (TBS; CaCl2 0,1 mM, MnCl2 1 mM/ MgCl2 1 mM; 10 minutos/ciclo) e tratadas com tampão de bloqueio (Boehringer Mannheim; ver também Falk, supra). As bactérias são diluídas até uma ϋΟεοο de 0,05 com tampão de diluição [TBS; CaCl2 0,1 mM, MnCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, contendo leupeptina (1 pg/ml), aprotinina (1 pg/ml), [-1-p-tosilamido-2-feniletilclorometilcetona (100 pg/ml), fluoreto de fenilmetilsulfonilo (100 pg/ml) e pepstatina A (1 pg/ml)] e vertidas sobre as secções durante 2 horas à temperatura ambiente numa câmara húmida. As lâminas são então lavadas seis vezes em tampão de lavagem numa plataforma rotativa (5 minutos/ciclo à temperatura ambiente). As bactérias marcadas com digoxigenina são visualizadas em lâminas lavadas com imunoglobulina de ovelha anti-digoxigenina conjugada com FITC (Boehringer Mannheim) diluída 1:100 num tampão de 23 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ histobloqueio. Os núcleos foram corados com bisbenzimida (Sigma). Para os controlos de bloqueio, as bactérias em fase estacionária conjugadas com digoxigenina podem ser suspensas em tampão de diluição até uma D06oo de 0,05 e agitadas com ou sem Leb-HSA ou Lea-HSA (concentração final, 50 pg/ml; mistura reaccional, 200 μΐ durante 1 hora à temperatura ambiente) . A suspensão é então vertida sobre as secções congeladas fixadas em metanol.

Utilização

Na prática do presente invento, o ITF pode ser administrado na pele, na superfície da córnea do olho e em tecidos dentro do tracto respiratório e genito-urinário. O modo de administração, dosagem e formulação de ITF dependerá da condição a tratar. Mais orientações em relação aos regímenes de tratamento são dadas abaixo. Para além disso, o tratamento pode começar antes de ocorrer um dano porque se crê que os polipéptidos e as composições do presente invento exercem um efeito protector.

Administração de ITF para Proteger ou Tratar Tecidos Fora do Canal Alimentar

Os polipéptidos do presente invento, incluindo ITF e análogos, podem ser utilizados para proteger ou tratar tecidos que não se verificam dentro do canal alimentar. Os polipéptidos podem ser utilizados, por exemplo, para tratar qualquer tipo de ferida, tal como uma lesão, uma úlcera, uma queimadura ou uma abrasão na pele, na superfície do olho (i.e., da córnea) ou dentro dos tractos respiratórios ou genito-urinários. A natureza exacta do dano e a causa do dano não necessita de ser definida com precisão.

Independentemente da localização do dano (i.e., independentemente de se o dano está ou não dentro do canal alimentar), a toxicidade e a eficácia terapêutica de um dado composto podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrão, utilizando células em cultura ou animais experimentais para determinar a DL50 (a dose letal para 50% da população) e a DE50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de doses entre os 24 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ efeitos tóxicos e terapêuticos é o indice terapêutico e pode ser expresso como a razão DL5o/DE5o. São preferidos compostos que exibam indices terapêuticos grandes. Embora possam ser utilizados compostos que exibem efeitos secundários tóxicos, deve-se ter cuidado no desenho de um sistema de distribuição que direccione tais compostos para o local do tecido afectado para minimizar potenciais danos para células não afectadas e, deste modo, reduzir os efeitos secundários.

Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de células e os estudos em animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem para utilização em humanos. A dosagem de tais compostos reside de preferência dentro de um intervalo de concentrações em circulação que inclui a DE50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método do presente invento, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para se alcançar um intervalo de concentração em circulação no plasma que inclua a CI50 (isto é, a concentração do composto de teste que consegue uma inibição semi-máxima dos sintomas) determinada na cultura celular. Tal informação pode ser utilizada para determinar com mais precisão as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, através de cromatografia líquida de alta resolução.

As composições farmacêuticas para utilização de acordo com o presente invento podem ser formuladas de modo convencional utilizando um ou mais transportadores ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. As composições farmacêuticas podem também conter glicoproteínas mucina.

Assim, os compostos e seus sais e solvatos fisiologicamente aceitáveis podem ser formulados para administração através de inalação ou insuflação (através da boca ou do nariz) ou de administração oral, bocal, parentérica ou rectal. 25 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ

Uma vez que os polipéptidos trevo não são degradados no tracto digestivo, espera-se que a via de administração seja a oral. 0 polipéptido pode ser administrado, por exemplo, na forma de um comprimido, cápsula ou pilula, ou pode ser suspenso numa solução, tal como um xarope, que o paciente engole. Alternativamente, a solução contendo o polipéptido pode ser administrada como lavagem gástrica. 0 polipéptido pode também ser incluido numa solução que seja administrada como um enema ou pode ser administrado como supositório.

Para administração oral, que pode ser utilizada para tratar tecido danificado dentro do canal alimentar, as composições farmacêuticas podem tomar a formar de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparados através de meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil-metilcelulose); enchimentos (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, glicolato de amido de batata ou amido de sódio); ou agentes humidificantes (por exemplo, laurilsulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos através de método bem conhecidos na arte. As preparações líquidas para administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Tais preparações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas edíveis); agentes emulsionantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoas, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fraccionados) e conservantes (por exemplo, metil- ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais tampão, agentes aromatizantes, corantes e adoçantes conforme apropriado. As preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para resultar em libertação controlada do composto activo. 26 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ

Para administração bocal, que pode ser utilizada para tratar tecido danificado dentro da boca, garganta ou esófago superior, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou pastilhas formulados de um modo convencional.

Para administração através de inalação, que pode ser utilizada para tratar tecido danificado dentro do tracto respiratório, os compostos para utilizar de acordo com o presente invento são convenientemente distribuídos na forma de uma apresentação em spray de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com a utilização de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para distribuir uma quantidade medida. As cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para utilizar num inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

As composições contendo os polipéptidos do presente invento podem também ser formuladas para administração parentérica através de injecção, por exemplo, através de uma única injecção ou de infusão contínua. As formulações para injecção podem ser preparadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em contentores multi-dose com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente activo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água apirogénica estéril, antes da utilização.

As composições podem também ser formuladas em composições rectais tais como supositórios ou enemas de retenção, por exemplo, contendo bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos. 27 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ

Para além das formulações descritas anteriormente, os compostos podem também ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de acção prolongada podem ser administradas através da implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou através de injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (por exemplo como uma emulsão num óleo aceitável) ou em resinas de permuta iónica, ou como derivados ligeiramente solúveis, por exemplo, como um sal ligeiramente solúvel.

As composições podem, se desejado, ser apresentadas numa embalagem ou dispositivo dispensador que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitárias contendo o ingrediente activo. A embalagem pode, por exemplo, compreender folha de aluminio ou plástico, tal como uma embalagem de "blister". A embalagem ou dispositivo dispensador pode ser acompanhada de instruções para administração.

As composições terapêuticas do presente invento podem também conter um transportador ou excipiente, muitos dos quais são conhecidos dos peritos na arte. Os excipientes que podem ser utilizados incluem tampões (por exemplo, tampão citrato, tampão fosfato, tampão acetato e tampão bicarbonato), aminoácidos, ureia, álcoois, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por exemplo, albumina do soro), EDTA, cloreto de sódio, lipossomas, manitol, sorbitol e glicerol. Os ácidos nucleicos, polipéptidos, anticorpos ou compostos moduladores do presente invento podem ser administrados através de qualquer via de administração padrão. Por exemplo, a administração pode ser parentérica, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracraniana, intra-orbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intra-espinal, intracisterna, intraperitoneal, transmucosa ou oral. 0 composto modulador pode ser formulado de vários modos, de acordo com a correspondente via de administração. Por exemplo, soluções líquidas podem ser produzidas para ingestão ou injecção; géis ou pós podem ser produzidos para ingestão, inalação ou aplicação tópica. Os métodos para produzir tais formulações são bem conhecidos e podem ser verificados em, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences". Espera-se que a via preferida de administração seja a oral. 28 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ É bem conhecido nas artes médicas que as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos factores, incluindo a saúde geral, o sexo, o peso, a área de superfície corporal e a idade do paciente, bem como o composto em particular a administrar, o tempo e a via de administração e outros fármacos a administrar concorrentemente.

As dosagens para os polipéptidos e anticorpos do presente invento variarão. Para administração oral, o polipéptido pode ser administrado em dosagens de cerca de 10 mg a cerca de 500 mg. Por exemplo, podem ser administrados 10, 50, 100, 200, 250, 300, 400 ou 500 mg. Estas dosagens podem ser administradas numa base periódica. Por exemplo, uma dose pode ser tomada uma a quatro vezes por dia. Para administração tópica, o polipéptido pode ser administrado em dosagens de cerca de 1 a cerca de 10 mg/ml dentro de um unguento ou creme. Esta composição pode também ser administrada periodicamente, se necessário. Para outras vias de administração, a dosagem variará também, por exemplo, de cerca de 0,1 a 1000 mg por aplicação. A determinação da dosagem correcta dentro de um dado regime terapêutico está bem dentro das capacidades de um vulgar perito na arte de farmacologia.

Para determinar a eficácia de um polipéptido no tratamento de um determinado distúrbio, os peritos na arte podem efectuar estudos de rotina utilizando qualquer um de vários modelos bem conhecidos de danos. Por exemplo, a eficácia do polipéptido no tratamento de danos na córnea pode ser efectuada utilizando o modelo in vitro para cicatrização de feridas na córnea descrito por Collin et al. (Current Eye Res. 14: 331-339, 1995). Neste sistema modelo, as córneas que não eram adequadas para transplantação eram obtidas em dadores de órgãos humanos e utilizadas dentro de 5 dias post-mortem. Era utilizada uma ponta de cauterização para criar uma queimadura térmica linear não perfurante com aproximadamente 5 mm de comprimento na córnea. As córneas feridas foram imediatamente dissecadas e colocadas num sistema de cultura de órgãos ar/líquido (tal como descrito em Richard et al., Curr. Eye Res. 10: 739-749, 1991; e Anderson et al., Ophtalmol. Vis. Sei. 3: 442-449, 1993). Assim, para determinar a eficácia de um polipéptido do presente invento 29 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ no tratamento de um tal dano, aplica-se simplesmente o polipéptido na córnea ferida, por exemplo, através da colocação do polipéptido no meio de cultura de tecidos e avaliando o efeito do polipéptido na cicatrização da ferida nas córneas danificadas versus não danificadas. Se for necessária uma orientação adicional na avaliação da ferida, os peritos na arte podem novamente consultar Collin et al., supra, que também descreve a análise histoquimica das córneas feridas. Podem também ser utilizados protocolos para um modelo de encerramento de feridas utilizando células endoteliais da córnea de coelho cultivadas (por exemplo, ver Joyce et al., Invest. Ophtalmol. Vis. Sei. 31: 1816-1826, 1990). Alternativamente, para avaliar a eficácia de um polipéptido no contexto de uma ferida física na córnea, pode ser utilizado o dano induzido tal como descrito por Kessler (Curr. Eye Res. 14: 985-992, 1995). De modo semelhante, estão disponíveis numerosos modelos nos quais testar a eficácia de um polipéptido na prevenção ou cicatrização de um ferida na epiderme.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: The General Hospital Corporation

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PROTEÍNAS TREVO INTESTINAIS (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 18 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Fish & Richardson, P.C. (B) RUA: 225 Franklin Street (C) CIDADE: Boston

(D) ESTADO: MA

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 02110-2804 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: Windows 95 (D) SOFTWARE: FastSEQ for Windows Version 2.0 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US97/---- (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: ll-ABR-1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/631,469 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 12-ABR-1996 30 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/191,352 (Β) DATA DE APRESENTAÇÃO: 02-FEV-1994 (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/037,741 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 25-MAR-1993 (A) NÚMERO DO PEDIDO: 07/837,192 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 13-FEV-1992 (A) NÚMERO DO PEDIDO: 07/655,965 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 14-FEV-1991 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Meiklejohn, Ph.D., Anita L. (B) NÚMERO DE REGISTO: 35,283 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 00786/322W01 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 617-542-5070 (B) TELEFAX: 617-542-8906 (C) TELEX: 200154 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 431 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Sequência de codificação (B) LOCALIZAÇÃO: 18...260 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: GAAGTTTGCG TGCTGCC ATG GAG ACC AGA GCC TTC TGG ATA ACC CTG CTG 50 Met Glu Thr Arg Ala Phe Trp Ile Thr Leu Leu 15 10 CTG GTC CTG GTT GCT GGG TCC TCC TGC AAA GCC CAG GAA TTT GTT GGC 98 Leu Vai Leu val 15 Ala Gly Ser Ser Cye 20 Lys Ala Gin Glu Phe 25 val Gly CTA TCT CCA AGC CAA TGT ATG GCG CCA ACA AAT GTC AGG GTG GAC TGT 146 Leu Ser Pro 30 Ser Gin Cys Met Ala 35 Pro Thr Asn Val Arg 40 Val Aap Cys AAC TAC CCC ACT GTC ACA TCA GAG CAG TGT AAC AAC CGT GGT TGC TGT 194 Asn Tyr 45 Pro Thr Val Thr Ser 50 Glu Gin Cys Asn Asn Arg 55 Gly Cys Cys TTT GAC TCC AGC ATC CCA AAT GTG CCC TGG TGC TTC AAA CCT CTG CAA 242 Phe Asp 60 Ser Ser Ile Pro 65 Asn Val Pro Trp Cys 70 Phe Lys Pro Leu Gin 75 GAG ACA GAA TGT ACA TTT TGAAGCTGTC CAGGCTCCAG GAAGGGAGCT CCACACCC 298 Glu Thr Glu Cys Thr Phe 80 TGGACTCTTG CTGATGGTAG TGGCCCAGGG TAACACTCAC CCCTGATCTG CTCCCTCGCG 358 CCGGCCAATA TAGGAGCTGG GAGTCCAGAA GAATAAAGAC CTTACAGTCA GCACAAGGCT 418 431

GTTCTAATTG CGG 31 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 81 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met 1 Glu Thr Arg Ala 5 Phe Trp Ile Thr Leu Leu 10 Leu Val Leu val 15 Ala Gly Ser Ser Cys 20 Lys Ala Gin Glu Phe 25 Val Gly Leu ser Pro 30 Ser Gin Cys Met Ala 35 Pro Thr Asn Val Arg 40 Val Asp Cys Asn Tyr 45 Pro Thr Val Thr Ser 50 Glu Gin Cys Asn Asn 55 Arg Gly Cys Cys Phe 60 Asp Ser ser Ile

Pro Asn Vai Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gin Glu Thr Glu Cys Thr 65 70 75 80

Phe (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 403 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: GATGCTGGGG CTGGTCCTGG CCTTGCTGTC CTCCAGCTCT GCTGAGGAGT ACGTGGGCCT GTCTGCAAAC CAGTGTGCCG TGCCGGCCAA GGACAGGGTG GACTGCGGCT ACCCCCATGT CACCCCCAAG GAGTGCAACA ACCGGGGCTG CTGCTTTGAC TCCAGGATCC CTGGAGTGCC TTGGTGTTTC AAGCCCCTGA CTAGGAAGAC AGAATGCACC TTCTGAGGCA CCTCCAGCTG CCCCTCGGAT GCAGGCTGAG CACCCTTGCC CGGCTGTGAT TGCTGCCAGG CACTGTTCAT CTCAGTTTTT CTGTCCCTTT GCTCCCGGCA AGCTTTCTGC TGAAAGTTCA TATCTGGAGC CTGATGTCTT AACGAATAAA GGTCCCATGC TCCACCCGAA AAA 403 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: GGGCGGCCGC 10 32 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5 GTACATTCTG TCTCTTGCAG A 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6 TAACCCTGCT GCTGCTGGTC CTGG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7 GTTTGCGTGC TGCCATGGAG A 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8 CCGCAATTAG AACAGCCTTG T 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9 33 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ GCAGTGTAAC AACCGTGGTT GCTGC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10 TGACCCTGTG TCATCACCCT GGC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11 CGGCTGCTCT GATGGCCGCC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12 GCCGGCCACA GTCGATGAAT C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13 GAGAGGTTGC TGTTTTGATG ACA 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico 34 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14: GCCAAGTCTT GATGTAGCCA GTT 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N0:15: Glu Ala Gin The Glu Thr Cys Thr Vai Ala Pro Arg Glu Arg Gin Asn 1 5 10 15 Cys Gly Phe Pro Gly Vai Thr Pro Ser Gin Cys Ala Asn Lys Gly Cys 20 25 30 Cys Phe Asp Asp Thr Vai Arg Gly Vai Pro Trp Cys Phe Tyr Pro Asn 35 40 45 Thr lie Asp Vai Pro Pro Glu Glu Glu Cys Glu Phe 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0 : 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 62 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:

Glu Lys Pro Ala Ala Cys Arg Cys Ser Arg Gin Asp Pro Lys Asn Arg 15 10 15

Vai Asn Cys Gly Phe Pro Gly lie The Ser Asp Gin Cys Phe Thr Ser 20 25 30

Gly Cys Cys Phe Asp Ser Gin Vai Pro Gly Vai Pro Trp Cys Phe Lys 35 40 45

Pro Leu Pro Ala Gin Glu Ser Glu Glu Cys Vai Met Glu Vai 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 59 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17:

Gin Glu Phe vai Gly Leu Ser pro Ser Gin cys Met Ala Pro Thr Asn 15 10 15

Vai Arg Vai Asp Cys Asn Tyr Pro Thr Vai Thr Ser Glu Gin Cys Asn 20 25 30 35 ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ

Asn Arg Gly Cys Cys Phe Asp Ser Ser Ile Pro Asn Vai Pro Trp Cys 35 40 45

Phe Lys pro Leu Gin Glu Thr Glu cys Thr Phe 50 55 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18:

Met Leu Gly Leu Vai Leu Ala Leu Leu ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu 15 10 15

Tyr Vai Gly Leu Sér Ala Asn Gin Cys Ala Vai Pro Ala Lys Asp Arg 20 25 30 vai Asp Cys Gly Tyr Pro His vai Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg 35 40 45

Gly Cys cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Vai Pro Trp Cys Phe Lys 50 55 60

Pro Leu Thr Arg Lys Thr Glu Cys Thr Phe 65 70

Lisboa

Claims (7)

1. ΕΡ Ο 954 330/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um polipéptido compreendendo um factor trevo intestinal para a produção de um medicamento para tratar ou inibir a formação de uma lesão da pele, uma lesão da superfície da córnea do olho, uma lesão do tracto respiratório ou uma lesão do tracto genito-urinário num paciente, em que o referido factor trevo intestinal possui pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:18 ao longo de mais de 35 resíduos de aminoácidos contíguos.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido paciente está a receber terapia de radiação para o tratamento de cancro.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 a 2, em que o referido paciente está a receber quimioterapia para o tratamento de cancro.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido polipéptido é adequado para administração oral.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que são utilizados cerca de 10 miligramas a cerca de 100 miligramas do referido polipéptido para administração oral.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polipéptido é adequado para administração tópica.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido polipéptido está presente de cerca de 1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml num unguento. Lisboa