JP2002530073A - ヒト2型グリシン輸送体 - Google Patents
ヒト2型グリシン輸送体Info
- Publication number
- JP2002530073A JP2002530073A JP2000582548A JP2000582548A JP2002530073A JP 2002530073 A JP2002530073 A JP 2002530073A JP 2000582548 A JP2000582548 A JP 2000582548A JP 2000582548 A JP2000582548 A JP 2000582548A JP 2002530073 A JP2002530073 A JP 2002530073A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- seq
- amino acid
- sequence
- glyt2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000010726 Glycine Plasma Membrane Transport Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 118
- 108010063380 Glycine Plasma Membrane Transport Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 215
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 182
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 180
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 166
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 130
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 130
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 80
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 40
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 37
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 154
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 150
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 88
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 72
- 101000631937 Homo sapiens Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 2 Proteins 0.000 claims description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 37
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 34
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 claims description 33
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 29
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 23
- 101000631936 Rattus norvegicus Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 2 Proteins 0.000 claims description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 19
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 14
- 101710083171 Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 1 Proteins 0.000 claims description 13
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 claims description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 claims description 9
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 claims description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 claims description 8
- 230000036407 pain Effects 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 101100438957 Mus musculus Cd8a gene Proteins 0.000 claims description 7
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 6
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 6
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 claims description 5
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 claims description 5
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 claims description 5
- 208000002033 Myoclonus Diseases 0.000 claims description 5
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 claims description 5
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 claims description 4
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims description 4
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 102100028886 Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 2 Human genes 0.000 abstract 1
- 101710083167 Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 2 Proteins 0.000 abstract 1
- QMGVPVSNSZLJIA-FVWCLLPLSA-N strychnine Chemical compound O([C@H]1CC(N([C@H]2[C@H]1[C@H]1C3)C=4C5=CC=CC=4)=O)CC=C1CN1[C@@H]3[C@]25CC1 QMGVPVSNSZLJIA-FVWCLLPLSA-N 0.000 description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 25
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 23
- QMGVPVSNSZLJIA-UHFFFAOYSA-N Nux Vomica Natural products C1C2C3C4N(C=5C6=CC=CC=5)C(=O)CC3OCC=C2CN2C1C46CC2 QMGVPVSNSZLJIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241001279009 Strychnos toxifera Species 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 20
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 20
- 229960005453 strychnine Drugs 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 16
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 13
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 13
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 10
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000011714 Glycine Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010076533 Glycine Receptors Proteins 0.000 description 7
- 102100023145 Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 1 Human genes 0.000 description 7
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 102000040811 transporter activity Human genes 0.000 description 5
- 108091092194 transporter activity Proteins 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- -1 Th 1. r Chemical group 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 102000058105 human SLC6A5 Human genes 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 102000034263 Amino acid transporters Human genes 0.000 description 3
- 108050005273 Amino acid transporters Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 3
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000934342 Mus musculus T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 101100015376 Rattus norvegicus Gnaz gene Proteins 0.000 description 2
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 108010078347 pregnancy-associated murine protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 2
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 2
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- DFUSDJMZWQVQSF-XLGIIRLISA-N (2r)-2-methyl-2-[(4r,8r)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical class OC1=CC=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 DFUSDJMZWQVQSF-XLGIIRLISA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-CNRUNOGKSA-N 2-amino-2-tritioacetic acid Chemical compound [3H]C(N)C(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-CNRUNOGKSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- BOJKULTULYSRAS-OTESTREVSA-N Andrographolide Chemical compound C([C@H]1[C@]2(C)CC[C@@H](O)[C@]([C@H]2CCC1=C)(CO)C)\C=C1/[C@H](O)COC1=O BOJKULTULYSRAS-OTESTREVSA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- 101100505076 Caenorhabditis elegans gly-2 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102100033779 Collagen alpha-4(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 239000004705 High-molecular-weight polyethylene Substances 0.000 description 1
- 101000710870 Homo sapiens Collagen alpha-4(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000887490 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(z) subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000740112 Homo sapiens Membrane-associated transporter protein Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100037258 Membrane-associated transporter protein Human genes 0.000 description 1
- 101100015375 Mus musculus Gnaz gene Proteins 0.000 description 1
- HSHXDCVZWHOWCS-UHFFFAOYSA-N N'-hexadecylthiophene-2-carbohydrazide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCNNC(=O)c1cccs1 HSHXDCVZWHOWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 208000001738 Nervous System Trauma Diseases 0.000 description 1
- 102000005665 Neurotransmitter Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010084810 Neurotransmitter Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 101100041799 Rattus norvegicus Slc6a5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 101000802478 Sylvirana guentheri Brevinin-2GHa Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOKMIHKIMQNRES-UHFFFAOYSA-L [Cl-].[Cl-].[Cr++]Cc1ccccc1 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Cr++]Cc1ccccc1 QOKMIHKIMQNRES-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000005441 aurora Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003185 calcium uptake Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011424 computer programming method Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002461 excitatory amino acid Effects 0.000 description 1
- 239000003257 excitatory amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000009540 excitatory neurotransmission Effects 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000052301 human GNAZ Human genes 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009539 inhibitory neurotransmission Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003040 nociceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000037324 pain perception Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000000063 presynaptic terminal Anatomy 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010007439 proline transporter Proteins 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- SRVJKTDHMYAMHA-WUXMJOGZSA-N thioacetazone Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(\C=N\NC(N)=S)C=C1 SRVJKTDHMYAMHA-WUXMJOGZSA-N 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Psychology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
のような核酸によりコードされるタンパク質、GlyT2活性化合物を特徴付け
る方法、GlyT2輸送体をコードする核酸に対するDNAおよびRNAのヌク
レオチドプローブの使用、GlyT2発現を阻害するためのアンチセンス分子の
使用、GlyT2特異的抗体を生成するためのGlyT2タンパク質の使用、お
よびGlyT2発現細胞株を使用するスクリーニング方法、ならびに薬物探索の
分野に関する。
不活化、またはシナプス前の末端もしくは周辺のグリア細胞へのそれらの取り込
みのいずれかを包含する(Amara,S.G.およびKuhar,M.J.,
Annu.Rev.Neurosci.16:73−93(1998);Mal
andro,M.S.およびKilberg,M.S.,Annu.Rev.B
iochem.65:305−336(1996))。高親和性の膜会合輸送体
は、代表的には、シナプス間隙からの神経伝達物質の迅速な除去を媒介する。濃
度勾配を介する取り込みは、膜内外のイオン勾配に対して熱力学的に共役してい
る(Kanner,B.I.,Curr.Opin.Cell Biol.1:
735−738(1989))。
方のファミリーは、Na+依存的興奮性アミノ酸取り込みを媒介する(Kana
i,Y.およびHediger,M.A.,Nature 360:467−4
71(1992);Pines,G.ら、Nature 360:464−46
6(1993);Storckら、Proc.Natl.Acad.Sci.(
USA)89:10855−10859(1992))。他方のファミリーは、
他の神経伝達物質について宿主のNa+/Cl-依存的輸送に関与するいくつかの
膜を含む。それらの神経伝達物質としては、以下が挙げられる:GABA(Bo
rden,L.A.ら、J.Biol.Chem.267:21096−211
04(1992));カテコールアミン(Pacholczyk,T.ら、Na
ture 350:350−354(1991));グリシン(Kimら、Mo
l.Pharm.45:608−17(1994);Liu,Q.R.ら、FE
BS Lett.305:110−114(1992a));プロリン(Fre
meau,R.T.ら、Neuron 8:915−926(1992))およ
びタウリン(Liu,Q.R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(
USA)89:12145−12149(1992b))。後者のファミリーの
大部分に関する遺伝子産物が、最近クローニングされ、そして配列決定された。
これらの輸送体は、40〜50%のアミノ酸類似性を示し、そして構造的保存性
を示すようである。なぜなら、膜トポロジー分析により、12の推定膜貫通領域
が予測されるからである(Guastella,J.ら、Science 24
9:1303−1306(1990);Smith,K.E.ら、Neuron
8:927−935(1992))。これらの膜貫通領域内の高い相同性は、
PCRベースの技術を用いる輸送体スーパーファミリーのさらなるメンバーのク
ローニングのための縮重プライマーの設計を容易にした(Borowsky,B
.ら、Neuron 10:851−863(1993);Hoffman,B
.J.ら、Science 254:579−580(1991))。
。脊髄、脳幹および網膜において、グリシンは、ストリキニーネ感受性グリシン
レセプターに対する効果を発揮する(Betz,H.ら、Ann.N.Y.Ac
ad.Sci.,207:109−115(1993);Betz,H.ら、Q
.Rev.Biophys.25:381−394(1992))。さらに、グ
リシンは、NMDAレセプターにおいてグルタミン酸とともにコアゴニスト(c
o−agonist)として作用する(Kemp,J.A.およびLeeson
,P.D.,Trends.Pharmacol.Sci.14:20−25(
1993);Benveniste,M.ら、J.Physiol.(Lond
on)428:333−357(1990))。シナプスのグリシン濃度は、神
経末端およびグリア細胞において見出されるNa+/Cl-依存的高親和性輸送体
により制御される(Johnston,G.A.R.およびIverson,L
.L.,J.Neurochem.18:1951−1961(1971);F
edele E.およびFoster A.C.,Brain Res.572
:154−163(1992))。2つの異なるグリシン輸送体である、Gly
T1(Smith,K.E.ら、Neuron 8:927−935(1992
);Liu,Q.R.ら、FEBS Lett.305:110−114(19
92a);Guastella,J.ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.(USA)89:7189−7193(1992))およびGlyT2(L
iu,Q.R.ら、J.Biol.Chem.268:22802−22806
(1993))が単離され、そしてヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルの
両方で約50%の同一性を共有する。インサイチュハイブリダイゼーション技術
によるGlyT1およびGlyT2の位置決めによって、CNSにおける発現の
異なるパターンが示される(Liu,Q.R.ら、J.Biol.Chem.2
68:22802−22806(1993);Zafra,F.ら、J.Neu
rosci.15:3952−3969(1995))。GlyT1は、脳の海
馬および皮質領域ならびに脊髄および脳幹領域において発現される。対照的に、
GlyT2は、脊髄および小脳において主に発現され、そして海馬および皮質領
域において存在しない。それらの発現パターンに基づくと、GlyT1は、NM
DAレセプターとともに共存する(colocalize)が、GlyT2発現
は、ストリキニーネ感受性グリシンレセプターの発現を模倣すると考えられる(
JurskyおよびNelson、J.Neurochem.67:336−3
44(1996);Liu,Q.R.ら、J.Biol.Chem.268−2
2802−22806(1993))。
ラット(Guastella,J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci
.(USA)89:7189−7193(1992))、マウス(Liu,Q.
R.ら、FEBS Lett.305:110−114(1992a))、およ
びヒト(Kim,K−M.ら、Mol.Pharm.45:608−17(19
94))が挙げられる。ヒト輸送体の3つの選択的スプライシング形態により、
それらのアミノ末端配列が異なる(GlyT1a〜GlyT1c)ことを同定し
た(Guastella,J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(
USA)89:7189−7193(1992);Liu,Q.R.ら、FEB
S Lett.305:110−114(1992a);Liu,Q.R.ら、
J.Biol.Chem.268:22802−22806(1993);Sm
ith,K.E.ら、Neuron 8:927−935(1992);Bor
owsky,B.ら、Neuron 10:851−863(1993);Ki
m,K−M.ら、Mol.Pharm.45:608−17(1994))。ラ
ットGlyT2配列が公表されており(Liu,Q.R.ら、J.Biol.C
hem.268:22802−22806(1993))、そしてこれはまた、
選択的スプライシング形態を示す(GlyT2aおよびGlyT2b)(Pon
ce,J.ら、Neurosci.Lett.242:25−28(1998)
)。最近、ヒトGlyT2のpHGT2−aおよびpHGT2−bとして記載さ
れた2つの全長クローンが構築された(WO98/07854;PCT/US9
7/14637)。
スである。なぜなら、グリシンは、興奮性および阻害性の両方の神経伝達に関与
するからである(Betz,H.ら、Ann.N.Y.Acad.Sci.,2
07:109−115(1993);Benveniste,M.ら、J.Ph
ysiol.(London)428:333−357(1990))。グリシ
ン輸送体は、このプロセスにおいて重要であるようである。グリシン輸送体の機
能を調節し得る(すなわち、グリシン輸送体を阻害または活性化し得る)化合物
は、広範な種々の治療的利益をもたらすことが予測される。例えば、グリシンレ
セプター阻害は、疼痛の伝達を生じることが公知である(Yaksh,Pain
,111−123(1989))。従って、GlyT2輸送体活性を阻害する化
合物は、ストリキニーネ感受性グリシンレセプターを有するニューロンの活性を
、グリシンのシナプスレベルを増大させることにより増大し得、従って、脊髄に
おける疼痛に関連する(すなわち、侵害受容の)情報の伝達を減少させ得る。こ
のことは、これらのレセプターにより媒介されることが示されている。さらに、
グリシンレセプターの機能不全は、筋痙性における役割を果たすことが公知であ
る(Becker,FASEB J.4:2767−2775(1990))の
で、GlyT2輸送体活性を阻害し、そして脊髄のストリキニーネ感受性グリシ
ンレセプターを通じて阻害性のグリシン作動性伝達の増強を導く化合物を用いて
、筋能亢進を低減させ得る。このような化合物は、増大した筋収縮と関連した疾
患または状態(例えば、筋痙性、ミオクローヌス(これは、急激な筋痙攣に関連
する)、および癲癇)を処置する際に有用である。グリシンレセプターの調節を
介して処置され得る痙性は、癲癇、発作(stroke)、頭部外傷、多発性硬
化症、脊髄損傷、失調症、および他の神経系の疾病および損傷の状態と関連する
。
リシン輸送体活性を有し、かつ以下のアミノ酸うちの1つ以上を有するタンパク
質をコードする核酸を含む核酸が提供される:(1)配列番号124のアミノ酸
24に対応する位置でセリン、(2)配列番号124のアミノ酸74に対応する
位置でトリプトファン、(3)配列番号124のアミノ酸155に対応する位置
でグリシン、(4)配列番号124のアミノ酸188に対応する位置でアスパラ
ギン酸、(5)配列番号124のアミノ酸362に対応する位置でロイシン、(
6)配列番号124のアミノ酸431に対応する位置でアラニン、または(7)
配列番号124のアミノ酸582に対応する位置でセリン。好ましいGlyT2
配列は、配列番号120のアミノ酸配列を含む。本発明は、核酸配列が、配列番
号123の塩基1〜2391の配列であるが、以下のヌクレオチドの1つ以上を
有する核酸を提供する:(1)70位でA、(2)220位でT、(3)463
位でG、(4)562位でG、(5)1085位でT、(6)1292位でC、
(7)1299位でA、(8)1617位でT、または(9)1744位でT。
好ましいGlyT2配列は、配列番号119の核酸配列を含む。
かつ以下のアミノ酸のうちの1つ以上をさらに有するタンパク質をコードする核
酸配列を含む核酸もまた提供される:(1)配列番号124のアミノ酸26に対
応する位置でロイシン、(2)配列番号124のアミノ酸75に対応する位置で
ロイシン、(3)配列番号124のアミノ酸89に対応する位置でバリン、(4
)配列番号124のアミノ酸102に対応する位置でグリシン、(5)配列番号
124のアミノ酸174に対応する位置でグルタミン酸、(6)配列番号124
のアミノ酸195に対応する位置でプロリン、(7)配列番号124のアミノ酸
199に対応する位置でグリシン、(8)配列番号124のアミノ酸249に対
応する位置でロイシン、(9)配列番号124のアミノ酸306に対応する位置
でプロリン、(10)配列番号124のアミノ酸419に対応する位置でグルタ
ミン酸、(11)配列番号124のアミノ酸442に対応する位置でアスパラギ
ン、(12)配列番号124のアミノ酸455に対応する位置でリジン、(13
)配列番号124のアミノ酸458に対応する位置でシステイン、(14)配列
番号124のアミノ酸485に対応する位置でプロリン、(15)配列番号12
4のアミノ酸493に対応する位置でアルギニン、または(16)配列番号12
4のアミノ酸650に対応する位置でグルタミン酸。
2391の配列であるが、上記の9つのヌクレオチドのうちの1つ以上を有し、
しかし以下のヌクレオチドのうちの1つ以上をさらに有する核酸配列を提供する
:(a)77位でT、(b)220位でT、(c)244位でT、(d)266
位でT、(e)304位でG、(f)521位でA、(g)583位でC、(h
)596位でG、(i)678位でG、(j)681位でC、(k)745位で
T、(l)750位でC、(m)765位でT、(n)777位でCまたはA、
(o)867位でG、(p)917位でC、(q)1256位でA、(r)12
92位でC、(s)1325位でA、(t)1364位でA、(u)1374位
でC、(v)1392位でA、(w)1454位でC、(x)1478位でG、
(y)1854位でC、(z)1949位でA、(aa)1959位でC、また
は(bb)2130位でC。
番号124のアミノ酸24に対応する位置でセリン、(2)配列番号124のア
ミノ酸74に対応する位置でトリプトファン、(3)配列番号124のアミノ酸
155に対応する位置でグリシン、(4)配列番号124のアミノ酸188に対
応する位置でアスパラギン酸、(5)配列番号124のアミノ酸362に対応す
る位置でロイシン、(6)配列番号124のアミノ酸431に対応する位置でア
ラニン、または(7)アミノ酸582に対応する位置でセリンのうちの1つ以上
を有し、そして以下のアミノ酸:(1)配列番号124のアミノ酸124に対応
する位置でフェニルアラニン、(2)配列番号124のアミノ酸279に対応す
る位置でアスパラギン、(3)配列番号124のアミノ酸393に対応する位置
でグリシン、(4)配列番号124のアミノ酸457に対応する位置でアスパラ
ギン、(5)配列番号124のアミノ酸463に対応する位置でアスパラギン、
(6)配列番号124のアミノ酸610に対応する位置でチロシン、(7)配列
番号124のアミノ酸611に対応する位置でバリン、(8)配列番号124の
アミノ酸733に対応する位置でセリン、(9)配列番号124のアミノ酸73
5に対応する位置でバリン、(10)配列番号124のアミノ酸245に対応す
る位置でロイシン、(11)配列番号124のアミノ酸305に対応する位置で
ロイシン、(12)配列番号124のアミノ酸366に対応する位置でイソロイ
シン、または(13)配列番号124のアミノ酸400に対応する位置でプロリ
ンのうちの1つ以上をさらに有するタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸
を提供する。
が、以下のヌクレオチド:(1)70位でA、(2)220位でT、(3)46
3位でG、(4)562位でG、(5)1085位でT、(6)1292位でC
、(7)1299位でA、(8)1617位でT、または(9)1744位でT
のうちの1つ以上を有し、しかし以下のヌクレオチド:(a)6位でC、(b)
371位でT、(c)571位でT、(d)836位でA、(e)1116位で
G、(f)1177位でG、(g)1371位でC、(h)1387位でA、(
i)1829位でA、(j)1831位でG、(k)2198位でC、(l)2
203位でG、(m)342位でG、(n)733位でC、(o)913位でC
、(p)951位でA、(q)1097位でT、(r)1199位でC、(s)
352位でT、または(t)2103位でAのうちの1つ以上をさらに有する核
酸を提供する。
ミノ酸置換:(1)Pro26からLeuへ、(2)Arg74からTrpへ、(3
)Pro75からLeuへ、(4)Ala89からValへ、(5)Ser102から
Glyへ、(6)Val174からGluへ、(7)Ser195からProへ、(8
)Asp199からGlyへ、(9)Val249からLeuへ、(10)Leu306
からProへ、(11)Gly419からGluへ、(12)Thr442からAsn
へ、(13)Thr455からLysへ、(14)Trp458からCysへ、(15
)Leu485からProへ、(16)Lys493からArgへ、もしくは(17)
Val650からGluへ、の置換を有する以外は、配列番号122のタンパク質
配列に対応する配列と少なくとも約96%の配列同一性を有するグリシン輸送体
をコードする核酸を提供する。好ましくは、配列同一性は、少なくとも約97%
、より好ましくは少なくとも約98%。なおより好ましくは少なくとも約99%
、なおより好ましくは少なくとも約99.5%である。本発明の別の実施形態に
おいて、配列同一性は100%である。好ましくは、コードされるグリシン輸送
体は、参照タンパク質配列の200アミノ酸から797アミノ酸までの領域にお
いて4アミノ酸に過ぎない差違を有し、ここで参照配列は、配列番号122また
は上記の置換の1つを有する以外は配列番号122のタンパク質配列に対応する
配列である。より好ましくは、コードされたグリシン輸送体は、2つのこのよう
な差違を有するに過ぎない。
て、そのベクターは、少なくとも1つの真核生物細胞または細菌細胞において、
グリシン輸送体mRNAを発現するのに効果的である。本発明の別の実施形態に
おいて、そのベクターは、少なくとも1つの哺乳動物細胞、酵母細胞またはトリ
(avian)細胞においてmRNAを発現するのに効果的である。
リシン輸送体を提供し、その輸送体は、上記に記載される核酸によってコードさ
れるアミノ酸配列、またはそのような核酸によってコードされるアミノ酸配列の
1つから2つの隣接した部分を含み、ここでそのタンパク質は、グリシン輸送体
活性を有し、そしてWO98/07854(PCT/US97/14637)(
ヒト)またはLiuら、J.Biol.Chem.268:22802−228
08(1993)(ラット)によって記載されるGlyT2輸送体配列の整列し
たセグメントと、配列において異なる。本明細書中で使用される隣接した配列と
は、関連する参照核酸配列または参照アミノ酸配列の中断されていない部分をい
う。好ましくは、本発明のグリシン輸送体タンパク質は、WO98/07854
(PCT/US97/14637)(ヒト)またはLiuら、J.Biol.C
hem.268:22802−22808(1993)(ラット)によって記載
されるGlyT2輸送体配列の整列したセグメントと、少なくとも2つのアミノ
酸、より好ましくは少なくとも4つのアミノ酸で配列が異なる。好ましくは、隣
接した配列は、少なくとも約600アミノ酸、より好ましくは少なくとも約70
0アミノ酸、より好ましくは少なくとも約750アミノ酸を含む。1つの実施形
態において、その輸送体タンパク質は、上記の核酸によってコードされるタンパ
ク質配列のすべてを含む。好ましくは、その輸送体タンパク質は、配列番号12
2のタンパク質配列に示されるアミノ酸配列、または1つ以上の以下のアミノ酸
置換:(1)Pro26からLeuへ、(2)Arg74からTrpへ、(3)Pr
o75からLeuへ、(4)Ala89からValへ、(5)Ser102からGly
へ、(6)Val174からGluへ、(7)Ser195からProへ、(8)As
p199からGlyへ、(9)Val249からLeuへ、(10)Leu306からP
roへ、(11)Gly419からGluへ、(12)Thr442からAsnへ、(
13)Thr455からLysへ、(14)Trp458からCysへ、(15)Le
u485からProへ、(16)Lys493からArgへ、または(17)Val65 0 からGluへ、の置換を有する以外は、配列番号122のタンパク質配列に対
応する配列、またはこれらの配列の1つから2つの隣接した部分を含むアミノ酸
配列を含む。
の隣接した部分、または1つ以上の以下のアミノ酸置換:(1)Pro26からL
euへ、(2)Arg74からTrpへ、(3)Pro75からLeuへ、(4)A
la89からValへ、(5)Ser102からGlyへ、(6)Val174からGl
uへ、(7)Ser195からProへ、(8)Asp199からGlyへ、(9)V
al249からLeuへ、(10)Leu306からProへ、(11)Gly419か
らGluへ、(12)Thr442からAsnへ、(13)Thr455からLysへ
、(14)Trp458からCysへ、(15)Leu485からProへ、(16)
Lys493からArgへ、もしくは(17)Val650からGluへ、の置換を有
する以外は、配列番号122のタンパク質配列に対応するアミノ酸配列の1つか
ら2つの隣接した部分と、少なくとも約99.5%の配列同一性を有する輸送体
タンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、コードされるタンパク質は、グ
リシン輸送体活性を有する。好ましくは、隣接した配列は、少なくとも約600
アミノ酸、より好ましくは少なくとも約700アミノ酸、より好ましくは少なく
とも約750アミノ酸を含む。本発明はまた、この核酸を含むベクターを提供す
る。1つの実施形態において、そのベクターは、少なくとも1つの真核生物細胞
または原核生物細胞(例えば、細菌細胞)においてグリシン輸送体mRNAを発
現するのに効果的である。本発明の別の実施形態において、そのベクターは、少
なくとも1つの酵母細胞、哺乳動物細胞、またはトリ細胞においてmRNAを発
現するのに効果的である。
いは、配列番号122のタンパク質配列の1つから2つの隣接した部分、または
1つ以上の以下:(1)Pro26からLeuへ、(2)Arg74からTrpへ、
(3)Pro75からLeuへ、(4)Ala89からValへ、(5)Ser102
からGlyへ、(6)Val174からGluへ、(7)Ser195からProへ、
(8)Asp199からGlyへ、(9)Val249からLeuへ、(10)Leu 306 からProへ、(11)Gly419からGluへ、(12)Thr442からA
snへ、(13)Thr455からLysへ、(14)Trp458からCysへ、(
15)Leu485からProへ、(16)Lys493からArgへ、もしくは(1
7)Val650からGluへ、の置換を有する以外は、配列番号122のタンパ
ク質配列に対応する配列の1つから2つの隣接した部分と、少なくとも約99.
5%の配列同一性を有する輸送体タンパク質をコードする第2の外因的に由来す
る核酸を含む、細胞を提供する。ここで、コードされるタンパク質は、グリシン
輸送体活性を有する。1つの実施形態において、その細胞は、その核酸に由来す
るグリシン輸送体を発現する。好ましくは、その核酸は、細胞中で作動可能であ
るプロモーターと機能的に結合される。本発明の1つの実施形態において、その
プロモーターは誘導性プロモーターである。
含する、グリシン輸送体を産生する方法を提供する。この方法はさらに、(a)
その細胞から膜(この膜は、グリシン輸送体を含む)を単離する工程、または(
b)その細胞からタンパク質画分(この画分は、グリシン輸送体を含む)を抽出
する工程の少なくとも1つを包含し得る。
るため、または神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子を同定す
るための方法を提供し、この方法は、(a)(i)上記のような細胞、または(
ii)上記の第1もしくは第2の外因的に由来する核酸によってコードされるア
ミノ酸配列を含む単離されたグリシン輸送体タンパク質を含む組成物の第1のア
ッセイ、を提供する工程、(b)第1のアッセイ組成物を、生物活性因子または
予期される生物活性因子と接触させる工程、およびそのアッセイ組成物によって
示されるグリシン輸送の量を測定する工程、を包含する。好ましくは、この方法
は、第1のアッセイ組成物によって示されるグリシン輸送の量を、生物活性因子
または予期される生物活性因子を接触されない以外は、第1のアッセイ組成物と
同様に処理される第2のこのようなアッセイ組成物によって示されるグリシン輸
送の量と比較する工程をさらに包含する。その方法は、生物活性因子を特徴付け
するために使用され得、ここで神経系障害または状態は、以下を含む群の1つで
あるが、これらに限定されない:(a)疼痛、(b)痙性、(c)ミオクローヌ
ス、(d)筋痙攣、(e)筋機能亢進、または(f)癲癇。好ましい実施形態に
おいて、生物活性因子が特徴付けられる痙性は、発作、頭部外傷、ニューロン細
胞死、多発性硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンティングトン病、または筋萎縮性
側索硬化症と関連する。
の置換:(a)C77→T、(b)C220→T、(c)C224→T、(d)C266→
T、(e)A304→G、(f)T521→A、(g)T583→C、(h)A596→G、
(i)A678→G、(j)T681→C、(k)G745→T、(l)G750→C、(m
)C765→T、(n)G777→C、(o)A867→G、(p)T917→C、(q)G 1256 →A、(r)T1292→C、(s)C1325→A、(t)C1364→A、(u)G 1374 →C、(v)C1392→A、(w)T1454→C、(x)A1478→G、(y)T 1854 →C、(z)T1949→A、(aa)T1959→C、もしくは(bb)T2130→
Cを有することによって配列番号121の核酸配列から変動する配列と、十分な
ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズして、(a)GlyT2輸送体に
ついての配列または(b)哺乳動物GlyT1輸送体についての配列とのハイブ
リダイゼーションを排除する核酸を提供する。好ましくは、その核酸配列は、少
なくとも18ヌクレオチドの長さであり、そして参照核酸配列に組み込まれた配
列と少なくとも約95%の配列同一性を有する。好ましくは、その核酸配列は、
少なくとも約40ヌクレオチドの長さ、より好ましくな少なくとも約100ヌク
レオチドの長さである。好ましくは、その核酸配列は、上記に挙げた参照配列と
、少なくとも約97%の配列同一性、より好ましくは99%の配列同一性を有す
る。好ましくは、その核酸はPCRプライマーであり、そしてストリンジェント
な条件は、ヒトGlyT2配列を増幅するが、(a)ラットもしくはマウスのG
lyT2輸送体についての配列または(b)哺乳動物のGlyT1輸送体につい
ての配列を増幅しないのに有効なPCR条件である。
コード鎖由来の隣接した配列を含む、少なくとも約18ヌクレオチドの長さの核
酸を提供し、ここでその隣接した配列は、隣接した配列とともに整列したラット
GlyT2遺伝子配列と比較した場合に、少なくとも1つの配列の差異を有する
。好ましくは、その核酸配列は、少なくとも約40ヌクレオチドの長さ、より好
ましくは少なくとも約100ヌクレオチドの長さである。好ましくは、その隣接
した配列は、隣接した配列とともに整列したラットGlyT2遺伝子配列と比較
した場合に、少なくとも2つの差異、より好ましくは3つの差異を有する。
胞において、または組織、器官、もしくは動物の細胞において、GlyT2の発
現を減少するのに効果的である、GlyT2についてのヒト遺伝子またはcDN
Aのコード鎖または非コード鎖由来の隣接した配列を含むアンチセンス分子を提
供し、ここでその隣接した配列は、その隣接した配列とともに整列したラットG
lyT2遺伝子配列と比較した場合に、少なくとも1つの配列の差異を有する。
好ましくは、隣接した配列は、隣接した配列とともに整列したラットGlyT2
遺伝子配列と比較した場合に、少なくとも2つの差異、より好ましくは3つの差
異を有する。アンチセンス分子は、本明細書中では、ゲノムDNAまたはmRN
Aに結合して、転写または翻訳を妨害する(mRNAの安定性を妨害することを
含む)ために設計された分子をいうために使用される。好ましくは、その隣接し
た配列は、少なくとも約15ヌクレオチドの長さである。好ましくは、隣接した
ストレッチは、配列番号121の核酸配列のコード鎖または非コード鎖に含まれ
る。本発明はさらに、このようなアンチセンス分子を含む発現ベクターを提供す
る。
センス分子の一定量を組織または細胞に適用する工程を含む、組織または細胞に
おいてGlyT2発現を減少する方法を提供する。組織または細胞においてGl
yT2発現を減少させるのに効果的なそのようなアンチセンス分子を発現するた
めの一定量の発現ベクターもまた、提供される。あるいは、本発明は、神経系の
障害または状態を処置する方法を提供し、この方法は、神経系の障害もしくは状
態を有するヒト患者の組織もしくは細胞に、そのような神経系の障害もしくは状
態を処置するのに効果的な一定量のそのようなアンチセンス分子、またはそのよ
うな神経系の障害もしくは状態を処置するのに効果的な、組織もしくな細胞にお
いてそのようなアンチセンス分子を発現するための一定量の発現ベクター、を適
用する工程を包含する。
かを検出するための方法を提供し、この方法は、動物由来の抗体調製物または動
物由来の体液を、グリシン輸送体を含むポリペプチド抗原、またはグリシン輸送
体から誘導されたポリペプチド抗原と接触させる工程を包含する。好ましくは、
そのポリペプチド抗原は、配列番号122のタンパク質配列、または1つ以上の
以下:(1)Pro26からLeuへ、(2)Arg74からTrpへ、(3)Pr
o75からLeuへ、(4)Ala89からValへ、(5)Ser102からGly
へ、(6)Val174からGluへ、(7)Ser195からProへ、(8)As
p199からGlyへ、(9)Val249からLeuへ、(10)Leu306からP
roへ、(11)Gly419からGluへ、(12)Thr442からAsnへ、(
13)Thr455からLysへ、(14)Trp458からCysへ、(15)Le
u485からProへ、(16)Lys493からArgへ、もしくは(17)Val 650 からGluへ、の置換を有する以外は、配列番号122のタンパク質配列に
対応する配列を有するタンパク質配列によってコードされる隣接した配列を含む
。好ましくは、隣接した配列は、少なくとも約6アミノ酸の長さ、より好ましく
は少なくとも約10アミノ酸の長さ、なおより好ましくは、少なくとも約15ア
ミノ酸の長さである。本発明の1つの実施形態においてそのペプチド抗原は、G
lyT1輸送体またはGlyT2輸送体のいずれかに対する抗体について選択性
である。
送体タンパク質の使用を提供する。
、または対応する、配列番号120および122のコードされたタンパク質配列
は、WO98/07854(PCT/US97/14637)に開示されたヒト
GlyT2輸送体配列およびLui、Q.R.ら、J.Biol.Chem.2
68:22802〜22808(1993)に開示されるラットGlyT2輸送
体配列のアナログである。配列番号119のGlyT2の核酸配列は、全長ヒト
GlyT2輸送体にわたる、6つのPCR増幅cDNAフラグメント(図1のフ
ラグメントA〜F)の連結により調製される全長ヒトGlyT2輸送体cDNA
の核酸配列である。配列番号121のGlyT2核酸配列は、全長ヒトGlyT
2輸送体のコンセンサス核酸配列を示す。ここで、このコンセンサス配列は、全
長GlyT2輸送体の配列にわたる種々のPCR増幅フラグメント(図1のフラ
グメントA〜F)のそれぞれの少なくとも8つのクローンの配列分析により誘導
される。さらなる核酸配列および対応するコードされたタンパク質配列は、フラ
グメントA〜Fのそれぞれの8つのクローンの配列を示す、配列番号22〜11
8に示される。これらの核酸配列は、コンセンサス配列からのさらなる改変体を
示し、そしてこれらのクローンを生成するために用いられたプールされたmRN
Aサンプルから誘導されたcDNA内に存在する対立遺伝子改変体を最もよく反
映するようである。
種々の核酸配列は、以下の配列改変体を示す:
挿入を除いて)、GlyT2輸送体活性の機能に有害に影響しないと考えられて
いる。
の核酸配列を生成するために用いられる物質は、一般に69、92、および92
の個体の3つのプール、ならびに個体由来の細胞株を含んだ。プールされた供給
源物質の使用は、保存された置換、またはサイレント置換の数と共に、バリエー
ションがヒト由来のバリエーションを反映するという結論を支持する。
チド配列との間、ならびにそれらがコードする配列の間の関係は、以下の表に示
される。これらの表に示される関係の値または配列同一性は、LASERGEN
Eコンピュータープログラム(DNASTAR,Inc.,Madison,W
I)を使用して決定された。
ラットヌクレオチド配列との間の関係、およびそれらの対応するタンパク質配列
を決定した。このヒトGlyT2輸送体配列は、ラットGlyT2配列(Liu
,Q.R.ら、J.Biol.Chem.268:22802−22806(1
993))と、非常に高い相同性を示した。これは、ヌクレオチドおよびアミノ
酸のレベルで、それぞれ、約88%および約93%である、2つの種の間の全体
の相同性を有する。このヒトGlyT2輸送体配列およびアミノ酸輸送体ファミ
リーの他のメンバーの配列は、約50%のアミノ酸相同性を共有する。ラットG
lyT2タンパク質とヒトGlyT2タンパク質との間の最も高い多様性は、最
初の190アミノ酸の中にあり、ここで、約74%の保存のみが観察される。
るような、特に、このような配列のストリング(string)間の一致により
決定されるような2つ以上のポリペプチド配列、または2つ以上のポリヌクレオ
チド配列の間の関係である。配列同一性、または同一性%、もしくは相同性%は
、公知の方法により容易に計算される
は当業者に周知である(例えば、Sequence Analysis in
Molecular Biology、前出;Sequence Analys
is Primer, 前出;およびCarillo,H.およびLipman
,D.,SIAM,J.Applied Math.48:1073(1988
)を参照のこと)。配列間の同一性を決定するために一般的に用いられる方法と
しては、Carillo,H.およびLipman,D.、前出、またはNee
dlemanおよびWunsch,J.Mol.Biol.,48:443−4
45(1970)に開示されるもの(ここで、パラメーターは、DNASISの
バージョン2(Hitachi Software Engineering
Co.,San Bruno,CA)において設定されるのと同じである)が挙
げられるが、これらに限定されない。同一性を決定するためのコンピュータープ
ログラムは、公的に利用可能である。2つの配列の間の同一性を決定するための
好ましいコンピュータープログラム方法としては、以下が挙げられるが、これら
に限定されない:LASERGENEプログラム(DNASTAR,Inc.,
Madison,WI);GCGプログラムパッケージ(Devereux,J
.ら、Nucleic Acids Research 12(1):387(
1984);BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschu
l,S.F.ら、J.Mol.Biol.215:403−410(1990)
)。BLAST Xプログラムは、NCBI(blast@ncbi.nlm.
nih.gov)および他の供給源(BLAST Manual, Altsc
ul,S.ら、NCBI NLM NIH,Bethesda,MD 2089
4;Altschul,S.ら、前出)から公的に利用可能である。
4(PCT/US97/14637)に記載されるpHGT2−aおよびpHG
T2−bヒトGlyT2輸送体配列と異なる。差異は、核酸配列およびアミノ酸
配列において、それぞれ、以下のように示される:
列が、開始点として用いられ得、かつ特定の要求を満たすように改変され得る。
例えば、この配列は、有用な制限酵素部位を組み込むように変異され得る。Ma
niatisら、Molecular Cloning,a Laborato
ry Manual,Cold Spring Harbor Press(1
989)を参照のこと。このような制限部位を用いて、カセット、または制限酵
素および連結反応を用いて容易に置換される核酸配列の領域を作成し得る。この
カセットを用いて、変異したグリシン輸送体アミノ酸配列をコードする合成配列
を置換する(例えば、Goeddlら、Proc.Natl.Acad.Sci
.USA,76:106−110(1979)を参照のこと)。組換え発現目的
のために、このような核酸が発現される生物に優先的なコドンの使用は、合成グ
リシン輸送体コード核酸を設計することにおいて、有利であると考えられている
。例えば、原核生物コドンの使用頻度(preference)を組み込んでい
る核酸配列は、National Biosciences、Inc.(Ply
mouth,MN)から入手可能な、Oligo−4のようなソフトウェアプロ
グラムを用いて、哺乳動物由来配列から設計され得る。
好ましくは二重鎖デオキシリボ核酸配列である。しかし、これらはまた、リボ核
酸配列であり得る。
または核酸配列を変異させること、およびこれらの欠失または変異した配列によ
りコードされるタンパク質の機能を確認することが知られている。従って、本発
明はまた、グリシンに特異的に結合し、かつグリシンを膜を越えて輸送する能力
を保持するタンパク質をコードするヒト核酸配列の変異したまたは欠失したバー
ジョンに関する。これらのアナログは、GlyT2機能が保持される限り、N末
端欠失、C末端欠失、または内部欠失を有し得る。ヒトGlyT2タンパク質配
列を保持することは、1つ以上の以下:
関して、好ましくは、約4を超えないアミノ酸バリエーション、好ましくは、2
を超えないアミノ酸バリエーション、より好ましくは、1を超えないアミノ酸バ
リエーションを有する。より好ましくは、このバリエーションは、配列番号12
0または配列番号122、なおより好ましくは、配列番号120のタンパク質配
列に関する。1つの好ましい実施形態において、本発明のタンパク質の実施形態
は、配列番号120または配列番号122のタンパク質配列に関して定義される
か、または1つ以上の以下:
対応する配列を用いて定義される。点バリエーションは、好ましくは保存された
点バリエーションである。好ましくは、アナログまたは改変体は、配列番号12
2のタンパク質配列、またはまたは1つ以上の以下:
、少なくとも約96%の配列同一性、好ましくは少なくとも約97%、より好ま
しくは少なくとも約98%、なおより好ましくは99.5%を有する。より好ま
しくは、このバリエーションは、配列番号120または配列番号122、なおよ
り好ましくは、配列番号120のタンパク質配列に関する。変異アプローチまた
は欠失アプローチは、ヒトGlyT2タンパク質を発現する本発明の核酸配列の
全てに適用され得る。上記のように、保存的変異が好ましい。このような保存的
変異は、以下の群の1つの中で、あるアミノ酸を別のアミノ酸に変換する変異を
含む: 1. 低分子脂肪族、無極性またはわずかに極性の残基:Ala、Ser、Th
r、ProおよびGly; 2. 極性、負に荷電する残基、およびそれらのアミド:Asp、Asn、Gl
uおよびGln; 3. 極性、、正に荷電する残基:His、ArgおよびLys; 4. 高分子脂肪族、無極性残基:Met、Leu、Ile、ValおよびCy
s;および 5. 芳香族残基:Phe、TyrおよびTrp。 保存的バリエーションの好ましい一覧は以下である:
Protein Structure,Springer−Verlag(1
978)により開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸バリエーシ
ョンの頻度の分析、ChouおよびFasman、Biochemistry
13:211(1974)およびAdv.Enzymol.47:45−149
(1987)により開発された構造形成能の分析、ならびにEisenberg
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:140−144(
1984)、KyteおよびDoolittle、J.Mol.Biol.17
5:105−132(1981)およびGoldmanら、Ann.Rev.B
iophys.Chem.15:321−353(1986)により開発された
タンパク質における疎水性パターンの分析に基づき得る。
を作製する同定された点バリエーションは、機能的なGlyT2分子を作製する
のに有用であると考えられるので、これらの点バリエーションの全ての組み合わ
せを組み込むタンパク質は、機能的であると考えられる。これらのバリエーショ
ンは、本発明の範囲内である。
の高分子から分離されている場合、精製または単離される。好ましくは、この核
酸を含む組成物は、核酸含量に関して、供給源の組成物よりも、少なくとも約1
0倍富化される。好ましくは、この核酸は、実質的に純粋(これは、他の核酸に
関して少なくとも約60%w/w、より好ましくは約80%、なおより好ましく
は約90%、さらにより好ましくは約95%の純度を意味する)である。
は、グリシン輸送体をコードする核酸についての有効なハイブリダイゼーション
プローブであることが認識される。従って、本発明は、このようなグリシン輸送
体をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核
酸配列に関する。好ましくは、この核酸配列は、配列番号121の核酸配列とハ
イブリダイズするか、または以下のうちの1つ以上の置換によりこの核酸配列か
ら変化する核酸配列とハイブリダイズする:
、配列番号121の核酸配列、または以下のうちの1つ以上の置換によりこの核
酸配列から変化する核酸配列に対して規定される:
ションを可能にする条件をいう。例えば、このような条件は、一般的に、少なく
とも約85%配列同一性、好ましくは少なくとも約90%配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約95%配列同一性を有する配列のハイブリダイゼーションを
可能にする。このようなハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら、
Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、第2版、Cold Spring Harbor Press(1989)
により記載される。ハイブリダイゼーション条件およびプローブは、ヒト由来の
プローブの選択的ハイブリダイゼーションを達成するように、十分に特徴付けら
れた様式で調節され得る。
ズする核酸分子は、上記に概略した方法を使用してか、または例えば、Samb
rookら、Molecular Cloning:A Laboratory
Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press
(1989)に概説されるハイブリダイゼーションの法則を使用することによっ
て、機能的に同定され得る。
は、以下が挙げられる:組織化学的使用(例えば、ヒトGlyT2輸送体を発現
する組織を同定すること、例えば、異常なレベルのグリシン輸送体を発現するサ
ンプルの組織型を同定するかまたは細胞を同定するためにmRNAのレベルを測
定すること、およびこのグリシン輸送体における多型を検出すること)が挙げら
れる。RNAハイブリダイゼーション手順は、Maniatisら、Molec
ular Cloning、a Laboratory Manual、Col
d Spring Harbor Press(1989)において記載される
。
Protocols、Cold Spring Harbor Press(1
991)により概説されるように、現在確立されている。縮重プライマー(すな
わち、所定の配列位置で不均一である調製物)が、ヒトGlyT2核酸と非常に
相同であるが同一ではない、核酸配列を増幅するために設計され得る。公知の配
列と特異的にハイブリダイズするのに必要なプライマーのうちの1つのみを可能
にするストラテジーが、現在利用可能である。Fromanら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 85:8998(1998)およびLohら
、Science 243:217(1989)を参照のこと。例えば、適切な
核酸プライマーが、増幅されるように努力される核酸に連結され得るか、または
このプライマーのうちの1つについてのハイブリダイゼーションパートナーを提
供し得る。この様式において、このプライマーのうちの1つのみが、増幅される
ように努力される核酸の配列に基づく必要がある。
らのプライマーのうちの一方は、増幅されるべき核酸の第1の鎖にハイブリダイ
ズし得、そして第1の方向で酵素に駆動される核酸合成をプライムし得る。もう
一方は、この第1の鎖の相互(reciprocal)配列(増幅されるべき配
列が単一の鎖である場合は、この配列は最初は仮想的であるが、第1の増幅サイ
クルにて合成される)にハイブリダイズし得、そしてこの第1の方向と反対の方
向でこの鎖からそして第1のプライマーのハイブリダイゼーション部位へ向かっ
て、核酸合成をプライムし得る。このような増幅を、特に好ましいストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下で実行するための条件は、周知である。例
えば、PCR Protocols、Cold Spring Harbor
Press(1991)を参照のこと。
NAの発現を助成し得、この宿主細胞は、真核生物、真菌、または原核生物であ
り得る。適切な発現ベクターとしては、数ある中で、pRc/CMV(Invi
trogen、San Diego、CA)、pRC/RDV(Invitro
gen)、pcDNA3(Invitrogen)、Zap Express
Vector(Stratagene Cloning Systems、La
Jolla、CA)、pBk/CMVベクターまたはpBk−RSVベクター
(Stratagene)、Bluescript II SK+/− Pha
gemid Vectors(Stratagene)、LacSwitch(
Stratagene)、pMAMおよびpMAM neo(Clontech
、Palo Alto、CA)、pKSV10(Pharmacia、Pisc
ataway、NJ)、pCRscript(Stratagene)およびp
CR2.1(Invitorgen)が挙げられる。有用な酵母発現系としては
、pYEUra3(Clontech)が挙げられる。有用なバキュロウイルス
ベクターとしては、Invitorgen(San Diego、CA)からの
いくつかのウイルスベクター(例えば、pVL1393、pVL1392、pB
luBac2、pBluBacHis A、pBluBacHis Bまたはp
BluBacHis CおよびpbacPAC6(Clontechから)が挙
げられる。
ましくは樹立された細胞培養経歴を有する形質転換細胞株またはトランスフェク
トされた細胞株において、発現される。本発明はさらに、上記のようなヒトGl
yT2輸送体をコードするベクターまたは核酸配列で形質転換またはトランスフ
ェクトされた、細胞を提供する。1つの実施形態において、この細胞は、細菌細
胞または真核生物細胞である。好ましくは、この細胞は、哺乳動物細胞であり、
COS−1、COS−7、LM(tk-)、HeLa、HEK293、CHO、
Rat−1およびNIH3T3が挙げられる。より好ましくは、この細胞は、C
OS−7細胞株由来の細胞である。使用され得るなお他の細胞としては、昆虫細
胞(例えば、ショウジョウバエ細胞)、魚類細胞、両生類細胞および爬虫類細胞
が挙げられる。
コードする、外因的に由来する核酸を含む、細胞が提供される。外因的に由来す
る核酸は、細胞中で見出される核酸であって、その細胞、その細胞の親または祖
先、あるいはその細胞が由来するトランスジェニック動物細胞に、組換え技術を
介して導入された核酸である。また、DNA構築物を介してGlyT2輸送体を
通常は発現しない細胞に導入された場合にその細胞に内在する遺伝子からGly
T2輸送体タンパク質が発現される配列(標的配列、調節配列、エキソンおよび
スプライスドナー配列を含む)をコードして、GlyT2輸送体タンパク質をコ
ードしない、外因的に由来する核酸もまた、本発明により意図される(例えば、
米国特許第5,733,761号;同5,733,746号;同5,641,6
70号を参照のこと)。
なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%まで精製または単離され
た、本発明の核酸のいずれかによりコードされる、精製または単離されたヒトG
lyT2輸送体を提供する。これらの純度は、本発明による組換え細胞の溶解物
を用いて、下記の方法を含むがこれらに限定されない、種々のタンパク質精製方
法により達成され得る。
たは細胞を作製するために使用され得る。関連する分子生物学の方法を含む精製
方法が、以下に記載される。
を単離する1つの簡単な方法は、その融合パートナーが容易にアフィニティー精
製される融合タンパク質を組換え発現することである。例えば、この融合パート
ナーは、グルタチオンS−トランスフェラーゼであり得、これは、商業的な発現
ベクター(例えば、ベクターpGEX4T3(Pharmacia、Pisca
taway、NJより入手可能))上にコードされる。次いで、この融合タンパ
ク質は、グルタチオンアフィニティーカラム(例えば、Pharmacia、P
iscataway、New Jerseyより入手可能なもの)上で精製され
得る。さらなる融合パートナーは、例えば、Invitrogen(Carls
bad、CA)より販売される種々の発現ベクターにおいて利用可能である。も
ちろん、この組換えポリペプチドは、このような融合パートナーを用いることな
く、GlyT2に結合する適切な抗体を使用して、アフィニティー精製され得る
。このような抗体を産生する方法は、本明細書中のGlyT2発現系の十分な記
載および公知の抗体産生方法(例えば、Ausubelら、Short Pro
tocols in Molecular Biology、John Wil
ey & Sons、New York(1992)を参照のこと)を考慮して
、当業者に利用可能である。融合タンパク質が使用される場合、この融合パート
ナーは、この融合パートナーとGlyT2との間のリンカーのような、非構造領
域を優先的に攻撃する、部分的タンパク質分解性消化アプローチにより除去され
得る。このリンカーは、例えば、ChouおよびFasman、Biochem
istry 13:211(1974)ならびにChouおよびFasman、
Adv.In Enzymol 47:45〜147(1978)により開発さ
れた2次構造形成能力についての法則を使用して、構造(structure)
を欠くように設計され得る。このリンカーはまた、プロテアーゼ標的アミノ酸(
例えば、アルギニン残基およびリジン残基(このアミノ酸は、トリプシンにより
切断される部位を規定する)、あるいは例えば、エンテロキナーゼの標的配列(
例えば、AspAspAspAspLys)(これは、リジン残基の後ろで切断
される))を組み込むように設計され得る。このリンカーを作製するために、オ
リゴヌクレオチドを作製するための標準的合成アプローチが、標準的サブクロー
ニング方法論をともに使用され得る。GSTに加えて、他の融合パートナーが、
使用され得る。真核生物細胞(特に、哺乳動物細胞)を利用する手順が好ましい
。なぜなら、これらの細胞は、ネイティブなタンパク質と非常に類似するかまた
は機能的に同一である分子を作製するように、このタンパク質を翻訳後修飾する
からである。
定はしない:分離用電気泳動、FPLC(Pharmacia、Uppsala
、Sweden)、HPLC(例えば、ゲル濾過カラム、逆相カラムまたは軽度
に(mildly)疎水性のカラムを使用する)、ゲル濾過、示差的沈殿(例え
ば、塩析沈殿)、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマト
グラフィー。
より、12個の膜貫通配列を有すると考えられるので、単離法はしばしば、この
タンパク質の適切な2次構造および3次構造を維持するために、界面活性剤(一
般的には、非イオン性界面活性剤)を利用する(例えば、Lopez−Corc
ueraら、J.Biol.Chem.266:24809〜24814(19
91)を参照のこと)。可溶化した輸送体を膜へ再組み込みするための方法の記
載について、例えば、Lopez−Corcueraら、J.Biol.Che
m.266;24809〜24814(1991)を参照のこと。
を単離することを包含する。好ましくは、このような細胞は、十分なコピー数で
GlyT2を発現し、その結果、膜画分中のGlyT2の量は、天然にGlyT
2を発現する細胞からの匹敵する膜に見出される量よりも、少なくとも約10倍
高く、より好ましくは、この量は、少なくとも約100倍高い。
に関して、少なくとも60%重量/重量の純度を意味する。この適用の目的のた
めに、GlyT2が、由来する細胞または組織の、他のタンパク質または他の高
分子から分離された場合に、このGlyT2は、精製または単離される。好まし
くは、GlyT2を含む組成物は、その供給源細胞の組成に対して、タンパク質
含量に関して、少なくとも約10倍、好ましくは少なくとも約100倍濃縮され
る。
れ得ることが、認識される。これらに使用のためのRNAは、GlyT2活性を
有するタンパク質をコードする核酸を、高効率インビトロ転写のためのプロモー
ター(例えば、SP6 RNAポリメラーゼプロモーターまたはT7 RNAポ
リメラーゼプロモーター)を含むベクター中にサブクローニングすることにより
調製され得る。このベクターからのRNA産生は、例えば、Ausubelら、
Short Protocols in Molecular Biology
、John Wiley & Sons、New York(1992)、10
−63〜10−65頁に記載される方法を用いて実行され得る。Xenopus
由来の卵母細胞へのRNAの挿入は、例えば、Liuら、FEBS Lette
rs 305:110〜114(1992)およびBannonら、J.Neu
rochem 54:706〜708(1990)に記載される。
ロ翻訳系に挿入する単純な方法によって発現され得ることが、認識される。イン
ビトロでのタンパク質の発現は、例えば、Ausubelら、Short Pr
otocols in Molecular Biology、John Wi
ley & Sons,New York(1992)10−63〜10−65
頁に記載される。また、Guastellaら、Science 249:13
03〜1306(1990)(輸送体のインビトロ発現)を参照のこと。インビ
トロで膜タンパク質を産生する亜細胞(subcelluar)膜様物質の使用
は、WalterおよびBlobel、Meth.Enzymol.96:84
(1983)(ウサギ網状赤血球翻訳系について)およびSpiessおよびL
odish、Cell 44:177(1986)(コムギ胚芽翻訳系について
)に記載される。
子を分析するための方法またはそれについてのスクリーニングのための方法は、
第1の細胞および第2の細胞を別々に培養する工程を包含し、ここでこの第1の
細胞および第2の細胞は、好ましくは同じ種であり、より好ましくはその同じ系
統であり、そして本明細書中に記載されるようなグリシン輸送体をコードする外
因性核酸を含む。因子が処置に使用され得る神経系の障害または状態は、(a)
疼痛、(b)ミオクローヌス、(c)筋痙攣、(d)筋機能亢進、(e)癲癇、
あるいは(f)痙性(例えば、発作、頭部外傷、ニューロン細胞死、多発性硬化
症、脊髄損傷、失調症、ハンティングトン病、または筋萎縮性側索硬化症と関連
するもの)を含むが、これらに限定されない。この方法では、第1の細胞は、グ
リシンの存在下で生物活性因子または予期される生物活性因子と接触され、この
因子は、好ましくは、化合物(例えば、ペプチドまたは有機化合物)であり、好
ましくは、放射性同位体(例えば、3Hまたは14C)を取り込む。次いで、接触
された第1の細胞は、化合物と接触しなかった第2の細胞(すなわち、コントロ
ール細胞)中へのグリシンの輸送と比較して、第1の細胞中へのグリシンの輸送
の増強または阻害について試験される。このような分析またはスクリーニングは
、好ましくは、認識、学習、発見、決定、同定、または確認の活動を含む。
む組成物を利用し得る。好ましくは、単離された輸送体のこのような調製は、膜
または脂質二重層を、好ましくは小胞中に含み、この小胞は、輸送が測定され得
る内側および外側を有する。例えば、Kanner、Biochemistry
17:1207〜1211、1978を参照のこと。
物質(例えば、化学物質)であり、細胞、ウイルス、器官または生物の機能にお
ける変化を生成する薬物(例えば、薬剤)を含むが、これらに限定されない。好
ましくは、この生物は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。本発明の好まし
い実施形態において、本発明の生物活性因子を同定する方法は、約1500未満
の分子量を有する有機分子に適用される。予期される生物活性因子は、それがグ
リシン輸送に影響するか否かを決定するために、本発明のスクリーニング方法に
よって試験されている物質である。
そうでなければ輸送されたグリシンの量が、その因子と接触していない組成物に
おけるよりも、その因子に接触した組成物において大きい場合に、グリシン輸送
取り込みのエンハンサーであり;逆に、生物活性因子は、細胞内グリシンまたは
小胞内グリシンの量が、その因子に接触した組成物と比較して因子と接触してい
ない組成物において大きい場合に、グリシン輸送のインヒビターである。好まし
くは、試験された第1の組成物とコントロールの第2の組成物との間のグリシン
取り込みにおける差異は、少なくとも約2倍であり;より好ましくは、この差異
は、少なくとも約5倍であり;最も好ましくは、この差異は、少なくとも約10
倍以上である。
子は、別のグリシン輸送体(例えば、GlyT1輸送体のうちの1つ)と中立の
効果または反対の効果を有し得る。好ましい生物活性因子は、GlyT2輸送体
を増強または阻害する特異性を有し、そして他のグリシン輸送体に対して中立の
効果または無視可能な効果を有する。好ましくは、生物活性因子は、第2のグリ
シン輸送体に対するその効果と比較して、GlyT2輸送体により媒介されるグ
リシン取り込みを阻害または活性化する際に、濃度依存性パラメーター(例えば
、IC50値)において反映される、少なくとも一桁より大きな効力の強度を有す
る。より好ましい因子は、他方と比較して、このグリシン輸送体の1つに対して
、少なくとも約100倍大きな効力を有する。
とを可能にする形式において、グリシン輸送体に提示され得る、任意の化合物、
物質、組成物、混合物、または化学物質であり得る。このような生物活性因子は
、好ましくは長さが2〜約25個までのアミノ酸、より好ましくは2〜約10個
、なおより好ましくは長さが2〜約5個のアミノ酸のポリペプチドを含むが、こ
れらに限定されない。本発明の状況における他の適切な生物活性因子は、好まし
くは、約100ダルトンと約5,000ダルトンとの間の分子量の小さな有機化
合物を含み、そしてアルキル、アリール、アルケン、アルキン、ハロ、シアノ、
および他の基(ヘテロ原子を含むかまたは含まない)のような官能基から構成さ
れる。このような有機化合物は、糖質(単糖を含む)、アミノ酸またはイミノ酸
、核酸、ステロイド、および他のものであり得る。予期される生物活性因子とし
て試験される化学物質は、当該分野において公知のコンビナトリアル化学プロセ
スまたは化学合成についての従来の手段を使用して、調製され得る。好ましくは
、生物活性因子は、神経系の障害または状態の処置のための薬物として有用であ
る。
ストリキニーネ感受性レセプター上のグリシン結合部位、またはNMDAレセプ
ター上のグリシン結合部位に結合する。ストリキニーネ感受性レセプターへのこ
のような結合は、例えば、放射性標識されたストリキニーネがストリキニーネ感
受性レセプターの調製物(脊髄組織または脳幹組織からの膜画分から調製され得
るような)と接触して置かれる結合アッセイによって、同定され得る。膜画分は
、従来の手段(例えば、ホモジネーションおよび遠心分離の方法を含む)を使用
して調製され得る。
ンがNMDAレセプターの調製物(ニューロン細胞または脳組織からの膜画分か
ら調製され得るような)と接触して置かれる結合アッセイによって、同定され得
る。Grimwoodら、Molec.Pharmacol.41:923〜9
30(1992)。このような膜に位置するNMDAレセプターは、任意の内因
性グリシンまたはグルタミン酸塩を除去するために、軽度の界面活性剤(例えば
、約0.1%〜約0.5%のサポニン)を使用して処理される。
例えば、炭素または水素の放射性同位体)で放射性標識される。次いで、放射性
標識リガンドの特異的結合は、その放射性標識リガンドの結合全体(すなわち、
特異的および非特異的)に起因する放射活性から、非特異的結合に起因する放射
活性を差し引くことによって決定される。非特異的結合に起因する放射活性は、
放射性標識リガンドおよび有意に過剰な非放射性標識リガンド(例えば、100
倍過剰)の両方と接触された、ストリキニーネ感受性膜画分またはNMDAレセ
プター含有膜画分と関連した放射性標識の量を測定することによって、決定され
る。放射性標識リガンドの結合全体に起因する放射活性は、非放射性標識リガン
ドの非存在下で、レセプター調製物に結合した放射性標識の量を測定することに
よって決定される。NMDAレセプターについては、アミノ酸の標識されたアナ
ログ(例えば、ジクロロキヌレン酸またはL−689,560など)を使用して
、このレセプター上のグリシン部位への結合もまた測定し得る。例えば、Gri
mwoodら、Molecular Pharmacol.49:923〜93
0(1992)を参照のこと。
カルシウムフラックスまたは(ストリキニーネ感受性レセプター調製物について
)塩素フラックスを増強または阻害する際に、本発明によって同定される化合物
の効果を測定するために使用される。この試験は、膜結合NMDAレセプターま
たはストリキニーネ感受性レセプターおよびグリシン輸送体を有する、細胞培養
物に対して実行される。このような細胞は、一般には、脳幹および脊髄の細胞を
含む、ニューロン細胞、およびそれに由来する細胞株、ならびにNMDAレセプ
ターもしくはストリキニーネ感受性レセプターを発現するように誘導もしくはト
ランスフェクトされている他の任意の細胞を含む。このような試験に使用される
カルシウムは、一般に、45Ca同位体であるが、他のカルシウム測定技術(例え
ば、カルシウム結合蛍光(これは、カルシウムキレート剤と結合する蛍光などで
あり得る)が、同様に使用され得る。このような試験に使用される塩素は、通常
は、同位体36Clを含む。カルシウムまたは塩素がどの方法によってモニターさ
れるかに関わらず、イオンフラックスは、本発明の生物活性因子の別々の添加の
結果として、増強または阻害され得る。この系の利点は、NMDAレセプターま
たはストリキニーネ感受性レセプターの機能に対する、レセプター上およびグリ
シン輸送体上の両方のグリシン部位と相互作用する化合物の正味の効果をモニタ
ーすることを可能にすることである。
は、グリシン輸送体の阻害を介して、およびストリキニーネ感受性レセプター活
性の直接的な増強を介して、ストリキニーネ感受性レセプターを発現しているシ
ナプスにて、グリシン濃度を増大させることによって、上記の適応症において作
用する。ストリキニーネ感受性レセプターアンタゴニストでもあるグリシン輸送
体インヒビターは、それにもかかわらず、例えば、グリシン輸送阻害に起因する
グリシンにおける増大がストリキニーネ感受性レセプターアンタゴニスト作用に
勝る場合、これらの適応症を処置する際に.活性を保持し得る。ストリキニーネ
感受性レセプターアンタゴニスト活性が、グリシン輸送体の阻害から生じる細胞
外グリシンの増大の効果に勝る場合、これらの化合物は、筋肉活動の減少と関連
した状態(例えば、重症筋無力症)を処置する際に有用である。
の化合物の相対的な有効性は、多くの様式において評価され得る。これらの様式
には、以下が挙げられる: 1.GlyT1輸送体およびGlyT2輸送体を介して媒介される活性の比較
。この試験は、(a)GlyT1輸送体に対してより活性であり、それによって
精神分裂病を処置または予防する際、認識を増大する際および記憶を増強する際
により有用である生物活性因子、あるいは(b)GlyT2輸送体に対してより
活性であり、それによって癲癇、疼痛または痙性を処置または予防する際により
有用である生物活性因子、を同定する 2.ストリキニーネ感受性レセプターまたはNMDAレセプターの結合につい
ての試験。この試験は、このような結合の薬理学的効果のさらなる試験を正当化
するに十分な結合がこの部位にて存在するかどうかを、確立する 3.初代組織培養におけるイオンフラックス(例えば、ストリキニーネ感受性
レセプターにより媒介される塩素イオンのフラックス、またはNMDAレセプタ
ーにより媒介されるカルシウムイオンフラックス)を増強または減少する化合物
の活性の試験。イオンフラックスを増大させる生物活性因子は、(a)ストリキ
ニーネ感受性レセプターにてアンタゴニスト活性をほとんど有さないか、または
全く有さず、そしてGlyT2輸送体阻害を介してグリシン活性の増強に影響し
ないか、あるいは(b)ストリキニーネ感受性レセプターと直接的な相互作用を
ほどんど有さない比較Gly2インヒビターでの結果に対する、著しい増大が観
察される場合、この因子がレセプターアゴニストであるかのいずれかである。
ーおよびGlyT1輸送体が関与する適応症を処置する際に有用であるか否かを
特徴付けるために使用される。この場合、一般に、ストリキニーネ感受性レセプ
ターおよびGlyT2輸送体に関してより低い尺度の活性が、より所望される。
を処置するためのアンチセンス核酸の使用に関し、この適応症としては、筋痙性
、発作、癲癇および多発性硬化症が挙げられるがこれらに限定されない。アンチ
センス治療は、GlyT2をコードするmRNAを結合するように設計されたア
ンチセンス分子(これは、このmRNAの翻訳を停止または阻害する)、あるい
はその転写を妨害するためにGlyT2遺伝子に結合するように設計されたアン
チセンス分子の使用を、含む。転写を妨害するためにゲノムDNAを結合するヌ
クレオチド配列を設計するための方法は、当該分野において公知である(例えば
、Helene、Anti−Cancer Drug Design 6:56
9(1991)を参照のこと)。一旦、結合されようとするmRNAの配列が既
知になると、DNA二重らせんに類似の二重鎖構造を形成するように、ワトソン
−クリック塩基対合法則によってセンス鎖に結合するアンチセンス分子が、設計
される。Gene Regulation:Biology of Antis
ense RNA and DNA、Erikson and Ixzant編
、Raven Press、New York(1991);Helene、A
nti−Cancer Drug Design 6:569(1991);C
rooke、Anti−Cancer Drug Design 6:609(
1991)。
Aの機能を効果的に妨害することは、首尾よいアンチセンス治療に対する有意な
障壁のままである。この問題を克服するために使用されてきた1つの方法は、ア
ンチセンスポリ核酸分子の5’または3’末端を疎水性置換基で共有結合的に修
飾することである。疎水性置換基で修飾したそのような核酸は、一般的に、より
大きな効率を有する細胞内部への接近を獲得する(例えば、Boutorinら
、FEBES Lett.23:1382−1390(1989)およびShe
aら、Nucleic Acids Res.18:3777−3783(19
90)を参照のこと)。他の方法としては、以下が挙げられる:アンチセンス分
子のリン酸骨格を修飾して、負電荷を除去または減少させる方法(例えば、Ag
risら、Biochemistry 25:6268(1986);Caze
naveおよびHelene、Antisence Nucleic Acid
s and Proteins:Fundamentals and Appl
ications,MolおよびVan der Krol編、第74頁(以下
参照)、Marcel Dekker,New York(1991)を参照の
こと)、またはプリンもしくはピリミジン塩基を修飾する方法(例えば、Caz
enaveおよびHelene、Antisence Nucleic Aci
ds and Proteins:Fundamentals and App
lications,MolおよびVan der Krol編、第74頁(以
下参照)、Marcel Dekker,New York(1991);Mi
lliganら、Gene Therapy For Neoplastic
Diseases,HuberおよびLaso編、第228頁(以下参照)、N
ew York Academy of Sciences,New York
(1994)を参照のこと)。細胞貫入障壁を克服するためのさらなる方法とし
ては、低コピー数で細胞に挿入され得るが細胞において細胞機構を指向し得る、
いわゆる過剰発現ベクターにアンチセンスポリ核酸配列を取り込んで、さらなる
実質的な量のアンチセンスポリヌクレオチド分子を合成する方法が挙げられる(
例えば、Farhoodら、Ann.N.Y.Acad.Sci.716:23
(1994)を参照のこと)。このストラテジーとしては、アンチセンス配列が
組み込まれている発現部位を有する組換えウイルスの使用が挙げられる(例えば
、Boris−LawrieおよびTemin,Ann,N.Y.Acad.S
ci.716:59(1994)を参照のこと)。なお別の方法としては、アン
チセンス分子または他の核酸分子上の負電荷をポリカチオンで中和することによ
って、膜貫通性を増加する方法が挙げられる(例えば、WuおよびWu,Bio
chemictry 27:877−892(1998)およびBehrら、P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6982−6986
(1989)を参照のこと)。
ターの導入を含み得る。例えば、より多量に発現される場合、細胞から失われる
タンパク質の合成を指向し得るかまたは細胞もしくは生物に有用なDNAベクタ
ーは、生物の1以上の細胞型に取り込まれ得る。DNAを細胞に導入して新たな
タンパク質またはより多量のタンパク質を産生するための方法は、トランフェク
ション法と呼ばれ、当該分野で一般的に公知である。一般的には、Neopla
stic Diseases,HuberおよびLazo編、New York
Academy of Science,New York(1994);F
iegner,Adv.Drug Deliv.Reb.5:163(1990
);MacLachlinら、Progr.Nucl.Acids.Res.M
ol.Bio.38:91(1990);Karlsson,S.Blood
78:2481(1991);EinerhandおよびValerio,Cu
rr.Top.Microbiol.Immunol.177:217−235
(1992);Makdisiら、Prog.Liver Dis.10:1(
1992);LitzingerおよびHuang,Biochem.Biop
hys.Acta.1113:201(1992);Morsyら、J.A.M
.A.270:2338(1992);Dorudiら、British J.
Surgery,80:566(1993)を参照のこと。
リン酸カルシウム沈殿(GrahamおよびVan der Eb,Virol
ogy 52:456(1983))、核酸、DEAE−デキストランおよび細
胞の同時インキュベーション(SompayracおよびDanna,Proc
.Natl.Acad.Sci.12:7575(1981))、核酸の存在下
での細胞のエレクトロポレーション(Potterら、Proc.Natl.A
cad.Sci.81:7161−7165(1984)、核酸をウイルス被覆
に取り込んでトランスフェクションビヒクルを作製すること(Gitmanら、
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:7309−731
3(1985))、および細胞をリポソームに取り込まれた核酸とともにインキ
ュベートすること(WangおよびHuang,Proc.Natl.Acad
.Sci.84:7851−7855(1987))。アンチセンス治療を含む
遺伝子治療に対する別のアプローチは、目的の核酸を、後の宿主細胞への感染の
ために、ウイルス(例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイル
スまたはレトロウイルス)に組み込むことである。例えば、Alkiら、Nat
ure Genetics 3:224(1993)を参照のこと。
入によって(例えば、エアロゾルの使用によって)、または非経口的に(例えば
、筋肉内的に)、皮下的に、腹膜内的に、脳室内的に、または静脈内的に投与さ
れ得る。核酸組成物は、単独で投与され得るか、または標準的な薬学的実施に従
って、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤と組み合わせられ得る。投与
の経口形式のために、核酸組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、粉
末、シロップ、エリキシル(elixer)、水溶液および懸濁物などの形態で
使用され得る。錠剤の場合、使用され得るキャリアとしては、ラクトース、クエ
ン酸ナトリウム、およびリン酸塩が挙げられる。デンプンのような様々な崩壊剤
、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタ
ルクは、錠剤に一般的に使用される。カプセル形態における経口投与のために、
有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量のポリエチレングリコールである。
水性懸濁物が経口使用に必要な場合、核酸組成物は、乳化剤および懸濁剤と組み
合わせられ得る。所望であれば、特定の甘味料および/または矯味矯臭剤が添加
され得る。経口投与のために、結合体の滅菌溶液が通常調製され、そしてその溶
液のpHは、適切に調製されそして緩衝化される。静脈内使用のために、溶質の
総濃度は、等張性調製物を付与するために制御されるべきである。眼用(ocu
lar)投与のために、軟膏および滴下可能な(droppable)液体が、
アプリケーターまたは目薬のような当該分野で公知の眼用送達系によって送達さ
れ得る。このような組成物は、ムコ模倣物(例えば、ヒアルロン酸、硫酸コンド
ロイチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ(ビニルアルコール
))、保存剤(例えば、ソルビン酸、EDTAまたはベンジルクロミウムクロリ
ド)、ならびに通常品質の希釈剤および/もしくはキャリアを含み得る。肺投与
のために、希釈剤および/またはキャリアは、エアロゾルの形成を可能にするに
適切であるように選択される。
量)で投与される。薬学的使用のために、有効な量は、以下のいずれかに有効な
量である:(1)処置されるべきだと考えられる徴候の症状を予防、遅延、また
は減少する、あるいは(2)処置されるべきだと考えられる徴候を処置または予
防することに関連する薬理学的変化を誘導する。
量は、一般的に、体重1kgあたり、約1μgから約100mgの核酸である。
ることが予測され得る。例えば、GlyT2輸送体について、そのような障害は
、減少した筋肉活性、例えば、臨床的に重症筋無力症に酷似の症状を提示する減
少した筋肉活性に関連するか、または減少した疼痛認知と関連すると予測され得
る。神経伝達に関与する分子(グルタミン酸デカルボキシラーゼ)に対する自己
抗体によって引き起こされる疾患の例については、Nathanら、Neuro
sci.Res.40:134−137(1995)を参照のこと。
連グリシン輸送体(例えば、Kimら、Mol.Pharmacol.45:6
08−617(1994)およびLiuら、Biol.Chem.268:22
802−22808(1992)を参照のこと)から得られたタンパク質配列を
使用する確立された免疫学的方法によって測定され得る。このような免疫学的方
法は、例えば、Ausbelら、Short Protocols in Mo
lecular Biology,Jhon Wiley&Sons,New
York(1992)に記載される。
) 本発明の目的のために、免疫グロブリン(例えば、抗体)は、特異的であるか
、結合する場合に抗原と反応するかもしくは抗原に結合するか、または標準的な
抗体−抗原もしくはリガンド−レセプターアッセイによって決定される場合にヒ
トGlyT2輸送体を結合し得る。このようなアッセイの例としては、競合アッ
セイ、免疫細胞学アッセイ、飽和アッセイ、または標準的な免疫アッセイ(例え
ば、ELISA、RIA、およびフローサイトメトリーアッセイ)が挙げられる
。特異性のこの定義はまた、単一の重鎖および/もしくは軽鎖、CDR、融合タ
ンパク質、または重鎖および/もしくは軽鎖のフラグメントに適用され、これら
は、ヒトGlyT2輸送体単独を結合するか、または適切には相補的な可変領域
および定常領域を有する免疫グロブリンコンフォメーションに適切に取り込まれ
る場合、ヒトGlyT2輸送体を結合し得る。
またはその免疫原性部分で動物を免疫することによって調製され得る。抗体の産
生のための動物を免疫する手段は、当該分野で周知である。例示の目的で、哺乳
動物は、GlyT2を含む種菌で注射され得る。GlyT2は、種菌単独に含ま
れ得るか、またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)のようなキャリ
アタンパク質に結合体化され得る。GlyT2は、当該分野で周知のように、ア
ジュバントに懸濁されて、その免疫原性が増強され得る。次いで、免疫学的に活
性な抗体を含有する血清は、そのように免疫された動物の血液から、当該分野で
周知の標準的な手順を使用して産生され得る。
と予測される血清をGlyT2に曝露して、抗体とhGlyT2との間で結合体
を形成することによってなされる。次いで、この結合体の存在は、当該分野で周
知の標準的な手順を使用して決定される。
使用され得るか、またはスクリーニングアッセイとして、このようなモノクロー
ナル抗体を同定するために使用され得る。モノクローナル抗体は、Kohler
ら、Nature,256:495、(1975)に記載されるような標準的な
技術に従って詳細されるハイブリドーマから産生される。簡潔には、適切な哺乳
動物(例えば、BALB/cマウス)は、GlyT2での注射によって免疫され
る。予め決定された時間の後、脾臓細胞がマウスから取り出され、そして細胞培
養培地に懸濁される。次いで、この脾臓細胞は、不死化細胞株と融合されて、ハ
イブリドーマが形成される。この形成されたハイブリドーマは、細胞培養で増殖
され、そしてGlyT2に対するモノクローナル抗体を産生する能力についてス
クリーニングされる。
たはIgGアイソタイプのモノクローナル抗体(本明細書中以後、MoAbsと
称する)であり得る。最も好ましくは、このようなMoAbsは、ヒトGlyT
2輸送体タンパク質と反応する。ヒトに操作されるMoAbsを産生するための
種々の方法は、当該分野で公知である(例えば、Antibody Engin
eerting,(第2版)Borrebaeck,C.A.K.編、Oxfo
rd University Press,New York(1995)を参
照のこと)。免疫グロブリンの他の形態は、当業者に周知の方法(例えば、実質
的に単一特異的な(monospecific)抗体集団を産生するためのポリ
クローナル血清のクロマトグラフィー精製)によって、産生され得る。
、免疫原の組み合わせを使用し、そして一般的にヒトGlyT2輸送体抗原のみ
を有する抗原をスクリーニングすることによって、または抗hGlyT2輸送体
モノクローナル抗体にのみ特異的であるように設計されたスクリーニングアッセ
イによって、得られ得る。例えば、ヒトGlyT2輸送体に対して指向されるモ
ノクローナル抗体の産生は、以下によって達成され得る:(1)ヒトGlyT2
輸送体抗原で免疫し、続いてヒトGlyT2輸送体でトランスフェクトされた非
ヒト細胞株に対する反応性について得られたハイブリドーマをスクリーニングす
ること(Nishimuraら、Eur.J.Immunol.,18:747
−753(1988)に記載される様式と類似の様式で構築される);(2)ヒ
トGlyT2輸送体でトランスフェクトされた非ヒト細胞株で免疫し、続いてヒ
トGlyT2輸送体抗原を発現するヒト細胞株に対する反応性について得られた
ハイブリドーマをスクリーニングすること;(3)ヒトhGlyT2輸送体を発
現するヒトまたは非ヒト細胞株で免疫し、続いて既存の抗hGlyT2輸送体モ
ノクローナル抗体のヒト細胞株との反応性をブロックする能力について得られた
ハイブリドーマをスクリーニングすること;(4)ヒトGlyT2輸送体を発現
するヒトまたは非ヒト細胞株で免疫し、続いて精製されたネイティブまたは組換
えヒトGlyT2輸送体抗原との反応性について得られたハイブリドーマをスク
リーニングすること;あるいは(5)ヒトGlyT2輸送体抗原の組換え誘導体
で免疫し、続いてヒトGlyT2輸送体を発現するヒト細胞株に対する反応性に
ついて得られたハイブリドーマをスクリーニングすること。GlyT2に対して
指向されるモノクローナル抗体はまた、ヒトGlyT2輸送体および/またはラ
ットGlyT2輸送体に対する反応性、またはその反応性の欠如についてスクリ
ーニングされ得る。
、Kodaら、Hum.Antibod.Hybridomas 1(1):1
5〜22(1990)を参照のこと)。このようなMoAbの生成は、従来の技
術を用いて困難であり得る。従って、非ヒト抗体の抗原結合領域(例えば、F(
ab’)2または超可変領域(CDR))を改変し、そしてこれらを組換えDN
A技術によってヒト定常領域(Fc)またはフレームワーク領域に融合して、実
質的にヒト分子を産生することが、所望され得る。
89)およびMarksら、J.Mol.Biol.222:581〜597(
1991)によって概説される一般的なプロトコルに従って、ヒトB細胞からD
NAライブラリーをスクリーニングし、次いで、所望の特異性の抗体(または結
合フラグメント)をコードする配列をクローニングおよび増幅することによって
、ヒトGlyT2輸送体に特異的に結合するヒトMoAbまたはその部分をコー
ドするDNA配列を単離し得る。
変された免疫グロブリンは、当業者に公知の種々の組換えDNA技術を利用して
容易に設計および製造され得る。免疫グロブリン遺伝子の改変は、種々の周知の
技術(例えば、部位特異的変異誘発(Gillmanら、Gene 8:81〜
97(1979);Robertsら、Nature 328:731〜734
(1987)を参照のこと)によって容易に達成され得る。また、結合親和性抗
体に影響する改変は、Marksら、J.Biol.Chem.267:160
07〜16010(1992)によって概説される一般的なプロトコルを使用し
て選択され得る。
よび非競合アッセイ系、RIA、ELISA、フローサイトメトリー、イムノブ
ロッティングならびに単純な免疫細胞学的染色を含むがこれらに限定されない)
のための、上記で産生されたヒトGlyT2特異的抗体の使用を提供する。いく
つかの競合アッセイにおいて、免疫グロブリン、抗体またはペプチドフラグメン
トが抗原に結合する能力は、その免疫グロブリン、抗体またはペプチドが、その
抗原を結合することが公知である化合物と競合する能力を検出することによって
決定される。多くの型の競合アッセイが公知であり、そして本明細書において考
察される。あるいは、インヒビターの非存在下において試験化合物の結合を測定
するアッセイもまた、使用され得る。例えば、分子または他の化合物がヒトGl
yT2輸送体を結合する能力は、目的の分子を間接的に標識することによって検
出され得るか、または標識されなくてもよいし、そして種々のサンドウィッチア
ッセイ形式を使用して間接的に検出されてもよい。結合アッセイ(例えば、競合
結合アッセイ)の多くの型は、公知である(例えば、米国特許第3,376,1
10号;米国特許第4,016,043号;およびHarlowら、Antib
odies:A Laboraory Manual,Cold Spring
Harbor Publications,N.Y.(1998)を参照のこ
と)。
を測定するためのアッセイもまた、利用可能である。例えば、免疫グロブリンは
、ヒトGlyT2輸送体の存在を同定するために使用され得る。モノクローナル
抗体アッセイについての標準的な手順(例えば、ELISA)が、使用され得る
。使用され得る種々のシグナル産生系の総説については、米国特許第4,391
,904号を参照のこと。他のアッセイ形式は、抗原−抗体相互作用から生じる
種々の生理学的変化または化学的変化の存在または非存在の検出を包含し得る(
Receptor−Effector Coupling−A Practic
al Approach,Hulme編、IRL Press,Oxford(
1990)を参照のこと)。
1鎖合成を、5’−RACEシステム(Gibco/Life Technol
ogies)に記載される代替のプロトコル(GCリッチな鋳型について)を使
用して達成した。簡潔には、ヒト脊髄ポリA+ mRNA(50ng)(Clo
ntech、Palo Alto,CA)を、3μgのランダムプライマー(G
ibco BRL)に添加し、そして得られた混合物を、10分間、70℃で変
性させた。Superscript IITM Reverse Transcr
iptaseの添加後、反応を室温で5分間進行させ、続いて、45℃で50分
間インキュベーションさせた。
y PCRシステム(Boehringer Mannheim Bioche
micals)を使用して達成した。このシステムは、TAQおよびPwo D
NAポリメラーゼの混合物を含み、この後者は、任意のPCRに誘導される配列
誤差を最小化するためのプルーフリーディング機能を保有する。増幅は、以下の
条件下で行った:94℃2.00分(プレドウェル(pre−dwell));
[94℃40秒、58℃40秒、72℃40秒]を10サイクル;[94℃40
秒、58℃40秒、72℃40秒(+20秒/サイクル)]を25サイクル;7
2℃10分;4℃保持。PCR産物を、代表的に、ウラシル脱グリコシラーゼ(
degycosylase)CLONEAMPTMシステムを使用してベクターp
−AMP−1中にサブクローニングした。全ての配列を、ベクター由来のSP6
(順方向)プライマーおよびT7(逆方向)プライマーを使用する、循環(cy
cle)配列決定(Epicentre Technologies,Madi
son,WI)によって確認した。配列決定において使用するプライマーを、N
EN Research Products/Dupont(Boston,M
A)からのγ−32P−dATPを使用して、T4キナーゼ(New Engla
nd Biolabs,Beverly,MA)を用いて末端標識した。全長ク
ローンを、この配列を一様に横切って間隔を空けて配置された10個のhGly
T2特異的プライマーに加えて、SP6プライマーおよびT7プライマーを使用
して配列決定した。
傾向があるので、変性プライマー(Genemed Biotechnolog
ies,South San Francisco,CA)を、推定膜貫通(T
M)領域2、5および10におけるラットGlyT2配列に基づいて設計した。
PCRクローニングにおいて使用されるプライマー(A〜Uは、配列番号1〜2
1に対応する)の全てのヌクレオチド配列は、以下の通りに示される:
びGをいい、BはG、TおよびCをいい、そしてIはイノシンをいう。hGly
T2の第1のフラグメントのPCR単離を、核酸レベルで変性したラットペプチ
ド配列(Liu,Q.R.ら、J.Biol.Chem.268:22802〜
22806(1993))をコードする2セットのプライマーを使用して達成し
た。TM2とTM5との間の領域を、プライマーAおよびプライマーBを使用し
て増幅した。同様に、TM5とTM10との間の領域を、プライマーCおよびプ
ライマーDを使用して増幅した。
よびプライマーF(ラットGlyT2コード配列の最後の40塩基に対して変性
した3’プライマー)を使用して、hGlyT2コード配列の3’末端を増幅し
た。
Gと共に使用して、ラットGlyT2塩基791〜999に対応するヒト配列を
PCR増幅した。さらなる100塩基は、TM1に対して5’側の配列が遺伝子
特異的プライマー設計のために使用されることを可能にした。
配列の5’末端においてさらなる配列をクローニングした。TM2の3’側の遺
伝子特異的な非コードプライマー(プライマーI)を、ヒト脊髄ポリA+ mR
NAの逆転写において使用した。次いで、このcDNA産物に、ターミナルトラ
ンスフェラーゼを用いてポリdCヌクレオチドでテーリングした(tailed
)。第1回のPCR増幅は、プライマーIの直ぐ5’側のさらなる非コードプラ
イマー(プライマーJ)を使用し、そしてそのキットは、プライマー(AAP)
を供給した。この第1回のPCR増幅の産物を鋳型として使用して、2つのさら
なるネスト化(nested)増幅を実施した。遺伝子特異的プライマーKおよ
びプライマーAUAP(Gibco/BRL)(第2回)、次いでプライマーL
およびUAP(Gibco/BRL)(第3回)を、PCRにおいて使用して5
’−RACE産物を得た。第1ラウンドの増幅からの最も大きな産物は、ラット
GlyT2輸送体よりも約200少ない塩基のコード配列を含んだ。この5’−
RACE産物を、以前に記載されるように、pAMP−1中にサブクローニング
した。
たラット5’非翻訳領域の塩基189〜210に対する非変性プライマー(プラ
イマーM)を使用して単離した。
ch Laboratories Inc.)のプールからのmRNAを含んだ
脊髄ポリA+ mRNAのサンプルからクローニングした。hGlyT2につい
ての正確なコンセンサス配列を得るために、この配列全体を、異なるロットの脊
髄mRNA(ロット7050107)(これは、92の個体のプールを示した)
から再増幅した。さらに、この輸送体の6つのフラグメントの各々(図1)を、
ポリA+mRNAの2つのさらなる供給源からの3つの独立したPCR反応にお
いて再増幅した。第1のセットの6つのフラグメントを、異なるアリコートのヒ
ト脊髄ポリA+ mRNA(ロット7050107、数月後に購入した)からク
ローニングし、そして第2のセットのフラグメントを、星状細胞腫細胞株U37
3MGから単離したポリA+ mRNAからクローニングした。得られた48個
の配列(配列番号22/23〜117/118)を使用して、配列番号121/
122に示されるコンセンサス配列を生成した。
。hGlyT2輸送体をコードする配列を、6個の異なるPCR産物フラグメン
ト(番号付けは、ラットGlyT2配列に対応する)から構築した:410〜8
22(A)、719〜1050(B)、892〜1506(C)、1477〜2
208(D)、2157〜2607(E)、189〜529(F)。これらの6
個の単離されたPCRフラグメントは、hGlyT2輸送体全体をコードする。
そして図1に示される5個の制限部位を使用して構築した。各フラグメントの少
なくとも8個の独立クローンを、hGlyT2コード配列を検証するために配列
決定した[フラグメント:A(配列番号22/23〜36/37)、B(配列番
号38/39〜52/53)、C(配列番号54/55〜69/70)、D(配
列番号71/72〜85/86)、E(配列番号87/88〜101/102)
、およびF(配列番号103/104〜117/118)]。フラグメントAお
よびBを、822位に見られるNcoI制限部位を使用してともに連結した。フ
ラグメントAおよびBの配列は重なり合っていなかったので、NcoI部位を、
プライマーセットOおよびP、ならびにOおよびQをそれぞれ使用する2回のP
CR伸張によって、フラグメントAへ導入した(図1)。フラグメントABおよ
びCを、PinAI制限部位を使用してともに連結した。この部位はフラグメン
トCにおいて見られたが、塩基782でのABにおける対立遺伝子変異に起因し
て、AB配列へ導入しなければならなかった(プライマーRを使用して、図1)
。PinAI消化されたABおよびCの連結の産物を、フラグメントABCと名
付けた。
、プライマーSおよびTを使用して、5’末端へ付加した。フラグメントDを、
プライマーUおよびDを使用して増幅した。フラグメントDおよびEを、Sac
Iで消化し、そして連結した。得られた産物(DE)を、pAMP−1中へサブ
クローニングした。ABCを含むプラスミドを、HinDIIIおよびSpeI
で消化し、そして得られた1100塩基対産物を、HinDIII/SpeI消
化したDE含有プラスミドへ連結し、hGlyT2の短縮型形態(ヌクレオチド
410〜2607)を作製した。最後に、5’末端を、フラグメントABCDE
およびFを合わせることによって付加した(図1)。両方のフラグメントをPs
t1で消化し、そしてともに連結した。次いで、この連結反応物を、プライマー
MおよびIを用いてPCR増幅し、そして塩基189〜1054を含む得れらた
構成物を、HinDIII/Pin−AI消化hGlyT2(410〜2607
)へサブクローニングして戻した。完全なhGlyT2輸送体配列(189〜2
607)および短縮型形態(410〜2607)を、哺乳動物細胞内での発現の
ために、pCDNA3(Invitrogen,Palo Alto,CA)の
EcoRI/HinDIII部位へサブクローニングした。
ならびに単一細胞株から誘導したので、多数の対立遺伝子変異を完全な配列にお
いて同定した。同定した変異は、以下の通りであった:
(Liu,Q.R.ら、J.Biol.Chem.268:22802〜228
06(1993))(図2)、これら2つの種の間の全体的な相同性は、ヌクレ
オチドおよびアミノ酸レベルで、それぞれ、88%および93%であった(図3
)。ヒトGlyT2輸送体および他のメンバーのアミノ酸輸送体ファミリーは、
およそ50%のアミノ酸相同性を共有した。ラットおよびヒトのGlyT2タン
パク質間の最も大きな相違は、最初の190個のアミノ酸内に有り、ここで74
%のみの保存が見られる。
される。ヒト構築物の配列決定によって、ヒトcDNA配列の最初の52個の塩
基(20個の5’非翻訳および32個のコード配列)が、ラット配列と同一であ
ることが分かった。この52塩基領域は、Genbankにおいて現在見られる
任意の他の配列と相同性を示さず、従って、GlyT2に独特である調節配列を
示し得る。コード配列の次の100個の塩基は、2種間でたった66%の同一性
を示す。
間に単離した(図2)。第1の変異体を、hGlyT2配列の塩基541〜67
5が続く相違する5’末端によって特徴付けた(図2A)。塩基675の後に、
全ての3つの読み取り枠で終止コドンを含む172塩基対の挿入物が存在した。
これに、輸送体配列の残りが続いた。この変異体の発現は、メチオニン235で
の開始コドンを予期し、従って、最初の234個のアミノ酸を欠く輸送体を形成
する(hGlyT2/5I(5’−挿入))。第2変異体は、塩基1488〜1
530の間の領域に42塩基対欠失を含んだ(hGlyT2−3D(3’−欠失
))(図2B)。この変異体は、推定膜貫通領域TM6とTM7との間の細胞内
ループにおいて14個のアミノ酸を欠く。両方の変異体(hGlyT2/5Iお
よびhGlyT2/3D)を構築し、そして全長配列と同様の様式で発現させた
。さらに、両方の変異を含む構築物もまた構築し(hGlyT2/5I−3D(
5’−挿入/3’−欠失))、そして発現させた。
1〜2391を用いて構築した。この構築物の発現は、メチオニン−154で開
始コドンを予期し、従って、最初の153アミノ酸を欠く輸送体(短縮型hGl
yT2)を形成する。
載したhGlyT2構築物を、SuperfectTMシステム(Qiagen,
Santa Clarita,CA)を使用して、COS−7細胞中で一過的に
発現させた。COS−7細胞を、1ウエル当たり20,000細胞で、トランス
フェクションの前日にプレーティングした。トランスフェクションのためのDN
Aを、Qiagen MidiprepTMキットを使用して調製し、そして1μ
gのhGlyT2の各々の形態を、24ウエルプレートの各ウエルへトランスフ
ェクトした。トランスフェクションを、培地を交換することによってDNA複合
体を細胞へ添加した後、2〜2.5時間で終了させた。トランスフェクション効
率を、グリーン蛍光タンパク質を含む構築物を一過的に発現させることによって
モニタリングした。トランスフェクタント体の数は、典型的に、総細胞の20〜
50%であった。標準的な増殖条件は、DMEM、高グルコース、10%仔ウシ
血清、ペニシリンG(100U/ml)、ストレプトマイシンスルフェート(1
00μg/mL)、5%CO2/湿潤雰囲気、37℃であった。細胞を、典型的
に、トランスフェクト後に48時間増殖させ、その後、図3に示されるアッセイ
結果を用いて実施例4に記載されるにように、グリシン取り込みアッセイにおい
て使用した。
rm.45:608〜17(1994))と同様であった。簡単に言えば、細胞
を、グリシン取り込み緩衝液(GUB;5mM Tris(pH7.4)、7.
5mM Hepes、120mM NaCl、5.4mM KCl、1.2mM
CaCl2、1.2mM MgSO4、1mM L−アスコルビン酸、5mM
D−グルコース)か、またはクロライドを含まない取り込み緩衝液(GUBと同
様であって、NaClを120mM酢酸ナトリウムで置き換え、そしてKClお
よびCaCl2を省く)のいずれかで3回洗浄した。[2−3H]−グリシン(5
81GBq/mmol;Amersham,Arlington Height
s,IL)を、GUBまたはCl-を含まないGUBのいずれかへ、2μCi/
mL(127nM)の濃度で添加した。[3H]グリシンの取り込みを、15分
間、37℃で進行させ、この後、細胞を、過剰の氷冷PBSで3回洗浄した。細
胞を、0.5%Triton X−100で可溶化し、そして放射能をシンチレ
ーション計数によって定量した。1ウエル当たりのタンパク質の量を、BCA試
薬アッセイ(Pierce)によって決定した。サルコシン阻害研究のために、
細胞を、取り込みの前に、所望の濃度のサルコシン(GUBまたはCl-を含ま
ないGUBのいずれかの中)で15分間、前処理した。全ての条件を3連で実施
し、そして取り込みをpmolグリシン/mgタンパク質/分として表現した。
へトランスフェクトされる場合に、高親和性グリシン輸送を媒介する(図3)。
HGlyT2トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクトされていないC
OS−7細胞および偽の(mock)トランスフェクトされたCOS−7細胞と
比較して、[H3]グリシン取り込みの7〜10倍の増加を示した。Cl-依存性
取り込みは、GlyT2トランスフェクション実験における総取り込みの80〜
90%を示した(図3)。トランスフェククトされた細胞を用いるグリシン取り
込みデータのイーディーホフステー変換は、Km=10±0.4μMおよびVmax =190±3pmolグリシン/mgタンパク質/分を示した(図4Aおよび4
B)。ラットGlyT2について報告されたKmは13μM(Liu,Q.R.
ら、J.Biol.Chem.268:22802〜22806(1993))
であったので、ヒトおよびラットのGlyT2輸送体についてのグリシン親和性
は、ほぼ同じである。興味深いことに、開始メチオニンが残基154であるよう
にhGlyT2を短縮化することによってまた、9±1μMのKm、および67
±3pmolグリシン/mgタンパク質/分を示す能動的な輸送体が得られた(
図4Aおよび4B)。これらのデータは、最初の153個のアミノ酸の欠失がこ
の輸送体のグリシン親和性に全く影響を及ぼさないことを示唆する。
PCRクローニングの間に同定した(図2)。第1の変異体は、単離された45
個のクローンのうちの3個において見られ、そして短縮型アミノ末端、および膜
貫通ドメイン1と2との間のループをコードする領域における168塩基対挿入
物によって特徴付けられた(図2A)。挿入物の配列分析は、全ての3つの読み
取り枠における終止コドンを示した。予期されるように、この挿入物を含む輸送
体の発現によって、COS−7細胞におけるグリシン取り込みの有意でない増加
を生じた(図3)。従って、第1膜貫通領域および細胞質アミノ末端の損失は、
グリシンの高親和性取り込みを媒介し得ない輸送体を生じる。第2のスプライス
形態もまた、50クローンのうち1つにおいて単離され、そして推定膜貫通領域
6と7との間での48塩基対欠失を示した(図2B)。この欠失は、輸送体の読
み取り枠に影響を与えず、そして効果的に、この細胞内ループからの16個のア
ミノ酸の欠失を生じた。しかし、この比較的小さな欠失は、非機能的輸送体を生
じた(図3)。
列のヌクレオチド221〜2391を含む構築物から発現した(図3)。この短
縮型輸送体(これは、ヒト輸送体のMet−154に対応する開始メチオニンを
予測する)は、全長輸送体の約3分の1の効率で高親和性グリシン取り込みを媒
介した(図3および4)。このレセプターによって媒介された取り込みのイーデ
ィーホフステー分析は、この輸送体のグリシンについての親和性が、全長輸送体
と同じであることを示した(図4Aおよび4B)。これら2つの輸送体について
の取り込みにおける差異は、Vmax値の差異が原因であった。輸送体の短縮型形
態は、高親和性取り込みを媒介するので、hGlyT2のアミノ末端は、グリシ
ン分子の輸送に直接的に関与しないようである。従って、この領域は、輸送体の
膜標的化において役割を果たし得るか、または輸送体の最適な高次構造に寄与し
得る。あるいは、伸長されたN末端の、細胞内調節タンパク質との相互作用が存
在し得る。実際、他のメンバーの輸送体に存在しない、GlyT2の細胞内N末
端における多くの可能性あるリン酸化部位が存在する。興味深いことに、Gly
T2のこのアミノ末端短縮型形態は、第1推定膜貫通領域(TM1)の開始の前
に44個のアミノ酸を有すると予期される。これは、hGlyT1(Kimら(
1994))およびプロリン輸送体(Fremeauら(1992))の、それ
ぞれのTM1の前の、予期される33個および43個の残基と同様である。アミ
ノ末端におけるさらなる153個のアミノ酸は、Na+/Cl-−依存性アミノ酸
輸送体ファミリー中でGlyT2を独特なものとする。
の感受性に関する(Liu,Q.R.ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.(USA)89:12145−12149(1992b);Kim,K−M
.ら、Mol.Pharm.45:608−17(1994);Guastel
la,J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89:71
89−7193(1992))。サルコシン濃度が200μMを超える場合、G
lyT1により媒介されるグリシンの取り込みは、ほとんど完全に阻害されるが
、ラットGlyT2媒介性の取り込みは、1mMのサルコシン濃度にて、わずか
10〜20%阻害される(Liu,Q.R.ら、J.Biol.Chem.26
8:22802−22806(1993))。hGlyT2輸送体と輸送体の短
縮型形態との両方によって媒介されるグリシンの取り込みを、サルコシン濃度を
増加することにおいて評価する(図5)。両方の形態は、サルコシンに対して比
較的非感受性であって、1mMサルコシンの存在下において15%未満の減少を
有した。従って、ヒト形態は、サルコシン阻害に関してはラットに匹敵する。
ある:
号6120295(プールサイズ=69、年齢範囲=22〜70歳)であり;H
SpC−2供給源は、Clontech脊髄ポリA+mRNA、ロット番号70
50107(プールサイズ=92、年齢範囲=16〜75歳)であり;HSpC
−3供給源は、Clontech脊髄ポリA+mRNA、ロット番号70501
07(プールサイズ=92、年齢範囲=16〜75歳)であり;U373MG供
給源は、U373MG星状細胞腫細胞株ポリA+mRNAである。
バイスおよび方法におけるバリエーションが使用され得ることが当業者に対して
明らかであり、そしてこれは、本発明が、本明細書中に具体的に記載されること
とは別に実行され得ることが意図される。従って、本発明は、上記の特許請求の
範囲により定義されるような本発明の精神および範囲内に含まれる全ての改変を
含む。
配列のアセンブリを示す。これらのフラグメントは、その末端で制限部位を用い
てアセンブルされた。このフラグメントは、以下のとおりアセンブルされた:A
をBに連結し(NcoI部位)、CをDに連結し(SpeI部位)、CDをEに
連結し(SacI部位)、CDEをABに連結し(PinA1部位)、そしてF
をABCDEに連結した(PstI部位)。この最終構築物をHinDIIIお
よびEcoR1で消化し、そして発現研究のためにpcDNA3にサブクローニ
ングした。
yT2改変体の配列を示す。この改変体は、示されるとおり別の5’末端を含む
(hGlyT2(5’−インサート))。hGlyT2配列と相同性を示す領域
は太字の下線で示す。この配列の最初の210塩基は、配列の現在のデータベー
スのいずれとも異なる。この相違した領域は、その後に、ヌクレオチド541〜
675の間のhGlyT2配列に適合する配列の135塩基が続く。この領域の
相同性の後、インフレームで終止コドン(ワク囲み残基)を含む172塩基イン
サートが存在する。この領域の後、この配列はヌクレオチド679からのhGl
yT2配列の残部に対する相同性を示す。この改変体について予期された開始メ
チオニンが示される。図2Bは、3’欠失改変体の配列を示す。この3’欠失改
変体(hGlyT2(3’−欠失))を、hGlyT2配列に比較して示してい
る。この改変体はアミノ酸残基496〜509を欠失しており、そして発現され
た場合、アミノ酸残基510〜511の代わりにプロリンをともなうバリンを有
する。この欠失は、推定膜貫通ドメインTM6とTM7との間の細胞内ループに
見出される。hGlyT2配列の翻訳された配列は、上部に示し、一方欠失して
いる配列は底部に示す。
T2輸送体構築物を、COS−7細胞中にトランスフェクトし、そして[3H]
グリシンの取り込みをそれぞれについて測定した。グリーン蛍光タンパク質(G
FP)でトランスフェクトされ、そして蛍光顕微鏡下で見られたコントロール細
胞を用いてトランスフェクション効率を評価した。全長hGlyT2、短縮hG
lyT2、および改変hGlyT2/5I、hGlyT2/3D、およびhGl
yT2/5I−3Dについて、総取り込み(白棒)およびCl-無しの(低親和
性)取り込み(斜線棒)を示す(実施例2を参照のこと)。全長hGlyT2輸
送体により媒介される取り込みは、GFPでトランスフェクトされた細胞よりも
10倍高かった。短縮輸送体は、高親和性グリシン取り込みを媒介して全長hG
lyT2と同じ効率で40%のみであった。改変hGlyT2/5Iは、プラス
ミドでトランスフェクトされたコントロールに比較して取り込みにおいて1.6
倍増加を示した。一方、3’欠失を含有するこの2つの改変体は機能的輸送体活
性を示さない(実施例4を参照のこと)。
ドでトランスフェクトされたコントロールからの値を、対応する、輸送体でトラ
ンスフェクトされたデータから引き算した。示される結果は、3つの独立した実
験の平均である。ここでそれぞれのグリシン濃度を三連でアッセイした。Gly
T2の全長輸送体(図4A)および短縮型形態(図4B)により媒介される輸送
の反応速度論分析が示される。Eadie−Hofstee分析は、それぞれの
インセットにおいて示されている。
ドでトランスフェクトされたコントロールからの値を、対応する、輸送体でトラ
ンスフェクトされたデータから引き算した。示される結果は、3つの独立した実
験の平均である。ここでそれぞれのグリシン濃度を三連でアッセイした。Gly
T2の全長輸送体(図4A)および短縮型形態(図4B)により媒介される輸送
の反応速度論分析が示される。Eadie−Hofstee分析は、それぞれの
インセットにおいて示されている。
ン取り込みへのサルコシンの効果を示す。hGlyT2の全長形態(●)および
短縮型形態(◆)により媒介されるグリシン取り込みへのサルコシンの漸増する
濃度の効果を示す。取りこみは、サルコシンの存在のなしでの輸送体でトランス
フェクトされた細胞により媒介された取り込みのパーセントとして示される。全
長輸送体および短縮輸送体は、サルコシン阻害に対して非感受性である。
Claims (85)
- 【請求項1】 グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号124のアミノ酸2
4に対応する位置でセリンを有する、2型グリシン輸送体(GlyT2)アミノ
酸配列をコードする核酸配列を含む、精製された核酸。 - 【請求項2】 グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号124のアミノ酸7
4に対応する位置でトリプトファンを有する、GlyT2アミノ酸配列をコード
する核酸配列を含む、精製された核酸。 - 【請求項3】 グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号124のアミノ酸1
55に対応する位置でグリシンを有する、GlyT2アミノ酸配列をコードする
核酸配列を含む、精製された核酸。 - 【請求項4】 グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号124のアミノ酸1
88に対応する位置でアスパラギン酸を有する、GlyT2アミノ酸配列をコー
ドする核酸配列を含む、精製された核酸。 - 【請求項5】 グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号124のアミノ酸3
62に対応する位置でロイシンを有する、GlyT2アミノ酸配列をコードする
核酸配列を含む、精製された核酸。 - 【請求項6】 グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号124のアミノ酸4
31に対応する位置でアラニンを有する、GlyT2アミノ酸配列をコードする
核酸配列を含む、精製された核酸。 - 【請求項7】 グリシン輸送体活性を有しかつ配列番号124のアミノ酸5
82に対応する位置でセリンを有する、GlyT2アミノ酸配列をコードする核
酸配列を含む、精製された核酸。 - 【請求項8】 精製された核酸であって、グリシン輸送体活性を有しかつ以
下のアミノ酸:(1)配列番号124のアミノ酸24に対応する位置でセリン、
(2)配列番号124のアミノ酸74に対応する位置でトリプトファン、(3)
配列番号124のアミノ酸155に対応する位置でグリシン、(4)配列番号1
24のアミノ酸188に対応する位置でアスパラギン酸、(5)配列番号124
のアミノ酸362に対応する位置でロイシン、(6)配列番号124のアミノ酸
431に対応する位置でアラニン、または(7)配列番号124のアミノ酸58
2に対応する位置でセリン、のうちの1つ以上を有する、GlyT2アミノ酸配
列をコードする核酸配列を含む、核酸。 - 【請求項9】 請求項1〜8のいずれか1項に記載の精製された核酸であっ
て、ここでコードされるGlyT2アミノ酸配列は、配列番号124のアミノ酸
1〜797の配列であるが以下のアミノ酸置換:(1)24位でセリン、(2)
74位でトリプトファン、(3)155位でグリシン、(4)188位でアスパ
ラギン酸、(5)362位でロイシン、(6)アミノ酸431に対応する位置で
アラニン、または(7)582位でセリン、のうちの1つ以上を有する、核酸。 - 【請求項10】 前記コードされるGlyT2アミノ酸配列が、配列番号1
22のアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の精製された核酸。 - 【請求項11】 前記コードされるGlyT2アミノ酸配列が、配列番号1
20のアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の精製された核酸。 - 【請求項12】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の精製された核酸であ
って、ここで前記核酸配列は、配列番号123の塩基1〜2391の配列である
が以下のヌクレオチド置換:(1)70位でA、(2)220位でT、(3)4
63位でG、(4)562位でG、(5)1085位でT、(6)1292位で
C、(7)1299位でA、(8)1617位でT、または(9)1744位で
T、のうちの1つ以上を有する、核酸。 - 【請求項13】 前記核酸配列が配列番号121の配列である、請求項12
に記載の精製された核酸。 - 【請求項14】 前記核酸配列が配列番号119の配列である、請求項12
に記載の精製された核酸。 - 【請求項15】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の精製された核酸であ
って、さらに以下のアミノ酸:(1)配列番号124のアミノ酸26に対応する
位置でロイシン、(2)配列番号124のアミノ酸75に対応する位置でロイシ
ン、(3)配列番号124のアミノ酸89に対応する位置でバリン、(4)配列
番号124のアミノ酸102に対応する位置でグリシン、(5)配列番号124
のアミノ酸174に対応する位置でグルタミン酸、(6)配列番号124のアミ
ノ酸195に対応する位置でプロリン、(7)配列番号124のアミノ酸199
に対応する位置でグリシン、(8)配列番号124のアミノ酸249に対応する
位置でロイシン、(9)配列番号124のアミノ酸306に対応する位置でプロ
リン、(10)配列番号124のアミノ酸419に対応する位置でグルタミン酸
、(11)配列番号124のアミノ酸442に対応する位置でアスパラギン、(
12)配列番号124のアミノ酸455に対応する位置でリジン、(13)配列
番号124のアミノ酸458に対応する位置でシステイン、(14)配列番号1
24のアミノ酸485に対応する位置でプロリン、(15)配列番号124のア
ミノ酸493に対応する位置でアルギニン、または(16)配列番号124のア
ミノ酸650に対応する位置でグルタミン酸、のうちの1つ以上を有する、核酸
。 - 【請求項16】 請求項1〜9のいずれか1項に記載の精製された核酸であ
って、さらに以下のアミノ酸:(1)配列番号124のアミノ酸124に対応す
る位置でフェニルアラニン、(2)配列番号124のアミノ酸279に対応する
位置でアスパラギン、(3)配列番号124のアミノ酸393に対応する位置で
グリシン、(4)配列番号124のアミノ酸457に対応する位置でアスパラギ
ン、(5)配列番号124のアミノ酸463に対応する位置でアスパラギン、(
6)配列番号124のアミノ酸610に対応する位置でチロシン、(7)配列番
号124のアミノ酸611に対応する位置でバリン、(8)配列番号124のア
ミノ酸733に対応する位置でセリン、(9)配列番号124のアミノ酸735
に対応する位置でバリン、(10)配列番号124のアミノ酸245に対応する
位置でロイシン、(11)配列番号124のアミノ酸305に対応する位置でロ
イシン、(12)配列番号124のアミノ酸366に対応する位置でイソロイシ
ン、または(13)配列番号124のアミノ酸400に対応する位置でプロリン
、のうちの1つ以上を有する、核酸。 - 【請求項17】 請求項12に記載の精製された核酸であるが、さらに以下
のヌクレオチド置換:(a)77位でT、(b)220位でT、(c)244位
でT、(d)266位でT、(e)304位でG、(f)521位でA、(g)
583位でC、(h)596位でG、(i)678位でG、(j)681位でC
、(k)745位でT、(l)750位でC、(m)765位でT、(n)77
7位でCもしくはA、(o)867位でG、(p)917位でC、(q)125
6位でA、(r)1292位でC、(s)1325位でA、(t)1364位で
A、(u)1374位でC、(v)1392位でA、(w)1454位でC、(
x)1478位でG、(y)1854位でC、(z)1949位でA、(aa)
1959位でC、または(bb)2130位でC、のうちの1つ以上を有する、
核酸。 - 【請求項18】 請求項12に記載の精製された核酸であるが、さらに以下
のヌクレオチド置換:(a)6位でC、(b)371位でT、(c)571位で
T、(d)836位でA、(e)1116位でG、(f)1177位でG、(g
)1371位でC、(h)1387位でA、(i)1829位でA、(j)18
31位でG、(k)2198位でC、(l)2203位でG、(m)342位で
G、(n)733位でC、(o)913位でC、(p)951位でA、(q)1
097位でT、(r)1199位でC、(s)352位でT、または(t)21
03位でA、のうちの1つ以上を有する、核酸。 - 【請求項19】 請求項1〜8、10〜11、および13〜14のいずれか
1項に記載の核酸配列を含む、ベクター。 - 【請求項20】 請求項9に記載の核酸配列を含む、ベクター。
- 【請求項21】 請求項12に記載の核酸配列を含む、ベクター。
- 【請求項22】 請求項15に記載の核酸配列を含む、ベクター。
- 【請求項23】 請求項16に記載の核酸配列を含む、ベクター。
- 【請求項24】 請求項17に記載の核酸配列を含む、ベクター。
- 【請求項25】 請求項18に記載の核酸配列を含む、ベクター。
- 【請求項26】 請求項19に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項27】 請求項20に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項28】 請求項21に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項29】 請求項22に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項30】 請求項23に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項31】 請求項24に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項32】 請求項25に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項33】 請求項1〜8、10〜11、および13〜14のいずれか
1項に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。 - 【請求項34】 請求項9に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項35】 請求項12に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項36】 請求項15に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項37】 請求項16に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項38】 請求項17に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項39】 請求項18に記載の核酸配列を含む、組換え宿主細胞。
- 【請求項40】 GlyT2を作製する方法であって、請求項33に記載の
組換え宿主細胞においてGlyT2を発現させる工程を包含する、方法。 - 【請求項41】 GlyT2を作製する方法であって、請求項34に記載の
組換え宿主細胞においてGlyT2を発現させる工程を包含する、方法。 - 【請求項42】 GlyT2を作製する方法であって、請求項35に記載の
組換え宿主細胞においてGlyT2を発現させる工程を包含する、方法。 - 【請求項43】 GlyT2を作製する方法であって、請求項36に記載の
組換え宿主細胞においてGlyT2を発現させる工程を包含する、方法。 - 【請求項44】 GlyT2を作製する方法であって、請求項37に記載の
組換え宿主細胞においてGlyT2を発現させる工程を包含する、方法。 - 【請求項45】 GlyT2を作製する方法であって、請求項38に記載の
組換え宿主細胞においてGlyT2を発現させる工程を包含する、方法。 - 【請求項46】 GlyT2を作製する方法であって、請求項39に記載の
組換え宿主細胞においてGlyT2を発現させる工程を包含する、方法。 - 【請求項47】 精製された核酸であって、配列番号122のタンパク質配
列である参照配列または以下のアミノ酸置換: 【化1】 のうちの1つ以上を有することを除いて配列番号122のタンパク質配列に対応
する配列と、少なくとも約96%の配列同一性を有する2型グリシン輸送体(G
lyT2)をコードする、核酸。 - 【請求項48】 請求項47に記載の核酸であって、ここで前記参照配列が
配列番号122のタンパク質配列であるか、または以下のアミノ酸置換: 【化2】 のうちの1つ以上を有することを除いて配列番号122のタンパク質配列に対応
する配列である、核酸。 - 【請求項49】 前記配列同一性が、少なくとも約97%の配列同一性、少
なくとも約98%の配列同一性、および少なくとも約99%の配列同一性の群か
ら選択される、請求項47に記載の核酸。 - 【請求項50】 前記配列同一性が、少なくとも約99.5%である、請求
項47に記載の核酸。 - 【請求項51】 前記核酸が、前記参照配列を有するGlyT2をコードす
る、請求項47に記載の核酸。 - 【請求項52】 請求項47に記載の核酸であって、配列番号121の核酸
配列または、以下のヌクレオチド置換: 【化3】 のうちの1つ以上を有することによって配列番号121の核酸配列から変動する
配列を含む、核酸。 - 【請求項53】 配列番号121の核酸配列または以下のヌクレオチド置換
:C220→T、A304→G、もしくはT1292→Cのうちの1つ以上を有することに
よって配列番号121の核酸配列から変動する配列。 - 【請求項54】 請求項47に記載の核酸およびそれと機能的に結合される
外因性プロモーターを含む、ベクター。 - 【請求項55】 参照アミノ酸配列のすべてまたは1〜2個の隣接した部分
と、少なくとも約99.5%の配列同一性を有するグリシン輸送体タンパク質を
コードする核酸であって、ここで該参照配列は、配列番号122であるかまたは
以下のアミノ酸置換: 【化4】 のうちの1つ以上を有することを除いて配列番号122のアミノ酸配列に対応す
るアミノ酸配列である、核酸。 - 【請求項56】 前記1〜2個の隣接した配列の部分が、少なくとも約60
0アミノ酸、少なくとも約700アミノ酸、および少なくとも約750アミノ酸
の群から選択されるアミノ酸を含む、請求項55に記載の核酸。 - 【請求項57】 請求項47〜53および55〜56のいずれか1項に記載
の核酸を含む、細胞。 - 【請求項58】 請求項54に記載のベクターで形質転換された、細胞。
- 【請求項59】 グリシン輸送体を産生する方法であって、請求項57に記
載の細胞を増殖させる工程を包含する、方法。 - 【請求項60】 グリシン輸送体を産生する方法であって、請求項58に記
載の細胞を増殖させる工程を包含する、方法。 - 【請求項61】 以下の工程:(a)前記細胞から膜を単離する工程であっ
て、該膜が前記グリシン輸送体を含む、工程、または(b)該細胞からタンパク
質画分を抽出する工程であって、該画分が該グリシン輸送体を含む、工程、のう
ちの少なくとも1つをさらに包含する、請求項59に記載の方法。 - 【請求項62】 以下の工程:(a)前記細胞から膜を単離する工程であっ
て、該膜が前記グリシン輸送体を含む、工程、または(b)該細胞からタンパク
質画分を抽出する工程であって、該画分が該グリシン輸送体を含む、工程、のう
ちの少なくとも1つをさらに包含する、請求項60に記載の方法。 - 【請求項63】 請求項57に記載の細胞から単離された、グリシン輸送体
。 - 【請求項64】 請求項58に記載の細胞から単離された、グリシン輸送体
。 - 【請求項65】 神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子を
特徴付けるため、または神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子
を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程:(a)以下(i)請求
項57に記載の細胞または(ii)請求項63に記載の単離されたグリシン輸送
体タンパク質、を含む第1のアッセイ組成物を提供する工程、(b)該第1のア
ッセイ組成物を、該生物活性因子または予期される生物活性因子と接触させる工
程、および該アッセイ組成物によって示されるグリシン輸送体の量を測定する工
程、を包含する、方法。 - 【請求項66】 神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子を
特徴付けるため、または神経系の障害もしくは状態の処置のための生物活性因子
を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程:(a)以下(i)請求
項58に記載の細胞または(ii)単離されたグリシン輸送体タンパク質(ii
)請求項64に記載の単離されたグリシン輸送体タンパク質、を含む第1のアッ
セイ組成物を提供する工程、(b)該第1のアッセイ組成物を、該生物活性因子
または予期される生物活性因子と接触させる工程、および該アッセイ組成物によ
って示されるグリシン輸送体の量を測定する工程、を包含する、方法。 - 【請求項67】 請求項65に記載の方法であって、前記生物活性因子また
は予期される生物活性因子と接触させていないことを除いて前記第1のアッセイ
組成物と同じように処理されているような第2のアッセイ組成物によって示され
るグリシン輸送体の量と、該第1のアッセイ組成物によって示されるグリシン輸
送体の量を比較する工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項68】 請求項66に記載の方法であって、前記生物活性因子また
は予期される生物活性因子と接触させていないことを除いて前記第1のアッセイ
組成物と同じように処理されているような第2のアッセイ組成物によって示され
るグリシン輸送体の量と、該第1のアッセイ組成物によって示されるグリシン輸
送体の量を比較する工程をさらに包含する、方法。 - 【請求項69】 前記神経系の障害もしくは状態が、(a)疼痛、(b)痙
性、(c)ミオクローヌス、(d)筋痙攣、(e)筋機能亢進、または(f)癲
癇、からなる群のうちの1つである、請求項65に記載の方法。 - 【請求項70】 前記神経系の障害もしくは状態が、(a)疼痛、(b)痙
性、(c)ミオクローヌス、(d)筋痙攣、(e)筋機能亢進、または(f)癲
癇、からなる群のうちの1つである、請求項66に記載の方法。 - 【請求項71】 前記痙性が、発作、頭部外傷、ニューロン細胞死、多発性
硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンティングトン病、または筋萎縮性側索硬化症と
関連する、請求項69に記載の方法。 - 【請求項72】 前記痙性が、発作、頭部外傷、ニューロン細胞死、多発性
硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンティングトン病、または筋萎縮性側索硬化症と
関連する、請求項70に記載の方法。 - 【請求項73】 核酸であって、(a)ラットGlyT2輸送体の配列また
は(b)哺乳動物GlyT1輸送体の配列とのハイブリダイゼーションを排除す
るのに十分なストリンジェンシーの条件下で、配列番号121である参照核酸配
列または以下のヌクレオチド置換: 【化5】 のうちの1つ以上を有することによって配列番号121の核酸配列から変動する
配列とハイブリダイズする、核酸。 - 【請求項74】 前記核酸がPCRプライマーであり、そして前記ストリン
ジェントな条件が、ヒトGlyT2配列を増幅するが、(a)ラットGlyT2
輸送体の配列または(b)哺乳動物GlyT1輸送体の配列を増幅しないために
有効なPCR条件である、請求項73に記載の核酸配列。 - 【請求項75】 ヒトGlyT2の遺伝子またはcDNAのコード鎖または
非コード鎖由来の隣接した配列を含む、少なくとも約18ヌクレオチド長の核酸
であって、該隣接した配列は、該隣接した配列と整列したラットGlyT2遺伝
子配列と比較した場合に、少なくとも1ヌクレオチドの差異を有する、核酸。 - 【請求項76】 請求項73に記載のアンチセンス分子であって、隣接した
ストレッチが、配列番号121の核酸配列または以下のヌクレオチド置換: 【化6】 のうちの1つ以上を有することによって配列番号121の核酸配列から変動する
配列のコード鎖または非コード鎖に含まれる、アンチセンス分子。 - 【請求項77】 請求項73に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 【請求項78】 組織または細胞におけるGlyT2発現を減少させる方法
であって、(a)GlyT2発現を減少させるために有効な量の請求項73に記
載の核酸、または(b)GlyT2発現を減少させるために有効な量で該組織ま
たは細胞において該核酸を発現させるための発現ベクターを、該組織または細胞
に適用する工程を包含する、方法。 - 【請求項79】 神経系の障害または状態を処置する方法であって、神経系
の障害もしくは状態を処置する有効な量の請求項73に記載の核酸、または神経
系の障害もしくは状態を処置する有効な量の、ヒト組織もしくは細胞において該
核酸を発現させるための発現ベクターを、該患者の組織または細胞に適用する工
程を包含する、方法。 - 【請求項80】 動物が、グリシン輸送体に対する自己免疫抗体を有するか
否かを決定する方法であって、該方法は、該動物由来の抗体調製物または該動物
由来の体液と、グリシン輸送体を含むポリペプチド抗原または該グリシン輸送体
に由来するポリペプチド抗原とを接触させる工程を包含する、方法。 - 【請求項81】 ヒトGlyT2に特異的な抗体を調製する方法であって、
請求項63に記載の単離されたグリシン輸送体タンパク質で動物を免疫する工程
を包含する、方法。 - 【請求項82】 ヒトGlyT2に特異的な抗体を調製する方法であって、
請求項64に記載の単離されたグリシン輸送体タンパク質で動物を免疫する工程
を包含する、方法。 - 【請求項83】 精製された核酸であって、グリシン輸送体活性を有しかつ
以下のアミノ酸:(1)配列番号124のアミノ酸24に対応する位置でセリン
、(2)配列番号124のアミノ酸74に対応する位置でトリプトファン、(3
)配列番号124のアミノ酸155に対応する位置でグリシン、(4)配列番号
124のアミノ酸188に対応する位置でアスパラギン酸、(5)配列番号12
4のアミノ酸362に対応する位置でロイシン、(6)配列番号124のアミノ
酸431に対応する位置でアラニン、および(7)配列番号124のアミノ酸5
82に対応する位置でセリンを有する、GlyT2アミノ酸配列をコードする核
酸配列を含む、核酸。 - 【請求項84】 請求項83に記載の精製された核酸であって、コードされ
るGlyT2アミノ酸配列は、配列番号124のアミノ酸1〜797の配列であ
るが以下のアミノ酸置換:(1)24位でセリン、(2)74位でトリプトファ
ン、(3)155位でグリシン、(4)188位でアスパラギン酸、(5)36
2位でロイシン、(6)アミノ酸431に対応する位置でアラニン、および(7
)582位でセリン、を有する、核酸。 - 【請求項85】 前記コードされるGlyT2アミノ酸配列が、配列番号1
20のアミノ酸配列を含む、請求項84に記載の精製された核酸。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/191,468 | 1998-11-12 | ||
US09/191,468 US6416975B1 (en) | 1998-11-12 | 1998-11-12 | Human glycine transporter type 2 |
PCT/US1999/026534 WO2000029564A2 (en) | 1998-11-12 | 1999-11-09 | Human glycine transporter type 2 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002530073A true JP2002530073A (ja) | 2002-09-17 |
Family
ID=22705618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000582548A Pending JP2002530073A (ja) | 1998-11-12 | 1999-11-09 | ヒト2型グリシン輸送体 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6416975B1 (ja) |
EP (1) | EP1129183A2 (ja) |
JP (1) | JP2002530073A (ja) |
AU (1) | AU1614400A (ja) |
CA (1) | CA2350698A1 (ja) |
WO (1) | WO2000029564A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008281545A (ja) * | 1996-08-20 | 2008-11-20 | Nps Allelix Corp | ヒトグリシン輸送体 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6416975B1 (en) * | 1998-11-12 | 2002-07-09 | Gliatech, Inc. | Human glycine transporter type 2 |
WO2003102011A1 (en) * | 2002-05-29 | 2003-12-11 | Neopharm, Inc. | Method for determining oligonucleotide concentration |
US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
CN115443145A (zh) * | 2020-04-14 | 2022-12-06 | 淀粉样蛋白解决方案株式会社 | 包括作为活性成分的甘氨酸转运体的用于治疗神经退行性脑病的药物组合物 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998007854A1 (en) * | 1996-08-20 | 1998-02-26 | Allelix Neuroscience, Inc. | Human glycine transporter |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3376110A (en) | 1967-01-30 | 1968-04-02 | Gen Aniline & Film Corp | Solid stabilized hydrogen peroxide compositions |
US4016043A (en) | 1975-09-04 | 1977-04-05 | Akzona Incorporated | Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies |
US4391904A (en) | 1979-12-26 | 1983-07-05 | Syva Company | Test strip kits in immunoassays and compositions therein |
US5047523A (en) * | 1988-08-02 | 1991-09-10 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea |
US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
US5733761A (en) | 1991-11-05 | 1998-03-31 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
US5641670A (en) | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
PT871440E (pt) * | 1995-12-07 | 2006-07-31 | Daniel C Javitt | Tratamento de sintomas negativos e cognitivos de esquizofrenia com antagonistas da captacao de glicina |
US6416975B1 (en) * | 1998-11-12 | 2002-07-09 | Gliatech, Inc. | Human glycine transporter type 2 |
-
1998
- 1998-11-12 US US09/191,468 patent/US6416975B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-11-09 AU AU16144/00A patent/AU1614400A/en not_active Abandoned
- 1999-11-09 CA CA002350698A patent/CA2350698A1/en not_active Abandoned
- 1999-11-09 WO PCT/US1999/026534 patent/WO2000029564A2/en not_active Application Discontinuation
- 1999-11-09 EP EP99958864A patent/EP1129183A2/en not_active Withdrawn
- 1999-11-09 JP JP2000582548A patent/JP2002530073A/ja active Pending
-
2002
- 2002-07-09 US US10/191,813 patent/US20030165907A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998007854A1 (en) * | 1996-08-20 | 1998-02-26 | Allelix Neuroscience, Inc. | Human glycine transporter |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008281545A (ja) * | 1996-08-20 | 2008-11-20 | Nps Allelix Corp | ヒトグリシン輸送体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20030165907A1 (en) | 2003-09-04 |
WO2000029564A2 (en) | 2000-05-25 |
EP1129183A2 (en) | 2001-09-05 |
AU1614400A (en) | 2000-06-05 |
CA2350698A1 (en) | 2000-05-25 |
US6416975B1 (en) | 2002-07-09 |
WO2000029564A3 (en) | 2000-11-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2002518010A (ja) | 94個のヒト分泌タンパク質 | |
JPH09509160A (ja) | Fk−506細胞質ゾル結合蛋白質 | |
US20070117166A1 (en) | Use of ULIP proteins in the diagnosis and therapy of cancers and paraneoplastic neurological syndromes | |
JP2002501738A (ja) | 67個のヒト分泌タンパク質 | |
JP2002530073A (ja) | ヒト2型グリシン輸送体 | |
US20040214763A1 (en) | Method for determining the ability of a compound to modify the interaction between parkin and the p38 protein | |
JPWO2001081401A1 (ja) | 新規コレクチン | |
WO1998041541A9 (en) | Therapeutic uses of grip and grip-related molecules | |
WO2001058943A1 (fr) | Nouvelle proteine clac du type collagene, precurseur de ladite proteine, et genes codant pour cette proteine | |
WO1998041541A1 (en) | Therapeutic uses of grip and grip-related molecules | |
JP4171228B2 (ja) | 可溶型rage測定法 | |
WO2001059107A1 (fr) | Nouveaux recepteurs destructeurs | |
WO2001077323A1 (fr) | Gene codant pour l'erbin et utilisations diagnostiques et therapeutiques | |
JP2003525059A (ja) | 新規ヒトulip/crmpタンパク質と癌及び傍新形成性神経症候群の診断及び治療におけるその使用 | |
US20040115682A1 (en) | Novel scavenger receptor class a protein | |
JP2005505264A (ja) | 新規ヒトプロトンゲート調節チャンネル | |
JP2002300878A (ja) | 新規bHLH型転写因子遺伝子、DEC2 | |
US6956104B2 (en) | Protein Rim2 | |
WO2001079478A1 (fr) | Facteurs participant a la degranulation des basophiles, adns codant ces facteurs, inhibiteurs de ces facteurs, et procedes de recherche systematique de ces inhibiteurs | |
JPWO2003044196A1 (ja) | ポストシナプス蛋白質 | |
JP4161103B2 (ja) | 小型中性アミノ酸を輸送するナトリウム非依存性トランスポーター及びその遺伝子、及びその機能特定を可能にした融合タンパク質作製によるトランスポーターの機能解析法 | |
JP2000083672A (ja) | アポトーシス関連タンパク質 | |
WO2002036630A2 (fr) | Proteine recepteur de la renine et/ou de la prorenine, acide nucleique codant pour ce recepteur et leurs applications | |
JP2003529332A (ja) | ヒト内向き整流性カリウムチャンネルサブユニット | |
JP2003512041A (ja) | ヒトおよびネズミの接着タンパク質(BIgR)をコードするポリヌクレオチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A625 | Written request for application examination (by other person) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A625 Effective date: 20061108 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20070405 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090901 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091124 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091201 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100420 |