JP2003525059A - 新規ヒトulip/crmpタンパク質と癌及び傍新形成性神経症候群の診断及び治療におけるその使用 - Google Patents
新規ヒトulip/crmpタンパク質と癌及び傍新形成性神経症候群の診断及び治療におけるその使用Info
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Abstract
Description
診断治療への使用に関する。
に先立って発症し、また腫瘍の増殖自体(初発、転移)にも治療にも関連しない。
その発症頻度はがん全体の約1%である。いくつかの臨床像 (脳脊髄炎、Denny-Br
own感覚性ニューロパシー、小脳萎縮、縁辺脳炎、眼球クローヌスなど) が長期
にわたり個別化されてきたが、それらは実際には特定神経細胞群の選択的又は差
別的発作に対応している。病変近傍における炎症細胞の出現頻度から長年、自己
免疫過程又はウィルス疾患過程の可能性が考えられた。もっと最近になって、腫
瘍のタイプ及び変性神経細胞のタイプに特異的である自己抗体がPNS患者の血清
中及び脳脊髄液(CSF)中に存在することが証明されたため、この病理状態を引き
起こす要因は自己免疫であるとの仮説が息を吹き返した(Graus et al., 1985; G
reenlee et al., 1983)。
に由来するという議論がある (Anderson et al., 1987)。中枢神経系に認められ
る抗原が患者腫瘍中にも存在するのはそのためだとする。腫瘍組織内にはこれら
の抗原に対して、またB及びT細胞に対しても特異的な抗体が見られる(Hetzel et
al., 1990)。
性のあることを示唆する。中枢神経系の病変は交差免疫過程に起因する可能性が
ある。他の議論もまた、脳の病変が自己免疫反応に起因することを示唆している
。そのため、患者の脳では血清やCSFに比べて特異的抗体価が高いとする(Dalmau
et al., 1991)。さらに、抗Hu抗体に関連する脳脊髄炎の場合には、破壊途上に
ある神経細胞近傍にB及びT細胞からなる激しいリンパ球反応が存在する(Dalmau
et al., 1991; Graus et al., 1990)。
ループ分けを可能にする数タイプの自己抗体が記述されてきた。
患う女性の血清及びCSF中に見られる(Greenlee et al., 1983; Jaeckle et al.,
1985)。
胞質タンパク質を認識する。
血清及びCSF中に見られる。これらの抗体は中枢神経系の神経細胞に特異的な50k
Daと80kDaの2種類のタンパク質を認識する(Luque et al., 1991)。
Denny-Brown症候群又は脳脊髄炎及び小細胞肺がんの患者の血清中及びCSF中であ
る(Graus et al., 1985; Dalmau et al., 1992)。これらの抗体は神経系のすべ
ての神経細胞で特異的に発現する37〜45 kDaの数種のタンパク質を認識する。
れている(Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996)。これらの抗体は非
定型抗体である。というのは、4患者の脳の死後検査により神経細胞の欠損、グ
リオーシス及びPNSsに特徴的な炎症過程の観察が可能になるとはいえ、成人にお
いて認識される抗原の標的は本質的に非神経細胞だからである。
プの自己抗体はそれまで、死後脳を対象とする通常の検査、すなわち認識された
抗原を免疫組織化学法で明らかにする検査をすべてすり抜けていた。認識された
抗原は実際には可溶性であり、大多数の固定条件下では死後脳から消滅してしま
う。パラホルムアルデヒドへの浸漬によるヒト死後脳組織の固定又は動物へのパ
ラホルムアルデヒドの潅流によるin situ固定により初めて、PNS患者のCSF又は
血清中の抗CV2抗体の存在を明らかにすることが可能になった(Antoine et al.,
1993; Honnorat et al., 1996)。
組織化学法により、成熟ラット脳内で脳幹、髄質及び小脳の希突起膠細胞の部分
母集団が特異的に発現する細胞質抗原を認識するその能力によって特徴付けられ
るに至った。
血清又はCSF中のその存在は、神経症候群の傍腫瘍性の特定を可能にするため、
診断面で有用である。抗CV2抗体の発見は、それががんの発見に先行する場合に
は、がん検査に道を開き、がんの早期発見を可能にする。抗CV2抗体をもつ19患
者中6患者はそのような例であった。臨床像は患者次第で異なり、縁辺脳炎を示
す患者もいれば、脳脊髄炎を示す患者もいれば、またLambert-Eaton症候群を示
す患者もいた。それにもかかわらず、症例の60%余りでは小脳症候群が支配的で
あった。最も一般的な随伴腫瘍は小細胞肺がんであった(症例の60%)。
することが判明した(Honnorat et al., 1996)。
って分化能を保持している細胞(嗅球、歯状回)中に、局在する。認識された該抗
原は、PNS患者の死後脳で観察される神経細胞の欠損が示唆するように、神経細
胞/希突起膠細胞の相互作用を通じて神経細胞の生存に寄与すると考えられる。
非常に強い一時的な発現とは対照的であり、それは神経系の発達で果たすと推定
されるこの抗原の役割を示唆する。
抗原、すなわち傍腫瘍性希突起膠細胞タンパク質66kDa (paraneoplastic oligod
endrocyte protein 66 kDa)を略してPOP-66と命名されたタンパク質に対応する
抗原がヒト型ULIP-4タンパク質として同定された。ULIP [Unc-33様リンタンパク
質(Unc-33 like phosphoprotein)の略]は神経の発達と軸索輸送の調節に関与す
るタンパク質である(Byk et al., 1996)。ULIPファミリーのタンパク質はすでに
4種類が3チーム(Byk et al., 1998; Wang and Strittmatter, 1996; Hamajima e
t al., 1996)により同定されていた。このファミリーに属する可能性のあるタン
パク質をさらに探し求める徹底的な研究が行われたが徒労であった。
果に直面した。すなわち、Hela細胞を対象に試験したすべての抗CV2血清は免疫
組織化学法では確かに組換えULIP 4タンパク質を認識したものの、同じ細胞抽出
物を対象にしたウェスタンブロット法ではULIP 4タンパク質を認識したのはこれ
らの血清のうち20%にすぎなかった。そのうえ、脳抽出物を対象にしたウェスタ
ンブロット法でも、免疫沈降後には試験したすべての抗CV2血清が同じ66kDaタン
パク質を認識した。さらに、in situハイブリダイゼーションでは希突起膠細胞
内でのULIP4 mRNAの発現は非常に弱いものにすぎなかった。これらのデータから
、本発明者は希突起膠細胞中で強く発現し、かつウェスタンブロット法ですべて
の抗CV2血清によって認識される未同定の新規ULIPファミリーメンバーが存在す
るものと想定した。
標的抗原であるPOP-66がULIP 4タンパク質ではなく別のタンパク質であることを
立証済みである。本発明者はこのタンパク質の特性解明にもすでに成功している
。それはULIPファミリーの新規ヒトタンパク質であり、ULIP 6と命名した。
される大きなエピトープを含む。
ペプチドである。
言えば、本発明の主題は配列SEQ ID No.4の精製ペプチドである。
クレオチド配列SEQ ID No.1を含む単離核酸である。配列SEQ ID No.1は5’非コ
ード領域(ヌクレオチド1〜162)、オープンリーディングフレーム(ヌクレオチド1
63〜1854)、及び3’非コード領域(ヌクレオチド1855〜3074)を有する。
るヌクレオチド配列SEQ ID No.3を含む単離核酸である。この非コード配列は5’
非コード部分(SEQ ID No.1のヌクレオチド1〜162)と共に特に特異的プローブの
調製に使用されよう。
発明のポリペプチドはたとえば、純度、抗原特異性、無用の副産物の排除、生産
し易さの点で有利であるMerrifieldタイプの合成などのような化学合成法で合成
してもよい。
るポリペプチドの発現を許容するような条件下で該宿主細胞を培養するという方
法で組換えULIP 6タンパク質を産生させてもよい。
物からの、また培地上清からの精製には、分画法、クロマトグラフィー法、特異
的単クローン又は多クローン抗体などの使用によるイムノアフィニティー法を用
いることができる。
、たとえば特に転写プロモーター、アクチベーター及び/又はターミネーターと
機能的に連結して発現ベクター中に挿入してもよい。
ター、ターミネーター)は、使用宿主細胞に応じて選択する。本発明のヌクレオ
チド配列はこれを目的に、選択された宿主中で自己複製するベクターに、又は選
択された宿主と一体化するベクターに、挿入してもよい。その種のベクターは技
術上周知慣用の方法で作製されようが、そこから得られるクローンは標準方法、
たとえばエレクトロポレーション法又はリン酸カルシウム法を用いて好適な宿主
に導入することができる。
ーもまた本発明に包含される。
胞に関する。これらの細胞は、前述のベクターに挿入されたヌクレオチド配列を
宿主細胞に導入し、次いで導入されたヌクレオチド配列の複製及び/又は発現を
許容するような条件下で該細胞を培養することによって得ることができる。
チャニーズハムスター卵巣)細胞などのような真核生物系、又は他の有利に利用
可能な生物系から選択してよい。本発明のタンパク質の発現にとって好ましい宿
主細胞は細菌E. coliからなる。
ID No.1又はNo.3を土台にして作製されたプローブを用いて配列ライブラリーを
スクリーニングすることによって得られるDNA又はRNAでもよい。そうしたライブ
ラリーは技術上周知の通常の分子生物学的手法で作製されよう。
のスクリーニングによって得られる配列の化学的又は酵素的修飾を含む混合的方
法で作製してもよい。
酸配列、ゲノムDNA配列又はメッセンジャーRNA配列と強力かつ特異的にハイブリ
ダイズすることができるヌクレオチドプローブの作製を可能にする。好適なハイ
ブリダイゼーション条件は、技術上慣用の温度及びイオン強度条件(Sambrook et
al., 1989)に対応し、好ましくは[Tm−5℃]と[Tm−30℃]の間の温度条件に、よ
り好ましくは[Tm−5℃]と[Tm−10℃]の間の温度(高ストリンジェンシー)条件に
対応する。ただし、Tmは理論融解温度であり、50%の相補対が離れる温度と定義
される。本発明にはそうしたプローブもまた包含される。それらは、本発明のポ
リペプチドに対応する生体試料中の転写産物をハイブリダイゼーション実験によ
って検出するための、又は多型、突然変異又は不正確なスプライシングに由来す
る異常合成又は遺伝子異常を明らかにするための、in vitro診断手段として使用
されよう。
オチド配列SEQ ID No.1かNo.3又はその相補鎖の全部を含む。
とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの作製に使用してもよい。
列決定反応に、又はPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法かその変法による特異的増幅
反応に有用であろう。
技術上周知の手法がいくつかある。たとえば蛍光、放射性、化学発光又は酵素標
識法などである。
合性の消失や遺伝子再編成などのような異常合成又は遺伝子異常を検出するため
にこれらのプローブが使用されるin vitro診断法もまた包含される。その種の方
法は次のステップを含む: − 本発明のヌクレオチドプローブを、該プローブと前述のヌクレオチド配列と
の間で、随意に該ヌクレオチド配列の増幅という先行ステップの後に、ハイブリ
ダイゼーション複合体の形成を可能にするような条件下で、生体試料と接触させ
る − 形成される可能性のあるハイブリダイゼーション複合体を検出する、及び − 随意に、本発明のプローブとハイブリダイゼーション複合体を形成するヌク
レオチド配列の配列を決定する。
核酸配列と特異的にハイブリダイズするアンチセンス配列を作製するうえでも有
用であり、得られるアンチセンス配列は遺伝子治療に使用することができる。よ
って、本発明の主題は前述のような本発明のポリペプチドの産生を、少なくとも
部分的に、阻害することができるアンチセンス配列である。
特に傍腫瘍性神経症候群の治療に、また抗がん治療、特に傍腫瘍性神経症候群に
随伴する腫瘍の治療に、とりわけ有用である。
用は様々な分野で有望である。
目下、診断検査として利用されている。
迅速確実な(Elisa法又はウェスタンブロット法タイプの)検査法の実現を可能に
する。
腫瘍性神経症候群が疑われる場合には患者血清中の抗CV2抗体を検出するための
検査法を指示することができるであろうし、したがって抗CV2抗体だけでなく前
述のようなPNSsで同定される他抗体も検査対象に含まれよう。
形成の早期診断のための方法に関するが、該方法では個人から採取した生体試料
(血液、血清、CSFなど)中のULIP 6タンパク質に対する抗体の存在が、次のステ
ップにより明らかにされる: − 個人から採取した生体試料を、随意に支持体へと付着させた精製ULIP 6ポリ
ペプチドへと、該ポリペプチドと該生体試料中に存在する可能性のある自己抗体
の間での特異的免疫複合体の形成を可能にするような条件下で、接触させる、及
び − 形成される可能性のある該特異的免疫複合体を検出する。
早期診断に有用な、ULIP 6ポリペプチド又は該ポリペプチドのエピトープ断片を
含む組成物である。
ミノ酸No.475からアミノ酸No.564にわたる断片)を使用するのが有利であろう。
特に、配列SEQ ID No.4を含むULIP 6ポリペプチドのエピトープ断片が使用され
よう。たとえば、配列SEQ ID No.4の該ペプチドはULIP 6に対してきわめて特異
的な抗体の産生を可能にしてきた。
の、また腫瘍形成を早期診断するための、次の構成要素を含むキットである: − 随意に支持体に付着させた1以上の精製ULIP 6ポリペプチド、及び − 抗ULIP 6自己抗体と該精製ULIP 6ポリペプチド(又はポリペプチド誘導体又
は断片)の間の特異的抗原/抗体複合体の形成を明らかにする手段、及び/又は
該複合体を定量する手段。
ペプチド又はペプチドを使用して得られる単クローン又は多クローン抗体又は断
片、キメラ抗体又はそのイムノコンジュゲート、及び生体試料中のULIPタンパク
質の精製又は検出を目的としたそれらの使用である。
よる遺伝子組換えにより通常の手順に従って生成し、該タンパク質に対して免疫
にした動物の血清から得られよう。
来ハイブリドーマ培養法に従って得られよう。
う。それらもまたイムノコンジュゲート又は標識抗体の形をとってよい。
パク質の存在を明らかにするための、ULIP 6タンパク質に対する抗体の使用に関
する。
クローン抗CV2血清から得られる単クローン抗体の使用に関する。
まだがんが発見されていない神経症候群患者におけるULIPタンパク質の異常発現
を検出するうえで有用である。このULIP 6タンパク質の異常発現は未発見のがん
の存在と関連する可能性がある。したがって、ULIP 6タンパク質に対する抗体は
がんの早期診断に有用である。
した後に得られるヒト又は非ヒト抗体は、たとえば放射性元素を結合させること
により検出可能に標識してから、個人に注射してもよい。技術上周知の画像化法
を使用すれば、これらの抗体の腫瘍細胞との抗原反応後にがん性腫瘍の検出又は
診断を行うことが可能になろう。
であって、検出可能に標識した前述のような抗体の患者への投与及び該抗体の付
着部位の画像化法による視覚化を含む方法である。
酸、ヌクレオチド配列SEQ ID No.1又はNo.3と特異的にハイブリダイズすること
ができるアンチセンス配列、又は該タンパク質に対する抗体から選択される治療
剤及び該治療剤と混合した製薬上許容しうる担体とを含有する製剤組成物である
。本発明は好ましくは、有効成分として好ましくは可溶性の形にした精製ULIP 6
ポリペプチド、及びそれと混合した製薬上許容しうる担体とを含有する製剤組成
物を含む。
群を治療するための新しい方針を提供する。さらに、そうした組成物は神経系に
おける神経細胞欠損及び/又はULIP 6タンパク質の過剰発現の治療に有用である
。
起膠細胞小集団の異常がすでに判明しているPNSs類似の障害であり(Rapp et al.
, 1992)。
中させるようにしてもよい。
リゴヌクレオチドは、ULIP 6タンパク質をコードする遺伝子が関与する任意タイ
プのがんの治療に有用であろう。そうしたがんの例としては、末梢性腫瘍たとえ
ば小細胞肺がん、胸腺種、乳がん及び卵巣がん、それに脳腫瘍、好ましくはグリ
ア起源の原発性脳腫瘍があげられよう。これとの関連では、ULIP 6は正常脳の非
増殖細胞内で発現すること、それはたとえば肺又は胸腺などのような正常組織に
は見られないこと、それはこれらの組織内で腫瘍形成時に差別的に再発現するこ
と、及び腫瘍系において分化時のその発現が調節されることは、ULIP 6が腫瘍抑
制遺伝子に由来するという可能性を示唆する。
してもよい。
ク質の発現又は作用を活性化する合成又は天然起源の化合物又は化合物ミックス
を使用することができる。
より全身投与するのがよい。
慮される基準、たとえば患者の年齢又は体重、症状全般の重篤度、該処置に対す
る耐性、及び観察される副作用などに応じて決定されよう。
伝子の非コード領域に属する核酸、ヌクレオチド配列SEQ ID No.1又はNo.3と特
異的にハイブリダイズすることができるアンチセンス配列、又は該タンパク質に
対する抗体の、製薬上許容しうる担体と組み合せた、神経変性疾患及び腫瘍の治
療を目的とした製剤への使用を含む。
、前述の製剤組成物の治療有効量をそうした治療を必要とする患者に投与するこ
とを含む方法である。
後、当時本発明者が保有していた抗CV2血清がいずれもULIP 4を認識することを
免疫組織化学法で証明することができた。この結果は、ULIP 4が抗CV2血清によ
って認識される主要抗原であるという可能性を示唆するものであった(Honnorat
et al., 1999)。他方、E. coli中で発現させたULIP 4タンパク質を対象にウェス
タンブロット法でもっと大きな血清群を検査すると、いくつかの抗CV2血清は確
かに組換えULIP 4タンパク質を認識するものの、それを認識しない血清もあるこ
と、ただし脳由来のタンパク質を免疫沈降させた後ではすべてのCV2血清がウェ
スタンブロット法で同じ66kDaタンパク質を認識することが判明した(Honnorat e
t al., 1996)。さらに、in situハイブリダイゼーション法では希突起膠細胞はU
LIP 4メッセンジャーRNAを発現しなかった。そこで本発明者は、ULIPタンパク質
と同族ではあるが、まだ記述されてない、また希突起膠細胞では発現されない別
のタンパク質が存在するとの仮説を提出した。
しなかった抗CV2血清を発現ライブラリーのスクリーニングに用いた。λgt11フ
ァージ中にクローニングされたヒト脊髄(成人でCV2抗原の発現が最大である部位
) cDNAライブラリー(Clontech, Palo alto, USA)を選択した。該ファージのスク
リーニングを2×104 pfu毎150 mm径ディッシュの密度で行った。42℃での3時間
半にわたるインキュベーション後に、IPTG (10mM) 中でインキュベートしたニト
ロセルロースフィルターでディッシュを覆い、37℃で3時間再インキュベートし
た。次に、フィルターにPBS-Tween-スキムミルクを飽和させ、次いで1/100に希
釈した血清で一晩インキュベートした。次にフィルターをPBS-Tweenで洗い、次
いでペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗血清でインキュベートした。
フィルターを洗浄後、ジアミノベンジジン法で発色させた。陽性クローンを、10
0%の陽性クローンが得られるまで順次継代培養した。同じタンパク質のC末端部
分をコードする1400〜1700塩基対の4つのcDNAを同定した。最大のコード配列を
もつクローン(クローン97)は1490塩基対(SEQ ID No.1のヌクレオチド1585〜3074
)を含み、90アミノ酸のポリペプチド(SEQ ID No.2のアミノ酸475〜564)をコード
する270ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有していた。データバ
ンクでの相同性検索により、このポリペプチド(本書では以下ULIP6 C-Termと呼
ぶ)はULIPファミリーの各既知タンパク質のC末端部分と35%の相同性を示し、ま
た他タンパク質ファミリーとの相同性はないことが判明した。
認するために、クローン97のコード領域を細菌発現ベクターpGex 2T (Pharmacia
Amersham Biotech, Sweden)中にクローニングした。このベクターは、目的タン
パク質がE. coli中でグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST, 26kDa)との融合
体として発現することを可能にする。ウェスタンブロット法では、試験した18抗
CV2血清のうち16血清が細菌タンパク質抽出物中のGST-ULIP6 C-Term融合タンパ
ク質を認識した(陽性率89%) (図1)。ULIP6 C-Termポリペプチドの分子量が10kDa
であり、66kDaタンパク質の約15%を占めることは注目に値する。これらの血清は
いずれも単独のGSTを認識しなかった。100のコントロール血清も検査したが、GS
T-ULIP6 C-Term融合タンパク質に対して反応性を示すものはなかった。検査を可
能な限り特異的にするために、本発明者は、アガロース−グルタチオンビーズで
精製したGST-ULIP6 C-Term融合タンパク質で抗CV2血清を検査した。図2はウェス
タンブロット法で得られた結果の一例である。
ポリA+ RNAs (Clontech, Palo alto, USA)を対象にノーザンブロット法を実施し
た。プローブはα-32P dCTPで標識した全クローン97に対応した。RNAsを1.2%ア
ガロースホルムアルデヒド電気泳動ゲル上で分離し、ナイロンフィルター上に移
した。フィルターはハイブリダイゼーション液(Clontech, Palo alto, USA)でプ
レハイブリダイズした後、プローブと1時間インキュベートした。フィルターを
洗浄後、−80℃で一晩フィルムに焼き付けた。5kb転写産物に対応する単一バン
ドが現れた。
、脊髄前部切片でin situハイブリダイゼーション分析を実施した。使用プロー
ブは、pBluescript SK (Stratagene)中にサブクローニングしたクローン97の転
写によって得られた、ジゴキシゲニンで標識したコールドRNAプローブであった
。ネガティブコントロールとしてセンスプローブを使用した。希突起膠細胞の特
異的標識を観察することができた。
対応するSEQ ID No.4のペプチドRep ULIP 6 = “KEMGTPLADTPTRPVTRHGG”)に対
してウサギを免疫して単クローン抗体を産生させた。該ペプチドはCOVALAB社(Ly
on, France)がペプチド合成機で合成した。試料純度はHPLCと質量分析で調節し
た。ヘモシアニンに結合させたペプチド1mgをフロイント完全アジュバントと共
にウサギ (COVALAB, Lyon, France) に注射した。3週間ごとに、さらに0.5mgの
注射を行った。抗体の産生とその特異性はウェスタンブロット法と免疫組織化学
法で、免疫前血清をコントロールとして分析した。
パク質すなわち66kDaタンパク質を、また免疫組織化学法ではラット脊髄切片上
で特異的に標識した希突起膠細胞を認識した。
脊髄cDNAライブラリー(Clontech, Palo alto, USA)を放射性プローブでスクリー
ニングした。PCRで得られたこのプローブはα-32P dCTPで標識したが、SEQ ID N
o.1のヌクレオチド1585〜1854に対応していた。該ファージのスクリーニングを2
×104 pfu毎150 mm径ディッシュの密度で行った。37℃での6時間にわたるインキ
ュベーション後に、ナイロンフィルター上にレプリカを得た。このフィルターを
処理してファージを変性させるようにし、次いでDNAを42℃で一晩固定した。急
速ハイブリダイゼーション液(Clontech, Palo Alto, USA)でプレハイブリダイズ
した後、フィルターを放射性プローブで1時間インキュベートした。フィルター
を洗浄後、−80℃で一晩フィルムに焼き付けた。陽性シグナルを示すクローンを
、100%の陽性クローンが得られるまで順次継代培養で精製した。得られた最大の
cDNAは3074ヌクレオチド(SEQ ID No.1)を含み、また1692ヌクレオチドのオーブ
ンリーディングフレーム(SEQ ID No.1のヌクレオチド163〜1854)を含んでいた。
該cDNAは564アミノ酸のタンパク質(SEQ ID No.2)をコードしていたが、そのC末
端部分はULIP6 C-Termポリペプチド(SEQ ID No.2のアミノ酸475〜564)と厳密に
一致した。得られたタンパク質の既知ヒトULIP/CRMPタンパク質4種とのアライン
メントにより50%の相同性が観察された。 参考文献 − Anderson et al., CRC Crit. Rev. Neurobiol., 1987, vol. 3, pp 245-99 − Antoine J.C. et al., Journal of the Neurological Sciences, 1993, vol
. 117, pp 215-223 − Byk et al., Journal of Neuroscience, 1996, vol. 16(2), pp 688-701 − Byk T., Ozon S., Sobel A., (1998). Eur. J. Biochem, 254:14-24 − Dalmau et al., Neurology, 1991, vol. 41, pp 1757-64 − Graus et al., Neurology, 1985, vol. 35, pp 538-543 − Greenlee et al., Ann. Neurol., 1983, vol. 14, pp 609-13 − Hamajima N., Matsuda K., Sakata S., Tamaki M., Nonaka M., (1996). Ge
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y, 1996, vol. 61, pp 270-278 − Jaeckle et al., Ann. Neurol., 1985, vol. 18, pp 592-600 − Koehler and Milstein, Nature, 1975, vol. 256, pp 495-497 − Levy N., Mattei M.G., 1995, Geneprobs II, a practical approach, B.D.
Hames and S.J. Higgins, Oxford University Press, pp 211-243 − Luque et al., Ann. Neurol., 1991, vol. 29, pp 241-51 − Sambrook et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, 1989, 9.47-
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物に関するウェスタンブロットである。これらの抽出物はSDS-12.5% PAGEで分離
し、PVDFフィルター上に移し、ヒト血清とインキュベートした。レーン1〜14:
抗CV2血清、レーン15〜17: コントロール血清。
パク質のウェスタンブロットである。2種類の抗CV2血清(レーン1: 血清94-822、
レーン2: 血清95-590)は該タンパク質を認識しているが、コントロール血清(レ
ーン3)は認識していない。
Claims (14)
- 【請求項1】 アミノ酸配列SEQ ID No.2を含むULIP 6と命名された精製ポ
リペプチド、又は該ポリペプチドのうち配列SEQ ID No.4を含むエピトープ断片
。 - 【請求項2】 請求項1のポリペプチド又は該ポリペプチドのエピトープ断
片を含む単離核酸。 - 【請求項3】 ヌクレオチド配列SEQ ID No.1を含む、請求項2に記載の核酸
。 - 【請求項4】 ヌクレオチド配列SEQ ID No.3からなる、又はSEQ ID No.1の
ヌクレオチド1からヌクレオチド162までの配列からなる単離核酸。 - 【請求項5】 請求項2〜4のいずれか1項に記載の核酸配列を収めたクロー
ニングベクター及び/又は発現ベクター。 - 【請求項6】 請求項5に記載のベクターによりトランスフェクトされた宿
主細胞。 - 【請求項7】 請求項1のポリペプチドを使用して得られたモノクローナル
及び/又はポリクローナル抗体並びに該モノクローナル及び/又はポリクローナ
ル抗体の断片、キメラ抗体又はイムノコンジュゲート。 - 【請求項8】 傍腫瘍性神経症候群の診断及び/又は腫瘍形成の早期診断に
有用な、請求項1のポリペプチド又は該ポリペプチドのエピトープ断片を含有す
る組成物。 - 【請求項9】 請求項1のポリペプチドの、生体試料中の抗CV2抗体の検出へ
の使用。 - 【請求項10】 請求項7のモノクローナル及び/又はポリクローナル抗体
、又はその断片、キメラ抗体又はイムノコンジュゲートの、生体試料中の請求項
1のULIP 6タンパク質の精製又は検出への使用。 - 【請求項11】 個人から採取した生体試料中のULIP 6タンパク質に対する
抗体の存在が次のステップにより明らかにされる、傍腫瘍性神経症候群の診断及
び/又は腫瘍形成の早期診断のための方法: − 個人から採取した生体試料を、随意に支持体へと付着させた精製ULIP 6ポリ
ペプチドへと、該ポリペプチドと該生体試料中に存在する可能性のある自己抗体
の間での特異的免疫複合体の形成を可能にするような条件下で、接触させるステ
ップ、及び − 形成される可能性のある該特異的免疫複合体を検出するステップ。 - 【請求項12】 生体試料を使用して傍腫瘍性神経症候群を診断するための
、また腫瘍形成を早期診断するための、次の構成要素を含むキット: − 随意に支持体に付着させた請求項1の1以上の精製ULIP 6ポリペプチド、及び − 抗ULIP 6自己抗体と該ULIP 6ポリペプチドの間の特異的抗原/抗体複合体の
形成を明らかにする手段、及び/又は該複合体を定量する手段。 - 【請求項13】 請求項1のポリペプチド、請求項2〜4に記載の核酸又は請
求項2〜4に記載の核酸と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンス
配列を含む核酸、又は請求項7に記載のポリペプチドに対する特異的抗体よりな
る群から選択される1以上の治療薬とそれと混合させた製薬上許容しうる担体と
を含有する製剤組成物。 - 【請求項14】 請求項13に記載の治療薬の、神経変性疾患及び腫瘍の治療
を目的とした製剤への使用。
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