JP2003512041A - ヒトおよびネズミの接着タンパク質（ＢＩｇＲ）をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト接着タンパク質またはネズミ接着タンパク質をコード鎖売る単離および精製されたポリヌクレオチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は分子生物学に関する。より詳細には、本発明は、ヒトまたはネズミの
接着タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによって
コードされるポリペプチド、および前記ポリペプチドを発現する組換えベクター
に関する。

【０００２】 発明の背景 細胞接着は、多細胞生物の形成および機能的維持には非常に重要である。接着
タンパク質は、細胞間の結合を媒介し、かつ／または細胞−基質の相互作用に関
与する細胞表面分子として分類することができる。それらの細胞内ドメインは、
細胞骨格に対する機能的な連結を提供し、そしてこのことが、効率的な細胞−細
胞の接着を生じさせるためには重要であると考えられている。接着タンパク質は
特徴的な時空的系列で発現する。種々のスーパーファミリーが記載されており、
これには、免疫グロブリン（以降、「Ｉｇ」）、カドヘリン、インテグリン、セ
レクチンが含まれる（Ａｌｐｉｎ ＡＥ、Ｈｏｗｅ Ａ、Ａｌａｈａｒｉ ＳＫ
、Ｊｕｌｉａｎｏ ＲＬ、（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５０：１
９７〜２６３）。免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着タンパク質は
、同種的様式および／または異種的様式の両方で作用し得る。共通した構成ブロ
ックはＩｇドメインであり、そしてその原型は、５つのＩｇドメインを有する神
経細胞接着分子（以降、「ＮＣＡＭ」）である。このファミリーは、白血球−内
皮細胞の相互作用、神経堤細胞遊走、神経突起誘導および腫瘍侵入を含む多様な
生物学的機能に関与している。

【０００３】 Ｉｇスーパーファミリーの炎症メンバーは、血管壁を介して、白血球と相互作
用し、かつ白血球の接着、侵入および遊走に関与していることが十分に明らかに
されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｍａｒｏ Ｒ、Ｄｉａｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ
Ｆ、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ Ｆ、（１９９８）Ｄｒｕｇｓ、５６：９
７７〜８８）。セレクチンは、白血球と活性化された内皮細胞との初期の相互作
用（束縛／ローリング）に関与しているが、インテグリンおよびＩｇスーパーフ
ァミリーのＣＡＭは、これらの細胞の強固な接着およびそれらのその後の管外遊
出を媒介している。

【０００４】 強固接合部（以降、「ＴＪ」）および付着性接合部（以降、「ＡＪ」）は、向
合う内皮細胞と上皮細胞との間に存在する特殊化された構造である。それらは、
動的であり、かつ調節される半透過性の細胞内拡散バリアを形成する。明らかに
、これらの構造は、循環から白血球の通過を容易にするためには破壊されるか、
または再構成されなければならない。血小板内皮細胞接着分子のＰＥＣＡＭ−１
（Ｉｇスーパーファミリーの接着タンパク質のメンバー）は内皮細胞間の外側膜
に局在化している（Ｚｏｃｃｈｉ ＭＲ、Ｆｅｒｒｅｒｏ Ｅ、Ｌｅｏｎｅ Ｂ
Ｅ、Ｒｏｖｅｒｅ Ｐ、Ｂｉａｎｃｈｉ Ｅ、Ｔｏｎｉｎｅｌｌｉ Ｅ、Ｐａｒ
ｄｉ Ｒ、（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：７５９〜６７）。
しかし、これはＴＪ構造およびＡＪ構造と結合していない（Ａｙａｌｏｎ Ｏ、
Ｓａｂａｎａｉ Ｈ、Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉ ＭＧ、Ｄｅｊａｎａ Ｅ、Ｇｅｉ
ｇｅｒ Ｂ、（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１２６（１）：２４７〜５８
）。白血球の管外組織へのパラ細胞的（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）遊走におけ
るＰＥＣＡＭ−１の極めて重要な役割が明らかにされている（Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ
Ａ、Ｗｅｉｇｌ ＳＡ、Ｄｅｎｇ Ｘ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＤＭ、（１９９３）
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４４９〜６０）。Ｉｇスーパーファミリーの別の
細胞−細胞接着分子であるネクチン（以降、「ＰＲＰ」）は、新規なタンパク質
のアファジンにおけるＰＤＺドメインとの相互作用によってＡＪに動員される（
Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ、Ｍｉｙａｈａｒａ Ｍ、Ｍ
ａｎｄａｉ Ｋ、Ｓａｔｏｈ Ｋ、Ｓａｔｏｈ Ａ、Ｎｉｓｈｉｏｋａ Ｈ、Ａ
ｏｋｉ Ｊ、Ｎｏｍｏｔｏ Ａ、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ Ａ、Ｔａｋａｉ Ｙ、（
１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４５：５３９〜４９）。

【０００５】 強固接合部は、血液脳関門（以降、「ＢＢＢ」）および血状網膜関門（以降、
「ＢＲＢ」）の維持には極めて重要な構造である。場合により、ＴＪを選択的に
破壊することが望ましい場合がある。例えば、ＢＢＢの破壊により、血管を介し
て治療剤を脳に送達する方法が提供され得る（Ｍｕｌｄｏｏｎ ＬＬ、Ｐａｇｅ
ｌ ＭＡ、Ｋｒｏｌｌ ＲＡ、Ｒｏｍａｎ−Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｓ、Ｊｏｎｅ
ｓ ＲＳ、Ｎｅｕｗｅｌｔ ＥＡ、（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｒａｄｉ
ｏｌ．２０：２１７〜２２）。一方、ＢＢＢの破壊は、多発性硬化症および卒中
の病理の一部である。この場合、ＴＪの再構成を防止することが望ましい。

【０００６】 １９９８年に、新規なマウス接合接着分子（以降、「ＪＡＭ」）がクローン化
され、強固接合部のさらなる膜貫通タンパク質成分として同定された（Ｍａｒｔ
ｉｎ−Ｐａｄｕｒａ Ｉ、Ｌｏｓｔａｇｌｉｏ Ｓ、Ｓｃｈｎｅｅｍａｎｎ Ｍ
、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｌ、Ｒｏｍａｎｏ Ｍ、Ｆｒｕｓｃｅｌｌａ Ｐ、Ｐａｎ
ｚｅｒｉ Ｃ、Ｓｔｏｐｐａｃｃｉａｒｏ Ａ、Ｒｕｃｏ Ｌ、Ｖｉｌｌａ Ａ
、Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｄ、Ｄｅｊａｎａ Ｅ、（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１４２（１）：１１７〜２７）。ＪＡＭは、２つのＩｇドメイン、１個の膜
貫通ドメインおよび短い細胞内ドメインを有する。したがって、これは接着分子
のＩｇスーパーファミリーに属し、そして証拠により、ＪＡＭもまた免疫細胞の
パラ細胞的移動に影響することが示唆される。その細胞外ドメインが異種的な相
互作用に関わっているかどうかは依然として評価されなければならない。

【０００７】 マウスＪＡＭのヌクレオチド配列を利用して、Ｉｇスーパーファミリーに属す
る新規な仮想的な接着タンパク質が同定された。

【０００８】 発明の概要 本発明は、ヒト接着ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離お
よび精製されたヒト接着ポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明はさらに、
配列番号１のヌクレオチド配列を有する単離および精製されたポリヌクレオチド
に関する。このヒト接着ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配
列を有する。

【０００９】 本発明は、ネズミ接着ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離
および精製されたネズミ接着ポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明はさら
に、配列番号３のヌクレオチド配列を有する単離および精製されたポリヌクレオ
チドに関する。このネズミ接着ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミ
ノ酸配列を有する。

【００１０】 本発明はまた組換えベクターに関する。このベクターは、ヒト接着タンパク質
またはネズミ接着タンパク質のいずれかをコードする、配列番号１または配列番
号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含有する。ポリヌクレオチ
ドは、ヌクレイチド配列および終結セグメントの発現を制御するプロモーターに
機能的に連結されている。

【００１１】 本発明はまた、組換えベクターを含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、細
菌細胞、動物細胞または植物細胞であり得る。本発明はまた、ポリヌクレオチド
のヌル変異を有するトランスジェニック哺乳動物、または本明細書中に記載され
るポリヌクレオチドを過剰に発現する動物に関する。

【００１２】 本発明はまた、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列のヌル変異を
含むトランスジェニック哺乳動物に関する。あるいは、本発明はまた、配列番号
１または配列番号３のヌクレオチド配列を過剰に発現するトランスジェニック哺
乳動物に関する。

【００１３】 最後に、本発明は、本明細書中前記に記載されるポリペプチドの一方または両
方に結合する抗体に関する。

【００１４】 図面の簡単な説明 図１Ａは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおける国立バイオテ
クノロジー情報センターのホームページからアクセスできるデータベースから得
られる相同的発現配列タグ（以降、「ＥＳＴ」として示される）と、ネズミの接
合接着タンパク質（以降、「マウスＪＡＭ」として示される）のオープンリーデ
ィングフレームとのアラインメントを示す。同一性がアミノ酸レベルで示されて
いる。図１Ｂは、停止コドンを含む、ヒト脳免疫グロブリンスーパーファミリー
受容体（以降、「ヒトＢＩｇＲ」として示される）の様々な部分をコードする重
複するＥＳＴのアラインメントを示す。図１Ｃは、ヒトＢＩｇＲの全長オープン
リーディングフレームを得るために用いられたｃＤＮＡ末端の迅速増幅（以降、
「ＲＡＣＥ」として示される）法を要約する。それぞれの反応から同定された最
長クローンがアラインメントされている。

【００１５】 図２は、ＲＡＣＥ反応物１および２から得られた配列のＧｅｎＢａｎｋアクセ
ション番号ＡＦ０６２７３３とのアラインメントを示す。単離されたＲＡＣＥ反
応物２は、ＡＦ０６２７３３と比較して、３４アミノ酸の欠失を有するクローン
である。

【００１６】 図３は、ヒトＢＩｇＲの全長のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。予測
されるシグナル配列および膜貫通ドメインには下線が付けられている。Ｎ結合型
グリコシル化部位が、細胞外ドメインの免疫グロブリン様フォールド内における
ジスルフィド結合を形成するシステイン残基と同様に強調されている。◆：３４
アミノ酸の挿入耐の位置および配列（下記） 図４は、ヒトＢＩｇＲの細胞内ドメインと、グリコフォリンＣおよびショウジ
ョウバエのニューレキシンとのアラインメントを示す。これらの配列の少なくと
も２つに間に保存されている残基が強調されている。

【００１７】 図５は、ネズミ接着タンパク質（以降、「マウスＢＩｇＲ」として示される）
の完全なｃＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示す。保存されているシステイン
残基が強調されている。

【００１８】 図６は、マウス（上段）およびヒト（下段）のＢＩｇＲアミノ酸配列のアライ
ンメントを示す。

【００１９】 図７は、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰのＢＩｇＲプローブを用いて高ストリンジェ
ンシーのもとでプローブされた多組織ノーザンブロットにおいて同定された転写
物を示す。矢印はヒトＢＩｇＲ転写物を強調している。

【００２０】 図８は、転写物が、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰのＢＩｇＲ（Ａ）またはβ−アク
チン（Ｂ）を用いて高ストリンジェンシーのもとでプローブされた正規化ヒト脳
多組織ノーザンブロットにおいて同定されたことを示す。矢印はヒトＢＩｇＲ転
写物を強調している。

【００２１】 図９は、ウサギ抗ＢＩｇＲ抗体を用いてプローブされたＣｏｓ細胞（コントロ
ール細胞およびＢＩｇＲ発現細胞）のウエスタンブロットである 図１０は、ＣＨＯ細胞において発現させたときのＢＩｇＲの細胞レベル以下で
の局在化を明らかにする。免疫蛍光を、ウサギ抗ＢＩｇＲ抗体を用いて行い、Ｎ
ｏｒａｎＴＭ共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｎｏｒａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）を使用して画像化した。

【００２２】 図１１は、様々な白血球細胞株におけるＢＩｇＲ対抗受容体のスクリーニング
を示す。カルセイン負荷細胞を、９６ウエルプレートに捕捉されたＢＩｇＲ−Ｆ
ｃに加えた。結合をＴＢＳ中（ｎ＝６）またはＴＢＳ＋１Ｍｎ中（ｎ＝６）にお
いて行った。ウエルを洗浄し、保持された細胞を溶解して、蛍光を、励起４８５
ｎｍ／放射５３０ｎｍにおいて蛍光計で定量した。代表的な実験から得られたデ
ータ。平均±ＳＥＭ。

【００２３】 発明の詳細な説明 Ｉ．本発明 本発明は、ヒト接着タンパク質（本明細書中では「ヒトＢＩｇＲ」と示される
）およびネズミ接着タンパク質（本明細書中では「マウスＢＩｇＲ」と示される
）をコードする単離および精製されたポリペプチド配列に関する。別の実施形態
において、本発明は、ヒトＢＩｇＲおよびマウスＢＩｇＲに対するポリペプチド
に関する。さらに別の実施形態において、本発明は、発現したときにヒトＢＩｇ
ＲまたはマウスＢＩｇＲを産生させる組換えベクターに関する。本発明はまた、
このような組換えベクターで形質転換された宿主細胞に関する。

【００２４】 ＩＩ．配列表 本出願はまた、１０個の配列を含む配列表を含む。配列表はヌクレオチド配列
およびアミノ酸配列を含む。ヌクレオチド配列の場合、塩基対は下記の塩基コー
ドによって表される： 記号： 意味 Ａ Ａ；アデニン Ｃ Ｃ；シトシン Ｇ Ｇ；グアニン Ｔ Ｔ；チミン Ｕ Ｕ；ウラシル Ｍ ＡまたはＣ Ｒ ＡまたはＧ Ｗ ＡまたはＴ／Ｕ Ｓ ＣまたはＧ 記号： 意味 Ｙ ＣまたはＴ／Ｕ Ｋ ＧまたはＴ／Ｕ Ｖ ＡまたはＣまたはＧ；Ｔ／Ｕではない Ｈ ＡまたはＣまたはＴ／Ｕ；Ｇではない Ｄ ＡまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ｃではない Ｂ ＣまたはＧまたはＴ／Ｕ；Ａではない Ｎ （ＡまたはＣまたはＧまたはＴ／Ｕ） 本出願において示されるアミノ酸はＬ形態であり、アミノ酸の下記の３文字略
号によって表される： 略号 アミノ酸名 Ａｌａ Ｌ−アラニン Ａｒｇ Ｌ−アルギニン Ａｓｎ Ｌ−アスパラギン Ａｓｐ Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｘ Ｌ−アスパラギン酸またはアスパラギン Ｃｙｓ Ｌ−システイン Ｇｌｕ Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｎ Ｌ−グルタミン Ｇｌｘ Ｌ−グルタミンまたはグルタミン酸 Ｇｌｙ Ｌ−グリシン Ｈｉｓ Ｌ−ヒスチジン Ｉｌｅ Ｌ−イソロイシン Ｌｅｕ Ｌ−ロイシン Ｌｙｓ Ｌ−リシン Ｍｅｔ Ｌ−メチオニン Ｐｈｅ Ｌ−フェニルアラニン Ｐｒｏ Ｌ−プロリン Ｓｅｒ Ｌ−セリン Ｔｈｒ Ｌ−トレオニン Ｔｒｐ Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ Ｌ−チロシン Ｖａｌ Ｌ−バリン Ｘａａ Ｌ−不明またはその他 ＩＩＩ．ポリヌクレオチド １つの態様において、本発明は、ヒトＢＩｇＲをコードする単離および精製さ
れたポリヌクレオチドを提供する。別の態様において、本発明は、マウスＢＩｇ
Ｒをコードする単離および精製されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポ
リヌクレオチドは、遺伝子配列、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡなどのＤＮＡ分子で
あり得る。ＤＮＡ分子は二本鎖または一本鎖であり得るが、一本鎖である場合に
はコード鎖であってもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡなどのＲＮ
Ａ分子であり得る。

【００２５】 本発明はまた、コード配列に対して相補的である非コード鎖（アンチセンス）
、ならびにそのようなコード配列に対して同一であるか、または相補的であるＲ
ＮＡ配列を提供する。当業者は、対応するＲＮＡ配列がウラシル（Ｕ）をチミジ
ンの代わりに含有することを容易に理解する。

【００２６】 １つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＢＩｇＲのコー
ド配列を含む単離および精製されたｃＤＮＡ分子である。例示的なｃＤＮＡ分子
が配列番号１として示されている。別の実施形態において、本発明のポリヌクレ
オチドは、マウスＢＩｇＲのコード配列を含む単離および精製されたｃＤＮＡ分
子である。例示的なｃＤＮＡ分子が配列番号３として示されている。

【００２７】 当分野でよく知られるように、遺伝コードの縮重のために、配列番号１または
配列番号３によってコードされるものと同じポリペプチドをコードすることがで
きる数多くの他のＤＮＡおよびＲＮＡ分子、またはこれらの一部分または断片が
存在する。本発明では、配列番号１または配列番号３に示される配列と少なくと
も７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、最も好ましくは９０
％の相同性を有する相同的ポリヌクレオチドも企図する。本明細書で使用する「
相同性」という語は、相補性の程度を表す。部分的な相同性または完全な相同性
（すなわち同一性）が存在してよい。部分的に相補的な配列は、同一の配列の標
的核酸とのハイブリダイズを少なくとも部分的に阻害する配列である。機能的な
用語「ほぼ相同性である」を使用することが好ましい。低ストリンジェンシーの
条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶
液ハイブリダイゼーションなど）を使用して、完全に相補的な配列の標的配列へ
のハイブリダイゼーションの阻害を調べることができる。ほぼ相同性である配列
またはプローブは競合し、完全に相同的な配列の結合（すなわちそのハイブリダ
イゼーション）を阻害するか、または低ストリンジェンシーの条件下で標的配列
へプローブする。低ストリンジェンシーの条件が非特異的な結合を可能にするよ
うな条件であるということはできない。低ストリンジェンシーの条件では、２つ
の配列のお互いへの結合が特異的（すなわち選択的）相互作用であることが必要
である。部分的な程度の相補性さえも欠けている（たとえば同一性が約３０％未
満）第２の標的配列を使用することによって、非特異的な結合が存在しないこと
を試験することができる。非特異的な結合が存在しない場合、プローブは第２の
非相補的な標的配列とはハイブリダイズしないはずである。さらに本発明では、
天然に存在する対立遺伝子の変異体および前述のｃＤＮＡ配列の突然変異体も企
図する。ただし、これらの変異体および突然変異体は、発現体上に本発明のヒト
またはネズミの接着性タンパク質をコードしている。本発明は、ヒトおよびネズ
ミのＢＩｇＲポリヌクレオチドのスプライス変異体も含む。

【００２８】 当分野でよく知られる技法を使用して、マーカー目的の選択において、本発明
のポリヌクレオチドを使用することができる。マーカー目的の選択は、遺伝子の
完全な配列を必要としない。その代わりに、部分的な配列をハイブリダイゼーシ
ョンプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマー用のベースとして使用して、
ＰＣＲまたはヒトまたはネズミの接着性タンパク質に特異的なヌクレオチドを他
のホ乳類中で同定するための他の方法によって増幅させることができる。

【００２９】 ＩＶ．ポリペプチド 本発明は、ヒトＢＩｇＲおよびネズミのＢＩｇＲをコードしているポリペプチ
ドも提供する。ヒトＢＩｇＲタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２中に提供し
、これは３９８個のアミノ酸残基を含む。マウスＢＩｇＲ接着性タンパク質のア
ミノ酸配列を配列番号４中に提供し、これは３９６個のアミノ酸残基を含む。

【００３０】 本発明は、本明細書で述べるアミノ酸残基とほぼ複製的な配列も企図し、その
結果これらの配列は開示する配列のような生物学的活性を示す。このような企図
される配列には、アミノ酸残基の配列またはタイプ（たとえば保存的に置換され
ている配列）の最小限の変化によって特徴付けられる配列があり、本質的ではな
い変化によってポリペプチドの基本的性質および生物学的活性が変わることはな
い。

【００３１】 ペプチドの生物学的機能をほとんど変化させずに、ポリペプチドの構造を改変
および変化させることができることが、当分野でよく知られている。たとえば、
所与のポリペプチド中では、機能をほとんど損失させることなくある種のアミノ
酸を他のアミノ酸で置換することができる。このように変化させる際には、比較
的類似な側鎖置換体、たとえばそのサイズ、電荷、疎水性、親水性などをベース
に、アミノ酸残基のような置換体を作製することができる。

【００３２】 米国特許第４，５５４，１０１号中に詳細に記載され、参照によって本明細書
に組み込まれるように、以下の疎水値がアミノ酸に割り当てられている。Ａｒｇ
（＋３．０）；Ａｓｐ（＋３．０）；Ｇｌｕ（＋３．０）；Ｓｅｒ（＋０．３）
；Ａｓｎ（＋０．２）；Ｇｌｎ（＋０．２）；Ｇｌｙ（０）；Ｐｒｏ（−０．５
）；Ｔｈｒ（−０．４）；Ａｌａ（−０．５）；Ｈｉｓ（−０．５）；Ｃｙｓ（
−１．０）；Ｍｅｔ（−１．３）；Ｖａｌ（−１．５）；Ｌｅｕ（−１．８）；
Ｉｌｅ（−１．８）；Ｔｙｒ（−２．３）；Ｐｈｅ（−２．５）；およびＴｒｐ
（−３．４）。アミノ酸残基は、類似の疎水値（プラスマイナス２．０の値内で
）を有し生物学的に均等なポリペプチドを依然として有する他のアミノ酸残基で
置換することができることが理解される。

【００３３】 同様の方法で、親水性インデックスの類似性をベースに、置換体を作製するこ
とができる。その疎水性および電荷の性質をベースに、それぞれのアミノ酸残基
に親水性インデックスが割り当てられている。これらの親水性インデックス値は
以下の通りである。Ｉｌｅ（＋４．５）；Ｖａｌ（＋４．２）；Ｌｅｕ（＋３．
８）；Ｐｈｅ（＋２．８）；Ｃｙｓ（＋２．５）；Ｍｅｔ（＋１．９）；Ａｌａ
（＋１．８）；Ｇｌｙ（−０．４）；Ｔｈｒ（−０．７）；Ｓｅｒ（−０．８）
；Ｔｒｐ（−０．９）；Ｔｙｒ（−１．３）；Ｐｒｏ（−１．６）；Ｈｉｓ（−
３．２）；Ｇｌｕ（−３．５）；Ｇｌｎ（−３．５）；Ａｓｐ（−３．５）；Ｌ
ｙｓ（−３．９）；およびＡｒｇ（−４．５）。親水性インデックスをベースに
置換体を作製する際には、プラスまたはマイナス２．０以内の値が好ましい。

【００３４】 Ｖ．組換えベクター 本発明は、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクターを用いて遺伝
子工学的に処理した宿主細胞を含む組換えベクター、および組換え技法によるポ
リペプチドの生成にも関する。

【００３５】 本発明のポリヌクレオチドは、当分野でよく知られる組換え技法を使用してポ
リペプチドを生成させるために使用することができる。たとえばポリヌクレオチ
ドは、ポリペプチドを発現するためのさまざまな発現ベクターの任意の１つに含
まれていてよい。このようなベクターには染色体性、非染色体性および合成ＤＮ
Ａ配列、たとえばＳＶ４０の誘導体、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキ
ュロウイルス、酵母菌のプラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせ
に由来するベクター、バッシニア、アデノウイルス、フォウルポックスウイルス
、偽狂犬病などのウイルス性ＤＮＡおよびがある。遺伝的要素を得るための最も
一般的なベクターの１つは、よく知られているクローニングベクターｐＢＲ３２
２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｐｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍ
ａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａから受託番号３７０１７として入手可能であ
る）からのものである。ｐＢＲ３２２の「バックボーン」部分を適切なプロモー
ターと組み合わせて、その構造配列を発現させることができる。しかしながら、
宿主中で複製可能で生命力がある限りは他のベクターを使用することができる。

【００３６】 本発明のポリヌクレオチド配列を、前述の組換えベクターの１つに正または逆
方向に挿入することができる。当分野でよく知られるさまざまな手順を使用して
、これを達成することができる。一般には、適切な制限エンドヌクレアーゼの部
位にポリヌクレオチドを挿入する。

【００３７】 適切な発現ベクターに挿入すると、本発明のポリヌクレオチドはプロモーター
などの適切な発現調節配列に動作可能に結合して、ｍＲＮＡを直接合成する。本
明細書で使用するように、「動作可能に結合する」という語は、プロモーターと
第２の配列の間の機能的結合に関することを含み、このプロモーター配列が第２
の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始させ仲介する。一般に、動作可能に結
合するとは、連結しているヌクレオチド配列が隣接しており、同じリーヂングフ
レーム中でそこが２つのタンパク質コード領域を結びつけるのに必要であること
を意味する。ヘテロ構造の配列は、所望の性質（発現される組換え生成物が安定
であるか精製が簡単であることなど）を有する、Ｎ末端またはＣ末端が同定され
ているペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。

【００３８】 クロラムフェニコールトランスファーゼ（ＣＡＴ）ベクターまたは選択可能な
マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の望ましい遺伝子からプロモー
ター領域を選択することができる。このようなプロモーターは、３−ホスホグリ
セレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質などの糖酵素をコードしているオペロンに由来する可能性がある。使
用することができる細菌のプロモーターの例には、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、
Ｔ７、ｇｔｐ、ｌａｍｂｄａ Ｐ_Ｒ、Ｐ_Ｌがあるが、これらだけには限られない
。原核プロモーターの例には、レトロウイルスおよびマウスのメタロチオネイン
−Ｉからの、ＣＭＶイミディエートキナーゼ、ＨＳＶリミジンキナーゼ、アーリ
ーおよびレイトＳＶ４０、ＬＴＲがある。使用することができる他のプロモータ
ーの例には、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターがある。

【００３９】 典型的には組換え発現ベクターは、複製の起点を含みベクターのメンテナンス
を保証する。これらは１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子を含み、形質
転換した細胞の選択用に表現型形質を提供することが好ましい。使用することが
できる選択可能なマーカー遺伝子の例には、ジヒドロフォラレリダクターゼ、原
核細胞培養物に耐性があるネオマイシンまたはブラスティジン、大腸菌およびＳ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰＩ遺伝子に耐性があるテトラサイクリンまたは
アンピシリンがあるが、これらだけには限られない。発現ベクターは、翻訳開始
用のリボソーム結合部位および転写終結断片を含んでもよい。ベクターは、発現
を増幅させるための適切な配列を含んでもよい。

【００４０】 真核および原核宿主と共に使用するのに適切なクローニングおよび発現ベクタ
ーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他のＭｏｌｅｃｕｋａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）に記載されており、これは
参照によって本明細書に取り込まれている。数多くの適切なベクターおよびプロ
モーターが市販されており、本発明において使用することができる。使用するこ
とができるベクターの例には、細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑ
ｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐｋｒＨ８Ａ、ｐＮＨ４６
Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ＰＫＫ２２３−３、ＰＫＫ２３
３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＧＥＭ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）、原核：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐ）Ｇ４４、ｐＸＴ１、ｐ
ＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ６（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）
があるが、これらだけには限られない。

【００４１】 他の実施形態では、本発明は、前に記載した組換えベクターを含む宿主細胞に
関する。前に記載したポリヌクレオチドを含むベクター（クローニングまたは発
現ベクターなど）を使用して、適切な宿主を形質転換、形質導入またはトランス
フェクトすることができ、宿主にタンパク質を発現させることができる。本発明
において使用することができる適切な宿主には大腸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｒｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｒｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ、および一般のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ内のさまざまな種などの真核細胞があ
るが、これらだけには限られない。酵母菌などの低級の原核細胞、およびＤｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｔ９およびＳｔ２１など
の昆虫細胞。リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎまたはリポソーム仲
介型トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって、組換え構
築体の宿主細胞への導入を行うことができる（参照によって本明細書に取り込ま
れているＤａｖｉｓ、Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ、Ｍ．、Ｂａｒｒｅｙ、Ｌ．Ｂａｓｉ
ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）
を参照のこと）。

【００４２】 ホ乳類細胞培養系などのさまざまな高級な真核細胞を使用して、組換えタンパ
ク質を発現させることもできる。ホ乳類発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ Ｃｅ
ｌｌ、２３：１７５（１９８１）によって記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣＯ
Ｓ−７細胞株、および競合的なベクターを発現することができる他の細胞株、た
とえばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株がある。ホ乳類
の発現ベクターは、複製の起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、およ
びあらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー
および受容部位、転写終結配列、および５’側面の転写されていない配列を含む
はずである。ＳＶ４０スプライス、ポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を
使用して、必要とされる転写されていない遺伝的要素を提供することができる。

【００４３】 プロモーターを活性化させるため、形質転換体を選択するため、あるいは本発
明のヒトの接合接着タンパク質をコードする遺伝子を増幅させるために、適切に
改質した従来型の栄養培地中で、工学処理した宿主細胞を培養することができる
。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択した宿主細胞に関して以前に使用
した条件と同様であり、当分野でよく知られている技法を使用して、実験によっ
てこの条件を決定することができる。

【００４４】 エンハンサー配列をベクター中に挿入することによって、高級な真核生物によ
る本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの転写を増大させる
ことができる。エンハンサーはＤＮＡのシス活性化型要素であり、約１０〜約３
００の塩基対の長さであり、プロモーターに働きかけてその転写を増大させる。
本発明において使用することができる適切なエンハンサーの例には、複製起点の
塩基対１００〜２７０の後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスア
ーリープロモーターのエンハンサー、複製起点の後側のポリオマエンハンサー、
およびアデノウイルスのエンハンサーがある。

【００４５】 適切な宿主細胞の形質転換、および宿主菌株の適切な細胞群への生育に続き、
適切な手段（温度シフトまたは化学的誘導など）によって選択したプロモーター
を誘導し、さらなる時間それらの細胞を培養する。典型的には遠心分離によって
細胞を採取し、物理的または化学的手段によって破壊し、その結果生じる未精製
抽出物をさらなる精製のために保持する。凍結解凍サイクリング、超音波処理、
機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含めた任意の好都合な方法によって、タ
ンパク質の発現において使用される微生物の細胞を破壊することができる。これ
らの方法は、当業者にはよく知られている。

【００４６】 組換え細胞の培養物、細胞集合体から、またはそうでなければ当分野で知られ
ているタンパク質化学の方法に従って、本発明のポリペプチドを回収し精製する
ことができる。たとえば、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸性抽出物
、およびさまざまな形のクロマトグラフィ、たとえばアニオン／カチオン交換、
ホスホセルロース、疎水性相互作用、免疫親和性を含めた親和性クロマトグラフ
ィ、レクチンおよびヒドロキシルアパライトクロマトグラフィ。他の方法には透
析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電フォーカシングがあって
よい。成熟タンパク質の形状を完成させる際に、必要に応じてタンパク質を再び
折りたたむステップを使用することができる。最後に、最終的な精製ステップの
ために、正常または逆の系などで高性能液体クロマトグラフィ（以後は「ＨＰＬ
Ｃ」）を使用することができる。

【００４７】 ＢＩｇＲを使用して、相同的組換えによる内生遺伝子を不活性化させることが
でき、これによってＢＩｇＲ欠失細胞、組織または動物が作製される。次いでこ
のような細胞、組織または動物を使用して、正常ではＢＩｇＲに依存する特異的
なｉｎ ｖｉｖｏでのプロセスを定義することができる。

【００４８】 ｃＤＮＡ配列を使用して、ｐｅｎｉｎｅｎｔ位置で突然変異しているｗｔＢＩ
ｇＲまたはＢＩｇＲのいずれかを発現している安定性のある細胞株を作製するこ
とができ、分子のどの部分が機能を担っているのかを判定することができる。５
’または３’端にタグ、たとえばＶ５またはＨＡエピトープを有するＢＩｇＲを
用いて、安定性があるかまたは一過性の細胞株を作製して、ＢＩｇＲの機能／改
質／細胞相互作用を監視することができる。

【００４９】 ＢＩｇＲの細胞外配列を使用して、ヒトまたはマウスＩｇＧのＦｃ領域に融合
する組換えタンパク質を作製することができる。このタンパク質を使用して以下
のことができる。

【００５０】 ａ）ＢＩｇＲリガンドを検査すること。ＢＩｇＲが接着性タンパク質である場
合、白血球／好中球だけには限らないが、これらに関する相互作用が分析される
。簡潔に言えば、ＢＩｇＲ−Ｆｃ融合体をＥＬＩＳＡプレート上で捕らえること
ができる。炎症性サイトカインで刺激を与えた培養した細胞、コントロールはカ
ルシエン色素で標識し、固定されたＢＩｇＲ−Ｆｃと共にインキュベートし、洗
浄し蛍光性を監視することができる。代替的に、ＢＩｇＲを固形担体に結合させ
て、次いでこれを使用して、さまざまな細胞／組織に由来する固形タンパク質を
精製するためのカラムを作製することができる。次いでペプチドの配列決定を使
用して、リガンドを同定することができる。他の手法は、ＢＩｇＲ−Ｆｃを細胞
溶解物に結合させてＤＳＳと交差結合させるものであろう。

【００５１】 ｂ）ＢＩｇＲリガンドの同定の際に、ＢＩｇＲ−Ｆｃを使用して、小さな分子
に関するＢＩｇＲのヘテロ型またはホモ型相互作用の阻害物質を検査することが
できる。

【００５２】 ｃ）ＢＩｇＲ機能、ヘテロ型またはホモ型相互作用を中和するためのツール。

【００５３】 ｄ）ＢＩｇＲがヘテロ型／ホモ型相互作用を示す場合、融合体を使用してＢＩ
ｇＲまたはそのリガンドのいずれかに結合させて、細胞の応答を開始させること
ができる。

【００５４】 細胞外領域に由来する組換えタンパク質は同型の相互作用を分析するために使
用することができる。そのようなタンパク質はＦｃ Ｔａｇを保有しないであろ
う。単一の免疫グロブリン類似領域が、どれが同型の相互作用に対応しているか
を判定するようにされ得る。別々の領域のお互いの、または３つすべてのＩｇ類
似領域を保有する組換え型との相互作用は様々な手段で評価することができる。
その例はＤＳＳとの架橋、分析学的超遠心分離あるいはサイズ分けカラムである
。

【００５５】 ＢＩｇＲ配列は、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを細胞系でのＢＩｇＲ機
能の阻害に関して識別するために使用することができる。さらに、ポリメラーゼ
連鎖反応によってこの族の追加的な構成要素を識別するのを補助するために変性
オリゴヌクレオチドを設計することができる。別の選択肢では、ｃＤＮＡライブ
ラリーの低緊縮ハイブリッド形成が緊密に関連する配列を識別するためにＢＩｇ
Ｒで実施される。

【００５６】 ＢＩｇＲの細胞内領域はイーストのツーハイブリッド系で新たな相互作用相手
を「釣り上げる」のに使用することができる。

【００５７】 加えて、組換え型の精製したＢＩｇＲおよび組換えＢＩｇＲを発現する細胞系
はＢＩｇＲの低分子阻害物質を選別するのに使用することができる。

【００５８】 胎盤での低い発現は別として、ＢＩｇＲは独占的に脳に局在する。ＢＩｇＲは
グリア細胞、神経細胞または内皮細胞に局在する可能性がある。もしも脳の内皮
細胞で発現されるならば、それは血液脳関門に役割りを果たす可能性がある。Ｂ
ＩｇＲが接着タンパク質であるならば、限定はされないが、神経可塑性、成長円
錐誘導および神経突起の外部成長に役割りを果たしているかもしれない。それは
もしかすると脳卒中および多発性硬化症に含まれるかもしれない。

【００５９】 ＶＩ．抗体 本発明のポリペプチド、その断片、または前記ポリペプチドを発現する細胞は
抗体を産生するための免疫原として使用することができる。これらの抗体は、例
えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。本発明はまた
、キメラ、一本鎖、および人体適合性の抗体、ならびにＦａｂ断片、またはＦａ
ｂ発現ライブラリーの産生物質をも含む。

【００６０】 本発明のポリペプチドに対して生成する抗体は、好ましくはヒト以外の動物に
このポリペプチドを投与することによって得られる。本発明のポリペプチドのほ
んの断片をコードする配列でさえ、自然界の完全なポリペプチドに結合する抗体
を生成させるのに使用することができる。その後、そのような抗体はそのポリペ
プチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用することができる
。

【００６１】 モノクローナル抗体の調製については、連続的な細胞系培養により生成される
抗体を供給するすべての技術が使用可能である。その例には、（ここで参考資料
として取り入れたＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２５６：４９５−４９７により述べられた）ハイブリドーマ技術、トリ
オーマ技術、（ここで参考資料として取り入れたＫｏｚｂｏｒら、１９８３，Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２により述べられた）ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ技術、および（ここで参考資料として取り入れたＣｏｌｅら、１９８
５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ７７−９６により述べ
られた）ヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術が
含まれる。

【００６２】 ポリクローナル抗体の調製については、当該技術で知られているそのような抗
体を供給するすべての技術が使用可能である。

【００６３】 ここでは参考資料として取り入れた米国特許第４，９４６，７７８号に述べら
れたような、一本鎖の抗体を生成するための技術は本発明の免疫原ポリペプチド
に対する一本鎖の抗体を生成するのに適している。

【００６４】 さらに別の実施形態では、本発明は内因性のヒトまたはマウスの接着タンパク
質を発現するヒトまたはマウス細胞を識別する方法に関する。この方法は、ここ
で述べたヒトまたはマウスの接着タンパク質と同じ機能を有するタンパク質を発
現する細胞を識別し、その後、当該技術で知られている技術を使用して前記タン
パク質を産生するのに必要不可欠な細胞を特性付ける方法を含む。ここに述べた
技術に従って準備される抗体はＢＩｇＲを選別するため、および内因性のＢＩｇ
Ｒを発現する被検体（ヒトまたは動物）の細胞（疾病または正常）を識別するた
めに使用することができる。

【００６５】 本発明の抗体は以下のために使用することができる。

【００６６】 ａ）被検体（ヒトまたは動物）の細胞（疾病または正常）内で内因性ＢＩｇＲ
の細胞内局在／発現を試験すること。

【００６７】 ｂ）細胞から内因性ＢＩｇＲを、または感染細胞から組換えＢＩｇＲを免疫沈
降させてグリコシル化、リン酸化などによって化学修飾されるかどうかを判定す
ること。この方式でＢＩｇＲを付随するタンパク質の共同沈降もまた識別可能。

【００６８】 ｃ）異型ないし同型の相互作用のいずれかでＢＩｇＲ機能を中和するツールと
して。ＢＩｇＲ機能を乱すためにｉｎ ｖｉｖｏで抗ＢＩｇＲ抗体を様々な動物
モデルに投与してもよい。別の選択肢では、概念立証の実験をｉｎ ｖｉｔｒｏ
で実施することもできる。

【００６９】 ｄ）ＢＩｇＲ分子の機能性エピトープをマップ化する。

【００７０】 限定されるものではないが、例を挙げるために本発明の実施例をここで示す。

【００７１】 実施例Ｉ：ヒトＢＩｇＲ ｃＤＮＡのクローニングおよびＢＩｇＲ遺伝子のマ
ップ化 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示したポリヌクレオ
チド配列は電気的および一般的な技術の組み合わせを使用してクローニングした
。使用した電気的技術はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のホームページｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを介してアクセスしたＥｘｐｒｅｓｓｅｄ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ（ＥＳＴ）データベースを含むものであった。ここで
は参考資料として取り入れたＭａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｌａ Ｉ、Ｌｏｓｔａｇｌ
ｉｏ Ｓ、Ｓｃｈｎｅｅｍａｎｎ Ｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｌ、Ｒｏｍａｎｏ
Ｍ、Ｆｒｕｓｃｅｌｌａ Ｐ、Ｐａｎｚｅｒｉ Ｃ、Ｓｔｏｐｐａｃｃｉａｒｏ
Ａ、Ｒｕｃｏ Ｌ、Ｖｉｌｌａ Ａ、Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｄ、Ｄｅｊａｎａ Ｅ
、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）１４２（Ｉ）：１１７−２７により発
表された正常マウスのＪｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ（ＪＡＭ）のｃＤＮＡ配列を電気的なクローニングのための鋳型として使用し
た。マウスのＪＡＭ ｃＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ（アクセス番号Ｕ８９９１
５）でも入手可能である。進歩型のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎ
ｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ２．０）を使用してマウスＪＡＭとの
相同性を示すＥＳＴを識別した。

【００７２】 電気的クローニング タンパク質の質問の配列を全リーディングフレームで動的に翻訳されたヌクレ
オチド配列と比較する（ｂｌａｓｔ）プログラムを使用して、マウスＪＡＭペプ
チドの完全な配列（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ８９９１５）をヒトＥＳＴ配列との相同性
について調べた。完全なマウスＪＡＭタンパク質配列は長さで３００アミノ酸で
ある。開始コドンは塩基対（以降は“ｂｐ”とする）７１で始まりストップコド
ンは９７１である（図１Ａ参照）。

【００７３】 ＥＳＴ Ｒ８８２５２内でコードされるいくらかの１１６アミノ酸はマウスＪ
ＡＭの１２９アミノ酸のストレッチと３８％の類似性および２８％の同一性を示
した（図１Ａ参照）。その後のＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベー
スの調査から、このＥＳＴが他の知られている接着タンパク質との類似性を示す
ことが明らかになった。このこと、および免疫グロブリン類似の折れ曲がりの形
成に重要なシステインの保存に基づいて、さらにＥＳＴ Ｒ８８２５２をさらに
分析した。仮想の配列を組み立てる間を通じて、仮想のタンパク質の開始および
終結の推定されるコドンを識別するためにすべてのリーディングフレームについ
て翻訳を連続的にモニタした。使用可能な場所で、配列エラーを確認するために
オーバーラップするＥＳＴを調べた。

【００７４】 ｂｌａｓｔプログラムを使用して、Ｒ８８２５２の５’の１５０ｂｐをｎｒヒ
トｄｂＥＳＴ（ａ ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｓｕｂ−ｃａｔｅｇｏｒｙ
ｏｆ ｔｈｅ ＥＳＴ ｄａｔａｂａｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｎｌｙ
ｈｕｍａｎ ＥＳＴｓ）を介してブラスト処理した。ＥＳＴ Ｔ０８９４９は１
０９ｂｐにわたってオーバーラップして１００％の同一性を示し、大部分の付加
的５’配列を与えた（図１Ｂ）。ｎｒヒトＥＳＴデータベースを介したＴ０８９
４９のｂｌａｓｔ分析は５’末端の付加的塩基を単離することでは不成功であっ
た。したがって、推定される開始コドンはこの方法でこのタンパク質については
識別できなかった。

【００７５】 Ｒ８８２５２の最後の１２０ｂｐはｂｌａｓｔプログラムを使用してｎｒヒト
ＥＳＴを介してブラスト処理した。ＨＩ４７２０は２２９ｂｐにわたって９７％
の同一性を示し、３’末端の１４７の付加的塩基を与えた（図１Ｂ参照）。

【００７６】 ＨＩ４７２０の３’の１０６ｂｐはｂｌａｓｔプログラムを使用してｎｒヒト
ＥＳＴを介してブラスト処理した。ＥＳＴ Ｒ１５３３８は１７０ｂｐにわたっ
て９５％の同一性を示し、３６７ｂｐで新たな配列を伸長した（図１Ｂ参照）。
この配列内に推定されるストップコドンが識別された。したがって、データベー
スのさらなる調査を終結した。

【００７７】 一般的なクローニング このｃＤＮＡについてさらに５’配列を得るために、ＲＡＣＥ技術を実施した
。ヒト胎児脳のｍＲＮＡを４２℃にてＡＭＶリバーストランスクリプターゼ（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で逆転写した。Ｍａｒａｔｈｏｎ
ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および２つのアンチセンスプライマ
ー（下記参照）のうちのいずれかを使用して増幅反応を実施した。以下のプログ
ラムを使用した、すなわち、９４℃、３０秒間で１サイクル、９４℃、５秒間お
よび７２℃、４分間を５サイクル、９４℃、５秒間および７０℃、４分間を５サ
イクル、９４℃、５秒間および６８℃、４分間を２５サイクルである。反応産物
はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連
結し、ＡＢＩ配列分析器（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ，ＴＸ）を使用して配列分析した
。

【００７８】 最初のＲＡＣＥ反応に使用したプライマーは部位１７６ｂｐでＥＳＴ Ｔ０８
９４９（５’−ＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＴＴＡＧＧＧＴＧＧＣＴＧ
−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）に向けられた。この反応の反応産物はＢＩ
ｇＲの付加的な２７２ｂｐを単離することを可能にした（図１Ｃ参照）。２番目
のＲＡＣＥ反応に使用したプライマーは部位８６ｂｐでＥＳＴ Ｔ０８９４９（
５’−ＧＣＧＣＡＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＴＣ−３’）（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）に向けられた。最も長い生成物はＴ０８９４９ｂｐの５
’末端から２３２ｂｐの延長を与えた（図１Ｃ参照）。

【００７９】 最も興味深いことに、各々のＲＡＣＥ反応から配列を整列させるとＴ０８９４
９の５’末端の上流のいくらかの２０４ヌクレオチドで配列は発散した（図３参
照）。いずれの生成物も開始のＡＴＧと上流ストップコドンとの推定の一致をも
たなかった。

【００８０】 この結果と一致して、さらなるデータベース調査は、ｃＤＮＡ（アクセス番号
ＡＦ０６２７３３）を含む最新のＧｅｎＢａｎｋの公開（１９９９年３月４日）
の配列を整列させるとＲＡＣＥ反応の生成物が全オープンリーディングフレーム
クローンから４１アミノ酸短くなることが示された（図２参照）。さらに、ＲＡ
ＣＥ反応２から得られた配列の比較から３４アミノ酸を消失したＡＦ０６２７３
３のスプライス変異体が単離された。

【００８１】 フルレングスＢＩｇＲの形成 フルレングスのヒトＢＩｇＲを形成するために、アクセス番号ＡＦ０６２７３
３の５’非翻訳領域に向けたセンスオリゴヌクレオチドを、ＡＴＧの上流のいく
つかの４５ｂｐで設計した。このオリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＡＧＧＣＴＣ
ＧＣＣＡＧＣＧＣＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）をＴＡＧストップ
コドンを組み入れたアンチセンスプライマー５’−ＣＴＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＴ
ＴＣＣＴＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）と結合させた
。ヒト胎児脳のｍＲＮＡを逆転写し、以下のプログラムを使用して増幅した、す
なわち、９５℃で７分間を１サイクル、９５℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２
℃で２０秒を３５サイクル、７２℃で５分間を１サイクルである。生成物はＥ．
ｃｏｌｉベクターに連結し、ＡＢＩ配列分析器（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ，ＴＸ）を
使用して配列分析した。

【００８２】 配列の特徴 ポリメラーゼ連鎖反応により、ＢＩｇＲの２つの異なる完全長アイソフォーム
を同定することが可能になった。ＲＡＣＥ反応に従い、クローンを、シグナル配
列の直後にある追加の３４個のアミノ酸およびこれらの残基がスプライシングさ
れているクローンと共に単離した。図３には、３９８個のアミノ酸を有するより
短いスプライス変異体の完全コード領域が表示されている。その下に、３４アミ
ノ酸（配列番号：１１）インサートに対応する配列が示されている。配列決定に
よって、これらの残基がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６２７３３の配列と同一
であることが証明された。ＢＩｇＲは、推定シグナル配列（下線箇所）、３つの
免疫グロブリン様フォールド、単一の膜貫通ドメイン（下線箇所）、および短い
細胞内ドメインを特徴とする（図３参照）。したがって、タンパク質は免疫グロ
ブリン科に属する。各免疫グロブリン様ドメイン内にジスルフィド結合を形成す
ることが予測されるシステイン残基は強調表示されている。第１および第２のシ
ステインは第１の免疫グロブリン様フォールドに、第３および第４のシステイン
は第２の免疫グロブリン様フォールドに、第５および第６のシステインは第３の
免疫グロブリン様フォールドに、それぞれ位置付けられている。アミノ酸２５お
よび３５３にある２つのコンセンサスＮ結合型糖鎖形成部位（ＮｘＳ／Ｔ）が強
調表示されている（最初のものが、予測されるシグナル配列内に含まれるが）。

【００８３】 ＢＩｇＲポリペプチドとＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６２７３３の相違 配列番号：２で示されるＢＩｇＲポリペプチドは、２箇所がＡＦ０６２７３３
とは異なっている。第１に、本発明のポリペプチドは、欠失する３４個のアミノ
酸を有するので、より小さいアイソフォームである（図２、図３参照）。第２に
、３４個のアミノ酸が保たれているかまたはスプライシングされるかに関係なく
、配列番号：２の位置１０４で単一のグルタミン酸欠失が生じる。したがって、
配列番号：２はアミノ酸１００からＡＬＡＤ＿ＥＧＥＹを読み取り、ＡＦ０６２
７３３は、これと同じ領域でＡＬＡＤＥＥＧＥＹを読み取る。

【００８４】 ＢＩｇＲ細胞外および細胞内ドメインに相同的なタンパク質 ＢＩｇＲは接合性接着分子族のメンバではない。それにもかかわらず、ブラス
ト分析によれば、その様々な免疫グロブリン様ドメインが、他の新規な推定され
る接着分子に対して類似性を示すことが実証される。

【００８５】 最も興味深いことは、ＢＩｇＲの細胞内ドメインが、グリコホリンＣ、すなわ
ちタンパク質４．１を赤血球に固定するのに必要とされるタンパク質に対し、６
６％の類似性および５３％の同一性を示すことである。さらに、ショウジョウバ
エ４．１タンパク質、コラクルを、セプテートジャクションに局在化させるのに
必要とされるこのＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ（ショウジョウバエ属）膜貫通タンパ
ク質Ｎｅｕｒｅｘｉｎ ＩＶとの相同性も、表示されている（図４参照）。

【００８６】 染色体のマッピング ＢＩｇＲ ｃＤＮＡと同一な染色体配列のセグメントを、公用非冗長データベ
ースから検索した。結果は、いくつかのエキソン境界の端部で分離された塩基の
二重指定のため、若干手を加える必要があった。正しい指定は、５’および３’
スプライス部位コンセンサス配列に基づいていた。公用データベースを使用して
、ＢＩｇＲに関する１０個のエキソンが確認された。エキソン／イントロン構造
は、ヒト染色体ｌｑ２１．２−２２から得られた受託番号ＡＬ０３５４０３から
決定しされた。全てのイントロン／エキソン境界は、ＧＴ／ＡＧ規則に従う。Ｂ
ＩｇＲ遺伝子の構造は、スプライシング中のエキソン２の除外によって本明細書
で述べる３４アミノ酸欠失が生じることを示すことが、最も適切である。

【００８７】

【表１】

【００８８】 実施例ＩＩ：マウスＢＩｇＲのクローニング データベースの探索（実施例Ｉ参照）では、任意のマウスＥＳＴコード化ＧＩ
ｇＲが同定されない。実施例Ｉで述べたプライマーを使用して完全長ヒトＢＩｇ
Ｒをクローニングし、マウス脳ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からの産物を増幅
した。３つの独立したＰＣＲ反応の配列決定により、細胞外ドメインに３４アミ
ノ酸欠失を有するアイソフォーム（図５参照）が分離されたことが示された。図
６は、アミノ酸レベルでマウス配列とヒト配列が９５％の同一性および９６％の
類似性を表すことを示している。顕著な相違は、シグナル配列のセリンおよびロ
イシンの欠失である。さらに、マウスＢＩｇＲは、細胞外ドメインのＡＬＡＤ＿
ＥＧＥＹ配列中に追加のグルタミン酸残基を持っていない。

【００８９】 実施例ＩＩＩ：ＢＩｇＲの発現パターン ＢＩｇＲの組織発現に関し、細胞外ドメインから得られた［α−^３２Ｐ］ｄＣ
ＴＰ標識プローブを用いて、標準化されたヒトマルチプルノーザンブロット（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ）上で試験を行った。その結果は、ＢＩｇＲが、約２．６および
３．８ｋｂの２つの転写物として発現することを示している（図７参照）。ブロ
ットは高ストリンジェンシーで精査され、したがってこれら２つの種は、代替と
してスプライシングされた産物に相当すると考えられる。図７は、ヒトＢＩｇＲ
が脳内に豊富に発現し、胎盤には極めて低いレベルで発現することを示している
。これは、この後者の組織において、ＰＣＲを使用することにより独立に確認さ
れた（以下の表２参照）。ＢＩｇＲをさらに局在化させるため、脳の様々な領域
での発現（図８参照）について試験を行った。発現は全体にわたって認められる
が、明らかに、小脳はこの遺伝子を他の領域よりも高いレベルで発現する。小脳
では、約６．５ｋｂの追加の少量の転写物が明らかに識別できる。ｍＲＮＡは、
髄質および脊髄では辛うじて検出可能である。全ての場合において、３．８ｋｂ
の転写物は、２．６ｋｂの種よりも高いレベルで発現する。

【００９０】 ＥＳＴデータベースにより、ＢＩｇＲは、乳児および成人の脳で発現する脳特
異転写物であることが確認される（以下の表２参照）。全てのＥＳＴ配列データ
は脳ｃＤＮＡライブラリーから得られた。

【００９１】

【表２】

【００９２】 実施例ＩＶ：昆虫細胞の細胞外ドメインの発現およびポリクローナル抗体の生
成 完全長クローンからヒトＢＩｇＲの細胞外ドメインが増幅されるように、オリ
ゴヌクレオチドを設計した。ＥｃｏＲＶおよびＫｐｎｌ制限部位（下線部位）を
それぞれ有するセンス５’−ＣＣＧＧＡＴＡＴＣＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＣＣＣ
Ａ−３’（配列番号：９）およびアンチセンス５’−ＧＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧ
ＧＴＡＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡ−３’（配列番号：１０）オリゴヌクレオチド
を使用することにより、マウスＩｇＧ−２ａの定常領域を含むＳａｃｌ／Ｋｐｎ
ｌ制限ｐＦａｓｔＢａｃｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）ベクターへのサブクローニングが
可能になった（Ｆｃ；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＳＡ、Ｔｒａｎ ＴＭ、Ａｒｒａ
ｔｅ ＭＰ、Ｂｒｏｃｋ ＴＡ、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４
：１８４２１〜７）。このベクターは、ポリヘドリンプロモーターからのタンパ
ク質の発現を推進する。

【００９３】 分泌された組換えＢＩｇＲ−Ｆｃを、Ｈｉ−Ｔｒａｐタンパク質Ａカラムを使
用して、感染Ｓｆ２１細胞の培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から精製した。Ｆｃ融合は、ト
ロンビン消化により除去された。メスのニュージーランド白ウサギ（生後１２週
間、Ｍｙｒｔｌｅ’ｓ Ｒａｂｂｉｔｒｙ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ
、ＴＮ）に対し、同体積のフロインドアジュバントで乳化した５００μｇのＢＩ
ｇＲを用いて免疫化を行った。それから６週間経過した後、この動物に対し、さ
らに、不完全フロインドアジュバンドで乳化した５００μｇのＢＩｇＲを用いて
追加の免疫化を行った。この追加免疫化の１４日後に、血清を収集した。

【００９４】 抗体の特異性を試験するため、ＢＩｇＲ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ６ベクターに
サブクローニングし、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＣｏｓ細胞に１
０μｇをトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、プロテアーゼ
インヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｉｏｗａ、
ＣＡ）を含めて、細胞をトリス緩衝液（ｐＨ７．５）／１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００中に分解した。図９は、ＢＩｇＲポリクローナル血清が、トランスフェク
トされたＣｏｓ細胞中に４６ｋＤａのタンパク質種を検出することを示す。抗体
は、模擬トランスフェクトされたＣｏｓ細胞と交差反応しない。 実施例Ｖ：哺乳動物細胞中の完全長クローンの発現および細胞下での局在化 ｐｃＤＮＡ６ベクターのＢＩｇＲの完全長クローンのＣ末端を、ＰＣＲ突然変
異誘発によって修飾し、追加の検出目的でＶ５エピトープタグを組み込んだ。数
１０μｇのｐｃＤＮＡ６−ＢＩｇＲを、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用し
てＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を
分割し、クローン選択のため１０μｌ／ｍｌブラストサイジン中に維持した。

【００９５】 対照またはＢＩｇＲを発現したＣＨＯ−Ｋ１をガラススライド上で成長させて
合流させ、これを、１％パラホルムアルデヒドで定着させ、１：１０倍希釈の免
疫前血清または抗ＢＩｇＲウサギポリクローナル血清で染色した。１：１００倍
のＧＡＲ−ＦＩＴＩを二次的に使用した。ＦＩＴＣ検出のため、アルゴンレーザ
および適切な光学系およびフィルタモジュールを備えたＮｏｒａｎ ＴＭ共焦点
レーザ顕微鏡（Ｎｏｒａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、Ｗ
Ｉ）を使用して、蛍光が観察された。デジタル画像が、光倍率４００倍で得られ
た。図１０は、ＢＩｇＲがＣＨＯ細胞の原形質膜に分布されるほか、細胞−細胞
接触の部位に分割されることを示す。この局在化パターンは、同型相互作用によ
りＢＩｇＲが動作することを裏付ける証拠を提供する。前に述べたように、細胞
間分布がＪＡＭ族の特徴であり、したがって、この特徴が維持される。

【００９６】 実施例ＶＩ：ＢｉｇＲ−Ｆｃの白血球細胞株への接着 参照により本明細書に組み込まれるＴｏｄｄｅｒｕｄ，Ｇ．、Ｊ．Ｌｅｕｋｏ
ｃ．Ｂｉｏｌ．、５２：８５（１９９２）９６に本質的に記載されているウェル
プレートで、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ接着アッセイを行った。簡単に言うと、５０μｌ
のヤギ抗マウスＩｇＧ２ａをＰＢＳ中５μｇ／ｍｌで被覆し、これを使用して４
．８ｐｍｏｌのＢＩｇＲ−ＦｃまたはｍＩｇＧ２ａ（対照）を取り込んだ。様々
な白血球細胞株、すなわちＴリンパ球、ＨＳＢ、ＴＫ−１；Ｂリンパ球、ＲＡＭ
ＯＳ；単球細胞、ＨＬ６０および赤白血病、Ｋ５６２株を、５０μｇ／ｍｌのカ
ルセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｉｃ、Ｏ
Ｒ）で２５分間、３７℃で標識したが、このとき２５０、０００細胞／ウェルで
あり、これを結合緩衝液、すなわちトリス緩衝生理食塩水に１ｍＭ ＭｎＣｌ_２ を添加したものと添加しないものに入れて行った。ウェルを、３回洗浄し分解し
たがこのとき５０ｍＭトリス（ｐＨ７．７）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ４
０を用い、蛍光による読取りを、励起が４８５／２０ｎｍ、放射が５３０／２５
ｎｍのＣｙｔｏｆｌｕｏｒで行った。特定の結合を、ＢＩｇＲ−Ｆｃによる蛍光
からｍｇＧ２ａによる蛍光を差し引いたものとして計算した。

【００９７】 図１１は、ＢＩｇＲ−ＥｃがＲＡＭＯＳ Ｂリンパ球細胞株を取り込むことが
できるが、試験をしたＴリンパ球、単球、または赤白血病細胞を取り込まないこ
とを示す。ＢＩｇＲとこれらの細胞との相互作用は、緩衝液へのマンガンの添加
に左右された。これらの結果は、ＢＩｇＲが接着タンパク質であり、インテグリ
ン反レセプターに係り合うことで動作可能であるという仮説を支持している。

【００９８】 ＢＩｇＲは、細胞内および細胞外の両方の領域で、機能既知のタンパク質と同
様の役割を果たす。しかしながらＢＩｇＲは、その長さ全体にわたり、染色体１
１ｑ２３．２上に局在する機能未知であって広く発現される推定接着タンパク質
であるＩｇＳＦ４（参照番号ＮＰ＿０５５１４８）に最も近接して配置されてい
る（Ｇｏｍｙｏ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６２：１３９−１４６、１
９９９）。このファミリーの別のものは、参照番号ＡＡＣ３２７４０の染色体１
９ｑ１３．２上で確認された仮定の遺伝子であると考えられる。ＩＧＳＦ４とＡ
ＡＣ３２７４０についての同一性パーセントはそれぞれ３８．５％および３５％
である。そこでこれら３種類のタンパク質は、新たなファミリーを形成するもの
と考えられる。

【００９９】 ＢＩｇＲの機能は、それが細胞間膜に分配する能力とともに、それの脳特異的
発現および機能既知の他のタンパク質とのそれの相同性から推定することができ
る（図４、７、８、１０参照）。ＢＩｇＲは、第１のＩｇ層におけるβ−シート
Ｆから膜横断領域まで、ポリオウイルスウィルス（ＰＶＲ）と４５％の類似性を
示す。ＰＶＲの細胞機能は不明である。しかしながら、ポリオウィルスに対する
結合部位は、Ｉｇ−層１ＮａＩに含まれているように思われ、ＢＩｇＲがその結
合能力を共有する可能性は低い。ＰＶＲファミリーの他のものには、別名ネクチ
ン−１、ネクチン−２およびネクチン−３として知られるポリオウィルス関連受
容体（ＰＲＲ）がある。ネクチン−１およびネクチン−２は、α−ヘルペスウイ
ルス侵入介在物質として働く。ネクチンファミリーは、カルシウム非依存性ホモ
フィリック（ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃ）接着分子である。それは、トランスホモ相
互作用（ｔｒａｎｓ−ｈｏｍｏｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）およびトランスヘテロ
相互作用（ｔｒａｎｓ−ｈｅｔｅｒｏｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）以外に、シス−
ホモ二量化を示す。ネクチン−２の場合、Ｉｇ層１は、細胞間でのネクチン−２
の接着には必須であるが、シスホモ二量化には必須ではない。ネクチン−１およ
びネクチン−２は、２３７および２３１のアミノ酸重複において、ＢＩｇＲと４
３％および４１％の類似性を示す。この領域は、主としてＩｇ層２および３に相
当する。ネクチン−３は、３種類のＩｇ層全てを含む２８０アミノ酸重複におい
て４３％の類似性を示す。非常に興味深い点として、ネクチンファミリーは、接
着接合部に局在している。そこで本発明者らは、ＢＩｇＲが、特にＣＨＯ細胞に
おけるＢＩｇＲの細胞発現によって明らかなようにトランスで、同型相互作用を
行うことができると考えている。さらに本発明者らは、ＢＩｇＲにおける非常に
関連の深い相同体間または他の接着細胞表面タンパク質間での異型相互作用が起
こったものと考えている（図１１参照）。ＢＩｇＲは、ウィルス侵入のための受
容体としても働く場合がある。脳においては、ＩｇＧ細胞接着分子は、成長円錘
誘導、神経突起伸長およびシナプス発生において役割を果たし、ＩｇＲはこれら
のいずれのプロセスにも関与し得る。

【０１００】 実施例１で考察したように、ＢＩｇＲの短い細胞内領域は、グリコホリンＣ、
ショウジョウバエニューレキシンＩＶおよびＣａｓｐｒ２と高い相同性を共有す
る。相同性は、新規な推定接着タンパク質ＩｇＳＦ４間で最も高い（下記の表３
参照）。これらのタンパク質はいずれも、タンパク質４．１ファミリーのものに
おける膜近接結合部位を保存しており、いずれも最も端のＣ末端にＰＤＺ結合単
位を有する（Ｃｓｐｒを除く）。脳におけるｃａｓｐｒとタンパク質４．１の間
の直接相互作用が示されている。類推すると、ＢＩｇＲ細胞内領域とタンパク質
４．１の間の複合体が予測される。最も最近では、タンパク質４．１ファミリー
の新規なものの脳特異的発現が示されている。脳における帯域４．１が、小脳に
おけるシナプス前終末での膜骨格成分として、シナプスの形成および維持に関与
することが示唆されている。ＢＩｇＲはそのような複合体の成分である可能性が
あることが理解できる。さらに、脳４．１を持たないマウスは、運動、協調、均
衡および学習において欠陥を有する。従ってＢＩｇＲは、これらの経路を侵害す
る可能性がある。

【０１０１】 帯域４．１は、ＦＥＲＭ領域を有するタンパク質の成長するスーパーファミリ
ー（ＮＦ２／ＥＲＭ／４．１）に属する。その領域の保存特性は、１個の膜横断
部分を有するタンパク質のＣ末端細胞質尾部の膜近位領域へ結合する能力である
。それは、細胞表面膜横断タンパク質を細胞骨格分子に連結する機能を有する。
ＢＩｇＲは、これらのスーパーファミリーのものに連結することができる。

【０１０２】

【表３】

【０１０３】 ＰＤＺ領域を有するタンパク質は、主として細胞膜に局在しており、細胞−細
胞接触の特殊部位に集合する。ＰＤＺ領域は、膜関連グアニル酸キナーゼ（ＭＡ
ＧＵＫ）ファミリー、いくつかのタンパク質ホスファターゼおよびキナーゼ、ニ
ューロン一酸化窒素シンターゼおよびいくつかのジストロフィン関連タンパク質
など、多様な膜関連タンパク質において認められる。ＢＩｇＲは、これらカテゴ
リーのタンパク質のＰＤＺ領域と相互作用することができる。

【０１０４】 ＭＡＧＵＫタンパク質ファミリーのものは、複数の領域を用いてシナプスおよ
び細胞接合部でイオンチャンネル、受容体、接着分子および細胞質ゾルシグナル
伝達タンパク質を密集させる。それらは、シナプス前細胞膜およびシナプス後細
胞膜の両方で基本的調整の役割を果たす。従って、シナプス前末端からの信号の
有効な伝達において、ＢＩｇＲが、直接または間接にこれらの構造および機能に
局在する可能性がある。ＢＩｇＲにおけるＰＤＺ領域相互作用を裏付けるものと
して、ニューレキシンＩＶとディスクス・ロスト（ＤＬＴ）との確認されている
相互作用があり、それの突然変異によってニューレキシンＩＶの異常局在および
上皮細胞極性の同時喪失を生じる。別の例としては、タンパク質４．１との三元
複合体におけるグリコフォリンＣのｐ５５との相互作用がある。

【０１０５】 ニューレキシンは、シナプス前部位で認められ、ニューロン間の相互作用に介
在するが、Ｃａｓｐｒ２は有鞘神経の節近位近接（ｊｕｘｔａｐａｒａｎｏｄａ
ｌ）領域に局在し、ニューロン−グリア相互作用に介在すると考えられる。従っ
て、ＢＩｇＲがこれらの部位に動員され、軸索−グリア細胞間接合に関与してい
る可能性が非常に高い。やはり、ＣＨＯ細胞で発現される際のＢＩｇＲの細胞間
局在が、その可能性を裏付けている。軸索−グリア接合が、節領域および節近位
領域の軸索鞘タンパク質領域の確立および維持において機能することが提案され
ている。実際、Ｃａｓｐｒ２が、この領域におけるＫ^＋チャンネル、すなわちそ
れに依存する相互作用と、Ｃ末端ＰＤＺ結合領域単位を連結させることが認めら
れている。ＢＩｇＲがチャンネルクラスター化において同様の役割を果たすもの
と仮定することができる。

【０１０６】 最後に、ＢＩｇＲが内皮細胞で転写されることが認められたとしたら、本発明
者らは、それが隔膜接合部におけるショウジョウバエニューレキシンＩＶの機能
と同様の、血液−脳関門の維持において何らかの役割を果たす可能性があると考
える。それはまた、卒中および多発性硬化症の際に生じるものなどの脳における
炎症反応に関与している可能性がある。

【０１０７】 以上の説明および実施例によって、本発明を説明した。前述の記載を考慮すれ
ば、当業者には多くの別形態が明らかになることから、上記説明は説明のための
ものであって、本発明を限定するものではない。添付の特許請求の範囲および精
神の範囲内にあるそのような別形態はいずれも、本発明に包含されるものである
。

【０１０８】 添付の特許請求の範囲で定義の本発明の概念および範囲から逸脱しない限りに
おいて、本明細書に記載の本発明の方法の組成、操作および配置に対して変更を
行うことが可能である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおける国立バイオテ
クノロジー情報センターのホームページからアクセスできるデータベースから得
られる相同的発現配列タグ（以降、「ＥＳＴ」として示される）と、ネズミの接
合接着タンパク質（以降、「マウスＪＡＭ」として示される）のオープンリーデ
ィングフレームとのアラインメントを示す図である。同一性がアミノ酸レベルで
示されている。図１Ｂは、停止コドンを含む、ヒト脳免疫グロブリンスーパーフ
ァミリー受容体（以降、「ヒトＢＩｇＲ」として示される）の様々な部分をコー
ドする重複するＥＳＴのアラインメントを示す図である。図１Ｃは、ヒトＢＩｇ
Ｒの全長オープンリーディングフレームを得るために用いられたｃＤＮＡ末端の
迅速増幅（以降、「ＲＡＣＥ」として示される）法を要約する。それぞれの反応
から同定された最長クローンがアラインメントされている図である。

【図２】 ＲＡＣＥ反応物１および２から得られた配列のＧｅｎＢａｎｋアクセション番
号ＡＦ０６２７３３とのアラインメントを示す図である。単離されたＲＡＣＥ反
応物２は、ＡＦ０６２７３３と比較して、３４アミノ酸の欠失を有するクローン
である。

【図３】 ヒトＢＩｇＲの全長のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。予測
されるシグナル配列および膜貫通ドメインには下線が付けられている。Ｎ結合型
グリコシル化部位が、細胞外ドメインの免疫グロブリン様フォールド内における
ジスルフィド結合を形成するシステイン残基と同様に強調されている。◆：３４
アミノ酸の挿入耐の位置および配列（下記）

【図４】 ヒトＢＩｇＲの細胞内ドメインと、グリコフォリンＣおよびショウジョウバエ
のニューレキシンとのアラインメントを示す図である。これらの配列の少なくと
も２つに間に保存されている残基が強調されている。

【図５】 ネズミ接着タンパク質（以降、「マウスＢＩｇＲ」として示される）の完全な
ｃＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示す図である。保存されているシステイン
残基が強調されている。

【図６】 マウス（上段）およびヒト（下段）のＢＩｇＲアミノ酸配列のアラインメント
を示す図である。

【図７】 ［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰのＢＩｇＲプローブを用いて高ストリンジェンシーの
もとでプローブされた多組織ノーザンブロットにおいて同定された転写物を示す
図である。矢印はヒトＢＩｇＲ転写物を強調している。

【図８】 転写物が、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰのＢＩｇＲ（Ａ）またはβ−アクチン（Ｂ
）を用いて高ストリンジェンシーのもとでプローブされた正規化ヒト脳多組織ノ
ーザンブロットにおいて同定されたことを示す図である。矢印はヒトＢＩｇＲ転
写物を強調している。

【図９】 ウサギ抗ＢＩｇＲ抗体を用いてプローブされたＣｏｓ細胞（コントロール細胞
およびＢＩｇＲ発現細胞）のウエスタンブロットである。

【図１０】 ＣＨＯ細胞において発現させたときのＢＩｇＲの細胞レベル以下での局在化を
明らかにする図である。免疫蛍光を、ウサギ抗ＢＩｇＲ抗体を用いて行い、Ｎｏ
ｒａｎＴＭ共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｎｏｒａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、
Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ）を使用して画像化した。

【図１１】 様々な白血球細胞株におけるＢＩｇＲ対抗受容体のスクリーニングを示す図で
ある。カルセイン負荷細胞を、９６ウエルプレートに捕捉されたＢＩｇＲ−Ｆｃ
に加えた。結合をＴＢＳ中（ｎ＝６）またはＴＢＳ＋１Ｍｎ中（ｎ＝６）におい
て行った。ウエルを洗浄し、保持された細胞を溶解して、蛍光を、励起４８５ｎ
ｍ／放射５３０ｎｍにおいて蛍光計で定量した。代表的な実験から得られたデー
タ。平均±ＳＥＭ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 バロス，マリア・ピア・トリンダツド・ア ラーテ アメリカ合衆国、テキサス・77096、ヒユ ーストン、アパートメント・ナンバー・ 268・ブレイスモント・8849 (72)発明者 トラン，チユアン・ミン アメリカ合衆国、テキサス・77088、ヒユ ーストン、ハーウツド・フオウレスト・ド ライブ・5659 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA63 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 FA06 GA01 GA11 HA01 HA03 HA11 4B065 AA01X AA57X AA90X AA91Y AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１を含む単離および精製されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 配列番号３を含む単離および精製されたポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む単
   離および精製されたポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列番号４のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む単
   離および精製されたポリペプチド。
5. 【請求項５】 配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を有するポ
   リヌクレオチドまたはそのフラグメントを含む組換えベクターであって、前記ポ
   リヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド配列および終止セグメントの発現を制
   御するプロモーターに機能的に連結されている組換えベクター。
6. 【請求項６】 前記プロモーターが、ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモ
   ーター、大腸菌プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターまたは
   ファージラムダＰ_Ｌプロモーターである、請求項５に記載のベクター。
7. 【請求項７】 請求項５に記載される組換えベクターを含む宿主細胞。
8. 【請求項８】 宿主細胞が、細菌細胞、動物細胞または植物細胞である、請
   求項７に記載の宿主細胞。
9. 【請求項９】 配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列のヌル変異
   を含むトランスジェニック哺乳動物。
10. 【請求項１０】 配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を過剰に
    発現するトランスジェニック哺乳動物。
11. 【請求項１１】 請求項３または４に記載されるポリペプチドに結合する抗
    体。