ES2257804T3 - Utilizacion de las proteinas ulip en el diagnostico y la terapia de los canceres y de los sindromes neurologicos paraneoplasicos. - Google Patents

Utilizacion de las proteinas ulip en el diagnostico y la terapia de los canceres y de los sindromes neurologicos paraneoplasicos.

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ES2257804T3 ES98912541T ES98912541T ES2257804T3 ES 2257804 T3 ES2257804 T3 ES 2257804T3 ES 98912541 T ES98912541 T ES 98912541T ES 98912541 T ES98912541 T ES 98912541T ES 2257804 T3 ES2257804 T3 ES 2257804T3
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Michele Aguera
Marie-Francoise Belin
Jerome Honnorat
Pappachan Kolattukudy
Than Tam Quach
Tamara Byk
Andre Sobel
Dominique Aunis
Jean-Christophe Antoine
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Abstract

La invención se refiere a un polipéptido purificado, a un derivado polipeptídico biológicamente activo o un fragmento de dicho polipéptido purificado, que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ.ID. No. 2, No. 4, No. 6 y No. 8.

Description

Utilización de las proteínas ULIP en el diagnóstico y la terapia de los cánceres y de los síndromes neurológicos paraneoplásicos.
La invención se refiere a la utilización de las proteínas denominadas ULIP/POP en el diagnóstico y la terapia de los cánceres y de los síndromes neurológicos paraneoplásicos.
Los síndromes neurológicos paraneoplásicos (SNP) aparecen con motivo de un cáncer, a menudo antes de su detección, y no están asociados ni a la proliferación tumoral en sí (invasión directa metástasis) ni a la terapia. Su frecuencia está globalmente estimada a aproximadamente el 1% de los cánceres. Hace mucho tiempo que se individualizaron varios cuadros clínicos (encefalomielitis, neuropatía sensitiva de Denny Brown, atrofia cerebelosa, encefalitis límbica, opsoclonus...) correspondientes a la degeneración ya sea electiva o bien preferencial de ciertos grupos de neuronas. La frecuencia de células inflamatorias cerca de las lesiones hace muchos años que había hecho sospechar en la posibilidad de un proceso autoinmune o viral. Más recientemente, la demostración de autoanticuerpos en el suero y en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes aquejados de SNP, específicos del tipo de tumor y del tipo de neuronas que degeneran, ha vuelto a lanzar la hipótesis de una participación de la autoinmunidad en la génesis de esta patología (Graus y col., 1985; Greenlee y col., 1983).
Además de la presencia de un número elevado de estos anticuerpos en la sangre y en el LCR de los pacientes, existen varios argumentos que sugieren que los SNP son el resultado de mecanismos autoinmunes. Así, los antígenos reconocidos en el sistema nervioso central también están presentes en los tumores de los pacientes (Anderson y col., 1987). En el seno del tejido tumoral, se encuentran anticuerpos específicamente dirigidos contra dichos antígenos, así como linfocitos B y T (Hetzel et al., 1990).
Estos datos sugieren que el proceso autoinmune se desencadenaría mediante la expresión de antígenos tumorales. Las lesiones del sistema nervioso central estarían provocadas por un proceso de inmunidad cruzada. Otros argumentos indican además que las lesiones cerebrales son consecuencia de la respuesta autoinmune. Así, en el cerebro de los pacientes, el número de anticuerpos específicos es superior al del suero y al del LCR (Dalmau et al., 1991). Además, en el caso de las encefalomielitis asociadas a los anticuerpos anti-Hu, existe una reacción linfocitaria intensa, compuesta de células B y T, situada cerca de neuronas en vías de destrucción (Dalmau et al., 1991; Graus et al., 1990).
Se han descrito varios tipos de autoanticuerpos que permiten establecer grupos sindrómicos precisos en función de criterios inmunológicos, neurológicos y carcinológicos.
Así, los anticuerpos anti-Yo se encuentran en el suero y en el LCR de mujeres que presentan una atrofia cerebelosa paraneoplásica y cáncer ginecológico (ovario, mama o útero) (Greenlee et al., 1983; Jaeckle et al., 1985).
Estos anticuerpos reconocen dos proteínas citoplasmáticas de 34 y 62 kDa específicas de las células de Purkinje del cerebelo.
Los anticuerpos anti-Ri se encuentran en el suero y en el LCR de pacientes (principalmente mujeres) que presentan opsoclonus-mioclonus, síndrome cerebeloso y cáncer de mama. Dichos anticuerpos reconocen dos proteínas de 50 y 80 kDa específicas de las neuronas del sistema nervioso central (Luque et al., 1991).
Los anticuerpos anti-Hu son los que más frecuentemente suelen aparecer asociados a los SNP. Se encuentran en el suero y en el LCR de pacientes que presentan síndrome de Denny Brown o encefalomieloneuritis y cáncer de pulmón de células pequeñas (Graus et al., 1985; Dalmau et al., 1992). Dichos autoanticuerpos reconocen varias proteínas de 37 a 45 kDa expresadas específicamente por el conjunto de neuronas del sistema nervioso.
Recientemente se ha identificado otro tipo de autoanticuerpos en pacientes aquejados de SNP: los anticuerpos anti-CV2 (Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996). Estos últimos son atípicos por el hecho de que la diana antigénica reconocida en la edad adulta es básicamente no neuronal, mientras que el análisis del cerebro post-mortem de cuatro pacientes permiten objetivar una pérdida neuronal, una gliosis y un proceso inflamatorio característicos de los SNP.
La originalidad del descubrimiento de estos autoanticuerpos reside, por una parte, en su demostración. Estos últimos habían escapado al conjunto de las investigaciones habituales que consistían en revelar los antígenos reconocidos por inmunohistoquímica en el cerebro post-mortem. En efecto, el antígeno reconocido es soluble y desaparece del cerebro post-mortem en la mayoría de las condiciones de fijación. La presencia de estos anticuerpos en el LCR o en el suero sanguíneo de pacientes aquejados de SNP sólo se pudo revelar gracias a una fijación del tejido post-mortem humano por inmersión en paraformaldehído o in situ mediante perfusión de paraformaldehído en animales (Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996).
Los autoanticuerpos anti-CV2 presentes en los sueros de pacientes aquejados de síndrome neurológico paraneoplásico (SNP) fueron definidos por su capacidad para reconocer, mediante inmunohistoquímica indirecta, un antígeno citoplasmático expresado específicamente en el cerebro de rata adulta por una subpoblación de oligodendrocitos del tronco cerebral, de la médula o del cerebelo.
La originalidad de estos autoanticuerpos reside, por otra parte, en su interés diagnóstico. Su presencia en el suero o en el LCR de pacientes tiene valor diagnóstico, ya que permite precisar el origen paraneoplásico de un síndrome neurológico. Cuando el descubrimiento de estos anticuerpos precede al del cáncer, sirve para orientar la búsqueda de éste y permite su detección. Esto fue así en 6 de los 19 pacientes que presentaban anticuerpos anti-CV2. Los trastornos clínicos eran diferentes según los pacientes, algunos presentaban un cuadro de encefalitis límbica, otros encefalomieloneuritis y otros síndrome de Lambert-Eaton. Sin embargo, el síndrome cerebeloso era predominante en más del 60% de los casos. El tumor más frecuentemente asociado era el cáncer de pulmón de células pequeñas (60% de los casos).
Experimentos con cerebros de ratas recién nacidas demostraron que esos anticuerpos anti-CV2 interaccionaban con una proteína de 66 kDa (Honnorat et al., 1996).
En el cerebro adulto, este antígeno se encuentra en una subpoblación de oligodendrocitos o en células que conservan la capacidad de diferenciación (bulbo olfativo y giro dentado). El antígeno reconocido desempeñaría una función en la supervivencia neuronal, mediante interacciones Neurona/Oligodendrocito, como se desprende de la pérdida de neuronas observada en el cerebro post-mortem de pacientes aquejados de SNP.
Su expresión, muy limitada en la edad adulta, contrasta con una expresión muy fuerte y transitoria en el sistema nervioso central y periférico en desarrollo, lo que sugiere la probable función de este antígeno en el desarrollo del sistema nervioso.
La Solicitante ha caracterizado el antígeno diana de los autoanticuerpos anti-CV2 correspondiente a una proteína que en lo sucesivo se denominará "POP-66" por las siglas de su nombre en inglés "paraneoplastic oligodendrocyte protein 66 kDa".
De manera sorprendente, se ha descubierto que la proteína POP-66 pertenece a la familia de las proteínas llamadas ULIP (Unc-33 like phosphoprotein), implicada en el control del desarrollo neuronal y en el transporte axonal, (T. Byk et al., 1996) y estudiada también en forma de proteínas CRMP (Goshima et al., 1995; Wang et al., 1996), TOAD-64 (Minturn et al., 1995) y DRPs (Hamajima et al., 1996). Más precisamente, POP-66 ha sido identificada como la forma humana de ULIP-4.
El conjunto de datos que se presenta a continuación pone de manifiesto la complejidad de esta familia de proteínas, la existencia de un espectro de expresión muy amplio de los miembros de esta familia en el cerebro durante la ontogénesis, pero muy limitado en el adulto, así como la especificidad de los anticuerpos anti-CV2 para un miembro de esta familia proteica ULIP, que no es otra que POP-66.
Así, la Solicitante ha demostrado que la proteína reconocida por los anticuerpos anti-CV2 de pacientes aquejados de SNP es POP-66/ULIP-4 y ha establecido la implicación de las proteínas ULIP en los síndromes neurológicos paraneoplásicos y en los cánceres asociados. Aparte de su función en los cánceres asociados a los SNP, la Solicitante igualmente ha descubierto que las proteínas de la familia ULIP podrían desempeñar un papel en cualquier otra forma de cáncer, no asociada a los SNP. De manera más concreta, las proteínas ULIP estarían principalmente implicadas en los cánceres de tejidos cuyo origen embrionario es común al del sistema nervioso central.
Por lo tanto, el objeto de la presente invención consiste en un polipéptido purificado ULIP, derivado o fragmento polipeptídico de dicho polipéptido purificado, que comprende una secuencia de aminoácidos ID SEC nº 8.
De manera preferente, el objeto de la presente invención consiste en un polipéptido purificado, derivado o fragmento polipeptídico biológicamente activo de dicho polipéptido purificado, que comprende la secuencia de aminoácidos ID SEC nº 8, recibiendo dicho polipéptido la denominación de "POP-66/ULIP-4".
Un fragmento interesante del polipéptido de secuencia ID SEC nº 8 es particularmente el fragmento antigénico PARASCPGKIS (aminoácidos nº 517 a nº 527).
En la descripción de la invención, se utilizan las siguientes definiciones:
-
derivado: todo polipéptido que se obtiene a partir del polipéptido de secuencia ID SEC nº 8 o cualquier otra molécula resultante de una modificación de naturaleza genética y/o química de la secuencia ID SEC nº 8, es decir, obtenida por mutación, deleción, adición, sustitución y/o modificación química de uno o de un número limitado de aminoácidos, así como toda secuencia isoforma, es decir, una secuencia idéntica a la secuencia ID SEC nº 8 o a uno de sus fragmentos o secuencias modificadas, que contiene uno o varios aminoácidos en forma de enantiómero D, habiendo conservado dichas secuencias derivadas modificadas o isoformas al menos una de las propiedades que las hacen biológicamente activas.
-
Biológicamente activo: que presenta propiedades de inducción y/o de control del desarrollo neuronal y/o propiedades antigénicas.
La invención también tiene por objeto una secuencia de ácidos nucleicos aislada ID SEC nº 7 o una secuencia derivada de la secuencia ID SEC nº 7 debido a la degeneración del código genético, o debido a la mutación, deleción o inserción de al menos un nucleótido, presentando dichas secuencias derivadas una actividad biológica prácticamente idéntica a la del péptido codificado por la secuencia ID SEC nº 7.
Las diferentes secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser de origen artificial o no. Se puede tratar de secuencias de ADN o de ARN, obtenidas por cribado de bancos de secuencias utilizando sondas elaboradas sobre la base de la secuencia ID SEC nº 8. Este tipo de bancos se pueden preparar por medio de técnicas clásicas de biología molecular, conocidas por el especialista.
Las secuencias nucleotídicas según la invención también se pueden preparar por síntesis química e incluso por métodos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de las secuencias obtenidas por cribado de los bancos.
Estas secuencias nucleotídicas permiten la realización de sondas nucleotídicas, capaces de hibridarse sólida y específicamente con una secuencia de ácidos nucleicos, de un ADN genómico o de un ARN mensajero, que codifica un péptido según la invención o un fragmento biológicamente activo de éste. Las condiciones de hibridación adecuadas se corresponden con las condiciones de temperatura y de fuerza iónica habitualmente utilizadas por el especialista (Sambrook et al, 1989), preferentemente con condiciones de temperatura comprendidas entre (T_{m} menos 5ºC) y (T_{m} menos 30ºC) y más preferentemente con condiciones de temperatura comprendidas entre (T_{m} menos 5ºC) y (T_{m} menos 10ºC) (estringencia elevada), siendo T_{m} la temperatura teórica de fusión, definida como la temperatura a la que el 50% de las hebras emparejadas se separan. Tales sondas también forman parte de la invención. Estas últimas se pueden utilizar como herramienta de diagnóstico in vitro para la detección, mediante experimentos de hibridación, de transcritos específicos de los polipéptidos de la invención en muestras biológicas o para la demostración de síntesis aberrantes o de anomalías genéticas resultantes de un polimorfismo, de mutaciones o de un empalme
incorrecto.
Las sondas de la invención comprenden como mínimo 10 nucleótidos y como máximo la totalidad de una secuencia nucleotídica ID SEC nº 7 o de su hebra complementaria.
En la presente invención también se incluyen los procedimientos de diagnóstico in vitro en los que se utilizan estas sondas nucleotídicas para la puesta en práctica de la detección de síntesis aberrantes o de anomalías genéticas, tales como la pérdida de heterocigosis y la reorganización genética, a nivel de las secuencias nucleicas que codifican un polipéptido ULIP según la invención o un fragmento biológicamente activo de éste. Este tipo de métodos comprenden:
-
la puesta en contacto de una sonda nucleotídica según la invención con una muestra biológica en condiciones que permiten la formación de un complejo de hibridación entre dicha sonda y la secuencia nucleotídica anteriormente mencionada, eventualmente tras una etapa previa de amplificación de la secuencia nucleotídica anteriormente mencionada;
-
la detección del complejo de hibridación eventualmente formado;
-
dado el caso, la secuenciación de la secuencia nucleotídica que forma el complejo de hibridación con la sonda según la invención.
Además, las sondas de ADNc de la invención se pueden utilizar ventajosamente para la detección de anomalías cromosómicas.
Las secuencias nucleotídicas según la invención también son útiles para la realización y la utilización de cebadores oligonucleotídicos sentido y/o antisentido en reacciones de secuenciación o de amplificación específica según la técnica llamada de PCR (reacción de polimerización en cadena) o cualquier otra variante de ésta.
Por otra parte, las secuencias nucleotídicas según la invención también se utilizan en el ámbito terapéutico, para la realización de secuencias antisentido, capaces de hibridarse específicamente con una secuencia de ácido nucleico e incluso con un ARN mensajero, utilizables en terapia en terapia génica. Así pues, la invención tiene por objeto secuencias antisentido capaces de inhibir, al menos parcialmente, la producción de un polipéptido según la invención, tal como se ha definido anteriormente.
Dichas secuencias nucleotídicas resultan particularmente útiles en el tratamiento de trastornos de la visión y del sistema nervioso central y periférico, principalmente en el tratamiento de los síndromes neurológicos paraneoplásicos, así como en el tratamiento anticancerígeno, principalmente de los tumores asociados a los síndromes neurológicos paraneoplásicos.
Por otra parte, las secuencias nucleotídicas según la invención también se pueden utilizar para la producción de proteínas recombinantes ULIP según la invención.
Estas proteínas se pueden producir a partir de las secuencias nucleotídicas anteriormente definidas, mediante técnicas de producción de productos recombinantes conocidas por el especialista. En este caso, la secuencia nucleotídica utilizada se pone bajo el control de señales que permiten su expresión en un huésped celular.
Un sistema eficaz de producción de una proteína recombinante necesita disponer de un vector, por ejemplo de origen plasmídico o viral, y de una célula huésped compatible.
El huésped celular se puede escoger entre los sistemas procarióticos, como las bacterias, o los eucarióticos, como por ejemplo las levaduras, células de insectos, CHO (células de ovarios de hámster chino) o cualquier otro sistema ventajosamente disponible. Un huésped celular preferido para la expresión de las proteínas de la invención es el constituido por la bacteria E. Coli.
El vector debe comprender un promotor de las señales de iniciación y terminación de la traducción, así como regiones apropiadas de regulación de la trascripción. Debe poder mantenerse de modo estable en la célula y, dado el caso, puede poseer señales particulares que especifican la secreción de la proteína traducida.
Estas diferentes señales de control se escogen en función del huésped celular utilizado. A tal efecto, las secuencias nucleotídicas según la invención se pueden insertar en vectores de replicación autónoma en el seno del huésped escogido o de los vectores integrativos del huésped escogido. Dichos vectores se prepararán según los métodos corrientemente utilizados por el especialista y los clones que resulten se podrán introducir en un huésped adecuado por procedimientos estándar, por ejemplo la electroporación.
La invención también tiene por objeto las células huéspedes transfectadas por estos vectores mencionados. Estas células se pueden obtener por la introducción en células huéspedes de una secuencia nucleotídica insertada en un vector como el anteriormente definido, seguida de la puesta en cultivo de dichas células en condiciones que permiten la replicación y/o la expresión de la secuencia nucleotídica transfectada.
Estas células se pueden utilizar en un método de producción de un polipéptido recombinante según la invención o de todo fragmento o derivado biológicamente activo de éste.
El método de producción de un polipéptido según la invención, en forma recombinante, también está comprendido en la presente invención y se caracteriza por el cultivo de las células transfectadas en condiciones que permiten la expresión de un polipéptido recombinante según la invención o de todo fragmento o derivado biológicamente activo de éste, y por la recuperación de dicho polipéptido recombinante.
Los procedimientos de purificación utilizados son conocidos por el especialista. El polipéptido recombinante se puede purificar a partir de lisados y extractos celulares, del sobrenadante del medio de cultivo, por procedimientos utilizados separada o conjuntamente, como el fraccionamiento, los procedimientos de cromatografía, las técnicas de inmunoafinidad con ayuda de anticuerpos mono o policlonales específicos, etc.
Una variante consiste en producir un polipéptido recombinante fusionado a una proteína "portadora" (proteína quimera). La ventaja de este sistema es que permite una estabilización y una disminución de la proteólisis del producto recombinante, un aumento de la solubilidad durante la renaturalización in vitro y/o una simplificación de la purificación cuando el compañero de fusión posee afinidad por un ligando específico.
La utilización de las proteínas ULIP, especialmente de POP-66/ULIP-4, y de los anticuerpos dirigidos contra dichas proteínas, es prometedora en diferentes ámbitos.
Por ejemplo, la detección del autoanticuerpo anti-CV2 por inmunofluorescencia en el cerebro animal fijado, se utiliza actualmente como prueba diagnóstica.
La producción de proteína recombinante POP-66/ULIP-4 según la invención permite la fabricación de una prueba (de tipo Elisa Western Blot) rápida y fiable, para detectar los anticuerpos anti-CV2.
Este tipo de pruebas ya existen para los anticuerpos anti-Hu, anti-Yo y anti-Ri. La prueba para detectar los anti-CV2 en el suero de los pacientes podría prescribirse en caso de sospecha de síndrome neurológico paraneoplásico y, por consiguiente, permitiría detectar tanto los anticuerpos anti-CV2 como los demás anticuerpos identificados en los SNP anteriormente citados.
La invención también tiene por objeto un procedimiento para el diagnóstico de los síndromes neurológicos paraneoplásicos y/o para el diagnóstico precoz de la formación de tumores de origen cancerígeno, caracterizado por la demostración, en una muestra de sangre extraída a un individuo, de autoanticuerpos dirigidos contra una proteína POP-66/ULIP-4 a través de:
-
la puesta en contacto de una muestra de sangre extraída a un individuo con un polipéptido purificado (POP-66), derivado o fragmento polipeptídico biológicamente activo de POP-66/ULIP-4, eventualmente fijado sobre un soporte en condiciones que permiten la formación de complejos inmunológicos específicos entre dicho polipéptido y los autoanticuerpos eventualmente presentes en la muestra de suero, y
-
la detección de los complejos inmunológicos específicos eventualmente formados.
La invención igualmente tiene por objeto un kit para el diagnóstico de los síndromes neurológicos paraneoplásicos y para el diagnóstico precoz de la formación de tumores a partir de una muestra biológica que comprende:
-
al menos un polipéptido purificado POP-66/ULIP-4, derivado o fragmento polipeptídico biológicamente activo de POP-66/ULIP-4, eventualmente fijado sobre un soporte,
-
unos medios de revelación de la formación de complejos antígeno/anticuerpo específicos entre un autoanticuerpo anti-POP-66 y dicho polipéptido purificado POP-66, derivado o fragmento polipeptídico, y/o medios de cuantificación de dichos complejos.
La invención también tiene por objeto los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos, Fab o F(ab')_{2}, o inmunoconjugados, dirigidos contra un polipéptido purificado ULIP que comprende una secuencia de aminoácidos ID SEC nº 8, derivado o fragmento polipeptídico biológicamente activo de ULIP, y su utilización para la purificación o la detección de una proteína ULIP en una muestra biológica.
Los anticuerpos policlonales se pueden obtener a partir del suero de un animal inmunizado contra la proteína, producida por ejemplo por recombinación genética según el procedimiento anteriormente descrito, según los modos operatorios habituales.
Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener según el procedimiento clásico de cultivo de hibridomas descrito por Köhler y Milstein.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanizados, fragmentos Fab y F(ab')_{2} e incluso pueden adoptar la forma de inmunoconjugados o de anticuerpos marcados.
De este modo, los anticuerpos dirigidos contra una proteína de la familia ULIP son útiles para detectar una expresión anormal de proteína ULIP en pacientes que presentan síndromes neurológicos, a los que no se les ha diagnosticado ningún tipo de cáncer por los procedimientos clásicos. Esta expresión anormal de proteína ULIP podrá relacionarse con la existencia de un cáncer que no había sido detectado. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos contra una proteína ULIP, principalmente contra POP-66/ULIP-4, son útiles para el diagnóstico precoz de un cáncer.
En un procedimiento para determinar una variabilidad alélica, una mutación, una deleción, una inserción, una pérdida de heterocigosis o una anomalía genética del gen POP-66/ULIP-4 (situado en el cromosoma 10, en la región 26q) que pueden estar implicadas en patologías, se pone en práctica al menos una secuencia nucleotídica ID SEC nº 7. Entre los procedimientos para determinar una variabilidad alélica, una mutación, una deleción, una inserción, una pérdida de heterocigosis o una anomalía genética del gen POP-66/ULIP-4, se prefiere un procedimiento que comprende al menos una etapa de amplificación por PCR de la secuencia nucleica de POP-66/ULIP-4 susceptible de presentar un polimorfismo, una mutación, una deleción o una inserción, empleando pares de cebadores de secuencias nucleotídicas, una etapa durante la cual se procede al tratamiento de los productos amplificados utilizando enzimas de restricción adecuadas y una etapa durante la cual se procede a la detección o a la dosificación de al menos uno de los productos de la reacción enzimática.
De manera ventajosa, se pueden buscar las mutaciones asociadas a dicho cromosoma 10 en relación con el cáncer, principalmente los tumores cancerígenos periféricos y los tumores cerebrales primitivos de origen glial por ejemplo.
La invención también tiene por objeto una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína purificada POP-66, fragmento polipeptídico o derivado biológicamente activo de ésta, una secuencia o fragmento de secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína, una secuencia antisentido capaz de hibridarse específicamente con una secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína, o un anticuerpo dirigido contra dicha proteína, asociada a un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De manera preferente, la invención comprende composiciones farmacéuticas cuyo principio activo es un polipéptido POP-66 purificado, derivado o fragmento polipeptídico de POP-66, preferentemente en forma soluble, asociado a un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Dichas composiciones ofrecen un nuevo enfoque para tratar los trastornos de la vista y del sistema nervioso central y periférico, y sobre todo, los síndromes neurológicos paraneoplásicos. Por otra parte, también son útiles para tratar los trastornos neurológicos asociados a una pérdida neuronal y/o a una subexpresión de las proteínas ULIP en el sistema nervioso.
De este modo, POP-66/ULIP-4 también resulta de gran interés en patologías neurodegenerativas como las atrofias multisistémicas, que son afecciones similares a las de los SNP, en las que se ha detectado una anomalía de una subpoblación oligodendrocitaria (Papp et al., 1992).
Por otra parte, las composiciones según la invención son útiles en terapia anticancerígena.
Los anticuerpos dirigidos contra una o varias proteínas ULIP se pueden asociar a agentes antineoplásicos, permitiendo así la administración de medicamentos dirigida hacia las células tumorales.
Además, dichos anticuerpos se pueden asociar a un grupo químico hidrófilo escogido para pasar o no la barrera hematoencefálica, según el tipo de tumor.
Las proteínas ULIP, y en particular POP-66, así como las secuencias nucleotídicas que codifican dichas proteínas y las secuencias u oligonucleótidos antisentido, pueden ser útiles en la terapia de cualquier tipo de cáncer en el que esté implicado un gen que codifique una proteína ULIP. Entre los ejemplos de cánceres, cabe señalar los tumores periféricos, tales como el cáncer de pulmón de células pequeñas, el timoma, el cáncer de mama y de ovario, así como los tumores cerebrales, preferentemente los tumores cerebrales primitivos de origen glial. La expresión de POP-66 en las células no proliferativas del cerebro normal, su ausencia en tejidos normales tales como pulmón o timo por ejemplo, su reexpresión diferencial durante la tumorogénesis de esos tejidos y la modulación de su expresión en una línea tumoral durante la diferenciación sugieren que POP-66 podría ser un gen supresor de tumor.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas según la invención se pueden administrar por vía sistémica, preferiblemente por vía intravenosa, por vía intramuscular, intradérmica o por vía oral.
Sus modos de administración, posologías y formas galénicas óptimas, se pueden determinar en función de los criterios que se suelen tener en cuenta a la hora de establecer un tratamiento terapéutico adaptado a un paciente, como por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios constatados, etc.
Para la fabricación de un medicamento destinado a tratar las enfermedades neurodegenerativas y los neoplasmas se puede utilizar una proteína purificada de la familia ULIP, fragmento polipeptídico o derivado biológicamente activo de ésta, una secuencia o fragmento de secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína, una secuencia antisentido capaz de hibridarse específicamente con una secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína, o un anticuerpo dirigido contra dicha proteína asociada a un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un método de tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y neoplasmas, consiste en administrar, a un sujeto que necesita este tipo de tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína purificada de la familia ULIP, fragmento polipeptídico o derivado biológicamente activo de ésta, una secuencia o fragmento de secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína, una secuencia antisentido capaz de hibridarse específicamente con una secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína, o un anticuerpo dirigido contra dicha proteína, asociada a un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los ejemplos y las figuras cuyas leyendas se presentan a continuación, se ofrecen a título ilustrativo.
Leyendas de las figuras
- La figura 1 representa un perfil de electroforesis bidimensional obtenido a partir de extractos proteicos de cerebros de ratas recién nacidas enriquecidos en POP-66.
A:
tinción con plata de todas las proteínas.
B:
inmunoimpresión con el suero anti-CV2 de pacientes.
Las flechas indican las manchas correspondientes a POP-66, reveladas con los anticuerpos anti-CV2.
- La figura 2 representa un perfil de electroforesis bidimensional obtenido a partir de extractos proteicos de cerebros de ratas recién nacidas.
Inmunoimpresión con A (el anticuerpo antipéptido 3) y B (el anticuerpo anti-CV2).
- La figura 3 representa una electroforesis monodimensional obtenida a partir de extractos proteicos de cerebros de ratas recién nacidas.
Inmunoimpresión con a: suero preinmune para péptido 3.
Inmunoimpresión con b: suero antipéptido 3.
Inmunoimpresión con c: suero antipéptido 4.
Inmunoimpresión con d: suero preinmune para péptido 4.
- La figura 4 representa un marcaje inmunohistoquímico de cortes de cerebros de ratas adultas con
A:
suero anti-CV2 de paciente aquejado de SNP.
B:
suero de conejo con anticuerpos antipéptido 3.
C:
suero de conejo con anticuerpos antipéptido 4.
- La figura 5 representa un marcaje histológico de cortes de cerebelo de ratas recién nacidas a 8 días de vida postnatal.
A:
tinción con azul de toluidina; ge: capa granular externa : m = capa molecular (x400).
B:
Inmunoimpresión después de la incorporación de BrdU (bromodeoxiuridina). Todas las células que incorporaron la BrdU están prácticamente situadas en la zona más externa de la capa granular externa (ge). Algunas células positivas están situadas en la capa granular interna (x400).
C:
Inmunoperoxidasa indirecta con un suero de paciente que contiene un anticuerpo anti-CV2 (x400). La inmunorreactividad está concentrada en la parte interna de la capa granular externa (futura capa molecular (m)). Algunas células son inmunorreactivas en la capa granular interna. Las células de Purkinje (p) son negativas, al igual que las células de la parte externa de la capa granular externa (ge).
D:
Inmunoperoxidasa indirecta con un suero de paciente que contiene un anticuerpo anti-CV2 (x1000). El inmunomarcaje está básicamente concentrada en la parte interna de la capa granular externa (futura capa molecular (m)). Cabe señalar la presencia de una célula reactiva en la capa granular interna (gi) (flecha).
- La figura 6 representa un marcaje inmunohistoquímico de cortes de hipocampo humano post-mortem (tinción HPS).
A:
cerebro de paciente testigo.
B:
cerebro de paciente que presenta una encefalitis límbica y anticuerpos circulantes anti-CV2. Se puede observar la desaparición de las células granulares.
- La figura 7 representa un perfil de electroforesis bidimensional con la proteína ULIP-2 (A) control y la proteína ULIP-4 (B).
La figura 7C representa el modelo de perfil de migración de las proteínas ULIP-1, 2, 3 y 4 como referencia. Las proteínas se revelan
a)
por autorradiografía para localizar las proteínas traducidas in vitro (traducción);
b)
por inmunoimpresión con el suero anti-CV2.
- La figura 8 representa un perfil de migración del ARNm de C-22/ULIP-3 (8A) y TOAD-64/ULIP-2 (8B) amplificado por RT-PCR, expresado en diferentes tipos celulares:
pistas 1-3: tumor de pulmón de células pequeñas
pista 2: tumor de pulmón de células pequeñas con suero anti-CV2
pista 4: ADNc control
pista 5: meduloblastoma tratado por infección HTLV1
pistas 6-7: meduloblastoma
pista 8: línea C6 de células gliales en el ratón
pista 9: control
pista 10: nula
pista 11: escala kb
Las flechas negras corresponden a POP-66 y las flechas blancas corresponden al estándar de peso molecular.
- La figura 9 representa la secuencia nucleotídica de ULIP-2 en el ratón (ID SEC Nº 1), así como la secuencia de aminoácidos deducida (ID SEC Nº 2).
- La figura 10 representa la secuencia nucleotídica de ULIP-3 en el ratón (ID SEC 10 Nº 3), así como la secuencia de aminoácidos deducida (ID SEC Nº 4).
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- La figura 11 representa la secuencia nucleotídica de ULIP-4 en el ratón (ID SEC Nº 5), así como la secuencia de aminoácidos deducida (ID SEC Nº 6).
- La figura 12 representa la secuencia nucleotídica de ULIP-4 en el hombre (ID SEC Nº 7), así como la secuencia de aminoácidos deducida (ID SEC Nº 8).
Un codón stop erróneo en la secuencia ULIP-4 de hombre (asterisco) es el resultado de una equivocación de la transcriptasa inversa en la producción del banco. En comparación con ULIP-4 de rata y de ratón, es casi seguro que la secuencia TAG que codifica un stop sea en realidad un codón AAG, que codifica una lisina como en el caso de la rata y del ratón. Además, la región alrededor de este aminoácido está completamente conservada en las tres especies.
La secuencia de aminoácidos se completó sobre la ID SEC nº 8 por medio de 15 aminoácidos en C-terminal (nº 554 a nº 568). Esta región C-terminal, ausente en la figura 12, se conserva excelentemente entre ULIP-4 de rata y ratón, así como entre las diferentes ULIP.
Ejemplo 1 Purificación de POP-66 y secuenciación
La purificación de POP-66 se realizó con el material y según los procedimientos descritos en el artículo de Honnorat et al., 1996, a partir de suero de pacientes aquejados de SNP.
Para identificar la proteína POP-66, se optó por una estrategia de purificación que permite obtener una secuenciación parcial. El cribado de un banco de expresión de ADNc de cerebro o la purificación de la proteína por inmunoafinidad se excluyeron debido a las cantidades limitadas de sueros asociadas al fallecimiento de pacientes. Se pudo desarrollar un método de purificación bioquímica a partir de cerebros de ratas recién nacidas gracias a los sueros humanos anti-CV2 que permitieron seguir cada etapa de la purificación.
Los tejidos, conservados a -70ºC antes de su utilización, fueron tratados con una solución compuesta por DTT (ditiotreitol) (Sigma) 0,2 M. Anfolinas 3-10 (Pharmacia) 2% y Triton X-100 (Merck) 2% y se pusieron a 2-4ºC. Inmediatamente antes de su utilización se añadió urea sólida (Pharmacia) para obtener una solución 8 M.
La proteína POP-66 es soluble, al menos parcialmente, y precipita por completo a una concentración de 40% de sulfato de amonio.
Una centrifugación a 100.000 (veces) g y una precipitación con sulfato de amonio (que elimina las proteínas que precipitan por debajo del 20% y por encima del 40% de sulfato de amonio) permiten obtener unos extractos proteicos enriquecidos en POP-66. Las proteínas de este extracto son posteriormente separadas, tras diálisis, por isofocalización en gel de agarosa (Peltre et al., 1982).
Una vez transferidos a la membrana, los anticuerpos anti-CV2 reconocen varias bandas de puntos isoeléctricos comprendidos entre 5,85 y 6,55. El conjunto de estas bandas corresponde a la proteína POP-66 reconocida por los anticuerpos anti-CV2. Este espectro sugiere la posibilidad de modificaciones transcripcionales (fosforilaciones y/o glicosilaciones) de la proteína.
A partir del gel de agarosa, la zona de las proteínas comprendida entre 5,85 y 6,55, de pl, se utiliza para una nueva migración electroforética con gradiente desnaturalizante en gel de poliacrilamida previamente equilibrado con una solución de equilibración (0,05 mol/l Tris/HCl, pH 6,8, urea 6 M, glicerol 30%, SDS 1% peso/volumen durante 2x10 minutos) a la que se añade DTT (0,25% peso/volumen) y azul de bromofenol.
Se utilizan dos medios de detección:
-
la tinción con plata. Justo al final de la migración, el gel se sumerge en una solución fijadora (40% de etanol, 10% de ácido acético) durante 30 minutos y a continuación se coloca en una solución de incubación (30% de etanol, 7% peso/volumen de acetato de sodio, 0,1% de glutaraldehído, 0,2% peso/volumen de tiosulfato de sodio) durante 30 minutos o una noche. Tras lavado, el gel se coloca en una solución de plata (0,1% peso/volumen de nitrato de plata + formaldehído) y se revela (2,5% peso/volumen de carbonato de sodio + formaldehído). La reacción se para con EDTA-Na_{2} (1,5% peso/volumen). Los geles se conservan en una solución de glicerol.
-
transferencia sobre membrana de PVDF (Immobilon-P®, Millipore). Las proteínas separadas se transfieren en una membrana de PVDF utilizando un tampón CAPS (Sigma) 100 mM pH 11. Las transferencias se incuban durante una hora en tampón TBS (Tris buffer saline) con un 5% de caseína (leche) y 18 horas en tampón TBS (+1% de caseína) que contiene anticuerpos (suero anti-CV2 1/500). Tras lavado con TBS-caseína (15 minutos), el revelado se efectúa incubando las transferencias durante 1 hora y media con los anticuerpos anti-IgG biotinilados (1/1000) y durante 1 hora y media con el complejo estreptavidina-peroxidasa (1/2000). Posteriormente, las transferencias se revelan con DAB (diaminobenzidina 0,06% peso/volumen en Tris 0,05 M) y con H_{2}O_{2} (0,02 \mug/ml).
Sólo se ve una banda correspondiente a una proteína 66 kDa. Esta última está específicamente marcada por los anticuerpos anti-CV2 (figura 1). Tras digestión trípsica, se procedió a una secuenciación N-terminal de esta proteína:
Se obtuvieron siete péptidos que presentan las siguientes secuencias:
1
– X-Met-Tyr-Asp-Gly-Pro
2
– X-Phe-Asn-Leu-Tyr-Pro-Arg
3
– X-Val-Leu-Glu-Asp-Gly-Thr-Leu-His-Val-Thr-Glu-Gly
4
– X-lle-Gly-X-X-Ala-Gln-Val-(His ?)-Ala-Glu-Asn-Gly-X-IIe-IIe-Ala-Glu-Glu- Gln
5
– X-X-Glu-Asn-Gln-Phe-Val-Ala-Val-Thr
6
– X-Val-Asn-Asp-(Asp ?)-Gln-Ser-Phe-Tyr-Ala-Asp-IIe-Tyr-Met-Glu-(Asp ?)- (Gly ?)-Leu-IIe
7
– X-X-X-Phe-Val-Thr-X-Pro-X-Leu-X-Pro
X:
corresponde a un aminoácido no determinado
(?)
corresponde a un aminoácido probable, pero no seguro.
Según el análisis de los bancos de datos disponibles en 1994, no existe ninguna proteína conocida que corresponda a esas secuencias.
Ejemplo 2 Clonación del ADNc de POP-66 o de las proteínas emparentadas
La clonación del ADNc de la proteína POP-66 o de las proteínas emparentadas se llevó a cabo utilizando sondas oligonucleotídicas degeneradas obtenidas a partir de fragmentos de dos péptidos:
IIe-IIe-Ala-Glu-Glu-Gln
Tyr-Ala-Asp-IIe-Tyr-Met-Glu-(Asp ?)
Se determinaron cuatro juegos de cebadores oligonucleotídicos degenerados (sentido/antisentido)
(AT(C/T)ATTGC(T/A)GA(A/G)CA; TG(C/T)TC(T/C)AC(T/A)GCAT(A/G)AT; TATGC(A/T)GA(CIT)AT(CIT)ATGGA; TCCAT(G/A)TA(G/A)CT(T/A)GCAT A) que se utilizaron para una amplificación PCR.
La matriz se preparó en forma de ADNc doble hebra (Promega kit) a partir de ARNpoli(A+) extraído del cerebro de ratas con 10 días de vida (Zivic-Miller, USA) utilizando el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (Invitrogen).
Las condiciones de amplificación por PCR son las siguientes: 35 ciclos a 94ºC, 1 minuto para la desnaturalización, 55ºC, 1 minuto para la hibridación y 72ºC, dos minutos para la extensión.
Los productos de PCR son analizados por electroforesis en gel de agarosa al 1%, electroeluidos, clonados en un vector de clonación TA (Invitrogen) y secuenciados utilizando los sitios de los cebadores de los promotores T7 y SP6.
La secuencia de aminoácidos deducida del clon MFB-17 concuerda con las secuencias de dos péptidos originales de POP-66 determinados mediante el análisis de la secuencia de aminoácidos.
Un análisis comparativo de las secuencias de ácidos nucleicos utilizando las bases de datos Genbank y EMBL revela que MFB-17 es un ADNc parcial con una secuencia nucleotídica idéntica a la de un segmento de TOAD-64, una proteína neuronal de rata (Minturn et al., 1995).
La secuencia de aminoácidos deducida a partir del ADNc de TOAD-64 concuerda con las secuencias de siete péptidos determinados mediante el análisis de las secuencias parciales de la proteína reconocida por los anticuerpos anti-CV2 tras purificación por electroforesis.
El peso molecular, el punto isoeléctrico, el perfil inmunohistoquímico y la regulación de TOAD-64 son similares a los del antígeno POP-66.
Dado que el clon MFB-17 no representa la región codificante completa, hubo que producir una proteína recombinante intacta para continuar las investigaciones relativas a la proteína CV2.
Para obtener una proteína completa TOAD-64, se amplificó la matriz ADNc-ds de cerebros de ratas con dos juegos de cebadores situados en los extremos 5' y 3' de las regiones codificantes
(sentido: GGCATATGTCTTATCAGGGGAAG; antisentido: GCGAATTCTTAGCCCAGGCTGATG).
Este enfoque permitió producir dos clones diferentes, uno de ellos correspondiente a la secuencia TOAD-64 y el otro a un clon denominado C-22.
Ejemplo 3 Comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de C-22 con las proteínas ULIP
La secuencia de aminoácidos deducida a partir del marco de lectura abierto, indica que el clon C-22 pertenece a la superfamilia de genes ULIP representada por varios genes de secuencias EST.
La secuencia de aminoácidos deducida de C-22 presenta una homología del 30% con la secuencia de aminoácidos de la proteína unc-33 de Caenorhabditis elegans.
Recientemente se han descrito cuatro genes diferentes, homólogos a la proteína unc-33, en los mamíferos y en el pollo.
Un análisis de las secuencias a partir de las bases de datos Genbank y de los bancos de proteínas, permitió proponer una clasificación de las proteínas unc-33 like (ULIP) en cuatro subgrupos diferentes (Byk et al., 1996).
Sin embargo, como las funciones reales de estas proteínas no se conocen claramente, la clasificación propuesta simplemente se basa en el porcentaje de identidad de aminoácidos. ULIP-1 está representado por una fosfoproteína "unc-33 like" de ratón que presenta una homología del 76% con TOAD-64, Crmp-62 y Munc, una secuencia de ratón recientemente disponible en Genbank.
ULIP-2 está compuesto por TOAD-64, Crmp-62 y Munc que presentan entre sí un 97% de identidad de aminoácidos.
Se encontraron secuencias parciales humanas EST, es decir, hcrmp-1, que presentan una identidad del 75% con ULIP-1 o ULIP-2. Dichas secuencias pertenecen a un tercer grupo llamado ULIP-3. El último grupo identificado, llamado ULIP-4, comprende r-CRMP-3 en la rata y las formas ULIP-4 en el ratón y POP-66/ULIP-4 en el
hombre.
La comparación de la secuencia de aminoácidos de los tres genes ULIP, a saber, TOAD-64 en la rata, Crmp-62 en el pollo y ULIP-1 en el ratón, con la secuencia de aminoácidos deducida del marco de lectura abierto del presente clon C-22, utilizando el programa de alineación Clustal V, revela que C-22 presenta una identidad del 74% con ULIP-1, del 77% con Crmp-62 y del 76% con TOAD-64.
La secuencia nucleotídica C-22 tiene una identidad del 97% con la secuencia parcial EST, hCrmp-1, y define el tercer miembro del grupo ULIP-3. Los genes TOAD-64, Crmp-62 y C-22 codifican cada uno una proteína de 572 aminoácidos de longitud, mientras que la secuencia de aminoácidos deducida a partir de ULIP-1 da una proteína de 570 aminoácidos.
El análisis de la secuencia de aminoácidos de C-22 no muestra ninguna secuencia de señal o de dominio trans-
membranal que sugiera que el o los productos del gen C-22 podrían estar localizados en el citoplasma de las
células.
A lo largo del producto del gen C-22, aparecen varios sitios consenso de fosforilación por la proteína quinasa C (S/T X R/K). Estas observaciones sugieren que C-22 es una fosfoproteína y que pequeñas diferencias en la fosforilación podrían dictar la actividad o la función de los diferentes miembros de esta familia de proteínas durante el ciclo
celular.
TABLA I Recapitulación de las proteínas que presentan una homología con las ULIP.
Familia Especies Nº EMBL
Unc-33 nematodo nematodo Z14146
Dihidropirimidinasa Hu DHPase hombre D78011
Ra DHPase rata D63704
grupo ULIP-1 Ulip ratón X87817
Hu DRP3 hombre D78014
r-CRMP-1 rata U52102
Hu-Ulip hombre Y07818
grupo ULIP-2 ULIP-2 ratón ID SEC nº 2
Toad-64 rata Z46882
CRMP-62 pollo U17277
Munc ratón X87242
HCRMP-2 hombre U17279
Hu DRP-2 hombre D78013
r-CRMP-4 rata U52104
grupo ULIP-3 ULIP-3 ratón ID SEC nº 4
HCRMP-1 hombre U17278
rCRMP-1 rata U52102
C-22 rata U52095
Hu DRP-1 hombre D78012
grupo ULIP-4 ULIP-4 ratón ID SEC nº 6
POP-66/ULIP-4 hombre ID SEC nº 8
r-CRMP-3 rata U52103
Ejemplo 4 Regulación de la expresión del gen C-22
La evaluación de las alteraciones en la expresión del gen C-22 podría tener una importancia considerable para el conocimiento de los aspectos funcionales de la proteína C-22.
Por consiguiente, la Solicitante estudió la posible regulación de la expresión del gen C-22 durante el desarrollo. El ARN total se extrae y separa por electroforesis en gel de agarosa al 1% y se transfiere sobre una membrana Nytran (Duchemin et al., 1987). Las transferencias se hibridan con una secuencia codificante C-22 marcada en el ^{32-}P, un tampón fosfato 0,5 mM y un 5% de SDS a 65ºC durante 16 horas.
Al final de la hibridación, las transferencias se lavan sucesivamente tres veces con 2xSSC, 0,1% SDS a temperatura ambiente, y luego con 1xSSC, 0,1% SDS a 65ºC durante 60 minutos, y se exponen a rayos X.
En las condiciones utilizadas, se detectó una única banda de 3,8 kb que representa el ARNm C-22, que también es el transcrito más pequeño de la familia de genes unc-33 de los vertebrados. El tamaño del transcrito permanece invariable durante los períodos prenatal y postnatal.
La cinética del gen C-22 en el cerebro de ratas durante el desarrollo, muestra que el mensajero se puede detectar durante el período embrionario el día E17. La cantidad de transcritos C-22 aumenta hasta el día 7 postnatal y disminuye rápidamente a partir de la segunda semana después del nacimiento hasta un nivel prácticamente indetectable en el adulto.
Poco antes del nacimiento, probablemente se recibe una señal de regulación todavía desconocida, lo que aumenta la expresión del gen C-22, estando dicha señal asociada temporalmente a la diferenciación neuronal y al desarrollo axonal.
El ARNm de C-22 no se pudo detectar mediante el análisis de Northern Blot en varias regiones del cerebro, tales como el córtex frontal, el cerebro medio y el tálamo en el adulto y en la rata de más de dos años.
Además, no se pudo detectar el ARNm de C-22 en tejidos no neuronales, tales como el corazón, el pulmón, el hígado o el riñón en ratas de una semana y en ratas adultas.
Los datos sobre el perfil de expresión del ARNm de C-22 sugieren una función preponderante de la proteína C-22 en el desarrollo del cerebro.
Ejemplo 5 Inmunoimpresión de POP-66 A - Materiales y procedimientos \bullet Transfección de las ULIP en E. Coli
Los ADNc enteros de ULIP-2 y ULIP-3 de rata y ULIP-1 y ULIP-4 de ratón se subclonaron de manera direccional en el vector de expresión pET-21a(+) E. coli después de la introducción de un sitio 5'N de I y de un sitio 3' EcoRI por PCR, y se volvieron a secuenciar las cuatro construcciones. La expresión de gen diana inducido por IPTG se realizó según el protocolo del fabricante (Novagen).
\bullet Producción de anticuerpos anti-ULIP
Se dirigieron anticuerpos de conejo (anti-Pep3) contra el péptido ITGPEGHVLSRPEEVE (aminoácidos 217-232 de la secuencia ID SEC nº 8), sintetizado en un aparato de síntesis peptídica múltiple utilizando el F-moc (432A Peptide Synthesizer SYNERGY, Applied Biosystems). La pureza se comprobó mediante el análisis de la secuencia por HPLC y espectrometría de masa. 1 mg del péptido sintético conjugado con hemocianina de lapa, en adyuvante completo de Freund, se utilizó para inmunizar conejos con una dosis "booster" de 0,5 mg del péptido conjugado en el adyuvante completo de Freund después de 4 semanas. Los anticuerpos anti-Pep3 reconocieron las cuatro proteínas ULIP recombinantes expresadas en E. coli.
El marcaje con anticuerpos anti-Pep3 se eliminó después de la preincubación con el péptido 3. Los controles con sueros de conejo preinmunes fueron negativos.
Siguiendo el mismo protocolo, se produjeron anticuerpos anti-péptido 4 dirigidos contra el péptido LEDGTLHV
TEGS.
B - Resultados
Se produjeron anticuerpos contra cuatro de los péptidos secuenciados. Dos de los sueros resultaron ser particularmente interesantes.
Uno de ellos contiene anticuerpos (Ac anti-pep3) que reconocen varios miembros de la familia ULIP mediante electroforesis bidimensional de extractos proteicos de cerebro de rata recién nacida (figura 2) y mediante electroforesis monodimensional (figura 3). El otro anticuerpo (Ac anti-pep4) reconoce por Western Blot una única banda de 66 kDa susceptible de corresponder a un solo miembro de la familia (figura 3), es decir, a ULIP-2.
Ejemplo 6 Inmunohistoquímica
Las preparaciones de tejidos para la inmunohistoquímica se obtienen a partir de cerebros de ratas recién nacidas y de cerebros humanos post-mortem, fijados a 4ºC en paraformaldehído al 4% y al 0,2% de ácido pícrico diluidos en tampón fosfato (0,1 M, pH = 7,4) y crioprotegidos.
La inmunocitoquímica se puede realizar mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Con el criostato se realizan cortes de 12 \mum de espesor que posteriormente se adhieren a un portaobjetos recubierto de gelatina, se tratan durante 2 horas en tampón PBS y 1% de albúmina sérica bovina (BSA) con 0,1% de Triton X100 y se incuban 12 h con el suero de pacientes anti-CV2 en PBS-1% BSA a temperatura ambiente (dilución del suero 1/100). Tras varios lavados con PBS-1% BSA, los cortes se incuban durante 2 horas con un antisuero antihumano de conejo conjugado con fluoresceína diluida al 1% (Dakopatts) en PBS-1% BSA. Tras lavado con PBS, los portaobjetos se examinan al microscopio. Los cortes de control se incuban ya sea con el antisuero IgG antihumano conjugado con fluoresceína sola, bien sea con el PBS-1% BSA solo, bien sea con el suero de paciente solo o bien con el suero control (pacientes no aquejados de SNP) y anticuerpos conjugado con fluoresceína a la misma dilución.
Para confirmar la inmunofluorescencia se puede utilizar el marcaje indirecto por inmunoperoxidasa. Los cortes de tejidos congelados fijados con paraformaldehído se incuban con 0,3% de H_{2}O_{2} (para destruir la actividad peroxidasa intrínseca) y 10% de suero normal de conejo (para evitar la unión no específica de los IgG de conejo) o con 1% BSA. Tras incubación de 12 h con sueros de pacientes diluidos 1/1000 y lavado, los cortes se incuban 2 h con antisuero IgG antihumano de conejo biotinilado diluido a 1/1000 en PBS-1% BSA. Los IgG humanos unidos se visualizan por incubación con un complejo avidina-biotina-peroxidasa (Vectastain ABC complex, Vector) y se revelan con 0,05% DAB (Sigma). Los cortes control se obtienen a partir de sueros de 15 pacientes sin SNP según el mismo protocolo.
A - Localización de las proteínas de la familia ULIP utilizando anticuerpos antipéptidos
Se realizó un marcaje inmunohistoquímico en cortes de cerebros de ratas recién nacidas y adultas. El anticuerpo antipéptido-3 reconoce uno o varios antígenos presentes en diferentes tipos celulares en los cortes de cerebros de ratas recién nacidas y adultas (fig. 4). Al igual que el suero anti-CV2 de paciente, los anticuerpos anti-péptido-4 no permiten la demostración de ningún antígeno en los cortes de cerebro de rata recién nacida, pero marcan específicamente una subpoblación de oligodendrocitos en el cerebro de rata adulta (fig. 4).
B - Expresión de POP-66 durante el desarrollo normal del cerebro
La figura 5 muestra que las células nerviosas proliferativas de las zonas progenitoras del sistema nervioso, evidenciadas por la acumulación de bromodeoxiuridina (BrdU), no expresan POP-66 mientras que las células no proliferativas correspondientes a las células nerviosas en diferenciación o en migración sí lo hacen.
Ejemplo 7 Función de POP-66 en la supervivencia neuronal
La figura 6 permite comparar cortes de cerebros humanos de pacientes sanos y de pacientes aquejados de SNP. En los pacientes aquejados de un SNP, que presentan anticuerpos circulantes anti-CV2, se observa una desaparición de las neuronas del giro dentado y de las neuronas piramidales (banda de células central), así como una reacción astrocitaria intensa.
Ejemplo 8 Caracterización de la proteína POP-66 - Identificación con ULIP-4 Materiales y procedimientos a) Purificación parcial de ULIP-1
Se obtuvo ULIP-1 parcialmente purificada a partir de cerebros de ratones recién nacidos, a través de tres etapas de purificación. Dichos cerebros se homogeneizaron en 4 volúmenes de tampón de homogeneización (25 mM fosfato de sodio, pH 7,8, 1 mM EGTA, 10 \mug/ml de leupeptina, 25 \mug/ml de aprotinina y 10 \mug/ml de pepstatina). Los homogenados se centrifugaron a 400 x g durante 10 minutos. Los sedimentos se suspendieron de nuevo en 2 volúmenes de tampón de homogeneización, se homogeneizaron, y se volvieron a centrifugar. Los sobrenadantes resultantes de las dos centrifugaciones se juntaron, se sonorizaron y se centrifugaron a 100.000 x g durante 1 hora. El sobrenadante (S2) se cargó en una columna CL-6B de DEAE-Sepharose (1,75 cm^{2} x 26 cm) equilibrado con 100 ml de tampón A (25 mM de fosfato de sodio, pH 7,8, 1 mM de EGTA) a un flujo de 30 ml por hora. Las proteínas fueron eluídas en 300 ml de un gradiente lineal de cloruro de sodio 0-250 mM en tampón A y se tomaron muestras de 5 ml. Las fracciones que contienen ULIP se recogieron y se añadió sulfato de amonio sólido hasta una saturación del 20%. Este "pool" se cargó en una columna CL-48 de fenil-Sepharose (1,75 cm^{2} x 22 cm) tras haber sido equilibrado con 100 ml de tampón B (10 mM de fosfato de sodio, pH 7,8, 1 mM de EGTA) que contiene un 20% de sulfato de amonio saturado. Las proteínas fueron eluídas en un gradiente lineal decreciente de 20 a 0% de sulfato de amonio saturado en tampón B. Las fracciones que contienen ULIP se recogieron y se dializaron dos veces contra 20 volúmenes de tampón A. Las proteínas se concentraron en una pequeña (10 ml) columna C1-6B de DEAE-Sepharose y fueron eluídas con 400 mM de cloruro de sodio en tampón A. El eluato se desaló en una columna Sephadex G-25 (NAP-10) y se concentró en un volumen final de 0,5 ml por evaporación. En la última etapa de purificación, la fracción concentrada se cromatografió en tres etapas sucesivas, a través de dos columnas de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) Superose 12 montadas en serie, en tampón C (50 mM de fosfato de sodio, pH 7,2, 150 mM de cloruro de sodio) a un caudal de 0,3 ml/minuto. Se recogieron las fracciones (0,6 ml) y se analizaron las fracciones enriquecidas en ULIP. La presencia de ULIP en las etapas sucesivas de purificación se demostró por medio de un Western Blot monodimensional utilizando un anticuerpo anti-estatmina capaz de reactividad cruzada. Las proteínas se cuantificaron según el procedimiento de Bradford.
b) Migración neta de electroforesis
Se efectuó una electroforesis monodimensional en geles de poliacrilamida al 13% según el procedimiento Laemmli. Las electroforesis PAGE bidimensionales se efectuaron tal como se describió anteriormente. Los geles de isoelectrofocalización contenían un 2% de anfolinas total y un pH 6-8 y 3-10 según una relación de 4:1. La segunda dimensión se realizó en geles de acrilamida al 10%. Las proteínas fueron sometidas a una inmunoimpresión o bien tintadas con plata.
c) Análisis de inmunotransferencia
Las proteínas se transfirieron a partir de los geles a la nitrocelulosa en un tampón que contiene Tris 48 mmM, glicina 39 mM y 5% de metanol. La membrana se saturó con caseína (2,5%) en la solución de inmunoimpresión (12 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 160 mM de Na Cl, 0,1% de Triton X-100) y se probó con un antisuero dirigido contra el péptido I de la estatmina de rata (dilución 1/10.000) o con un antisuero dirigido contra la proteína ULIP recombinante (dilución 1/20.000) diluido en una solución de inmunoimpresión que contiene un 1% de caseína. Los anticuerpos asociados fueron detectados ya sea con una proteína A marcada en ^{|'125|} y autorradiografiados o bien con
anticuerpos anticonejo asociados a la peroxidasa utilizando el kit ECL (Amersham).
d) Análisis de la secuencia proteica
Las fracciones enriquecidas en ULIP se separaron en los geles de poliacrilamida bidimensionales. Los geles se fijaron durante 30 minutos en 25% de etanol y 10% de ácido acético y se tiñeron durante 3 minutos en 0,1% de negro amido, en 1% de ácido acético y 40% de metanol. Los geles se destiñeron en 1% de ácido acético y las manchas correspondientes a la forma principal de ULIP se recortaron en estos tres geles, se recogieron y se digirieron con 2 mg/ml de endoproteasa Lys C. Los péptidos eluidos del gel fueron posteriormente separados por HPLC en una columna DEAE-C18 con un gradiente de 0-55% de acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético. A continuación, los péptidos se secuenciaron según la degradación automática de Edman.
e) Expresión in vitro en un mamífero
Se utilizó 1 \mug del plásmido Bluescript que contiene el ADNc entero que codifica las proteínas ULIP-1, ULIP-2, ULIP-3 o ULIP-4 para realizar la trascripción y la traducción in vitro con el sistema "Reticulocyte lysate" (Promega) según el protocolo descrito por el fabricante. 5 \mug de la mezcla total de 25 \mul de la trascripción/traducción fueron analizados en gel de electroforesis bidimensional.
Resultados
Ni la proteína recombinante ULIP-1, ni las proteínas recombinantes TOAD-64 (ULIP-2) y C-22 (ULIP-3) fueron reconocidas por los sueros anti-CV2. Además, el perfil de distribución de las manchas correspondientes a POP-66 reconocidas por los anticuerpos anti-CV2 en la electroforesis bidimensional, no se corresponde con las manchas reconocidas por los anticuerpos anti-UL1P-1. No obstante, POP-66 es un miembro de la familia ULIP, ya que las tres manchas POP-66 fueron reconocidas por el Ac anti-pep3. Por lo tanto, POP-66 corresponde a un miembro de la familia de pHi más básico.
Después de la traducción in vitro de las cuatro proteínas (ULIP-1, 2, 3 y 4), se demostró que ULIP-4 presenta el mismo perfil electroforético 2D que POP-66 y que está reconocida por los anticuerpos anti-CV2 (figura 7).
Para ello, la proteína ULIP-4 y, como control, la proteína ULIP-2, fueron traducidas in vitro en presencia de metionina ^{35}S a partir de clones de ADNc que codifican las proteínas enteras. Las proteínas fueron separadas por electroforesis bidimensional (en presencia de un extracto de cerebro que proporciona las referencias esenciales), transferidas a nitrocelulosa y reveladas:
- por autorradiografía para localizar las proteínas traducidas in vitro (traducción);
- por inmunoimpresión con el suero CV2.
La figura 7 muestra que las tres manchas de la traducción in vitro de ULIP-4 se corresponden con las manchas reconocidas por CV2. En la traducción de ULIP2 no se reconocen dichas manchas.
El suero CV2 reconoce específicamente la proteína ULIP-4.
Esto ha permitido identificar a POP-66 como ULIP-4.
Ejemplo 9 Localización cromosómica de la proteína POP-66/ULIP-4
Como el ADNc de ULIP-4 humano está clonado, es posible determinar la localización cromosómica del gen POP-66/ULIP-4 mediante cartografía génica por hibridación in situ isotópica (Levy y Mattei et al., 1995).
La hibridación in situ se lleva a cabo con preparaciones de cromosomas obtenidas a partir de linfocitos humanos estimulados por la fitohemaglutinina puesta en cultivo durante 72 horas. Durante las 7 últimas horas del cultivo se añadió 5-bromodeoxiuridina (60 \mug/ml de medio) para garantizar que la imagen de las bandas cromosómicas posthibridación fuese de buena calidad. El clon que contiene una inserción de 1300 pares de bases que codifican la proteína ULIP-4 en el vector Bluescript, está marcado con tritio por desplazamiento de mella ("nick translation") con una actividad específica de 1x10^{8} dpm.\mug-1. La sonda radiomarcada se hibridó en la etapa metafase a una concentración final de 200 ng por ml de solución de hibridación. Después de haber sido recubiertos con una emulsión Kodak NTB_{2}, los portaobjetos se expusieron durante 20 días a +4ºC y luego se revelaron. Para evitar la desviación de los granos de plata durante el proceso, las muestras de cromosomas se marcaron previamente con una solución tampón de Giemsa y las metafases se fotografiaron. El revelado de las bandas se efectuó por el procedimiento "fluorocromo-fotolisis Giemsa" (FPG) y las metafases se volvieron a fotografiar antes del análisis. Sobre las 100 células en metafase examinadas tras hibridación in situ, se contaron 246 granos de plata asociados a los cromosomas y 54 de ellos (21,9%) estaban localizados en el cromosoma 10. La distribución de los granos en este cromosoma no era aleatoria: 39 de 54 (72,2% de ellos) estaban localizados en la región q25.2-q26 del brazo largo del cromosoma 10.
Por lo tanto, el gen POP-66/ULIP-4 se encuentra situado en el cromosoma 10, en la región q25.2-q26. En esta región cromosómica es donde se han localizado los locus de enfermedades neurodegenerativas y de genes supresores de tumores implicados en diferentes tipos de cánceres. El locus de una enfermedad cerebelosa de inicio precoz ("infantil onset spinocerebellar ataxia") se identificó en la región 10q24-26 (Varilo y col., 1996; Nikati y col., 1995). Los síntomas de esta enfermedad degenerativa hereditaria recesiva, caracterizada por una ataxia, una neuropatía y una atrofia óptica son similares a los observados en los pacientes aquejados de síndromes neurológicos paraneoplásicos con autoanticuerpos anti-CV2 circulantes (Honnorat y col., 1996). Por otro lado, el 80% de los gliobastomas presentan mutaciones en esta región cromosómica y varios locus supresores implicados en diferentes tipos de tumores (próstata, riñón, cáncer de pulmón de células pequeñas y carcinomas del endometrio) se localizan en esta región cromosómica. Estos datos refuerzan la posibilidad de que POP-66/ULIP-4 desempeña una función crucial en la neurodegeneración y en la tumorogénesis.
A este respecto, cabe señalar que la expresión de ULIP-1 se regula al alza en las células de neuroblastomas diferenciados por el ácido retinoico y que ULIP-1 y ULIP-3 se regulan al alza, mientras que ULIP-4 se regula a la baja en las células PC12 diferenciadas en presencia de NGF, lo que sugiere que la interrupción del crecimiento celular puede estar relacionada con los niveles de expresión de las proteínas ULIP.
Ejemplo 10 Expresión de las proteínas ULIP en las células HeLa transfectadas A - Materiales y procedimientos
Se clonó una secuencia "flag" (EcoRI-ATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGG-BamHI) (Kodak) en el sitio EcoRI de pSG5 seguida de ULIP-1 (EMBEL X87817, pares de bases: 309-2023), ULIP-2 (Y10339, pares de bases: 23-1741), ULIP-3 (Y09080, pares de bases: 269-1991) o ULIP-4 (Y09079, pares de bases: 102-1820), respectivamente. Las células HeLa fueron cultivadas en medios DMEM (Gibco) y adicionadas de suero de ternera fetal (10%) (v/v). Las transfecciones se realizaron por precipitación con fosfato de calcio (Maniatis et al., 1978). Las células HeLa se mezclaron con 5 \mug de plásmidos pSG5flag-ULIP-1, 2, 3, 4 y con 10 \mug de pUC18. Veinticuatro horas después de la transfección, las células HeLa se fijaron con un 4% de paraformaldehído, se inmunomarcaron con diferentes sueros humanos (dilución 1/300) y se revelaron con anticuerpos anti-IgG humanos conjugados con FITC (Biosys) o con anticuerpos anti-flag (M2. Kodak) (dilución 1/1000), revelados con anticuerpos anticonejo conjugados con rojo Texas (Vector).
Las células HeLa transfectadas por ULIP fueron sometidas a un doble inmunomarcaje utilizando anticuerpos anti-flag y anti-Pep3. El 10-20% de las células transfectadas por cualquier tipo de ADNc presentaban un inmunomarcaje con los anticuerpos anti-flag revelados por los anticuerpos anti-ratón conjugados con rojo Texas.
Todas las células transfectadas fueron doblemente marcadas por anticuerpos dirigidos contra Pep3 y un péptido común a las cuatro ULIP fue revelado por anticuerpos anti-IgG de conejo conjugados con la fluoresceína.
También se realizó un doble inmunomarcaje en las células HeLa transfectadas por ULIP utilizando anticuerpos anti-flag y anti-CV2. Los sueros humanos de pacientes aquejados de SNP con autoanticuerpos circulantes anti-CV2 marcaron las células transfectadas por ULIP-4 y un suero anti-CV2 también marcó las células transfectadas por ULIP-3. En los sueros de control de pacientes sin cáncer o enfermedad neurológica, no se detectó ningún marcaje de las células transfectadas por ULIP-4.
B) Resultados
Después de la transfección de las células HeLa con ADNc marcados por los flag de las 4 ULIP, entre el 10 y el 20% de las células presentaron una fuerte reactividad con los anticuerpos anti-flag y anticuerpos anti-Pep3 que reconocen las 4 ULIP de mamíferos. Las células transfectadas no se inmunomarcaron con suero control de 10 pacientes neurológicos sin SNP ni con suero preinmune de conejo. En cambio, las células transfectadas con el ADNc de ULIP-4 demostraron una inmunorreactividad intensa con el conjunto de los 7 sueros probados de pacientes con autoanticuerpos anti-CV2 circulantes. Estos sueros son negativos en células transfectadas con ADNc de otras ULIP, salvo un suero que igualmente reconoció las células transfectadas por ULIP-3 y un suero que también reconoció las células transfectadas por ULIP-1, 3 y 4. No se observó ningún marcaje en las células HeLa no transfectadas con un suero anti-CV2.
La tabla I que figura a continuación presenta los resultados de inmunofluorescencia indirecta con diferentes sueros en las células HeLa por ADNc marcados de miembros de la familia de ULIP.
TABLA 1
Nº suero Síntomas Tipo de tumor Ulip-1 Ulip-2 Ulip-3 Ulip-4
neurológicos
Anti-Pep3 - - + + + +
Preinmune Pep3 - - - - - -
90-002 PCD, uveítis UC - - + +
93-484 LE Timoma - - - +
94-590 LE SCLC - - - +
95-700 PEM SCLC + - + +
95-701 PCD Sarcoma uterino - - - +
95-706 LE, neuropatía SCLC - - - +
97-040 PCD SCLC - - - +
97-103 PCD SCLC - - - +
PCD: degeneración paraneoplásica del cerebelo;
LE: encefalitis límbica;
PEM: encefalomielitis paraneoplásica;
UC: carcinoma indiferenciado;
SCLC: carcinoma de pulmón de células pequeñas.
Ejemplo 11 Expresión de POP-66/ULIP-4 y de los miembros de la familia ULIP en los cánceres A - Expresión de ULIP-2 y ULIP-3 en los cánceres 1) Materiales y métodos: experimentos de RT-PCR
El ARN total se extrajo utilizando 1 ml de RNAZOL ^{TM}B (Bioprobe) según el método de Chomczynski y Sacchi. La cantidad de ARN se determinó por densidad óptica medida a 260 nm y su pureza se determinó a partir de la relación de las absorbancias medidas a 260 y 280 nm (relaciones 1,8-2,0). Además, la integridad de las preparaciones de ARN se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% en TBE (0,45 M de Tris-borato, 10 mM de EDTA, pH 8). La especificidad de los cebadores se analizó comparando sus secuencias con los diferentes bancos de datos de genes (EMBL y FASTA). Para una cuantificación relativa, el gen que codifica el G3PDH (gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, Clontech), gen ubicuo expresado en numerosos tejidos, incluido el cerebro, fue coamplificado con el ARNm probado como estándar interno para comprobar la igualdad de las cantidades de ARN de las muestras y para probar la eficacia de la etapa de trascripción inversa para las diferentes muestras de ARN. Los cebadores 5' y 3', y los oligonucleótidos de las sondas internas de G3PDH fueron sintetizados y purificados por Eurogentec. El ARNm total (1 \mug) se desnaturalizó (15 minutos a 65ºC) y se trascribió en ADNc de hebra simple (1 hora y media, 42ºC) en un volumen final de 20 \mul de tampón (50 mM de Tris-HCl, 75 mM de KCl, pH 8,3, Gibco BRL) que contiene 5 ng por \mul de cebador oligo-dT 12-18 (Pharmacia Biotech), 40 unidades de transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (Mu-LV) (Gibco BRL), 40 unidades de RNAsina (Promega), 10 mM DTT (Gibco BRL) y 0,5 mM de cada uno de los deoxinucleótidos trifosfato (Promega). Las muestras de ADNc se diluyeron a 1/10 en agua destilada y las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando 1 \mul, 4 \mul o 2 \mul de la muestra de ADNc para el ARN mensajero de ULIP-2 y ULIP-3, en un tampón (50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, 0,1% de Triton X100, 0,4% de glicerol y 800 \muM de NaCl, pH 9) al cual se añadieron 40 \muM de DTT, 3 mM de MgCl_{2}, 0,2 mM de cada dNTP, 0,4 \muM de cada cebador seleccionado y 2 unidades del AmpliTaq ADN polimerasa (Promega) en un volumen final de 50 \mul. Posteriormente, las muestras se colocaron en un termociclador (Biomed-Hybaid), se desnaturalizaron a 95ºC durante 5 minutos y se amplificaron durante 35 ciclos (1 ciclo = desnaturalización 95ºC durante 65 segundos, hibridación de los cebadores 60ºC durante 45 segundos, extensión 72ºC durante 4 minutos y elongación final 15 minutos a 72ºC). Los productos se separaron por electroforesis en gel de agarosa-Seakem al 1% y las bandas prueba de los productos de RT-PCR de tamaño esperado, así como la escala de marcador de peso molecular (100 pares de base) (Promega) se visualizaron recurriendo a la tinción con bromuro de etidio.
Composición de las sondas oligonucleotídicas utilizadas para la PCR ULIP-3 5' ATAGAGGAGCGGATGACG (899) 3'
GCTGTTATGGTCTTCAACTTGTCGG (1092)
GGCCTGTTATGGTCTTCAACTTGTCG (1093)
Composición de las sondas oligonucleotídicas utilizadas para la PCR ULIP-2 5' AGGAGGAGTGAAGACCATCG 5227) 3'
CTTATGCCACTCGCTGATGTCC (509).
2) Resultados
Los experimentos de RT-PCR demuestran que TOAD-64 (ULIP-2) y C-22 (ULIP-3) se expresan en ciertos tumores del pulmón de células pequeñas (ver figura 8) y están ausentes en otros, principalmente en los de los pacientes que desarrollan síndromes neurológicos paraneoplásicos de mejor pronóstico.
B - Expresión de ULIP-4 en los cánceres 1) Materiales y mátodos \bullet Preparación del ARN y RT-PCR
Los ARN totales se extrajeron de tumores cerebrales conservados en nitrógeno líquido, según la técnica clásica con RNAZOL ^{TM}(Bioprobe, Francia). La trascripción inversa se efectuó utilizando oligos(dt)_{18} en 1 \mug de ARN total y la PCR se realizó con 1/20 del volumen de la mezcla para la trascripción inversa (RT-mix). Los cebadores utilizados para ULIP-4 son:
5'CATCTGGCTGTCGCTGCAC3', 5'GCCGCCCCTACCAGAGACC3' y para GAPDH: 5'GGAGATTCAGTG
TGGTGG3', 5'GGCTCTCCAGAACATCATCC3'. El ADNc se desnaturalizó a 95ºC durante cinco minutos. La amplificación por PCR se realizó durante 30 ciclos. ULIP-4: 95ºC, 45 s; 62ºC, 45 s y 72ºC, 45 s. GAPDH: 95ºC, 45 s; 55ºC, 45 s y 72ºC, 45 s. La extensión final se realizó a 72ºC durante 5 minutos.
2) Resultados
De los 8 extractos de gliobastomas estudiados, 4 (el 50%) expresaron el ARN mensajero de ULIP-4. En cambio, de los 10 extractos de oligodendrogliomas probados, ninguno expresó el ARN mensajero de ULIP-4. Esta expresión diferencial, en función del tipo de tumor cerebral primitivo, corrobora una posible función de ULIP-4 en la proliferación celular de dichos tumores.
La proteína POP-66/ULIP-4, así como las proteínas de la familia ULIP, podrían expresarse en los tumores periféricos (tumor del pulmón de células pequeñas, timoma, cáncer de mama y de ovario). Por lo tanto, su presencia podría estar correlacionada con un pronóstico. La localización del gen de POP-66/ULIP-4 en la parte distal del cromosoma 10 lo confirma en el caso de los tumores cerebrales.
Así, la expresión diferencial de los miembros de la familia ULIP en los tumores tales como el cáncer de pulmón de células pequeñas, cuando el gen ULIP correspondiente está ausente en un tejido sano, así como la modulación de la expresión de los miembros de la familia ULIP obtenidos durante la diferenciación por el retrovirus humano HTLV1 de una línea de meduloblastoma, sugieren la implicación de las ULIP en los tumores cancerígenos.
Ejemplo 12 Producción de anticuerpos específicos de cada una de las proteínas ULIP humanas
Se sintetizaron péptidos específicos de cada miembro de la familia ULIP en un aparato de síntesis peptídico múltiple, utilizando el F-moc (432A Peptide Synthesizer SYNERGY, Applied Biosystems). La pureza se comprobó mediante el análisis de la secuencia por HPLC y espectrometría de masa.
Dichos péptidos son:
Péptido específico de ULIP-1: G S A R G S P T R P N (11 aminoácidos)
Péptido específico de ULIP-2: S S A K T S P A K Q Q A (12 aminoácidos)
Péptido específico de ULIP-3: P S A K S S P S K H Q (11 aminoácidos)
Péptido específico de ULIP-4: P A R A S C P G K I S (11 aminoácidos).
Se utilizó 1 mg del péptido sintético conjugado con hemocianina de lapa, en adyuvante completo de Freund, para inmunizar unos conejos con una dosis "booster" de 0,5 mg del péptido conjugado en adyuvante completo de Freund después de 4 semanas.
Los anticuerpos obtenidos reconocen específicamente cada proteína miembro de la familia ULIP.
Ejemplo 13 Producción de animales transgénicos que expresan ULIP-4
Se transformaron drosófilas mediante el ADNc de ULIP-4 humano.
El ADNc de ULIP-4, anteriormente clonado en pbluescript SK-phagemid, se escindió por doble digestión enzimática Kpn1 y Xba1. Tras electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de ADNc fue purificado, clonado en pUAST, derivado de pCaSpeR3, y digerido por la enzimas de restricción Kpn1 y Xba1. El plásmido 10-C resulta de la clonación direccional del ADNc de ULIP-4 en pUAST asociado al gen transportador mini-white. El plásmido 10-C se inyectó con un plásmido helper p-delta-2-3 que codifica la transposasa del elemento P activo en la línea germinal.
Las drosófilas transformadas se identifican por sus ojos rojos, que son el resultado de la expresión del gen mini-white. Estas líneas transformadas por el ADNc de ULIP-4 bajo el control de secuencias reguladoras UASGAL4, permiten una expresión específica del ADNc de ULIP-4.
Esta producción de drosófilas transformadas permite estudiar específicamente la función de ULIP-4 en diferentes células y comprender su implicación en las patologías humanas.
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- Wang L-H et al., J. Neurosci., 1996, vol. 16(9), pp 6197-6207.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
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(i)
SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 101, rue de Tolbiac
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(C)
CIUDAD: París
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(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 75013
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: + 144236000
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: + 145856856
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Utilización de las ULIP en los SNP y en los cánceres asociados
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
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(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release#1.0, Versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1817 pares de bases
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(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
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(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
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(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mus musculus 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:
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1
2 
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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 572 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mus musculus 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2297 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mus musculus 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 572 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mus musculus 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1920 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mus musculus 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 572 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mus musculus 
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
13
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1690 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Humano
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 572 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Humano
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 8:
18
19

Claims (11)

1. Polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos ID SEC nº 8, recibiendo dicho polipéptido la denominación de "POP-66".
2. Ácido nucleotídico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es ID SEC nº 8.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 2, que comprende una secuencia ID SEC nº 7.
4. Vector de clonación y/o de expresión que contiene una secuencia de ácidos nucleicos según una de las reivindicaciones 2 ó 3.
5. Célula huésped transfectada por un vector según la reivindicación 4.
6. Anticuerpo monoclonal dirigido contra un polipéptido POP-66 según la reivindicación 1, así como los fragmentos Fab o F(ab')_{2} o los inmunoconjugados de dicho anticuerpo monoclonal.
7. Utilización de un polipéptido purificado POP-66 según la reivindicación 1, para detectar la presencia de anticuerpos anti-CV2 en una muestra biológica.
8. Utilización de un anticuerpo monoclonal o de sus fragmentos Fab o F(ab')_{2} o inmunoconjugados según la reivindicación 6, para la purificación o la detección de una proteína POP-66 en una muestra biológica.
9. Método in vitro para el diagnóstico de los síndromes neurológicos paraneoplásicos y/o para el diagnóstico precoz de la formación de tumores cancerígenos, caracterizado por la demostración, en una muestra de sangre extraída a un individuo, de los anticuerpos dirigidos contra una proteína POP-66 mediante
-
la puesta en contacto de una muestra de sangre de un individuo con un polipéptido purificado (POP-66) según la reivindicación 1, eventualmente fijado sobre un soporte en condiciones que permiten la formación de complejos inmunológicos específicos entre dicho polipéptido y los autoanticuerpos eventualmente presentes en la muestra de sangre, y
-
la detección de los complejos inmunológicos específicos que eventualmente se hayan formado.
10. Kit para el diagnóstico de los síndromes neurológicos paraneoplásicos y para el diagnóstico precoz de la formación de tumores a partir de una muestra biológica que comprende:
-
al menos un polipéptido purificado POP-66, según la reivindicación 1, eventualmente fijado sobre un soporte,
-
unos medios de revelación de la formación de complejos antígeno/anticuerpo específicos entre un autoanticuerpo anti-POP-66 y dicho polipéptido purificado POP-66, y/o medios de cuantificación de estos complejos.
11. Composición farmacéutica, que comprende al menos un polipéptido purificado POP-66 según la reivindicación 1, un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, una secuencia antisentido capaz de hibridarse específicamente con una secuencia nucleotídica que codifica dicho polipéptido, o un anticuerpo dirigido contra dicho polipéptido, asociado a un vehículo farmacéuticamente aceptable.
ES98912541T 1997-02-19 1998-02-19 Utilizacion de las proteinas ulip en el diagnostico y la terapia de los canceres y de los sindromes neurologicos paraneoplasicos. Expired - Lifetime ES2257804T3 (es)

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