JP2002530073A

JP2002530073A - ヒト２型グリシン輸送体

Info

Publication number: JP2002530073A
Application number: JP2000582548A
Authority: JP
Inventors: マイケルジェイ．ギャラガー，; ロイドエイチ．バージェス，; カートアール．ブランデン，
Original assignee: グリアテックインコーポレイテッド
Priority date: 1998-11-12
Filing date: 1999-11-09
Publication date: 2002-09-17
Also published as: US20030165907A1; WO2000029564A2; EP1129183A2; AU1614400A; CA2350698A1; US6416975B1; WO2000029564A3

Abstract

(57)【要約】ヒト２型グリシン輸送体の配列に由来する核酸およびタンパク質を記載する。１つの実施形態では、本発明の精製された核酸は、グリシン輸送体活性を有しかつ以下のアミノ酸：（１）配列番号１２４のアミノ酸２４に対応する位置でセリン、（２）配列番号１２４のアミノ酸７４に対応する位置でトリプトファン、（３）配列番号１２４のアミノ酸１５５に対応する位置でグリシン、（４）配列番号１２４の１８８に対応する位置でアスパラギン酸、（５）配列番号１２４のアミノ酸３６２に対応する位置でロイシン、（６）配列番号１２４のアミノ酸４３１に対応する位置でアラニン、または（７）配列番号１２４の５８２に対応する位置でセリン、のうちの１つ以上を有する、ＧｌｙＴ２アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ヒト２型グリシン輸送体（ＧｌｙＴ２）分子をコードする核酸、そ
のような核酸によりコードされるタンパク質、ＧｌｙＴ２活性化合物を特徴付け
る方法、ＧｌｙＴ２輸送体をコードする核酸に対するＤＮＡおよびＲＮＡのヌク
レオチドプローブの使用、ＧｌｙＴ２発現を阻害するためのアンチセンス分子の
使用、ＧｌｙＴ２特異的抗体を生成するためのＧｌｙＴ２タンパク質の使用、お
よびＧｌｙＴ２発現細胞株を使用するスクリーニング方法、ならびに薬物探索の
分野に関する。

【０００２】（背景）中枢神経系（ＣＮＳ）におけるシナプス伝達の終結は、神経伝達物質の酵素的
不活化、またはシナプス前の末端もしくは周辺のグリア細胞へのそれらの取り込
みのいずれかを包含する（Ａｍａｒａ，Ｓ．Ｇ．およびＫｕｈａｒ，Ｍ．Ｊ．，
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：７３−９３（１９９８）；Ｍａｌ
ａｎｄｒｏ，Ｍ．Ｓ．およびＫｉｌｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．６５：３０５−３３６（１９９６））。高親和性の膜会合輸送体
は、代表的には、シナプス間隙からの神経伝達物質の迅速な除去を媒介する。濃
度勾配を介する取り込みは、膜内外のイオン勾配に対して熱力学的に共役してい
る（Ｋａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１：
７３５−７３８（１９８９））。

【０００３】神経伝達物質輸送体は、２つの構造的に異なるファミリーに分けられ得る。一
方のファミリーは、Ｎａ⁺依存的興奮性アミノ酸取り込みを媒介する（Ｋａｎａ
ｉ，Ｙ．およびＨｅｄｉｇｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ３６０：４６７−４
７１（１９９２）；Ｐｉｎｅｓ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３６０：４６４−４６
６（１９９３）；Ｓｔｏｒｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ）８９：１０８５５−１０８５９（１９９２））。他方のファミリーは、
他の神経伝達物質について宿主のＮａ⁺／Ｃｌ^-依存的輸送に関与するいくつかの
膜を含む。それらの神経伝達物質としては、以下が挙げられる：ＧＡＢＡ（Ｂｏ
ｒｄｅｎ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０９６−２１１
０４（１９９２））；カテコールアミン（Ｐａｃｈｏｌｃｚｙｋ，Ｔ．ら、Ｎａ
ｔｕｒｅ３５０：３５０−３５４（１９９１））；グリシン（Ｋｉｍら、Ｍｏ
ｌ．Ｐｈａｒｍ．４５：６０８−１７（１９９４）；Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、ＦＥ
ＢＳＬｅｔｔ．３０５：１１０−１１４（１９９２ａ））；プロリン（Ｆｒｅ
ｍｅａｕ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ８：９１５−９２６（１９９２））およ
びタウリン（Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ）８９：１２１４５−１２１４９（１９９２ｂ））。後者のファミリーの
大部分に関する遺伝子産物が、最近クローニングされ、そして配列決定された。
これらの輸送体は、４０〜５０％のアミノ酸類似性を示し、そして構造的保存性
を示すようである。なぜなら、膜トポロジー分析により、１２の推定膜貫通領域
が予測されるからである（Ｇｕａｓｔｅｌｌａ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
９：１３０３−１３０６（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ
８：９２７−９３５（１９９２））。これらの膜貫通領域内の高い相同性は、
ＰＣＲベースの技術を用いる輸送体スーパーファミリーのさらなるメンバーのク
ローニングのための縮重プライマーの設計を容易にした（Ｂｏｒｏｗｓｋｙ，Ｂ
．ら、Ｎｅｕｒｏｎ１０：８５１−８６３（１９９３）；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ
．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：５７９−５８０（１９９１））。

【０００４】グリシンは、脊髄、脳幹および網膜における主要な阻害性神経伝達物質である
。脊髄、脳幹および網膜において、グリシンは、ストリキニーネ感受性グリシン
レセプターに対する効果を発揮する（Ｂｅｔｚ，Ｈ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，２０７：１０９−１１５（１９９３）；Ｂｅｔｚ，Ｈ．ら、Ｑ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５：３８１−３９４（１９９２））。さらに、グ
リシンは、ＮＭＤＡレセプターにおいてグルタミン酸とともにコアゴニスト（ｃ
ｏ−ａｇｏｎｉｓｔ）として作用する（Ｋｅｍｐ，Ｊ．Ａ．およびＬｅｅｓｏｎ
，Ｐ．Ｄ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１４：２０−２５（
１９９３）；Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ
ｏｎ）４２８：３３３−３５７（１９９０））。シナプスのグリシン濃度は、神
経末端およびグリア細胞において見出されるＮａ⁺／Ｃｌ^-依存的高親和性輸送体
により制御される（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｇ．Ａ．Ｒ．およびＩｖｅｒｓｏｎ，Ｌ
．Ｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１８：１９５１−１９６１（１９７１）；Ｆ
ｅｄｅｌｅＥ．およびＦｏｓｔｅｒＡ．Ｃ．，ＢｒａｉｎＲｅｓ．５７２
：１５４−１６３（１９９２））。２つの異なるグリシン輸送体である、Ｇｌｙ
Ｔ１（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ８：９２７−９３５（１９９２
）；Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３０５：１１０−１１４（１９
９２ａ）；Ｇｕａｓｔｅｌｌａ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）８９：７１８９−７１９３（１９９２））およびＧｌｙＴ２（Ｌ
ｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８０２−２２８０６
（１９９３））が単離され、そしてヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルの
両方で約５０％の同一性を共有する。インサイチュハイブリダイゼーション技術
によるＧｌｙＴ１およびＧｌｙＴ２の位置決めによって、ＣＮＳにおける発現の
異なるパターンが示される（Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６８：２２８０２−２２８０６（１９９３）；Ｚａｆｒａ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．１５：３９５２−３９６９（１９９５））。ＧｌｙＴ１は、脳の海
馬および皮質領域ならびに脊髄および脳幹領域において発現される。対照的に、
ＧｌｙＴ２は、脊髄および小脳において主に発現され、そして海馬および皮質領
域において存在しない。それらの発現パターンに基づくと、ＧｌｙＴ１は、ＮＭ
ＤＡレセプターとともに共存する（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）が、ＧｌｙＴ２発現
は、ストリキニーネ感受性グリシンレセプターの発現を模倣すると考えられる（
ＪｕｒｓｋｙおよびＮｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：３３６−３
４４（１９９６）；Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８−２
２８０２−２２８０６（１９９３））。

【０００５】ＧｌｙＴ１配列は、多くの種について決定されており、それらの種としては、
ラット（Ｇｕａｓｔｅｌｌａ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．（ＵＳＡ）８９：７１８９−７１９３（１９９２））、マウス（Ｌｉｕ，Ｑ．
Ｒ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３０５：１１０−１１４（１９９２ａ））、およ
びヒト（Ｋｉｍ，Ｋ−Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４５：６０８−１７（１９
９４））が挙げられる。ヒト輸送体の３つの選択的スプライシング形態により、
それらのアミノ末端配列が異なる（ＧｌｙＴ１ａ〜ＧｌｙＴ１ｃ）ことを同定し
た（Ｇｕａｓｔｅｌｌａ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ）８９：７１８９−７１９３（１９９２）；Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、ＦＥＢ
ＳＬｅｔｔ．３０５：１１０−１１４（１９９２ａ）；Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８０２−２２８０６（１９９３）；Ｓｍ
ｉｔｈ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ８：９２７−９３５（１９９２）；Ｂｏｒ
ｏｗｓｋｙ，Ｂ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ１０：８５１−８６３（１９９３）；Ｋｉ
ｍ，Ｋ−Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４５：６０８−１７（１９９４））。ラ
ットＧｌｙＴ２配列が公表されており（Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６８：２２８０２−２２８０６（１９９３））、そしてこれはまた、
選択的スプライシング形態を示す（ＧｌｙＴ２ａおよびＧｌｙＴ２ｂ）（Ｐｏｎ
ｃｅ，Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２４２：２５−２８（１９９８）
）。最近、ヒトＧｌｙＴ２のｐＨＧＴ２−ａおよびｐＨＧＴ２−ｂとして記載さ
れた２つの全長クローンが構築された（ＷＯ９８／０７８５４；ＰＣＴ／ＵＳ９
７／１４６３７）。

【０００６】ＣＮＳにおけるシナプスのグリシン濃度の正確な調節は、非常に重要なプロセ
スである。なぜなら、グリシンは、興奮性および阻害性の両方の神経伝達に関与
するからである（Ｂｅｔｚ，Ｈ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２
０７：１０９−１１５（１９９３）；Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄｏｎ）４２８：３３３−３５７（１９９０））。グリシ
ン輸送体は、このプロセスにおいて重要であるようである。グリシン輸送体の機
能を調節し得る（すなわち、グリシン輸送体を阻害または活性化し得る）化合物
は、広範な種々の治療的利益をもたらすことが予測される。例えば、グリシンレ
セプター阻害は、疼痛の伝達を生じることが公知である（Ｙａｋｓｈ，Ｐａｉｎ
，１１１−１２３（１９８９））。従って、ＧｌｙＴ２輸送体活性を阻害する化
合物は、ストリキニーネ感受性グリシンレセプターを有するニューロンの活性を
、グリシンのシナプスレベルを増大させることにより増大し得、従って、脊髄に
おける疼痛に関連する（すなわち、侵害受容の）情報の伝達を減少させ得る。こ
のことは、これらのレセプターにより媒介されることが示されている。さらに、
グリシンレセプターの機能不全は、筋痙性における役割を果たすことが公知であ
る（Ｂｅｃｋｅｒ，ＦＡＳＥＢＪ．４：２７６７−２７７５（１９９０））の
で、ＧｌｙＴ２輸送体活性を阻害し、そして脊髄のストリキニーネ感受性グリシ
ンレセプターを通じて阻害性のグリシン作動性伝達の増強を導く化合物を用いて
、筋能亢進を低減させ得る。このような化合物は、増大した筋収縮と関連した疾
患または状態（例えば、筋痙性、ミオクローヌス（これは、急激な筋痙攣に関連
する）、および癲癇）を処置する際に有用である。グリシンレセプターの調節を
介して処置され得る痙性は、癲癇、発作（ｓｔｒｏｋｅ）、頭部外傷、多発性硬
化症、脊髄損傷、失調症、および他の神経系の疾病および損傷の状態と関連する
。

【０００７】（発明の要旨）本発明は、新規なヒト２型グリシン輸送体（ＧｌｙＴ２）分子を提供する。グ
リシン輸送体活性を有し、かつ以下のアミノ酸うちの１つ以上を有するタンパク
質をコードする核酸を含む核酸が提供される：（１）配列番号１２４のアミノ酸
２４に対応する位置でセリン、（２）配列番号１２４のアミノ酸７４に対応する
位置でトリプトファン、（３）配列番号１２４のアミノ酸１５５に対応する位置
でグリシン、（４）配列番号１２４のアミノ酸１８８に対応する位置でアスパラ
ギン酸、（５）配列番号１２４のアミノ酸３６２に対応する位置でロイシン、（
６）配列番号１２４のアミノ酸４３１に対応する位置でアラニン、または（７）
配列番号１２４のアミノ酸５８２に対応する位置でセリン。好ましいＧｌｙＴ２
配列は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸配列が、配列番
号１２３の塩基１〜２３９１の配列であるが、以下のヌクレオチドの１つ以上を
有する核酸を提供する：（１）７０位でＡ、（２）２２０位でＴ、（３）４６３
位でＧ、（４）５６２位でＧ、（５）１０８５位でＴ、（６）１２９２位でＣ、
（７）１２９９位でＡ、（８）１６１７位でＴ、または（９）１７４４位でＴ。
好ましいＧｌｙＴ２配列は、配列番号１１９の核酸配列を含む。

【０００８】グリシン輸送体活性を有し、上記の７つのアミノ酸のうちの１つ以上を有し、
かつ以下のアミノ酸のうちの１つ以上をさらに有するタンパク質をコードする核
酸配列を含む核酸もまた提供される：（１）配列番号１２４のアミノ酸２６に対
応する位置でロイシン、（２）配列番号１２４のアミノ酸７５に対応する位置で
ロイシン、（３）配列番号１２４のアミノ酸８９に対応する位置でバリン、（４
）配列番号１２４のアミノ酸１０２に対応する位置でグリシン、（５）配列番号
１２４のアミノ酸１７４に対応する位置でグルタミン酸、（６）配列番号１２４
のアミノ酸１９５に対応する位置でプロリン、（７）配列番号１２４のアミノ酸
１９９に対応する位置でグリシン、（８）配列番号１２４のアミノ酸２４９に対
応する位置でロイシン、（９）配列番号１２４のアミノ酸３０６に対応する位置
でプロリン、（１０）配列番号１２４のアミノ酸４１９に対応する位置でグルタ
ミン酸、（１１）配列番号１２４のアミノ酸４４２に対応する位置でアスパラギ
ン、（１２）配列番号１２４のアミノ酸４５５に対応する位置でリジン、（１３
）配列番号１２４のアミノ酸４５８に対応する位置でシステイン、（１４）配列
番号１２４のアミノ酸４８５に対応する位置でプロリン、（１５）配列番号１２
４のアミノ酸４９３に対応する位置でアルギニン、または（１６）配列番号１２
４のアミノ酸６５０に対応する位置でグルタミン酸。

【０００９】本発明はまた、核酸配列が、配列番号１１９、１２１または１２３の塩基１〜
２３９１の配列であるが、上記の９つのヌクレオチドのうちの１つ以上を有し、
しかし以下のヌクレオチドのうちの１つ以上をさらに有する核酸配列を提供する
：（ａ）７７位でＴ、（ｂ）２２０位でＴ、（ｃ）２４４位でＴ、（ｄ）２６６
位でＴ、（ｅ）３０４位でＧ、（ｆ）５２１位でＡ、（ｇ）５８３位でＣ、（ｈ
）５９６位でＧ、（ｉ）６７８位でＧ、（ｊ）６８１位でＣ、（ｋ）７４５位で
Ｔ、（ｌ）７５０位でＣ、（ｍ）７６５位でＴ、（ｎ）７７７位でＣまたはＡ、
（ｏ）８６７位でＧ、（ｐ）９１７位でＣ、（ｑ）１２５６位でＡ、（ｒ）１２
９２位でＣ、（ｓ）１３２５位でＡ、（ｔ）１３６４位でＡ、（ｕ）１３７４位
でＣ、（ｖ）１３９２位でＡ、（ｗ）１４５４位でＣ、（ｘ）１４７８位でＧ、
（ｙ）１８５４位でＣ、（ｚ）１９４９位でＡ、（ａａ）１９５９位でＣ、また
は（ｂｂ）２１３０位でＣ。

【００１０】本発明はまた、グリシン輸送体活性を有し、かつ以下のアミノ酸：（１）配列
番号１２４のアミノ酸２４に対応する位置でセリン、（２）配列番号１２４のア
ミノ酸７４に対応する位置でトリプトファン、（３）配列番号１２４のアミノ酸
１５５に対応する位置でグリシン、（４）配列番号１２４のアミノ酸１８８に対
応する位置でアスパラギン酸、（５）配列番号１２４のアミノ酸３６２に対応す
る位置でロイシン、（６）配列番号１２４のアミノ酸４３１に対応する位置でア
ラニン、または（７）アミノ酸５８２に対応する位置でセリンのうちの１つ以上
を有し、そして以下のアミノ酸：（１）配列番号１２４のアミノ酸１２４に対応
する位置でフェニルアラニン、（２）配列番号１２４のアミノ酸２７９に対応す
る位置でアスパラギン、（３）配列番号１２４のアミノ酸３９３に対応する位置
でグリシン、（４）配列番号１２４のアミノ酸４５７に対応する位置でアスパラ
ギン、（５）配列番号１２４のアミノ酸４６３に対応する位置でアスパラギン、
（６）配列番号１２４のアミノ酸６１０に対応する位置でチロシン、（７）配列
番号１２４のアミノ酸６１１に対応する位置でバリン、（８）配列番号１２４の
アミノ酸７３３に対応する位置でセリン、（９）配列番号１２４のアミノ酸７３
５に対応する位置でバリン、（１０）配列番号１２４のアミノ酸２４５に対応す
る位置でロイシン、（１１）配列番号１２４のアミノ酸３０５に対応する位置で
ロイシン、（１２）配列番号１２４のアミノ酸３６６に対応する位置でイソロイ
シン、または（１３）配列番号１２４のアミノ酸４００に対応する位置でプロリ
ンのうちの１つ以上をさらに有するタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸
を提供する。

【００１１】本発明はまた、核酸配列が、配列番号１２３の塩基１〜２３９１の配列である
が、以下のヌクレオチド：（１）７０位でＡ、（２）２２０位でＴ、（３）４６
３位でＧ、（４）５６２位でＧ、（５）１０８５位でＴ、（６）１２９２位でＣ
、（７）１２９９位でＡ、（８）１６１７位でＴ、または（９）１７４４位でＴ
のうちの１つ以上を有し、しかし以下のヌクレオチド：（ａ）６位でＣ、（ｂ）
３７１位でＴ、（ｃ）５７１位でＴ、（ｄ）８３６位でＡ、（ｅ）１１１６位で
Ｇ、（ｆ）１１７７位でＧ、（ｇ）１３７１位でＣ、（ｈ）１３８７位でＡ、（
ｉ）１８２９位でＡ、（ｊ）１８３１位でＧ、（ｋ）２１９８位でＣ、（ｌ）２
２０３位でＧ、（ｍ）３４２位でＧ、（ｎ）７３３位でＣ、（ｏ）９１３位でＣ
、（ｐ）９５１位でＡ、（ｑ）１０９７位でＴ、（ｒ）１１９９位でＣ、（ｓ）
３５２位でＴ、または（ｔ）２１０３位でＡのうちの１つ以上をさらに有する核
酸を提供する。

【００１２】本発明はまた、配列番号１２２のタンパク質配列、または１つ以上の以下のア
ミノ酸置換：（１）Ｐｒｏ²⁶からＬｅｕへ、（２）Ａｒｇ⁷⁴からＴｒｐへ、（３
）Ｐｒｏ⁷⁵からＬｅｕへ、（４）Ａｌａ⁸⁹からＶａｌへ、（５）Ｓｅｒ¹⁰²から
Ｇｌｙへ、（６）Ｖａｌ¹⁷⁴からＧｌｕへ、（７）Ｓｅｒ¹⁹⁵からＰｒｏへ、（８
）Ａｓｐ¹⁹⁹からＧｌｙへ、（９）Ｖａｌ²⁴⁹からＬｅｕへ、（１０）Ｌｅｕ³⁰⁶
からＰｒｏへ、（１１）Ｇｌｙ⁴¹⁹からＧｌｕへ、（１２）Ｔｈｒ⁴⁴²からＡｓｎ
へ、（１３）Ｔｈｒ⁴⁵⁵からＬｙｓへ、（１４）Ｔｒｐ⁴⁵⁸からＣｙｓへ、（１５
）Ｌｅｕ⁴⁸⁵からＰｒｏへ、（１６）Ｌｙｓ⁴⁹³からＡｒｇへ、もしくは（１７）
Ｖａｌ⁶⁵⁰からＧｌｕへ、の置換を有する以外は、配列番号１２２のタンパク質
配列に対応する配列と少なくとも約９６％の配列同一性を有するグリシン輸送体
をコードする核酸を提供する。好ましくは、配列同一性は、少なくとも約９７％
、より好ましくは少なくとも約９８％。なおより好ましくは少なくとも約９９％
、なおより好ましくは少なくとも約９９．５％である。本発明の別の実施形態に
おいて、配列同一性は１００％である。好ましくは、コードされるグリシン輸送
体は、参照タンパク質配列の２００アミノ酸から７９７アミノ酸までの領域にお
いて４アミノ酸に過ぎない差違を有し、ここで参照配列は、配列番号１２２また
は上記の置換の１つを有する以外は配列番号１２２のタンパク質配列に対応する
配列である。より好ましくは、コードされたグリシン輸送体は、２つのこのよう
な差違を有するに過ぎない。

【００１３】本発明はまた、上記の核酸を含むベクターを提供する。１つの実施形態におい
て、そのベクターは、少なくとも１つの真核生物細胞または細菌細胞において、
グリシン輸送体ｍＲＮＡを発現するのに効果的である。本発明の別の実施形態に
おいて、そのベクターは、少なくとも１つの哺乳動物細胞、酵母細胞またはトリ
（ａｖｉａｎ）細胞においてｍＲＮＡを発現するのに効果的である。

【００１４】本発明はさらに、本発明に従って形質転換された細胞に由来する単離されたグ
リシン輸送体を提供し、その輸送体は、上記に記載される核酸によってコードさ
れるアミノ酸配列、またはそのような核酸によってコードされるアミノ酸配列の
１つから２つの隣接した部分を含み、ここでそのタンパク質は、グリシン輸送体
活性を有し、そしてＷＯ９８／０７８５４（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６３７）（
ヒト）またはＬｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８０２−２２８
０８（１９９３）（ラット）によって記載されるＧｌｙＴ２輸送体配列の整列し
たセグメントと、配列において異なる。本明細書中で使用される隣接した配列と
は、関連する参照核酸配列または参照アミノ酸配列の中断されていない部分をい
う。好ましくは、本発明のグリシン輸送体タンパク質は、ＷＯ９８／０７８５４
（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６３７）（ヒト）またはＬｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６８：２２８０２−２２８０８（１９９３）（ラット）によって記載
されるＧｌｙＴ２輸送体配列の整列したセグメントと、少なくとも２つのアミノ
酸、より好ましくは少なくとも４つのアミノ酸で配列が異なる。好ましくは、隣
接した配列は、少なくとも約６００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７０
０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７５０アミノ酸を含む。１つの実施形
態において、その輸送体タンパク質は、上記の核酸によってコードされるタンパ
ク質配列のすべてを含む。好ましくは、その輸送体タンパク質は、配列番号１２
２のタンパク質配列に示されるアミノ酸配列、または１つ以上の以下のアミノ酸
置換：（１）Ｐｒｏ²⁶からＬｅｕへ、（２）Ａｒｇ⁷⁴からＴｒｐへ、（３）Ｐｒ
ｏ⁷⁵からＬｅｕへ、（４）Ａｌａ⁸⁹からＶａｌへ、（５）Ｓｅｒ¹⁰²からＧｌｙ
へ、（６）Ｖａｌ¹⁷⁴からＧｌｕへ、（７）Ｓｅｒ¹⁹⁵からＰｒｏへ、（８）Ａｓ
ｐ¹⁹⁹からＧｌｙへ、（９）Ｖａｌ²⁴⁹からＬｅｕへ、（１０）Ｌｅｕ³⁰⁶からＰ
ｒｏへ、（１１）Ｇｌｙ⁴¹⁹からＧｌｕへ、（１２）Ｔｈｒ⁴⁴²からＡｓｎへ、（
１３）Ｔｈｒ⁴⁵⁵からＬｙｓへ、（１４）Ｔｒｐ⁴⁵⁸からＣｙｓへ、（１５）Ｌｅ
ｕ⁴⁸⁵からＰｒｏへ、（１６）Ｌｙｓ⁴⁹³からＡｒｇへ、または（１７）Ｖａｌ⁶⁵ ⁰ からＧｌｕへ、の置換を有する以外は、配列番号１２２のタンパク質配列に対
応する配列、またはこれらの配列の１つから２つの隣接した部分を含むアミノ酸
配列を含む。

【００１５】本発明はまた、配列番号１２２のアミノ酸配列のすべてもしくは１つから２つ
の隣接した部分、または１つ以上の以下のアミノ酸置換：（１）Ｐｒｏ²⁶からＬ
ｅｕへ、（２）Ａｒｇ⁷⁴からＴｒｐへ、（３）Ｐｒｏ⁷⁵からＬｅｕへ、（４）Ａ
ｌａ⁸⁹からＶａｌへ、（５）Ｓｅｒ¹⁰²からＧｌｙへ、（６）Ｖａｌ¹⁷⁴からＧｌ
ｕへ、（７）Ｓｅｒ¹⁹⁵からＰｒｏへ、（８）Ａｓｐ¹⁹⁹からＧｌｙへ、（９）Ｖ
ａｌ²⁴⁹からＬｅｕへ、（１０）Ｌｅｕ³⁰⁶からＰｒｏへ、（１１）Ｇｌｙ⁴¹⁹か
らＧｌｕへ、（１２）Ｔｈｒ⁴⁴²からＡｓｎへ、（１３）Ｔｈｒ⁴⁵⁵からＬｙｓへ
、（１４）Ｔｒｐ⁴⁵⁸からＣｙｓへ、（１５）Ｌｅｕ⁴⁸⁵からＰｒｏへ、（１６）
Ｌｙｓ⁴⁹³からＡｒｇへ、もしくは（１７）Ｖａｌ⁶⁵⁰からＧｌｕへ、の置換を有
する以外は、配列番号１２２のタンパク質配列に対応するアミノ酸配列の１つか
ら２つの隣接した部分と、少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する輸送体
タンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、コードされるタンパク質は、グ
リシン輸送体活性を有する。好ましくは、隣接した配列は、少なくとも約６００
アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７００アミノ酸、より好ましくは少なく
とも約７５０アミノ酸を含む。本発明はまた、この核酸を含むベクターを提供す
る。１つの実施形態において、そのベクターは、少なくとも１つの真核生物細胞
または原核生物細胞（例えば、細菌細胞）においてグリシン輸送体ｍＲＮＡを発
現するのに効果的である。本発明の別の実施形態において、そのベクターは、少
なくとも１つの酵母細胞、哺乳動物細胞、またはトリ細胞においてｍＲＮＡを発
現するのに効果的である。

【００１６】本発明はさらに、第１の実施形態に従って外因的に由来する第１の核酸、ある
いは、配列番号１２２のタンパク質配列の１つから２つの隣接した部分、または
１つ以上の以下：（１）Ｐｒｏ²⁶からＬｅｕへ、（２）Ａｒｇ⁷⁴からＴｒｐへ、
（３）Ｐｒｏ⁷⁵からＬｅｕへ、（４）Ａｌａ⁸⁹からＶａｌへ、（５）Ｓｅｒ¹⁰²
からＧｌｙへ、（６）Ｖａｌ¹⁷⁴からＧｌｕへ、（７）Ｓｅｒ¹⁹⁵からＰｒｏへ、
（８）Ａｓｐ¹⁹⁹からＧｌｙへ、（９）Ｖａｌ²⁴⁹からＬｅｕへ、（１０）Ｌｅｕ ³⁰⁶ からＰｒｏへ、（１１）Ｇｌｙ⁴¹⁹からＧｌｕへ、（１２）Ｔｈｒ⁴⁴²からＡ
ｓｎへ、（１３）Ｔｈｒ⁴⁵⁵からＬｙｓへ、（１４）Ｔｒｐ⁴⁵⁸からＣｙｓへ、（
１５）Ｌｅｕ⁴⁸⁵からＰｒｏへ、（１６）Ｌｙｓ⁴⁹³からＡｒｇへ、もしくは（１
７）Ｖａｌ⁶⁵⁰からＧｌｕへ、の置換を有する以外は、配列番号１２２のタンパ
ク質配列に対応する配列の１つから２つの隣接した部分と、少なくとも約９９．
５％の配列同一性を有する輸送体タンパク質をコードする第２の外因的に由来す
る核酸を含む、細胞を提供する。ここで、コードされるタンパク質は、グリシン
輸送体活性を有する。１つの実施形態において、その細胞は、その核酸に由来す
るグリシン輸送体を発現する。好ましくは、その核酸は、細胞中で作動可能であ
るプロモーターと機能的に結合される。本発明の１つの実施形態において、その
プロモーターは誘導性プロモーターである。

【００１７】本発明はまた、前の段落において記載されたような細胞を増殖させる工程を包
含する、グリシン輸送体を産生する方法を提供する。この方法はさらに、（ａ）
その細胞から膜（この膜は、グリシン輸送体を含む）を単離する工程、または（
ｂ）その細胞からタンパク質画分（この画分は、グリシン輸送体を含む）を抽出
する工程の少なくとも１つを包含し得る。

【００１８】本発明は、神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子を特徴付け
るため、または神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子を同定す
るための方法を提供し、この方法は、（ａ）（ｉ）上記のような細胞、または（
ｉｉ）上記の第１もしくは第２の外因的に由来する核酸によってコードされるア
ミノ酸配列を含む単離されたグリシン輸送体タンパク質を含む組成物の第１のア
ッセイ、を提供する工程、（ｂ）第１のアッセイ組成物を、生物活性因子または
予期される生物活性因子と接触させる工程、およびそのアッセイ組成物によって
示されるグリシン輸送の量を測定する工程、を包含する。好ましくは、この方法
は、第１のアッセイ組成物によって示されるグリシン輸送の量を、生物活性因子
または予期される生物活性因子を接触されない以外は、第１のアッセイ組成物と
同様に処理される第２のこのようなアッセイ組成物によって示されるグリシン輸
送の量と比較する工程をさらに包含する。その方法は、生物活性因子を特徴付け
するために使用され得、ここで神経系障害または状態は、以下を含む群の１つで
あるが、これらに限定されない：（ａ）疼痛、（ｂ）痙性、（ｃ）ミオクローヌ
ス、（ｄ）筋痙攣、（ｅ）筋機能亢進、または（ｆ）癲癇。好ましい実施形態に
おいて、生物活性因子が特徴付けられる痙性は、発作、頭部外傷、ニューロン細
胞死、多発性硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンティングトン病、または筋萎縮性
側索硬化症と関連する。

【００１９】本発明はさらに、配列番号１２１である参照核酸配列、または１つ以上の以下
の置換：（ａ）Ｃ⁷⁷→Ｔ、（ｂ）Ｃ²²⁰→Ｔ、（ｃ）Ｃ²²⁴→Ｔ、（ｄ）Ｃ²⁶⁶→
Ｔ、（ｅ）Ａ³⁰⁴→Ｇ、（ｆ）Ｔ⁵²¹→Ａ、（ｇ）Ｔ⁵⁸³→Ｃ、（ｈ）Ａ⁵⁹⁶→Ｇ、
（ｉ）Ａ⁶⁷⁸→Ｇ、（ｊ）Ｔ⁶⁸¹→Ｃ、（ｋ）Ｇ⁷⁴⁵→Ｔ、（ｌ）Ｇ⁷⁵⁰→Ｃ、（ｍ
）Ｃ⁷⁶⁵→Ｔ、（ｎ）Ｇ⁷⁷⁷→Ｃ、（ｏ）Ａ⁸⁶⁷→Ｇ、（ｐ）Ｔ⁹¹⁷→Ｃ、（ｑ）Ｇ ¹²⁵⁶ →Ａ、（ｒ）Ｔ¹²⁹²→Ｃ、（ｓ）Ｃ¹³²⁵→Ａ、（ｔ）Ｃ¹³⁶⁴→Ａ、（ｕ）Ｇ ¹³⁷⁴ →Ｃ、（ｖ）Ｃ¹³⁹²→Ａ、（ｗ）Ｔ¹⁴⁵⁴→Ｃ、（ｘ）Ａ¹⁴⁷⁸→Ｇ、（ｙ）Ｔ ¹⁸⁵⁴ →Ｃ、（ｚ）Ｔ¹⁹⁴⁹→Ａ、（ａａ）Ｔ¹⁹⁵⁹→Ｃ、もしくは（ｂｂ）Ｔ²¹³⁰→
Ｃを有することによって配列番号１２１の核酸配列から変動する配列と、十分な
ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズして、（ａ）ＧｌｙＴ２輸送体に
ついての配列または（ｂ）哺乳動物ＧｌｙＴ１輸送体についての配列とのハイブ
リダイゼーションを排除する核酸を提供する。好ましくは、その核酸配列は、少
なくとも１８ヌクレオチドの長さであり、そして参照核酸配列に組み込まれた配
列と少なくとも約９５％の配列同一性を有する。好ましくは、その核酸配列は、
少なくとも約４０ヌクレオチドの長さ、より好ましくな少なくとも約１００ヌク
レオチドの長さである。好ましくは、その核酸配列は、上記に挙げた参照配列と
、少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは９９％の配列同一性を有す
る。好ましくは、その核酸はＰＣＲプライマーであり、そしてストリンジェント
な条件は、ヒトＧｌｙＴ２配列を増幅するが、（ａ）ラットもしくはマウスのＧ
ｌｙＴ２輸送体についての配列または（ｂ）哺乳動物のＧｌｙＴ１輸送体につい
ての配列を増幅しないのに有効なＰＣＲ条件である。

【００２０】さらに、本発明は、ヒトＧｌｙＴ２遺伝子またはｃＤＮＡのコード鎖または非
コード鎖由来の隣接した配列を含む、少なくとも約１８ヌクレオチドの長さの核
酸を提供し、ここでその隣接した配列は、隣接した配列とともに整列したラット
ＧｌｙＴ２遺伝子配列と比較した場合に、少なくとも１つの配列の差異を有する
。好ましくは、その核酸配列は、少なくとも約４０ヌクレオチドの長さ、より好
ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである。好ましくは、その隣接
した配列は、隣接した配列とともに整列したラットＧｌｙＴ２遺伝子配列と比較
した場合に、少なくとも２つの差異、より好ましくは３つの差異を有する。

【００２１】なおさらに、本発明は、細胞、組織、器官、または動物に投与した場合に、細
胞において、または組織、器官、もしくは動物の細胞において、ＧｌｙＴ２の発
現を減少するのに効果的である、ＧｌｙＴ２についてのヒト遺伝子またはｃＤＮ
Ａのコード鎖または非コード鎖由来の隣接した配列を含むアンチセンス分子を提
供し、ここでその隣接した配列は、その隣接した配列とともに整列したラットＧ
ｌｙＴ２遺伝子配列と比較した場合に、少なくとも１つの配列の差異を有する。
好ましくは、隣接した配列は、隣接した配列とともに整列したラットＧｌｙＴ２
遺伝子配列と比較した場合に、少なくとも２つの差異、より好ましくは３つの差
異を有する。アンチセンス分子は、本明細書中では、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａに結合して、転写または翻訳を妨害する（ｍＲＮＡの安定性を妨害することを
含む）ために設計された分子をいうために使用される。好ましくは、その隣接し
た配列は、少なくとも約１５ヌクレオチドの長さである。好ましくは、隣接した
ストレッチは、配列番号１２１の核酸配列のコード鎖または非コード鎖に含まれ
る。本発明はさらに、このようなアンチセンス分子を含む発現ベクターを提供す
る。

【００２２】本発明はまた、ＧｌｙＴ２発現を減少させるために効果的なそのようなアンチ
センス分子の一定量を組織または細胞に適用する工程を含む、組織または細胞に
おいてＧｌｙＴ２発現を減少する方法を提供する。組織または細胞においてＧｌ
ｙＴ２発現を減少させるのに効果的なそのようなアンチセンス分子を発現するた
めの一定量の発現ベクターもまた、提供される。あるいは、本発明は、神経系の
障害または状態を処置する方法を提供し、この方法は、神経系の障害もしくは状
態を有するヒト患者の組織もしくは細胞に、そのような神経系の障害もしくは状
態を処置するのに効果的な一定量のそのようなアンチセンス分子、またはそのよ
うな神経系の障害もしくは状態を処置するのに効果的な、組織もしくな細胞にお
いてそのようなアンチセンス分子を発現するための一定量の発現ベクター、を適
用する工程を包含する。

【００２３】さらに、本発明は、動物がグリシン輸送体に対する自己免疫抗体を有するか否
かを検出するための方法を提供し、この方法は、動物由来の抗体調製物または動
物由来の体液を、グリシン輸送体を含むポリペプチド抗原、またはグリシン輸送
体から誘導されたポリペプチド抗原と接触させる工程を包含する。好ましくは、
そのポリペプチド抗原は、配列番号１２２のタンパク質配列、または１つ以上の
以下：（１）Ｐｒｏ²⁶からＬｅｕへ、（２）Ａｒｇ⁷⁴からＴｒｐへ、（３）Ｐｒ
ｏ⁷⁵からＬｅｕへ、（４）Ａｌａ⁸⁹からＶａｌへ、（５）Ｓｅｒ¹⁰²からＧｌｙ
へ、（６）Ｖａｌ¹⁷⁴からＧｌｕへ、（７）Ｓｅｒ¹⁹⁵からＰｒｏへ、（８）Ａｓ
ｐ¹⁹⁹からＧｌｙへ、（９）Ｖａｌ²⁴⁹からＬｅｕへ、（１０）Ｌｅｕ³⁰⁶からＰ
ｒｏへ、（１１）Ｇｌｙ⁴¹⁹からＧｌｕへ、（１２）Ｔｈｒ⁴⁴²からＡｓｎへ、（
１３）Ｔｈｒ⁴⁵⁵からＬｙｓへ、（１４）Ｔｒｐ⁴⁵⁸からＣｙｓへ、（１５）Ｌｅ
ｕ⁴⁸⁵からＰｒｏへ、（１６）Ｌｙｓ⁴⁹³からＡｒｇへ、もしくは（１７）Ｖａｌ ⁶⁵⁰ からＧｌｕへ、の置換を有する以外は、配列番号１２２のタンパク質配列に
対応する配列を有するタンパク質配列によってコードされる隣接した配列を含む
。好ましくは、隣接した配列は、少なくとも約６アミノ酸の長さ、より好ましく
は少なくとも約１０アミノ酸の長さ、なおより好ましくは、少なくとも約１５ア
ミノ酸の長さである。本発明の１つの実施形態においてそのペプチド抗原は、Ｇ
ｌｙＴ１輸送体またはＧｌｙＴ２輸送体のいずれかに対する抗体について選択性
である。

【００２４】なおさらに、本発明は、ＧｌｙＴ２特異的抗体を生成するためのＧｌｙＴ２輸
送体タンパク質の使用を提供する。

【００２５】（発明の詳細な説明）配列番号１１９および配列番号１２１の配列であるＧｌｙＴ２輸送体核酸配列
、または対応する、配列番号１２０および１２２のコードされたタンパク質配列
は、ＷＯ９８／０７８５４（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６３７）に開示されたヒト
ＧｌｙＴ２輸送体配列およびＬｕｉ、Ｑ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６８：２２８０２〜２２８０８（１９９３）に開示されるラットＧｌｙＴ２輸送
体配列のアナログである。配列番号１１９のＧｌｙＴ２の核酸配列は、全長ヒト
ＧｌｙＴ２輸送体にわたる、６つのＰＣＲ増幅ｃＤＮＡフラグメント（図１のフ
ラグメントＡ〜Ｆ）の連結により調製される全長ヒトＧｌｙＴ２輸送体ｃＤＮＡ
の核酸配列である。配列番号１２１のＧｌｙＴ２核酸配列は、全長ヒトＧｌｙＴ
２輸送体のコンセンサス核酸配列を示す。ここで、このコンセンサス配列は、全
長ＧｌｙＴ２輸送体の配列にわたる種々のＰＣＲ増幅フラグメント（図１のフラ
グメントＡ〜Ｆ）のそれぞれの少なくとも８つのクローンの配列分析により誘導
される。さらなる核酸配列および対応するコードされたタンパク質配列は、フラ
グメントＡ〜Ｆのそれぞれの８つのクローンの配列を示す、配列番号２２〜１１
８に示される。これらの核酸配列は、コンセンサス配列からのさらなる改変体を
示し、そしてこれらのクローンを生成するために用いられたプールされたｍＲＮ
Ａサンプルから誘導されたｃＤＮＡ内に存在する対立遺伝子改変体を最もよく反
映するようである。

【００２６】まとめれば、本明細書において単離されたヒトＧｌｙＴ２輸送体をコードする
種々の核酸配列は、以下の配列改変体を示す：

【００２７】

【表１】この改変体の供給源に関係無く、アミノ酸配列における点改変は（終止コドンの
挿入を除いて）、ＧｌｙＴ２輸送体活性の機能に有害に影響しないと考えられて
いる。

【００２８】上記のバリエーションは、主にヒト個体間のバリエーションを反映する。上記
の核酸配列を生成するために用いられる物質は、一般に６９、９２、および９２
の個体の３つのプール、ならびに個体由来の細胞株を含んだ。プールされた供給
源物質の使用は、保存された置換、またはサイレント置換の数と共に、バリエー
ションがヒト由来のバリエーションを反映するという結論を支持する。

【００２９】配列番号１２１のヒトヌクレオチド配列とＧｌｙＴ２に関するラットヌクレオ
チド配列との間、ならびにそれらがコードする配列の間の関係は、以下の表に示
される。これらの表に示される関係の値または配列同一性は、ＬＡＳＥＲＧＥＮ
Ｅコンピュータープログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ
Ｉ）を使用して決定された。

【００３０】

【表２】配列番号１１９のヒトＧｌｙＴ２輸送体核酸配列とＧｌｙＴ２輸送体に関する
ラットヌクレオチド配列との間の関係、およびそれらの対応するタンパク質配列
を決定した。このヒトＧｌｙＴ２輸送体配列は、ラットＧｌｙＴ２配列（Ｌｉｕ
，Ｑ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８０２−２２８０６（１
９９３））と、非常に高い相同性を示した。これは、ヌクレオチドおよびアミノ
酸のレベルで、それぞれ、約８８％および約９３％である、２つの種の間の全体
の相同性を有する。このヒトＧｌｙＴ２輸送体配列およびアミノ酸輸送体ファミ
リーの他のメンバーの配列は、約５０％のアミノ酸相同性を共有する。ラットＧ
ｌｙＴ２タンパク質とヒトＧｌｙＴ２タンパク質との間の最も高い多様性は、最
初の１９０アミノ酸の中にあり、ここで、約７４％の保存のみが観察される。

【００３１】配列同一性は、当該分野で公知のように、配列を比較することにより決定され
るような、特に、このような配列のストリング（ｓｔｒｉｎｇ）間の一致により
決定されるような２つ以上のポリペプチド配列、または２つ以上のポリヌクレオ
チド配列の間の関係である。配列同一性、または同一性％、もしくは相同性％は
、公知の方法により容易に計算される

【００３２】

【表３】。２つの配列の間の同一性を測定するための多数の方法が存在するが、この用語
は当業者に周知である（例えば、ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、前出；ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓ
ｉｓＰｒｉｍｅｒ，前出；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ
，Ｄ．，ＳＩＡＭ，Ｊ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．４８：１０７３（１９８８
）を参照のこと）。配列間の同一性を決定するために一般的に用いられる方法と
しては、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、前出、またはＮｅｅ
ｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４
４５（１９７０）に開示されるもの（ここで、パラメーターは、ＤＮＡＳＩＳの
バージョン２（ＨｉｔａｃｈｉＳｏｆｔｗａｒｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｃｏ．，ＳａｎＢｒｕｎｏ，ＣＡ）において設定されるのと同じである）が挙
げられるが、これらに限定されない。同一性を決定するためのコンピュータープ
ログラムは、公的に利用可能である。２つの配列の間の同一性を決定するための
好ましいコンピュータープログラム方法としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない：ＬＡＳＥＲＧＥＮＥプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ
．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２（１）：３８７（
１９８４）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕ
ｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）
）。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ（ｂｌａｓｔ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃ
ｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩＮＬＭＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９
４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、前出）から公的に利用可能である。

【００３３】本明細書中に記載されるヒトＧｌｙＴ２輸送体配列は、ＷＯ／９８／０７８５
４（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６３７）に記載されるｐＨＧＴ２−ａおよびｐＨＧ
Ｔ２−ｂヒトＧｌｙＴ２輸送体配列と異なる。差異は、核酸配列およびアミノ酸
配列において、それぞれ、以下のように示される：

【００３４】

【化７】差異はまた、対立遺伝子改変体において、以下のアミノ酸配列：

【００３５】

【化８】および以下のヌクレオチド：

【００３６】

【化９】について示される。

【００３７】（グリシン輸送体をコードする核酸）天然に存在しないグリシン輸送体コード核酸を構築するため、ネイティブの配
列が、開始点として用いられ得、かつ特定の要求を満たすように改変され得る。
例えば、この配列は、有用な制限酵素部位を組み込むように変異され得る。Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１
９８９）を参照のこと。このような制限部位を用いて、カセット、または制限酵
素および連結反応を用いて容易に置換される核酸配列の領域を作成し得る。この
カセットを用いて、変異したグリシン輸送体アミノ酸配列をコードする合成配列
を置換する（例えば、Ｇｏｅｄｄｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，７６：１０６−１１０（１９７９）を参照のこと）。組換え発現目的
のために、このような核酸が発現される生物に優先的なコドンの使用は、合成グ
リシン輸送体コード核酸を設計することにおいて、有利であると考えられている
。例えば、原核生物コドンの使用頻度（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を組み込んでい
る核酸配列は、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｐｌｙ
ｍｏｕｔｈ，ＭＮ）から入手可能な、Ｏｌｉｇｏ−４のようなソフトウェアプロ
グラムを用いて、哺乳動物由来配列から設計され得る。

【００３８】本発明の核酸配列の実施形態は、好ましくは、デオキシリボ核酸配列であり、
好ましくは二重鎖デオキシリボ核酸配列である。しかし、これらはまた、リボ核
酸配列であり得る。

【００３９】多数の方法が、タンパク質をコードする核酸配列から配列を欠失させること、
または核酸配列を変異させること、およびこれらの欠失または変異した配列によ
りコードされるタンパク質の機能を確認することが知られている。従って、本発
明はまた、グリシンに特異的に結合し、かつグリシンを膜を越えて輸送する能力
を保持するタンパク質をコードするヒト核酸配列の変異したまたは欠失したバー
ジョンに関する。これらのアナログは、ＧｌｙＴ２機能が保持される限り、Ｎ末
端欠失、Ｃ末端欠失、または内部欠失を有し得る。ヒトＧｌｙＴ２タンパク質配
列を保持することは、１つ以上の以下：

【００４０】

【化１０】の置換を有する以外、配列番号１２０または配列番号１２２のタンパク質配列に
関して、好ましくは、約４を超えないアミノ酸バリエーション、好ましくは、２
を超えないアミノ酸バリエーション、より好ましくは、１を超えないアミノ酸バ
リエーションを有する。より好ましくは、このバリエーションは、配列番号１２
０または配列番号１２２、なおより好ましくは、配列番号１２０のタンパク質配
列に関する。１つの好ましい実施形態において、本発明のタンパク質の実施形態
は、配列番号１２０または配列番号１２２のタンパク質配列に関して定義される
か、または１つ以上の以下：

【００４１】

【化１１】の置換を有する以外、配列番号１２０または配列番号１２２のタンパク質配列に
対応する配列を用いて定義される。点バリエーションは、好ましくは保存された
点バリエーションである。好ましくは、アナログまたは改変体は、配列番号１２
２のタンパク質配列、またはまたは１つ以上の以下：

【００４２】

【化１２】の置換を有する以外、配列番号１２２のタンパク質配列に対応する配列に対して
、少なくとも約９６％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９７％、より好ま
しくは少なくとも約９８％、なおより好ましくは９９．５％を有する。より好ま
しくは、このバリエーションは、配列番号１２０または配列番号１２２、なおよ
り好ましくは、配列番号１２０のタンパク質配列に関する。変異アプローチまた
は欠失アプローチは、ヒトＧｌｙＴ２タンパク質を発現する本発明の核酸配列の
全てに適用され得る。上記のように、保存的変異が好ましい。このような保存的
変異は、以下の群の１つの中で、あるアミノ酸を別のアミノ酸に変換する変異を
含む：１．低分子脂肪族、無極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈ
ｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；２．極性、負に荷電する残基、およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｕおよびＧｌｎ；３．極性、、正に荷電する残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；４．高分子脂肪族、無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙ
ｓ；および５．芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。保存的バリエーションの好ましい一覧は以下である：

【００４３】

【表４】選択されるバリエーションの型は、Ｓｈｕｌｚら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆ
ＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１
９７８）により開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸バリエーシ
ョンの頻度の分析、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１３：２１１（１９７４）およびＡｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７：４５−１４９
（１９８７）により開発された構造形成能の分析、ならびにＥｉｓｅｎｂｅｒｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１４０−１４４（
１９８４）、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７
５：１０５−１３２（１９８１）およびＧｏｌｄｍａｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：３２１−３５３（１９８６）により開発された
タンパク質における疎水性パターンの分析に基づき得る。

【００４４】本明細書中で同定された種々のヒトＧｌｙＴ２ｍＲＮＡの間のアミノ酸置換
を作製する同定された点バリエーションは、機能的なＧｌｙＴ２分子を作製する
のに有用であると考えられるので、これらの点バリエーションの全ての組み合わ
せを組み込むタンパク質は、機能的であると考えられる。これらのバリエーショ
ンは、本発明の範囲内である。

【００４５】本出願の目的のために、本発明の核酸は、それが由来する細胞または組織の他
の高分子から分離されている場合、精製または単離される。好ましくは、この核
酸を含む組成物は、核酸含量に関して、供給源の組成物よりも、少なくとも約１
０倍富化される。好ましくは、この核酸は、実質的に純粋（これは、他の核酸に
関して少なくとも約６０％ｗ／ｗ、より好ましくは約８０％、なおより好ましく
は約９０％、さらにより好ましくは約９５％の純度を意味する）である。

【００４６】（ハイブリダイゼーションプローブ）グリシン輸送体に関する核酸配列の、多くの欠失アナログまたは変異アナログ
は、グリシン輸送体をコードする核酸についての有効なハイブリダイゼーション
プローブであることが認識される。従って、本発明は、このようなグリシン輸送
体をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核
酸配列に関する。好ましくは、この核酸配列は、配列番号１２１の核酸配列とハ
イブリダイズするか、または以下のうちの１つ以上の置換によりこの核酸配列か
ら変化する核酸配列とハイブリダイズする：

【００４７】

【化１３】。１つの実施形態において、本発明の核酸（または機能的等価物）の実施形態は
、配列番号１２１の核酸配列、または以下のうちの１つ以上の置換によりこの核
酸配列から変化する核酸配列に対して規定される：

【００４８】

【化１４】ストリンジェントな条件とは、実質的に関連する核酸配列のハイブリダイゼー
ションを可能にする条件をいう。例えば、このような条件は、一般的に、少なく
とも約８５％配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約９５％配列同一性を有する配列のハイブリダイゼーションを
可能にする。このようなハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９８９）
により記載される。ハイブリダイゼーション条件およびプローブは、ヒト由来の
プローブの選択的ハイブリダイゼーションを達成するように、十分に特徴付けら
れた様式で調節され得る。

【００４９】グリシン輸送体をコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする核酸分子は、上記に概略した方法を使用してか、または例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ
（１９８９）に概説されるハイブリダイゼーションの法則を使用することによっ
て、機能的に同定され得る。

【００５０】限定することなく、ハイブリダイゼーションプローブについての使用の例とし
は、以下が挙げられる：組織化学的使用（例えば、ヒトＧｌｙＴ２輸送体を発現
する組織を同定すること、例えば、異常なレベルのグリシン輸送体を発現するサ
ンプルの組織型を同定するかまたは細胞を同定するためにｍＲＮＡのレベルを測
定すること、およびこのグリシン輸送体における多型を検出すること）が挙げら
れる。ＲＮＡハイブリダイゼーション手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９８９）において記載される
。

【００５１】（ＰＣＲプライマー）ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)プライマーを設計するための法則は、ＰＣＲ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１
９９１）により概説されるように、現在確立されている。縮重プライマー（すな
わち、所定の配列位置で不均一である調製物）が、ヒトＧｌｙＴ２核酸と非常に
相同であるが同一ではない、核酸配列を増幅するために設計され得る。公知の配
列と特異的にハイブリダイズするのに必要なプライマーのうちの１つのみを可能
にするストラテジーが、現在利用可能である。Ｆｒｏｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８（１９９８）およびＬｏｈら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：２１７（１９８９）を参照のこと。例えば、適切な
核酸プライマーが、増幅されるように努力される核酸に連結され得るか、または
このプライマーのうちの１つについてのハイブリダイゼーションパートナーを提
供し得る。この様式において、このプライマーのうちの１つのみが、増幅される
ように努力される核酸の配列に基づく必要がある。

【００５２】核酸を増幅するＰＣＲ方法は、少なくとも２つのプライマーを利用する。これ
らのプライマーのうちの一方は、増幅されるべき核酸の第１の鎖にハイブリダイ
ズし得、そして第１の方向で酵素に駆動される核酸合成をプライムし得る。もう
一方は、この第１の鎖の相互（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）配列（増幅されるべき配
列が単一の鎖である場合は、この配列は最初は仮想的であるが、第１の増幅サイ
クルにて合成される）にハイブリダイズし得、そしてこの第１の方向と反対の方
向でこの鎖からそして第１のプライマーのハイブリダイゼーション部位へ向かっ
て、核酸合成をプライムし得る。このような増幅を、特に好ましいストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下で実行するための条件は、周知である。例
えば、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照のこと。

【００５３】（ベクター）適切な発現ベクターは、宿主細胞において含まれるＧｌｙＴ２をコードするＤ
ＮＡの発現を助成し得、この宿主細胞は、真核生物、真菌、または原核生物であ
り得る。適切な発現ベクターとしては、数ある中で、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＲＣ／ＲＤＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＺａｐＥｘｐｒｅｓｓ
Ｖｅｃｔｏｒ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＢｋ／ＣＭＶベクターまたはｐＢｋ−ＲＳＶベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋／− Ｐｈａ
ｇｅｍｉｄＶｅｃｔｏｒｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＬａｃＳｗｉｔｃｈ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＫＳＶ１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＣＲｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐ
ＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）が挙げられる。有用な酵母発現系としては
、ｐＹＥＵｒａ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。有用なバキュロウイルス
ベクターとしては、Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）からの
いくつかのウイルスベクター（例えば、ｐＶＬ１３９３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢ
ｌｕＢａｃ２、ｐＢｌｕＢａｃＨｉｓＡ、ｐＢｌｕＢａｃＨｉｓＢまたはｐ
ＢｌｕＢａｃＨｉｓＣおよびｐｂａｃＰＡＣ６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）が挙
げられる。

【００５４】（細胞）本発明に従って、グリシン輸送体は、好ましくは哺乳動物細胞株において、好
ましくは樹立された細胞培養経歴を有する形質転換細胞株またはトランスフェク
トされた細胞株において、発現される。本発明はさらに、上記のようなヒトＧｌ
ｙＴ２輸送体をコードするベクターまたは核酸配列で形質転換またはトランスフ
ェクトされた、細胞を提供する。１つの実施形態において、この細胞は、細菌細
胞または真核生物細胞である。好ましくは、この細胞は、哺乳動物細胞であり、
ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＬＭ（ｔｋ^-）、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、
Ｒａｔ−１およびＮＩＨ３Ｔ３が挙げられる。より好ましくは、この細胞は、Ｃ
ＯＳ−７細胞株由来の細胞である。使用され得るなお他の細胞としては、昆虫細
胞（例えば、ショウジョウバエ細胞）、魚類細胞、両生類細胞および爬虫類細胞
が挙げられる。

【００５５】本発明に従って、グリシン輸送体活性を有するＧｌｙＴ２輸送体タンパク質を
コードする、外因的に由来する核酸を含む、細胞が提供される。外因的に由来す
る核酸は、細胞中で見出される核酸であって、その細胞、その細胞の親または祖
先、あるいはその細胞が由来するトランスジェニック動物細胞に、組換え技術を
介して導入された核酸である。また、ＤＮＡ構築物を介してＧｌｙＴ２輸送体を
通常は発現しない細胞に導入された場合にその細胞に内在する遺伝子からＧｌｙ
Ｔ２輸送体タンパク質が発現される配列（標的配列、調節配列、エキソンおよび
スプライスドナー配列を含む）をコードして、ＧｌｙＴ２輸送体タンパク質をコ
ードしない、外因的に由来する核酸もまた、本発明により意図される（例えば、
米国特許第５，７３３，７６１号；同５，７３３，７４６号；同５，６４１，６
７０号を参照のこと）。

【００５６】（ヒトＧｌｙＴ２輸送体）本発明はさらに、タンパク質に関して少なくとも約８０％、より好ましくは少
なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％まで精製または単離され
た、本発明の核酸のいずれかによりコードされる、精製または単離されたヒトＧ
ｌｙＴ２輸送体を提供する。これらの純度は、本発明による組換え細胞の溶解物
を用いて、下記の方法を含むがこれらに限定されない、種々のタンパク質精製方
法により達成され得る。

【００５７】上記の段落のヒトＧｌｙＴ２改変体は、ヒトＧｌｙＴ２活性を産生する生物ま
たは細胞を作製するために使用され得る。関連する分子生物学の方法を含む精製
方法が、以下に記載される。

【００５８】（グリシン輸送体を産生する方法）本発明の核酸のうちの１つの指向のもとで生物により合成されるポリペプチド
を単離する１つの簡単な方法は、その融合パートナーが容易にアフィニティー精
製される融合タンパク質を組換え発現することである。例えば、この融合パート
ナーは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼであり得、これは、商業的な発現
ベクター（例えば、ベクターｐＧＥＸ４Ｔ３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ、ＮＪより入手可能））上にコードされる。次いで、この融合タンパ
ク質は、グルタチオンアフィニティーカラム（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐ
ｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙより入手可能なもの）上で精製され
得る。さらなる融合パートナーは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ、ＣＡ）より販売される種々の発現ベクターにおいて利用可能である。も
ちろん、この組換えポリペプチドは、このような融合パートナーを用いることな
く、ＧｌｙＴ２に結合する適切な抗体を使用して、アフィニティー精製され得る
。このような抗体を産生する方法は、本明細書中のＧｌｙＴ２発現系の十分な記
載および公知の抗体産生方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＳｈｏｒｔＰｒｏ
ｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）を参照のこと）を考慮して
、当業者に利用可能である。融合タンパク質が使用される場合、この融合パート
ナーは、この融合パートナーとＧｌｙＴ２との間のリンカーのような、非構造領
域を優先的に攻撃する、部分的タンパク質分解性消化アプローチにより除去され
得る。このリンカーは、例えば、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ１３：２１１（１９７４）ならびにＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、
Ａｄｖ．ＩｎＥｎｚｙｍｏｌ４７：４５〜１４７（１９７８）により開発さ
れた２次構造形成能力についての法則を使用して、構造（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）
を欠くように設計され得る。このリンカーはまた、プロテアーゼ標的アミノ酸（
例えば、アルギニン残基およびリジン残基（このアミノ酸は、トリプシンにより
切断される部位を規定する）、あるいは例えば、エンテロキナーゼの標的配列（
例えば、ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ）（これは、リジン残基の後ろで切断
される））を組み込むように設計され得る。このリンカーを作製するために、オ
リゴヌクレオチドを作製するための標準的合成アプローチが、標準的サブクロー
ニング方法論をともに使用され得る。ＧＳＴに加えて、他の融合パートナーが、
使用され得る。真核生物細胞（特に、哺乳動物細胞）を利用する手順が好ましい
。なぜなら、これらの細胞は、ネイティブなタンパク質と非常に類似するかまた
は機能的に同一である分子を作製するように、このタンパク質を翻訳後修飾する
からである。

【００５９】さらなる精製技術が適用され得、この技術としては、以下が挙げられるが、限
定はしない：分離用電気泳動、ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ
、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＨＰＬＣ（例えば、ゲル濾過カラム、逆相カラムまたは軽度
に（ｍｉｌｄｌｙ）疎水性のカラムを使用する）、ゲル濾過、示差的沈殿（例え
ば、塩析沈殿）、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマト
グラフィー。

【００６０】ＧｌｙＴ２は膜タンパク質であり、関連する輸送体タンパク質に対する類推に
より、１２個の膜貫通配列を有すると考えられるので、単離法はしばしば、この
タンパク質の適切な２次構造および３次構造を維持するために、界面活性剤（一
般的には、非イオン性界面活性剤）を利用する（例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｃｏｒｃ
ｕｅｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２４８０９〜２４８１４（１９
９１）を参照のこと）。可溶化した輸送体を膜へ再組み込みするための方法の記
載について、例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｃｏｒｃｕｅｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６６；２４８０９〜２４８１４（１９９１）を参照のこと。

【００６１】ＧｌｙＴ２の単離は、ＧｌｙＴ２を発現するように形質転換された細胞から膜
を単離することを包含する。好ましくは、このような細胞は、十分なコピー数で
ＧｌｙＴ２を発現し、その結果、膜画分中のＧｌｙＴ２の量は、天然にＧｌｙＴ
２を発現する細胞からの匹敵する膜に見出される量よりも、少なくとも約１０倍
高く、より好ましくは、この量は、少なくとも約１００倍高い。

【００６２】好ましくは、このタンパク質は実質的に純粋である。これは、他のタンパク質
に関して、少なくとも６０％重量／重量の純度を意味する。この適用の目的のた
めに、ＧｌｙＴ２が、由来する細胞または組織の、他のタンパク質または他の高
分子から分離された場合に、このＧｌｙＴ２は、精製または単離される。好まし
くは、ＧｌｙＴ２を含む組成物は、その供給源細胞の組成に対して、タンパク質
含量に関して、少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約１００倍濃縮され
る。

【００６３】（ＲＮＡ挿入によるＧｌｙＴ２の発現）ヒトＧｌｙＴ２は、ｍＲＮＡを細胞に挿入するという簡単な方法により発現さ
れ得ることが、認識される。これらに使用のためのＲＮＡは、ＧｌｙＴ２活性を
有するタンパク質をコードする核酸を、高効率インビトロ転写のためのプロモー
ター（例えば、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼプロモーター）を含むベクター中にサブクローニングすることにより
調製され得る。このベクターからのＲＮＡ産生は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、
ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）、１０
−６３〜１０−６５頁に記載される方法を用いて実行され得る。Ｘｅｎｏｐｕｓ
由来の卵母細胞へのＲＮＡの挿入は、例えば、Ｌｉｕら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅ
ｒｓ３０５：１１０〜１１４（１９９２）およびＢａｎｎｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｃｈｅｍ５４：７０６〜７０８（１９９０）に記載される。

【００６４】あるいは、ヒトＧｌｙＴ２は、ｍＲＮＡを、膜含有翻訳系であり得るインビト
ロ翻訳系に挿入する単純な方法によって発現され得ることが、認識される。イン
ビトロでのタンパク質の発現は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＳｈｏｒｔＰｒ
ｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉ
ｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）１０−６３〜１０−６５
頁に記載される。また、Ｇｕａｓｔｅｌｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１３
０３〜１３０６（１９９０）（輸送体のインビトロ発現）を参照のこと。インビ
トロで膜タンパク質を産生する亜細胞（ｓｕｂｃｅｌｌｕａｒ）膜様物質の使用
は、ＷａｌｔｅｒおよびＢｌｏｂｅｌ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９６：８４
（１９８３）（ウサギ網状赤血球翻訳系について）およびＳｐｉｅｓｓおよびＬ
ｏｄｉｓｈ、Ｃｅｌｌ４４：１７７（１９８６）（コムギ胚芽翻訳系について
）に記載される。

【００６５】（因子を特徴付けるかまたは同定する方法）神経系の障害または状態と関連した疾患または状態の処置のための生物活性因
子を分析するための方法またはそれについてのスクリーニングのための方法は、
第１の細胞および第２の細胞を別々に培養する工程を包含し、ここでこの第１の
細胞および第２の細胞は、好ましくは同じ種であり、より好ましくはその同じ系
統であり、そして本明細書中に記載されるようなグリシン輸送体をコードする外
因性核酸を含む。因子が処置に使用され得る神経系の障害または状態は、（ａ）
疼痛、（ｂ）ミオクローヌス、（ｃ）筋痙攣、（ｄ）筋機能亢進、（ｅ）癲癇、
あるいは（ｆ）痙性（例えば、発作、頭部外傷、ニューロン細胞死、多発性硬化
症、脊髄損傷、失調症、ハンティングトン病、または筋萎縮性側索硬化症と関連
するもの）を含むが、これらに限定されない。この方法では、第１の細胞は、グ
リシンの存在下で生物活性因子または予期される生物活性因子と接触され、この
因子は、好ましくは、化合物（例えば、ペプチドまたは有機化合物）であり、好
ましくは、放射性同位体（例えば、³Ｈまたは¹⁴Ｃ）を取り込む。次いで、接触
された第１の細胞は、化合物と接触しなかった第２の細胞（すなわち、コントロ
ール細胞）中へのグリシンの輸送と比較して、第１の細胞中へのグリシンの輸送
の増強または阻害について試験される。このような分析またはスクリーニングは
、好ましくは、認識、学習、発見、決定、同定、または確認の活動を含む。

【００６６】あるいは、このアッセイは、細胞の代わりに単離されたＧｌｙＴ２輸送体を含
む組成物を利用し得る。好ましくは、単離された輸送体のこのような調製は、膜
または脂質二重層を、好ましくは小胞中に含み、この小胞は、輸送が測定され得
る内側および外側を有する。例えば、Ｋａｎｎｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１７：１２０７〜１２１１、１９７８を参照のこと。

【００６７】生物活性因子は、細胞、ウイルス、組織、器官または生物に対して作用し得る
物質（例えば、化学物質）であり、細胞、ウイルス、器官または生物の機能にお
ける変化を生成する薬物（例えば、薬剤）を含むが、これらに限定されない。好
ましくは、この生物は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。本発明の好まし
い実施形態において、本発明の生物活性因子を同定する方法は、約１５００未満
の分子量を有する有機分子に適用される。予期される生物活性因子は、それがグ
リシン輸送に影響するか否かを決定するために、本発明のスクリーニング方法に
よって試験されている物質である。

【００６８】生物活性因子は、試験の終了時に、細胞内グリシン、小胞内グリシン、または
そうでなければ輸送されたグリシンの量が、その因子と接触していない組成物に
おけるよりも、その因子に接触した組成物において大きい場合に、グリシン輸送
取り込みのエンハンサーであり；逆に、生物活性因子は、細胞内グリシンまたは
小胞内グリシンの量が、その因子に接触した組成物と比較して因子と接触してい
ない組成物において大きい場合に、グリシン輸送のインヒビターである。好まし
くは、試験された第１の組成物とコントロールの第２の組成物との間のグリシン
取り込みにおける差異は、少なくとも約２倍であり；より好ましくは、この差異
は、少なくとも約５倍であり；最も好ましくは、この差異は、少なくとも約１０
倍以上である。

【００６９】ＧｌｙＴ２輸送体に関してインヒビターまたはエンハンサーである生物活性因
子は、別のグリシン輸送体（例えば、ＧｌｙＴ１輸送体のうちの１つ）と中立の
効果または反対の効果を有し得る。好ましい生物活性因子は、ＧｌｙＴ２輸送体
を増強または阻害する特異性を有し、そして他のグリシン輸送体に対して中立の
効果または無視可能な効果を有する。好ましくは、生物活性因子は、第２のグリ
シン輸送体に対するその効果と比較して、ＧｌｙＴ２輸送体により媒介されるグ
リシン取り込みを阻害または活性化する際に、濃度依存性パラメーター（例えば
、ＩＣ₅₀値）において反映される、少なくとも一桁より大きな効力の強度を有す
る。より好ましい因子は、他方と比較して、このグリシン輸送体の１つに対して
、少なくとも約１００倍大きな効力を有する。

【００７０】この生物活性因子は、その因子がグリシン輸送体と接触するように拡散するこ
とを可能にする形式において、グリシン輸送体に提示され得る、任意の化合物、
物質、組成物、混合物、または化学物質であり得る。このような生物活性因子は
、好ましくは長さが２〜約２５個までのアミノ酸、より好ましくは２〜約１０個
、なおより好ましくは長さが２〜約５個のアミノ酸のポリペプチドを含むが、こ
れらに限定されない。本発明の状況における他の適切な生物活性因子は、好まし
くは、約１００ダルトンと約５，０００ダルトンとの間の分子量の小さな有機化
合物を含み、そしてアルキル、アリール、アルケン、アルキン、ハロ、シアノ、
および他の基（ヘテロ原子を含むかまたは含まない）のような官能基から構成さ
れる。このような有機化合物は、糖質（単糖を含む）、アミノ酸またはイミノ酸
、核酸、ステロイド、および他のものであり得る。予期される生物活性因子とし
て試験される化学物質は、当該分野において公知のコンビナトリアル化学プロセ
スまたは化学合成についての従来の手段を使用して、調製され得る。好ましくは
、生物活性因子は、神経系の障害または状態の処置のための薬物として有用であ
る。

【００７１】ＧｌｙＴ１またはＧｌｙＴ２媒介性輸送を阻害するいくつかの化合物はまた、
ストリキニーネ感受性レセプター上のグリシン結合部位、またはＮＭＤＡレセプ
ター上のグリシン結合部位に結合する。ストリキニーネ感受性レセプターへのこ
のような結合は、例えば、放射性標識されたストリキニーネがストリキニーネ感
受性レセプターの調製物（脊髄組織または脳幹組織からの膜画分から調製され得
るような）と接触して置かれる結合アッセイによって、同定され得る。膜画分は
、従来の手段（例えば、ホモジネーションおよび遠心分離の方法を含む）を使用
して調製され得る。

【００７２】ＮＭＤＡレセプターへのこのような結合は、例えば、放射性標識されたグリシ
ンがＮＭＤＡレセプターの調製物（ニューロン細胞または脳組織からの膜画分か
ら調製され得るような）と接触して置かれる結合アッセイによって、同定され得
る。Ｇｒｉｍｗｏｏｄら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：９２３〜９
３０（１９９２）。このような膜に位置するＮＭＤＡレセプターは、任意の内因
性グリシンまたはグルタミン酸塩を除去するために、軽度の界面活性剤（例えば
、約０．１％〜約０．５％のサポニン）を使用して処理される。

【００７３】このような結合アッセイに使用されるリガンドは、任意の検出可能な同位体（
例えば、炭素または水素の放射性同位体）で放射性標識される。次いで、放射性
標識リガンドの特異的結合は、その放射性標識リガンドの結合全体（すなわち、
特異的および非特異的）に起因する放射活性から、非特異的結合に起因する放射
活性を差し引くことによって決定される。非特異的結合に起因する放射活性は、
放射性標識リガンドおよび有意に過剰な非放射性標識リガンド（例えば、１００
倍過剰）の両方と接触された、ストリキニーネ感受性膜画分またはＮＭＤＡレセ
プター含有膜画分と関連した放射性標識の量を測定することによって、決定され
る。放射性標識リガンドの結合全体に起因する放射活性は、非放射性標識リガン
ドの非存在下で、レセプター調製物に結合した放射性標識の量を測定することに
よって決定される。ＮＭＤＡレセプターについては、アミノ酸の標識されたアナ
ログ（例えば、ジクロロキヌレン酸またはＬ−６８９，５６０など）を使用して
、このレセプター上のグリシン部位への結合もまた測定し得る。例えば、Ｇｒｉ
ｍｗｏｏｄら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌ．４９：９２３〜９３
０（１９９２）を参照のこと。

【００７４】機能的イオンフラックスアッセイが、（ＮＭＤＡレセプター調製物について）
カルシウムフラックスまたは（ストリキニーネ感受性レセプター調製物について
）塩素フラックスを増強または阻害する際に、本発明によって同定される化合物
の効果を測定するために使用される。この試験は、膜結合ＮＭＤＡレセプターま
たはストリキニーネ感受性レセプターおよびグリシン輸送体を有する、細胞培養
物に対して実行される。このような細胞は、一般には、脳幹および脊髄の細胞を
含む、ニューロン細胞、およびそれに由来する細胞株、ならびにＮＭＤＡレセプ
ターもしくはストリキニーネ感受性レセプターを発現するように誘導もしくはト
ランスフェクトされている他の任意の細胞を含む。このような試験に使用される
カルシウムは、一般に、⁴⁵Ｃａ同位体であるが、他のカルシウム測定技術（例え
ば、カルシウム結合蛍光（これは、カルシウムキレート剤と結合する蛍光などで
あり得る）が、同様に使用され得る。このような試験に使用される塩素は、通常
は、同位体³⁶Ｃｌを含む。カルシウムまたは塩素がどの方法によってモニターさ
れるかに関わらず、イオンフラックスは、本発明の生物活性因子の別々の添加の
結果として、増強または阻害され得る。この系の利点は、ＮＭＤＡレセプターま
たはストリキニーネ感受性レセプターの機能に対する、レセプター上およびグリ
シン輸送体上の両方のグリシン部位と相互作用する化合物の正味の効果をモニタ
ーすることを可能にすることである。

【００７５】ストリキニーネ感受性レセプターアゴニストでもあるＧｌｙＴ２インヒビター
は、グリシン輸送体の阻害を介して、およびストリキニーネ感受性レセプター活
性の直接的な増強を介して、ストリキニーネ感受性レセプターを発現しているシ
ナプスにて、グリシン濃度を増大させることによって、上記の適応症において作
用する。ストリキニーネ感受性レセプターアンタゴニストでもあるグリシン輸送
体インヒビターは、それにもかかわらず、例えば、グリシン輸送阻害に起因する
グリシンにおける増大がストリキニーネ感受性レセプターアンタゴニスト作用に
勝る場合、これらの適応症を処置する際に.活性を保持し得る。ストリキニーネ
感受性レセプターアンタゴニスト活性が、グリシン輸送体の阻害から生じる細胞
外グリシンの増大の効果に勝る場合、これらの化合物は、筋肉活動の減少と関連
した状態（例えば、重症筋無力症）を処置する際に有用である。

【００７６】上記のように、本発明の生物活性因子は、多くの薬理学的作用を有し得る。こ
の化合物の相対的な有効性は、多くの様式において評価され得る。これらの様式
には、以下が挙げられる：１．ＧｌｙＴ１輸送体およびＧｌｙＴ２輸送体を介して媒介される活性の比較
。この試験は、（ａ）ＧｌｙＴ１輸送体に対してより活性であり、それによって
精神分裂病を処置または予防する際、認識を増大する際および記憶を増強する際
により有用である生物活性因子、あるいは（ｂ）ＧｌｙＴ２輸送体に対してより
活性であり、それによって癲癇、疼痛または痙性を処置または予防する際により
有用である生物活性因子、を同定する２．ストリキニーネ感受性レセプターまたはＮＭＤＡレセプターの結合につい
ての試験。この試験は、このような結合の薬理学的効果のさらなる試験を正当化
するに十分な結合がこの部位にて存在するかどうかを、確立する３．初代組織培養におけるイオンフラックス（例えば、ストリキニーネ感受性
レセプターにより媒介される塩素イオンのフラックス、またはＮＭＤＡレセプタ
ーにより媒介されるカルシウムイオンフラックス）を増強または減少する化合物
の活性の試験。イオンフラックスを増大させる生物活性因子は、（ａ）ストリキ
ニーネ感受性レセプターにてアンタゴニスト活性をほとんど有さないか、または
全く有さず、そしてＧｌｙＴ２輸送体阻害を介してグリシン活性の増強に影響し
ないか、あるいは（ｂ）ストリキニーネ感受性レセプターと直接的な相互作用を
ほどんど有さない比較Ｇｌｙ２インヒビターでの結果に対する、著しい増大が観
察される場合、この因子がレセプターアゴニストであるかのいずれかである。

【００７７】いくつかの場合、本発明の因子分析方法は、生物活性因子がＮＭＤＡレセプタ
ーおよびＧｌｙＴ１輸送体が関与する適応症を処置する際に有用であるか否かを
特徴付けるために使用される。この場合、一般に、ストリキニーネ感受性レセプ
ターおよびＧｌｙＴ２輸送体に関してより低い尺度の活性が、より所望される。

【００７８】（アンチセンス治療）本発明の１つの局面は、神経学的適応症（例えば、上記に同定される適応症）
を処置するためのアンチセンス核酸の使用に関し、この適応症としては、筋痙性
、発作、癲癇および多発性硬化症が挙げられるがこれらに限定されない。アンチ
センス治療は、ＧｌｙＴ２をコードするｍＲＮＡを結合するように設計されたア
ンチセンス分子（これは、このｍＲＮＡの翻訳を停止または阻害する）、あるい
はその転写を妨害するためにＧｌｙＴ２遺伝子に結合するように設計されたアン
チセンス分子の使用を、含む。転写を妨害するためにゲノムＤＮＡを結合するヌ
クレオチド配列を設計するための方法は、当該分野において公知である（例えば
、Ｈｅｌｅｎｅ、Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ６：５６
９（１９９１）を参照のこと）。一旦、結合されようとするｍＲＮＡの配列が既
知になると、ＤＮＡ二重らせんに類似の二重鎖構造を形成するように、ワトソン
−クリック塩基対合法則によってセンス鎖に結合するアンチセンス分子が、設計
される。ＧｅｎｅＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＡｎｔｉｓ
ｅｎｓｅＲＮＡａｎｄＤＮＡ、ＥｒｉｋｓｏｎａｎｄＩｘｚａｎｔ編
、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）；Ｈｅｌｅｎｅ、Ａ
ｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ６：５６９（１９９１）；Ｃ
ｒｏｏｋｅ、Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ６：６０９（
１９９１）。

【００７９】アンチセンス分子を細胞に効果的に導入して標的化ｍＲＮＡの翻訳またはＤＮ
Ａの機能を効果的に妨害することは、首尾よいアンチセンス治療に対する有意な
障壁のままである。この問題を克服するために使用されてきた１つの方法は、ア
ンチセンスポリ核酸分子の５’または３’末端を疎水性置換基で共有結合的に修
飾することである。疎水性置換基で修飾したそのような核酸は、一般的に、より
大きな効率を有する細胞内部への接近を獲得する（例えば、Ｂｏｕｔｏｒｉｎら
、ＦＥＢＥＳＬｅｔｔ．２３：１３８２−１３９０（１９８９）およびＳｈｅ
ａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：３７７７−３７８３（１９
９０）を参照のこと）。他の方法としては、以下が挙げられる：アンチセンス分
子のリン酸骨格を修飾して、負電荷を除去または減少させる方法（例えば、Ａｇ
ｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５：６２６８（１９８６）；Ｃａｚｅ
ｎａｖｅおよびＨｅｌｅｎｅ、ＡｎｔｉｓｅｎｃｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓａｎｄＡｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ，ＭｏｌおよびＶａｎｄｅｒＫｒｏｌ編、第７４頁（以下
参照）、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）を参照の
こと）、またはプリンもしくはピリミジン塩基を修飾する方法（例えば、Ｃａｚ
ｅｎａｖｅおよびＨｅｌｅｎｅ、ＡｎｔｉｓｅｎｃｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓａｎｄＡｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＭｏｌおよびＶａｎｄｅｒＫｒｏｌ編、第７４頁（以
下参照）、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）；Ｍｉ
ｌｌｉｇａｎら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＦｏｒＮｅｏｐｌａｓｔｉｃ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ＨｕｂｅｒおよびＬａｓｏ編、第２２８頁（以下参照）、Ｎ
ｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ
（１９９４）を参照のこと）。細胞貫入障壁を克服するためのさらなる方法とし
ては、低コピー数で細胞に挿入され得るが細胞において細胞機構を指向し得る、
いわゆる過剰発現ベクターにアンチセンスポリ核酸配列を取り込んで、さらなる
実質的な量のアンチセンスポリヌクレオチド分子を合成する方法が挙げられる（
例えば、Ｆａｒｈｏｏｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：２３
（１９９４）を参照のこと）。このストラテジーとしては、アンチセンス配列が
組み込まれている発現部位を有する組換えウイルスの使用が挙げられる（例えば
、Ｂｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．７１６：５９（１９９４）を参照のこと）。なお別の方法としては、アン
チセンス分子または他の核酸分子上の負電荷をポリカチオンで中和することによ
って、膜貫通性を増加する方法が挙げられる（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃｔｒｙ２７：８７７−８９２（１９９８）およびＢｅｈｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６９８２−６９８６
（１９８９）を参照のこと）。

【００８０】アンチセンス治療のような遺伝子治療は、宿主細胞へのアンチセンス発現ベク
ターの導入を含み得る。例えば、より多量に発現される場合、細胞から失われる
タンパク質の合成を指向し得るかまたは細胞もしくは生物に有用なＤＮＡベクタ
ーは、生物の１以上の細胞型に取り込まれ得る。ＤＮＡを細胞に導入して新たな
タンパク質またはより多量のタンパク質を産生するための方法は、トランフェク
ション法と呼ばれ、当該分野で一般的に公知である。一般的には、Ｎｅｏｐｌａ
ｓｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｓ，ＨｕｂｅｒおよびＬａｚｏ編、ＮｅｗＹｏｒｋ
ＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９４）；Ｆ
ｉｅｇｎｅｒ，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｂ．５：１６３（１９９０
）；ＭａｃＬａｃｈｌｉｎら、Ｐｒｏｇｒ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏ．３８：９１（１９９０）；Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｓ．Ｂｌｏｏｄ
７８：２４８１（１９９１）；ＥｉｎｅｒｈａｎｄおよびＶａｌｅｒｉｏ，Ｃｕ
ｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：２１７−２３５
（１９９２）；Ｍａｋｄｉｓｉら、Ｐｒｏｇ．ＬｉｖｅｒＤｉｓ．１０：１（
１９９２）；ＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１１３：２０１（１９９２）；Ｍｏｒｓｙら、Ｊ．Ａ．Ｍ
．Ａ．２７０：２３３８（１９９２）；Ｄｏｒｕｄｉら、ＢｒｉｔｉｓｈＪ．
Ｓｕｒｇｅｒｙ，８０：５６６（１９９３）を参照のこと。

【００８１】核酸を細胞に取り込むための他の一般的な方法としては、以下が挙げられる：
リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎｄｅｒＥｂ，Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ５２：４５６（１９８３））、核酸、ＤＥＡＥ−デキストランおよび細
胞の同時インキュベーション（ＳｏｍｐａｙｒａｃおよびＤａｎｎａ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２：７５７５（１９８１））、核酸の存在下
での細胞のエレクトロポレーション（Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：７１６１−７１６５（１９８４）、核酸をウイルス被覆
に取り込んでトランスフェクションビヒクルを作製すること（Ｇｉｔｍａｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：７３０９−７３１
３（１９８５））、および細胞をリポソームに取り込まれた核酸とともにインキ
ュベートすること（ＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．８４：７８５１−７８５５（１９８７））。アンチセンス治療を含む
遺伝子治療に対する別のアプローチは、目的の核酸を、後の宿主細胞への感染の
ために、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイル
スまたはレトロウイルス）に組み込むことである。例えば、Ａｌｋｉら、Ｎａｔ
ｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ３：２２４（１９９３）を参照のこと。

【００８２】本発明の核酸組成物は、例えば、経口的に、局所的に、直腸的に、膣的に、吸
入によって（例えば、エアロゾルの使用によって）、または非経口的に（例えば
、筋肉内的に）、皮下的に、腹膜内的に、脳室内的に、または静脈内的に投与さ
れ得る。核酸組成物は、単独で投与され得るか、または標準的な薬学的実施に従
って、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤と組み合わせられ得る。投与
の経口形式のために、核酸組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、粉
末、シロップ、エリキシル（ｅｌｉｘｅｒ）、水溶液および懸濁物などの形態で
使用され得る。錠剤の場合、使用され得るキャリアとしては、ラクトース、クエ
ン酸ナトリウム、およびリン酸塩が挙げられる。デンプンのような様々な崩壊剤
、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタ
ルクは、錠剤に一般的に使用される。カプセル形態における経口投与のために、
有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量のポリエチレングリコールである。
水性懸濁物が経口使用に必要な場合、核酸組成物は、乳化剤および懸濁剤と組み
合わせられ得る。所望であれば、特定の甘味料および／または矯味矯臭剤が添加
され得る。経口投与のために、結合体の滅菌溶液が通常調製され、そしてその溶
液のｐＨは、適切に調製されそして緩衝化される。静脈内使用のために、溶質の
総濃度は、等張性調製物を付与するために制御されるべきである。眼用（ｏｃｕ
ｌａｒ）投与のために、軟膏および滴下可能な（ｄｒｏｐｐａｂｌｅ）液体が、
アプリケーターまたは目薬のような当該分野で公知の眼用送達系によって送達さ
れ得る。このような組成物は、ムコ模倣物（例えば、ヒアルロン酸、硫酸コンド
ロイチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ（ビニルアルコール
））、保存剤（例えば、ソルビン酸、ＥＤＴＡまたはベンジルクロミウムクロリ
ド）、ならびに通常品質の希釈剤および／もしくはキャリアを含み得る。肺投与
のために、希釈剤および／またはキャリアは、エアロゾルの形成を可能にするに
適切であるように選択される。

【００８３】一般的には、核酸組成物は、有効な量（例えば、予防的または治療的に有効な
量）で投与される。薬学的使用のために、有効な量は、以下のいずれかに有効な
量である：（１）処置されるべきだと考えられる徴候の症状を予防、遅延、また
は減少する、あるいは（２）処置されるべきだと考えられる徴候を処置または予
防することに関連する薬理学的変化を誘導する。

【００８４】ウイルス遺伝子治療ベクターのために、アンチセンスオリゴヌクレオチド投薬
量は、一般的に、体重１ｋｇあたり、約１μｇから約１００ｍｇの核酸である。

【００８５】（自己免疫障害）抗体がグリシン輸送体に対して産生される自己免疫障害は、疾患状態と関連す
ることが予測され得る。例えば、ＧｌｙＴ２輸送体について、そのような障害は
、減少した筋肉活性、例えば、臨床的に重症筋無力症に酷似の症状を提示する減
少した筋肉活性に関連するか、または減少した疼痛認知と関連すると予測され得
る。神経伝達に関与する分子（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）に対する自己
抗体によって引き起こされる疾患の例については、Ｎａｔｈａｎら、Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ．Ｒｅｓ．４０：１３４−１３７（１９９５）を参照のこと。

【００８６】これらの抗体の存在は、本明細書中に記載される核酸または他に報告される関
連グリシン輸送体（例えば、Ｋｉｍら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：６
０８−６１７（１９９４）およびＬｉｕら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２
８０２−２２８０８（１９９２）を参照のこと）から得られたタンパク質配列を
使用する確立された免疫学的方法によって測定され得る。このような免疫学的方
法は、例えば、Ａｕｓｂｅｌら、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｈｏｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載される。

【００８７】（ＧｌｙＴ２特異的抗体を生成するためにＧｌｙＴ２輸送体タンパク質の使用
）本発明の目的のために、免疫グロブリン（例えば、抗体）は、特異的であるか
、結合する場合に抗原と反応するかもしくは抗原に結合するか、または標準的な
抗体−抗原もしくはリガンド−レセプターアッセイによって決定される場合にヒ
トＧｌｙＴ２輸送体を結合し得る。このようなアッセイの例としては、競合アッ
セイ、免疫細胞学アッセイ、飽和アッセイ、または標準的な免疫アッセイ（例え
ば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリーアッセイ）が挙げられる
。特異性のこの定義はまた、単一の重鎖および／もしくは軽鎖、ＣＤＲ、融合タ
ンパク質、または重鎖および／もしくは軽鎖のフラグメントに適用され、これら
は、ヒトＧｌｙＴ２輸送体単独を結合するか、または適切には相補的な可変領域
および定常領域を有する免疫グロブリンコンフォメーションに適切に取り込まれ
る場合、ヒトＧｌｙＴ２輸送体を結合し得る。

【００８８】ヒトＧｌｙＴ２輸送体に対するポリクローナル抗体は、ヒトＧｌｙＴ２輸送体
またはその免疫原性部分で動物を免疫することによって調製され得る。抗体の産
生のための動物を免疫する手段は、当該分野で周知である。例示の目的で、哺乳
動物は、ＧｌｙＴ２を含む種菌で注射され得る。ＧｌｙＴ２は、種菌単独に含ま
れ得るか、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリ
アタンパク質に結合体化され得る。ＧｌｙＴ２は、当該分野で周知のように、ア
ジュバントに懸濁されて、その免疫原性が増強され得る。次いで、免疫学的に活
性な抗体を含有する血清は、そのように免疫された動物の血液から、当該分野で
周知の標準的な手順を使用して産生され得る。

【００８９】ＧｌｙＴ２と特異的に免疫反応する抗体の同定は、そのような抗体を含有する
と予測される血清をＧｌｙＴ２に曝露して、抗体とｈＧｌｙＴ２との間で結合体
を形成することによってなされる。次いで、この結合体の存在は、当該分野で周
知の標準的な手順を使用して決定される。

【００９０】ＧｌｙＴ２はまた、ＧｌｙＴ２に対するモノクローナル抗体を調製するために
使用され得るか、またはスクリーニングアッセイとして、このようなモノクロー
ナル抗体を同定するために使用され得る。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５、（１９７５）に記載されるような標準的な
技術に従って詳細されるハイブリドーマから産生される。簡潔には、適切な哺乳
動物（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）は、ＧｌｙＴ２での注射によって免疫され
る。予め決定された時間の後、脾臓細胞がマウスから取り出され、そして細胞培
養培地に懸濁される。次いで、この脾臓細胞は、不死化細胞株と融合されて、ハ
イブリドーマが形成される。この形成されたハイブリドーマは、細胞培養で増殖
され、そしてＧｌｙＴ２に対するモノクローナル抗体を産生する能力についてス
クリーニングされる。

【００９１】本発明の免疫グロブリンは、マウス、ヒトまたは他の哺乳動物起源のＩｇＭま
たはＩｇＧアイソタイプのモノクローナル抗体（本明細書中以後、ＭｏＡｂｓと
称する）であり得る。最も好ましくは、このようなＭｏＡｂｓは、ヒトＧｌｙＴ
２輸送体タンパク質と反応する。ヒトに操作されるＭｏＡｂｓを産生するための
種々の方法は、当該分野で公知である（例えば、ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎ
ｅｅｒｔｉｎｇ，（第２版）Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．編、Ｏｘｆｏ
ｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５）を参
照のこと）。免疫グロブリンの他の形態は、当業者に周知の方法（例えば、実質
的に単一特異的な（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体集団を産生するためのポリ
クローナル血清のクロマトグラフィー精製）によって、産生され得る。

【００９２】ヒトＧｌｙＴ２輸送体抗原に対して特異的に指向されるモノクローナル抗体は
、免疫原の組み合わせを使用し、そして一般的にヒトＧｌｙＴ２輸送体抗原のみ
を有する抗原をスクリーニングすることによって、または抗ｈＧｌｙＴ２輸送体
モノクローナル抗体にのみ特異的であるように設計されたスクリーニングアッセ
イによって、得られ得る。例えば、ヒトＧｌｙＴ２輸送体に対して指向されるモ
ノクローナル抗体の産生は、以下によって達成され得る：（１）ヒトＧｌｙＴ２
輸送体抗原で免疫し、続いてヒトＧｌｙＴ２輸送体でトランスフェクトされた非
ヒト細胞株に対する反応性について得られたハイブリドーマをスクリーニングす
ること（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：７４７
−７５３（１９８８）に記載される様式と類似の様式で構築される）；（２）ヒ
トＧｌｙＴ２輸送体でトランスフェクトされた非ヒト細胞株で免疫し、続いてヒ
トＧｌｙＴ２輸送体抗原を発現するヒト細胞株に対する反応性について得られた
ハイブリドーマをスクリーニングすること；（３）ヒトｈＧｌｙＴ２輸送体を発
現するヒトまたは非ヒト細胞株で免疫し、続いて既存の抗ｈＧｌｙＴ２輸送体モ
ノクローナル抗体のヒト細胞株との反応性をブロックする能力について得られた
ハイブリドーマをスクリーニングすること；（４）ヒトＧｌｙＴ２輸送体を発現
するヒトまたは非ヒト細胞株で免疫し、続いて精製されたネイティブまたは組換
えヒトＧｌｙＴ２輸送体抗原との反応性について得られたハイブリドーマをスク
リーニングすること；あるいは（５）ヒトＧｌｙＴ２輸送体抗原の組換え誘導体
で免疫し、続いてヒトＧｌｙＴ２輸送体を発現するヒト細胞株に対する反応性に
ついて得られたハイブリドーマをスクリーニングすること。ＧｌｙＴ２に対して
指向されるモノクローナル抗体はまた、ヒトＧｌｙＴ２輸送体および／またはラ
ットＧｌｙＴ２輸送体に対する反応性、またはその反応性の欠如についてスクリ
ーニングされ得る。

【００９３】ヒト抗原に対するヒトＭｏＡｂの生成はまた、当該分野で公知である（例えば
、Ｋｏｄａら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ１（１）：１
５〜２２（１９９０）を参照のこと）。このようなＭｏＡｂの生成は、従来の技
術を用いて困難であり得る。従って、非ヒト抗体の抗原結合領域（例えば、Ｆ（
ａｂ’）₂または超可変領域（ＣＤＲ））を改変し、そしてこれらを組換えＤＮ
Ａ技術によってヒト定常領域（Ｆｃ）またはフレームワーク領域に融合して、実
質的にヒト分子を産生することが、所望され得る。

【００９４】あるいは、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５〜１２８１（１９
８９）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７（
１９９１）によって概説される一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞からＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングし、次いで、所望の特異性の抗体（または結
合フラグメント）をコードする配列をクローニングおよび増幅することによって
、ヒトＧｌｙＴ２輸送体に特異的に結合するヒトＭｏＡｂまたはその部分をコー
ドするＤＮＡ配列を単離し得る。

【００９５】特に本明細書に記載される免疫グロブリンに加えて、他の実質的に相同な、改
変された免疫グロブリンは、当業者に公知の種々の組換えＤＮＡ技術を利用して
容易に設計および製造され得る。免疫グロブリン遺伝子の改変は、種々の周知の
技術（例えば、部位特異的変異誘発（Ｇｉｌｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ８：８１〜
９７（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２８：７３１〜７３４
（１９８７）を参照のこと）によって容易に達成され得る。また、結合親和性抗
体に影響する改変は、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６０
０７〜１６０１０（１９９２）によって概説される一般的なプロトコルを使用し
て選択され得る。

【００９６】（免疫組織化学的目的および診断目的のためのＧｌｙＴ２特異的抗体の使用）本発明はまた、種々の免疫組織化学的目的および診断目的（競合アッセイ系お
よび非競合アッセイ系、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、イムノブ
ロッティングならびに単純な免疫細胞学的染色を含むがこれらに限定されない）
のための、上記で産生されたヒトＧｌｙＴ２特異的抗体の使用を提供する。いく
つかの競合アッセイにおいて、免疫グロブリン、抗体またはペプチドフラグメン
トが抗原に結合する能力は、その免疫グロブリン、抗体またはペプチドが、その
抗原を結合することが公知である化合物と競合する能力を検出することによって
決定される。多くの型の競合アッセイが公知であり、そして本明細書において考
察される。あるいは、インヒビターの非存在下において試験化合物の結合を測定
するアッセイもまた、使用され得る。例えば、分子または他の化合物がヒトＧｌ
ｙＴ２輸送体を結合する能力は、目的の分子を間接的に標識することによって検
出され得るか、または標識されなくてもよいし、そして種々のサンドウィッチア
ッセイ形式を使用して間接的に検出されてもよい。結合アッセイ（例えば、競合
結合アッセイ）の多くの型は、公知である（例えば、米国特許第３，３７６，１
１０号；米国特許第４，０１６，０４３号；およびＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）を参照のこ
と）。

【００９７】競合アッセイを使用するのではなく１つの成分単独に対する試験化合物の結合
を測定するためのアッセイもまた、利用可能である。例えば、免疫グロブリンは
、ヒトＧｌｙＴ２輸送体の存在を同定するために使用され得る。モノクローナル
抗体アッセイについての標準的な手順（例えば、ＥＬＩＳＡ）が、使用され得る
。使用され得る種々のシグナル産生系の総説については、米国特許第４，３９１
，９０４号を参照のこと。他のアッセイ形式は、抗原−抗体相互作用から生じる
種々の生理学的変化または化学的変化の存在または非存在の検出を包含し得る（
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ＥｆｆｅｃｔｏｒＣｏｕｐｌｉｎｇ−ＡＰｒａｃｔｉｃ
ａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｈｕｌｍｅ編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（
１９９０）を参照のこと）。

【００９８】（実施例１）（ヒト２型グリシン輸送体（ｈＧｌｙＴ２）のクローニング）（Ａ．ｈＧｌｙＴ２の第１鎖合成およびＰＣＲ）ｈＧｌｙＴ２のクローニングにおいて使用するｃＤＮＡを作製するために、第
１鎖合成を、５’−ＲＡＣＥシステム（Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）に記載される代替のプロトコル（ＧＣリッチな鋳型について）を使
用して達成した。簡潔には、ヒト脊髄ポリＡ⁺ ｍＲＮＡ（５０ｎｇ）（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を、３μｇのランダムプライマー（Ｇ
ｉｂｃｏＢＲＬ）に添加し、そして得られた混合物を、１０分間、７０℃で変
性させた。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ^TM ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒ
ｉｐｔａｓｅの添加後、反応を室温で５分間進行させ、続いて、４５℃で５０分
間インキュベーションさせた。

【００９９】ｃＤＮＡ反応物のＰＣＲ増幅を、Ｅｘｐａｎｄ^TM ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔ
ｙＰＣＲシステム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）を使用して達成した。このシステムは、ＴＡＱおよびＰｗｏＤ
ＮＡポリメラーゼの混合物を含み、この後者は、任意のＰＣＲに誘導される配列
誤差を最小化するためのプルーフリーディング機能を保有する。増幅は、以下の
条件下で行った：９４℃２．００分（プレドウェル（ｐｒｅ−ｄｗｅｌｌ））；
［９４℃４０秒、５８℃４０秒、７２℃４０秒］を１０サイクル；［９４℃４０
秒、５８℃４０秒、７２℃４０秒（＋２０秒／サイクル）］を２５サイクル；７
２℃１０分；４℃保持。ＰＣＲ産物を、代表的に、ウラシル脱グリコシラーゼ（
ｄｅｇｙｃｏｓｙｌａｓｅ）ＣＬＯＮＥＡＭＰ^TMシステムを使用してベクターｐ
−ＡＭＰ−１中にサブクローニングした。全ての配列を、ベクター由来のＳＰ６
（順方向）プライマーおよびＴ７（逆方向）プライマーを使用する、循環（ｃｙ
ｃｌｅ）配列決定（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ）によって確認した。配列決定において使用するプライマーを、Ｎ
ＥＮＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ／Ｄｕｐｏｎｔ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍ
Ａ）からのγ−³²Ｐ−ｄＡＴＰを使用して、Ｔ４キナーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて末端標識した。全長ク
ローンを、この配列を一様に横切って間隔を空けて配置された１０個のｈＧｌｙ
Ｔ２特異的プライマーに加えて、ＳＰ６プライマーおよびＴ７プライマーを使用
して配列決定した。

【０１００】（Ｂ．ｈＧｌｙＴ２領域ＴＭ２〜ＴＭ１０のクローニング）膜貫通領域は、アミノ酸レベルにおいて、異なる種間で最も優れた保存を示す
傾向があるので、変性プライマー（ＧｅｎｅｍｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を、推定膜貫通（Ｔ
Ｍ）領域２、５および１０におけるラットＧｌｙＴ２配列に基づいて設計した。
ＰＣＲクローニングにおいて使用されるプライマー（Ａ〜Ｕは、配列番号１〜２
１に対応する）の全てのヌクレオチド配列は、以下の通りに示される：

【０１０１】

【化１５】上記に列挙されたプライマー配列において、ＹはＣおよびＴをいい、ＲはＡおよ
びＧをいい、ＢはＧ、ＴおよびＣをいい、そしてＩはイノシンをいう。ｈＧｌｙ
Ｔ２の第１のフラグメントのＰＣＲ単離を、核酸レベルで変性したラットペプチ
ド配列（Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８０２〜
２２８０６（１９９３））をコードする２セットのプライマーを使用して達成し
た。ＴＭ２とＴＭ５との間の領域を、プライマーＡおよびプライマーＢを使用し
て増幅した。同様に、ＴＭ５とＴＭ１０との間の領域を、プライマーＣおよびプ
ライマーＤを使用して増幅した。

【０１０２】ヒトＧｌｙＴ２輸送体の部分的配列を得た後、遺伝子特異的なプライマーＥお
よびプライマーＦ（ラットＧｌｙＴ２コード配列の最後の４０塩基に対して変性
した３’プライマー）を使用して、ｈＧｌｙＴ２コード配列の３’末端を増幅し
た。

【０１０３】（Ｃ．ｈＧｌｙＴ２の５’末端のクローニング）ＴＭ１の上流の配列をコードしたプライマー（プライマーＨ）を、プライマー
Ｇと共に使用して、ラットＧｌｙＴ２塩基７９１〜９９９に対応するヒト配列を
ＰＣＲ増幅した。さらなる１００塩基は、ＴＭ１に対して５’側の配列が遺伝子
特異的プライマー設計のために使用されることを可能にした。

【０１０４】Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ５’−ＲＡＣＥＳｙｓｔｅｍを使用して、この輸送体
配列の５’末端においてさらなる配列をクローニングした。ＴＭ２の３’側の遺
伝子特異的な非コードプライマー（プライマーＩ）を、ヒト脊髄ポリＡ⁺ ｍＲ
ＮＡの逆転写において使用した。次いで、このｃＤＮＡ産物に、ターミナルトラ
ンスフェラーゼを用いてポリｄＣヌクレオチドでテーリングした（ｔａｉｌｅｄ
）。第１回のＰＣＲ増幅は、プライマーＩの直ぐ５’側のさらなる非コードプラ
イマー（プライマーＪ）を使用し、そしてそのキットは、プライマー（ＡＡＰ）
を供給した。この第１回のＰＣＲ増幅の産物を鋳型として使用して、２つのさら
なるネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）増幅を実施した。遺伝子特異的プライマーＫおよ
びプライマーＡＵＡＰ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（第２回）、次いでプライマーＬ
およびＵＡＰ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）（第３回）を、ＰＣＲにおいて使用して５
’−ＲＡＣＥ産物を得た。第１ラウンドの増幅からの最も大きな産物は、ラット
ＧｌｙＴ２輸送体よりも約２００少ない塩基のコード配列を含んだ。この５’−
ＲＡＣＥ産物を、以前に記載されるように、ｐＡＭＰ−１中にサブクローニング
した。

【０１０５】ｈＧｌｙＴ２コード配列の５’末端全体を、最終的に、プライマーＮと合わせ
たラット５’非翻訳領域の塩基１８９〜２１０に対する非変性プライマー（プラ
イマーＭ）を使用して単離した。

【０１０６】この完全配列を、６９の個体（ロット番号６１２０２９５、Ｃｏｌｏｎｅｔｅ
ｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．）のプールからのｍＲＮＡを含んだ
脊髄ポリＡ＋ｍＲＮＡのサンプルからクローニングした。ｈＧｌｙＴ２につい
ての正確なコンセンサス配列を得るために、この配列全体を、異なるロットの脊
髄ｍＲＮＡ（ロット７０５０１０７）（これは、９２の個体のプールを示した）
から再増幅した。さらに、この輸送体の６つのフラグメントの各々（図１）を、
ポリＡ＋ｍＲＮＡの２つのさらなる供給源からの３つの独立したＰＣＲ反応にお
いて再増幅した。第１のセットの６つのフラグメントを、異なるアリコートのヒ
ト脊髄ポリＡ＋ｍＲＮＡ（ロット７０５０１０７、数月後に購入した）からク
ローニングし、そして第２のセットのフラグメントを、星状細胞腫細胞株Ｕ３７
３ＭＧから単離したポリＡ＋ｍＲＮＡからクローニングした。得られた４８個
の配列（配列番号２２／２３〜１１７／１１８）を使用して、配列番号１２１／
１２２に示されるコンセンサス配列を生成した。

【０１０７】（実施例２）（輸送体構築物の構築）異なるｈＧｌｙＴ２フラグメントの構築の詳細なアウトラインを、図１に示す
。ｈＧｌｙＴ２輸送体をコードする配列を、６個の異なるＰＣＲ産物フラグメン
ト（番号付けは、ラットＧｌｙＴ２配列に対応する）から構築した：４１０〜８
２２（Ａ）、７１９〜１０５０（Ｂ）、８９２〜１５０６（Ｃ）、１４７７〜２
２０８（Ｄ）、２１５７〜２６０７（Ｅ）、１８９〜５２９（Ｆ）。これらの６
個の単離されたＰＣＲフラグメントは、ｈＧｌｙＴ２輸送体全体をコードする。
そして図１に示される５個の制限部位を使用して構築した。各フラグメントの少
なくとも８個の独立クローンを、ｈＧｌｙＴ２コード配列を検証するために配列
決定した［フラグメント：Ａ（配列番号２２／２３〜３６／３７）、Ｂ（配列番
号３８／３９〜５２／５３）、Ｃ（配列番号５４／５５〜６９／７０）、Ｄ（配
列番号７１／７２〜８５／８６）、Ｅ（配列番号８７／８８〜１０１／１０２）
、およびＦ（配列番号１０３／１０４〜１１７／１１８）］。フラグメントＡお
よびＢを、８２２位に見られるＮｃｏＩ制限部位を使用してともに連結した。フ
ラグメントＡおよびＢの配列は重なり合っていなかったので、ＮｃｏＩ部位を、
プライマーセットＯおよびＰ、ならびにＯおよびＱをそれぞれ使用する２回のＰ
ＣＲ伸張によって、フラグメントＡへ導入した（図１）。フラグメントＡＢおよ
びＣを、ＰｉｎＡＩ制限部位を使用してともに連結した。この部位はフラグメン
トＣにおいて見られたが、塩基７８２でのＡＢにおける対立遺伝子変異に起因し
て、ＡＢ配列へ導入しなければならなかった（プライマーＲを使用して、図１）
。ＰｉｎＡＩ消化されたＡＢおよびＣの連結の産物を、フラグメントＡＢＣと名
付けた。

【０１０８】フラグメントＥはＳａｃＩ部位の半分のみを含んだので、最初の３つの塩基を
、プライマーＳおよびＴを使用して、５’末端へ付加した。フラグメントＤを、
プライマーＵおよびＤを使用して増幅した。フラグメントＤおよびＥを、Ｓａｃ
Ｉで消化し、そして連結した。得られた産物（ＤＥ）を、ｐＡＭＰ−１中へサブ
クローニングした。ＡＢＣを含むプラスミドを、ＨｉｎＤＩＩＩおよびＳｐｅＩ
で消化し、そして得られた１１００塩基対産物を、ＨｉｎＤＩＩＩ／ＳｐｅＩ消
化したＤＥ含有プラスミドへ連結し、ｈＧｌｙＴ２の短縮型形態（ヌクレオチド
４１０〜２６０７）を作製した。最後に、５’末端を、フラグメントＡＢＣＤＥ
およびＦを合わせることによって付加した（図１）。両方のフラグメントをＰｓ
ｔ１で消化し、そしてともに連結した。次いで、この連結反応物を、プライマー
ＭおよびＩを用いてＰＣＲ増幅し、そして塩基１８９〜１０５４を含む得れらた
構成物を、ＨｉｎＤＩＩＩ／Ｐｉｎ−ＡＩ消化ｈＧｌｙＴ２（４１０〜２６０７
）へサブクローニングして戻した。完全なｈＧｌｙＴ２輸送体配列（１８９〜２
６０７）および短縮型形態（４１０〜２６０７）を、哺乳動物細胞内での発現の
ために、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）の
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎＤＩＩＩ部位へサブクローニングした。

【０１０９】最初のｃＤＮＡを、３個の異なる、多数のプールしたｍＲＮＡサンプルから、
ならびに単一細胞株から誘導したので、多数の対立遺伝子変異を完全な配列にお
いて同定した。同定した変異は、以下の通りであった：

【０１１０】

【化１６】これらの対立遺伝子変異は、以下のアミノ酸置換体をコードする：

【０１１１】

【化１７】ヒトＧｌｙＴ２輸送体は、ラットＧｌｙＴ２配列との非常に高い相同性を示し
（Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８０２〜２２８
０６（１９９３））（図２）、これら２つの種の間の全体的な相同性は、ヌクレ
オチドおよびアミノ酸レベルで、それぞれ、８８％および９３％であった（図３
）。ヒトＧｌｙＴ２輸送体および他のメンバーのアミノ酸輸送体ファミリーは、
およそ５０％のアミノ酸相同性を共有した。ラットおよびヒトのＧｌｙＴ２タン
パク質間の最も大きな相違は、最初の１９０個のアミノ酸内に有り、ここで７４
％のみの保存が見られる。

【０１１２】ラットおよびヒトのＧｌｙＴ２輸送体の５’非翻訳領域は、非常に高度に保存
される。ヒト構築物の配列決定によって、ヒトｃＤＮＡ配列の最初の５２個の塩
基（２０個の５’非翻訳および３２個のコード配列）が、ラット配列と同一であ
ることが分かった。この５２塩基領域は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて現在見られる
任意の他の配列と相同性を示さず、従って、ＧｌｙＴ２に独特である調節配列を
示し得る。コード配列の次の１００個の塩基は、２種間でたった６６％の同一性
を示す。

【０１１３】ｈＧｌｙＴ２の２つのスプライス形態を、ＧｌｙＴ２輸送体のクローニングの
間に単離した（図２）。第１の変異体を、ｈＧｌｙＴ２配列の塩基５４１〜６７
５が続く相違する５’末端によって特徴付けた（図２Ａ）。塩基６７５の後に、
全ての３つの読み取り枠で終止コドンを含む１７２塩基対の挿入物が存在した。
これに、輸送体配列の残りが続いた。この変異体の発現は、メチオニン２３５で
の開始コドンを予期し、従って、最初の２３４個のアミノ酸を欠く輸送体を形成
する（ｈＧｌｙＴ２／５Ｉ（５’−挿入））。第２変異体は、塩基１４８８〜１
５３０の間の領域に４２塩基対欠失を含んだ（ｈＧｌｙＴ２−３Ｄ（３’−欠失
））（図２Ｂ）。この変異体は、推定膜貫通領域ＴＭ６とＴＭ７との間の細胞内
ループにおいて１４個のアミノ酸を欠く。両方の変異体（ｈＧｌｙＴ２／５Ｉお
よびｈＧｌｙＴ２／３Ｄ）を構築し、そして全長配列と同様の様式で発現させた
。さらに、両方の変異を含む構築物もまた構築し（ｈＧｌｙＴ２／５Ｉ−３Ｄ（
５’−挿入／３’−欠失））、そして発現させた。

【０１１４】さらに、ｈＧｌｙＴ２の短縮型形態を、ｈＧｌｙＴ２配列のヌクレオチド２２
１〜２３９１を用いて構築した。この構築物の発現は、メチオニン−１５４で開
始コドンを予期し、従って、最初の１５３アミノ酸を欠く輸送体（短縮型ｈＧｌ
ｙＴ２）を形成する。

【０１１５】（実施例３）（ｈＧｌｙＴ２輸送体の発現）ＧｌｙＴ２の全長、短縮型および変異スプライス形態を含む上記実施例２で記
載したｈＧｌｙＴ２構築物を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ^TMシステム（Ｑｉａｇｅｎ，
ＳａｎｔａＣｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を使用して、ＣＯＳ−７細胞中で一過的に
発現させた。ＣＯＳ−７細胞を、１ウエル当たり２０，０００細胞で、トランス
フェクションの前日にプレーティングした。トランスフェクションのためのＤＮ
Ａを、ＱｉａｇｅｎＭｉｄｉｐｒｅｐ^TMキットを使用して調製し、そして１μ
ｇのｈＧｌｙＴ２の各々の形態を、２４ウエルプレートの各ウエルへトランスフ
ェクトした。トランスフェクションを、培地を交換することによってＤＮＡ複合
体を細胞へ添加した後、２〜２．５時間で終了させた。トランスフェクション効
率を、グリーン蛍光タンパク質を含む構築物を一過的に発現させることによって
モニタリングした。トランスフェクタント体の数は、典型的に、総細胞の２０〜
５０％であった。標準的な増殖条件は、ＤＭＥＭ、高グルコース、１０％仔ウシ
血清、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシンスルフェート（１
００μｇ／ｍＬ）、５％ＣＯ₂／湿潤雰囲気、３７℃であった。細胞を、典型的
に、トランスフェクト後に４８時間増殖させ、その後、図３に示されるアッセイ
結果を用いて実施例４に記載されるにように、グリシン取り込みアッセイにおい
て使用した。

【０１１６】（実施例４）（グリシン取り込み）グリシン取り込みは、本質的に、以前（Ｋｉｍ，Ｋ−Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａ
ｒｍ．４５：６０８〜１７（１９９４））と同様であった。簡単に言えば、細胞
を、グリシン取り込み緩衝液（ＧＵＢ；５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、７．
５ｍＭＨｅｐｅｓ、１２０ｍＭＮａＣｌ、５．４ｍＭＫＣｌ、１．２ｍＭ
ＣａＣｌ₂、１．２ｍＭＭｇＳＯ₄、１ｍＭＬ−アスコルビン酸、５ｍＭ
Ｄ−グルコース）か、またはクロライドを含まない取り込み緩衝液（ＧＵＢと同
様であって、ＮａＣｌを１２０ｍＭ酢酸ナトリウムで置き換え、そしてＫＣｌお
よびＣａＣｌ₂を省く）のいずれかで３回洗浄した。［２−³Ｈ］−グリシン（５
８１ＧＢｑ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔ
ｓ，ＩＬ）を、ＧＵＢまたはＣｌ^-を含まないＧＵＢのいずれかへ、２μＣｉ／
ｍＬ（１２７ｎＭ）の濃度で添加した。［³Ｈ］グリシンの取り込みを、１５分
間、３７℃で進行させ、この後、細胞を、過剰の氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。細
胞を、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で可溶化し、そして放射能をシンチレ
ーション計数によって定量した。１ウエル当たりのタンパク質の量を、ＢＣＡ試
薬アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。サルコシン阻害研究のために、
細胞を、取り込みの前に、所望の濃度のサルコシン（ＧＵＢまたはＣｌ^-を含ま
ないＧＵＢのいずれかの中）で１５分間、前処理した。全ての条件を３連で実施
し、そして取り込みをｐｍｏｌグリシン／ｍｇタンパク質／分として表現した。

【０１１７】完全に構築される場合、ｈＧｌｙＴ２輸送体配列は、一過性にＣＯＳ−７細胞
へトランスフェクトされる場合に、高親和性グリシン輸送を媒介する（図３）。
ＨＧｌｙＴ２トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされていないＣ
ＯＳ−７細胞および偽の（ｍｏｃｋ）トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞と
比較して、［Ｈ³］グリシン取り込みの７〜１０倍の増加を示した。Ｃｌ^-依存性
取り込みは、ＧｌｙＴ２トランスフェクション実験における総取り込みの８０〜
９０％を示した（図３）。トランスフェククトされた細胞を用いるグリシン取り
込みデータのイーディーホフステー変換は、Ｋ_m＝１０±０．４μＭおよびＶ_max ＝１９０±３ｐｍｏｌグリシン／ｍｇタンパク質／分を示した（図４Ａおよび４
Ｂ）。ラットＧｌｙＴ２について報告されたＫｍは１３μＭ（Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８０２〜２２８０６（１９９３））
であったので、ヒトおよびラットのＧｌｙＴ２輸送体についてのグリシン親和性
は、ほぼ同じである。興味深いことに、開始メチオニンが残基１５４であるよう
にｈＧｌｙＴ２を短縮化することによってまた、９±１μＭのＫｍ、および６７
±３ｐｍｏｌグリシン／ｍｇタンパク質／分を示す能動的な輸送体が得られた（
図４Ａおよび４Ｂ）。これらのデータは、最初の１５３個のアミノ酸の欠失がこ
の輸送体のグリシン親和性に全く影響を及ぼさないことを示唆する。

【０１１８】上記実施例２に記載されるように、ｈＧｌｙＴ２の２つのさらなる変異体を、
ＰＣＲクローニングの間に同定した（図２）。第１の変異体は、単離された４５
個のクローンのうちの３個において見られ、そして短縮型アミノ末端、および膜
貫通ドメイン１と２との間のループをコードする領域における１６８塩基対挿入
物によって特徴付けられた（図２Ａ）。挿入物の配列分析は、全ての３つの読み
取り枠における終止コドンを示した。予期されるように、この挿入物を含む輸送
体の発現によって、ＣＯＳ−７細胞におけるグリシン取り込みの有意でない増加
を生じた（図３）。従って、第１膜貫通領域および細胞質アミノ末端の損失は、
グリシンの高親和性取り込みを媒介し得ない輸送体を生じる。第２のスプライス
形態もまた、５０クローンのうち１つにおいて単離され、そして推定膜貫通領域
６と７との間での４８塩基対欠失を示した（図２Ｂ）。この欠失は、輸送体の読
み取り枠に影響を与えず、そして効果的に、この細胞内ループからの１６個のア
ミノ酸の欠失を生じた。しかし、この比較的小さな欠失は、非機能的輸送体を生
じた（図３）。

【０１１９】実施例２において考察されるような短縮型形態ｈＧｌｙＴ２を、ヒト輸送体配
列のヌクレオチド２２１〜２３９１を含む構築物から発現した（図３）。この短
縮型輸送体（これは、ヒト輸送体のＭｅｔ−１５４に対応する開始メチオニンを
予測する）は、全長輸送体の約３分の１の効率で高親和性グリシン取り込みを媒
介した（図３および４）。このレセプターによって媒介された取り込みのイーデ
ィーホフステー分析は、この輸送体のグリシンについての親和性が、全長輸送体
と同じであることを示した（図４Ａおよび４Ｂ）。これら２つの輸送体について
の取り込みにおける差異は、Ｖ_max値の差異が原因であった。輸送体の短縮型形
態は、高親和性取り込みを媒介するので、ｈＧｌｙＴ２のアミノ末端は、グリシ
ン分子の輸送に直接的に関与しないようである。従って、この領域は、輸送体の
膜標的化において役割を果たし得るか、または輸送体の最適な高次構造に寄与し
得る。あるいは、伸長されたＮ末端の、細胞内調節タンパク質との相互作用が存
在し得る。実際、他のメンバーの輸送体に存在しない、ＧｌｙＴ２の細胞内Ｎ末
端における多くの可能性あるリン酸化部位が存在する。興味深いことに、Ｇｌｙ
Ｔ２のこのアミノ末端短縮型形態は、第１推定膜貫通領域（ＴＭ１）の開始の前
に４４個のアミノ酸を有すると予期される。これは、ｈＧｌｙＴ１（Ｋｉｍら（
１９９４））およびプロリン輸送体（Ｆｒｅｍｅａｕら（１９９２））の、それ
ぞれのＴＭ１の前の、予期される３３個および４３個の残基と同様である。アミ
ノ末端におけるさらなる１５３個のアミノ酸は、Ｎａ⁺／Ｃ^l-−依存性アミノ酸
輸送体ファミリー中でＧｌｙＴ２を独特なものとする。

【０１２０】ＧｌｙＴ１輸送体とＧｌｙＴ２輸送体との間の薬理学的な差異は、サルコシン
の感受性に関する（Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）８９：１２１４５−１２１４９（１９９２ｂ）；Ｋｉｍ，Ｋ−Ｍ
．ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４５：６０８−１７（１９９４）；Ｇｕａｓｔｅｌ
ｌａ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：７１
８９−７１９３（１９９２））。サルコシン濃度が２００μＭを超える場合、Ｇ
ｌｙＴ１により媒介されるグリシンの取り込みは、ほとんど完全に阻害されるが
、ラットＧｌｙＴ２媒介性の取り込みは、１ｍＭのサルコシン濃度にて、わずか
１０〜２０％阻害される（Ｌｉｕ，Ｑ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８：２２８０２−２２８０６（１９９３））。ｈＧｌｙＴ２輸送体と輸送体の短
縮型形態との両方によって媒介されるグリシンの取り込みを、サルコシン濃度を
増加することにおいて評価する（図５）。両方の形態は、サルコシンに対して比
較的非感受性であって、１ｍＭサルコシンの存在下において１５％未満の減少を
有した。従って、ヒト形態は、サルコシン阻害に関してはラットに匹敵する。

【０１２１】本明細書に配列番号によって言及される核酸配列またはアミノ酸配列は以下で
ある：

【０１２２】

【表５】 ¹ＨＳｐＣ−１の供給源は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ脊髄ポリＡ⁺ｍＲＮＡ、ロット番
号６１２０２９５（プールサイズ＝６９、年齢範囲＝２２〜７０歳）であり；Ｈ
ＳｐＣ−２供給源は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ脊髄ポリＡ⁺ｍＲＮＡ、ロット番号７０
５０１０７（プールサイズ＝９２、年齢範囲＝１６〜７５歳）であり；ＨＳｐＣ
−３供給源は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ脊髄ポリＡ⁺ｍＲＮＡ、ロット番号７０５０１
０７（プールサイズ＝９２、年齢範囲＝１６〜７５歳）であり；Ｕ３７３ＭＧ供
給源は、Ｕ３７３ＭＧ星状細胞腫細胞株ポリＡ⁺ｍＲＮＡである。

【０１２３】本発明は、好ましい実施形態に対して強調して記載されているが、好ましいデ
バイスおよび方法におけるバリエーションが使用され得ることが当業者に対して
明らかであり、そしてこれは、本発明が、本明細書中に具体的に記載されること
とは別に実行され得ることが意図される。従って、本発明は、上記の特許請求の
範囲により定義されるような本発明の精神および範囲内に含まれる全ての改変を
含む。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、６つの単離されたフラグメントを用いるｈＧｌｙＴ２輸送体ｃＤＮＡ
配列のアセンブリを示す。これらのフラグメントは、その末端で制限部位を用い
てアセンブルされた。このフラグメントは、以下のとおりアセンブルされた：Ａ
をＢに連結し（ＮｃｏＩ部位）、ＣをＤに連結し（ＳｐｅＩ部位）、ＣＤをＥに
連結し（ＳａｃＩ部位）、ＣＤＥをＡＢに連結し（ＰｉｎＡ１部位）、そしてＦ
をＡＢＣＤＥに連結した（ＰｓｔＩ部位）。この最終構築物をＨｉｎＤＩＩＩお
よびＥｃｏＲ１で消化し、そして発現研究のためにｐｃＤＮＡ３にサブクローニ
ングした。

【図２】図２は、ｈＧｌｙＴ２改変体の配列を示す。図２Ａは、５’インサートｈＧｌ
ｙＴ２改変体の配列を示す。この改変体は、示されるとおり別の５’末端を含む
（ｈＧｌｙＴ２（５’−インサート））。ｈＧｌｙＴ２配列と相同性を示す領域
は太字の下線で示す。この配列の最初の２１０塩基は、配列の現在のデータベー
スのいずれとも異なる。この相違した領域は、その後に、ヌクレオチド５４１〜
６７５の間のｈＧｌｙＴ２配列に適合する配列の１３５塩基が続く。この領域の
相同性の後、インフレームで終止コドン（ワク囲み残基）を含む１７２塩基イン
サートが存在する。この領域の後、この配列はヌクレオチド６７９からのｈＧｌ
ｙＴ２配列の残部に対する相同性を示す。この改変体について予期された開始メ
チオニンが示される。図２Ｂは、３’欠失改変体の配列を示す。この３’欠失改
変体（ｈＧｌｙＴ２（３’−欠失））を、ｈＧｌｙＴ２配列に比較して示してい
る。この改変体はアミノ酸残基４９６〜５０９を欠失しており、そして発現され
た場合、アミノ酸残基５１０〜５１１の代わりにプロリンをともなうバリンを有
する。この欠失は、推定膜貫通ドメインＴＭ６とＴＭ７との間の細胞内ループに
見出される。ｈＧｌｙＴ２配列の翻訳された配列は、上部に示し、一方欠失して
いる配列は底部に示す。

【図３】図３は、ＣＯＳ−７細胞におけるｈＧｌｙＴ２輸送体の発現を示す。ｈＧｌｙ
Ｔ２輸送体構築物を、ＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトし、そして［³Ｈ］
グリシンの取り込みをそれぞれについて測定した。グリーン蛍光タンパク質（Ｇ
ＦＰ）でトランスフェクトされ、そして蛍光顕微鏡下で見られたコントロール細
胞を用いてトランスフェクション効率を評価した。全長ｈＧｌｙＴ２、短縮ｈＧ
ｌｙＴ２、および改変ｈＧｌｙＴ２／５Ｉ、ｈＧｌｙＴ２／３Ｄ、およびｈＧｌ
ｙＴ２／５Ｉ−３Ｄについて、総取り込み（白棒）およびＣｌ^-無しの（低親和
性）取り込み（斜線棒）を示す（実施例２を参照のこと）。全長ｈＧｌｙＴ２輸
送体により媒介される取り込みは、ＧＦＰでトランスフェクトされた細胞よりも
１０倍高かった。短縮輸送体は、高親和性グリシン取り込みを媒介して全長ｈＧ
ｌｙＴ２と同じ効率で４０％のみであった。改変ｈＧｌｙＴ２／５Ｉは、プラス
ミドでトランスフェクトされたコントロールに比較して取り込みにおいて１．６
倍増加を示した。一方、３’欠失を含有するこの２つの改変体は機能的輸送体活
性を示さない（実施例４を参照のこと）。

【図４Ａ】図４は、ＣＯＳ−７細胞へのグリシン取り込みの反応速度論を示す。プラスミ
ドでトランスフェクトされたコントロールからの値を、対応する、輸送体でトラ
ンスフェクトされたデータから引き算した。示される結果は、３つの独立した実
験の平均である。ここでそれぞれのグリシン濃度を三連でアッセイした。Ｇｌｙ
Ｔ２の全長輸送体（図４Ａ）および短縮型形態（図４Ｂ）により媒介される輸送
の反応速度論分析が示される。Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ分析は、それぞれの
インセットにおいて示されている。

【図４Ｂ】図４は、ＣＯＳ−７細胞へのグリシン取り込みの反応速度論を示す。プラスミ
ドでトランスフェクトされたコントロールからの値を、対応する、輸送体でトラ
ンスフェクトされたデータから引き算した。示される結果は、３つの独立した実
験の平均である。ここでそれぞれのグリシン濃度を三連でアッセイした。Ｇｌｙ
Ｔ２の全長輸送体（図４Ａ）および短縮型形態（図４Ｂ）により媒介される輸送
の反応速度論分析が示される。Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ分析は、それぞれの
インセットにおいて示されている。

【図５】図５は、ｈＧｌｙＴ２でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞によるグリシ
ン取り込みへのサルコシンの効果を示す。ｈＧｌｙＴ２の全長形態（●）および
短縮型形態（◆）により媒介されるグリシン取り込みへのサルコシンの漸増する
濃度の効果を示す。取りこみは、サルコシンの存在のなしでの輸送体でトランス
フェクトされた細胞により媒介された取り込みのパーセントとして示される。全
長輸送体および短縮輸送体は、サルコシン阻害に対して非感受性である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/04 Ａ６１Ｐ 25/08 ４Ｃ０８４ 25/08 25/28 ４Ｃ０８６ 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８７Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 ４Ｈ０４５ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ブランデン，カートアール．アメリカ合衆国オハイオ 44202，オーロラ，グレンエデンコート 664 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA20 EA04 GA11 HA01 HA17 4B063 QA13 QQ41 QR31 QR62 QS03 QS25 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 BA35 CA53 MA52 MA55 NA14 ZA032 ZA062 ZA082 ZA152 ZA942 4C086 AA01 EA16 MA52 MA55 NA10 NA14 ZA02 ZA06 ZA08 ZA15 ZA94 4C087 AA01 BB65 MA52 MA55 NA10 NA14 ZA02 ZA06 ZA08 ZA15 ZA94 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA45 DA75 EA21 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号１２４のアミノ酸２
４に対応する位置でセリンを有する、２型グリシン輸送体（ＧｌｙＴ２）アミノ
酸配列をコードする核酸配列を含む、精製された核酸。
【請求項２】グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号１２４のアミノ酸７
４に対応する位置でトリプトファンを有する、ＧｌｙＴ２アミノ酸配列をコード
する核酸配列を含む、精製された核酸。
【請求項３】グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号１２４のアミノ酸１
５５に対応する位置でグリシンを有する、ＧｌｙＴ２アミノ酸配列をコードする
核酸配列を含む、精製された核酸。
【請求項４】グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号１２４のアミノ酸１
８８に対応する位置でアスパラギン酸を有する、ＧｌｙＴ２アミノ酸配列をコー
ドする核酸配列を含む、精製された核酸。
【請求項５】グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号１２４のアミノ酸３
６２に対応する位置でロイシンを有する、ＧｌｙＴ２アミノ酸配列をコードする
核酸配列を含む、精製された核酸。
【請求項６】グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号１２４のアミノ酸４
３１に対応する位置でアラニンを有する、ＧｌｙＴ２アミノ酸配列をコードする
核酸配列を含む、精製された核酸。
【請求項７】グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号１２４のアミノ酸５
８２に対応する位置でセリンを有する、ＧｌｙＴ２アミノ酸配列をコードする核
酸配列を含む、精製された核酸。
【請求項８】精製された核酸であって、グリシン輸送体活性を有しかつ以
下のアミノ酸：（１）配列番号１２４のアミノ酸２４に対応する位置でセリン、
（２）配列番号１２４のアミノ酸７４に対応する位置でトリプトファン、（３）
配列番号１２４のアミノ酸１５５に対応する位置でグリシン、（４）配列番号１
２４のアミノ酸１８８に対応する位置でアスパラギン酸、（５）配列番号１２４
のアミノ酸３６２に対応する位置でロイシン、（６）配列番号１２４のアミノ酸
４３１に対応する位置でアラニン、または（７）配列番号１２４のアミノ酸５８
２に対応する位置でセリン、のうちの１つ以上を有する、ＧｌｙＴ２アミノ酸配
列をコードする核酸配列を含む、核酸。
【請求項９】請求項１〜８のいずれか１項に記載の精製された核酸であっ
て、ここでコードされるＧｌｙＴ２アミノ酸配列は、配列番号１２４のアミノ酸
１〜７９７の配列であるが以下のアミノ酸置換：（１）２４位でセリン、（２）
７４位でトリプトファン、（３）１５５位でグリシン、（４）１８８位でアスパ
ラギン酸、（５）３６２位でロイシン、（６）アミノ酸４３１に対応する位置で
アラニン、または（７）５８２位でセリン、のうちの１つ以上を有する、核酸。
【請求項１０】前記コードされるＧｌｙＴ２アミノ酸配列が、配列番号１
２２のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の精製された核酸。
【請求項１１】前記コードされるＧｌｙＴ２アミノ酸配列が、配列番号１
２０のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の精製された核酸。
【請求項１２】請求項１〜９のいずれか１項に記載の精製された核酸であ
って、ここで前記核酸配列は、配列番号１２３の塩基１〜２３９１の配列である
が以下のヌクレオチド置換：（１）７０位でＡ、（２）２２０位でＴ、（３）４
６３位でＧ、（４）５６２位でＧ、（５）１０８５位でＴ、（６）１２９２位で
Ｃ、（７）１２９９位でＡ、（８）１６１７位でＴ、または（９）１７４４位で
Ｔ、のうちの１つ以上を有する、核酸。
【請求項１３】前記核酸配列が配列番号１２１の配列である、請求項１２
に記載の精製された核酸。
【請求項１４】前記核酸配列が配列番号１１９の配列である、請求項１２
に記載の精製された核酸。
【請求項１５】請求項１〜９のいずれか１項に記載の精製された核酸であ
って、さらに以下のアミノ酸：（１）配列番号１２４のアミノ酸２６に対応する
位置でロイシン、（２）配列番号１２４のアミノ酸７５に対応する位置でロイシ
ン、（３）配列番号１２４のアミノ酸８９に対応する位置でバリン、（４）配列
番号１２４のアミノ酸１０２に対応する位置でグリシン、（５）配列番号１２４
のアミノ酸１７４に対応する位置でグルタミン酸、（６）配列番号１２４のアミ
ノ酸１９５に対応する位置でプロリン、（７）配列番号１２４のアミノ酸１９９
に対応する位置でグリシン、（８）配列番号１２４のアミノ酸２４９に対応する
位置でロイシン、（９）配列番号１２４のアミノ酸３０６に対応する位置でプロ
リン、（１０）配列番号１２４のアミノ酸４１９に対応する位置でグルタミン酸
、（１１）配列番号１２４のアミノ酸４４２に対応する位置でアスパラギン、（
１２）配列番号１２４のアミノ酸４５５に対応する位置でリジン、（１３）配列
番号１２４のアミノ酸４５８に対応する位置でシステイン、（１４）配列番号１
２４のアミノ酸４８５に対応する位置でプロリン、（１５）配列番号１２４のア
ミノ酸４９３に対応する位置でアルギニン、または（１６）配列番号１２４のア
ミノ酸６５０に対応する位置でグルタミン酸、のうちの１つ以上を有する、核酸
。
【請求項１６】請求項１〜９のいずれか１項に記載の精製された核酸であ
って、さらに以下のアミノ酸：（１）配列番号１２４のアミノ酸１２４に対応す
る位置でフェニルアラニン、（２）配列番号１２４のアミノ酸２７９に対応する
位置でアスパラギン、（３）配列番号１２４のアミノ酸３９３に対応する位置で
グリシン、（４）配列番号１２４のアミノ酸４５７に対応する位置でアスパラギ
ン、（５）配列番号１２４のアミノ酸４６３に対応する位置でアスパラギン、（
６）配列番号１２４のアミノ酸６１０に対応する位置でチロシン、（７）配列番
号１２４のアミノ酸６１１に対応する位置でバリン、（８）配列番号１２４のア
ミノ酸７３３に対応する位置でセリン、（９）配列番号１２４のアミノ酸７３５
に対応する位置でバリン、（１０）配列番号１２４のアミノ酸２４５に対応する
位置でロイシン、（１１）配列番号１２４のアミノ酸３０５に対応する位置でロ
イシン、（１２）配列番号１２４のアミノ酸３６６に対応する位置でイソロイシ
ン、または（１３）配列番号１２４のアミノ酸４００に対応する位置でプロリン
、のうちの１つ以上を有する、核酸。
【請求項１７】請求項１２に記載の精製された核酸であるが、さらに以下
のヌクレオチド置換：（ａ）７７位でＴ、（ｂ）２２０位でＴ、（ｃ）２４４位
でＴ、（ｄ）２６６位でＴ、（ｅ）３０４位でＧ、（ｆ）５２１位でＡ、（ｇ）
５８３位でＣ、（ｈ）５９６位でＧ、（ｉ）６７８位でＧ、（ｊ）６８１位でＣ
、（ｋ）７４５位でＴ、（ｌ）７５０位でＣ、（ｍ）７６５位でＴ、（ｎ）７７
７位でＣもしくはＡ、（ｏ）８６７位でＧ、（ｐ）９１７位でＣ、（ｑ）１２５
６位でＡ、（ｒ）１２９２位でＣ、（ｓ）１３２５位でＡ、（ｔ）１３６４位で
Ａ、（ｕ）１３７４位でＣ、（ｖ）１３９２位でＡ、（ｗ）１４５４位でＣ、（
ｘ）１４７８位でＧ、（ｙ）１８５４位でＣ、（ｚ）１９４９位でＡ、（ａａ）
１９５９位でＣ、または（ｂｂ）２１３０位でＣ、のうちの１つ以上を有する、
核酸。
【請求項１８】請求項１２に記載の精製された核酸であるが、さらに以下
のヌクレオチド置換：（ａ）６位でＣ、（ｂ）３７１位でＴ、（ｃ）５７１位で
Ｔ、（ｄ）８３６位でＡ、（ｅ）１１１６位でＧ、（ｆ）１１７７位でＧ、（ｇ
）１３７１位でＣ、（ｈ）１３８７位でＡ、（ｉ）１８２９位でＡ、（ｊ）１８
３１位でＧ、（ｋ）２１９８位でＣ、（ｌ）２２０３位でＧ、（ｍ）３４２位で
Ｇ、（ｎ）７３３位でＣ、（ｏ）９１３位でＣ、（ｐ）９５１位でＡ、（ｑ）１
０９７位でＴ、（ｒ）１１９９位でＣ、（ｓ）３５２位でＴ、または（ｔ）２１
０３位でＡ、のうちの１つ以上を有する、核酸。
【請求項１９】請求項１〜８、１０〜１１、および１３〜１４のいずれか
１項に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２０】請求項９に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２１】請求項１２に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２２】請求項１５に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２３】請求項１６に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２４】請求項１７に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２５】請求項１８に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２６】請求項１９に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項２７】請求項２０に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項２８】請求項２１に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項２９】請求項２２に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項３０】請求項２３に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項３１】請求項２４に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項３２】請求項２５に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項３３】請求項１〜８、１０〜１１、および１３〜１４のいずれか
１項に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
【請求項３４】請求項９に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
【請求項３５】請求項１２に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
【請求項３６】請求項１５に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
【請求項３７】請求項１６に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
【請求項３８】請求項１７に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
【請求項３９】請求項１８に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
【請求項４０】ＧｌｙＴ２を作製する方法であって、請求項３３に記載の
組換え宿主細胞においてＧｌｙＴ２を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４１】ＧｌｙＴ２を作製する方法であって、請求項３４に記載の
組換え宿主細胞においてＧｌｙＴ２を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４２】ＧｌｙＴ２を作製する方法であって、請求項３５に記載の
組換え宿主細胞においてＧｌｙＴ２を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４３】ＧｌｙＴ２を作製する方法であって、請求項３６に記載の
組換え宿主細胞においてＧｌｙＴ２を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４４】ＧｌｙＴ２を作製する方法であって、請求項３７に記載の
組換え宿主細胞においてＧｌｙＴ２を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４５】ＧｌｙＴ２を作製する方法であって、請求項３８に記載の
組換え宿主細胞においてＧｌｙＴ２を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４６】ＧｌｙＴ２を作製する方法であって、請求項３９に記載の
組換え宿主細胞においてＧｌｙＴ２を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４７】精製された核酸であって、配列番号１２２のタンパク質配
列である参照配列または以下のアミノ酸置換：【化１】のうちの１つ以上を有することを除いて配列番号１２２のタンパク質配列に対応
する配列と、少なくとも約９６％の配列同一性を有する２型グリシン輸送体（Ｇ
ｌｙＴ２）をコードする、核酸。
【請求項４８】請求項４７に記載の核酸であって、ここで前記参照配列が
配列番号１２２のタンパク質配列であるか、または以下のアミノ酸置換：【化２】のうちの１つ以上を有することを除いて配列番号１２２のタンパク質配列に対応
する配列である、核酸。
【請求項４９】前記配列同一性が、少なくとも約９７％の配列同一性、少
なくとも約９８％の配列同一性、および少なくとも約９９％の配列同一性の群か
ら選択される、請求項４７に記載の核酸。
【請求項５０】前記配列同一性が、少なくとも約９９．５％である、請求
項４７に記載の核酸。
【請求項５１】前記核酸が、前記参照配列を有するＧｌｙＴ２をコードす
る、請求項４７に記載の核酸。
【請求項５２】請求項４７に記載の核酸であって、配列番号１２１の核酸
配列または、以下のヌクレオチド置換：【化３】のうちの１つ以上を有することによって配列番号１２１の核酸配列から変動する
配列を含む、核酸。
【請求項５３】配列番号１２１の核酸配列または以下のヌクレオチド置換
：Ｃ²²⁰→Ｔ、Ａ³⁰⁴→Ｇ、もしくはＴ¹²⁹²→Ｃのうちの１つ以上を有することに
よって配列番号１２１の核酸配列から変動する配列。
【請求項５４】請求項４７に記載の核酸およびそれと機能的に結合される
外因性プロモーターを含む、ベクター。
【請求項５５】参照アミノ酸配列のすべてまたは１〜２個の隣接した部分
と、少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するグリシン輸送体タンパク質を
コードする核酸であって、ここで該参照配列は、配列番号１２２であるかまたは
以下のアミノ酸置換：【化４】のうちの１つ以上を有することを除いて配列番号１２２のアミノ酸配列に対応す
るアミノ酸配列である、核酸。
【請求項５６】前記１〜２個の隣接した配列の部分が、少なくとも約６０
０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、および少なくとも約７５０アミノ酸
の群から選択されるアミノ酸を含む、請求項５５に記載の核酸。
【請求項５７】請求項４７〜５３および５５〜５６のいずれか１項に記載
の核酸を含む、細胞。
【請求項５８】請求項５４に記載のベクターで形質転換された、細胞。
【請求項５９】グリシン輸送体を産生する方法であって、請求項５７に記
載の細胞を増殖させる工程を包含する、方法。
【請求項６０】グリシン輸送体を産生する方法であって、請求項５８に記
載の細胞を増殖させる工程を包含する、方法。
【請求項６１】以下の工程：（ａ）前記細胞から膜を単離する工程であっ
て、該膜が前記グリシン輸送体を含む、工程、または（ｂ）該細胞からタンパク
質画分を抽出する工程であって、該画分が該グリシン輸送体を含む、工程、のう
ちの少なくとも１つをさらに包含する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】以下の工程：（ａ）前記細胞から膜を単離する工程であっ
て、該膜が前記グリシン輸送体を含む、工程、または（ｂ）該細胞からタンパク
質画分を抽出する工程であって、該画分が該グリシン輸送体を含む、工程、のう
ちの少なくとも１つをさらに包含する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】請求項５７に記載の細胞から単離された、グリシン輸送体
。
【請求項６４】請求項５８に記載の細胞から単離された、グリシン輸送体
。
【請求項６５】神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子を
特徴付けるため、または神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子
を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）以下（ｉ）請求
項５７に記載の細胞または（ｉｉ）請求項６３に記載の単離されたグリシン輸送
体タンパク質、を含む第１のアッセイ組成物を提供する工程、（ｂ）該第１のア
ッセイ組成物を、該生物活性因子または予期される生物活性因子と接触させる工
程、および該アッセイ組成物によって示されるグリシン輸送体の量を測定する工
程、を包含する、方法。
【請求項６６】神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子を
特徴付けるため、または神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子
を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）以下（ｉ）請求
項５８に記載の細胞または（ｉｉ）単離されたグリシン輸送体タンパク質（ｉｉ
）請求項６４に記載の単離されたグリシン輸送体タンパク質、を含む第１のアッ
セイ組成物を提供する工程、（ｂ）該第１のアッセイ組成物を、該生物活性因子
または予期される生物活性因子と接触させる工程、および該アッセイ組成物によ
って示されるグリシン輸送体の量を測定する工程、を包含する、方法。
【請求項６７】請求項６５に記載の方法であって、前記生物活性因子また
は予期される生物活性因子と接触させていないことを除いて前記第１のアッセイ
組成物と同じように処理されているような第２のアッセイ組成物によって示され
るグリシン輸送体の量と、該第１のアッセイ組成物によって示されるグリシン輸
送体の量を比較する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６８】請求項６６に記載の方法であって、前記生物活性因子また
は予期される生物活性因子と接触させていないことを除いて前記第１のアッセイ
組成物と同じように処理されているような第２のアッセイ組成物によって示され
るグリシン輸送体の量と、該第１のアッセイ組成物によって示されるグリシン輸
送体の量を比較する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６９】前記神経系の障害もしくは状態が、（ａ）疼痛、（ｂ）痙
性、（ｃ）ミオクローヌス、（ｄ）筋痙攣、（ｅ）筋機能亢進、または（ｆ）癲
癇、からなる群のうちの１つである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】前記神経系の障害もしくは状態が、（ａ）疼痛、（ｂ）痙
性、（ｃ）ミオクローヌス、（ｄ）筋痙攣、（ｅ）筋機能亢進、または（ｆ）癲
癇、からなる群のうちの１つである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】前記痙性が、発作、頭部外傷、ニューロン細胞死、多発性
硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンティングトン病、または筋萎縮性側索硬化症と
関連する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】前記痙性が、発作、頭部外傷、ニューロン細胞死、多発性
硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンティングトン病、または筋萎縮性側索硬化症と
関連する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】核酸であって、（ａ）ラットＧｌｙＴ２輸送体の配列また
は（ｂ）哺乳動物ＧｌｙＴ１輸送体の配列とのハイブリダイゼーションを排除す
るのに十分なストリンジェンシーの条件下で、配列番号１２１である参照核酸配
列または以下のヌクレオチド置換：【化５】のうちの１つ以上を有することによって配列番号１２１の核酸配列から変動する
配列とハイブリダイズする、核酸。
【請求項７４】前記核酸がＰＣＲプライマーであり、そして前記ストリン
ジェントな条件が、ヒトＧｌｙＴ２配列を増幅するが、（ａ）ラットＧｌｙＴ２
輸送体の配列または（ｂ）哺乳動物ＧｌｙＴ１輸送体の配列を増幅しないために
有効なＰＣＲ条件である、請求項７３に記載の核酸配列。
【請求項７５】ヒトＧｌｙＴ２の遺伝子またはｃＤＮＡのコード鎖または
非コード鎖由来の隣接した配列を含む、少なくとも約１８ヌクレオチド長の核酸
であって、該隣接した配列は、該隣接した配列と整列したラットＧｌｙＴ２遺伝
子配列と比較した場合に、少なくとも１ヌクレオチドの差異を有する、核酸。
【請求項７６】請求項７３に記載のアンチセンス分子であって、隣接した
ストレッチが、配列番号１２１の核酸配列または以下のヌクレオチド置換：【化６】のうちの１つ以上を有することによって配列番号１２１の核酸配列から変動する
配列のコード鎖または非コード鎖に含まれる、アンチセンス分子。
【請求項７７】請求項７３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項７８】組織または細胞におけるＧｌｙＴ２発現を減少させる方法
であって、（ａ）ＧｌｙＴ２発現を減少させるために有効な量の請求項７３に記
載の核酸、または（ｂ）ＧｌｙＴ２発現を減少させるために有効な量で該組織ま
たは細胞において該核酸を発現させるための発現ベクターを、該組織または細胞
に適用する工程を包含する、方法。
【請求項７９】神経系の障害または状態を処置する方法であって、神経系
の障害もしくは状態を処置する有効な量の請求項７３に記載の核酸、または神経
系の障害もしくは状態を処置する有効な量の、ヒト組織もしくは細胞において該
核酸を発現させるための発現ベクターを、該患者の組織または細胞に適用する工
程を包含する、方法。
【請求項８０】動物が、グリシン輸送体に対する自己免疫抗体を有するか
否かを決定する方法であって、該方法は、該動物由来の抗体調製物または該動物
由来の体液と、グリシン輸送体を含むポリペプチド抗原または該グリシン輸送体
に由来するポリペプチド抗原とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項８１】ヒトＧｌｙＴ２に特異的な抗体を調製する方法であって、
請求項６３に記載の単離されたグリシン輸送体タンパク質で動物を免疫する工程
を包含する、方法。
【請求項８２】ヒトＧｌｙＴ２に特異的な抗体を調製する方法であって、
請求項６４に記載の単離されたグリシン輸送体タンパク質で動物を免疫する工程
を包含する、方法。
【請求項８３】精製された核酸であって、グリシン輸送体活性を有しかつ
以下のアミノ酸：（１）配列番号１２４のアミノ酸２４に対応する位置でセリン
、（２）配列番号１２４のアミノ酸７４に対応する位置でトリプトファン、（３
）配列番号１２４のアミノ酸１５５に対応する位置でグリシン、（４）配列番号
１２４のアミノ酸１８８に対応する位置でアスパラギン酸、（５）配列番号１２
４のアミノ酸３６２に対応する位置でロイシン、（６）配列番号１２４のアミノ
酸４３１に対応する位置でアラニン、および（７）配列番号１２４のアミノ酸５
８２に対応する位置でセリンを有する、ＧｌｙＴ２アミノ酸配列をコードする核
酸配列を含む、核酸。
【請求項８４】請求項８３に記載の精製された核酸であって、コードされ
るＧｌｙＴ２アミノ酸配列は、配列番号１２４のアミノ酸１〜７９７の配列であ
るが以下のアミノ酸置換：（１）２４位でセリン、（２）７４位でトリプトファ
ン、（３）１５５位でグリシン、（４）１８８位でアスパラギン酸、（５）３６
２位でロイシン、（６）アミノ酸４３１に対応する位置でアラニン、および（７
）５８２位でセリン、を有する、核酸。
【請求項８５】前記コードされるＧｌｙＴ２アミノ酸配列が、配列番号１
２０のアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の精製された核酸。