ES2269353T3

ES2269353T3 - Nueva proteina ulip/crmp humana y su utilizacion en el diagnostico y la terapia de canceres y de sindromes neurologicos paraneoplasicos.

Info

Publication number: ES2269353T3
Application number: ES01911811T
Authority: ES
Inventors: Michele Aguera; Jean-Christophe Antoine; Marie-Francoise Belin; Jerome Honnorat; Veronique Rogemont
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2021-02-28
Also published as: US20190119339A1; US10087220B2; US20130243755A1; CA2401438C; US8377645B2; EP1263784A1; ATE334145T1; US20080226636A1; DE60121735T2; DE60121735T4; JP2003525059A; JP4990459B2; EP1263784B1; DE60121735D1; CA2401438A1; WO2001064737A1; US20030176336A1; US7329499B2

Abstract

Polipéptido purificado designado ULIP-6, que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 2, o un fragmento epitópico de dicho polipéptido que comprende la secuencia SEC ID Nº 4.

Description

Nueva proteína ULIP/CRMP humana y su utilización en el diagnóstico y la terapia de cánceres y de síndromes neurológicos paraneoplásicos.

La invención se refiere a una nueva proteína ULIP/CRMP humana y a su utilización en el diagnóstico y la terapia de cánceres y de síndromes neurológicos paraneoplásicos.

Los síndromes neurológicos paraneoplásicos (SNP) surgen con motivo de un cáncer, a menudo antes de su descubrimiento, y no están ligados a la proliferación tumoral misma (invasión directa, metástasis) ni a la terapia. Su frecuencia se estima globalmente en aproximadamente un 1% de los cánceres. Se han individualizado desde hace mucho tiempo varios cuadros clínicos (encefalomielitis, neuropatía sensitiva de Denny Brown, atrofia cerebelosa, encefalitis límbica, opsoclono,...) correspondientes de hecho a la afectación bien electiva o bien preferida de ciertos grupos de neuronas. La frecuencia de células inflamatorias en las cercanías de las lesiones había hecho plantear, desde hace muchos años, la posibilidad de un proceso autoinmune o vírico. La puesta en evidencia, más reciente, de autoanticuerpos en el suero y el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes que padecen SNP, específicos del tipo de tumor y del tipo de neuronas que degeneran, ha relanzado la hipótesis de un participación de la autoinmunidad en la génesis de esta patología (Graus et al., 1985; Greenlee et al., 1983).

Además de la presencia de un título elevado de estos anticuerpos en la sangre y el LCR de los pacientes, existen varios argumentos que sugieren que los SNP elevan los mecanismos autoinmunes. Así, los antígenos reconocidos en el sistema nervioso central están también presentes en los tumores de los pacientes (Anderson et al., 1987). Dentro del tejido tumoral, se encuentran anticuerpos dirigidos específicamente contra estos antígenos, así como linfocitos B y T (Hetzel et al., 1990).

Estos datos sugieren que el proceso autoinmune se desencadenará por la expresión de antígenos tumorales. Un proceso de inmunidad cruzada provocaría las lesiones del sistema nervioso central. Otros argumentos indican además que las lesiones cerebrales son el resultado de la respuesta autoinmune. Así, en el cerebro de los pacientes, el título de anticuerpos específicos es superior al del suero y al del LCR (Dalmau et al., 1991). Además, en el caso de encefalomielitis asociadas a anticuerpos anti-Hu, existe una reacción linfocítica fuerte, compuesta por células B y T, situada en la proximidad de neuronas en vías de destrucción (Dalmau et al., 1991; Graus et al., 1990).

Se han descrito varios tipos de anticuerpos que permiten reagrupamientos sindrómicos precisos en función de criterios inmunológicos, neurológicos y carcinológicos.

Así, se encuentran anticuerpos anti-Yo en el suero y el LCR de mujeres que presentan una atrofia cerebelosa paraneoplásica y un cáncer ginecológico (de ovario, mama o útero) (Greenlee et al., 1983; Jaeckle et al., 1985).

Estos anticuerpos reconocen dos proteínas citoplasmáticas de 34 y 62 kDa específicas de células de Purkinje del cerebelo.

Se encuentran anticuerpos anti-Ri en el suero y el LCR de pacientes (principalmente mujeres) que presentan un opsoclono-mioclono, un síndrome cerebeloso y un cáncer de mama. Estos anticuerpos reconocen dos proteínas de 50 y 80 kDa específicas de neuronas del sistema nervioso central (Luque et al., 1991).

Los anticuerpos anti-Hu son los que se encuentran más frecuentemente en el transcurso de los SNP. Se encuentran en el suero y el LCR de pacientes que presentan un síndrome de Denny-Brown o una encefalomieloneuritis y un cáncer de pulmón de células pequeñas (Graus et al., 1985; Dalmau et al., 1992). Estos autoanticuerpos reconocen varias proteínas de 37 a 45 kDa expresadas específicamente por el conjunto de neuronas del sistema nervioso.

Se ha identificado otro tipo de autoanticuerpos en los pacientes que presentan un SNP: los anticuerpos anti-CV2 (Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996). Estos últimos son atípicos en el sentido de que la diana antigénica reconocida en la edad adulta es esencialmente no neuronal, mientras que el análisis post-mortem del cerebro de cuatro pacientes permite objetivar una pérdida neuronal, una gliosis y un proceso inflamatorio característico de los SNP.

La originalidad del descubrimiento de estos autoanticuerpos reside, por un lado, en su puesta en evidencia. Estos últimos habían escapado al conjunto de las investigaciones habituales que consistían en revelar los antígenos reconocidos mediante inmunohistoquímica en el cerebro post-mortem. El antígeno reconocido es efectivamente soluble y desaparece del cerebro post-mortem en la mayoría de las condiciones de fijación. Sólo una fijación del tejido humano post-mortem mediante inmersión en paraformaldehído o in situ mediante perfusión de paraformaldehído en el animal ha permitido revelar la presencia de estos anticuerpos en el LCR o el suero de pacientes afectados por SNP (Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996).

Los autoanticuerpos anti-CV2 presentes en los sueros de pacientes afectados por síndrome neurológico paraneoplásico (SNP) se han definido mediante su capacidad de reconocer, mediante inmunohistoquímica indirecta, un antígeno citoplasmático expresado específicamente en el cerebro de rata adulta por una subpoblación de oligodendrocitos del tronco cerebral, de la médula y del cerebelo.

La originalidad de estos autoanticuerpos reside, por otro lado, en su interés de diagnóstico. Su presencia en el suero o el LCR de pacientes tiene valor diagnóstico, ya que permite precisar el origen paraneoplásico de un síndrome neurológico. El descubrimiento de estos anticuerpos, cuando precede al del cáncer, orienta la investigación de éste y permite su descubrimiento. Éste ha sido el caso para 6 pacientes de 19 que presentaban anticuerpos anti-CV2. Los trastornos clínicos eran diferentes según los pacientes, algunos presentaban un cuadro de encefalitis límbica, otros una encefalomieloneuritis y otros un síndrome de Lambert-Eaton. Sin embargo, en más de un 60% de los casos, el síndrome cerebeloso era predominante. El tumor más frecuentemente asociado era el cáncer de pulmón de células pequeñas (un 60% de los casos).

Los experimentos con cerebros de ratas recién nacidas han mostrado que estos anticuerpos anti-CV2 reaccionaban con una proteína de 66 kDa (Honnorat et al., 1996).

Este antígeno se sitúa en el cerebro adulto en una subpoblación de oligodendrocitos o en células que mantienen las capacidades de diferenciación en el cerebro adulto (bulbo olfativo, región dentada). El antígeno reconocido desempeñaría un papel en la supervivencia neuronal mediante interacciones neurona/oligodendrocito, como sugiere la pérdida de neuronas observada en el cerebro post-mortem de pacientes afectados por SNP.

Su expresión muy limitada en la edad adulta contrasta con una expresión muy fuerte y transitoria en el sistema nervioso central y periférico en desarrollo, sugiriendo el papel probable de este antígeno en el desarrollo del sistema nervioso.

En la solicitud WO 98/37192 y el artículo de Honnorat et al. de 1999, el antígeno diana de los autoanticuerpos anti-CV2, correspondiente a una proteína designada como "POP-66" por "proteína oligodendrocítica paraneoplástica de 66 kDa", se ha identificado por ser la forma humana de la proteína ULIP-4. Las proteínas ULIP (por "fosfoproteína similar a Unc-33") están implicadas en el control del desarrollo neuronal y el transporte axonal (Byk et al., 1996). Se han identificado cuatro miembros de esta familia por tres equipos diferentes (Byk et al., 1998, Wang y Strittmatter, 1996 y Hamajima et al., 1996). La investigación extensiva de otros miembros eventuales de esta familia no ha tenido resultados.

Los autores de la presente invención se han enfrentado por tanto a nuevos resultados que no eran coherentes con la identificación establecida por la solicitud WO 98/37192: mientras que todos los sueros anti-CV2 ensayados en células HeLa reconocían indiscutiblemente la proteína recombinante ULIP-4 en inmunohistoquímica, sólo un 20% de estos sueros reconocían la proteína ULIP-4 mediante transferencia Western en estos mismos extractos de células. Ahora bien, todos los sueros anti-CV2 ensayados reconocían por otra parte mediante transferencia Western la misma proteína de 66 kDa después de inmunoprecipitar en extractos de cerebros. Además, el ARNm de ULIP-4 se expresaba sólo muy débilmente en los oligodendrocitos en hibridación in situ. A partir de estos datos, los autores de la presente invención han supuesto que podía existir un nuevo miembro de la familia de las ULIP no identificado hasta ahora, expresado fuertemente por los oligodendrocitos y reconocido en transferencia Western por todos los sueros anti-CV2.

Los autores de la presente invención han puesto ahora en evidencia que, contrariamente a lo que proponía la solicitud WO 96/37192, POP-66, el antígeno mayor diana de los autoanticuerpos anti-CV-2, no era la proteína ULIP-4, sino otra proteína. Han conseguido caracterizarla. Se trata de una nueva proteína humana de la familia de las ULIP designada ULIP-6.

ULIP-6 comprende en su parte C-terminal un epítopo mayor reconocido en transferencia Western por los anticuerpos anti-CV2.

La presente invención tiene por tanto como objeto un polipéptido purificado ULIP-6 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2.

Está comprendido además en la presente invención un fragmento epitópico del polipéptido citado anteriormente, que comprende la secuencia SEC ID Nº 4. Más particularmente, la invención tiene como objeto el péptido purificado de secuencia SEC ID Nº 4.

La presente invención tiene igualmente como objeto un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido ULIP-6 tal como se define anteriormente, que comprende preferiblemente la secuencia nucleotídica SEC ID Nº 1. La secuencia SEC ID Nº 1 presenta una región 5' no codificante (nucleótidos 1 a 162), un marco de lectura abierto (nucleótidos 163 a 1.854) y una región 3' no codificante (nucleótidos 1.855 a 3.074).

La presente invención tiene además como objeto un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia nucleotídica SEC ID Nº 3, que corresponde a la región no codificante en 3' de la secuencia codificante humana SEC ID Nº 1. Esta secuencia no codificante, igual que la parte 5' no codificante (nucleótidos 1 a 162 de SEC ID Nº 1), puede servir especialmente para la preparación de sondas específicas.

El polipéptido de la presente invención puede sintetizarse por todos los métodos bien conocidos por el experto en la técnica. El polipéptido de la invención puede sintetizarse, por ejemplo, mediante las técnicas de química sintética tales como la síntesis de tipo Merrifield, que es ventajosa por razones de pureza, de especificidad antigénica, de ausencia de productos secundarios no deseados y por su facilidad de producción.

Puede producirse igualmente una proteína ULIP-6 recombinante mediante un procedimiento en el que un vector que contiene un ácido nucleico que comprende la secuencia SEC ID Nº 1 se transfiere a una célula hospedadora que se pone en cultivo en condiciones que permiten la expresión del polipéptido correspondiente.

La proteína producida puede recuperarse y purificarse a continuación.

Los procedimientos de purificación utilizados son conocidos por el experto en la técnica. El polipéptido recombinante obtenido puede purificarse a partir de lisados y extractos celulares, del sobrenadante del medio de cultivo, mediante métodos utilizados individualmente o en combinación tales como fraccionamiento, métodos cromatográficos, técnicas de inmunoafinidad con ayuda de anticuerpos mono- o policlonales específicos, etc.

La secuencia de ácido nucleico de interés que codifica el polipéptido ULIP-6 puede insertarse en un vector de expresión, en el que está ligada de manera operativa a elementos que permiten la regulación de su expresión tales como especialmente promotores, activadores y/o terminadores de transcripción.

Las señales que controlan la expresión de las secuencias nucleotídicas (promotores, activadores, secuencias de terminación...) se eligen en función del hospedador celular utilizado. A este efecto, las secuencias nucleotídicas según la invención pueden insertarse en vectores de replicación autónoma dentro del hospedador elegido, o vectores integrativos del hospedador elegido. Dichos vectores se prepararán según los métodos utilizados habitualmente por el experto en la técnica, y los clones resultantes pueden introducirse en un hospedador apropiado mediante métodos estándar tales como, por ejemplo, electroporación o precipitación con fosfato de calcio.

Los vectores de clonación y/o expresión tales como los descritos anteriormente, que contienen una secuencia nucleotídica definida según la invención, forman igualmente parte de la presente invención.

La invención tiene como objetivo además las células hospedadoras transfectadas, de manera transitoria o estable, mediante estos vectores de expresión. Estas células pueden obtenerse mediante la introducción en las células hospedadoras de una secuencia nucleotídica insertada en un vector tal como se define anteriormente, y después la puesta en cultivo de dichas células en condiciones que permiten la replicación y/o la expresión de la secuencia nucleotídica transfectada.

El hospedador celular puede elegirse entre sistemas procarióticos como las bacterias, o eucarióticos como, por ejemplo, las levaduras, células de insectos, CHO (células de ovario de hámster chino) o cualquier otro sistema disponible ventajosamente. Un hospedador celular preferido para la expresión de proteínas de la invención está constituido por la bacteria E. coli.

Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser de origen artificial o no. Puede tratarse de secuencias de ADN o de ARN obtenidas mediante cribado de bancos de secuencias mediante sondas elaboradas basándose en la secuencia SEC ID Nº 1 ó 3. Dichos bancos pueden prepararse mediante técnicas clásicas de biología molecular conocidas por el experto en la técnica.

Las secuencias nucleotídicas según la invención pueden prepararse igualmente mediante síntesis química, o también mediante métodos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de secuencias obtenidas mediante cribado de bancos.

Este ácido nucleico permite la realización de sondas nucleotídicas capaces de hibridar fuerte y específicamente con una secuencia de ácido nucleico, de un ADN genómico o de un ARN mensajero que codifican un polipéptido según la invención o un fragmento biológicamente activo de éste. Las condiciones de hibridación apropiadas corresponden a las condiciones de temperatura y fuerza iónica utilizadas habitualmente por el experto en la técnica (Sambrook et al., 1989), preferiblemente a condiciones de temperatura comprendidas entre (T_{m} menos 5ºC) y (T_{m} menos 30ºC) y, aún más preferiblemente, a condiciones de temperatura comprendidas entre (T_{m} menos 5ºC) y (T_{m} menos 10ºC) (fuerte rigor), siendo T_{m} la temperatura teórica de fusión, definida por ser la temperatura a la que un 50% de las cadenas apareadas se separan. Dichas sondas forman igualmente parte de la invención. Pueden utilizarse como herramienta de diagnóstico in vitro para la detección, mediante experimentos de hibridación, de transcriptos específicos de polipéptidos de la invención en muestras biológicas o para la puesta en evidencia de síntesis aberrantes o de anomalías genéticas resultantes de un polimorfismo, de mutaciones o de un mal
ajuste.

Las sondas de la invención comprenden como mínimo 10 nucleótidos, y comprenden como máximo la totalidad de una secuencia nucleotídica SEC ID Nº 1 ó 3, o de su cadena complementaria.

El ácido nucleico de la invención puede utilizarse igualmente para realizar cebadores oligonucleotídicos que hibridan en condiciones de fuerte rigor con la secuencia SEC ID Nº 1 ó 3.

Estos cebadores oligonucleotídicos sentido y/o antisentido pueden ser útiles para reacciones de secuenciación o de amplificación específica según la técnica denominada de PCR (reacción en cadena con polimerasa) o cualquier otra variante de la misma.

Preferiblemente, las sondas o cebadores de la invención se marcan previamente a su utilización. Para ello, están a disposición del experto en la técnica varias técnicas como, por ejemplo, el marcaje fluorescente, radiactivo, quiomioluminiscente o enzimático.

Se incluyen en la presente invención los métodos de diagnóstico in vitro en los que estas sondas oligonucleotídicas se emplean para la detección de síntesis aberrantes o de anomalías genéticas tales como la pérdida de la heterocigosis y la redisposición genética, al nivel de secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido ULIP-6 según la invención. Dicho tipo de método comprende:

-: la puesta en contacto de una sonda nucleotídica de la invención con una muestra biológica en condiciones que permiten la formación de un complejo de hibridación entre dicha sonda y dicha secuencia nucleotídica, eventualmente después de una etapa previa de amplificación de dicha secuencia nucleotídica;

-: la detección del complejo de hibridación eventualmente formado;

-: eventualmente, la secuenciación de la secuencia nucleotídica que forma el complejo de hibridación con la sonda de la invención.

Las sondas de la invención son además utilizables ventajosamente para la detección de anomalías cromosómicas. Las secuencias nucleotídicas según la invención tienen por otra parte usos en el dominio terapéutico, para la realización de secuencias antisentido capaces de hibridar específicamente con una secuencia de ácido nucleico, incluyendo un ARN mensajero, utilizables en terapia génica. La invención tiene así como objeto secuencias antisentido capaces de inhibir, al menos parcialmente, la producción de un polipéptido según la invención tal como se define
anteriormente.

Son más particularmente útiles en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central y periférico y de la visión, especialmente en el tratamiento de síndromes neurológicos paraneoplásicos, así como en el tratamiento anticanceroso, especialmente de tumores asociados a síndromes neurológicos paraneoplásicos. La explotación de las proteínas ULIP, y en particular de ULIP-6, así como de anticuerpos dirigidos contra estas proteínas, es prometedora en diversos dominios.

Así, la detección del autoanticuerpo anti-CV2 mediante inmunofluorescencia en el cerebro animal fijado se utiliza actualmente como ensayo de diagnóstico.

La producción de proteína recombinante ULIP-6 según la invención permite la fabricación de un ensayo (de tipo ELISA o transferencia Western) rápido y fiable para detectar los anticuerpos anti-CV2.

Existen ya dichos ensayos para los anticuerpos anti-Hu, anti-Yo y anti-Ri. El ensayo para detectar los anti-CV2 en el suero de pacientes podría prescribirse en caso de sospecha de síndrome neurológico paraneoplásico, e incluiría por consiguiente los anticuerpos anti-CV2 al mismo título que los otros anticuerpos identificados en los SNP tales como los anteriormente citados.

La invención tiene por tanto igualmente como objeto un método para el diagnóstico de síndromes neurológicos paraneoplásicos y/o para el diagnóstico precoz de la formación de tumores de origen canceroso, caracterizado porque se ponen en evidencia en una muestra biológica (tal como sangre, suero, LCR, etc.) extraída de un individuo autoanticuerpos dirigidos contra una proteína ULIP-6 mediante:

-: la puesta en contacto de una muestra biológica extraída de un individuo con un polipéptido purificado ULIP-6 eventualmente fijado sobre un soporte en condiciones que permiten la formación de complejos inmunológicos específicos entre dicho polipéptido y los autoanticuerpos eventualmente presentes en la muestra biológica, y

-: la detección de complejos inmunológicos específicos eventualmente formados.

La invención tiene por tanto como objeto una composición útil para el diagnóstico de síndromes neurológicos paraneoplásicos y/o para el diagnóstico precoz de la formación de tumores, caracterizada porque comprende un polipéptido ULIP-6 o un fragmento epitópico de dicho polipéptido.

Ventajosamente, se puede utilizar en lugar del polipéptido completo la parte C-terminal que comprende el epítopo dominante (por ejemplo, el fragmento que va desde el aminoácido nº 475 al aminoácido 564). Se puede utilizar particularmente un fragmento epitópico del polipéptido ULIP-6 que comprende la secuencia SEC ID Nº 4. El péptido de secuencia SEC ID Nº 4 ha permitido así la producción de anticuerpos muy específicos de ULIP-6.

La invención tiene igualmente como objeto un kit para el diagnóstico de síndromes neurológicos paraneoplásicos y para el diagnóstico precoz de la formación de tumores a partir de una extracción biológica que comprende:

-: al menos un polipéptido purificado ULIP-6, eventualmente fijado sobre un soporte,

-: medios de revelado de la formación de complejos antígeno/anticuerpo específicos entre un autoanticuerpo anti-ULIP-6 y dicho polipéptido purificado ULIP-6, derivado o fragmento polipeptídico y/o medios de cuantificación de estos complejos.

La invención tiene igualmente como objeto los anticuerpos mono- o policlonales o sus fragmentos, anticuerpos quiméricos o inmunoconjugados, obtenidos a partir de un péptido o polipéptido purificado ULIP que comprende una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 ó 4 y su utilización para la purificación o la detección de una proteína ULIP en una muestra biológica.

Pueden obtenerse anticuerpos policlonales a partir del suero de un animal inmunizado contra la proteína producida, por ejemplo, mediante recombinación genética según el método descrito anteriormente, según los modos de operación habituales.

Pueden obtenerse los anticuerpos monoclonales según el método clásico de cultivo de hibridomas descrito por Köhler y Milstein.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fragmentos Fab y F(ab')2. Pueden presentarse igualmente en forma de inmunoconjugados o de anticuerpos marcados.

La invención se refiere igualmente a la utilización de anticuerpos dirigidos contra la proteína ULIP-6 para la puesta en evidencia de una proteína ULIP-6 en neoplasmas y síndromes neurológicos paraneoplásicos con fines de diagnóstico.

Preferiblemente, la invención se refiere a la utilización de anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de suero policlonal anti-CV2 de pacientes mediante inmortalización de linfocitos según las técnicas habituales conocidas por el experto en la técnica.

Así, los anticuerpos dirigidos contra una proteína de la familia de ULIP son útiles para detectar una expresión anormal de proteína ULIP en pacientes que presentan síndromes neurológicos en los que no se ha diagnosticado ningún cáncer mediante los métodos clásicos. Esta expresión anormal de proteína ULIP-6 podrá correlacionarse con la existencia de un cáncer en el que no se había reparado. Así, los anticuerpos dirigidos contra la proteína ULIP-6 son útiles para el diagnóstico precoz de un cáncer.

Los anticuerpos humanos o no, obtenidos en pacientes o después de inmunizar con el conjunto o una parte de la proteína ULIP-6 tales como los definidos anteriormente, pueden marcarse igualmente de manera detectable, por ejemplo, mediante asociación con un elemento radiactivo, e inyectarse en un individuo. Mediante procedimientos de formación de imágenes bien conocidos por el experto en la técnica, pueden permitir detectar o diagnosticar un tumor canceroso después de reacción antigénica de estos anticuerpos con las células del tumor.

La invención tiene por tanto igualmente como objeto un método de detección o de diagnóstico de un tumor canceroso que comprende la administración a un paciente de un anticuerpo tal como se define anteriormente marcado de manera detectable y la visualización mediante formación de imágenes del sitio de fijación de este anticuerpo.

La invención tiene igualmente como objeto una composición farmacéutica que comprende al menos un agente terapéutico elegido entre una proteína purificada ULIP-6 o un ácido nucleico que codifica dicha proteína, una secuencia antisentido capaz de hibridar específicamente con una secuencia nucleotídica de SEC ID Nº 1 ó 3, o un anticuerpo dirigido contra dicha proteína, asociada a un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención comprende preferiblemente composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo un polipéptido ULIP-6 purificado, preferiblemente en forma soluble, asociado a un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Dichas composiciones ofrecen un nuevo enfoque para tratar los trastornos del sistema nervioso central y periférico y de la visión, y especialmente los síndromes neurológicos paraneoplásicos. Por otra parte, son útiles para tratar los trastornos neurológicos ligados a una pérdida neuronal y/o a una subexpresión de la proteína ULIP-6 en el sistema nervioso.

Así, la ULIP-6 revela también un interés en patologías neurodegenerativas tales como atrofias multisistemáticas, que son afecciones similares a las de SNP y para las que se ha detectado una anomalía de una subpoblación oligodendrocítica (Papp et al., 1992).

Las composiciones según la invención son útiles por otra parte en terapia anticancerosa.

Los anticuerpos dirigidos contra la proteína ULIP-6 pueden estar asociados a agentes antineoplásicos, permitiendo así el cribado de medicamentos frente a células tumorales.

Además, pueden estar asociados a un grupo químico hidrófilo elegido de manera que pase o no la barrera hematoencefálica, según el tipo de tumor.

La proteína ULIP-6, así como las secuencias nucleotídicas descritas anteriormente, y las secuencias u oligonucleótidos antisentido, pueden ser útiles en la terapia de cualquier tipo de cáncer en el que esté implicado un gen que codifica la proteína ULIP-6. Entre los ejemplos de cánceres, se pueden citar los tumores periféricos tales como cáncer de pulmón de células pequeñas, timoma, cáncer de mama y de ovario, así como tumores cerebrales, preferiblemente tumores cerebrales primitivos de origen glial. La expresión de ULIP-6 en las células no proliferativas del cerebro normal, su ausencia en tejidos normales tales como pulmón o timo, por ejemplo, su reexpresión diferencial en la tumorigénesis de estos tejidos y la modulación de su expresión en una línea tumoral en el transcurso de la diferenciación, sugieren a este respecto que ULIP-6 podría ser un gen supresor de tumor.

Se puede utilizar igualmente un compuesto o una mezcla de compuestos de origen sintético o natural que inhibe la acción de ULIP-6.

Como alternativa, puede investigarse una estimulación de ULIP-6. Puede utilizarse entonces un compuesto o una mezcla de compuestos de origen sintético o natural que activa la expresión o la acción de la proteína ULIP-6.

Estos compuestos activadores o inhibidores pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas según la invención pueden administrarse por vía sistémica, preferiblemente por vía intravenosa, por vía intramuscular, intradérmica o por vía oral.

Sus modos de administración, posologías y formas galénicas óptimas pueden determinarse según los criterios tenidos generalmente en cuenta en el establecimiento de un tratamiento terapéutico adaptado a un paciente como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios verificados, etc.

La invención comprende igualmente la utilización de una proteína purificada ULIP-6, un ácido nucleico que codifica dicha proteína o pertenece a las regiones no codificantes del gen ULIP-6, una secuencia antisentido capaz de hibridar específicamente con una secuencia nucleotídica SEC ID Nº 1 ó 3, o un anticuerpo dirigido contra dicha proteína, asociada a un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento destinado a tratar las enfermedades neurodegenerativas y los neoplasmas.

La invención tiene por último como objeto un método de tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y de neoplasmas que comprende la administración a un sujeto necesitado de dicho tratamiento de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica tal como la definida anteriormente.

Los ejemplos y las figuras cuyas leyendas se presentan a continuación se dan a título ilustrativo.

Leyenda de las figuras

- La figura 1 representa una transferencia Western realizada a partir de extractos proteicos de E. coli que expresan la proteína de fusión GST-ULIP-6 C-term. Estos extractos se han separado por SDS-PAGE al 12,5%, se han transferido a membrana de PVDF e incubado con sueros humanos. Carriles 1 a 14: sueros anti-CV2; carriles 15 a 17: sueros control.

- La figura 2 representa una transferencia Western realizada a partir de proteínas de fusión GST-ULIP-6 C-term después de purificar sobre perlas de agarosa-glutation. La proteína se reconoce por dos sueros anti-CV2 (carril 1: suero 94-822, carril 2: suero 95-590), pero no por un suero control (línea 3).

Ejemplo 1

Identificación de la diana de los anticuerpos anti-CV2

Después de expresar las proteínas recombinantes de la familia ULIP en células HeLa, los autores de la invención han podido mostrar que los sueros anti-CV2 entonces en su posesión reconocían todos ULIP-4 en inmunohistoquímica. Este resultado sugería que ULIP-4 podía ser el antígeno mayor reconocido por los sueros anti-CV2 (Honnorat et al., 1999). En contraposición, cuando se ha ensayado una cohorte más importante de sueros en transferencia Western con la proteína ULIP-4 expresada en E. coli, se han apercibido de que aunque varios sueros anti-CV2 reconocían indiscutiblemente la proteína recombinante ULIP-4, algunos no la reconocían, mientras que todos los sueros anti-CV2 reconocían mediante transferencia Western una misma proteína de 66 kDa después de inmunoprecipitar extractos proteicos de cerebros (Honnorat et al., 1996). Además, mediante hibridación in situ, los oligodendrocitos no expresaban el ARN mensajero de ULIP-4. Los autores de la invención han planteado entonces la hipótesis de la existencia de otra proteína homóloga de las proteínas ULIP, aún no descrita y expresada por los oligodendrocitos.

Para investigar esta proteína, se ha utilizado un suero anti-CV2 que no reconoce ULIP-4 recombinante mediante transferencia Western para cribar un banco de expresión. Se ha elegido un banco de ADNc de médula espinal humana, lugar de expresión máxima del antígeno CV-2 en el adulto, clonado en un fago lambda gt11 (Clontech, Palo Alto, EE.UU.). Se han cribado los fagos a una densidad de 2 x 10^{4} ufp mediante placas de 150 mm de diámetro. Después de incubar durante 3,5 horas a 42ºC, se han recubierto las placas con una membrana de nitrocelulosa incubada en IPTG (10 mM) y se han reincubado durante 3 horas a 37ºC. A continuación, se han saturado las membranas con PBS-Tween-leche desnatada y después se han incubado durante una noche con suero diluido 1/100. A continuación, se han lavado las membranas con PBS-Tween, después se han incubado con un antisuero antiinmunoglobulina humana marcado con peroxidasa. Después de lavar, se han revelado las membranas mediante el método de diaminobenzidina. Los clones que daban una señal positiva se han purificado mediante transplantes sucesivos hasta obtener un 100% de clones positivos. Se han identificado cuatro ADNc de 1.400 a 1.700 pares de bases que codifican la parte C-terminal de una misma proteína. El clon que presentaba la secuencia codificante más grande (clon 97) contenía 1.490 pares de bases (nucleótidos 1.585 a 3.074 de la secuencia ID Nº 1) con un marco abierto de lectura de 270 nucleótidos codificantes de un polipéptido de 90 aminoácidos (aminoácidos 475 a 564 de la secuencia ID Nº 2). Después de investigar la homología en los bancos de datos, se ha verificado que este polipéptido (designado a continuación en el estudio como ULIP-6 C-term) presentaba una homología de un 35% con la parte C-terminal de cada uno de los miembros ya conocidos de la familia ULIP y que no existía ninguna homología con otras familias de proteínas.

Ejemplo 2

Producción de la proteína recombinante GST-ULIP-6 C-term

Para confirmar que este polipéptido era realmente el antígeno reconocido por los sueros anti-CV2, se ha clonado la fase codificante del clon 97 en un vector de expresión bacteriana, pGex 2T (Pharmacia Amersham Biotech, Suecia). Este vector permite la expresión en E. coli de la proteína de interés fusionada con la glutation-S-transferasa (GST, 26 kDa). Mediante transferencia Western, 16 de los 18 sueros anti-CV2 ensayados reconocieron la proteína de fusión GST-ULIP-6-C term en un extracto proteico bacteriano, es decir un 89% de positivos (Figura 1). Ha de observarse que el polipéptido ULIP-6 C-term tiene un peso molecular de 10 kDa, lo que representa aproximadamente un 15% de una proteína de 66 kDa. Ninguno de estos sueros reconoce la GST sola. Se han ensayado igualmente 100 sueros control. Ninguno presentaba reactividad frente a la proteína de fusión GST-ULIP-6 C-term. Con el fin de disponer de un ensayo lo más específico posible, los autores de la invención han ensayado igualmente los sueros anti-CV2 con la proteína de fusión GST-ULIP-6 C-term purificada sobre perlas de agarosa-glutation. La Figura 2 muestra un ejemplo de los resultados obtenidos en transferencia Western.

Ejemplo 3

Transferencia Northern con ARN de médula espinal humana

Para determinar el tamaño del transcripto del gen ULIP-6, se ha realizado un análisis por transferencia Northern con ARN poliA+ purificados extraídos de médula espinal humana (Clontech, Palo Alto, EE.UU.). La sonda correspondía a la totalidad del clon 97 marcado con dCTP alfa-^{32}P. Se han separado los ARN en gel de electroforesis de agarosa-formaldehído al 1,2% y se han transferido a membrana de nailon. Después de prehibridar con la solución de hibridación rápida (Clontech, Palo Alto, EE.UU.), se ha incubado la membrana durante una hora con la sonda. Después de lavar, se ha expuesto la membrana sobre una película durante una noche a -80ºC. Se ha revelado una sola banda correspondiente a un transcripto de 5 kb.

Ejemplo 4

Hibridación in situ en médula espinal

Para verificar la presencia del ARN mensajero de ULIP-6 en los oligodendrocitos, se ha realizado un análisis mediante hibridación in situ en corte frontal de médula. La sonda utilizada era una sonda de ARN fría obtenida mediante transcripción del clon 97 subclonado en pBluescript SK (Stratagène) y marcado con digoxigenina. Se ha utilizado una sonda sentido como control negativo. Se ha podido observar un marcaje específico de los oligodendrocitos.

Ejemplo 5

Producción de un anticuerpo de conejo anti-ULIP-6

Se han producido anticuerpos policlonales mediante inmunización de conejos contra un péptido específico de la proteína ULIP-6 (péptido Pep ULIP-6= "KEMGTPLADTPTRPVTRHGG" de secuencia SEC ID Nº 4, correspondiente al fragmento de aminoácidos 505 a 524 en la SEC ID Nº 2). Se ha sintetizado el péptido en un aparato de síntesis peptídica (432A Peptide Synthesizer SYNERGY, Applied Biosystems) de la compañía COVALAB (Lyon, Francia). Se ha controlado la pureza de las muestras mediante HPLC y espectrometría de masas. Se ha inyectado en conejos 1 mg de péptido acoplado con hemocianina y coadyuvante completo de Freund (COVALAB, Lyon, Francia). Cada 3 semanas, se ha realizado una nueva inyección de 0,5 mg. Se han analizado la producción de anticuerpos y su especificidad mediante transferencia Western e inmunohistoquímica utilizando como control los sueros
preinmunes.

Los anticuerpos obtenidos reconocían la proteína GST-ULIP-6 C-term mediante transferencia Western, una proteína de 66 kDa de extractos de cerebro, y marcaban específicamente oligodendrocitos mediante inmunohistoquímica en cortes de médula de ratas.

Ejemplo 6

Investigación de la secuencia completa de ULIP-6

Para obtener un ADNc completo de ULIP-6, se ha cribado el banco de ADNc de médula espinal humana, clonado en el fago lambda gt11 (Clontech, Palo Alto, EE.UU.), con una sonda radiactiva. Esta sonda obtenida mediante PCR estaba marcada con dCTP alfa ^{32}P y correspondía a los nucleótidos 1.585 a 1.854 de la secuencia ID Nº 1. Se han cribado los fagos a una densidad de 2 x 10^{4} ufp mediante placas de 150 mm de diámetro. Después de incubar durante 6 horas a 37ºC, se ha obtenido una réplica sobre una membrana de nailon. Se ha tratado esta membrana para desnaturalización de los fagos; después, se ha fijado el ADN durante una noche a 42ºC. Después de prehibridar con la solución de hibridación rápida (Clontech, Palo Alto, EE.UU.), se ha incubado la membrana durante una hora con la sonda radiactiva. Después de lavar, se ha expuesto la membrana sobre una película durante una noche a -80ºC. Se han purificado los clones que daban señal positiva mediante transplantes sucesivos hasta obtener un 100% de clones positivos. El ADNc más grande obtenido comprendía 3.074 nucleótidos (SEC ID Nº 1) y comprendía un marco abierto de lectura de 1.692 nucleótidos (nucleótidos nº 163 a 1.854 de la SEC ID Nº 1). Codificaba una proteína de 564 aminoácidos (SEC ID Nº 2) cuya parte C-terminal era estrictamente idéntica al polipéptido ULIP-6 C-term (aminoácidos 475 a 564 de la SEC ID Nº 2). Después de alinear la proteína obtenida con las cuatro proteínas ULIP/CRMP humanas conocidas, se ha observado una homología de un 50%.

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<110> INSERM

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<120> Nueva proteína ULIP/CRMP humana y su utilización en el diagnóstico y la terapia de cánceres y de síndromes neurológicos paraneoplásicos

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<130> BET 01/0161

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<140>

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<141>

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<160> 4

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<170> PatentIn ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 3074

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (163)...(1.854)

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<400> 1

1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 564

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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5

6

7

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<210> 3

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<211> 1.218

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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8

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<210> 4

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\sa{Lys Glu Met Gly Thr Pro Leu Ala Asp Thr Pro Thr Arg Pro Val Thr}

\sac{Arg His Gly Gly Cys}

Claims

1. Polipéptido purificado designado ULIP-6, que comprende la secuencia aminoacídica SEC ID Nº 2, o un fragmento epitópico de dicho polipéptido que comprende la secuencia SEC ID Nº 4.

2. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido o un fragmento epitópico de dicho polipéptido tal como se define en la reivindicación 1.

3. Ácido nucleico según la reivindicación 2, que comprende una secuencia nucleotídica SEC ID Nº 1.

4. Ácido nucleico aislado constituido por una secuencia nucleotídica SEC ID Nº 3 o la secuencia que va desde el nucleótido 1 al nucleótido 162 de la SEC ID Nº 1.

5. Vector de clonación y/o de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Célula hospedadora transfectada mediante un vector según la reivindicación 5.

7. Anticuerpos mono- o policlonales dirigidos específicamente contra un polipéptido según la reivindicación 1, así como los fragmentos, anticuerpos quiméricos o inmunoconjugados de dichos anticuerpos mono- o policlonales, estando específicamente dirigidos dichos fragmentos, anticuerpos quiméricos o inmunoconjugados contra un polipéptido según la reivindicación 1.

8. Composición útil para el diagnóstico de síndromes neurológicos paraneoplásicos y/o para el diagnóstico precoz de la formación de tumores, caracterizada porque comprende un polipéptido o un fragmento epitópico de dicho polipéptido tal como se define en la reivindicación 1.

9. Utilización de un polipéptido según la reivindicación 1 para detectar la presencia de anticuerpos anti-CV2 en una muestra biológica.

10. Utilización de anticuerpos mono- o policlonales o sus fragmentos, anticuerpos quiméricos o inmunoconjugados según la reivindicación 7 para la purificación o la detección de una proteína ULIP-6 según la reivindicación 1 en una muestra biológica.

11. Método para el diagnóstico de síndromes neurológicos paraneoplásicos y/o para el diagnóstico precoz de la formación de tumores cancerosos, en el que se ponen en evidencia en una muestra biológica extraída de un individuo los autoanticuerpos dirigidos contra una proteína ULIP-6 mediante:

-: la puesta en contacto de una muestra biológica extraída de un individuo con un polipéptido según la reivindicación 1, eventualmente fijado sobre un soporte, en condiciones que permiten la formación de complejos inmunológicos específicos entre dicho polipéptido y los autoanticuerpos eventualmente presentes en la muestra biológica, y;

-: la detección de los complejos inmunológicos específicos eventualmente formados.

12. Kit para el diagnóstico de síndromes neurológicos paraneoplásicos y para el diagnóstico precoz de la formación de tumores a partir de una extracción biológica, que comprende:

-: al menos un polipéptido ULIP-6 según la reivindicación 1, eventualmente fijado sobre un soporte,

-: medios de revelado de la formación de complejos antígeno/anticuerpo específicos entre un autoanticuerpo anti-ULIP-6 y dicho polipéptido ULIP-6 y/o medios de cuantificación de estos complejos.

13. Composición farmacéutica que comprende al menos un agente terapéutico elegido entre un polipéptido según la reivindicación 1, un ácido nucleico según la reivindicación 2 a 4, o un ácido nucleico que comprende una secuencia antisentido capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico según la reivindicación 2 a 4, o un anticuerpo según la reivindicación 7 dirigido específicamente contra el polipéptido, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Utilización de un agente terapéutico tal como se define en la reivindicación 13 para la fabricación de un medicamento destinado a tratar enfermedades neurodegenerativas y neoplasmas.